优化的脱氮假单胞菌发酵生产维生素B12方法与合成培养基 【技术领域】
本发明涉及发酵领域，更具体地涉及一种优化的脱氮假单胞菌发酵生产维生素B12方法以及相关的合成培养基。
背景技术
维生素B12是一种结构非常复杂的分子，根据与其中心钴离子结合配基基团的不同可形成羟钴胺素、甲基钴胺素、脱氧腺苷钴胺素和氰钴胺素[1]。
维生素B12的化学结构如图9所示。
维生素B12是一种生物催化活性物质，是哺乳动物不可缺少的维生素，能够预防和治疗恶性贫血症，维护神经系统的健康，促进碳水化合物、脂肪和蛋白质的代谢[2]；
现在国内和国外商品化的维生素B12几乎都是通过微生物发酵来生产的。能够合成维生素B12的微生物根据其耗氧情况分为两类：(1)厌氧菌或间性厌氧菌如：费氏丙酸杆菌(Propionibacterium freudenreichii)[3]、谢氏丙酸杆菌(Propionibacterium shermanii)[4]和鼠伤寒沙门氏菌(Salmonellatyphimurium)等。(2)好氧菌：比如脱氮假单胞杆菌(Pseudomonasdenitrificans)[5]，钴胺素根瘤菌[6](Rhizobium cobalaminogenum FERM BP-4429)等。在这些微生物进行发酵生产时一般都是以麦芽糖、玉米浆和糖蜜为主要原料，未见有在合成培养基中研究维生素B12发酵的报道。
为了能够最大限度的提高生产菌的合成能力，降低发酵生产成本，就必须从代谢工程的角度来研究菌种在不同条件下的物质流走向，来优化代谢网络，使更多的底物流向产物的合成[7]。为了能够对菌体的代谢网络模型了解和分析的更清楚，13C同位素标记试验来用于微生物代谢通量的研究日趋成熟，能够更准确地分析代谢通量的分布[8]。而这种开展同位素示踪标记试验就必须要求人们对培养基中的碳源和氮源要特别清楚，只有这样才能减少外围碳氮源对代谢同位素分布丰度的影响，减少实验误差。
目前，维生素B12需求量较大，因此提高维生素B12的表达水平成为当务之急，本领域迫切需要开发高效的生产维生素B12的方法，尤其是能够在使用合成培养基下大幅度提高维生素B12的方法。
【发明内容】
本发明的目的就是提供一种高效的生产维生素B12的方法。
本发明的另一目的是提供可用于本发明高效的生产维生素B12的方法的合成培养基。
在本发明的第一方面，提供了一种生产维生素B12的方法，它包括步骤：
(a)在适合发酵的且钾离子浓度为0.7-1.3g/L发酵液的条件下下，培养生产维生素B12的工程菌，从而产生维生素B12，其中所述的钾离子浓度以氯化钾计；和
(b)从发酵液中分离纯化出维生素B12。
在另一优选例中，在步骤(a)中，按氯化钾计，钾离子的浓度为0.8-1.1g/L，更佳地0.9-1.05g/L。
在另一优选例中，在步骤(a)中还包括：控制培养基中葡萄糖浓度，使得葡萄糖浓度为60-90g/L培养基。
在另一优选例中，葡萄糖的浓度为65-80g/L，更佳地70-75g/L。
在另一优选例中，在步骤(a)中还包括：控制磷酸氢二铵的浓度，使得磷酸氢二铵浓度为4.0-8.0g/L发酵液。
在另一优选例中，磷酸氢二铵的浓度为5.0-7.0g/L，更佳地5.5-6.0g/L。
在另一优选例中，在步骤(a)中，还包括：
-控制发酵液中钾离子(按氯化钾计算)∶葡萄糖重量比为(0.7～1.3)∶(60～90)；或
-控制发酵液中钾离子(按氯化钾计算)∶磷酸氢二铵二者的重量比宜为(0.7～1.3)∶(4.0～8.0)；或
-控制发酵液中钾离子(按氯化钾计)∶葡萄糖∶磷酸氢二铵三者的重量比为(0.7～1.3)∶(60～90)∶(4.0～8.0)。
在另一优选例中，所述的工程菌是费氏丙酸杆菌(Propionibacteriumfreudenreichii)、谢氏丙酸杆菌(Propionibacterium shermanii)、鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)、脱氮假单胞杆菌(Pseudomonasdenitrificans)或钴胺素根瘤菌。一种优选的工程菌是脱氮假单胞杆菌(Pseudomonas denitrificans)。
在本发明的第二方面，提供了一种可用于本发明上述方法的培养基，所述的培养基中钾离子(按氯化钾计)∶葡萄糖∶磷酸氢二铵三者的重量比为(0.7～1.3)∶(60～90)∶(4.0～8.0)。
在另一优选例中，所述的培养基的重量配方如下：葡萄糖：71.2±10％；甜菜碱：9.7±2％；磷酸氢二铵：5.6±1％；硫酸铵：5.9±1％；尿素：1.97±0.5％；硫酸镁：1.38±0.1％；氯化钾：0.97±0.1％；DMBI(5，6-二甲基苯并咪唑)：0.077±0.007％；硫酸亚铁：0.030±0.01％；氯化钴：0.025±0.01％；钼酸钠：0.020±0.01％；和硫酸锌：0.020±0.01％。
在本发明的第三方面，还提供了可溶性无机钾盐(包括氯化钾、磷酸钾、磷酸氢二钾、磷酸二氢钾、乙酸钾、硫酸钾)等的用途，它们被用作发酵生产维生素B12的促进剂。
应理解，上述的以及本文下文中所详述的任二个或多个技术特征都可相互组合，以构成新的技术方案。在此申请中，为了节省篇幅，不再一一列出。
【附图说明】
图1当葡萄糖浓度为70g/L时，磷酸氢二铵和氯化钾含量的变化对VB12效价影响的曲曲面图。
图2当磷酸氢二铵浓度为4g/L时，葡萄糖和氯化钾含量的变化对VB12效价影响地曲曲面图。
图3当氯化钾浓度为0.7g/L时，葡萄糖和磷酸氢二铵含量的变化对VB12效价影响的曲曲面图。
图4显示了在5L罐中的发酵过程参数相关变化曲线。
图5显示了发酵过程的菌体形态(19小时)。
图6显示了发酵过程的菌体形态(39小时)。
图7显示了发酵过程的菌体形态(76小时)。
图8显示了发酵过程的菌体形态(110小时)。
【具体实施方式】
本发明人通过深入而广泛的研究，意外地发现在维生素B12的发酵生产过程中，通过控制钾离子浓度，可以大幅提高维生素B12的产量。在此基础上完成了本发明。
适用于本发明方法的表达维生素B12的菌株没有特别限制，可以是现有的生产维生素B12的工程菌，也可用常规方法改造或诱变的工程菌。代表性的工程菌包括(但并不限于)：厌氧菌或间性厌氧菌如：费氏丙酸杆菌(Propionibacterium freudenreichii)、谢氏丙酸杆菌(Propionibacteriumshermanii)和鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)；以及好氧的脱氮假单胞杆菌(Pseudomonas denitrificans)，钴胺素根瘤菌[6](Rhizobiumcobalaminogenum FERM BP-4429)等。一种优选的工程菌是脱氮假单胞杆菌(Pseudomonas denitrificans)。
在获得了表达维生素B12的工程菌后，便可在常规的适合表达维生素B12的条件下培养，以表达维生素B12。
钾离子浓度
在本发明中，通过控制发酵过程中的钾离子浓度，便可大幅提高维生素B12的产量。
在本发明中，钾离子可以来自钾盐，例如KCl，K2SO4，乙酸钾等钾盐，还可来自其他含钾离子的物质，或它们的混合物。一种优选的钾盐是氯化钾。
在本发明方法中，按氯化钾浓度计，将钾离子的浓度控制在0.7-1.3g/L，较佳地0.8-1.1g/L，更佳地0.9-1.05g/L。或者，将氯化钾的用量换算成mM浓度，则钾离子的浓度通常为约9-18mM(如9.39-17.44mM)或更高，较佳地为约10-15mM(如10.73-14.75mM)，更佳地为约12-14mM(如12.07-14.08mM)。
葡萄糖浓度
在另一优选实施例中，本发明人还在发酵生产过程中，通过控制葡萄糖浓度，从而进一步提高维生素B12的产量。
在本发明方法中，通常，葡萄糖浓度可控制在60-90g/L，较佳地65-80g/L，更佳地70-75g/L。
在优选例中，在发酵过程中，钾离子浓度(按氯化钾计算)∶葡萄糖重量比宜为(0.7～1.3)∶(60～90)，较佳地为(0.8～1.1)∶(65～80)，更佳地为(0.9～1.05)∶(70-75)或为1.2～1.4∶100。
磷酸氢二铵浓度
在另一优选实施例中，本发明人还在发酵过程中或在发酵培养基中，通过控制磷酸氢二铵的浓度，从而进一步提高维生素B12的产量。
磷酸氢二铵浓度控制在4.0-8.0g/L，较佳地5.0-7.0g/L，更佳地5.5-6.0g/L。
在优选例中，在发酵过程中，钾离子浓度(按氯化钾计算)∶磷酸氢二铵二者的重量比宜为(0.7～1.3)∶(4.0～8.0)，较佳地为(0.8～1.1)∶(5.0～7.0)，更佳地为(0.9～1.05)∶(5.5～6.0)或为(0.16～0.17)∶1。
在本发明的优选例中，在发酵过程中，钾离子浓度(按氯化钾计算)∶葡萄糖∶磷酸氢二铵三者的重量比宜为(0.7～1.3)∶(60～90)∶(4.0～8.0)，较佳地为(0.8～1.1)∶(65～80)∶(5.0～7.0)，更佳地为(0.9～1.05)∶(70～75)∶(5.5～6.0)或为(0.16～0.17)∶(11.5～12.5)∶1。
培养基
用于本发明的培养基没有特别限制，可以是各种常规的培养基。例如对于脱氮假单胞菌而已，可以选用(但并不限于)：培养基1(g/L)：蔗糖80，玉米浆45，甜菜碱14，(NH4)2SO41，CoCL·6H2O 0.075，MgO 0.5，DMBI0.05，ZnSO4·7H2O 0.08，CaCO31，pH 7.2-7.4；培养基2(g/L)：葡萄糖55g，玉米浆35g(干物)，硫酸铵5g，磷酸二氢钠8g，氯化钻0.01g，调pH 6.8-7.0；或低盐发酵培养基等。
当然，为了用于本发明的发酵方法，应当在培养基中添加一定浓度的钾盐，以便使得使用时钾离子的浓度处于合适的范围。当然，也可使用一般的培养基，然后在发酵过程中添加或补加钾离子源，从而将发酵体系中的钾离子浓度控制在合适的范围。
另外，还在培养基中添加一定浓度的葡萄糖和/或磷酸氢二铵，以便使得使用时葡萄糖和/或磷酸氢二铵的浓度处于合适的范围。当然，也可使用一般的培养基，然后在发酵过程中补加或添加葡萄糖和/或磷酸氢二铵，从而将发酵体系中的葡萄糖和/或磷酸氢二铵浓度控制在合适的范围。
一种特别优选的培养基是全合成的培养基，其干重配比的培养基组分及含量(％)如下：
成分 含量范围(wt％) 优选范围(wt％) 最佳含量(wt％) 葡萄糖 71.2±10 71.2±5 71.2 甜菜碱 9.7±2 9.7±1 9.7 磷酸氢二铵 5.6±1 5.6±0.5 5.6 硫酸铵 5.9±1 5.9±0.5 5.9 尿素 1.97±0.5 1.97±0.2 1.97 硫酸镁 1.38±0.1 1.38±0.05 1.38 氯化钾 0.97±0.1 0.97±0.05 0.97
成分 含量范围(wt％) 优选范围(wt％) 最佳含量(wt％) DMBI (5，6-二甲基苯并咪唑) 0.077±0.007 0.077±0.003 0.077 硫酸亚铁 0.030±0.01 0.030±0.005 0.030 氯化钴 0.025±0.01 0.025±0.005 0.025 钼酸钠 0.020±0.01 0.020±0.005 0.020 硫酸锌 0.020±0.01 0.020±0.002 0.020
在本发明中，对于发酵生产的维生素B12，可以用常规方法进行纯化，随后制成药剂。一种优选方法是对发酵样品用常规方法酸化后进行离心、过滤等方式去除菌体，获得含维生素B12的发酵清液。然后，对发酵清液通过盐析、超滤等方法进行初步纯化后再进行层析纯化，也可直接进行离子层析纯化。
在本发明的一个实例中，通过用Plackett-Burman(P-B)试验设计对培养基中相关影响因素进行筛选，得到葡萄糖、磷酸氢二铵和氯化钾为显著影响因子，并通过Central Composite Design(CCD)响应面分析确定了主要影响因素的最佳浓度。在优化的培养基中，维生素B12产量达到64.6mg/L，菌浓达到了29g干菌体每升发酵液，在5L发酵罐中进行pH自动控制发酵试验，VB12发酵产量大幅度提高了300％以上，达77mg/L。
本发明的主要优点在于：
(a)通过简单有效的控制方法(控制钾离子浓度)，极其有效地提高维生素B12的产量。
(b)建立了用于维生素B12发酵生产的全合成培养基，有利于发酵液中维生素B12的提取，降低提取成本。
(c)建立的合成培养基能够很好的用于13C同位素标记研究维生素B12合成代谢流通量，更好地指导生产控制工艺。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York：Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
实施例1
1材料与方法
1.1菌种和培养基
菌种：脱氮假单胞菌(购自石家庄华荣制药集团)
种子培养基(g/L)：葡萄糖20.0，硫酸铵8.0，MgSO4·7H2O 1.5，KCl0.2，微量元素混合液I 10ml/100ml，pH 7.0。葡萄糖液单独灭菌后加到发酵培养基中。
微量元素混液I(g/L)：FeSO4·7H2O 0.03，CoCl2·6H2O 0.016，MnSO4·H2O 0.02Na2MoO4·2H2O 0.02，ZnSO4·6H2O 0.02
初始发酵合成培养基组成(g/L)：葡萄糖30.0，甜菜碱10.0，(NH4)2HPO42.0，硫酸铵4.0，尿素2.0，MgSO4·7H2O 1.0，KCl 0.2，DMBI0.025，微量元素混合液II：三10ml/100ml，pH 7.0。葡萄糖液单独灭菌后加到发酵培养基中。
微量元素混合液II(g/L)：FeSO4·7H2O 0.03，CoCl2·6H2O 0.016，Na2MoO4·2H2O 0.02，ZnSO4·6H2O 0.02
补料培养基：甜菜碱30g/l，氯化钴0.3g/l，DMBI 0.3g/l，葡萄糖50g/l pH 6.2-6.5，葡萄糖液单独灭菌后与其它补料溶液混合。
1.2试剂和仪器
试剂：玉米浆(华北制药康欣有限公司)，甜菜碱(华荣制药有限公司)，葡萄糖(上海糖业有限公司)，其他试剂均为国产分析纯。
仪器：722型紫外一可见分光光度计；HPLC 1100(Agilent公司)；5L发酵罐：上海国强生化装备有限责任公司；发酵控制系统：国佳生化工程中心NCBbiostar发酵控制系统。旋转式摇床：
1.3培养方法
菌悬液制备：用无菌水洗涤培养了48-54小时的斜面，稀释成菌浓为108个细胞每毫升的菌悬液。
母瓶种子培养：将制好的菌悬液接种2ml到母瓶培养基中，装量100ml/500ml，培养温度32℃，转速260rpm，培养18-22小时，菌浓在700nm下的OD值为9-11之间。
发酵培养：将培养好的母瓶种子接种5ml到装有100ml培养基的500ml无菌发酵摇瓶中，培养温度32℃，转速260rpm，每隔20小时取样测定并用NaOH调节pH到7.2左右，72小时和96小时分别补加补料培养基3.5ml和3.0ml，144小时放瓶。
5L发酵罐培养：将培养好后镜检无菌的母瓶种子液100ml火焰保护接种到装有2.5L培养基的发酵罐中，32℃，通气量2.5L/min，发酵过程中根据菌体生长情况当残糖浓度为20g/L时开始连续补加葡萄糖并维持在这个糖浓度，菌浓在700nm下的OD达到30以上时开始补加甜菜碱料液培养基，pH用氢氧化钠进行流加自控在6.8-7.0之间。
1.4测定方法
总糖和还原糖测定：采用改进了的DNS法。
生物量(DCW)测定：取发酵液25ml，4000rpm离心15分钟，将菌体沉淀用超纯水洗涤并加稀盐酸除去沉淀的碳酸钙，离心后将菌体洗涤2次后，于115度烘箱内烤干称重，计算菌体含量。
铵离子测定：利用苯酚--次氯酸盐反应测定[9]
维生素B12含量测定[5]：将发酵液用亚硝酸钠溶液和冰醋酸水解后用氰化钠溶液进行氰化，使发酵液中不同形式的维生素B12转化为氰钴胺素，用高压液相谱进行含量分析，高效液相色谱条件：流动相为250mmol/L磷酸水溶液-乙腈(30∶70，v/v)；色谱柱为大连依利特Hypersil NH2柱(4.6mm×250mm，5μm)；检测波长为361nm；进样量是20μL；流速为1.7mL/min。
pH在线测定：采用Mettler Toledo耐高温电机进行在线测定。
溶氧测定：采用Mettler Toledo耐高温电机进行在线测定。
P-B试验设计：为了建立钴胺素根瘤菌发酵生产维生素B12的最佳全合成培养基，以葡萄糖为唯一碳源，选用无机铵盐作为氮源，考察合成培养基中更多因素对发酵菌浓和B12发酵的影响。
鉴于合成培养基发酵过程中产生大量酸性物质使得发酵液pH值较低，影响了菌的生长和产物合成，加入了磷酸氢二钠缓冲盐，来对发酵过程的pH进行适当的稳定调节。在P-B试验设计中，选择的因素为八个，分别是葡萄糖(X1)、氯化钾(X2)、磷酸氢二钠(X3)、硫酸镁(X4)、尿素(X5)、硫酸铵(X6)、磷酸氢二铵(X7)、微量元素(X8)，每个因素的水平均为三个(-1，0，1)。试验结果分别以菌体浓度和VB12的产量为响应值，利用SAS统计软件进行统计分析。
试验因素和水平设计如表1所示。
表1P-B试验设计各因素变量和水平表单位(g/L)
中心组合试验设计：根据P-B因子筛选试验的结果所确定的显著性因素，用中心组合响应面设计进一步优化其最适添加水平。对中心组合响应面试验结果运用SAS和Design-Expert软件进行统计分析，分别以菌浓和VB12发酵单位为响应值，应用二多项式方程对试验结果进行响应面回归分析。
Y=βo+ΣiβiXi+ΣiiβiiXi2+ΣijβijXiXj]]>
Y是预测相应值，Xi是自变量，βi为自变量一次性系数，βii为变量的平方相系数，βij为自变量交叉相乘积的系数，Xij为两个自变量的交叉乘积。
2结果与讨论
2.1P-B试验因素考察
根据P-B试验设计，对选择的八个因素葡萄糖、硫酸镁、氯化钾、磷酸氢二铵、尿素、磷酸氢二钠、硫酸铵、微量元素，进行考察，每组安排3个平行，其结果为三个平行的平均值。得到的试验结果见表2。
表2Plackett-Burman设计得到的各因素对菌体生长和VB12发酵合成的结果
序号 X1 X2 X3 X4 X5 X6 X7 X8 DCW(g/l) Vb12(mg/l) 1 -1 -1 -1 1 -1 1 1 -1 12.2 36.0 2 -1 -1 -1 -1 -1 -1 -1 -1 14.6 39.0
序号 X1 X2 X3 X4 X5 X6 X7 X8 DCW(g/l) Vb12(mg/l) 3 1 -1 1 1 -1 1 1 1 15.0 49.5 4 -1 1 1 -1 1 1 1 -1 10.7 31.5 5 -1 1 -1 1 1 -1 1 1 11.3 28.5 6 -1 -1 1 -1 1 1 -1 1 13.9 40.5 7 1 -1 -1 -1 1 -1 1 1 16.7 39.0 8 1 1 -1 -1 -1 1 -1 1 18.1 49.5 9 1 1 1 -1 -1 -1 1 -1 18.9 42.0 10 1 1 -1 1 1 1 -1 -1 28.9 46.5 11 1 -1 1 1 1 -1 -1 -1 25.6 54.0 12 -1 1 1 1 -1 -1 -1 1 16.4 37.5 13 0 0 0 0 0 0 0 0 21.2 45.0 14 0 0 0 0 0 0 0 0 21.7 44.8 15 0 0 0 0 0 0 0 0 21.0 45.2 16 0 0 0 0 0 0 0 0 20.9 45.5
通过SAS软件对P-B试验结果进行统计分析，以不同时间发酵液中菌浓、Vb12的含量为响应值，分别建立模型分析各个因素对Vb12产量的影响，分析结果见表3。
表3模型相关度拟合分析结果
从表3可以看出，分别以菌浓和Vb12产量为指标的模型拟和度都较好，相关度都达到95％以上，所以参考这两个模型考察其中各个因素的不同影响，包括显著性与否、正相关还是负相关。
表4各参数对发酵菌浓和VB12合成的模型参数估计
由表4结果可知，以菌体和发酵液效价为响应值的模型参数分析结果是一致的，而且模型的拟和参数几乎完全相同：因素的影响显著顺序为X1＞X7＞X2＞X3＞X6＞X5＞X4＞X8；葡萄糖、磷酸氢二铵和氯化钾影响是最为显著的。
葡萄糖与Vb12产量、菌浓是正相关的，磷酸氢二铵与Vb12产量、菌浓是负相关的；氯化钾与Vb12产量、菌浓是负相关的，磷酸氢二钠与Vb12产量、菌浓是正相关的，可能较多的磷酸氢二钠能更好的维持发酵体系的pH值，有利于VB12的合成；硫酸镁与Vb12产量、菌浓是正相关的，尿素与Vb12产量、菌浓是负相关的，硫酸铵与Vb12产量、菌浓是正相关的，微量元素与Vb12产量、菌浓是负相关的，对VB12的合成影响最小。
对显著因素葡萄糖、氯化钾和磷酸氢二铵作进一步的试验优化，其他因素的取值则根据各因素效应的正负和大小确定，正效应的因素均取较高值，负效应的因素均取较低值，最佳浓度为(g/L)：磷酸氢二钠3，硫酸镁1.4，尿素2，硫酸铵6，微量元素混合溶液II为80ml发酵液。
实施例2中心组合试验进一步优化
根据P-B因子筛选试验的结果，确定了合成培养基中的三个显著性因素——葡萄糖、氯化钾和磷酸氢二铵。在此基础上，本实施例通过中心组合试验进一步来考察这三个因素的最适添加水平，试验设计水平表选取和安排如表5和表6所示。
表5试验因素设计水平表
表6中心组合设计结果及模型的预测值
每组三个平行，16-20为中心点水平试验
表7以VB12发酵液效价为响应值的统计分析结果
对中心组合响应面试验结果运用SAS和Design-Expert软件进行统计分析，从统计分析的结果来看，葡萄糖的影响最为显著。模型的F值为46.08，Lack of Fit值为0.5145，较高的F值和不显著的Lack of Fit参数(0.5145＞0.05)说明所选择的模型能够对数据进行很好的拟合，同时模型的Prob值＜0.0001和影响不显著的Lack of Fit值说明试验得到的数据结果与模型吻合度较好。
方程的回归分析参数显示，多元相关系数R2为0.976(一般大于0.75就认为能很好拟合)，矫正R2为0.955可以认为该拟合方法和建立的模型对于效价的统计分析是有效的。通过统计回归分析，获得了该多元二次方程表达如下：
Y=63.88+1.66X1-0.27X2-1.23X3-7.27X12-4.09X22-4.17X32]]>
-0.5X1X2+0.45X1X3+2.03X2X3]]>
式中X1：葡萄糖、X2：氯化钾、X3：磷酸氢二铵
为了找到发酵生产VB12最大量时三个因素的最优水平，以VB12的效价为响应值Z轴，以其他两个独立的因素为横坐标进行三维响应面分析，保持另一个因素在其最佳值。
从图1、图2和图3的响应曲面图中可以看出，磷酸二氢铵、氯化钾和葡萄糖这三个关键影响因素彼此之间都有很强的交互作用，最佳添加量的点都落在实验考察的区域内，该试验设计和方案选取是很成功的。
具体而言，从图1～3可以看出：
(a)钾离子浓度(以氯化钾计)宜控制在0.7-1.3g/L，较佳地0.8-1.1g/L，更佳地0.9-1.05g/L发酵液；
(b)葡萄糖浓度控制在60-90g/L，较佳地65-80g/L，更佳地70-75g/L发酵液。
(c)磷酸氢二铵浓度控制在4.0-8.0g/L，较佳地5.0-7.0g/L，更佳地5.5-6.0g/L发酵液。
此外，可以对钾离子浓度、葡萄糖浓度、磷酸氢二铵浓度中的三者或任何二者同时进行控制，即分别将钾离子浓度、葡萄糖浓度和/或磷酸氢二铵浓度控制在上述的范围内。
一种特别优选葡萄糖、氯化钾和磷酸氢二铵的浓度分别为：72.2±7g/L、0.98±0.1g/L和5.7±0.5g/L；更佳地葡萄糖、氯化钾和磷酸氢二铵的优选浓度分别为：72.2g/L、0.98g/L和5.7g/L。
实施例3发酵验证实验
根据P-B因子筛查试验和显著影响因子的继续考察研究，得到的最优化培养基配方为(g/L)：葡萄糖72.2，氯化钾0.98，磷酸氢二铵5.7，磷酸氢二钠3，硫酸镁1.4，尿素2，硫酸铵6，微量元素混合溶液为8ml/100ml发酵液，甜菜碱10，DMBI 0.08消毒前pH值为7.2-7.4。
根据以上得到的最优化的培养基浓度配比，进行了3批发酵试验验证，每批5个平行，得到的平均维生素B12产量为66.6mg/L，菌浓达到了29g干菌体每升发酵液，分别比优化前的高出212％和246％，与模型的预测最大值67.2mg/L的维生素B12产量非常接近。这表明，本发明优化方法得到的实验结果可信度是很高的，建立的全合成发酵培养基能够很好地用于维生素B12的发酵生产及进一步开展代谢途径通量的研究。
实施例4钾离子浓度对发酵的影响(验证实验)
同实施例3，在以配方如下的培养基配方为基础，其中各组分(g/L)：葡萄糖72.2，磷酸氢二铵5.7，磷酸氢二钠3，硫酸镁1.4，尿素2，硫酸铵6，微量元素混合溶液为8ml/100ml发酵液，甜菜碱10，DMBI 0.08消毒前pH值为7.2-7.4。不同点在于，在该培养基中添加不同浓度的氯化钾(表8)。
根据各种钾离子浓度的培养基浓度，各进行了1批发酵试验验证，每批3个平行，结果如表8所示，其中以0.98g/L浓度下的维生素B12产量为100％。
表8不同钾离子浓度对维生素B12产量的影响
编号 氯化钾浓度(g/L) 维生素B12产量 1 0 35％ 2 0.3 50％ 3 0.7 91％ 4 0.98 100％ 5 1.3 87％ 6 1.5 75％
这表明，本发明通过控制培养基中钾离子浓度(以氯化钾计)在0.7-1.3g/L范围内，非常有利于维生素B12的发酵生产。
实施例5在5L发酵罐中合成培养基发酵过程参数优化
配制一合成培养基，其干重配比的培养基组分及含量(％)如下：葡萄糖71.2，甜菜碱9.7，磷酸氢二铵5.6，硫酸铵5.9，尿素1.97，硫酸镁1.38，氯化钾0.97，DMBI(5，6二甲基苯并咪唑)0.077，硫酸亚铁0.030，氯化钴0.025，钼酸钠0.020，硫酸锌0.020。
采用该优化后的合成培养基配方，在5L全自动发酵罐中进行发酵试验考察，在初始培养基中不再添加DMBI和甜菜碱，等菌体生长进入稳定期后开始流加，24小时开始流加氨水和1mol/L氢氧化钠进行pH值自控，以维持铵离子浓度在400-450mg/L，pH值控制在6.8-7.0，33小时开始葡萄糖和甜菜碱的补加。
发酵过程各相关参数的变化如图4所示。从发酵的过程曲线图4中可以看出，随着菌体的生长，溶氧在14小时开始迅速下降，19小时左右，溶氧降到3％，这时不断提高转速以增加供氧，转速从19小时的280转/min调到21小时的400转/min，但随着菌体的不断增长，溶氧于21小时降到0.5％左右，这时发酵处于氧限制阶段，直到发酵后期菌体开始老化，溶氧开始回升。
菌体10小时后进入对数增长期，最大比生长速率um为0.081，30小时菌体生长进入稳定期，开始补加甜菜碱和葡萄糖，在稳定期维生素B12开始合成，60到110小时之间合成速率最大，110小时后菌体的合成速率减缓，130小时放罐时的维生素B12的含量为77mg/L，比对照提高了305％。
从发酵过程的菌体形态观察中，发现菌体的形态变化很大，19小时的形态(图5)较短小，染色很深，均一，菌体活力较强，不发生粘连，菌体一般呈现独立存在。
随着菌体进入稳定期，糖迅速被消耗降到2％以下，溶氧降到最低，这时菌体开始了维生素B12的合成，如图6所示菌体形态上发生了较大的变化，菌体变长、膨胀产生粘连，并逐渐形成了染色空泡，这个阶段的菌体合成速率最大。
发酵后期随着染色空泡的逐渐增多，菌体开始老化生产速率明显下降(见图7和图8)。
此外，在发酵过程中，还发现当糖浓度降到2.5g/l和铵离子降到400mg/1以下时，菌体的形态变得异常的膨大，不再呈现短杆状，染色很浅，不利于维生素B12的合成。
讨论
1通过P-B试验设计，筛选出了影响维生素B12发酵菌体生长和合成最为显著的关键因素，葡萄糖、磷酸氢二铵和氯化钾，确定了其它因素的最佳添加水平为：磷酸氢二钠0.15％，硫酸镁0.14％，尿素0.2％，硫酸铵0.6％，微量元素混合溶液为8ml/100ml发酵液。
2通过用中心组合响应面设计对筛选得到的显著因素的进一步优化，确立了葡萄糖、磷酸氢二铵和氯化钾的最优化添加浓度，使得在此最佳合成培养基中，VB12的发酵单位达到了64.6mg/L。
3在5L的发酵罐中，对得到的最优化合成培养基进行了过程pH值用氨水和NaOH进行自控，维持铵离子浓度为400mg/L，发酵过程中进行糖和甜菜碱的连续补加，发酵130小时的VB12的发酵单位达到了77mg/L，可见，建立的合成培养基能够很好的用于VB12的代谢研究和发酵生产试验，能够改善生产中VB12发酵液提取工艺，降低提取成本，有非常重要的应用潜力。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
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