高血压及血管病变疾病风险的遗传学检测芯片及其用途 【技术领域】
本发明涉及基因多态性检测芯片，尤其涉及一种高血压及血管病变疾病风险的遗传学检测芯片及其用途。
背景技术
高血压是一种常见病，世界各国患病率高达10％～20％。近年来，我国高血压发病率有明显上升趋势。据2002年全国居民营养与健康状况调查资料显示，我国成人高血压患病率为18.8％，全国有高血压患者约1.6亿。高血压导致心、脑、肾等重要脏器的严重病变，是心脑血管病最重要的危险因素。在我国，心脑血管病已成为首位死因，占总死亡的44.4％。在引起死亡的各种危险因素中，高血压排在首位。高血压及相关疾病给社会和家庭带来巨大负担。据2003年统计，我国高血压直接医疗费为300亿元人民币，由此造成心脑血管病的直接和间接耗费高达每年3000亿元人民币。
在高血压等多基因遗传病中，基因变异赋予患者对疾病的易感性，它可作为预报疾病风险的遗传生物标志。与传统危险因素比较，遗传生物标志深入到基因水平，更加准确、可靠，不受药物、食物和各种环境因素的影响；而且可以在青少年甚至更早期筛查出高血压或心脑血管病的易患者。因而，遗传生物标志研究备受重视。如果选择与高血压及血管病变相关的SNP，制定基因检测芯片，在人群中开展筛查，将有可能早期找到易发生高血压及血管病变的高危人群，并做到及早防治。
高血压发生的病理学基础是血管重塑造成的血管结构与功能改变，因此高血压的本质是一种血管性病变。高血压导致的靶器官损伤也是以血管损伤为基础的器官功能衰减过程。血管损伤是高血压发生的病理基础，也是高血压维持、发展的结构基础。因此如何采取简便、快捷、准确的手段在高血压早期即筛查出高血压及血管损伤的高危患者，及早采取治疗预防措施，对于提高心血管疾病的控制率、降低心血管并发症的死亡率、改善病人的生活质量、减少国家医疗费用支出等都具有重要意义，也是目前医学研究及临床应用的重要课题。
骨桥蛋白(osteopontin，OPN)是一种重要的细胞黏附及趋化因子，它主要通过两种机制发挥细胞信号分子的作用：一是以分子内RGD基元与整合蛋白家族分子结合；二是与细胞表面黏附性糖蛋白CD44以非RGD依赖方式结合。两种作用方式均通过激活细胞内特异性信号传导系统而介导细胞黏附、迁移和增殖。近年来，已有研究人员发现OPN与血管损伤和血管重塑有关(Li G，Chen SJ，Oparil S，et al.Direct in vivo evidence demonstrating neointimal migration of adventitialfibroblasts after balloon injury of rat carotid artery.Circulation，2000，101：1362-1365)。RhoA/ROK是调节心血管功能活性的重要信号通路转导通路。RhoA蛋白(Ras homolog gene family，member A)是小G蛋白超家族中Rho家族的Rho亚家族中的一个成员，现在被公认为是可收缩蛋白的Ca2+敏化作用的主要调节器，负责血管平滑肌细胞收缩的增强组件。Rho蛋白作为一种分子开关启动Rho连接激酶(Rho associated kinase)的活化，ROCKα基因编码的Rho激酶作为Rho下游的效应分子发挥特定的生物学效应，介导平滑肌细胞及非平滑肌细胞的收缩，细胞的黏附、游走、增殖、凋亡及细胞骨架的改变，从而参与体内一系列的生理病理过程。在高血压血管性疾病中不同的上游区信号能向RhoA激活作用会聚，RhoA/Rho激酶在高血压中具有重要作用(Masumoto A，HirookaY，Shimokawa H，Hironaga K，SetoguchiS，Takeshita A.Possible involvement of Rho-kinase in the pathogenesis ofhypertension in humans.Hypertension.2001；38：1307-1310.)。这些改变是高血压病理过程的重要环节。因此，选择上述与高血压及血管病变相关基因的SNP，制定基因检测芯片，在人群中开展筛选，将有可能找到发生高血压及血管病变的高危人群，并及时开展防治工作。
【发明内容】
本发明要解决的技术问题是提供一种高血压及血管病变疾病风险的遗传学检测芯片及其用途，该芯片能够有效检测高血压及血管病变相关基因的多态性，辅助医生及时找到治疗高血压及血管病变疾病风险的诊断方法。此外，本发明还提供应用该芯片检测高血压及血管病变相关基因多态性的方法。
为了解决上述技术问题，本发明通过如下技术方案实现：
在本发明的一个方面，提供了一种高血压及血管病变疾病风险的遗传学检测芯片，包括固相载体和固定在所述固相载体上的探针，所述探针包括检测高血压及血管病变相关基因多态性的探针，所述探针与待测的高血压及血管病变相关基因的核苷酸序列和/或其互补序列进行杂交。本发明中所述固相载体可选用领域周知的载体，只要所述载体与所述反应物相容，不会影响检测结果就可以。优选的，本发明所述固相载体可为玻片、硅片、硝酸纤维素膜、尼龙膜和高分子材料中的一种或它们的任意组合。
所述待测高血压及血管病变疾病风险相关基因包括OPN、RhoA、ROKα基因。
所述探针可以是DNA、RNA、DNA-RNA嵌合体、PNA或其衍生物。所述探针的长度没有限制，只要能完成与目的核苷酸序列特异性结合。由于不同地探针长度对杂交效率、信号特异性有不同的影响，所述探针的长度通常至少是14个碱基对，最长一般不超过30个碱基对，与目的核苷酸序列互补的长度以15-25个碱基对之间的为最佳。所述探针的自身互补序列最好少于6个碱基对，以免影响杂交效率。
本发明检测芯片的探针为DNA，包括：
(1)与待测OPN基因杂交的(a)SEQ ID NO：1～SEQ ID NO：33所示序列，(b)SEQ ID NO：1～SEQ ID NO：33所示序列中每条序列的互补链，和/或(c)与SEQ ID NO：1～SEQ ID NO：33所示的序列中每条序列有至少70％同源性的序列；
(2)与待测ROKα基因杂交的(a)SEQ ID NO：34～SEQ ID NO：48所示序列，(b)SEQ ID NO：34～SEQ ID NO：48所示序列中每条序列的互补链，和/或(c)与SEQ ID NO：34～SEQ ID NO：48所示的序列中每条序列有至少70％同源性的序列；
(3)与待测RhoA基因杂交的(a)SEQ ID NO：49～SEQ ID NO：54所示序列，(b)SEQ ID NO：49～SEQ ID NO：54所示序列中每条序列的互补链，和/或(c)与SEQ ID NO：49～SEQ ID NO：54所示的序列中每条序列有至少70％同源性的序列。
优选的，本发明检测芯片的探针选自SEQ ID NO：1～SEQ IDNO：54所示序列。
本发明所涉及的序列如下：
所述探针序列可包含1～10个错配碱基，较佳地，可包含1～5个错配碱基，更佳地，可包含1～2个错配碱基。
本发明检测芯片还包括至少一种对照探针，所述对照探针选自：阴性对照探针、阳性对照探针、杂交对照探针和固定化对照探针。
所述探针可通过连接臂固定于固相载体上。连接臂可以为探针形成双链的部分提供一个自由的空间以减少空间位阻，有助于杂交反应的进行[Afanassiev V，HanemannV，Wolfl S.Preparation of DNA andprotein micro arrays on glass slides coated with an agarose film.NucleicAcids Res.2000，28：e66；USA Patent No.5556752]。连接臂越长，杂交效率越高。典型的连接臂包括15～30个功能基团长度。连接臂可以选用适当形式的功能基团，如Poly T(A、C或G)、C原子或聚乙烯乙二醇与Poly T(A、C或G)的嵌合体、聚乙醇、聚酯、聚氨、聚硫酸酯和其组合物。
所述探针或连接臂通过连接分子固定于固相载体上。探针固定到载体上可以通过C-C键实现，例如，聚三氟氯乙烯表面；或更好的用硅氧烷键(玻璃或二氧化硅作支持物时使用)。硅氧烷键键合可以通过支持物和连接分子的三氯甲硅烷基或三烷氧基甲硅烷基等基团反应完成。氨基烷基硅烷、羟基烷基硅烷、2-羟乙基一氨丙基三乙氧基硅烷、羟乙基一氨丙基三乙氧基硅烷或羟丙基三乙氧基硅烷都是很有用的表面吸附基团。
所述探针可以被修饰，修饰方法可以是5’-NH2修饰、5’-SH修饰、5’-Poly T(A、C或G)修饰、5’-生物素修饰、3’-NH2修饰、3’-SH修饰、3’-Poly T(A、C或G)修饰和3’-生物素修饰等。
所述探针可以有一条或几条，甚至全部都是经过标记的，所述标记包括荧光素标记、生物素标记、放射性元素标记、酶标记和荧光共振能量转移标记。
在本发明的另一方面，提供了一种上述芯片的使用方法，包括如下步骤：
(1)在固相载体表面点载与待测高血压及血管病变疾病风险相关基因的核苷酸序列和/或其互补序列进行杂交的探针；
(2)抽提待测样品的核酸；
(3)制备待测高血压及血管病变相关基因的目的核苷酸序列；
(4)标记步骤(3)的目的核苷酸序列；
(5)在适于与步骤(1)所述的点载在固相载体上的探针进行杂交的条件下，加入经标记的目的核苷酸序列，并使其反应足够时间；
(6)检测杂交反应的结果。
在本发明的另一方面，还提供了一种上述芯片的另一种使用方法，包括如下步骤：
(1)标记与待测高血压及血管病变相关基因的核苷酸序列和/或其互补序列进行杂交的探针；
(2)抽提待测样品的核酸；
(3)制备待测高血压及血管病变相关基因的目的核苷酸序列；
(4)在固相载体表面点载步骤(3)所述的目的核苷酸序列；
(5)在适于与步骤(4)所述的点载在固相载体上的目的核苷酸序列进行杂交的条件下，加入经标记的探针，并使其反应足够时间；
(6)检测杂交反应的结果。
所述目的核苷酸序列的制备可包括扩增的步骤，用分离的靶样本中含核酸的细胞直接扩增，也可用抽提的靶核酸直接扩增。如用磁珠从全血中分离白细胞，直接用分离的白细胞或用全血抽提的核酸作模板，扩增目的核酸序列。扩增得到的单链或双链的DNA或RNA可含有荧光或生物素标记，标记的DNA或RNA可不经纯化直接用于杂交。与本发明中所述芯片杂交的优选靶核苷酸分子是单链核酸分子，双链核酸分子经过变性等处理后也于本发明所述芯片杂交。
目的核苷酸序列可使用任何适当的扩增方法进行富集，如：聚合酶链反应(polymerase chain reaction，PCR)，多重PCR，连接酶链反应(ligase chain reaction，LCR)，滚环扩增(rolling cycle amplification，RCA)，基于核酸序列的扩增(nucleic acid sequence-basedamplification，NASBA)，链置换扩增(strand displacementamplification，SDA)和转录介导的扩增(transcription medicatedamplification，TMA)等。
在本发明的一个实施例中，目的核苷酸序列的制备采用PCR扩增方法，该方法所用引物含有SEQ ID NO：55～SEQ ID NO：90所示序列的核苷酸链或其互补链。
所述探针或目的核苷酸序列都适合用于标记。探针在合成引入标记，目的核苷酸序列可以在扩增中引入标记，或者扩增后用合适的方法引入标记。
合适的标记包括荧光标记、放射性同位素标记、发色团、发光体、FRET、酶、生物素或有特殊结合配体的配基。
本发明方法的杂交可在任何适当的温度下进行，如25℃～65℃，所述杂交时间为2分钟～18小时。可以改变杂交条件以提高或降低杂交的严谨程度、杂交特异性。
本发明高血压及血管病变的疾病风险检测芯片及其应用，使医务人员及时掌握高血压等心脑血管疾病患者大量遗传信息，并指导其合理用药，实现个体化医疗，提高治疗的有效性和减少药物的毒副作用。对于医药企业，本发明的检测芯片可使其选择合适的临床试验人群，从而提高药物疗效，降低药物的无效率和毒副作用，缩短药物的研发周期。
【附图说明】
图1是本发明的实施例1中多重PCR扩增后的电泳检测结果图；
图2是本发明的实施例1中PCR产物片段化后的电泳检测结果图；
图3是本发明实施例1的高血压及血管病变的疾病风险检测芯片的杂交结果图。
【具体实施方式】
下面结合附图和实施例对本发明作进一步详细的说明。
实施例1反向杂交
1.基因芯片的制备
(1)探针溶解
将人工合成的SEQ ID NO：1～SEQ ID NO：54所示序列探针的每条探针用TE溶液稀释，终浓度为10mM。将浓度为10mM的探针与浓度为200mM的PBS溶液于384孔板中等体积混合，以粘胶片封好384孔板，室温下振荡2分钟，离心，-20℃保存，以备点样使用。
(2)点样
将预先设计并合成好的探针通过接触式点样或喷墨式点样点载到玻片、硅片等材质的固相载体片基上。片基采用Cell AssociatesCSS-100醛基片基，GeneMachine公司的Ominigrid 100型号的点样仪，在湿度：65-75％(以FullMoon片基为准)，温度为25℃的条件下点样，点样完毕后，放置半小时后，将芯片取出，室温干燥保存。
2.待测样品的处理和标记
(1)人基因组DNA抽提及目的基因的扩增
采用FlexiGene DNA Kit(250)(QIAGEN，Cat.No.51206)试剂盒抽提人外周血中基因组DNA。取1ul进行电泳(1％琼脂糖凝胶，0.5×TBE，EB，80MV，1.5小时电泳)，在FR-200紫外与可见分析装置上拍摄照片，并对照marker(Lambda DNA/EcoRI+HindIII)进行定量。
用人工合成的OPN的引物(SEQ ID NO：55～76)、ROKα的引物(SEQ ID NO：77～86)、RhoA的引物(SEQ ID NO：87～90)进行目的核苷酸序列的扩增。PCR扩增用30μl反应体系进行，反应体系是0.3mM dNTP、10mM Tris-HCl、50mM KCl、2mM MgCl2、20％Q溶液(Qiagen)、上游和下游引物的浓度0.16μM、基因组DNA 10ng，Taq酶0.6U(Takara)。应用Touch-down PCR反应程序[Don RH，CoxPT，Wainwright BJ，Baker K，Mattick JS.′Touchdown′PCR tocircumvent spurious priming during gene amplification.Nucleic AcidsRes.1991，19：4008]：94℃变性5min；94℃变性40s，64℃退火1min，每个循环降低0.5℃，72℃延伸50s，共10个循环；然后94℃变性40s，59℃退火40s，72℃延伸50s，共30个循环；最后72℃延伸5min。PCR结束后用1.5％琼脂糖凝胶检测扩增结果。
当进行多重PCR反应时，将SEQ ID NO：55～SEQ ID NO：90所示序列的引物放入一个反应体系中进行扩增，体系为50μl。多重PCR的反应体系为：每种dNTP 0.3μmol/L，Tricine-KOH(PH8.7)40mmol/L，KCl 16mmol/L，MgCl23.5mmol/L，BSA 3.75μg/ml，每条引物2μmol/L，DNA 80ng和2.2×Titanium Taq DNA聚合酶(Clontech，USA)。多重PCR反应条件：95℃变性3min；95℃变性30s，66℃退火2min，68℃延伸4min，共40个循环；最后68℃延长10min。PCR扩增后，取3μ1PCR反应产物做琼脂糖凝胶电泳，电泳结果见图1。这些PCR产物经处理后可用于下面的杂交步骤。
(2)PCR产物纯化和片段化
每个样品的所有PCR产物混合，用QIAquick PCR Purification Kit(Qiagen，Cat.No.28106)纯化。纯化的PCR产物经测定浓度后，用DNase I进行片段化。片段化的反应体系包括：30μl纯化PCR产物(10μg)，4μl的10×DNase I缓冲液，0.12μl的DNase I，5.88μl的ddH2O。反应条件为37℃温浴5min，然后95℃15min。片段化后的产物进行4％琼脂糖凝胶电泳，保证绝大多数的片段处于30-200个碱基对，电泳检测结果如图2所示。
(3)荧光素标记
利用脱氧核苷酸转移酶在3’末端进行荧光素标记，标记的40μl反应体系包括：25μl片段化PCR产物，8μl的5×脱氧核苷酸转移酶缓冲液，1μl的CY3-N6-ddCTP(1mM)，3μl的脱氧核苷酸转移酶(20U/μl)，3μl的ddH2O。反应条件为37℃温浴120min，然后95℃加热15min。
3.杂交、洗涤和结果检测
荧光标记的PCR产物95℃变性10min，立即置于冰上，用于杂交，杂交反应20μl体系包括：荧光素标记的PCR产物15μl，20×SSPE 1.2μl，1％Triton 0.2μl，10×Denhandts 0.9μl，甲酰胺0.5μl，ddH2O 2.2μl。反应条件为48℃温浴120min，然后相继用1×洗涤缓冲液I(5×SSC，0.1％SDS)、1×洗涤缓冲液II(2×SSC，0.1％SDS)和1×洗涤缓冲液III(1×SSC)在42℃各洗涤10min，最后用ddH2O洗涤0.5min。
洗涤后的芯片，经甩干后，用GenePix 4000B共聚焦激光扫描仪进行扫描(也可以用其他的激光扫描仪)。扫描杂交后的芯片得到的杂交结果如图3所示，再用GenePix Pro处理图像得到数据文件，然后对数据文件进行分析就可以得到高血压及血管病变的疾病风险结果，从而指导临床医生为患者选择合适的药物和合理的剂量。
如图3，该样本各SNP基因型分别为rs2428127A/GGG，rs11730582T/C CC，rs6839524C/G CG，rs6840362T/C CC，rs7695531A/G AA，rs6811536T/C CC，rs2853750A/G AG，rs11728697T/CTC，rs10516799C/G CC，rs1126772A/G AA，8975T/CTT，rs11693061T/CCC，rs2271621G/T TT，rs978906A/G AA，rs13018466T/CTT，rs9808232G/T GT，rs7621003T/C TT，rs6784820A/G AA。每个SNP的两个碱基，分别代表高血压及血管病变低危险/高危险等位基因。如样本检测后高危险等位基因提示其发生高血压及血管病变的危险性更高。
实施例2 正向杂交
1.高血压及血管病变的疾病风险相关基因的扩增和芯片制备
OPN的引物(SEQ ID NO：55～76)、ROKα的引物(SEQ ID NO：77～86)、RhoA的引物(SEQ ID NO：87～90)扩增基因。PCR扩增用100μl反应体系进行，反应体系是0.3mM dNTP，10mM Tris-HCl，50mM KCl，2mM MgCl2，20％Q溶液(Qiagen)，0.01μM SHV-F，0.2μM SHV-R，100ng基因组DNA，3U Ex Taq酶(Takara)。循环参数：94℃变性5min；94℃变性40s，65℃退火1min，72℃延伸1min，共40个循环；最后72℃延伸5min。PCR产物用QIAquick PCRPurification Kit(Qiagen，Cat.No.28106)纯化。将纯化的PCR产物浓度调整至400ng/μl。
将浓度为400ng/μl的PCR产物与100％的DMSO于384孔板中等体积混合，以粘胶片封好384孔板，室温下振荡2分钟，离心。将200ng/μl的PCR产物通过接触式点样或喷墨式点样点载到玻片、硅片等材质的固相载体片基上。采用GeneMachine公司的Ominigrid100型号的点样仪，在湿度：65-75％(以FullMoon片基为准)，温度为25℃的条件下点样，点样完毕放置半小时后，将芯片放于饱和食盐水盒中，37℃水化过夜，次日取出，600mJ交联，交联完毕之芯片即可使用。
2.芯片杂交
杂交反应体系包括：2nM荧光标记的寡核苷酸探针(SEQ IDNO：1～SEQ ID NO：54)，1.2μl 20×SSPE，0.2μl 1％Triton，0.9μl 10×Denhandts，0.5μl甲酰胺，2.2μl ddH2O。反应条件为50℃温浴2小时，然后相继用1×洗涤缓冲液I(5×SSC，0.1％SDS)、1×洗涤缓冲液II(2×SSC，0.1％SDS)和1×洗涤缓冲液III(1×SSC)在42℃各洗涤10min，最后用ddH2O洗涤10秒。洗涤后的芯片，经甩干后，用GenePix 4000B共聚焦激光扫描仪进行扫描(也可以用其他的激光扫描仪)。
【序列表】
<110>上海市高血压研究所
<120>高血压及血管病变疾病风险的遗传学检测芯片及其用途
<130>D108-2052-XC37
<160>90
<170>PatentIn version 3.3
<210>1
<211>25
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<210>36
<211>25
<212>DNA
<213>人工序列
<400>36
ttttcaggag ggaagagaac taaac 25
<210>37
<211>25
<212>DNA
<213>人工序列
<400>37
ttttctataa aaaagtttga ataaa 25
<210>38
<211>25
<212>DNA
<213>人工序列
<400>38
ttttctataa aaaattttga ataaa 25
<210>39
<211>25
<212>DNA
<213>人工序列
<400>39
ttttctataa aaaactttga ataaa 25
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<211>25
<212>DNA
<213>人工序列
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tttttcacac tacaatgcac acaag 25
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<211>25
<212>DNA
<213>人工序列
<400>41
tttttcacac tacagtgcac acaag 25
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<211>25
<212>DNA
<213>人工序列
<400>42
tttttcacac tacactgcac acaag 25
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<211>25
<212>DNA
<213>人工序列
<400>43
ttttccttgc ttaatatgga acgtt 25
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<211>25
<212>DNA
<213>人工序列
<400>44
ttttccttgc ttaacatgga acgtt 25
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<211>25
<212>DNA
<213>人工序列
<400>45
ttttccttgc ttaagatgga acgtt 25
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<211>25
<212>DNA
<213>人工序列
<400>46
tttttatgga atcagtttct ctaca 25
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<211>25
<212>DNA
<213>人工序列
<400>47
tttttatgga atcattttct ctaca 25
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<212>DNA
<213>人工序列
<400>48
tttttatgga atcactttct ctaca 25
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<212>DNA
<213>人工序列
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ttttagaggg cttttaggac agaaa 25
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<211>25
<212>DNA
<213>人工序列
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<211>25
<212>DNA
<213>人工序列
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ttttagaggg ctttgaggac agaaa 25
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<211>25
<212>DNA
<213>人工序列
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tttttcctga gcacattgac ctcat 25
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<211>25
<212>DNA
<213>人工序列
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tttttcctga gcacgttgac ctcat 25
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<211>25
<212>DNA
<213>人工序列
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tttttcctga gcaccttgac ctcat 25
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<213>人工序列
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<212>DNA
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ttagtgagcg 10