一种双歧杆菌受体细胞的电转化方法及使用的改进液体培养基 【技术领域】
本发明涉及一种受体细胞的电转化方法及使用的改进液体培养基，具体涉及一种双歧杆菌受体细胞的电转化方法及使用的改进液体培养基。
背景技术
双歧杆菌是存在于自然界的有益微生物，它具有维持肠道微生物平衡的保健功能和防治疾病的作用，同时还具有无污染，无抗药性和无残留等优点。在可克服长期大量使用抗生素所造成的微生态失调、抗药性及药物残留等副作用方面有重要应用价值。
1906年Tisser在法国首先用培养的双歧杆菌治疗婴儿腹泻。其后，有人用它制作婴儿食品，并且将含促生长剂的双歧杆菌奶喂养营养不良或营养失调的婴儿。1948年该菌在德国用于生产婴儿食品，1968年开始大量商业性生产发酵乳。1983年后相继在法国、日本、瑞士、德国等生产药物制剂，主要用于治疗胃肠功能紊乱，有的还用于治疗某些肝病、防治肿瘤。国内已将双歧杆菌和其他菌株混合制作液体制剂，多作为营养保健口服液。经实验研究和临床证明，具有一定的治疗和保健作用。
益生菌在人和动物的疾病特别是肠道感染和肿瘤的防治中起着重要的作用，并且通过多种途径弥补了抗生素和疫苗的不足，为人类的健康和获得安全的食品开辟了新的途径。但是对益生菌的作用机理研究仍然存在的许多问题，特别是益生菌免疫协同作用。
随着研究水平的提高，现今人们对研究益生菌作用机理的研究方法已集中在分子生物学水平，试图通过基因工程手段，获得基因工程益生菌。例如把致病菌的保护性抗原克隆到双歧杆菌中，利用它直接刺激机体的免疫系统，同时还可以增强益生菌对酸的抵抗力，使益生菌通过胃后有更高的存活率，从而进入肠道发挥免疫功能。在基因工程益生菌的研究过程中，如何提高外源性基因的表达水平是研究改造双歧杆菌的关键。重组DNA转化不同细菌有不同的转化效率，转化效率的高低与受体菌的感受态以及具体的转化方法有密切的关系。
所谓感受态，就是细菌具有吸收周围环境中的DNA的生理状态。关于感受态的本质与存在，说法很多，目前主要两种假设：1、局部原生质体化假说，即认为是由于细菌表面的细胞壁结构发生变化——局部失去细胞壁或局部溶解细胞壁，使DNA分子能通过细胞膜进入细胞；2、酶受体假说，认为感受态细胞的表面形成一种能接受DNA的酶位点，使DNA分子能进入细胞。而只有感受态的细胞才能稳定地收取外源DNA分子。而且感受态是在短暂时间内发生地。一般出现在细菌对数生长的后期。作为基因工程的受体菌必须是基因重组缺陷突变体，必须能同外来DNA分子发生遗传重组，同时它们又必须是限制系统缺陷或限制与修饰系统均缺陷的菌株，使外来基因(DNA)不受其限制酶的降解，这样才能进行遗传操作。受体菌的感受态往往通过各种化学试剂的处理而获得。DNA分子转化的复杂过程如下：
1、吸附：完整的双链DNA分子吸附在受体菌的表面；
2、转入：双链DNA分子解链。单链DNA分子进入受体菌，另一条链被降解；
3、自稳：外源质粒DNA分子在受体菌内又复制成双链环状DNA；
4、表达：外源基因随同复制子同时复制，并被转录翻译。
对DNA分子来说，成功转化的比率极小，仅占DNA分子的0.01％。体外连接的DNA重组分子导入合适的受体细胞才能大量增殖。为了提高受体菌摄取外源DNA的能力，提高转化效率以获得更多的转化子，人们摸索出了不同地方法处理细菌，使其处于感受态。目前主要采用电转化法和CaCl2法将外源DNA导入受体细胞中，并需要相应地制备电转化感受态细胞和CaCl2感受态细胞。
电转化法是利用瞬间高压在细胞上打孔，因而需用冰冷的超纯水多次洗涤处于对数生长前期的细胞，以使细胞悬浮液中应含有尽量少的导电离子。转化效率为105～1010转化子。人们研究双歧杆菌的电转化方法已经有较长的时间了，但是相关的成功转化方法报道很少，国内外至今没有见到特殊的电转化方法的报道。
【发明内容】
本发明的目的在于提供一种双歧杆菌受体细胞的电转化方法及使用的改进液体培养基，其解决了背景技术中电转化效率低的技术问题。
本发明的技术解决方案是：
一种双歧杆菌受体细胞的电转化方法，其特殊之处在于，该方法包括以下步骤：
1)将双歧杆菌细胞处理成双歧杆菌感受态细胞；
2)将双歧杆菌感受态细胞进行电转化前处理
将感受态细胞放入含有0.8～1.5mM柠檬酸铵以及0.5～0.6M蔗糖的电转化缓冲液中，在4℃条件下培养4～12h；
3)双歧杆菌感受态细胞电转化
i.分别取多个80μl上述步骤2)培养后的感受态细胞悬液，分别加入0.5μg质粒DNA，体积不超过5μl；
ii.混合后，转入预冷0～4℃的0.2cm的电击杯中，并轻敲电击杯，使混合物沉入电击杯底，在电转化仪上进行转化，所述电转化参数条件是电压12kV/cm-1、电容25μF以及电阻200欧；
iii.电穿孔后立即向上述管中分别加入0.8mL温度在37℃含有0.4～0.6M蔗糖以及体积百分比为0.04％～0.05％半胱氨酸的液体培养基CM149，使总体积到0.9mL，摇匀后于37℃厌氧培养，使受体菌恢复正常生长状态，并使转化体表达抗生素基因产物，电转化结束。
上述将双歧杆菌细胞处理成双歧杆菌感受态细胞的方法具体是：
i.从新活化的双歧杆菌的菌平板上挑取一单菌落，接种于3～5mL液体培养基CM149中，37℃厌氧培养10～14h，直至对数生长期，将该菌悬液以1∶50～1∶25转接于100mL含有0.4～0.6M蔗糖以及体积百分比为0.04％～0.05％半胱氨酸的液体培养基CM149中，37℃扩大培养10～12h，再将该菌悬液以1∶50～1∶25转接于100mL含有0.4～0.6M蔗糖以及体积百分比为0.04％～0.05％半胱氨酸的液体培养基CM149中，37℃扩大培养4～6h，至吸光值OD695nm≤0.2时停止培养；
ii.每组取培养液2个1.5mL转入1.5mL离心管中，在冰上冷却20～30min，于温度4℃、转速6000r/min的条件下离心15min，再清洗两次；
iii.倒净上清培养液，用放置在冰上进行冷却处理的1mL的0.5～0.6mol/L蔗糖溶液悬浮细胞，冰浴；
iv.再在温度为0～4℃，转数6000r/min的条件下，离心15min；
v.弃去上清液，用放置在冰上进行冷却处理的500μl的0.5～0.6mol/L的蔗糖溶液悬浮细胞，再重复步骤iv；
vi.弃去上清液，用放置在冰上进行冷却处理的100μl的0.5～0.6mol/L的蔗糖溶液悬浮细胞，冰上放置片刻后，制备好感受态细胞。
上述电转化缓冲液以含有1.1mM柠檬酸铵以及0.55M蔗糖的电转化缓冲液为佳。
一种双歧杆菌受体细胞的电转化使用的改进液体培养基，包括标准液体培养基CM149，其特殊之处在于：还包括0.4～0.6M蔗糖以及体积百分比为0.04％～0.05％半胱氨酸。
上述蔗糖以0.55M为佳；上述半胱氨酸体积百分比以0.05％为佳。
其中感受态细胞可直接用于转化实验，也可加入占总体积15％左右高压灭菌过的甘油，混匀后分装于1.5mL离心管中，置于-70℃条件下，可保存半年至一年。
本发明的优点在于：此方法大大提高了双歧杆菌受体细胞成功电转化的几率，而且电转化的效率也有很大提高，可以达到每微克有105以上的转化菌落。
【具体实施方式】
一种双歧杆菌受体细胞的电转化方法，该方法包括以下步骤：
1)将双歧杆菌细胞处理成双歧杆菌感受态细胞；具体是
i.从新活化的双歧杆菌的菌平板上挑取一单菌落，接种于3～5mL液体培养基CM149中，37℃厌氧培养10～14h，直至对数生长期，将该菌悬液以1∶50～1∶25转接于100mL含有0.55M蔗糖以及体积百分比为0.05％半胱氨酸的液体培养基CM149中，37℃扩大培养10～12h，再将该菌悬液以1∶50～1∶25转接于100mL含有0.55M蔗糖以及体积百分比为0.05％半胱氨酸的液体培养基CM149中，37℃扩大培养4～6h，至吸光值OD695nm≤0.2时停止培养；
ii.每组取培养液2个1.5mL转入1.5mL离心管中，在冰上冷却20～30min，于温度4℃、转速6000r/min的条件下离心15min，再清洗两次；
iii.倒净上清培养液，用放置在冰上进行冷却处理的1mL的0.5～0.6mol/L蔗糖溶液悬浮细胞，冰浴；
iv.再在温度为0～4℃，转数6000r/min的条件下，离心15min；
v.弃去上清液，用放置在冰上进行冷却处理的500μl的0.5～0.6mol/L的蔗糖溶液悬浮细胞，再重复步骤iv；
vi.弃去上清液，用放置在冰上进行冷却处理的100μl的0.5～0.6mol/L的蔗糖溶液悬浮细胞，冰上放置片刻后，制备好感受态细胞。
2)将双歧杆菌感受态细胞进行电转化前处理
将感受态细胞放入含有1.1mM柠檬酸铵以及0.55M蔗糖的电转化缓冲液中，在4℃条件下培养4～12h；
3)双歧杆菌感受态细胞电转化
i.分别取多个80μl上述步骤2)培养后的感受态细胞悬液，分别加入0.5μg质粒DNA，体积不超过5μl；
ii.混合后，转入预冷0～4℃的0.2cm的电击杯中，并轻敲电击杯，使混合物沉入电击杯底，在电转化仪上进行转化，所述电转化参数条件是电压12kV/cm-1、电容25μF以及电阻200欧；
iii.电穿孔后立即向上述管中分别加入0.8mL温度在37℃含有0.55M蔗糖以及体积百分比为0.05％半胱氨酸的液体培养基CM149，使总体积到0.9mL，摇匀后于37℃厌氧培养，使受体菌恢复正常生长状态，并使转化体表达抗生素基因产物，电转化结束。
一种双歧杆菌受体细胞的电转化使用的改进液体培养基，包括标准液体培养基CM149，还包括0.4～0.6M蔗糖以及体积百分比为0.04％～0.05％半胱氨酸，其中以包括0.55M蔗糖以及体积百分比为0.05％半胱氨酸为最佳。