快速、简便分离、筛选产L多巴LDOPA菌株的方法.pdf

本发明属于从微生物的培养介质中分离微生物的方法（国际专利分类号为：C12N1/02）。
    L-多巴（L-Dopa）是预防、治疗帕金森氏病、震颤性麻痹综合症、一氧化碳中毒、锰中毒等病症的有效药物。现在，可以从野生植物藜豆中提取、化学合成等途径制取此药。但这些方法原料来源有限、工艺复杂、产率低、成本高。用微生物发酵催化L-酪氨酸合成L-多巴，其优越性是工艺简单，经济合算，适于工业化大生产，因此，必须获得高产L-多巴的菌株，但用常规方法分离筛选产L-多巴菌株，不仅手续繁杂，时间长，而且很难得到产L-多巴的菌株。

    本发明的目的是创造一种快速、简便的方法，能分离、筛选到产L-多巴的菌株。

    为达上述目的，本发明的技术解决方案是，采取十字花科植物的根系土壤，将所采土壤与适量的无菌生理盐水混匀，然后再用无菌生理盐水按10倍稀释，取上述处理好的样品涂布在选择培养基上，在24℃～30℃温度下培养3～7天，得到单个菌落。该选择培养基的组成如下：

    蛋白胨    10～20克

    NaCl    2～5克

    CaCl20.1～0.5克

    吐温80（或吐温60，或土温20）    10～20毫升

    蔗糖    1～4克

    琼脂    15克

    水    1，000毫升

    该选择培养基的pH值为7.0，15磅20分钟灭菌。选择革兰氏阴性，有沉淀环地单个黄色菌落，对所选菌落进行产L-多巴的检测。首先进行定性检测，然后再进行定量检测。定性检测和定量检测的检测方法是已知的。定性检测：将菌落用无菌生理盐水稀释，涂布在检测培养基上（葡萄糖20克，蛋白胨10克，L-酪氨酸2克，（NH4）2SO45克，MgSO4·7H2O 0.2克，乳酸亚铁0.5克，琼脂15克，水1000毫升，pH6.5），培养在28℃，5天，挑选出产黑色素的菌落。再进行这些菌产L-多巴的定量检测。定量检测：将菌接入种子培养基（葡萄糖1.51.5克，NaCl15克，蛋白胨6克，牛肉膏6克，酵母膏3克，pH7.0），30℃震荡培养24小时，以1/20的接种量接入发酵培养基（葡萄糖15克，（NH4）2SO42.3克，K2HPO41克，MgSO4·7H2O 0.56克，CaCO33克，玉米浆20克，pH7.0），28℃震荡培养48小时，加入L-酪酸酸和抗坏血酸并调pH到5.5，L-酪氨酸和抗坏血酸可分多次加入，最后浓度分别为8.6克/升和5克/升，最后一次加入后，继续培养15～20小时，将发酵液离心（5000转/分钟）10分钟，然后测定上清液的L-多巴含量。具体方法是：取1毫升待测液，加入1毫升0.5NHCl溶液混匀，再加入亚硝酸盐-钼酸盐试剂（10克亚硝酸钠和10克钼酸钠溶解于100毫升蒸馏水中）1毫升，再加入1毫升1N NaOH，显出红色则含有L-多巴，在530nm时，测定其0，D值与用同样方法测蒸馏水（使成酸性）制成的L-多巴含量的标准曲线比较，则可查到发酵液所含L-多巴的量。

    本发明完成一个工艺流程所需时间不超过16天，而常规分离、筛选方法要花一月左右的时间，还不一定能筛选到产L-多巴的菌株;本发明采样位置准确可靠，能筛选到产L-多巴菌株;本发明所设计的选择培养基，所规定的选择菌落的指标以及对所选菌落相继进行定性、定量检测，为筛选到产L-多巴菌株提供了可靠的保证;本发明的工艺流程不仅简便易行，比常规方法可靠，而且效果显著，本发明人曾从10个样品中筛选到8株转化L-多巴的菌种，转化率达60～97%，最好的一株株能将8.6克/升L-酪氨酸催化合成8.4克/升L-多巴，转化率达97%。

    下面是本发明的具体实施例：

    用采样器采取白菜的根系土壤，装入无菌平皿，取其中10克土壤用90毫升无菌生理盐水，在捣粹机（40，000转/分钟）中混匀一分钟，然后再用无菌生理盐水按10倍稀释，取样涂布在选择培养基上，选择培养基的最佳配方是：蔗糖2克，蛋白胨12克，NaCl5克，CaCl20.2克，吐温80，10毫升，琼脂15克，水1，000毫升。该选择培养基的pH值为7.0，15磅、20分钟灭菌。培养在28℃，5天，选择革兰氏阴性，有沉淀环的单个黄色菌溶，进行产L-多巴的检测。先进行定性检测。再进行定量检测，检测方法如本发明的技术方案部分所述。从该样品中分离筛选到一株产L-多巴的菌株，转化8.6克/升L-酪氨酸成7.8克/升L-多巴，转化率达90%。