载脂蛋白ASUB1/SUB，A2高压液相色谱仪.pdf

本发明涉及一种液相色谱仪分离物质的方法，是医学界用于载脂蛋白A₁、A₂（APOA₁、APOA₂）的高压液相色谱仪（HPLC）分离方法。
    近年来，各国医学界对载脂蛋白的研究十分活跃，因为它影响到脂蛋白的合成、分泌和代谢，其测定、分离又对冠心病的预防、诊断和治疗，具有重要的临床价值，所以正受到人们的高度重视和关注。

    自一九八三年日本学者首次提出使用高压液相色谱仪分离载脂蛋白以来，迄今为止用该法测定APOA₁、APOA₂均采用连续漂浮超速离心法，即将经过多次超速离心（转速在5万转/分以上）的血清HDL上清液进行过滤后，再与洗脱液充分混合，在60℃温度下加热5分钟，而后注入高压液相色谱仪，分离出APOA₁、APOA₂，但目前这种测定方法仍停留在研究室中未能全面推广，其主要原因是血清在进入高压液相分析柱前必须先由超速离心机分离为HDL、LDL、VLDL，再分别进样，这一步骤需要仪器昂贵（仅超速离心机的价格就为5万美元/台），耗时长（54-72小时），手续复杂，又因血清离心后的上清液与沉淀物液相界面不清晰，故脂蛋白提取不完全，这对测定精度有一定的影响。

    本发明的目的在于：利用APOA₁、APOA₂热凝固点高于血清中其它蛋白的温度差，建立一种采用加热法沉淀其它蛋白，经普通离心后的上清液直接进样，一次即可分离APOA₁、APOA₂的HPLC分离法。本发明将比原连续漂浮超速离心法对其它蛋白沉淀更加完全，测定精度更高，由于简化了操作手续，故采用普通离心即可完成进一步的分离，且测定时间短，投资费用低。

    本发明是这样实现的：将装在密封试管中的血清标本，首先在沸水中加热，取其经离心、过滤的上清液与洗脱液充分混合后，直接注入HPLC，一次分离APOA₁、APOA₂，洗脱液由0.05mol/l（基质水）Na₂SO₄、0.02mol/l（基质水）NaH₂PO₄、0.1%SDS（十二烷基磺酸钠）、（W/W）、0.05%NaN₂（W/W）组成，其pH＝6.8。

    本发明使用的仪器：

    1.高压液相柱包括BiO-Sil    TSK预柱75×7.5mm，Bil-Sil    TSK250凝胶分离柱300×7.5mm，Bil-Sil    TSK400凝胶分离柱300×7.5mm，上述三柱连接使用。

    2.高压液相仪：为色谱分析通用仪器，它有501高压液相泵，715资料处理仪，481分光光度仪，实验室用普通离心机。

    试剂与标准：

    用于凝胶分离柱分子量试剂为纯APOA₁标准品、纯APOA₂标准品。

    操作步骤：

    血清在沸水中（100℃）加热5分钟，然后经4000转（11600g）离心10分钟，其上清液经0.22mm过滤片过滤后与洗脱液充分混合，直接注入分离柱，过柱后使用紫外可见光检测测器，波长（A）280mm，流速1-2ml/分，用纯APOA₁、APOA₂标准品作外标定量。

    附图说明：

    图1、对数分子量和保留时间曲线

    图2、纯APOA₁、APOA₂高压液相图谱

    图3、HDL高压液相图谱

    图4、血清加热100℃、5分钟，上清液高压液相图谱

    图5、APOA₁加入量和测得浓度相关关系图。

    图6、APOA₂加入量和实测浓度相关关系图。

    相同条件下，利用分子量标准品以对数分子量为纵坐标，保留时间为横坐标，标出两者线性关系图（如图1曲线所示），现将图1中的标号分述如下（表一）：

    表一：

    标号    分子量    对数    保留时间

    A₁： （道尔顿） 分子量 （分）

    （甲状腺球蛋白）    670000    5.826    11.491

    A₂：

    （r-球蛋白）    158000    5.198    15.081

    A₃：

    牛白蛋白    44000    4.68    17.475

    A₄：

    肌球蛋白    17000    4.23    19.441

    A₅：

    VitB₁₂1350 3.13 27.608

    X₁：

    APOA₁28000 4.45 17.95

    X₃：

    APOA₂17000 4.23 19.44

    APOA₁标准分子量为28000（道尔顿）、APOA₂标准分子量为17000（道尔顿），该两物质在上述液相条件下理论出峰时间（保留时间）应分别为18分钟和20分钟左右。

    对比法：分别对纯APOA₁、APOA₂的高压液相图谱（图2）、HDL高压液相图谱（图3）、血清APOA₁、APOA₂高压液相图谱（图4）进行对照，其图形相似，且保留时间均为18和20分钟左右。（见表二）

    表二

    保留时间（出峰时间）

    图谱名称 APOA₁APOA₂

    纯APOA₁、APOA₂18.138分 20.168分

    高压液相图谱

    HDL高压液相图谱    18.837分    20.170分

    血清加热100℃

    5分钟上清液APOA₁、 18.064分 20.410分

    APOA₂高压液相图谱

    免疫扩散法：用血清经本发明分离法在高压液相色谱仪中保留时间为18分钟和20分钟时的提取液，经浓缩滴入RIM APOA免疫扩散药盒后，它们均呈阳性反应，18分钟时提取液在RIM APOA₁免疫扩散药盒中呈阳性反应，20分钟时提取液在RIM APOA₁免疫扩散药盒中呈阴性反应。该免疫扩散法可证明在18分钟和20分钟保留时间的提取液中均存在APOA成份，其中18分钟提取液为APOA₁，而20分钟提取液中可能是APOA₂。

    回吸收率试验：

    （1）、分别在三个试管中各加入血清AIML，第一管中加入洗脱液150μl，第二管加入APOA₁（200μg/dI）150μl，第三管中加入APOA₂（100μg/dI）150μl，100℃加热5分钟后进样，其结果见纯APOA₁、APOA₂标准试剂回收率表格（表三）。

    表三：

    APOA₁μg/dI APOA₂μg/dI

    实际值    预期值    实际值    预期值

    回吸收率    回吸收率

    血清AIML+

    洗脱液150    17329    9131

    μl

    血清AIML+

    APOA₁207.87 199.37 104.26%

    （200μg/dI）

    ×150μl

    血清AIML+

    APOA₂

    （100μg/dI）    105.45    104.36    101.07%

    ×150μl

    其APOA₁的回吸收率为104.26%，APOA₂的回吸收率为101.04%。

    （2）用任一血清B的APOA₁、APOA₂作为“标准血清”，并以各种比例加入另一血清C，其测定结果见血清B加入各种比例血清C回收率表格（表四）。

    如按表四数值将APOA₁、APOA₂加入量为纵轴，实际测得APOA₁、APOA₂浓度为横轴，可以画出两条相关曲线，APOA₁曲线r＝0.999，y＝70.03+0.766X（图5），APOA₂曲线r＝0.991，y＝30.88+0.691X（图6）。

    精密度试验：

    同一份样品分成10管同样处理和进样，APOA₁的结果为192.1±1.68μg/dl，变异系数为0.88%，APOA₂结果为93.4±1.52μg/dl，变异系数为1.63%（见表五）。

    表五：

    试管序号 APOA₁mg/dl APOA₁mg/dl

    1    191.2    93.3

    2    190.6    92.8

    3    190.7    91.6

    4    191.4    91.2

    5    191.2    93.0

    6    192.0    93.8

    7    191.3    93.3

    8    192.7    94.5

    9    195.4    95.4

    10    194.8    95.8

    结果    192.1    93.4

    误差    ±1.68    ±1.52

    变异系数    0.88%    1.63%

    用高压液相色谱仪分离血清载脂蛋白必须解决二个问题：

    一是血中含有大量蛋白，特别是球蛋白，其分子量从10000-40000左右，且浓度远高于APOA₁、APOA₂，如果用血清直接进样，APOA₁、APOA₂峰值将被高浓度球蛋白所掩盖，无法定性、定量。如前所述采用超高速离心提取HDL、LDL、VLDL同时离心掉多余蛋白，但仪器昂贵、手续复杂。本发明采用加热法，经离心后亦能除去绝大部分的血清蛋白，仅存下APOA₁、APOA₂液相图象清晰，无干扰，便于定量，用加热后的血清蛋白电泳也证实了这一点。回吸收率试验表明，加热对APOA₁、APOA₂含量无甚影响，其方法简便。

    二是APOA₁、APOA₂在血清中和脂肪结合，如有脂肪同时进入分离柱，必然影响结果，日本学者用加热60℃法脱脂并认为效果理想。本发明用加热血清至100℃脱脂更完全。

    本发明人用加热后血清进行蛋白电泳，然后再用脂肪红7B染色（Faf    Rad7B）证明去脂完全，即加热100℃不仅去除蛋白，同时起到脱脂作用，一举两得，可获得理想结果。

    在实验方法时，使用过多种不同洗脱液，如6M尿素、洗脱液浓度太高难以完成溶解，无法实际使用。0.1M磷酸洗脱液效果理想，但易造成柱内结晶沉淀影响柱效和柱寿命。本法选用0.2M磷酸二氢钠和0.05M硫酸二钠，加入0.1%S·D·S（十二烷基磺酸钠）后，峰形改善，为了防腐，洗脱液中加入0.1%NaN₂。各不同的pH值，APOA₁、APOA₂峰面积比例有所变化，根据纯APOA₁、APOA₂标准品，以pH＝6.8时两者峰面积比例接近于加入标准品的比例。

    TSK250适用分子量1000-20000蛋白质分离，TSK400适用于分子量5000-40000蛋白质分离，两柱子联用效果较单根柱子为好，其洗脱液流速为1ml/分，温度常温。

    全部过程约在30分钟内完成。

    发明人对60℃～100℃不同加热血清温度和自3分-10分钟不同时间进行了试验，发现100℃时去蛋白效应最佳且易掌握，加热时间亦以5分钟为最佳。

    综上所述，利用加热法处理血清标本，其上清液再由HPLC分析，可分离出APOA₁、APOA₂其方法简便易行，回吸收率及重复性好。便于在临床实验室推广，本分离法原理可完全用于APOA₁、APOA₂的测定和制备，其不同点仅在于高压液相泵的容量及分离柱的内径有所差别，其分离步骤是一致的。

    目前从国外进口1mgAPOA₁约117美元，APOA₂约145美元，本发明的实现可为国家节约大量外汇，并能争取向国外输出，如从100ml血清（人民币80元）中就可提出APOA₁121mg，APOA₂37mg，由此可见，采用本发明的分离法，其APOA₁、APOA₂的提取成本将比连续漂浮超速离心法成本大大降低，因此，本发明进一步促进了冠心病的预防、诊断和治疗的临床工作。

    APOA₁μg/dl APOA₂μg/dl

    实测值    理论值    回收率%    实测值    理论值    回收率%

    血清B    116.13    47.85

    血清C    115.69    35.92

    血清BIML+血清C100μl    79.06    85.13    92.87    33.85    34.29    98.72

    +洗脱液400μl

    血清BIML+血清C200μl    87.12    92.84    93.84    35.60    36.99    97.30

    +洗脱液300μl

    血清BIML+血清C300μl    97.21    100.56    96.67    37.54    39.08    96.06

    +洗脱液200μl

    血清BIML+血清C400μl    105.48    108.57    97.42    40.99    41.48    98.82

    +洗脱液100μl

    血清BIML+血清C500μl    114.20    116.20    98.40    43.58    43.87    99.30