本发明是关于水溶性呫吨鎓衍生物底物，其合成方法以及这类合成底物在测定单独或以彼此结合形式存在的蛋白酶、抑制剂、辅助因子、活化剂和阻活剂之活性方面的应用。 如Leytus等人所报导的〔详见Biochem.Journal 209：299-307（1983）和Biochem.Journal215：253-260（1983）〕，此前已将合成的若丹明110（rhodamine 110）衍生物底物用于荧光测定蛋白酶活性。Leytus等人的这种底物与先前报导的底物相比较，对于测定酶活性具有极好的敏感性。然而也发现，Leytus等人的若丹明110衍生物底物的水溶性很差，即37℃时溶解度约为120微摩尔，因此必须添加有机溶剂添加剂如二甲基甲酰胺和乙醇，以促进底物溶解。但已了解到，作酶分析时加有机溶剂会干扰分析程序，即会使蛋白变性，降低反应速率以及（或者）引起其它反应物或产物的沉淀，以致不能达到最佳试验效果。
除Leytus等人所公开的底物外，Smith等人（见美国专利4，294，923）公开了一种用于荧光或分光光度法测定生物体液中蛋白水解酶的香豆素衍生物底物。Gargiulo等人（见美国专利4，275，153和4，336，186）公开了用于测定生物学样品中蛋白酶活性的发生荧光的aminoisophalate底物。
本发明涉及用于荧光和分光光度法测定蛋白酶活性的水溶性呫吨鎓衍生物底物-下文称之为若丹明110和若道尔（rhodoe）;因其在工作浓度有较好的水溶性，故不必使用如二甲基甲酰胺和乙醇等有机增溶剂，也就不存在它们在试验过程中产生的干扰作用。此外，水溶性若丹明110和若道尔衍生物底物用于测定蛋白酶活性水平时，较之先有技术中的若丹明110衍生物底物表现有更大的敏感性。鉴于这种增加了的敏感性，所以水溶性若丹明110和若道尔衍生物底物可用于分光光度试验方法;而先有技术的低水溶性若丹明110衍生物底物在用较小体积的样品和底物进行分光光度和萤光法测定时，不能表现足够的敏感度。本发明的水溶性呫吨鎓衍生物底物可用于测定单独或以彼此结合形式存在的蛋白酶、辅助因子、活化剂和阻活剂的活性，特别是用于测定胰蛋白酶样酶的活性。
本发明的一个目的是提供一种带有可被酶水解之侧链的水溶性呫吨鎓衍生物底物的复合物，这样，侧链的水解是与酶活性成正比的。
本发明的另一个目的是提供具有较好水溶性的呫吨鎓衍生物底物。
本发明再一个目的是消除在测定蛋白酶、辅助因子、抑制剂、活化剂和阻活剂，特别是凝血酶形成的分析方法中使用有机溶剂的需要。
本发明还有一个目的，即提供呫吨鎓衍生物，该衍生物用于分光光度及萤光法测定时有足够的敏感性。
本文所述的合成底物及其水解产物在工作浓度下是水溶性的，因此可在不使用有机溶剂添加剂和（或）特殊的水增溶剂的情况下，用于分光光度和萤光测定。这种新的水溶性底物具有下列结构通式，也包括它们的水溶性盐。
其中：
R1是增加水溶性的基团，选自肌氨酰基、焦谷氨酰基和戊二酰基;
R2是呫吨鎓，3′，6′-二氨基-9′-（2-羧苯基）;R3是呫吨鎓，3′-氨基-6′-羟基-9′-（2-羧苯基）。
若丹明110和若道尔的化学结构式如下：
若丹明110 若道尔
由于蛋白酶对这些化合物的敏感度增加，使得能够检测以前已知方法所不易测到的低水平的酶、抑制剂、辅助因子、活化剂和阻活剂;敏感度定义为最小可检测量。经过这些改进，即可使用本发明的新的水溶性若丹明110和若道尔衍生物底物，通过凝血酶原时间（PT）的测定、部分活化的组织促凝血酶原激酶（凝血因子Ⅲ）时间（APTT）的测定和血栓形成试验（TT，thrombotest）来检测凝血酶。
实施例
以下叙述合成水液剂呫吨鎓衍生物底物的方法、分析试验如果及使用这些底物的实施例。下述实施例并不意味着对本发明范围的限定。
除特别指出者外，所使用的所有氨基酸均为L构型。以下实施例中所用缩写符号是：
Arg＝精氨酸
Cbz＝苄氧羰基
DMF＝二甲基甲酰胺
EDAC＝1-乙基-3-（3′-二甲氨丙基）-碳二亚胺HCI
Glt＝戊二酰基
Pro＝醋酸
Pro＝脯氨酸
Pyro＝焦谷氨酰基
Sar＝肌氨酸基
在洗脱液和产物的薄层色谱（TLC）分析中，使用预涂布玻璃板，以硅胶60，254（EM，试剂公司）作吸附介质。展开薄层色谱使用的是下列溶剂体系：
S1＝2-丁酮∶丙酮∶H2O;8∶1∶1（V/V）
S2＝甲醇∶醋酸∶H2O;9∶0.5∶0.5（V/V）
合成底物的合成
水溶性呫吨鎓衍生物底物是通过首先制备结构为（H-L-Pro-Arg）2-若丹明110的呫吨衍生物底物来合成的。（H-L-Pro-Arg）2若丹明110的合成完全按Leytus等人介绍的方法进行。
实施例1
先有技术
步骤Ⅰ：
在搅拌下，将0.96克（2.62毫摩尔）若丹明110溶于400毫升4℃冰溶下冷却的二甲基甲酰胺（DMF）与吡啶的混合物（1∶1，V/V）中，尔后于其中加入25.6克（133.5毫摩尔）EDAC。约搅拌1分钟后，迅速加入溶有11.52克（33.41毫摩尔）Cbz-L-Arg-HCl的96毫升冷DMF∶吡啶（1∶1，V/V）溶液。约24小时后，加1.6升无水乙醚以分离所得产物，随后以10，000g离心约10分钟，形成一种油状产物。将所得油状产物溶于50毫升冷DMF中，并加1.3升冷丙酮使发生沉淀。在10，000g离心分离油状物10分钟。将油状物重新溶于50毫升冷DMF并加500毫升冷的1.2N HCl。以10，000g离心10分钟，分离出一种红色沉淀物。将此红色沉淀物溶于50毫升冷甲醇并加350毫升冷乙酸乙酯使之沉淀。以10，000g离心10分钟收集所得沉淀物，即（Cbz-L-Arg）2-若丹明110。最后一步重复三次。
产量：2.08克（+79.4%）（Cbz-L-Arg）2-若丹明110。
步骤Ⅱ：
将3.4克（3.40毫摩尔）按步骤Ⅰ制备的（Cbz-L-Arg）2-若丹明110溶于75毫升32%HBr-HAc溶液中。所得红色溶液于室温（RT）下搅拌约1小时。加800毫升无水乙醚，离心分离所得产物。离心步骤再重复三次后，将所得褐色固体-（H-L-Arg）2-若丹明110真空干燥16小时。
产量：3.4克（+100%）（H-L-Arg）2-若丹明110。
TLC，S2∶Rf0.09。
步骤Ⅲ：
在搅拌下，将步骤Ⅱ中制备的2.75克（2.79毫摩尔）（H-L-Arg）2-若丹明110溶于在4℃冰结冷却的330毫升DMF∶吡啶（1∶1，V/V）溶液内，然后加入32克（166.9毫摩尔）EDAC。搅拌约1分钟以加速溶解，随后迅速加入溶于60毫升DMF∶吡啶（1∶1）的10.4克（41.7毫摩尔）Cbz-L-脯氨酸的溶液。约24小时后，依步骤Ⅰ的方法分离产物。将所得褐色固体-（Cbz-L-Pro-Arg）2-若丹明110真空干燥16小时。
产量：1.86g（52.0%）（Cbz-L-Pro-Arg）2-若丹明110。
TLC，S2∶Rf0.44。
步骤Ⅳ：
将1.80克（1.40毫摩尔）按步骤Ⅲ制备的（Cbz-L-Pro-Arg）2-若丹明110溶于45毫升32%HBr-HAc溶液内，所得红色溶液在室温（RT）下搅拌约1小时。按步骤Ⅰ所述的方法，加无水乙醚离心分离所得产物。将所得褐色固体-（H-L-Pro-Arg）2-若丹明110真空干燥16小时。
产量：1.90克（+100%）（H-L-Pro-Arg）2-若丹明110。
TLC，S2∶Rf0.03。
实施例Ⅱ
制备（H-Sar-Pro-Arg）2-若丹明110的方法
步骤A：
将按步骤Ⅰ-Ⅳ方法制备的1.90克（1.63毫摩尔）（H-L-Pro-Arg）2-若丹明110溶于190毫升在4℃冰浴中冷却的1∶1的DMF∶吡啶溶液内，然后再加入17.85克（93.1毫摩尔）EDAC。搅拌约1分钟以加速溶解，随后迅速加入5.20克（23.3毫摩尔）Cbz-肌氨酸在40毫升DMF∶吡啶（1∶1）中的溶液。约24小时后，按步骤Ⅰ所述的方法分离所得的产物。将所得粉红色固体-（Cbz-Sar-Pro-Arg）2-若丹明110真空干燥24小时。
产量：1.1克（49.6%）（Cbz-Sar-Pro-Arg）2-若丹明110。
步骤B：
将1.1克（0.78毫摩尔）步骤A中制备的（Cbz-Sar-Pro-Arg）2-若丹明110溶于24毫升32%HBr-HAc溶液中，在室温下搅拌所得深红色溶液约1小时。加入350毫升无水乙醚，离心分离所得产物。此步骤再重复三次后，将所得褐色固体-（H-Sar-Pro-Arg）2-若丹明110真空干燥24小时。
（H-Sar-Pro-Arg）2-若丹明110.5 1/2 氢溴酸盐五水合物的产量为1.00克（84.7%）。
C48H64N14O9·5 1/2 HBr5H2O的元素分析：
计算值，% 实验值，%
C＝38.00 37.84，38.11
H＝5.24 5.17，4.81
N＝12.93 12.69，12.76
Br＝29.03 29.58
TLC，S2∶Rf0.01。
实施例Ⅲ
制备（H-L-Pyro-Pro-Arg）2-若丹明110的方法
步骤A
把380毫克（0.325毫摩尔）按步骤Ⅰ-Ⅳ方法制备的（H-L-Pro-Arg）2-若丹明110溶解于50毫升在冰浴（4℃）中冷却的DMF∶吡啶（1∶1）溶液中，然后于其中加入3.58克（18.62毫摩尔）EDAC。搅拌约1分钟以加速溶解，随后迅速加入溶于11毫升冷DMF∶吡啶（1∶1）的1.23克（4.66毫摩尔）Cbz-L-焦谷氨酸的溶液。约24小时后，按步骤Ⅰ中所述分离所得产物。将所得褐色固体-（Cbz-L-Pyro-Pro-Arg）2-若丹明110真空干燥16小时。
（Cbz-L-Pyro-Pro-Arg）2-若丹明110的产量为278毫克（57.1%）。
步骤B
将78毫克（0.0521毫摩尔）（Cbz-L-Pyro-Pro-Arg）2-若丹明110溶解于3毫升32%的HBr-HAc溶液中，室温搅拌所得红色溶液约1小时。加入75毫克无水乙醚离心分离所得产物。该离心步骤再重复三次后，将所得褐色固体-（H-L-Pyro-Pro-Arg）2-若丹明110真空干燥16小时。
（H-L-Pyro-Pro-Arg）2-若丹明110·4 1/2氢溴化物·5 1/2 水合物的产量为57毫克（71.7%）。
C52H66N14O11·4 1/2 HBr。5 1/2 H2O的元素分析：
计算值，% 实验值，%
C＝40.90 40.54，40.32
H＝5.01 5.08，5.06
N＝12.85 12.55，12.73
Br＝23.60 23.56，
实施例Ⅳ
制备（Glt-Pro-Arg）2-若丹明110的方法
步骤A
把110毫克（0.094毫摩尔）按步骤Ⅰ-Ⅳ制备的（H-L-Pro-Arg）2-若丹明110溶于12毫升冰浴（4℃）中冷却的DMF∶吡啶（1∶1）溶液中，然后加入171毫克（1.5毫摩尔）戊二酸酐。约24小时后，按步骤Ⅰ中所述分离所得产物。将所得褐色固体-（Glt-Pro-Arg）2-若丹明110真空干燥16小时。
（Glt-Pro-Arg）2-若丹明110的产量为118.3毫克（97.5%）。
实施例Ⅴ
制备Cbz-Arg-若道尔的方法
步骤A
在室温搅拌下，将3.5克（0.54毫摩尔）若丹明110溶于25毫升浓硫酸中，然后在约20分钟内缓缓加入700毫克（1.45毫摩尔）亚硝酸钠和10毫升浓硫酸的溶液。约16小时后，将所得混合物倾入250克冰水内。把所得暗红色溶液-重氮化合物-加热至65-70℃并保持约30分钟，有氮气放出。不经冷却即过滤所得浅色溶液。冷却后，过滤所得红褐色絮状沉淀，用少量水洗，在90℃真空干燥16小时。经TLC分析，该红褐色絮状产物-若道尔半硫酸盐（含量）显示为75%。
若道尔半硫酸盐的产量为35克（96%）。
TLC，Si∶Rf0.70。
步骤B
将1.4克（3毫摩尔）若道尔半硫酸盐溶于500毫升冰浴（4℃）冷却的DMF∶吡啶（1∶1）溶液中，然后加入8.98克（75毫摩尔）EDAC的溶液。约搅拌1分钟后，迅速加入溶于60毫升DMF∶吡啶（1∶1）溶液的6.55克（19毫摩尔）Cbz-L-Arg-HCl的溶液。约24小时后，按步骤Ⅰ的方法分离所得产物。将所得带红褐色的固体-Cbz-L-Arg-若道尔真空干燥16小时。
Cbz-L-Arg-若道尔的产量为0.2克（10%）。
TLC，S1∶Rf0.20。
（Sar-Pro-Arg）2-若丹明110
与先有技术中（Cbz-Pro-Arg）2若丹明110的溶解度比较水溶性若丹明110衍生物底物的敏感性提高了的一个实例通过下列数据加以说明：用水溶性底物-（Sar-Pro-Arg）2-若丹明110和先有技术中的低水溶性底物-（Cbz-Pro-Arg）2-若丹明110测定凝血酶的反应速率。所用的试验条件完全相同，包括：温度为37℃，体积为1.0毫升，缓冲液为0.10MAces（PH7.0），含0.05MKCI。因为肌氨酰基（Sar）和苄氧羰基（Cbz）有相似的分子量，故两者的试验浓度均用100微克（μg）/毫升。需使用15%乙醇以促进（Cbz-Pro-Arg）2-若丹明110的溶解。即使加入15%乙醇，Cbz衍生物底物的溶解度在37℃也只能达到120微摩尔。与此相反，37℃时（Sar-Pro-Arg）2-若丹明110的溶解度高达120毫摩尔，即其溶解度增加了一千倍。
吸光率改变，460毫微米/单位凝血酶/毫升
先有技术 本发明
（Cbz-Pro-Arg）2若丹明110 （Bar-Pro-Arg）2-若丹明110
80微摩尔 80微摩尔 80微摩尔
0.122 1.700 2.872
比较先有技术底物与本发明底物的上列数据可见，在摩尔浓度相同时，本发明的水溶性衍生物底物比先有技术中的低水溶性底物敏感14倍以上。使用较高的水溶性底物浓度时，本发明的底物比先有技术的底物敏感24倍以上。
使用水溶性呫吨鎓衍生物底物进行的各种分析
新的水溶性呫吨鎓衍生物底物可用于分光光度和萤光检测法测定蛋白水解酶、抑制剂、辅助因子、活化剂和阻活剂的活性。在基于血纤维蛋白凝固的血凝试验中，该新的水溶性呫吨鎓衍生物底物可代替天然底物-血纤维蛋白原。
为了更充分地了解这一发明，下面举出几个检测实例。
检测实施例
实施例Ⅰ
用（Pyro-Pro-Arg）2-若丹明110对凝血酶
进行分光光度分析
通过测定468毫微米和496毫微米处吸光率的增加，确定三种不同浓度凝血酶的剂量反应曲线。按下述方法制备凝血酶的工作稀释液：将纯化的人α-凝血酶（Dr.John Fenton，N.Y.state Dept.of Health）稀释成PH8.0的含0.25M NaCl的0.05MHEPES中的浓度为1.04单位/毫升、0.52单位/毫升和0.26单位/毫升的各个稀释液，并使各稀释液保持在4℃。将底物（Pyro-Pro-Arg）2-若丹明110溶解为PH8.0的含0.3MKCl的0.20MHEPES中的溶液，其浓度为78微克/毫升。采用光程为1厘米的一次性使用的丙烯酸比色杯（Centaur Siences，Inc.）。用吸管将1毫升等份的底物吸入比色杯内，在一加热装置中加温到37℃。往比色杯内加入1毫升工作凝血酶稀释液的样品。凝血酶与底物混合后，用Hewlett-Packard 8450B型分光光度计测468毫微米和496毫微米处的吸光率（测30秒）。在此确定的时间间隔内增加了吸光率为：
吸光率，0-30秒
凝血酶，单位/毫升 468毫微米 496毫微米
0.26 0.0461 0.0462
0.52 0.0912 0.0860
1.04 0.1766 0.1670
在各波长测得的吸光率与凝血酶浓度间存在一线性关系：
相关系数，γ＝ (468毫微米)/0.9999 (496毫微米)/0.9996
在468毫微米和496毫微米测得的吸光率之间的关系是：相关系数，γ＝0.9998。
上述数据证明，能够在468毫微米或496毫微米波长处测到吸光读数。
实施例Ⅱ
用（Sar-Pro-Arg）2-若丹明110对
凝血因子作萤光分析
用底物（Sar-Pro-Arg）2-若丹明110，基于活化部分组织促凝血酶原激酶时间（APTT）分析，对凝血因子Ⅷ和Ⅸ进行萤光检测。用合成的底物代替存在于人和动物血浆中的天然底物血纤维蛋白原检测凝血酶生成。用正常血浆的测定结果绘出标准校正曲线。该血浆即得自Curtin Matheson Scientific公司的Thromboscreen，TM用于纠正因子Ⅷ和Ⅸ缺乏血浆（George King Biomedical）。APTT试剂包含有纯化的大豆磷脂和鞣花酸活化剂（Dade Diagnostics）。将125微克/毫升的底物样品溶解于含0.05MKCI和5mM CaCl2的0.10MACES中，PH7.0。用具有温控吸收池架（37℃）的Turner 430型分光光度计进行动力学萤光检测。激发和发射波长分别定在468毫微米和525毫微米。用玻璃试管完成血浆活化，并用一次性使用的丙烯酸比色杯进行萤光测定。
在试管内加入100微升等份的0.85%盐水或在盐水中稀释的正常血浆，然后相继加入100微升因子缺乏血浆和100微升APTT试剂。将试管在一加热装置中于37℃保温2分钟，此时向其中加入100微升25mMCaCl2并继续保温30秒钟。将保温混合物转移到含2.0毫升底物溶液（预加温至37℃）的比色杯内，并测定萤光速率。得到因子Ⅷ和Ⅸ的线性剂量反应曲线（正常的1%和100%之间的水平）：
相对萤光＊
血浆稀释度 因子水平，%正常 因子Ⅷ 因子Ⅸ
- ＜1 0.119 0.121
1∶250 1 0.121 0.127
1∶25 10 0.148 0.154
1∶25 100 0.333 0.333
＊除了激发和发射波长分别为350毫微米时外，在同样测定条件下，0.85微克硫酸喹宁/毫升0.1NH2SO4的相对萤光为1.0。
实施例Ⅲ
用（Sar-Pro-Arg）2-若丹明对
血纤维蛋白溶酶原进行分光光度分析
测定血浆样品中链激酶活化的血纤维蛋白溶酶原，将结果与Pochron，S.P.等人的标准萤光分析法（Pochron，S.P.et al，Thrombosis Research 13，733-739，1978）相比较。将得自Hyland Diagnostics公司的冷融的正常柠檬酸化血浆用于分析标准校正曲线的绘制，将链激酶（Calbiochem-Behring公司）在0.02M HEPES中重新配成2000单位/毫升（PH 7.5）。将（Sar-Pro-Arg）2-若丹明110溶解于含0.05MKCL的0.10M ACES（PH 7.0）中，至浓度为375微克/毫升。分析过程是：将每份20毫升血浆样品及50微升H2O加入半微量一次性使用的比色杯（光程1厘米，Evergreen Scientific公司产品）内。在一加热装置中加温至37℃后，向其中加入500微升链激酶溶液并混合之，随后于37℃保温2分钟零48秒。之所以将活化时间定为2分48秒，是因为它是COULTERDACOS化学系统的固定计时增量。在大约2分钟时血纤维蛋白溶酶原完全活化，但活化时间亦可长达15分钟。以后在37℃加入500微升-等份的底物溶液，混合后，使用Hewlett-Packard 8450A型分光光度计于460毫微米波长检测其吸光率，测3分钟。以使链激酶充分发挥活性。与对照血浆检测结果比较，血纤维蛋白溶酶原以%正常值来表示。12份血浆样品的结果，读数为40-140%正常，比与参比分析结果十分相近。比较数据的相关系数为γ＝0.990，最小二乘方程（the least squares equation）按y＝0.956x+4.08计算。
实施例Ⅳ
用（Sar-Pro-Arg）2-若丹明110以分光光度
法测定凝血酶原时间
用凝血酶原时间（PT）用于监测血凝的非固有途径。该试验是将组织促凝血酶原激酶加入血浆样品内，导致凝血因子蛋白酶的活化，以最终形成血纤维蛋白凝块。测定血凝块形成速率，该速率与血浆样品中的非固有凝血因子活性直接相关。在这一试验中，可用合成底物（Sar-Pro-Arg）2-若丹明110代替天然底物-血纤维蛋白原。最后的非固有途径凝血因子-凝血酶是通过合成底物检测的。
底物是在浓度为40μM，PH为7.5的0.05M Aces缓冲液中制得的。以每毫升底物0.05毫升的比例，将组织促凝血酶原激酶加入含底物的缓冲液中，并将混合物加温至37℃。在光程为1厘米的半微量丙烯酸比色杯（Evergreen Scientific公司）内加入25微升血浆样品。在含有血浆样品的比色杯内加入0.5毫升组织促凝血酶原激酶底物混合物，并用Hewlett-Packard 8450A型分光光度计测定496毫微米处吸光率的改变。对56份病人血浆样品-其中包括部分接受了抗凝剂肝素和（或）香豆定（coumadin）的病人的样品-用合成底物进行试验，其结果同血块形成的凝血酶原时间相比较。试验中使用了三种商品组织促凝血酶原激酶试剂：即General Diagnostics、Ortho Diagnostics和Dade Diagostics公司的产品。用Coag-a-Mate2001-光学照相凝血检测系统（General Diagnostics公司）检测病人样品，测得凝固时间为9.8至40.6秒。合成底物试验结果与血凝分析值反相关，用三种组织促凝血酶原激酶所得对比数据的相关系数为-0.944、-0.953和-0.963。
实施例Ⅴ
用（Sar-Pro-Arg）2-若丹明110以分光光度法
测定抗凝血酶Ⅲ-肝素辅助因子
使用水溶性底物（Sar-Pro-Arg）2-若丹明110和Mitchell等人的参比萤光底物分析法（Thrombosis Research 12，219-225，1978）检测血浆样品中的抗凝血酶Ⅲ，比较所得结果。向半微量一次性使用的聚苯乙烯比色杯（光程1厘米，Evergreen Scienfific公司出品）内加入5微升血浆和50微升纯化水。加温至370℃后，再加入含有5单位/毫升凝血酶和10单位/毫升肝素、溶于缓冲盐水的0.5毫升一份的溶液。将该混合物于37℃保温2分48秒。采用2分钟48秒的活化时间是因为它是COULTER DACOS系统的固定时间增量。于比色杯内加入500微升水溶性底物的溶液，底物系溶于含0.05M KCL的0.1M ACES（PH 7.0）中，其浓度为375微克/毫升（37℃）。于460毫微米波长测定吸光率改变，测20秒钟。抗凝血酶Ⅲ水平为正常值的40-115%的26份血浆样品的测定结果与参比分析值密切相关。比较数据的相关系数为γ＝0.983，最小二乘方程y＝1.026x-2.90计算。
亦可按Dr.P.A.Owren首先描述的方法（Lancet Ⅱ，754-758，1959），通过人所熟知的血栓形成试验（thrnmbotest），用该新的水溶性呫吨鎓衍生物底物同时监测非固有的和固有的凝血酶形成途径。血栓形成试验对非固有和固有途径的各因子均很敏感，而且由这两种途径产生的凝血酶差不多相等。血栓形成试验的试剂包括：组织促凝血酶原激酶、部分的组织促凝血酶原激酶、吸附了的血浆和血纤维蛋白原。在该试验中，新的水溶性呫吨鎓衍生物底物可代替天然底物-血纤维蛋白原，以检测已形成的凝血酶的活性。
在各种凝血试验-凝血酶原时间、活化的部分组织促凝血酶原激酶和血栓形成试验中可以使用水溶性若丹明110和若道尔衍生物底物，这一点在上述实施例中得到了支持。
虽然本文中给出并详细描述了本发明的特定实施方案和实施例，但决不是要由此限制本发明的范围。相反地，本发明通过本说明书和待审批的权利要求，在不违反本发明之精神实质和范围的前提下，概括了本发明主题所涉及的所有改动、替代、实施方案、应用和等价内容。
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说明书 16 倒1 “以使” 删去
17 1 “链激酶充分发挥活性” 删去
1 比较， 比较，链激酶（活化的）
1 原 原活性