本发明涉及酵母、特别是涉及具有较高二氧化碳和乙醇产生速率的面包或啤酒酵母。例如，较高的二氧化碳释放速率可使面包酵母更迅速地发酵，而较高的乙醇产生速率则可减少酿造啤酒的时间。本发明还涉及包括经调节去除转录阻断在内的调节基因表达的新方法。
酵母是一种最古老的养殖植物，其使用历史将追溯到公元前2000年。在许多被认识的酵母种属中，啤酒酵母最为经济和特别重要的，它被广泛地应用于面包制作，酿酒及果酒制造工业以及生物量的生产中（如见Read.G.，“Yeasts”，Kirk Othmer Encyclopedia of Chemical Technology，24：711-806，John Wiley & Sons，New York，1984）。
虽然不是唯一的，但在发酵过程中酵母的功能是所提供的二氧化碳和乙醇的主要来源，为此必须将足够的酵母、麦芽汁或其它可发酵的底物加入生面内，以获得所期望的二氧化碳和乙醇生产速率。如果使用一种有较大活性的酵母，即可减少酵母的用量，相应地降低生产成本。
改进酵母的发酵能力是不断对其进行研究的结果。干酵母和湿酵母均可改良，以提高其二氧化碳产生能力，从而（1）减少发酵时间和/或（2）使用较少的酵母，以降低制作面包及酿酒的成本。改善酵母发酵能力亦可制得更稳定的活性干酵母（ADY）。一般说来，由新鲜酵母培养物制备ADY，发酵能力约丢失40%。为消除或减少这一问题，须进一步研究改进。
改善干酵母活性的手段之一是改进干燥方法，或者改善酵母菌株的干燥性质，从而防止在干燥期间出现活性丢失。业已进行了干燥方法的改良，並将传统的遗传学方法用于解决这一问题，且已取得了一定的成功（见美国专利3933783号）。
美国专利4420563号中述及了解决低活性干酵母问题的另一途径。其改善酵母特别是高糖含量甜面团中酵母之发酵活性的方法是，在酵母的后期增殖阶段向生长的酵母培养物内加盐，从而诱导酵母发酵活性的提高。
本发明则是通过遗传学和化学诱导进行修变（modification），以提高酵母菌株的二氧化碳和乙醇的产生活性。
本文公开了增加由酵母产生二氧化碳、乙酵和其它发酵产物（如柠檬酸）之速率的方法。一般说来，该方法包括降低酵母细胞中的ATP含量，以达到刺激糖酵解的目的。本发明的一个方面是，通过在酵母基因型中（如通过单拷贝或多拷贝载体，或通过共整合作用进入酵母基因组内）用一可调节的启动子置换编码代谢酶之基因的天然启动子，使酶得以可调节的表达，进而允许由该酶催化的代谢反应在逆反应的同时进行，以使ATP被消耗。本发明的另一个方面是，这种修变也包括了将一编码代谢酶的基因插入酵母基因型内，经如此处理后即使得基因的表达处于启动子的表达控制之下，从而允许由该酶催化的代谢反应能在逆反应的同时进行，进而消耗ATP。此外，本发明的修变还包括修变编码代谢酶的基因，从而阻止或消除变构或其它抑制作用，或阻止与消除对酶的失活化作用。
在一实施方案中，其所涉及的酶是FDP酶。该FDP酶的基因可被另加诱变，以除丝氨酸外的其它氨基酸的密码子置换酶的丝氨酸
-12的密码子;或加入某些化学物质（如AMP或/和果糖-2，6-二磷酸）以降低或消除对酶的变构抑制作用。在本发明的另一实施方案中，这种遗传修变包括了修变细胞外AP酶基因，如通过除去基因的编码前导序列的部分，使被修变的酶保留在酵母胞浆内並催化细胞内的ATP水解。
本发明所提供的一个有利条件在于，遗传修变过程只能在发酵期间尤其是在发酵的早期阶段，而不是在酵母生产水平的生长阶段被“打开”。这对于制作面包所使用的酵母是一个很重要的有利条件。另外，通过这种遗传修变可导致酵母的组成表达，使之能在大规模生产期间即酵母的商业规模培养期间被打开，从而得以提高发酵产物如乙醇的产生速率。
对遗传修变的调节可由一温度敏感性启动子或由某特殊化学物质诱导的启动子来完成，以使酶只能在预定的温度下或者只能在有该物质存在的条件下方可得以表达。或者，表达控制亦可通过将-FLP基因构建物插入酵母基因组内来达到-对此，将在下文中详细阐述。
用于这些方法的载体包括单拷贝、含有着丝粒的质粒和含有酵母2μ复制原点的多拷贝质粒，以及允许共整合进入酵母基因组的载体。
本发明进一步包括的方法是，通过培养酵母或使酵母与可直接或间接引起ATP消耗的化学物质相接触以降低ATP水平。这样的化学物质包括相对小的有机分子以及如酵母杀伤毒素等蛋白质。
最后，本发明还包括了用本文所公开之方法遗传修变的酵母菌。
图1图解说明含有自GalⅠ启动子表达之FLP基因的整合酵母质粒的构建。
图2图解显示同大肠杆菌之β-Gal编码区融合的含Gal启动
子的酵母质粒。
图3图解说明在限制葡萄糖的生长条件下，由GalⅠ启动子开始对β-半乳糖酶活性的诱导。
图4图解说明经被调节的位点特异性重组丢失异源基因。
图5图解说明从表达酵母FDP酶基因的GPDH启动子上丢失一转录阻断区。
图6图解显示一含有由SalⅠ/BglⅡ限制性切点联结的表达阻断区的质粒。
图7图解说明含有复制原点以及酵母和大肠杆菌之可选择性标记物的表达载体的构建。
图8给出经克隆的酵母FDP酶基因的核苷酸序列。
图9A和9B分别给出克隆化FDP酶之推测的氨基酸序列以及猪FDP酶的氨基酸序列。
图10图解说明自异源性启动子表达的FDP酶“暗盒”（Cassotte）的构建。
图11图解说明其中FDP酶自GPDH启动子表达的表达载体的合成。
图12图解说明FDP酶之氨基末端删除的构建。
图13图解说明在蛋白激酶识别位点上丝氨酸残基与丙氨酸的交换。
图14图解说明表达野生型FDP酶或氨基末端删除之FDP酶的酵母培养物发酵期间的二氧化碳释放。
图15图解说明表达缺失环AMP依赖性蛋白酶识别位点之FDP酶的酵母培养物发酵期间二氧化碳的释放。
图16图解显示用于气体生成试验的装置。
图17图解说明对表达非磷酸化FDP酶基因的酵母菌株之产气能力的改善。
图18图解说明酵母酸性磷酸酶启动子被引入酵母表达载体内。
图19图解显示酵母酸性磷酸酶启动子和酸性磷酸酶（PHO5）结构基因初始部分的DNA序列。
图20图解说明在酸性磷酸酶启动子的3′端引入唯一的BglⅡ切点。
图21图解说明将一限制性切点引入表达成熟蛋白质的酸性磷酸酶基因内。
图22图解自酸性磷酸酶启动子表达成熟酸性磷酸酶基因之表达载体的合成。
图23图解说明将一酵母着丝粒引入含被修变之酸性磷酸酶基因的质粒内。
多年来，已对糖酵解途径进行了广泛的研究（如参见Fraenkel，“Carbohydrate Metabolism”，摘自The Molecular Biology of the Yeast Saccharomyces;Metabol-ism and Gene Expnression，Cold Spring Harbor Laboratary，New York）。从能量和生物量转化的角度看，糖的酵解发酵是一个效率很低的过程。但无氧酵解能使酵母菌生长更为迅速，其中酵母生长所需的能量是得自于底物水平磷酸化作用，之后它们则可从厌氧生长的氧化磷酸化获得能量。
在导致本发明的研究过程中，我们发现酵解的速率是受酵母细胞的三磷酸腺苷（ATP）水平调节的。这一发现确实令人惊异：虽然
已在某些酶促阶段中观察到了ATP的调节作用，且以前也已对糖酵解过程作过广泛的研究，但在证明並提出这一发现之前，我们对ATP在整个酵解途径中所起的调节作用却全然不清楚。本发明正是利用这一发现，通过提供修变方法来降低胞浆ATP水平並刺激酵解过程，进而达到增加酵母产生二氧化碳和乙醇之速率的目的。
据以上所述，如果在面包酵母的发酵期间能使其增加二氧化碳的产生能力，即表明面包酵母可能被改良。同样地，如果使啤酒酵母之发酵速率得以增加，且减少了酿酒过程所需的时间，则证明啤酒酵母亦可被改良。使用按本发明的方法修变了的酵母进行发酵，即可缩减生物量的产生又可使生产乙酵的发酵过程得以改善。本发明通过使细胞ATP水平异常地降低以调节酵解的速率，从而提供获得这些改善的修变方法。所谓“细胞ATP水平的异常降低”，我们指的是用本发明的方法诱导的“降低”。
因为参与酵解过程的酶正常情况都是过量的，所以酵解的速率可因细胞代谢物对某些酵解酶的变构抑制而受到限制;其所说的细胞代谢物包括前述研究过程中发现的细胞内三磷酸腺苷（ATP）水平。因此，依据本发明的方法降低细胞ATP水平即可刺激酵解，从而提高二氧化碳和乙醇释放的速率並降低生物量的产生。
然而，就面包酵母而言，如果酵母的这种改变是在正常生长期间进行，则酵母生产生物量的效率将是很低的。这样一来，由于增加了生产成本，培养这种酵母在商业上就将是不可行的。因而期望依照本发明的遗传修变方法调整面包酵母的生产能力，並使修变过程只在发酵进行期间、而不是在酵母本身的生产（生长期）期间运转。本发明的一个显著优点是能够在面团成熟期的开始阶段或早期开动遗传修变
以及相伴随的二氧化碳产生能力增加。然而，这一限定对于酿酒或生产乙醇的酵母是不必要的，因为在其发酵期间可同时获得生物量的增加。
下面叙述降低胞浆ATP水平的几种方法及有关的特定实施例。总的说来，这些方法包括：（Ⅰ）确定一个被调节的、消耗ATP的、无效的代谢循环;（Ⅱ）以一种经调节的方式引入或提高胞浆ATP酶活性;以及（Ⅲ）通过影响胞浆膜功能来降低胞浆ATP水平。从后面的阐述中将会看出，上述方法（Ⅰ）和（Ⅱ）包括了靠DNA重组技术将一个改变了的基因或基因功能引入酵母菌株内。在进一步详细描述这些方法之前，有必要简单介绍一下影响这些遗传修变的工具如适用的载体、被调节的启动子以及将这些改变引入酵母的制作面包和酿酒菌株的方法。
载体
可于启动子的转录控制下将诱导无效循环的基因或胞浆酸性磷酸酶基因引入两种类型自发复制的表达载体内，即单拷贝、含有丝粒的质粒或多拷贝质粒。或者可通过重组将DNA引入酵母染色体。此外，正如本领域内技术人员所熟知的，这些载体包含了一个选择基因和3′端非编码区域。
将载体转化到酵母菌株内並用本领域内已知的选择方法筛选含有载体的酵母细胞。将筛选出的细胞即转化了的细胞培养在适当的生长介质内，並诱导启动子以启动胞浆ATP损耗。
适用的选择基因是本领域中已知的。所用的选择剂最好是其能阻止细胞在没有选择基因的条件下生长。因此，如在大规模培养时，细胞丢失质粒便不含有选择基因，发酵期间也就不能过度生长。然而，可以
期望在制取预期产品的商业化生产中避免使用某些细胞毒素，以简化产品纯化步骤。为此，合乎要求的选择基因应能使转化体在没有亲代菌株生长所需要之营养素的培养基内生长。在本发明的实践中，有用的选择基因包括URA3、LEU3等。
本发明所用的载体亦可按本领域内技术人员熟知的技术合成。选择基因、启动子等载体组成成分可以由天然来源得到，或者可按下述方法合成之。可以大量得到的这些成分〔即存在于天然质粒（如酵母的2μ质粒）上的或能够很容易合成的〕，基本上都可借助适当的限制性内切酶和T4DNA连接酶进行组装。如果一种组分是不易大量得到的，则可按已知技术将其插入细菌的克隆载体（如质粒或噬菌体）内进行扩增。之后，可借助适当的限制性内切酶，用本领域内已知的技术经简单地培养转化菌得到大量载体、用适当的核酸内切酶消化其DNA、分离DNA片段、鉴定含有插入片段的DNA並回收之。一般可以小量组装转化载体，之后连接于适当的自发复制的合成载体如质粒或噬菌体上，以产生大量的转化载体DNA。例如大多数情况下可使用人们熟知的pBR322质粒。
可依照惯用方式将合成的载体用于克隆被连接的转化载体，如通过转化随意选择的原核生物体、复制合成载体达到高拷贝数，之后经细胞溶解回收合成载体並由细胞碎片中分离合成载体。可直接用所得的合成载体之收获物转化酵母细胞。许多类型的酵母载体都是很容易得到的，並可按照需要进行置换（Parent等，Yeast，1∶83-138（1985））。
包括转化载体在内的某些载体以及包含各种组成元件如特定启动子，FLP基因和FDP酶基因的载体已寄存于Rockville MD
的美国典型培养物保藏中心（ATCC），其中有：
1.AZ402 基因，其包含有URA3转录阻断区，该区段两侧接
在BglⅡ/SalⅠ暗盒内的FLP识别序列
（ATCC67257号）
2.AU125 质粒，其包含一个有效地与GPDH启动子连接的
FDP酶基因（ATCC67256号）
3.AR900 质粒，其包含有效地连接于Gal启动子的FLP基
因，具有一限制性切点以便用其它启动子置换
GalⅠ启动子;该质粒保证了FLP基因的被调节
的表达（ATCC67259号）
4.AT823 质粒，其包含一FDP酶基因（ATCC67258
号）
5.Yop1 质粒，其为可选择的2μ质粒的一个有代表性的例
子（ATCC67260号）
6.BA601 质粒，其包含与GPDH启动子有效地连接的经诱变
了的（丝氨酸12变成丙氨酸）FDP酶基因
（ATCC67261号）
7.M138 为多拷贝质粒，其表达胞浆（经诱变了的）AP酶
基因（ATCC67262号）
8.N305 其相似于M138，不同的是该质粒包含一酵母着
丝粒，因此是单拷贝质粒（ATCC67263号）
上列各质粒均存在于大肠杆菌菌株HB101内。
被调节的启动子
适用于酵母转化载体的许多启动是已知的，它们均可用于本发明
的实践。正如本文中所详细讨论的，许多本领域里已知的被调节的启动子是本发明之某些实施方案中优选的。被调节的酵母启动子的例子是选自于半乳糖、麦芽糖、磷酸或氮代谢、同种细胞色素（iso-cytochromes）及乙醇脱氢酶者。被调节的启动子的一特殊实例是得自于酵母酸性磷酸酶基因（PHO5）的。曾报导该启动子在对培养基内无机磷酸盐水平的反应中起作用。这可能是因为象得自酸性磷酸酶（AP酶）的强启动子，可发挥比最适表达水平更高的、适于本发明某些实施方案（如无效循环）的表达能力。可依几种方式调整预期的被调节之启动子。例如，可在体外用Shortle的方法（Shortle等，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，79：1588（1982））使酸性磷酸酶启动子的克隆拷贝产生突变，或者使用已知的技术（Mcknight and Kingsbury，Science 217：316（1982）;Heffron and McCarthy，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，75：6012（1978））插入一连接物，以使启动子内产生一小的删除/置换。将含有突变之酸性磷酸酶启动子的DNA片段插入酵母/大肠杆菌穿梭质粒内，启动子即可在其中表达一可检测的标志，如大肠杆菌β-半乳糖苷酶或β-内酰胺酶基因（Guarente and Ptashne，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，78：2199（1981）;Rose etal，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，78：2460（1981）;Martines and Casadoban，Mol.Cell.Biol.，3：580（1983）;Silver-man et al，Mol.Cell.Biol.，2：1212（1982））。之后根据其产生之可检测的标志物筛选被转化了的酵母菌
落，例如在含5-溴-4-氯-3-吲哚基-β-D-半乳糖苷（X-gal）的培养基上，当有高浓度磷酸盐时预期的表现型得到白色菌落，而在低浓度磷酸盐培养基上则生成淡兰色菌落。据此可鉴定强或弱启动子。由显示有适当表现型的酵母细胞制备DNA並使用标准技术将其转化到大肠杆菌内。氨苄青霉素抗性菌落必然含有酵母质粒。由这些大肠杆菌转化体制取质粒DNA並用来自质粒的酸性磷酸酶启动子进行表达。
另外，亦可使用温度敏感性调节基因。例如，已发现酸性磷酸酶途径之Pho R和Pho U调节基因中的许多突变可于36℃导致结构表达，而在23℃时则给出正常调节（Ueda et al，J.Bact.，122：911（1975））。将含有PHO5启动子的质粒转化到包含Pho R或Pho U温度敏感性突变的酵母菌株内，並改变含高浓度磷酸盐培养基内的培养温度以调节酸性磷酸酶启动子。这一调节方式也用于与弱（突变了的）酸性磷酸酶启动子结合。
调节本发明之修变作用的另一个方法是使用另一被调节的启动子，该启动子在自然条件下比酸性磷酸酶启动弱得多。已鉴定了几个这样的启动子，例如来自酵母HO基因的启动子。该启动子的表达直接受丝氨酸（Sir）座位突变的控制（Rine，“Regulation and Transposition of Cryptic Mating type qene in Saccharornyces Cerevisiae”，Ph.D.thesis，University of Oregon at Eugene，（1979））。正常“野生型”细胞中，接合型座位上有Mata，而同宗配合型座位上有一α暗盒HML和HO等位基因，其HO启动子可被打开。然而，倘菌株携带有Sir突变时，则Mat a和Mat α（自HML）
可被表达，且HO启动子将被关闭。因此可使用携带有温度敏感性Sir突变的菌株，其中在低温度下HO启动子得以表达，而在高温度条件下则被抑制。
改变酵母的培养条件，可使被调节的启动子在面包酵母生长期间转向“关”，而在发酵终末或在发酵面团内时转向“开”。例如，当使用AP酶启动子时，酵母被培养在有调节量磷酸盐的培养基内，即可使培养物在发酵终止前利用所有的磷酸盐。此时，通过由发酵器内除去磷酸盐来诱导AP酶启动子。为使用温度敏感性表达系统，则须调整培养温度，以使启动子在酵母生长期间转向“关”，而在发酵终末转向“开”。
作为表达无效循环之机制的被调节的位点特异性重组
完善面包酵母中ATP降低过程之表达的一个问题是很难于鉴定可被调节以使其在生长期关闭又可在发酵期间打开的启动子。这一问题之所以难以解决，是因为在制作面包中使用了许多不同型的酵母;又因为可能影响被调节之启动子的条件难于掌握，所以其中酵母的一致性便不易得到控制。当使用正常产生CO2的即由进行酵解所需要的同一生长条件调节的启动子时，所使用的酵母应是与标准的面包酵母相一致的。
因此，设计了一种新颖的方法，以充许酵母生长而不消耗ATP，但在发酵期间具有自酵解启动子表达的ATP降低过程。为此可使用一种被调节的、位点特异的重组方法来完成，以除去启动子（如GPDH启动子）内的转录阻断，有关细节我们将在下文述及。应注意到的是，为调节多种基因的表达，可能经使用这一不常用的表达战略，以调节多种基因的表达，其包括但不限于编码无效循环或胞浆磷酸酶
的那些基因。
已揭示酵母的2微米质粒可在两个反向重复之间经受位点特异性重组（Hartley and Donelson，Nature，286：860-864（1980））。这一重组是由特异的重组酶（FLP）催化的，该酶基因定位于2微米质粒上（Broach and Hicks，Cell，21：501-508（1980））。GalⅠ启动子可被葡萄糖抑制並被半乳糖诱导（Yocum al al，Mol.Cell.Biol.，4：1985-1998（1984））。为此，如使用GalⅠ启动子调节面包酵母中的FLP表达时，假如天然的2微米质粒已丢失，那么在加入半乳糖之前FLP基因便不会被表达。在限制葡萄糖的条件下使生长发酵器正常运转，以阻止Cramentree效应和乙醇产生，並使细胞生产达到最大限度。我们已经发现，在这些条件下GalⅠ启动子没有被葡萄糖抑制。向发酵器内加入半乳糖，从而诱导继后引起FLP基因表达的GalⅠ启动子。可用Erhart和Hollenberg的方法（J.Bact.，156：625-635）处理酵母的2微米质粒。或者亦可使用前述的另一种可调节的启动子。
因此，可以分离FLP基因的克隆並自被调节的GalⅠ启动子表达之。为此目的，可先用Xbal之后用HindⅢ消化酵母的2微米质粒，並用制备性凝胶电泳分离1450bp XbaⅠ/HindⅢ片断。将分离的片段在PvuⅡ/SphⅠ切点上插入到包含GalⅠ启动子的常用酵母质粒质内，以便从GalⅠ启动子表达FLP片段，产生出质粒AR900（图1）。这样就可允许自GalⅠ启动子表达FLP基因。
在限制葡萄糖条件下的连续生长期调节GalⅠ启动子
为进一步试验GalⅠ启动子作为调节FLP基因的一种机制，将
含有与得自大肠杆菌之β-半乳糖苷酶编码区相融合的GalⅠ启动子的质粒以整合方式转化到实验室酵母菌株（如KY114）的基因组内。将该菌株接种到恒化器内，使培养物在其中的酵母基本培养基内于限制葡萄糖的条件下生长。培养物因生长而趋稳定，其倍增时间为3.5小时，共培养48小时。以2%的终浓度向反应器内加入半乳糖並定时取样用标准技术测定β-半乳糖苷酶活性及蛋白质浓度（Miller，Experiments in Molecular Genetics，Cold Spring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor，NY（1972）;Rose at al，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，78：246-2464（1981））。从图3可以看出，在限制了葡萄糖的生长条件下，当存在有半乳糖时GalⅠ启动子诱导了β-半乳糖苷酶活性。
为试验利用这种半乳糖可诱导的FLP基因以调节重组的可行性，用含有GalⅠ/FLP融合基因的质粒转化缺少内源性2微米质粒的酵母菌株（该菌株已预先通过整合作用被含有异源基因的质粒转化，该异源基因含有侧接了来自酵母2微米质粒的串联重复片段）（Hartley and Donelson，Nature，286：860-864（1985）;Senecoff et al，Proc，Natl.Acad.Sci.USA，82：7270-7274（1985）;Andrews et al，Cell，40：795-803（1985））。如果GalⅠ/FLP融合是成功的，则当菌株生长于含葡萄糖培养基上时，便应能够表达异源基因（葡萄糖抑制GalⅠ启动子）。但如果菌株生长在半乳糖基质上，就应借助导致基因丢失的重组将异源基因从基因组中切掉。已发现情况确系如此，因为在葡萄糖培养基上
97%的菌落表达了异源基因，而在半乳糖培养基上所有菌落均不含有异源基因活性（0%）。接下来是将表达阻断区如含有转录阻断（如URA3 HindⅢ片段）的DNA序列、或沉默区段或转录终止密码子（Brand et al，Cell，21：501-508（1985））在上游活化序列与转录起始位点之间插入启动子（如GPDH启动子）内。这一转录阻断元件侧接有可被作为位点特异性重组之底物的、被FLP基因产物识别的DNA片段（其作为合成的寡核苷酸被插入，参见表1）（Senecoff等的上述文献;Andrew等的上述文献）。这样的调节作用可因向酵母的非葡萄糖抑制性培养物内加入半乳糖而运转。半乳糖诱导FLP蛋白的合成在于其可催化与侧接有表达阻断区的DNA序列之间的重组。此重组过程可除去表达阻断，从而允许异源基因如自GPDH启动子表达FDP酶的基因表达（参见图5）。
如图6中所示的由重组位点包围的阻断区已被寄存，並可将其插入经过选择的启动子内：可首先按已述的方法（Zoller and Smith，N.A.R.，10：6487-6500（1982）;Methods Enzymol.，100：468-500（1983）;DNA，3：479-488（1984）），应用位点针对性突变，将BglⅡ/SalⅠ连接物在允许表达的位点上插入到启动子序列内，之后再作为BglⅡ/SalⅠ片段插入到质粒AZ402的转录
表1
FLP催化的位点特异性重组位点的序列
TCGACGCTTTCAAGTTCCTATTCCGAAGTTCCTA
GCGAAAGTTCAAGGATAAGGCTTCAAGGAT
TTCTCTAGAAAGTATAGGAACTTCAGAGCGCTTA
AAGAGATCTTTCATATCCTTGAAGTCTCGCGAATCTAG
阻断区内。
使用上述的载体和被调节的启动子，我们得到了特征在于有较高CO2产生速率的酵母菌株，並且得以向宿主菌株内引入了（Ⅰ）消耗ATP的无效循环，以及在本发明的另一实施方案中体现的引入了（Ⅱ）提高了的胞浆ATP酶活性。
对制作面包和酿酒菌株的遗传修变
因制作面包和酿酒所用的酵母菌株是多倍体，並且一般都不含有用于本领域内已知选择程序的营养缺陷型标志物，所以便存在一个比实验室菌株更难于解决的转化底物问题。
然而可以将下面要讨论的经过修变的基因或异源基因/启动子构建物如与GPDH启动子连接的FDP酶基因引入用于制作面包的酵母菌株内，其中使用了显性抗药基因如抗庆大霉素（G418，抗真菌剂）（Jimines and Davies，Nature，287：869（1980））或抗潮霉素B（Grits and Davies，Gene，25：179-188（1983））抗性基因。作为这一研究的一个例子是由细菌转座子TN601携带的编码氨基环多醇转磷酸酶（ACPT）的抗性基因，其可供献抗G418抗性，但因其启动子很微弱，故在供献抗药性上只部分有效（Jimenes and Davies，上述文献）。用该启动子交换酵母启动子（如酵母甘油醛磷酸脱氢酶启动子）。之后用其天然侧接区连同上述的TN601ACPT构建含有预期之基因/启动子构建物的质粒。这个质粒並不含酶母复制原点。
用该质粒转化面包酵母的菌株並在G418平板上选择转化体。如果质粒在天然基因座位上被整合到酵母基因组内，则只能稳定地保留ACPT的质粒拷贝。这就导致可根据质粒和ACPT序列分离基因（如FDP酶）的串联重复。这些转化体在没有G418的培养基中生长，可通过留下“野生型”或被引入之序列的“环出”过程丢失质粒。之后使用检测异源构建物存在的寡核苷酸探针，以标准的Southern杂交方法筛选这些G418敏感克隆。
（Ⅰ）消耗ATP的无效循环
降低细胞ATP水平的一种遗传修变方法是使用以非正常方式消耗ATP的正常代谢途径以刺激酵解。最首选的途径是循环途径，以使其非正常地利用ATP，导致任何所需代谢中间体底物或产物的不明显的净积聚或耗竭。依据细胞的生长条件和要求，酵母中的许多代谢途径均能够以两相反方向运转。例如，按照细胞的营养需要，代谢物“A”可转化为代谢物“B”，或由“B”转化为“A”。在同一时间使这一途径在两个方向上进行，导致代谢物的非净积聚或损耗，但不消耗使该途径运转所需要的能量，此即“无效”循环。当然，亦可使用包括另外步骤的其它无效循环（为A→B→C→A）。转录、翻译和翻译后控制可用于打开或关闭无效循环，其中每循环一圈可消耗一分子ATP，而不引起产物的净积聚或使底物损失。面包酵母中的代谢改变必然降低ATP水平，从而刺激酵解，而这一代谢改变应是经过调节的，以使之只能在发酵期间起作用。
一个优选的消耗ATP的无效循环是：果糖-6-磷酸→果糖-1，6-二磷酸→果糖-6-磷酸。已全面地鉴定了参与这一途径的酶即磷酸果糖激酶和果糖-1，6-二磷酸酶（FDP酶或FBP酶）
的性质（Bloxham and Lardy，The Enzymes，Vol.δ，Boyer，Ph.D.，Ed.，pp239-278（1973）;Uyeda，Adv.Enzymology，48：193-244（1981）;Foy and Bhattachargee，Arch.Microbiol.，129：215-220（1981）;Funayama et al（1979））。经克隆该编码FDP酶的基因並将其启动子与被调节的启动交换，即可使基因得以随意表达。我们发现，使酵母菌在葡萄糖培养基上生长期间表达这一基因，即足以大量损耗ATP，並进而增加酵解的速率。为使FDP酶驱动的无效循环最大程度地进行，须充分了解FDP酶的自然调节。为清楚起见，我们首先简要讨论一下FDP酶的调节。
FDP酶调节
许多研究者已对FDP酶的调节作过研究。为了阻止野生型酵母中果糖-1，6-二磷酸的合成和水解之间的无效循环，可向生长于不能被发酵之碳源上的细胞培养物内加入葡萄糖，即很容易地使FDP酶失活。FDP酶的这种失活化作用发生于三个阶段。对酶活性的初始抑制作用是通过变构调节达到的（Lenz and Holzer，F.E.B.S.Lett，109：27-274（1980）;Wolf and Holzer，Transport and Utilization of Aminoa-cids，Peptides and Proteins by Microorganisms，Payne，J.W.Ed.，John Wiley，Chinchester，1980;Tortora et al，Biochem，Biophys.Res.Comm.，100：688-695（1981））。当将葡萄糖加进酵母细胞内时，其中果糖-2，6-二磷酸的浓度即在几秒钟内由
测不到的水平增加到几个微摩尔（μM），以致足可部分地抑制FDP酶。有关调节果糖-2，6-二磷酸合成的机制尚不清楚（Gancedo et al，J.Biol.Chem.，258：5998-5999（1983））。在经过很快的最始抑制之后，包括了FDP酶之磷酸化的第二阶段可存在几分钟的时间（Muller and Holzer，Biochem.Biophys.Res.Comm.，103：926-933（1981）;Tortora et al，上述文献;Purman et al.，Biochem.Biophys.Res.Comm.，107：1482-1489（1982））。FDP酶磷酸化的水平是由特异的激酶和特异的磷酸酶控制的。磷酸化作用发生在特定的丝氨酸残基上（Muller and Holzer，上述文献;Mazon et al，J.Biol.Chem.，257：1128-1130（1982）），且经过修变的FDP酶比未修变的酶活性低。最后，磷酸化的酶似乎是某特异性蛋白酶的底物，该蛋白酶可在大约一小时内催化FDP酶的不可逆性失活化。
调节FDP酶的遗传修变
有几种遗传学方法可用于阻滞对FDP酶的失活化作用。不合成果糖-2，6-二磷酸的或者有不与抑制物结合之FDP酶的突变体可在初始阶段阻断失活化级联。对丝氨酸的位点特异性诱变可使其本身变为被磷酸化的，从而产生一种对第二和第三阶段的失活作用有抗性的酶。在经过初始阶段的部分抑制后，由于果糖-2，6-二磷酸的存在而保留了部分酶活性（Lenz and Holzer，上述文献;Wolf and Holzer，上述文献;Tortora et al，上述文献）。这一酶活性足以引起显著地无效循环。
我们已鉴定了FDP酶中（Ser-12）磷酸化的位点，它是仅有的与存在于克隆化FDP酶基因中的cAMP依赖性蛋白激酶的识别位点（Arg9.Arg10.Asp11.Ser12）相符合的位点，並且很容易通过常规的位点特异性诱变改变之（Zoller and Smith，上述文献）。我们发现，以某种氨基酸取代丝氨酸以阻止磷酸化作用，便可产生足以引起显著水平之无效循环的酶活性。然而，该酶亦受高浓度AMP的抑制（Taketa and Pogell，J.Biol.Chem.，240：651-662（1965））。为进一步使酶（其已经借助Ser12位上的取代对AMP的抑制作用稍有抗性）达到最佳化，可以另外在其AMP结合位点上改变之，以便克服这一抑制作用。已鉴定了酶上AMP结合位点的性质。为了提高无效循环的酶促活性，可在体外将这一位点致突变並引入酵母内，间接测定AMP的量以估计抑制作用的丧失情况。在平板上，酶的突变形式不再被AMP所抑制，而允许酵母在异生葡萄糖的碳源上正常生长但在葡萄糖基质上却生长很差，依此可对这一修变结果作出初步的判断。
鉴于卷入这一无效循环的酶是相当重要的酵母蛋白质，所以这一途径足可消耗大量ATP。对酵解的刺激是经过了“精细调节的”，通过改变已修变了的果糖二磷酸酶基因的拷贝数，以及改变上述FDP酶或FDP酶变异性表达载体中所使用之启动子或启动子的强度，便可获得任何预期水平的二氧化碳输出量的改变。
可供选择的其它无效循环
有许多可供选择的无效循环参与消耗ATP。例如，可反向进行的由丙酮酸激酶催化的磷酸烯醇式丙酮酸向丙酮酸的转化（Katz，J.and Rognstad，R，Cur.Top.Cell.Reg.，10：
237-289（1976）;Reeves，R.E.，Biothem.J.，125：531（1971））。可消耗ATP的其它许多无效循环包括见于氨基酸生物合成和降解、多磷酸合成和降解、脂肪酸生物合成及嘧啶生物合成者。因为这些生化过程都在转录水平上受到严格控制，所以可通过改变酶的调节包括改变其启动子来诱导无效循环。其它调节包括由中间体或能量代谢物对酶进行反馈抑制或变构调节。必要时可依上述调节FDP酶的相类似方式修变其变构结合位点，以消除或减小变构抑制。其它类型的调节包括隔离某细胞器内的酶，以使底物的可利用性受到限制;或者将不稳定的中间体“被抓到”酶复合物内，以使之尽快地转化为稳定的中间体。所有这些途径都是潜在可诱导的ATP水解过程，故可通过适当的遗传修变来消耗ATP。
可望使修变的细胞消耗之ATP的量受到调节，以最大限度地产生CO2和乙醇。为此可使用较弱或较弱的启动子或修变其活性，或者使用调节的程度取决于上述培养物之温度的温度敏感性调节基因以达到这一调节目的。
（Ⅱ）引入提高了的胞浆酸性磷酸酶活性
调节酵解速率的另一修变途径包括产生胞浆酸性磷酸酶，以水解包括ATP在内的有机磷酸酯。一般啤酒酵母的细胞外酸性磷酸酶是定位于周质中的一种可诱导的非特异性磷酸酶。目前已克隆並定性了编码这种酶的基因（Rogers at al，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，79：2157-2161（1982））。阻止磷酸酶被分泌到细胞周质中（如经遗传修变除去酶的分泌前导序列），将致使胞浆中的有机磷酸酯（包括ATP）去磷酸化。然而这种非特异的磷酸酶亦可使其它重要的有机磷酸酯去磷酸化，而对细胞的代谢
造成严重危害。因此，必须严格地控制“被抓住的”胞浆磷酸酶的水平。例如，当为了增加酵解速率而进行诱导时，酵母酸性磷酸酶（PHO5）的天然启动子将会表达过高的ATP酶活性。为了获得一个由胞浆酸性磷酸酶水解ATP的调节的方法，最好使用较弱的启动子，以使之当充分被诱导时能产生预期的效果，或者亦可使用下述有基本活性水平的可诱导的启动子。此可通过几种方式来完成，有关例子已如上所述。
（Ⅲ）修变胞浆膜功能
本发明的另一实施方案涉及了胞浆膜ATP酶，以调节胞浆中的离子浓度，其可利用三分之一以上的由发酵产生的ATP。此为细胞中ATP水解的主要途径。因此，刺激这一途径即可降低细胞的ATP水平，进而刺激发酵（即乙醇和二氧化碳产生）。
有证据表明某些影响胞浆膜质子泵的药物可刺激细胞的发酵（Serrano，Eur.J.Biochem.，105：419（1980））。但也发现这种刺激作用很弱。这一发现的重要性似乎被忽视了，並且因被误认为实验误差而未得以进一步研究。因为其它一些药物（如二环己基碳二亚胺和二乙基己烯雌酚）也能破坏胞浆膜质子梯度又不引起对发酵的刺激，所以有关这种刺激作用的原因尚不完全明瞭。这一研究所支持的一种解释是，二环己基碳二亚胺和二乙基己烯雌酚抑制胞浆膜ATP酶，因此並不降低细胞ATP水平。对细胞一般代谢过程的明显损害亦可能受到其它ATP依赖性膜功能紊乱的影响。二硝基苯酚似乎是通过直接破坏跨越胞浆膜的质子梯度而起作用的。这样就刺激了胞浆膜ATP酶並进而降低细胞ATP的水平。
刺激胞浆膜ATP酶的另一方法是可使用小分子蛋白如核苷酸酶
（Alper et al，J.Bact.，93：759-765（1967）;Yphantis et al，J.Bact，94：1509-1515（1967））或酵母杀伤毒素（Bussey and Sher-man，Biochimica et Biophysica Acta，298：868-875（1973））。
下列实施例旨在进一步阐明本发明，这些实施例纯系作为举例给出的，而並非限定在权利要求书中所提出的本发明之真正范围。
实验性实施例
材料
所有DNA限制酶和代谢酶均购自New England Biolabs公司，並在该公司所介绍的条件下和缓冲液中使用这些酶;但所用的绿豆核酸外切酶是购自PL Biochemicals公司的，並且按其所述的方法使用。ATP和脱氧核糖三磷酸（dNTP）即dATP、dGTP、dCTP和dTTP购自PL Biochemicals公司，〔32P〕购自New England Nuclear公司。
按照Maniatis等人（Molecular Cloning，A Labo-ratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor，NY（1982）;该文列为参考文献）所述的方法完成连接反应，其中使用了246页上介绍的缓冲液，所用DNA浓度为1-100μg/ml，连接平端DNA和连接粘性末端DNA分别于23℃或16℃下进行。电泳使用含90mMTris-硼酸、10mM EDTA的0.5-1.5%琼脂糖凝胶。
DNA消化后，再于65℃加热10分钟以使限制酶失活。在完成相继的每一步骤反应后即用70%乙醇沉淀DNA。经与DNA聚
合酶的大片段（Klenow）及四种dNTP反应以“填入”一限制性切点之后，向反应混合物内加入氯化镁使其终浓度为10mM，並加等体积的5M醋酸铵。于-20℃用2体积乙醇沉淀DNA，于4℃在Eppendorf microfuge离心机内离心10分钟得到DNA的沉淀团块。倾去乙醇並将DNA沉淀团块以10μl/μg DNA的浓度溶解于0.2M醋酸钠中。再次用2体积乙醇沉淀DNA並按上述方法离心。在进行下一步处理之前，于真空下干燥DNA沉淀物。用前述Maniatis等人的方法激活合成的寡核苷酸，並加热至65℃再缓慢冷却到4℃使之退火。
DNA制备和转化
按Maniatis等人（1982，上述文献）所述的方法纯化得自大肠杆菌的“超螺旋”质粒DNA並转化到大肠杆菌内。按Hinnen等人（Proc.Natl.Acad.Sci.USA，75：1929-1933（1978））所述的方法转化酵母菌，其中不同的是以1.2M山梨醇代替1.0M山梨醇。大体上依照（Maniatis等人，1982，上述文献;Holmes and Quigley，Anal，Biochem.14：193（1981））所述的方法制备用于筛选转化菌的质粒，不同的只是在限制性酶消化之后，电泳之前，向琼脂糖凝胶小井内加入1μl浓度为1mg/ml的RNA酶（Boeh-ringer Mannheim）溶液，以进行RNA酶消化。
菌株和培养基
所用的细菌转化株均为大肠杆菌菌株HB101，所用的酵母菌株为DB745（Botstein et al.，Gene，8：17-24（1979））、KY114或ATCC26675。大肠杆菌生长于
Maniatis等人（1982，上述文献）所介绍的含有或不含氨苄青霉素（10μg/ml）的LB培养基内。转化之前酵母生长于30℃含1%酵母提取物（Difco）、1%Bacto胨（Difco）和2%葡萄糖的培养基内。酵母基本培养基每升含有5g硫酸铵、10g葡萄糖、40mg腺嘌呤、60mg亮氨酸、2μg生物素、40μg泛酸钙、2μg叶酸、2μg肌醇、400μg烟酸、100μg对位氨基苯甲酸、400μg盐酸吡哆醇、500μg硼酸、40μg硫酸铜、100μg碘化钾、200μg钼酸钠、400μg硫酸锌、500mg硫酸镁、100mg氯化钠、100mg氯化钙及1g（高磷酸盐培养基）或100ng（低磷酸盐培养基）磷酸钾（一碱价）。为诱导酸性磷酸酶启动子，将细胞于30℃预培养于高磷酸盐酵母基本培养基内，洗去磷酸盐並转移到低磷酸盐酵母基本培养基内重新于30℃培养之。最大诱导作用出现于转移后的8-12小时。
用于二硝基苯酚实验的酵母菌株是Fleishman氏活性干酵母。将酵母培养在含1%酵母提取液（Difco）、1%Bacto胨（Difco）、0.05M磷酸氢二钾並用柠檬酸滴定到pH5.6的CO中。在15升容积的大玻璃瓶内批量配制10升培养基並于121℃高压灭菌2小时。冷却后加入无菌葡萄糖至浓度为2%（重量/体积）。每24小时加入消泡剂以防止泡沫形成。恰于培养基进料器与恒化器接合之前，直接向培养基的15升大玻璃瓶内加入二硝基苯酚，並加入培养容器内使之与培养基进料器内有相同的浓度。储备溶液中的二硝基苯酚在乙醇中配制。在接种于恒化器内之前，先使细胞在CO中生长过夜，培养物生长于New Brunwick Scien-
tific F200型恒化器内。培养器接有一外加的侧臂，以使其工作容积达到一升。借助一个浸没的开口管使废弃的培养物流出培养器，以防止趋向留存于培养物表面上的消泡剂丢失。
发酵器的工作温度为30℃並装有一4头搅拌器。不断以500CC/分的速度通过送气管鼓泡通入氮气，且排出气体通过Dry-Rite的湿吸收器后被送入Perkin Elmer气相质谱分析仪，以测定二氧化碳比例。
在连续培养中用Pharmacia M3型泵以250ml/小时的流速提供培养基。当进行二氧化碳测定时，可根据需要检查並调整所有装置、体积和温度。但发现培养基给进、温度和搅拌都相当的稳定，氮气的通入量可有变化，在4小时期间可达10%。因此可根据由气体分析仪给出並打在记录纸上的结果，每隔2小时手动调整一次氮气的流速。在测定培养物中的细胞密度之前，须检查氮气的流速和排出气体中的二氧化碳水平，以确保此期间的稳定性。事实证明，在测定之前的限定时间内培养物是稳定的。根据数据的可重复性即可得出这一结论。用水将培养物稀释10倍以测定培养物的细胞密度並用Bausch和Lomb Spectronic 20型分光光度仪于600nm处读出细胞密度的结果。
载体构建
为使表达质粒的大小减到最小並尽可能减少限制性切点的数目，须构建一含尿嘧啶3基因（URA3）作为选择基因且包含有2μ复制原点的质粒。亦可使用其它的酵母质粒如YEp24或YEp13或等价物（Parent等，上述文献）。我们的质粒是得自于外加有HaeⅡ/HpaⅠ片段的YIp5（Botstein等，上述文献），其含有来源
酵母之2μ质粒的复制原点。将2μ原点引入YIp5的EcoRl切点即构成质粒YOp1（图7）。用限制性内切酶HaeⅢ和HpaⅠ酶切得自YEp24（Botstein等，上述文献）的质粒DNA，並在制备用1.0%琼脂糖凝胶上电泳。将其与分子量标志物片段的泳动图谱相比较，以鉴定出含2μ复制原点的1.4Kb片段，並电洗脱到切入琼脂糖中的小井内。将小井内缓冲液加入DEAE Sephace柱（Maniatis等，上述文献）以纯化DNA片段。用EcoRI酶切质粒YIp5，並用DNA聚合酶1的Klenow片段和所有四种dNTP“填入”粘性末端。将YEp24的HaeⅢ/HpaⅠ片段连接到填入的YIp5EcoRⅠ切点中（图7）。将连接混合物转化到HB101中並筛选存在有2μ原点片段的氨苄青霉素抗性菌株。因为“被填入的”EcoRⅠ切点连接了HaeⅢ切点，故重新造成了EcoRⅠ切点，可根据所得EcoRⅠ切点至质粒上限制性位点的基因图确定该片段的定向。将氨苄青霉素抗性基因内具有EcoRⅠ切点邻接于PstⅠ切点的质粒（YOp1）用于继后的构建。
实施例
经无效循环消耗ATP
分离编码果糖-1，6-二磷酸的基因
通过对大肠杆菌（菌株DF657，CGSC6695号）中一FDP酶的删除突变体的补足分离编码FDP酶的基因。借助对抗生素抗性的选择将pBR322质粒载体中“野生型”酵母基因组DNA的质粒文库转化到DF657内，並根据其充许细菌在异生葡萄糖之碳源上生长的能力鉴定携带酵母FDP酶基因的质粒。用Sanger等人（Proc，Natl.Acad.Sci.USA，74：5463-
5467，（1977））的二脱氧核糖核苷酸序列分析法测定酵母FDP酶克隆的序列（图8）。将衍生自此DNA序列的酵母FDP酶的氨基酸序列与经过纯化的猪FDP酶的氨基酸序列（Marcus et al，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，79：7161-7165（1982））（图9）进行比较，显示有50%以上相符，从而提供了鉴定酵母克隆的准确方法。
因为无效循环必须经过仔细调节以防止成熟前的ATP消耗，所以对天然FDP酶基因的首要处理应是改变其启动子，以使序列能在发酵期间得以调节。对酵母FDP酶基因之DNA序列的限制性切点进行分析，鉴定出NdeⅠ切点很接近于编码区的起始部分（图10）。使用体外诱变方法将NdeⅠ切点转变为SphⅠ切点，以允许克隆的5′末端自异源性酵母启动子表达。首先将FDP酶基因再克隆到pBR322中产生质粒AR705（图10）。用NdeⅠ消化质粒AR705並用绿豆核酸外切酶处理。将一端含SphⅠ切点之六个碱基对中的4个及另一端伸出有XhoⅠ切点的连接物连接于该质粒上，用XhoⅠ酶消化並用T4DNA连接酶闭合质粒环，以产生质粒AT823（图10）。将连接混合物转化到细菌内並筛选存在有SphⅠ和XhoⅠ切点的氨苄青霉素抗性菌落。
按下面叙述的方法将质粒AT823中的FDP酶基因连接到得自编码甘油醛磷酸脱氢酶之基因（GAP491）〔Holland and Holand，J.Biol.Chem，255∶2596-2605（1980））的启动子上。用KpnⅠ消化衍生于质粒M903的质粒O605（图13），用DNA PolⅠ的Klenow片段处理並用HindⅢ酶切。用SphⅠ酶切质粒AT823，用DNA PolⅠ的
Klenow片段处理、再用HindⅢ酶切並分离3.8Kb SphⅠ/HindⅢ片段，之后连接到HindⅢ/KpnⅠ消化的O605上以产生质粒AU125。这样，质粒AU125中FDP酶基因的表达便是由GPDH启动子调节的了。
FDP酶诱变
将包含异源性启动子之FDP酶基因的质粒转化到酵母内並试验转化体能否表达FDP酶克隆。当细胞于诱导条件下生长于异生葡萄糖碳源或酵解碳源上时可以测得FDP酶活性。而当于发酵条件下生长时即可因变构抑制物的存在和酶失活化而降低了酶活性。
因为失活化作用是由丝氨酸残基的磷酸化介导的，所以本发明所期望达到的结构基因的改变即在于除去这一磷酸化位点。序列中被磷酸化的丝氨酸残基经鉴定是为残基12（仅有的cAMP依赖性蛋白激酶的识别位点）。对此也同时根据纯化的磷酸化了的酶的肽谱和对被磷酸化之肽的氨基酸序列分析（Rittenhouse et al，J.Biol.Chem.，261：3939-3943（1986）得以确认。
前已发现，对肝FDP酶进行温和地胰蛋白酶消化，可产生仍保留了酶活性的氨基末端删除（Chattejee et al，1985）。哺乳动物和酵母FDP酶表现有很高的活性保留水平。如此造成酵母酶的氨基末端删除並作活性试验。
使果糖-1，6-二磷酸酶（FDP酶）与存在于基因片段之氨基末端DNA序列中的EcoRV限制性切点（图12，AX4）来的酵母GPDH启动子挂上钩，从而得到至残基19的氨基末端删除部分。经这一删除便丢失了蛋白激酶的识别位点。
另外，可使用位点针对性诱变将丝氨酸（残基12）换成丙氨酸（Zoller and Smith，上述文献）。这是一种保留性改变，不会影响非磷酸化之蛋白质的活性，但可阻止酶的磷酸化。亦可用位点针对性诱变方法将丝氨酸换成苏氨酸、缬氨酸、半胱氨酸或其它一种氨基酸（图13）。这可通过将这个残基周围的序列部分克隆到单股DNA病毒即M13内达到。制备一合成的寡核苷酸，使其与DNA的这个区域杂交，但在丝氨酸残基上有误配，以至该序列置换了另一密码子。之后使用DNA聚合酶PolⅠ的Klenow片段由这一杂化物制得一双股分子。该反应是在所有四种脱氧核糖核苷酸和DNA连接酶的存在下进行的。之后再将这一杂化双股DNA克隆到细菌内、复制、再分离並重新转化到细菌内，以解开两股。子链的一半含有编码丝氨酸的序列，另一半含有被置换的编码丙氨酸的其它经选择之氨基酸密码子的序列。它们可通过与互补于置换了的序列的短寡核苷酸杂交得以鉴别。之后将置换了的基因放回上述的多拷贝GPDH表达载体内並转化到酵母的实验室菌株（如KY114）内。
为测定酵解的速率，可检测生长于小的一升发酵器内的自甘油醛磷酸脱氢酶（GPDH）启动子表达FDP酶之克隆的酵母培养物。培养物成批培养並以110ml/分的流速使之鼓泡通入氮气。定时测定二氧化碳排出量及细胞密度。
先将表达野生型酶（质粒AU125）和表达氨基末端删除（质粒AX4）的酵母培养物与含对照质粒（质粒AU110，不表达FDP酶）（图14）的酵母培养物比较。在生长周期的开始阶段由这些培养物产生的二氧化碳水平十分相近。但在生长周期的终末，则产生了明显较高水平的CO2。携带氨基末端FDP酶删除的菌株二
氧化碳排出的增加少于表达野生型酶的菌株。然而在这一酵母菌株中FDP酶似乎並没有被失活，而且氨基末端删除者比“野生型”酶具有低得多的特异活性。因此可望野生型酶比包含氨基末端删除的酶能产生更大的酵解刺激作用。令人感兴趣的是，二氧化碳放出增加只出现在生长周期的终末。这一点提出FDP酶在指数生长期内受到变构调节。参与这一调节的很大可能是果糖-2，6-二磷酸或AMP。
造成了在FDP酶的磷酸化位点中具有特异性点突变的突变体后，再次重复发酵实验。在这些实验中，试验了自GPDH启动子表达FDP酶的菌株ATCC26675〔该菌株包含有丝氨酸变成丙氨酸的突变（质粒BA601）〕，或者含不表达FDP酶之对照质粒的菌株。在许多被试酵母菌株中，发现菌株ATCC26675可产生较高水平的失活化作用。因此可初步估计这些培养物可能会增加了气体产生能力。
完成上述的发酵並测定二氧化碳和细胞密度。表达FDP酶的菌株在生长周期之末再次增加了二氧化碳的释放。重复发酵实验並得出有良好再现性的结果。在生长周期终末收获培养物、离心並用下述的气体生成实验检测之。
气体生成试验是在如图16所示的装置内进行的。试验用烧瓶内装有1g细胞，1g葡萄糖和10ml培养基（酵母含氮有机碱，Difco），且最后的OD-600nm值为12。所有溶液均为32℃。水浴温度亦为32℃。在将烧瓶放入水浴中之后的前10分钟里管A是打开着的。关闭管A定时测定CO2排出量，並在调整滴定管Y中的液体水平达到滴定管X中的水平以使滴定管X内的气体达到大气压力后测定排到滴定管X内的CO2量。测定直到产生100
ml CO2时为止。含上述质粒的菌株中CO2的产生速率如图17图解所示。在这一试验中，表达突变FDP酶的菌株之气体生成能力增加了25%。
除上述修变外，本发明还试图用果糖-2，6-二磷酸或AMP改变FDP酶的变构调节。
果糖-2，6-二磷酸是使用果糖-6-磷酸-2-激酶通过酶促途径由果糖-6-磷酸合成的（Clifton and Fraenkel，J.Biol.Chem.，258：9245（1983）;Pilkis et al.，J.Biol.Chem.，259：949（1949））。
降低对酶活性的抑制作用的一种方法是在体外使FDP酶的克隆拷贝产生突变（如见Shortle at al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，79：1588（1982））並将其重新引入细胞内自身复制的、可选择的酵母质粒上，之后分析果糖-2，6-二磷酸和AMP之抑制效应的丧失。原则上说，结合变构抑制物之位点的丢失常常是酶结构中的一个相当保守的改变，因为既使结合位点的一个轻微修变即可在很大程度上改变对果糖-2，6-二磷酸的亲合力。这一研究须对改变了的酶作很好的分析。因为FDP酶是在可诱导的启动子控制下的，所以当无效循环在诱导条件下有效地进行时，生长于可发酵碳源上的突变体菌落长得很小，而在非诱导条件下生长的菌落则呈正常大小。可疑的突变体菌落也被接种在异生葡萄糖的碳源平板上，此时它们可在诱导条件下正常生长。因此，可将这样的菌落筛选方法用于分析被改变了的酶。
最后，按上述的程序将改变了的FDP酶引入面包酵母菌株内。已发现含有被改变了的FDP酶的面包酵母显著地增加了发酵能力。
实施例2
胞浆酸性磷酸酶的表达
制备AP酶的启动子片段
用各种限制性酶切含酸性磷酸酶大亚基P60（PHO5）全拷贝的质粒YIpAⅡ（Roger at al，1982，上述文献）並作出其基因图，发现HpaⅡ给出含有自结构基因起始密码子之600bp上游DNA序列的一个700bp限制性片段;已参照片段上ClaⅠ切点定出了这些酶切点的位置（Thill et al.，Molecular Cell Biology，3：570-579（1983））。用HpaⅡ酶切质粒YIpAPⅡ，将DNA加于制备用1.5%琼脂糖凝胶上电泳。按前述方法将含有启动子的700bp区带洗脱到切入凝胶的小井内，並在DEAE Sephacel柱上纯化之。将该片段混合用YOpⅠ与ClaⅠ酶切並用T4DNA连接酶连接所得DNA。因为HpaⅡ和ClaⅠ片段有自身互补的“粘性末端”，所以这些DNA片段将会连接在一起。将连接混合物转化到HB101内並筛选存在有启动子片段的氨苄青霉素抗性菌落。将一个这样的质粒920（见图18）用于下一步构建。
从酸性磷酸酶基因片段（PHO5）的DNA序列（图3）（Thill et al，1983，上述文献，Arima et al，N.A.R.11：1657-1672（1983））中起始密码子ATG的5bp上游鉴定出具有BglⅡ限制性内切酶识别位点之六个碱基中四个碱基的区域。使用自身互补序列GTAGCATGCTAG的合成的寡核苷酸连接子，用这个区域在AP酶启动子序列的这个点上造成-BglⅡ切点。
用KpnⅠ酶切质粒920（见图20），並用双股核酸外切酶Ba131（Legerski et al，A.A.R.，5：1145-1463（1978））处理DNA。以一定的时间间隔加入乙二胺四乙酸（EDTA）至0.05M以终止反应（Legerski et al，1978，上述文献）。用ClaⅠ消化在每一时间间隔里分离的质粒並在12%聚丙烯酰胺凝胶上电泳。记录300bp ClaⅠ/KpnⅠ片段被消化成约270bp的时间点。用DNA聚合酶1的Klenow片段和四种dTNP处理由这一时间点得到的经Ba131处理之质粒的剩余部分。激活自身互补序列CTAGCATGCTAG之连接子、退火並连接到这个质粒DNA上。之后用T4DNA连接酶处理使之成环状並转化到HB101内。由平板上洗下大约二千个氨苄青霉素抗性菌落並由这些大肠杆菌细胞中制取超螺旋质粒DNA（Mahiatis et al，1982，前述文献）。用限制性酶BglⅡ切储集的质粒DNA並在制备用琼脂糖凝胶上电泳分离之。将电泳呈切割线形带的DNA洗脱到切入琼脂糖中的小井内並在DEAE Sephacel柱上纯化之。用T4DNA连接酶处理使该纯化的DNA连接成环状並转化到HB101内。筛选存在有BglⅡ切点的氨苄青霉素抗性菌落。使质粒得有BglⅡ切点的唯一方法是使切点产生于Ba131消化的DNA与连接子（Iinker）的接合点上。而使其能够出现于KpnⅠ切点之上游几千bp内的唯一可利用的序列是在ATG起始密码前面的5个碱基。检查含有BglⅡ切点的一个这样的质粒D718（图20），其显示与用Sanger的二脱氧核糖核苷酸序列分析法（Sanger et al，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，74：5463-5467（1977））测定结果
相符。
存在于大肠杆菌HB101中的质粒YIpAPⅡ已寄存于美国典型培养物保藏中心（ATCC）：
大肠杆菌HB101（YIpAPⅡ）-ATCC39570号
在前导物/天然蛋白接合处造成限制性切点
从酸性磷酸酶基因的序列中可以看出（图18），在紧接成熟序列的起始处有一个KpnⅠ切点。这个切点即可使我们能够使用一合成的寡核苷酸序列 ![]()
在前导序列和成熟蛋白序列的接合处引入一限制性切点。因为酸性磷酸酶基因中有几个KpnⅠ切点，所以一片段必然是从基因的5′端再克隆。用BamHI和SalⅠ酶切质粒YIpAPⅡ並将含有启动子的片段再克隆到YOpⅠ的BamHⅠ/SalⅠ切点内（图21）。筛选转化了的细菌並发现质粒801具有相符的序列。为了在成熟序列的5′端引入限制性切点，可用KpnⅠ酶切质粒801並将上述的连接物连接于KpnⅠ切点（图21）。之后用BamHⅠ酶切质粒並用DNA聚合酶Ⅰ的Klenow片段作切点“填入”，再将质粒连接成环状。筛选存在有连接物的转化之细菌菌落。将一个这样的质粒（J401）用于进一步的构建。正如从图21中可以看出的，该连接物在前导序列和成熟之酸性磷酸酶序列的接合处造成了一个XhoⅠ切点，这样一来，如果用XhoⅠ酶切质粒並用绿豆核酸外切酶消化突出部分，即可在成熟之编码区的起始处序列的相符位置上造成一平头切点。
合成酸性磷酸酶的“前导丢失”克隆
首先由质粒J401构建酸性磷酸酶的全长度拷贝。用BamHⅠ酶切质粒YIpAPⅡ，用DNA聚合酶Ⅰ的Klenow片段“填入”
5′伸出部分，之后用SalⅠ酶切並经制备凝胶电泳纯化含AP酶基因的BamHⅠ/SalⅠ片段。将该片段连接到质粒J401的SalⅠ/NruⅠ切点内（图22）。将“填入”的BamHⅠ切点连接到NruⅠ切点上再形成BamHⅠ切点。接下来将酸性磷酸酶启动子重新接到结构基因上。用BglⅡ酶切质粒D718並将再建酸性磷酸酶启动子序列至起始因子蛋氨酸密码子之序列 ![]()
的连接物连接于BglⅡ切点上。之后用EcoRⅠ酶切质粒並将EcoRⅠ至BglⅡ连接物片段（图22）克隆到已经用XhoⅠ酶切过的质粒K219内，用绿豆核酸外切酶处理以嵌平DNA的末端，再用EcoRⅠ酶切。筛选转化体並用二脱氧核糖核苷酸序列分析法测定有相符限制片段之质粒的核苷酸序列。结果发现质粒M138在启动子和成熟基因的接合处具有相符序列。
向质粒内加入酵母着丝粒
酸性磷酸酶启动子可诱导提高活性约1，000倍。酵母质粒的拷贝数可因使用不同的复制原点或酵母着丝粒而不同（Clark & Carbon，1980;Tachumper and Carbon，1983）。酵母着丝粒可使2μ原点质粒的拷贝数减少到每细胞1个拷贝。
用EcoRⅠ酶切质粒M138並用DNA聚合酶1的Klenow片段将其末端修成平头。之后用HindⅢ酶切含得自酵母染色体4之着丝粒（Payent等，上述文献）的质粒YCP19（图23）並用DNA聚合酶1的Klenow片段将末端修成平头。再将此含着丝粒的片段连接到M138的EcoRⅠ切点上，以产生质粒N305（图22）。
胞浆酸性磷酸酶的表达
分别将质粒M138、N305及对照质粒M721转化到酵母内。选择尿嘧啶原养型並于1升New Brunswick Scientific F200型发酵器内使之生长在含过量葡萄糖（4%）的高磷酸盐MO培养基中。生长期间定时取样用Bausch和Lomb Spectr-onic 20型分光光度计于600nm检测细胞密度。发酵器工作温度为30℃並装有4头搅拌装置。以430CC/分的流速连续鼓泡通入氮气，排出气体通过Dry-Rit的湿吸收器进入Perkin Elmer气相质谱仪以检测CO2含量（%）。结果列于表2。
表2
未诱导的培养物中二氧化碳的释放
对照质粒M721
时间（分） 细胞数（X106） 二氧化碳（%）
0 0.25 0.08
80 0.64 0.21
150 0.90 0.16
215 1.35 0.19
280 1.8 0.26
340 2.3 0.34
405 3.3 0.45
470 4.75 0.61
520 6.25 0.73
580 7.0 0.79
630 8.5 0.85
（续）
时间（分） 细胞数（X106） 二氧化碳（%）
690 10.0 0.85
710 11.0 0.75
表2（续）
质粒N305
时间（分） 细胞数（X106） 二氧化碳（%）
0 1.1 0.17
60 1.35 0.22
108 1.5 0.26
165 2.0 0.35
245 3.0 0.50
345 5.0 0.76
390 6.5 0.92
465 8.5 1.05
520 10.0 1.15
610 14.5 1.02
685 16.0 0.86
表2（续）
质粒M138
时间（分） 细胞数（X106） 二氧化碳（%）
0 2.7 0.72
48 3.5 0.77
77 4.0 0.87
105 5.0 1.02
165 7.2 1.31
200 8.0 1.56
238 8.5 1.70
286 10.5 1.75
363 13.0 1.75
450 16.5 1.65
568 20.0 1.60
632 21.0 1.44
由上列表2可以看出，由携带三种不同质粒的菌株在其生长于高磷酸盐培养基上时产生的二氧化碳水平是不同的。而在高磷酸盐培养基中有基础水平的启动子活性即足以影响酵解的速率。整理这些数据並使之在生长周期的同一阶段标准化，可发现由生长于高磷酸盐培养基中的培养物产生的二氧化碳水平将随着质粒的拷贝数增多而增加。携带多拷贝质粒的菌株产生的二氧化碳量为携带对照质粒者的两倍，而携带单拷贝质粒者则产生中等水平的二氧化碳。因此，可按照本发明的方法控制酸性磷酸酶的水平进而控制胞浆ATP的水平並增加二
氧化碳的产生速率。
实施例3
胞浆膜解偶联剂对酵解速率的影响
当以不断增加的量向Fleishman氏面包酵母的稳定的恒化器培养物内加入2，4-二硝基苯酚时，可观察到对酵母二氧化碳产生有相当大的刺激作用。
实验首先是测定每个细胞于恒化器所限定的生长条件下产生之二氧化碳的基础水平，並测定培养物的稳定性。将一过夜培养物接种到恒化器内並使之作为批量培养物生长24小时。开始给进培养基后，于测定前再使培养物稳定24小时。监测48小时内二氧化碳产生量及细胞数。结果如表3所示。时间标示为开始加培养基后的小时数。二氧化碳量以其在气体流中所占百分比表示。
表3 恒化器培养物的稳定性
开始加培养基 培养物密度 细胞数 排出气体中的
后的小时数 O.D.-600nm 细胞/ml×10-8CO2百分比
26 0.33 1.1 2.4
29.5 0.32 1.1 2.3
32 0.31 1.0 2.3
34 0.33 1.1 2.2
50 0.31 1.0 2.3
培养物显示为相对稳定。
加至培养基进料内的二硝基苯酚浓度为5μM。亦按实验程序所
述将二硝基苯酚以5μM的浓度加到培养容器内。
培养物留置稳定24小时。从表4所示的结果可以看出，5μM二硝基苯酚对二氧化碳的产生量有稍许影响。
表4 二硝基苯酚对发酵速率的影响
二硝基苯酚 细胞密度 排出气体中 每个细胞的相
的浓度（μM） 细胞数/ml×10-8的CO2百分比 对CO2产生量
0 1.1 2.2 1.0
5 1.1 2.3 1.0
20 0.75 1.85 1.2
50 0.75 2.0 1.3
100 0.67 2.0 1.5
200 0.55 1.9 1.7
0 1.1 2.3 1.0
培养物中二硝基苯酚的浓度缓慢地分段增加到200μM。每加一次二硝基苯酚后、测定细胞密度二氧化碳浓度前均将培养物放置稳定36至48小时。如上列表4所示，随着二硝基苯酚浓度的不断增加，每个细胞二氧化碳的产生水平增加。
如果二硝基苯酚对细胞代谢的影响在于胞浆膜ATP酶的解偶联，即可望能够增加二氧化碳输出量並相应地减少细胞密度。应该想到，胞浆膜离子梯度的破坏也可影响其它依赖这一离子梯度的细胞过程（即运输过程）。因此，发现经这种处理后细胞代谢效率降低是不足为奇的。对酵解的这种水平的刺激作用可认为是最低限度的。
实验已证明，以一剂量依赖方式加入二硝基苯酚可刺激二氧化碳产生。刺激作用的水平显示有良好的可重复性，並且当使用最高浓度时，二氧化碳产生量可增加二倍以上。