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1、(10)申请公布号 CN 102228718 A (43)申请公布日 2011.11.02 CN 102228718 A *CN102228718A* (21)申请号 201110172555.0 (22)申请日 2011.06.24 A61L 27/38(2006.01) C12N 5/0797(2010.01) (71)申请人 中国人民解放军军事医学科学院基 础医学研究所 地址 100850 北京市海淀区太平路 27 号 (72)发明人 王常勇 李蓝兰 林秋霞 陈威震 韩尧 张志立 王妍 (74)专利代理机构 北京众合诚成知识产权代理 有限公司 11246 代理人 史双元 (54) 发明名。
2、称 一种组织工程化神经组织及其构建方法 (57) 摘要 本发明公开了属于组织工程与再生医学技 术领域的一种组织工程化神经组织及其构建方 法。该组织工程化神经组织以传代、 纯化培养的 神经干细胞作为种子细胞， 以液态 I 型胶原和 Matrigel 基质作为支架材料， 种子细胞与支架材 料体外复合后进行培养。本发明采用的支架体系 能够有效地维持神经干细胞的存活与增殖， 促进 神经干细胞的分化， 形成由分化成熟神经元、 星形 胶质细胞和少突胶质细胞构成的工程化神经组 织。本发明对于未来临床利用组织工程化神经组 织移植治疗神经系统损伤具有重要意义， 同时也 可以作为神经发育、 脑外伤以及神经电生理研。
3、究 的体外模型。 (51)Int.Cl. (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书 1 页 说明书 4 页 附图 1 页 CN 102228719 A1/1 页 2 1. 一种组织工程化神经组织的构建方法， 其特征在于， 按照如下操作步骤进行 ： (1) 制备神经干细胞悬液 从已死亡的 Wistar 小鼠大脑皮层组织中分离得到神经干细胞， 传代纯化培养， 然后用 DMEM 培养液重悬细胞制备细胞密度为 1106 1108的神经干细胞悬液 ； (2) 胶原 /Matrigel 支架材料的制备 将胶原与 10DMEM 混匀， 并用 NaOH 调节其 pH 值至 7.2。
4、-7.4， 然后加入 Matrigel， 充分 混匀， 此操作过程在冰上进行 ； (3) 细胞与支架材料的复合及细胞 - 支架材料复合物的培养 将步骤 (1) 制得的细胞悬液与步骤 (2) 制得的胶原 /Matrigel 支架材料混合， 其中胶 原的终浓度为 0.4-1mg/mL， 支架材料中 Matrigel 所占的体积分数为 10 -80； 然后将获 得的细胞 - 支架材料复合物加至培养板中， 置于 5 CO2、 37的培养箱中培养 30min， 待细 胞 - 支架材料凝胶化后再加入含生长因子的 DMEM-F12 培养基， 培养 14 天， 即得到组织工程 化神经组织。 2. 根据权利要求。
5、 1 所述一种组织工程化神经组织的构建方法， 其特征在于， 所述胶原 为液态 I 型鼠尾胶原。 3. 根据权利要求 1 所述一种组织工程化神经组织的构建方法， 其特征在于， DMEM-F12 培养基中的生长因子为 5 50ng/mL 碱性成纤维生长因子和 5 50ng/mL 表皮生长因子。 4. 一种利用权利要求 1-3 任一所述的组织工程化神经组织构建方法获得的组织工程 化神经组织。 权 利 要 求 书 CN 102228718 A CN 102228719 A1/4 页 3 一种组织工程化神经组织及其构建方法 技术领域 0001 本发明属于组织工程与再生医学技术领域， 具体涉及一种组织工程。
6、化神经组织及 其构建方法。 背景技术 0002 组织工程是 20 世纪 80 年代末发展起来的一门新兴交叉学科， 近年来， 随着生命 科学和材料科学的发展， 科研人员相继在骨骼、 软骨、 皮肤等多种组织和器官体外再造研究 方面取得突破性进展， 其中， 一些组织工程产品如软骨、 皮肤已实现商品化。尽管由于神经 系统本身的复杂性， 再加上组织工程化神经组织的研究起步较晚， 目前在体外构建的神经 组织还远不能实现商品化 ； 但是， 随着干细胞、 神经营养因子与生物材料研究领域的快速 发展， 体外构建组织工程化神经组织后的体内移植已经成为治疗脊髓与周围神经损伤研 究的重要手段， 也可以作为体外模型进行。
7、神经干细胞发育机理、 神经电生理、 脑损伤等研 究。James 等人的研究发现， 将混有雪旺氏细胞及成纤维细胞的胶原注入硅管中， 移植修 复坐骨神经损伤， 能够促进其神经再生 1。Heather 等人研究发现， 复合神经干细胞或者 雪旺氏细胞的 PLGA 移植治疗大鼠脊髓横断损伤能有效的促进轴突再生 2。Hillary 等用 Matrigel 为基质， 神经元和星形胶质细胞混合体外再造神经组织， 作为神经生理学研究平 台 3。Michelle 等将神经元、 星形胶质细胞以及 Matrigel 混合再造的三维神经组织作为 脑外伤研究模型， 研究高速剪切力对其损伤的细胞机制 4。 0003 生物材。
8、料是细胞附着的基本框架和代谢场所， 其形态和功能直接影响所构成组织 的形态和功能。对于神经组织体外三维再造而言， 再造的三维微环境必须能够支持神经细 胞的黏附、 突起生长与功能性突触的形成， 并且能够允许营养物的扩散， 从而能够长时间 的培养与研究。目前， 在神经组织的体外三维再造研究中， 所应用的支架材料包括胶原、 Matrigel、 琼脂糖、 三维文石生物基质等。其中， 利用三维文石生物基质作为支架材料构建 的神经组织中的神经元与星形胶质细胞的能够高效存活 5 ； 将神经干细胞接种于胶原基质 并在旋转壁式生物反应器提供的微环境下进行长期培养， 能够形成在结构和功能上一定程 度类似于胚胎脑皮。
9、层的双层结构 6 ； 利用气 / 液界面系统进行胚胎干细胞来源的神经祖细 胞的体外扩增和分化可以形成有机的三维神经组织， 该方法形成的组织在表型和结构上与 早期发育的胎儿脑具有相似性 7。 0004 但是， 根据以往研究报道， 利用单纯 I 型胶原体外再造的神经组织由于缺少氧气 和营养致使神经细胞难以长期生存， 而单纯 Matrigel 构建的组织韧性差、 易碎。将一定比 例的 Matrigel 掺入 I 型胶原获得的胶原 /Matrigel 支架除了具有胶原低免疫原性， 良好的 生物相容性等优点之外， 还可以改善胶原的物理特性， 使其疏松多孔， 能够更好的作为组织 工程支架材料， 为细胞提供。
10、附着点， 且便于细胞在三维孔径中的生长延展， 利于氧气、 营养 物质和代谢废物等的运输， 且 Matrigel 中的一些组分如层连接蛋白、 IV 型胶原、 巢蛋白等 能够为细胞生长提供营养作用。将液态 I 型胶原 /Matrigel 应用于神经组织工程， 作为神 经干细胞的支架材料尚未见报道。 说 明 书 CN 102228718 A CN 102228719 A2/4 页 4 发明内容 0005 本发明的目的在于提供一种组织工程化神经组织的构建方法。 0006 本发明的目的还在于提供一种利用上述方法获得的组织工程化神经组织。 0007 一种组织工程化神经组织的构建方法， 按照如下操作步骤进行。
11、 ： 0008 (1) 制备神经干细胞悬液 0009 从已死亡的 Wistar 小鼠大脑皮层组织中分离得到神经干细胞， 传代纯化培养， 然 后用 DMEM 培养液重悬细胞制备细胞密度为 1106 1108的神经干细胞悬液 ； 0010 (2) 胶原 /Matrigel 支架材料的制备 0011 将胶原与 10DMEM 混匀， 并用 NaOH 调节其 pH 值至 7.2-7.4， 然后加入 Matrigel， 充分混匀， 此操作过程在冰上进行 ； 0012 (3) 细胞与支架材料的复合及细胞 - 支架材料复合物的培养 0013 将步骤 (1) 制得的细胞悬液与步骤 (2) 制得的胶原 /Matr。
12、igel 支架材料混合， 其 中胶原的终浓度为 0.4-1mg/mL， 支架材料中 Matrigel 所占的体积分数为 10 -80； 然后 将获得的细胞 - 支架材料复合物加至培养板中， 置于 5 CO2、 37的培养箱中培养 30min， 待细胞 - 支架材料凝胶化后再加入含生长因子的 DMEM-F12 培养基， 培养 14 天， 即得到组织 工程化神经组织。 0014 所述胶原为液态 I 型鼠尾胶原。 0015 DMEM-F12 培养基中的生长因子为 5 50ng/mL 碱性成纤维生长因子和 5 50ng/ mL 表皮生长因子。 0016 一种利用上述的组织工程化神经组织构建方法获得的组。
13、织工程化神经组织。 0017 本发明的有益效果 ： 本发明用鼠尾液态 I 型胶原， 结合 Matrigel 基质胶作为组织 工程化神经组织的支架， 同现有的用于神经组织的支架材料相比， 该支架材料能够有效的 促进细胞在材料中的存活， 其中， Matrigel 基质胶掺入 I 型胶原后， 有效的增加了胶原表明 的孔径， 更有利于气体以及营养物质的交换， 且 Matrigel 基质胶中的 IV 型胶原、 层连接蛋 白等对细胞的生长有营养支持的作用。 本方法操作简单、 可实施性强， 能够较好的维持神经 干细胞的存活与增殖， 促进神经干细胞的分化， 对推进组织工程化神经组织发展具有重要 意义。 附图说。
14、明 0018 图 1 为神经干细胞在相差显微镜下观察结果 ； 0019 图中， bar ： A 100m， B 200m。 具体实施方式 0020 通过以下实施例对本发明做详细描述， 但是以下实施例仅作为例证， 并不对本发 明构成任何限制。 0021 实施例 1 组织工程化神经组织的体外构建 0022 本实施例中使用的细胞分离、 培养及组织鉴定所需试剂 ： 0023 (1) 解剖液 ： 3g D- 葡萄糖， 7.5g 蔗糖， 2.34g HEPES， 8g NaCl， 0.4g KCl， 0.24g 说 明 书 CN 102228718 A CN 102228719 A3/4 页 5 Na2H。
15、PO4， 4.12g H2O， 0.03g KH2PO4加至 1L 超纯水中， 调 pH 值为 7.2-7.4， 0.22m 滤膜过滤 除菌， 4保存。 0024 (2)DMEM-F12 培养基 ： DMEM-F12 干粉培养基一包溶解于 1000mL 超纯水中， 添加 1.2g NaHCO3， 调节 pH 值为 7.2-7.4， 经 0.22m 滤膜过滤除菌， 分装并 4保存。 0025 (3) 浓缩培养基 (10H-DMEM) ： DMEM-F12 干粉培养基一包溶解于 100mL 超纯水 中， 添加 1.2g NaHCO3， 调节 pH 值为 7.2-7.4， 经 0.22m 滤膜过滤除。
16、菌， 分装并 4保存。 0026 (4) 胰酶抑制剂 ： 1mg/mL 胰酶抑制剂溶解于 DMEM-F12 溶中， 0.22m 滤膜过滤除 菌， 4保存， 现用现配。 0027 (5)NSC 完全培养基 ： 以 DMEM/F12 作为基础培养基， 添加 1 N2、 2 B27、 20ng/mL EGF 和 20ng/mL bFGF， 现用现配。 0028 (6)NSC 分化培养基 ： 以 DMEM/F12 作为基础培养基， 添加 1 N2、 2 B27 和 5 FBS， 现用现配。 0029 1、 大鼠神经干细胞的分离、 纯化与鉴定 0030 大鼠神经干细胞来源于已死亡的Wistar大鼠。 取。
17、Wistar大鼠大脑皮层， 并剥去脑 膜， 随后将之转移到 60mm 培养皿中， 用眼科剪剪成 1mm3左右的组织块， 整个操作过程在冰 盒上进行。然后将组织块转移到 35mm 培养皿中， 加入适量 0.25胰酶溶液消化约 20min， 胰酶抑制剂终止消化， 移入离心管中 1000rpm 离心 5min， 弃上清， 将沉淀移入到完全培养基 中， 并用吸管轻轻吹打成细胞悬液， 并通过 200 目的筛网过滤。收集到的细胞悬液通过血球 计数板计数， 以 1-2105个 /mL 的细胞密度接种于培养瓶中。5 CO2， 37孵箱恒温培养 5-7d， 待神经干细胞分裂、 增殖形成较大的细胞球后传代。 00。
18、31 待原代培养 5-7d， 神经干细胞克隆形成后， 用吸管在培养瓶中轻轻吹打， 使沉在 瓶底没有贴壁的神经球浮起， 然后将神经球和培养液一并移入到 50mL 的无菌离心管中， 800rpm离心4min， 弃上清， 加入适量0.25胰酶37消化约3min， 胰酶抑制剂终止消化， 然 后用巴斯德吸管机械吹打成单个细胞悬液， 经 200 目筛网过滤， 将收集到的液体血球计数 板计数， 1000rpm 离心 5min， 弃上清， 加入神经干细胞完全培养基调整细胞浓度为 1-2105 个 /mL， 并接种于培养瓶中。于 5 CO2， 37孵箱恒温培养。以后每隔 3-4d 传代一次， 方法 同前。相差显。
19、微镜下的观察结果表明， 神经干细胞存活良好， 形成大小均一的细胞克隆 ( 图 1) ； 免疫荧光染色结果表明， 分离培养的细胞内表达神经干细胞特异性的 Nestin 蛋白， 具 有良好的增殖能力和多向分化的潜能。 0032 2、 细胞与支架材料的复合及复合物培养 0033 将神经干细胞， 加入液态 I 型鼠尾胶原、 Matrigel、 10DMEM 混匀， 并用 NaOH 调 节 pH 值， 调整胶原浓度为 0.5mg/mL、 Matrigel 所占体积分数为 60、 神经干细胞密度为 1107/mL ； 将细胞 - 支架材料的混合物加入 48 孔板， 每孔注入复合物 200L。30min 后。
20、， 待细胞 - 胶原复合物凝固， 加入无血清培养基培养。24h 后更换培养液， 此后每天更换培养 液。 0034 实施例 2 体外构建的组织工程化神经组织的 Live/Dead 和免疫荧光检测 0035 Live/Dead检测 ： 实施例1中体外构建的组织工程化神经组织， 在培养的第1d、 3d、 7d， 用 Live/Dead 试剂盒检测组织工程化神经组织内细胞存活的影响。方法如下 ： 首先将 20l的2mM EthD-1和5l的4mM Calcein AM加入到10ml PBS中制备染料溶液 ； 弃培养 说 明 书 CN 102228718 A CN 102228719 A4/4 页 6 。
21、基， PBS 漂洗 3 次 ； 加入 1mL 染料溶液， 37染色 60min ； 弃染液， 新鲜 PBS 再次清洗 30min ； 随机选取 3-5 个视野运用激光共聚焦检测细胞存活情况。 0036 结果显示， 神经干细胞以及分化细胞在胶原 /Matrigel 复合物中存活良好， 在体 外培养 7 天时， 存活率仍然高达 87以上。 0037 免疫荧光检测 ： 实施例 1 中体外构建的组织工程化神经组织， 在体外培养 14d 后， 去除培养基， 将细胞 - 材料复合体在预冷冷 4多聚甲醛中固定 30min ； PBS 漂洗 5min3 次 ； 加入 MAP2、 GFAP 或 Oligo2 抗。
22、体 37孵育 2h ； PBS 漂洗 5min3 次 ； 加入二抗 37孵育 30min ； PBS 漂洗 5min3 次 ； 共聚焦荧光显微镜观察结果。 0038 结果显示， 神经干细胞在胶原/Matrigel复合物中分化为GFAP阳性的星形胶质细 胞， MAP2 阳性的神经元以及 Oligo2 阳性的少突胶质细胞。 0039 参考文献 0040 1.Olson HE，Rooney GE，Gross L，Nesbitt JJ，Galvin KE，Knight A， Chen B， Yaszemski MJ， Windebank AJ.Neural stem cell-and Schwann 。
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