多孔生物材料-填充物复合物及其制造方法
技术领域
本发明涉及多孔生物材料-填充物复合物、其制备方法及使用。在 一个具体实施方案中，本发明涉及无机胶原支架。
背景技术
骨骼的30％到35％是由有机材料组成(基于干重)。此有机材料中 约95％是胶原。其余有机成分是软骨素硫酸盐、角蛋白硫酸盐和磷脂。 骨骼的65％到70％是由无机物质组成。几乎所有的这些无机物质都是 由羟磷灰石组成。
当需要对大量流失的骨质进行替换时，通常采用多种移植物或永久 性的合金植入物来实现。有时这些移植物和植入物不能达到期望的效果 是由于它们没有足够的强度提供给活动的生物体或没有足够的生物活 性来促进细胞附着和增殖。许多使用的植入物不能被天然的组织所吸 收，并且其力学性能或降解速率也不可调。
胶原是具有低的免疫原性、生物可吸收并且可被细胞附着、反应以 及降解的天然形成的结构蛋白。胶原海绵以及胶原泡沫已被用作止血 剂、组织修复的支架和细胞生长的支撑物。然而，到目前为止，还没有 植入物或胶原海绵能够达到与天然骨骼相同或相似的性能。
发明目的
本发明的目的之一，至少在优选实施方案中，是克服或充分改善至 少一个上述的缺点。
发明概述
本发明的第一个方面是提供多孔生物材料-填充物复合物，其中， 该复合物含有分散有填充物的生物材料，并且该复合物具有与天然骨骼 相接近的孔隙率。
本发明的第二个方面是提供多孔生物材料-填充物复合物，其中， 该复合物含有分散有填充物的生物材料，并且该复合物具有孔径大于 100微米的孔、孔径在约30～50微米之间的孔以及纳米大小的孔。
本发明的第三个方面是提供多孔生物材料-填充物复合物，其中， 该复合物含有分散有填充物的生物材料，且生物材料与填充物的干重比 例为1∶3到2∶1。
在一种实施方案中，该复合物含有干重为25～65重量％的生物材 料和35～75重量％的填充物。
本发明的第四个方面是提供多孔生物材料-填充物复合物，其中， 该复合物含有分散有填充物的生物材料，并且生物材料的量至少约为25 重量％。
在一种实施方案的第三或第四个方面，该复合物可具有与骨骼相接 近的孔隙率。
本发明的第五个方面是提供多孔生物材料-填充物复合物，其中， 该复合物含有分散有填充物的生物材料，并且该复合物填充物是通过溶 胶-凝胶的方法制备。
本发明的第六个方面是提供制备多孔生物材料-填充物复合物的方 法，该方法包括：
将生物材料、液体以及填充物进行混合从而形成混合物，
对混合物进行均化形成浆状物，并且
对浆状物进行冻干，从而形成多孔生物材料-填充物复合物。
本发明的第七个方面是提供制备多孔生物材料-填充物复合物的方 法，该方法包括：
将生物材料和液体进行混合从而形成混合物，
对混合物进行均化形成浆状物，
将填充物加入浆状物中；
进一步均化浆状物；并且
对浆状物进行冻干，从而形成多孔生物材料-填充物复合物。
本发明的第八个方面是提供制备多孔生物材料-填充物复合物的方 法，该方法包括：
将填充物和液体进行混合从而形成混合物，
对混合物进行均化形成浆状物，
将生物材料加入浆状物中；
进一步均化浆状物；并且
对浆状物进行冻干，从而形成多孔生物材料-填充物复合物。
在一种实施方案中，液体为水或者能够形成浆状物的任何其它液 体。在一种实施方案中，当生物材料为胶原时，液体为酸。
本发明的第九个方面是提供制备多孔生物材料-填充物复合物的方 法，该方法包括：
将生物材料、液体以及填充物进行混合从而形成混合物，
对混合物进行均化形成浆状物，并且
对浆状物进行冻干，从而形成多孔生物材料-填充物复合物，其中 使用的液体为酸，并且浆状物中生物材料量的范围为每100ml到1000mM 的酸对应最多约10g的生物材料。
本发明的第十个方面是提供制备多孔生物材料-填充物复合物的方 法，该方法包括：
将生物材料和液体进行混合从而形成混合物，
对混合物进行均化形成浆状物，
将填充物加入浆状物中；
进一步均化浆状物；并且
对浆状物进行冻干，从而形成多孔生物材料-填充物复合物，其中 使用的液体为酸，并且浆状物中生物材料量的范围为每100ml到1000mM 的酸对应最多约10g的生物材料。
本发明的第十一个方面是提供制备多孔生物材料-填充物复合物的 方法，该方法包括：
将填充物和液体进行混合从而形成混合物，
对混合物进行均化形成浆状物，
将生物材料加入浆状物中；
进一步均化浆状物；并且
对浆状物进行冻干，从而形成多孔生物材料-填充物复合物，其中 使用的液体为酸并且浆状物中生物材料量的范围为每100ml到1000mM 的酸对应最多约10g的生物材料。
本发明的第十二个方面是提供通过方法六、七、八、九、十或十一 所制得的复合物。
定义
下面所给出的定义为一般性定义，并不限制本发明的范围，而是为 了对下列描述进行更好的理解。
除非文中另外说明或明确做出相反陈述，本发明中所引用的单数形 式的整数、步骤或元素清楚地包括单数和复数两种形式。
在本发明中，除非另外说明，术语“包含”或其变化形式都应理解 为包括一个或多个所阐述的步骤、元素或整数，但也不排除包括一个或 多个其它的步骤、元素或整数。因此，在本说明书的上下文中，术语“含 有”表示“主要包括，但不只是包括”。
本领域的技术人员理解这里描述的本发明可有多种变化而不局限 于这些具体描述。应当理解，本发明包括所有的这些变化和改进。本发 明还包括所有在本说明书中所引用或所指的步骤、特征、组合物和化合 物，(这些步骤、特征、组合物和化合物可以是独立的或全体的)所述 的步骤或特征中的任何和所有的组合或任何二个或多个。
本申请中引用的所有参考文献及其全部内容均并入本发明做参考。
在本说明书的上下文中，术语“生物材料”是指任何适用于引入到 有生命的有机体如包含人在内的哺乳动物内的生物材料。当该生物材料 引入生命有机体时，要求其无毒和生物可吸收，并且该生物有机体的降 解物对于有机体来讲也是无毒的。该生物材料可以来源于生物体，或是 合成的变体。
附图的简要说明
现在，将通过实施例并参考对应的附图对本发明的优选方式进行描 述：
图1是制备本发明的复合物(骨骼支架)的适用方法的示意图；
图2是适用于本发明中的胶原的一组扫描电子显微图；
图3是适用于本发明中的羟磷灰石的一组扫描电子显微图；
图4A、4B、4C和4D是本发明中各种多孔支架的应力-应变图；
图5是小梁骨在各种辨析率下的一组扫描电子显微图；
图6是与本发明的一个实施方案相对应的无机胶原支架在各种辨析 率下的一组扫描电子显微图；
图7是与本发明的另一个实施方案相对应的无机胶原支架在各种辨 析率下的一组扫描电子显微图；
图8是与本发明的另一个实施方案相对应的无机胶原支架在各种辨 析率下的一组扫描电子显微图和XRD光谱图；
图9是与本发明相对应的两种无机胶原支架与天然骨骼和碳化羟磷 灰石的XRD对比图；
图10是与本发明相对应的四种无机胶原支架与碳酸钙和透钙磷石 的XRD对比图；
图11是各种原材料、与本发明的一个实施例相对应的无机胶原支 架和天然小梁骨的FTIR图谱。
图12是在与本发明的一个实施例相对应的支架上培养一星期的 MC3T3细胞(大鼠造骨细胞)的一组扫描电子显微图；
图13是将与本发明相对应的支架植入SCID大鼠后60天的异位植 入图；
图14是与本发明相对应的支架在植入8天以后，用苏木精和曙红 染色后的组织显微图；
图15是与本发明相对应的支架在植入30天以后，用苏木精和曙红 染色后的组织显微图；
图16是与本发明相对应的支架在植入8天以后，用冯库萨染色的 组织显微图；
图17是与本发明相对应的支架在植入30天以后，用冯库萨染色的 组织显微图；
图18是将与本发明相对应的支架植入威斯达大鼠大腿6个月后的 大腿骨的一组照片；
图19A、19B和19C分别为将与本发明相对应的支架植入威斯达大 鼠大腿5个月后的X射线图(图19A)、将商用支架植入威斯达大鼠大腿 5个月后的X射线图(图19B)以及没有植入支架的5个月后的X射线 图(图19C)。
优选实施方案的详细描述
在这里提供一种多孔生物材料-填充物复合物，该复合物含有充满 填充物的生物材料。在本发明的实施方案中，提供一种复合物，该复合 物含有生物材料相以及分散于其中的无机填充物。无机填充物分散于聚 合物相中是合适的。该生物材料和分散的填充物可以通过化学键结合在 一起。
在一种实施方案中，复合物的孔隙率与天然骨骼的孔隙率非常接 近。在一些实施方案中，希望本发明中的复合物能够与天然骨骼在结构、 化学和力学性能上尽可能相似，从而使得被植入复合物的生物体能够识 别并重新塑造该复合物以接近天然骨骼。
在一种实施方案中，复合物含有孔径大于100微米的孔、孔径在 30～50微米之间的孔以及小的纳米级孔。这些小的纳米级孔可能是由填 充物粒子之间的空隙所形成。这种孔隙率与骨骼的实际结构非常匹配， 大孔允许造骨细胞能够进行迁移，中等尺寸的孔使得血液/蛋白/体液能 够进行传送，而小尺寸的孔提供更好的细胞附着。
在一种实施方案中，复合物含有至少约25重量％的生物材料。填充 物最高可达到75重量％。在另一种实施方案中，复合物含有至少约25 到50重量％(干重)的生物材料，同时填充物占约35到约75重量％(干 重)。调节总量以及使用的生物材料和填充物可使得有机：无机的比率 与天然骨骼的组成相近。例如30～35重量％的胶原和65～70％的羟磷灰 石。
在一种实施方案中，填充物可事先通过溶胶-凝胶方式制备。使用 这种方式制备的填充物能够达到纳米级的孔隙率。
在一种实施方案中，还提供了一种制备多孔生物材料填充物复合物 的方法，其包括：
将生物材料、液体和填充物进行混合从而形成混合物，
对混合物进行均化形成浆状物，并且
对浆状物进行冻干，从而形成多孔生物材料-填充物复合物。
在另一种实施方案中，也提供了一种制备多孔生物材料填充物复合 物的方法，其包括：
将生物材料和液体进行混合从而形成混合物，
对混合物进行均化形成浆状物，
将填充物加入到浆状物中，
对浆状物进一步进行均化，并且
对浆状物进行冻干，从而形成多孔生物材料-填充物复合物。
在另一种实施方案中，也提供了一种制备多孔生物材料填充物复合 物的方法，其包括：
将填充物和液体进行混合从而形成混合物，
对混合物进行均化形成浆状物，
将生物材料加入到浆状物中，
对浆状物进一步进行均化，并且
对浆状物进行冻干，从而形成多孔生物材料-填充物复合物。
在一种实施方案中，复合物含有至少约25重量％的生物材料。在一 种实施方案中，液体为酸，并且在浆状物中生物材料量的范围为每100ml 到1000mM的酸中约含有最多约10g的生物材料。例如在50～500mM酸 如磷酸100ml中加入0.6～6g的生物材料如胶原(6mg/ml～60mg/ml)， 形成具有不同力学性能和微型结构的复合物。
用作原材料的一些样品成分的实施例包括：
50mM磷酸100ml+2g胶原+7.5g CAP(碳酸磷灰石)
50mM磷酸100ml+2g胶原+12g HAP(羟磷灰石)
100mM磷酸100ml+2g胶原+10g CaCO3(碳酸钙)
50mM磷酸100ml+4g胶原+7.5g CAP(碳酸磷灰石)
50mM磷酸100ml+4g胶原+12g HAP(羟磷灰石)
500mM磷酸100ml+4g胶原+10g CaCO3(碳酸钙)
在一种实施方案中，生物材料是从指生物组织中提取的材料，包括 如胎儿组织、皮肤/真皮、肌肉或连接组织，包括骨骼、腱、韧带或软 骨。在一种实施方案中，生物材料为生物聚合物。生物聚合物可以是生 物系统或有机体中天然形成的聚合物质。生物聚合物也可适当地为通过 对天然形成的生物聚合物进行加工后得到的人造聚合物。
任何生物材料可以在室温下形成稳定的固态结构，例如干燥后形成 薄膜、从融态结晶、交联后形成凝胶、冻干后形成泡沫，所形成的这些 材料可被用于本发明中。
在一种实施方案中，生物材料可以从蛋白、肽、多聚糖或其它有机 物质中选择一种或多种。例如生物材料可以是下列物质中的一种或多 种：胞外基质蛋白如纤连蛋白、层连蛋白、玻连蛋白、生腱蛋白、巢蛋 白、血小板反应蛋白、弹性蛋白、明胶、胶原、小纤维、分区蛋白、 锚定蛋白、软骨粘连蛋白、连接蛋白、骨骼唾液蛋白、骨钙蛋白、骨 桥蛋白、上皮表面蛋白(epinect in)、透明质酸连接蛋白、粗纤维调 节素、表皮整联配体蛋白以及缰蛋白、蛋白聚糖如饰胶蛋白聚糖、硫 酸皮肤素蛋白聚糖、角蛋白、硫酸角蛋白蛋白聚糖、聚集蛋白聚糖〔 软骨〕、硫酸软骨素蛋白聚糖、硫酸肝素蛋白聚糖、双糖链蛋白多 糖、黏结蛋白聚糖、基膜蛋白多糖、丝甘蛋白聚糖、糖氨聚糖如硫酸 肝素、硫酸软骨素、硫酸皮肤素、硫酸角质素或透明质酸、多聚糖 如肝素、硫酸葡聚糖、壳多糖、褐藻酸、果胶或木聚糖、聚乙烯 醇、细胞因子、苷类、糖蛋白、聚吡咯、清蛋白、纤维蛋白原或 磷脂。
在一种实施方案中，生物材料为胶原。在进一步的实施方案中，胶 原可以为下列胶原类型的一种或多种组合：胶原型I、胶原型II、胶 原型III、胶原型IV、胶原型V、胶原型VI、胶原型VII、胶原 型VIII、胶原型IX、胶原型X、胶原型XI、胶原型XII、胶原 型XIII、胶原型XIV、或上述物质的混合物。在一种实施方案中， 胶原为I型胶原。
生物材料可以通过如下方法萃取：酸萃取、盐萃取、酶/胃蛋白酶 萃取或上述方法的组合或通过其它的方法如机械方法萃取如研磨。使用 酸萃取来制备生物材料是通过氯化钠来沉淀生物材料(如胶原)并且在 酸性pH的介质中对该生物材料(如胶原)进行再溶解。
生物材料的来源包括陆地和海洋中的脊椎动物和无脊椎动物，如哺 乳动物、有袋动物、人、非人类的灵长类动物、鼠科动物、牛科动物、 绵羊科动物、马科动物、公山羊、野兔、鸟类、猫科动物、猪科 动物或犬科动物。在一种实施方案中，生物材料来源于哺乳动物或有袋 动物如人、猪、牛、羊、鹿、山羊、马、驴子、野兔、大鼠、小鼠、 兔、袋鼠、小袋鼠或骆驼。
在一种实施方案中，复合物可以形成泡沫、凝胶或包括纤维在内的 其它结构。在一种实施方案中，复合物以一种多孔泡沫的形式存在。该 泡沫可包括由生物材料分子和/或丝状体分散贯通而得的互相连接的微 小隔间的网络。在另一种实施方案中，复合物可以以无机填充物分散于 其中的生物材料细丝或纤维的形式存在。在一种实施方案中，复合物以 交联的海绵体泡沫形式存在。在另一种实施方案中，复合物以硬泡沫的 形式存在。在一种实施方案中，复合物可以以支架的形式存在。支架是 用于黏合细胞的基质层。
在一种实施方案中，填充物包括一种或多种无机化合物。在一种实 施方案中，填充物用于提高复合物的压缩模量。在一种实施方案中，无 机填充物包括碳酸钙或含钙的盐。在另一种实施方案中，无机填充物包 括磷酸钙，例如磷灰石或磷灰石的取代物。在进一步的实施方案中，填 充物包括碳酸钙和磷酸钙的组合如磷灰石。在一种实施方案中，磷酸钙 为透钙磷石、磷酸三钙、磷酸八钙。在各种实施方案中，磷灰石选自于 羟磷灰石(HAP)、氟磷灰石(FAP)、碳酸磷灰石(CAP)或锆羟磷灰石 (ZrHAP)。还可使用含有搀杂剂和添加剂或取代的磷灰石。填充物可以 为粉末状。在一种实施方案中，填充物是通过溶胶-凝胶法制得。溶胶- 凝胶法可参考此处引用的文章“羟磷灰石基生物陶瓷的纳米结构加工”， ES Ahn、NJ Gleason、A.Nakahira、JY Ying Nano Letters 2001 1(3) p149-153。使用溶胶-凝胶法可制得纳米级粒子并且在最后的复合物中 在磷灰石粒子的空隙间可形成小的纳米级孔。在一种实施方案中，可对 大小在约8～约20纳米的粒子(例如8、9、10、11、12、13、14、 15、16、17、18、19或20纳米的粒子)通过溶胶-凝胶法制备碳酸 磷灰石或对大小在约40～约60纳米的粒子(例如40、41、42、43、 44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、 57、58、59或60纳米)通过溶胶-凝胶法制备羟磷灰石。填充物粒 子的大小可从5纳米最大到微米级。当填充物为磷灰石时，填充物粒子 的大小可从5～100纳米。
在另一种实施方案中，填充物为去除矿物质的骨骼、骨骼粉末、骨 骼形态形成蛋白、硫酸钙、自体同源骨骼、蜡珠、明胶珠、琼脂糖珠、 可再吸收聚合物或上述物质的混合物。这些物质可被单独使用也可混合 使用，还可用于辅助或代替含有磷灰石和含钙的化合物。
为制备这复合物，在一种实施方案中，液体可以为任何液体或一种 可形成浆状物的液体。例如，液体可以为水、有机溶剂、酸、碱或表面 活性剂。在一种实施方案中，液体可以为酸。当生物材料为胶原时，液 体可为酸从而使得胶原能够适当地分散。液体中可含有盐或其它添加 剂。在进一步的实施方案中，液体可以为无机酸。在另一种实施方案中， 液体可以为有机酸。例如，液体可以为磷酸。其它可使用的酸包括醋酸、 乳酸、蚁酸、酒石酸、山梨酸、硫酸、盐酸、磷酸、抗坏血酸、丙酸、 三氟甲磺酸、三氟乙酸或其它类型的酸。当复合物含有碳酸钙时，希望 使用磷酸是因为在碳酸钙和除磷酸以外的其它酸反应时可能得不到所 期望的的磷酸钙。
所使用的酸的浓度最高可到1000mM，例如约1mM～约500mM。进一 步如1mM，5mM，10mM，20mM，30mM，40mM，50mM，60mM，70mM， 80mM，90mM，100mM，150mM，200mM，300mM，400mM，500mM，600mM， 700mM，800mM，900mM或1000mM酸.在一种实施方案中，酸的浓度 最高可到约150mM。在另一种实施方案中，酸的浓度最高可到约100mM。 当填充物为碳酸钙时，合适的酸的浓度约1mM～500mM，例如使用100mM 的磷酸。当填充物为磷灰石时，合适的酸的浓度约1mM～500mM，例如使 用50mM的磷酸。
在一种实施方案中，液体为磷酸，填充物为碳酸钙。在一种实施方 案中，磷酸可与碳酸钙反应从而形成可沉淀在生物材料上的磷酸钙。
在一种实施方案中，当液体为酸时，浆状物中每100ml的酸最多可 含有约10g的生物材料，也可最多约9g、最多约8g、最多约7g、最多 约6g、最多约5g、最多约4g、最多约3g、最多约2g、最多约1g、最 多约0.5g。在一种实施方案中，浆状物中每100ml的酸含有约0.6g的 生物聚合物。在另一种实施方案中，浆状物中每100ml的酸含有约2g 的生物聚合物。通过控制生物聚合物与液体的比例，有可能改进或控制 复合物的力学性能以及微型结构。
在一种实施方案中，选择填充物的使用量使得生物材料：粉末的比 率与所要插入填充物的生物系统中的比率相接近。在一种实施方案中， 每100ml的液体使用约5～15g的填充物。也可以是100ml的液体使用 填充物的量为约6g、约7g、约8g、约9g、约10g、约11g、约12g、约 13g、约14g。在一种实施方案中，制备的第一个复合物/支架可含有100ml 液体、0.6g胶原以及5～15g范围内的填充物，从而通过较高液体：固 体比率使得具有较高孔隙率的支架。在另一种实施方案中，制备的第二 个复合物/支架可含有100ml液体、2g胶原以及5～15g范围内的填充物， 由于其具有较低的孔隙率、受到压缩时不易破碎并且比第一个提及的支 架具有较高的压缩模量，从而可被用作插入型的骨骼替代物。
在一种实施方案中，混合物在搅拌器中进行均化/分散。在一种实 施方案中，搅拌器为涡旋搅拌器。混合物可以被均化/分散约1分钟～ 约10小时。在一种实施方案中，混合物可被均化/分散约10分钟～约6 小时。例如，混合物可以被均化/分散约1小时。进一步的例子如混合 物可被均化/分散5、10、20、30、40、50、60分钟，1、2、3、 4、5、6、7、8、9或10小时。浆状物可在1000～60000rpm的 条件下进行均化/分散。在一种实施方案中，混合物在6000～50000rpm 的条件下进行均化/分散，例如在约14000rpm条件下形成浆状物。搅拌 器的其它速度可以是1000、2000、3000、4000、5000、6000、7000、8000、 9000、10000、11000、12000、13000、14000、15000、16000、17000、 18000、19000、20000、30000、40000、50000、60000rpm。例如，混合 物还可在均化时通过冰浴如在4℃时进行冷却。其它可用于冷却的温度 包括0℃、1℃、2℃、3℃、4℃、5℃、6℃、7℃、8℃、9℃、10℃、11 ℃、12℃、13℃、14℃、15℃、16℃、17℃、18℃、19℃、20℃、21℃、 22℃、23℃、24℃、25℃、2 6℃、27℃、28℃、29℃或30℃。在一种实 施方案中，还可对混合物进一步使用声波处理从而改进其均匀分散。
根据本发明的制备过程，浆状物是冻干状态。通过冻干可在复合物 内部形成多孔性。多孔性有助于细胞附着和迁移，并且有助于血管渗透， 从而使得液体能够通过支架传输。在一种实施方案中，可通过控制冷冻 的速率和/或冻干前均化的浆状物中水的含量来控制孔的大小以及孔隙 率。在另一种实施方案中，可通过选择合适的原材料以及它们的量来控 制孔的大小以及孔隙率。在液体或填充物分别使用酸如磷酸以及碳酸盐 如碳酸钙的实施方案中，可通过酸与碳酸盐反应时生成的二氧化碳气泡 来增加孔隙率。
在一种实施方案中，复合物要通过两种不同的冷冻速率(-80℃或 -20℃冷冻装置)。优化这种冻干的方式从而控制孔的结构，如孔的数量 和大小。
在一种实施方案中，将在4℃冰浴下得到的浆状物倒入盘中并置于 冷冻装置中，冷冻装置的温度范围为0℃～-50℃，例如-5℃、-10℃、 -15℃、-20℃、-25℃、-30℃、-35℃、-40℃、-45℃。在一种实施方 案中，将浆状物倒入盘中并置于-20℃冷冻装置中，根据混合物的量而 放置1～12小时。例如浆状物可被冷冻1、2、3、4、5、6、7、8、9、 10、11或12小时。使用下面的抽真空以及加热过程对冷冻的混合物进 行冻干直到形成干的孔状固态泡沫：
抽真空阶段：设置冻干机使得压缩机的温度在约0℃～约-105℃之 间。例如，在约-40～约-75℃之间。对冻干机抽真空使得其真空度在约 4.58～约0.005托(约0.61kPa～约0.00067kPa)。例如在约0.15～约 0.035托(约0.012～约0.0047kPa)。
加热阶段：将冷冻的混合物在保持上述真空度的前提下从冷冻的温 度例如-20℃转移到室温下。此步骤使得冰结晶体升华从而在混合物中 形成孔。
在一种实施方案中，保持浆状物的温度在约0℃～约30℃之间，例 如约5℃、约10℃、约15℃、约20℃、约25℃，保持时间从0～约60 分钟，例如约10、约15、约20、约25、约30、约35、约40、约45、 约50、约55分钟。然后适当地降低温度，降温的速率从约＜1～约50℃ /分钟，例如速率约1°、约5 °、约10 °、约15 °、约20 °、约25 °、 约30 °、约35°、约40 °、约45℃/分钟到最终的温度范围从约-5℃～ 约-80℃，例如约-10、-15、-20、-25、-30、-35、-40、-50、-60、-70 ℃。保持最终的温度从约5分钟～约12小时或更多。在一种实施方案 中，设置冻干机使得压缩机的温度在约-105℃～约0℃之间。例如，在 约-40℃～约-75℃之间。对冻干机抽真空使得其真空度在约 4.58(0.61kPa)～约0.005托(0.00067kPa)。例如在约0.15托 (0.12kPa)～约0.035托(0.0047kPa)。
在一种实施方案中，对复合物进行冻干直至升华所有的水。
可对复合物进行进一步的处理，如添加涂层材料从而使得复合物的 性能与天然骨骼相接近。例如，可对生物材料进行聚合或使用酶如赖氨 酰氧化酶对浆状物进行处理。在另一种实施方案中，可对生物材料进行 酯化、酰化、脱氨基化或使用封闭剂进行封闭。还可将添加剂加入到浆 状物中。例如可向浆状物中加入纤维增强物、多肽、糖蛋白防冻剂、药 剂、抗生素、增长素或骨骼形态形成蛋白。
在一种实施方案中，可用细胞对复合物进行调节。合适的细胞包括， 但不局限于此，上皮细胞如角质形成细胞、脂肪细胞、肝细胞、神经元、 胶质细胞、星形细胞、伪足血细胞、乳腺上皮细胞、岛细胞，内皮细胞 如主动脉、毛细和静脉内皮细胞，以及间充质细胞如真皮成纤维细胞、 间皮细胞、干细胞、造骨细胞、平滑肌细胞、横纹肌细胞、韧带成纤维 细胞、腱成纤维细胞、软骨细胞或成纤维细胞。
在一种实施方案中，冻干的复合物是交联的。交联可增加复合物的 压缩模量并且提高抗降解性。交联使得复合物的物理性能更加稳定并且 不溶于水性介质。如Y.S.Pek et al.在Biomaterials 25(3)(2004) p 473-482中的描述那样，在一种实施方案中，可通过改变复合物交联 的程度来控制复合物/支架的降解速率。例如，冻干的复合物可进行交 联从而形成坚硬的泡沫或海绵体泡沫或介于这二者之间的泡沫。
在一种实施方案中，冻干的产物可发生交联。在另一种实施方案中， 浆状物可在冻干前发生交联。可使用氨基交联法进行交联反应。实施例 1描述了使用EDC/NHS进行氨基交联的方法。
还可以使用其它的交联方法或交联试剂。例如，可以使用物理交联、 化学交联和酶交联法。可使用丙烯酰胺、二酮、戊二醛、乙醛、甲醛或 核糖进行交联。还可以使用UV或其它的辐射法如γ辐射、脱水加热法。
与当前市场上的支架相比，本发明中的支架具有与天然骨骼相接近 的更好的力学性能与微型结构以及化学配对，并且更易进行骨引导生 长。
本发明的复合物/支架的优点是，在承重应用下其具有足够的力学 强度和足够的生物活性来促进附着和增殖。本发明的材料可以被天然组 织再吸收并具有可调的力学性能和降解速率。本发明的材料具有约 100～600微米级的微孔隙度，如等于200微米。该材料具有生物相容性 并可被组织再吸收和替换。在本发明的一种实施方案中的复合物/支架 具有与骨骼相当的多孔性。
本发明可通过植入复合物的方法来对骨骼进行替换和修复。
复合物/支架可适用于整形外科或其它承重应用。支架可被用作骨 引导生长的承重硬组织，并且可用作其它的组织工程应用。支架可用作 可再吸收的骨骼在很大程度上有助于大范围的骨折以及骨骼缺失的治 愈。支架具有足够的强度来维持主体动物在恢复期间的日常活动。它们 还对体内的快速细胞附着显示出足够的生物利用率。支架可用于组织修 复和重建从而使得替代组织再生、用作敷料、用作止血剂或作为体内和 体外细胞生长的支持。支架还可用作传送蛋白或药物的载体。支架可用 作研究的模型系统或作为修补物或植入物，从而替换损坏的或有疾病的 组织，或提供的支架在细胞占据后经过重塑而成为功能性组织。支架可 接种细胞，并且可种植那些与用支架修复、重建或替换的组织细胞同类 型的细胞。支架还可接种干细胞。支架可被用作修补物或植入物，并且 用于替换下述的组织，如皮肤、神经组织、血管组织、心脏组织、心包 组织、肌肉组织、视觉组织、牙周组织、连接组织如骨骼、软骨、腱或 韧带、器官组织、肝脏组织、腺组织、乳腺组织、肾上腺组织、泌尿组 织和消化组织。支架可用作植入物，其可被引入或移植到合适的受体， 如包括人在内的哺乳动物的体内。支架还可用作敷料如皮肤敷料或用于 药物传送。
本发明中的复合物/支架可通过局部、皮下、腹膜内部或肌肉内应 用。
通过参考下面具体的实施例可对本发明进行更详细的描述，但这些实施 例并不局限本发明的范围。
实施例A
下面的实施例对可用于本发明中的羟磷灰石的制备方法进行描述。 本方法中的羟磷灰石通过溶胶-凝胶的方式制备。
使用下面的原材料：
Ca(NO3)2.4H2O mw＝236.15
(NH4)2HPO4 mw＝132.06
将0.05M～0.5M硝酸钙Ca(NO3)2.4H2O溶于dH2O(重水)中制备第一 份溶液。另外将0.05M～0.5M磷酸铵(NH4)2HPO4溶于dH2O制备第二份溶 液，并向其中加入适氨水NH4OH，调节溶液的pH值到10。再将第一份溶 液滴加到第二份溶液中。然后将溶液于室温下熟化100小时，并通过离 心过滤得到沉淀物。再用三份降低浓度的氨水NH4OH和dH2O冲洗，随后 再用乙醇冲洗二次。
将得到的凝胶放置在表面玻璃上于空气中风干24小时，随后在120 ℃的烘箱中干燥12小时。研磨粉末，并将研磨后的粉末搁置于热盘上 进行干燥，并可选择在500℃以上煅烧5小时。为确定其微型结构，对 通过这种方法制备的干燥的羟磷灰石进行扫描，得到扫描电子显微图， 结果以x120和x2.3的辨析率显示于图3中。聚集形成附聚物的粒子大 约为25纳米(通过XRD X射线衍射)。
实施例B
下面的实施例是对用于本发明中碳酸磷灰石的制备方法进行描述。 本方法的中碳酸磷灰石通过下述溶胶-凝胶的方式制备。
使用下面的原材料：
Ca(NO3)2.4H2O mw＝236.15
(NH4)2HPO4 mw＝132.06
(NH4)HCO3 mw＝79.06
将0.05M～0.5M硝酸钙Ca(NO3)2.4H2O溶于dH2O(重水)中制备第一 份溶液。另外将0.05M～0.5M磷酸铵(NH4)2HPO4、0.05M～0.5M碳酸铵 (NH4)HCO3以及适当的表面活性剂溶于dH2O制备第二份溶液。向溶液中加 入氨水NH4OH并调节溶液的pH值到10。然后将第一份溶液滴加到第二 份溶液中。再将溶液于室温下熟化100小时并通过离心过滤得到沉淀物。 然后用三份降低浓度的氨水NH4OH和dH2O冲洗，随后再用乙醇冲洗二次。
将得到的凝胶放置在表面玻璃上于空气中风干24小时，随后在120 ℃的烘箱中干燥12小时。研磨粉末，然后将研磨后的粉末搁置于热盘 上进行干燥。
实施例1
图1显示了根据本发明的一种实施方案制备支架的示意图。在这种 实施方案中，使用了1型胶原，如图2所示。图2为用于本发明的干燥 的胶原的一组扫描电子显微图，该图以x120和x2.3的辨析率显示。该 微型结构显示了与薄片混合的直径约为1.5～2微米的小纤维。
如图1所示，将1型胶原和磷酸混合成浆状物并进行均化，再向浆 状物中加入碳酸钙和/或磷灰石(如HAP、FAP、CAP、或ZrCAP)。然后 对浆状物进行均化，从而使得磷酸钙和/或磷灰石分散开来并沉淀在胶 原纤维上。
然后将浆状物冻干并交联从而形成海绵体泡沫。冻干的产物可通过 下述方案进行交联：
1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)碳二亚胺/N-羟基琥珀酰亚胺(EDC/NHS)交联方案-修改自Olde Damink et al.，Biomaterials 17 (1996)765-773方案。
因为EDC具有197g/mol的分子量，如每100ml可使用0.276g。因 为NHS具有115g/mol的分子量，如每100ml可使用0.064g。
(1)向本发明中冻干的基质中加入最终体积的一半体积的去离子 水进行水合反应(例如最终的冻干产物为100ml，可加入50ml的去离子 水进行水合反应)
(2)然后将EDC和NHS溶解在最终体积的一半体积的去离子水中 (例如最终的体积为100ml，可溶解在50ml的去离子水中)。该溶液在 每次使用前配置。溶液的最后浓度为0.014M的EDC和0.005M的NHS。
(3)将EDC/NHS溶液通过0.2mm的滤纸无菌过滤到一个无菌容器 中(或直接过滤到含有水合基质的容器中)。适合使用6mmol EDC/g的 胶原，其EDC∶NHS的比率为5∶2。
(4)在室温下交联约2小时；
(5)将溶液作为有害废弃物处理；
(6)在无菌PBS(磷酸盐缓冲溶液)中对基质进行冲洗，在新配置 的、无菌的PBS溶液中培育约2小时；
(7)在无菌去离子水中冲洗2次约2×10分钟；并且
(8)在使用前在4℃下保存最多一星期。
可制得上述的交联支架。
比较下述合成参数对最终产物的影响：
(i)冷冻速率对微型结构(如孔的特性)和力学性 能(如压缩模量)的影响；
(ii)无机粉末：浆状物的比率对微型结构(如孔的 特性)和力学性能(如压缩模量)以及化学组成和结晶相的 影响；
(iii)EDC/NHS交联对微型结构(如孔的特性)和力学 性能(如压缩模量)的影响。
使用各种冷却速率、粉末：浆状物的比率以及选择性交联制备多个 胶原-无机支架。根据用于整形外科和牙齿材料的British Standard 6039：1981，在37℃下使用仿真流体(SBF)进行压缩测试。每个压缩点 从对八个样品的平均值得到。通过孔的压缩得到初始压缩模量，通过多 数材料发生孔塌陷的模量得到最终模量。模量测试的结果显示于图4A 和4B。图4A是使用100ml的50mM磷酸、4g胶原和10g羟磷灰石制得 的支架的压缩曲线。图4B是使用100ml的50mM的磷酸、2g胶原和5g 碳酸磷灰石制得的支架的压缩曲线。图4C是使用100ml的50mM的磷酸、 2g胶原和5g羟磷灰石制得的支架的压缩曲线。图4D是使用100ml的 100mM的磷酸、2g胶原和5g碳酸钙制得的支架的压缩曲线。支架在-20 ℃的条件下经过冷冻。
压缩测试表明，较慢的冷却速率到较低的最终冷却温度导致较大的 冰晶，从而导致冻干后形成较大的孔。然而冷却速率对多孔性没有明显 的影响。压缩测试表明，对所有样品来讲，最终的冷却温度为-80℃时 要比-20℃时产生低得多的压缩模量。因此建议冻干的温度不要低于-50 ℃。其它的报告表明在-80℃～-50℃时会对胶原的结构产生破坏-Fois et al.，J.Polym.Sci.Part B-Polym.Physics，38(7)(2000) 987-992，这种现象可解释导致较低压缩模量的原因。
发现通过改变粉末：浆状物的比率可以调节最终的压缩模量 (100-300MPa)。较高的粉末：浆状物的比率可以产生较高的初始压缩 模量，然而如果比率过高，胶原基质就不能保留所有的粉末并且在压缩 时将会滤出过量的粉末从而导致最终的压缩模量没有显著的上升或者 会出现下降。粉末与浆状物的合适的重量比率可达到每100ml的液体溶 液中最高5～15g粉末：最高10g的胶原。
还发现交联也会导致较高的压缩模量。
实施例2
获得本发明的各种胶原-无机支架的显微图，并与小梁骨进行对比。
如图5所示，小梁骨的显微图在各种辨析率下都比较密集，除了纳 米级的孔外，还含有较大的300～400微米的孔以及较小的30～50微米 的孔。
图6显示了CPCAP支架在各种辨析率下的显微图，其中CPCAP支架 由100毫升50mM磷酸、4g胶原以及7.5g的CAP(碳酸磷灰石粉末)制 得。从图6中可以看出这种材料的微型结构与骨骼的最相接近，其含有 较大的200～300微米的孔以及较小的20～30微米的孔和在CAP粒子的 空隙间形成的纳米级的孔。
图7显示了CPHAP支架在各种辨析率下的显微图，其中CPHAP支架 通过与实施例1中相同的支架制造方法制得，使用100毫升50mM的液 体、4g胶原以及12g的HAP(羟磷灰石)粉末制得。这种材料与骨骼相 似，但还需要含有更多的较大的约300微米的孔(可通过优化冷却速率 得到)、许多较小的20～30微米的孔和在HAP粒子的空隙间形成的纳米 级的孔。
图8显示了CPC支架在各种辨析率下的显微图以及EDX(X射线能 量色散)图谱，其中CPC支架通过与实施例1中相同的支架制造方法制 得，使用100毫升100mM的磷酸液体、4g胶原以及10g的碳酸钙粉末制 得。这种材料与骨骼相似，但还需要含有更多的较大的约300微米的孔 (可通过优化冷却速率得到)。EDX图谱显示的粒子是由酸-碳酸盐之间 反应所得到磷酸钙的某种形态。
实施例3
对支架产品进行XRD和FTIR研究。图9显示了通过与实施例1中 相同的制造方法得到的各种胶原-碳酸磷灰石(CPCAP)以及胶原-羟磷 灰石(CPHAP)支架和天然骨骼的XRD图。可以想象出与天然骨骼最相匹 配的方式是在相同支架中，将CAP和HAP粉末以最优化的比例组合。图 10显示了胶原-碳酸钙支架的XRD形状，其中支架通过与实施例1中相 同的制造方法制得，浆状物的浓度为每100毫升100mM的磷酸0.6g的 胶原。图10中还显示了透钙磷石与碳酸钙的XRD形状。可看出XRD形 状根据粉末：浆状物的比率而发生变化。
图11显示了原材料、使用实施例1中的方法制得的支架以及天然 骨骼的傅立叶转换红外图谱(FTIR)。可看出本发明中的支架在化学结 构上与天然骨骼最为接近。
实施例4
使用MC3T3造骨细胞的体外研究显示了在本发明的材料上的优异的 细胞附着和增殖能力。在该实施例中，将MC3T3(小鼠造骨细胞)在本 发明的支架上培养一个星期，其中该支架由100毫升50mM的磷酸、0.6g 胶原以及1g的羟磷灰石制得。结果显示于图12中。可看出细胞附着在 支架上并占据了孔所在的位置。
实施例5
将支架异位植入到SCID小鼠内并进行60天的体内研究，其中该支 架由100毫升50mM的磷酸、2g胶原以及5g的羟磷灰石制得。所有的动 物都存活过试验过程中的2个月并且没有观察到不利的副作用。结果显 示于图13中。该研究表明对SCID小鼠的异位体内植入显示了骨骼、组 织和血管在本发明的支架材料上形成的证据。结果显示支架具有生物相 容性，能够对组织的生长、血管形成、骨形成以及骨骼矿化起到足够的 支持作用。图14～17中显示的组织结果也对此进行了确认。
图14和15显示了8天和30天后的苏木精和曙红染色情况。从图 中可看出组织被膜和空隙空间已被确认，其中可含有磷酸钙。此外还可 看见被膜形成、新骨、降解的支架、血管形成、纤维蛋白网络、新的胶 原基质以及皮肤组织。
图16和17显示了8天和30天后的冯库萨染色情况。从图中可看 出钙盐以及组织已显现。支架已被新的组织、新骨、新骨骼基质、新骨 骼材料以及整合的骨无机物和支架所代替。该研究显示对威斯达/SD大 鼠股骨的缺陷区域采用本发明的支架材料的体内植入可成功地治愈并 恢复缺陷区域的功能而不需要附加外部支撑敷料。支架与周围的主体组 织已经成功地整合在一起。
实施例6
对本发明的有孔胶原骨骼植入物的体内承重能力进行测定。由胶原 和磷酸钙合成得到有孔骨骼植入物以用于骨骼替换。
选择威斯达/SD大鼠是类似体内研究中最为常用的种。使用50个平 均重量为180～220g的雌性动物。在手术前对使用的大鼠进行一周的观 察。在手术刚进行前对大鼠使用戊巴比妥注射溶液进行IP(腹膜内部) 麻醉，麻醉的剂量为≤0.1ml/100g的动物体重。使用用于疼痛反射的趾 轧痛测试来确保动物已被完全麻醉。仅对每个动物的一个股骨进行手 术。去除手术部位的多余的毛发，并用70％的酒精进行异位消毒。
割开动物的皮肤并且剥开肌肉从而使得股骨暴露出来。暴露中间股 骨的方案如下：
1、弧形切开股骨骨干的前部；
2、如果直接在骨干切割会碰到股二头肌(BF)；
3、不要切割BF；
4、割开BF前部的阔筋膜；
5、缩回前部的股外侧肌；
6、缩回尾部的BF；并且
7、横切股骨；
使用手术锯(或相似的合适工具)对股骨进行完全的切割并取出股 骨中部的3mm长度的骨头。
将大小合适的支架插入到被去掉的骨骼所形成的裂缝。使用不锈钢 (Kirschner)钉和/或线对支架进行固定。
固定的过程如下：
1、将钉倒着插入，从转子窝近侧的位置插出；
2、拉伸动物的髋部，并通过转子槽将股骨和钉绑定在一 起，从而避开坐骨神经，并插入支架；以及
3、采用8字形方式用线进行额外的固定。
创伤部位的肌肉和皮肤使用丝线(4号)进行缝合。
在手术后，将动物置于22℃的室温下进行恢复并提供所需的食物和 饮用液体。
给动物至少一个星期的适应(如手术前处理)过程。需要时可在皮 下使用丁丙诺啡来减轻手术后的疼痛。在术后3周，每天对动物进行检 查。
可使动物吸入过量的二氧化碳而无痛致死。
术后2个月后支架的初步X射线表明使用可去除的固定针脚的骨骼 正在恢复。
图18显示了本发明的支架通过上述方法植入威斯达大鼠大腿骨(负 重)后6个月的情况。结果显示支架可用作适合再吸收的骨骼取代物材 料从而有助于大范围的骨折以及骨骼缺失的治愈。本发明的支架具有足 够的强度从而使得主体动物在恢复期内能够进行日常活动。此外，对于 快速的附着和增殖，支架还表现出充分的体内生物利用率。
一部分大鼠在植入后5个月处死，其股骨被取出并拍摄X射线图。 如图19所示，X射线图显示了本发明中支架(在图中将胶原-羟磷灰石 标记为YSP-IBN)。通过与参考图19C空白对照相对比，发现图19A中的 支架要比图19B中的商用支架更为成功。
工业应用
本发明的复合物可应用于牙科、整形外科、制药、医疗、兽医应用 中，并可用作其它方面，如止血剂、用于组织修复或支持细胞生长的支 架。
在不背离本发明的精神和范围的情况下，本领域的技术人员可对本 发明中的具体实施方案作出各种改进和/或变化。因此这里揭露的具体 实施方案应当理解为是说明性的而不是限制性的。