本发明涉及一种新颖载体。更为特殊的是，发明所涉及的这种载体，其特征是至少含有一个启动基因区，此启动基因区出现在两个限制性内切酶断裂位置之间，而这两个位置分别地为两种不同的限制性内切酶所识别，但在断裂处却给出了两个相同的粘性末端。 这种启动基因是一种调节因子，它控制着由RNA所提供的遗传信息。其作用相当于是一个被RNA聚合酶所识别的位置，相当于是一个RNA聚合酶联接的位置，和相当于RNA合成的起始点，在蛋白质的合成中起非常重要的作用。
Lac启动基因、trp启动基因和β-内酰胺酶启动基因是人们所熟知的启动基因，它们在宿主大肠杆菌（Escherichiacoli）中的表型表达具有显著的功效。
在探索一种更有效的启动基因的研究中，一直在寻找这样的启动子并创造了杂种启动基因。例如，tac启动基因是由trp启动基因和Lac启动基因所组成。这是人们所熟知的杂种启动基因。
对于以酵母为宿主的启动基因来说，被提到的有PGK启动基因、ADH启动基因和phoE启动基因。
在探寻一种更有效的启动基因中，本发明人将研究引导到那些各包括有众多的系列启动基因的各种启动基因中去。
研究结果，他们发现，提供了这样一种载体，即其上有一个启动区，该区在两种限制性内切酶分别识别地切点之间，而又在两个切点上分别形成相同的粘性末端，那么，就能造出一系列的含有众多启动子的载体。目前，本发明已经完成了。
所以，本发明所涉及的是这样的载体，其特征是在两个限制性内切酶断裂位置之间至少出现一个启动基因区，而这两个位置分别地为两种不同的限制性内切酶所识别，而在断裂处却给出两个相同的粘性末端。
在附图中，
图1表示了pDR540和由此衍生得到的pTL1，后者对于多重tac启动基因来说是一种基本质粒;
图2表示了从pTL1构成多重tac启动基因的示意图;
图3表示了多重tac启动基因的构成示意图;
图4指出了pYN1的限制性内切酶断裂位置;
图5表示了pYN1的trp启动基因/操纵基因区的，以及围绕它们的DNA序列;
图6指出了pYN3的trp启动基因/操纵基因区内部和周围的限制性内切酶断裂位置;
图7指出了pYN4的限制性内切酶断裂位置;
图8指出了pYN6的限制性内切酶断裂位置;
图9表示了在pYN6的trp启动基因/操纵基因区中的DNA序列;
图10指出了pYN8、pYN9和pYN10的限制性内切酶断裂位置;
图11表示了pYN20的制备示意图，pYN20通过SalⅠ和XhoⅠ位置用以制备多重trp启动基因;
图12指出了从pYN20制备pYN21的示意图，pYN21起着多重trp启动基因的基本构成的作用;
图13指出了利用SalⅠ和XhoⅠ位置制备双重和三重trp启动基因的示意图。
按本发明所述，“具有相同的粘性末端”意味着在限制性内切酶断裂处出现单股断裂的那些部分具有相同的碱基序列。例如，BglⅡ判别序列是
5′-AGATCT-3′
3′-TCTAGA-5′
在断裂处，5′-GATC-3′成为粘性末端。另一方面，BamHⅠ识别序列是
5′-GGATCC-3′
3′-CCTAGG-5′
在断裂处，5′-GATC-3′成为粘性末端。其他限制性内切酶结合位置是SalⅠ与XhoⅠ和BamHⅠ与BclⅠ，这些结合位置也给出相同的粘性末端。
上述事实使两端可能发生连接（以下称为“连接”-Ligation）。此连接位置不可能再被前边所用的两种酶所断裂，这是因为这两个酶的识别位置之间有差别。利用这一特性，就可能制备多重启动基因。例如，BamHⅠ和BglⅡ粘性末端彼此连接时，就得到下面的序列。
5′-GGATCT-3′
3′-CCTAGA-5′
这样，在这一MboⅠ断裂位置上不再能够用BamHⅠ或BglⅡ断裂了。
SalⅠ和XhoⅠ粘性末端彼此连接时，就得到下面的序列。
5′-GTCGAG-3′
3′-CAGCTC-5′
这一序列是TaqⅠ断裂位置，所以不再能够被SalⅠ或XhoⅠ断裂了。
根据本发明，一个操纵基因和一个SD序列可以与两个不同的限制性内切酶的识别位置之间的启动基因一起存在。
操纵基因区控制着mRNA的合成，通过与一特定的阻遏物相互作用，使之与邻近的结构基因相符合。SD序列是一个核糖体连接位置，被置于蛋白质合成起始位置的邻接位置和上方。
根据发明所提供的载体能够起到多重启动基因的一个基本形式的作用。通过利用所谓的载体来构成多重启动基因，希望以基因工程来更有效地合成蛋白质成为可能。
〔多重启动基因的合成〕
这里所出现的术语“多重的启动基因”，意思就是众多的重复出现的相邻的启动基因。这里，它可以包括一个操纵基因和一个SD序列。当所述的操纵基因和SD序列未被包括在启动基因中时，操纵基因和SD序列应存在于多重启动基因的邻接位置和下方。
按照上述方式连接许多启动基因，可导致提高mRNA的转录效率。
trp启动基因是一种能够有效地产生多肽的启动基因。当它变为多重时，能够给出一种可大大提高产率的启动基因。
曾经提到过具有以下序列的启动基因作为一种trp启动基因。
此启动基因用pDR720（可从PLBiochemica1得到）和pGX112（可从Genex得到）制备。虽然pDR720没有SD序列，但那些表现遗传信息所必不可少的基本单元-35区段、-10区段，和SD序列可以用pGX112衍生一个复合物来获得。所述的启动基因的大小约为70bp，并且能够容易地被切开以用于外来基因的表现。
杂化启动基因可以高产率地和高可调节地诱导生产所需要的多肽。例如，可能有一种提到过的tac启动基因，它是一种介于trp启动基因和lac启动基因之间的杂种，并且是介于rrn启动基因和lac启动基因之间的杂种启动基因。
tac启动基因包括了trp启动基因衍生物-35区段（RNA聚合酶识别位置）和lac启动基因衍生的-10区段（RNA聚合酶连接位置，Prinbnow box），并且使多肽的生产具有高产率。
tac启动基因也含有lac启动基因衍生的操纵基因和SD序列，受乳糖阻遏物所控制，并且其优点在于可很方便地进行调节。
使这种tac启动基因多重化后，就能够得到一种能够提供很高的多肽产率的，有很高的可调节性的启动基因。
这样的多重tac启动基因可以从pDR540（可从PL Biochemical得到）衍生一个基本载体pTL1来制取。
将结构基因插入到这样获得的载体上的启动基因/操纵基因（以下缩写为P/O）下方的限制性内切酶位置处，并且用插入产物来使宿主发生转化，从而所述的基因的表现变为可能了。优先选用的宿主是大肠杆菌（Escherichia coli）。
有关本发明的载体的例子在下面给以叙述。
DNA的酶解和连接进行如下：混合所需要的DNA（或几种INA）和酶（或几种酶），并用与反应相适应的缓冲液（酶解反应或连接反应），以制备50～100微升的反应混合物，反应混合物中DNA的最终浓度约为1微克/微升，使反应进行2小时至过夜。酶的用量是每微克DNA用大约3个单位。反应温度，当使用T4连接酶时为12～16℃，BclⅠ酶解反应是50℃，SmaⅠ酶解反应是30℃，TaqⅠ酶解反应是65℃，用其它酶反应是37℃。
下面是反应缓冲液组成，各自的浓度均10倍于进行反应所需要的在实际使用这些缓冲液时，将它们加于反应体系，在数量上作了10倍的稀释。
10×EcoRⅠ 缓冲液 1.0M Tris-Hcl，pH7.2
50mMMgcl2
0.5MNacl
10×HincⅡ 缓冲液 60mM Tris-Hcl，pH7.5
60mMMgcl2
60mMβ-巯基乙醇
0.5MNacl
10×HpaⅠ 缓冲液 0.1M Tris-HCl，pH7.5
0.1MMgCl2
10mM二硫代苏糖醇
0.2MKCl
10×ClaⅠ 缓冲液 60mM Tris-HCl，pH7.9
60mMMgCl2
0.5MNaCl
10×PstⅠ 缓冲液 0.2M Tris-HCl，pH7.5
0.1MMgCl
0.5M（NH4）2SO4
10×RsaⅠ 缓冲液 60mM Tris-HCl，pH7.5
0.12MMgCl2
60mMβ-巯基乙醇
0.5M NaCl
10×HaeⅡ 缓冲液 0.1M Tris-HCl，pH7.5
70mM MgCl2
70mM β-巯基乙醇
10×HinfⅠ 缓冲液 0.06M Tris-HCl，pH7.4
0.06M MgCl2
0.06M β-巯基乙醇
0.5M Nacl
10×HindⅢ 缓冲液 0.06M Tris-Hcl，pH7.4
0.06M Mgcl2
0.06M β-巯基乙醇
0.5MNacl
10×SalⅠ 缓冲液 0.1M Tris-Hcl，pH7.5
70mM Mgcl2
70mM β-巯基乙醇
2mM EDTA
1.75M NaCl
10×TaqⅠ 缓冲液 0.1M Tris-Hcl，pH7.5
0.1M Mgcl2
0.1M β-巯基乙醇
1M Nacl
10×BglⅠ 缓冲液 0.1M Tris-Hcl，pH7.4
0.1M Mgcl2
10mM二硫代苏糖醇
0.66M Kcl
10×BglⅡ 缓冲液 0.1M Tris-Hcl，pH7.5
70mM Mgcl2
1M Nacl
70mM β-巯基乙醇
10×AluⅠ 缓冲液 60mM Tris-Hcl，pH7.5
60mM Mgcl2
60mM β-巯基乙醇
0.5M Nacl
10×AccⅠ 缓冲液 60mM Tris-Hcl，pH7.5
60mM Mgcl2
60mM β-巯基乙醇
60mM Nacl
10×SmaⅠ 缓冲液 0.1M Tris-Hcl，pH8.0
70mM Mgcl2
70mM β-巯基乙醇
0.2M Kcl
10×BamHⅠ 缓冲液 0.1M Tris-Hcl，pH8.0
70mM Mgcl2
20mM β-巯基乙醇
1M Nacl
10×XhoⅠ 缓冲液 60mM Tris-Hcl，pH7.9
60mM Mgcl2
60mM β-巯基乙醇
1.5M Nacl
10×PvuⅡ 缓冲液 0.1M Tris-Hcl，pH7.5
70mM Mgcl2
70mM β-巯基乙醇
0.6M Nacl
T4连接酶缓冲液 660mM Tris-Hcl，pH7.6
66mM Mgcl2
100mM DTT
1-10mM ATP
实施例1多重tac P/O的制备
pDR540的Hind Ⅲ断裂位置按下列方法变换成BglⅡ断裂位置。
即，pDR540用HindⅢ酶解，接着用苯酚/氯仿萃取和用乙醇沉淀。所得到的沉淀物以无菌水溶解，在65℃加热3分钟，然后用于制备下列反应混合物：
反应混合物：
pDR540 HindⅢ级分 150微升
10×Nick转译缓冲液 20微升
四种dNTP浓度各为2mM 各10微升
DNA聚合酶大片段 20微升（15单位）
10×Nick转译缓冲液的组成：
0.5M Tris-Hcl，pH7.2
0.1M MgSO4
1mM二硫代苏糖醇
上述反应混合物在室温（28-30℃）下保持40分钟。将100微升水饱和的重蒸酚和100微升氯仿加于所得到的反应混合物。剧烈地搅拌30秒钟，混合物离心2分钟。取出水相（200微升），并用乙醇使沉淀。沉淀物用70%乙醇洗涤并干燥。干燥过的沉淀物溶于38微升水中，然后加5微克（5微升）BglⅡ联结子〔Takara Shuzo的磷酸化的BglⅡ联结子d（pCAGATCTG）〕，混合物在65℃下加热3分钟，并在室温下冷却。
反应混合物：
上述DNA混合物 43微升
10×T4连接酶缓冲液 5微升
T4连接酶 2微升（5.6个单位）
上述反应混合物在16℃下保持过夜以完成Bgl Ⅱ联结子的连接。所得到的DNA用Bgl Ⅱ酶解，所得到的反应混合物在1%琼脂糖上电泳，相当于约4000bp的DNA带用电洗提法（electroelution）（G.Dretzen，H.Bellard，P.Sassone Corsi，and P.Chambon（1981），Anal Biochem，112，295～298〕使复原。这样得到的DNA片段用常规方法连接。所得到的载体用于大肠杆菌JM103的转化。以抗氨苄青霉素性能坏来进行转化选择，并由此提取DNA。所得到的DNA经Bgl Ⅱ酶解、Hind Ⅲ酶解、Eco RⅠ-BglⅡ双酶解（以下称“Eco RⅠ+BglⅡ酶解）、BglⅡ+Eco RⅠ酶解，和Bam HⅠ+Eco RⅠ酶解，接着用5%聚丙烯酰胺凝胶电泳证实形成了pDR540衍生载体，并且在该载体上代替了原有的Hind Ⅲ断裂位置的是一个Bgl Ⅱ断裂位置。所述的载体称做pTL1（图1）。
这样得到的pTL1具有两个不同的限制性内切酶Bgl Ⅱ和Bam HⅠ的切点，并有一个tac P/O位于它们之间。
然后此pTL1用Eco RⅠ+Bam HⅠ酶解以给出大小约为380bp的含tac P/O片段。另外将pTL1用Eco RⅠ+Bgl Ⅱ酶解给出大小约为4kb的片段。这两个片段被连接在一起，大肠杆菌JM103用连接产物进行转化，随后根据抗氨苄青霉素性来选择转化。获得了10000多个转化体。取其中47个用微量制备法〔H.C.Birnboim和J.Doly（1979），Nucl.Acids Res.，I，1513〕提取质粒DNA，用Bam HⅠ+Bgl Ⅱ进行酶解，从47个转化体中的45个得到了大小约为200bp的片段。从这样的转化体中提取了大量的质粒DNA，并用Bam HⅠ+Bgl Ⅱ，Eco RⅠ+Bam HⅠ，和Eco RⅠ+Bgl Ⅱ进行酶解。酶解的结果列于表1。这些质粒均为含有一个双重tac P/O的质粒，称为pTL2。
用Eco RⅠ+Bam HⅠ酶解pTL1得到380bp片段，用Eco RⅠ+Bgl Ⅱ酶解pTL2得到4kb片段。这些片段被连接在一起，此连接产物用于大肠杆菌JM103的转化。根据抗氨苄青霉素性选择得到10000多个转化体，其中30个用微量制备法进行载体DNA的萃取，接着用Bam HⅠ+BglⅡ进行酶解。来源于29个转化体的质粒DNA给出了300bp大小的片段。这些质粒大量地被制备，并且象应用于pTL2那样进行同样的限制性内切酶酶解。所得到的结果例于表1。这些载体均为含有一个三重tac P/O的载体。此载体称作pTL3（图2）。
表1
pTL1 pTL2 pTL3
Bam HⅠ+Bgl Ⅱ酶解 98bp 195bp 295bp
Eco RⅠ+Bam HⅠ酶解 400bp 495bp 600bp
Eco RⅠ+Bgl Ⅱ酶解 305bp 305bp 300bp
例2（多重trp P/O的制备）
〔下文pYN1至pYN7是前体质粒。〕〔制备的概图如图3所示。〕
（1）pYN1的制备
pGX112经Eco RⅠ+Pvu Ⅱ+Pst Ⅰ酶解，此酶解过程按常规方法进行，然后以1%琼脂糖作电泳。用杨等人的方法〔R.C.A.Yang，L.Lis，and R.Wu（1979），Method in Enzymology，68，176～182〕使相当于2.95kb的谱带（在此谱带中存在有trp启动基因区）复原。pBR322同样地用Eco RⅠ+Pvu Ⅱ+Sal Ⅰ酶解，2.25kb谱带用电洗提法复原。
然后，将所得到的这两个DNA碎片用常规方法连接在一起。连接后，用连接产物使大肠杆菌RR1转化。从所得到的转化物，用微量制备法提取质粒DNA。此DNA（处于ccc DNA形式）在1%琼脂糖上电泳，获得了5.2kb的质粒，这是通过计算而希望得到的一种质粒（是从20个转化物中的一个所得到的）。
此质粒用限制性内切酶Hpa Ⅰ酶解，接着用5%聚丙烯酰胺作凝胶电泳。结果得到了在trp邻近具有基本序列特征的230和320bp碎片。此质粒称为pYN1。
为pYN1制作了一张限制性内切酶识别图。图4就是所述图的部分情况。用Maxam-Gilbert方法（图5）对围绕trp P/O区域的DNA序列检验了此pYN1。-35区段、-10区段和SD序列各自的碱基序列符合下列参考文献中的数据：
。J.D.Windass，C.R.Newton，J.De Guignard，V.E.Moore，A.F.Markham，and M.D.Edge（1982）Nucl.Acids Res.，10，6639～6657。
。F.Lee，K.Bertrand，G.Bennett，and C.Yanofsky（1978）J.Mol.
Biol.，121，193～217。
（2）pYN3的制备
为制备更紧密的trp P/O，分离了图5所示的从Alu Ⅰ位置至Taq Ⅰ-（2）位置的部分。这样，首先用Alu Ⅰ酶解pYN1而给出一个大小约为340bp的含trp P/O区段的片段（图6）。在16℃下在下面所给的反应混合物中反应过夜，在此片段的各端连接上一个Hind Ⅲ联接子〔Takara Shuzo的磷酸化的Hind Ⅲ联接子d（pCAAGCTTG）〕。
反应混合物：
340bp Alu Ⅰ碎片 30微升
Hind Ⅲ联接子 2微克（2微升）
10×T4连接酶缓冲液 5微升
T4连接酶 5个单位（4微升）
H2O 10微升
向反应得到的50微升Hind Ⅲ连接反应混合物添加18个单位的Taq Ⅰ，并且在65℃部分酶解5分钟，接着用苯酚/氯仿萃取，以乙醇沉淀，并溶于无菌水中。
这样所得到的pYN1的Hind Ⅲ-Taq Ⅰ片段在ClaⅠ-Hind Ⅲ位置上插入到pBR322中去。
然后用所得到的质粒对大肠杆菌RR1和大肠杆菌HB101进行转化。选择转化物，取得优异的抗氨苄青霉素性，给出了10000个以上的大肠杆菌RR1转化物和约300个大肠杆菌HB101转化物。用微量制备法从120个转化物中提取质粒DNA，用Hpa Ⅰ断裂，在1%琼脂糖上电泳，并试验trp P/O区段中Hpa Ⅰ位置的存在。结果判断出两个克隆有这样的Hpa Ⅰ位置，所以用各种限制性内切酶酶解，然后进行电泳。图6表示了处于trp P/O位置邻近的限制性内切酶断裂位置分布图，与从断裂模型发现的一样。这些质粒DNA在Hinc Ⅱ位置中是缺少的。Hinc Ⅱ位置必须存在在-35区段，但-10区段和SD序列确实存在在那里。这些质粒称作pY3。
（3）pYN4的制备
缺少SD序列的pDR720的trp P/O和pYN3的SD序列在Hpa Ⅰ位置上连接起来，这已被确定。
这样，用Hpa Ⅰ+Hind Ⅲ酶解pDR720，接着在5%聚丙烯酰胺凝胶上进行电泳，从而一个相当于约60bp的谱带被洗脱出来。另外，用Hpa Ⅰ+Hind Ⅲ酶解pYN3，然而用细菌碱性磷酸酶（下文称“BAP”）（BRL）进行处理。
由pDR720得到的Hpa Ⅰ-Hind Ⅲ片段（约60bp）和由pYN3得到的Hpa Ⅰ-Hind Ⅲ片段（约4kp）被连接在一起，连接产物用于大肠杆菌HB101的转化。用抗氨苄青霉素性进行选择，给出13个转化物。用微量制备法从这些转化物中提取DNA，并经受Hind Ⅲ+Cla Ⅰ酶解和Hind Ⅲ+Cla Ⅰ+Hpa Ⅰ酶解。用所有的克隆得到了尺寸约58bp的一个碎片和约32bp的一个碎片。基于这一事实，考虑所希望的质粒存在于头部。提取了大量的这种质粒并且根据用各种限制性内切酶酶解所得到的断裂模型，制得了限制性内切酶断裂分布图（图7）。此质粒称为pYN4。
（4）pYN5的制备
进行以下实验以制备存在于Bgl Ⅱ和Bam HⅠ位置之间的trp P/O区。
用Eco RⅠ+Cla Ⅰ酶解pYN4以给出一个尺寸约为66bp的片段。另外，用Eco RⅠ+Cla Ⅰ酶解pBR322，然后用BAP处理，给出尺寸约4kp的碎片。这些两个碎片被连接在一起，并且用连接产物使大肠杆菌HB101转化。用抗氨苄青霉素性进行选择，给出22个转化物，以微量制备法从各个转化物中提取DNA，并用Eco RⅠ+Cla Ⅰ进行酶解。所有的克隆都给出一个60-70bp的片段。克隆之一被称为pYN5。
（5）pYN6的制备
为将pYN5的Cla Ⅰ位置转变成Bam HⅠ位置，用Bam HⅠ+Cla Ⅰ酶解pYN5。用DNA聚合酶Ⅰ Klenow片段（NEB）将各位置上的单链断裂部分转变为互补的双链，而给出一个尺寸约为4kb的片段。此片段经连接，产物用于转化大肠杆菌HB101。用抗氨苄青霉素性选择，给出27个转化物。从其中14个得到的DNA质粒是可用Bam HⅠ断裂的，但不能用Cla Ⅰ断裂。所以得到结论，所述的质粒是所希望的一个，并且检查了它的限制性内切酶断裂分布图（图8）。（此质粒称为pYN6）再者，用Maxam-Gilbert方法研究了pYN6的trp P/O区段的碱基序列。揭示出pYN6的trp P/O区段含有-35区段、-10区段和SD序列。通过Eco RⅠ+Bam HⅠ酶解，所述区段可以被切开成为尺寸约为70bp的片段（图9）。
（6）pYN7的制备
下一步打算将pYN6的Eco RⅠ位置转变成为Bgl Ⅱ位置。例如，用Eco RⅠ处理pYN6，然后再用SⅠ核酸酶处理，并且用DNA聚合酶Ⅰ Klenow片段使单链断裂部分变为双链断裂。然后用与上述相同的方法，将一个Bgl Ⅱ联接子连在那里，接着用Bgl Ⅱ处理并进行连接。用连接产物使大肠杆菌HB101发生转化。用抗氨苄青霉素性进行选择，给出10000多个转化物。所述转化物40个中的一个可用Bgl Ⅱ断裂，但不能用Eco RⅠ断裂，并且发现正是所希望的质粒。（这被称为pYN7）。
（7）pYN8、pYN9和pYN10的制备
用Bgl Ⅱ+Bam HⅠ酶解pYN7给出一个尺寸约为70bp的片段。另外，例1中的pTL1经受Bgl Ⅱ+Bam HⅠ酶解，并用BAP处理，给出一个大小约4kb的片段。这些两个片段被连接在一起，连接产物用于转化大肠杆菌HB101。用抗氨苄青霉素性进行选择，得到10000多个转化物。被研究的54个转化物中13个给出了用Bgl Ⅱ和Bam HⅠ两者都能使之断裂的质粒DNA。使此质粒进一步经受Bgl Ⅱ+Bam HⅠ酶解和经受Bgl Ⅱ+Bam HⅠ+Hpa Ⅰ酶解。结果，从8个克隆得到的质粒DNA（称为pYN8），经Bgl Ⅱ+Bam HⅠ酶解，给出了大小约为75bp的片段。Bgl Ⅱ+Bam HⅠ+Hpa Ⅰ酶解导致相当于约75bp的谱带的消失。从其它3个无性系得到的质粒DNA（称为pYN9），经Bgl Ⅱ+Bam HⅠ酶解，给出一个大小约为165bp的片段，而经Bgl Ⅱ+Bam HⅠ+Hpa Ⅰ酶解，给出一个大小约为75bp的片段。对于下一个克隆的质粒DNA（称为pYN10）经Bgl Ⅱ+Bam HⅠ酶解给出了一个大小约为240bp的片段，经Bgl Ⅱ+Bam HⅠ+Hpa酶解，给出一个大小约为75bp的碎片。
各克隆被大规模地进行培养，用消除溶解物的方法来制备质粒DNA。用各种的限制性内切酶酶解质粒，随后进行电泳。对所得到的各个片段的大小进行了测定。用这一方法得到的限制性内切酶断裂分布图如图10所示。pYN8是一个作为多重trp P/O的基本形式的质粒，而pYN9和pYN10分别地为含双重trp P/O和含三重trp P/O的质粒。
实施例3（三重trp启动子的制备。）
（1）pYN20的制备
图11概述了这一程序。例2中制备的质粒pYN5经受Cla Ⅰ+Sal Ⅰ酶解，随后用1%琼脂糖电泳和电洗提，给出大小约3.3kb的片段。在四个dNTP的存在下使用DNA聚合酶Ⅰ klenow片段，使填满其结合端。用T4DNA连接酶随后进行连接，导致ClaⅠ位置的消失和Sal Ⅰ位置的再生。用所产生的DNA，使大肠杆菌HB101发生转化。用抗氨苄青霉素性进行选择，给出了10000多个转化物。用微量制备法从其中24个转化物萃取质粒DNA。INA被分成两部分。一部分用Sal Ⅰ进行酶解，而另一部分用ClaⅠ进行酶解，随后各用1%琼脂糖进行凝胶电泳。从13个转化物得到的质粒可用Sal Ⅰ断裂，但不能用Cla Ⅰ断裂，所以这是所希望的质粒，命名为pYN20。
（2）pYN21的制备
接着在图12中概述了将pYN20的Eco RⅠ位置转换为Xho Ⅰ位置的程序。用Eco RⅠ酶解pYN20，接着用苯酚/氯仿萃取和用乙醇沉淀。这样得到的DNA用SⅠ核酸酶处理进行粘性末端酶解。三个苯酚/氯仿萃取物随被乙醇沉淀，给出沉淀物，溶于无菌水中，在65℃加热3分钟，然后迅速冷却。之后，在4个dNTP存在下用DNA聚合酶Ⅰ Klenow片段进行处理，接着用苯酚/氯仿萃取，和乙醇沉淀，再进一步与Xho Ⅰ联接子转化〔Takara Shuzo的Xho Ⅰ联结子d（CCTCGAGG）〕。接着用Xho Ⅰ酶解之后，酶解物在1%琼脂糖上作电泳，并且电洗提得到大小约3.8kb的片段。此片段用T4DNA连接酶连接，连接产物用于转化大肠杆菌HB101。经抗氨苄青霉素性选择，给出10000多个转化物，其中24个经萃取质粒DNA。DNA被分成两部分。一部分用Xho Ⅰ酶解，另一部分用Eco RⅠ酶解。从三个转化物提出的DNA不是可用Eco RⅠ酶解的，但可用Xho Ⅰ酶解，并且发现正是所希望得到的一种。这种DNA被称作为pYN21。
（3）多重trp启动基因的制备
下列程序如图13所概述。例如，pYN21用Xho Ⅰ+SalⅠ所酶解。随后的5%聚丙烯酰胺电泳给出了大小约为75bp的片段。另外，pYN21用Xho Ⅰ酶解，然后用BAP处理。苯酚/氯仿萃取重复三次，随后用乙醇沉淀，得到沉淀物，用75bp片段连接。大肠杆菌用连接产物转化。用抗氨苄青霉素性进行选择，得到10000多个转化物。从其中20个转化物萃取得到质粒DNA，并用XhoⅠ+Sal Ⅰ和用Hpa Ⅰ酶解。各个酶解物用核糖核酸酶处理，并在5%聚丙烯酰胺凝胶上电泳。从四个转化物得到的DNA，经XhoⅠ+Sal Ⅰ酶解给出大小约160bp的片段，经Hpa Ⅰ酶解给出大小约75bp的片段。经判断这个质粒含有一个双重的trp启动基因，称为pYN22。pYN22被大量地制备，用Xho Ⅰ+Sal Ⅰ酶解，并在5%聚丙烯酰胺凝胶上进行电泳。这样获得大小约160bp的片段。此片段与从pYN21（前面已提到）得到的Xho Ⅰ片段连接，产物用于转化大肠杆菌HB101。用抗氨苄青霉素性来选择，给出约1000个转化物。从其中30个转化物提取质粒DNA，并用Xho Ⅰ+Sal Ⅰ酶解和用Hpa Ⅰ酶解。经Xho Ⅰ+Sal Ⅰ酶解，从一个转化物得到的质粒给出了一个大小为230bp的片段，而经Hpa Ⅰ酶解，则给出一个大小约为75bp的片段。这就是所希望得到的含一个三重trp P/O的质粒，称为pYN23。