技术领域
本发明属于生物医用材料技术领域，具体涉及一种利用3D打印制备高强度羟基磷灰石-壳聚糖-二氧化硅杂化支架的方法。
背景技术
由于创伤、感染、肿瘤、骨骼老化、先天性畸形等各种原因造成的大面积骨缺损通常需要采用骨移植手术进行治疗。目前，骨组织工程技术克服了传统骨缺损移植技术的缺点，为临床骨修复治疗提供了一种新的选择。而3D打印作为一种新兴加工技术，能同时满足微观和宏观结构需求，适应个性化定制，在骨组织工程中具有极大优势。
壳聚糖是一种带正电荷的天然聚多糖，其结构与细胞外基质的主要成分—糖胺聚糖十分类似，是自然界中生物复合体中主要的有机成分之一，作为大分子模板可为无机矿物的沉积提供高度的分子识别点。它具有优良的生物相容性,生物可降解性，抗菌性和易成膜性等优良的生物化学性质。近年来已被广泛应用生物、医药、食品、化妆品等多种领域，其产品的开发研究己引起越来越多的国家和研究机构的重视。单纯的壳聚糖作为材料应用有一定的局限性，对壳聚糖进行改性，合成有机无机杂化或复合材料国内外已经作了大量的研究工作。天然骨组织是一个有机/无机纳米杂化体，其中的无机物主要是纳米级羟基磷灰石。因此，从仿生学的角度出发，通过模仿人体骨组织的成分、结构特性及矿化过程来构建骨修复材料已成为一种新颖的治疗骨缺损的方法。
近年来，由溶胶-凝胶法制备的有机-无机杂化材料成为骨修复材料新的研究热点。杂化材料是一种特殊的复合材料，其有机组分和无机组分能在分子水平上相互作用，在材料中有机无机两组分之间不存在明显的相界面，材料实现了分子级别的充分混合，其能够结合无机材料在力学强度、弹性模量方面、高分子材料在韧性方面的优势,弥补两种材料的不足,实现骨的临时替代,并伴随着材料降解诱导产生新骨。
发明内容
本发明提供了一种利用3D打印制备高强度羟基磷灰石-壳聚糖-二氧化硅杂化支架的方法，该方法通过溶胶-凝胶法将有机高分子和无机物在分子水平上复合，从仿生的角度出发，通过原位引入纳米级羟基磷灰石，制备出具有“结构仿生”的硬组织替代材料，并且借助3D打印技术精确调控支架的内部结构和外部形态，将其制备成具有特定形状的支架。其制备方法简单，材料来源广泛，制备条件温和，得到的三维支架具有良好的机械性能和生物相容性，在组织工程和再生医学领域的应用前景广阔。
本发明通过以下技术方案实现。
一种利用3D打印制备高强度羟基磷灰石-壳聚糖-二氧化硅杂化支架的方法，包括以下步骤：
(1)将壳聚糖粉体加入到酸溶液中，搅拌使壳聚糖粉体充分溶解，得到均匀透明的壳聚糖溶液；所述酸溶液为乙酸、乳酸、盐酸的水溶液；
(2)将正硅酸乙酯加入酸溶液中，搅拌使正硅酸乙酯充分水解，得到澄清透明的水解液，所述酸溶液为盐酸、硝酸、乙酸、乳酸的水溶液；
(3)依次向步骤(1)的壳聚糖溶液中加入钙源和磷源，搅拌使钙源和磷源充分溶解，得混合液，所述钙源为醋酸钙、硝酸钙、氢氧化钙、磷酸氢钙和氯化钙中的一种；所述磷源为磷酸二氢铵、磷酸二氢钾、磷酸二氢钠、磷酸和磷酸三乙酯中的一种；
(4)将步骤(2)的水解液加入到步骤(3)所得到的混合液中，快速搅拌均匀，真空除泡，得到乳白色的溶胶；
(5)将步骤(4)所得到的溶胶装入3D打印料筒中，静置，使溶胶凝胶化；
(6)使用3D-BioplotterTM打印设备，在一定的打印参数下，将步骤(5)所得到的凝胶挤成丝状打印到打印垫片上，形成预先设置的支架结构，得三维多孔支架；
(7)将步骤(6)的三维多孔支架充分凝胶化，得到三维贯通的多孔支架；
(8)将步骤(7)所得到的支架浸泡于碱液中以除去材料中剩余的酸；
(9)用水反复冲洗步骤(8)所得到的支架，直至PH为中性；然后干燥，得羟基磷灰石(HA)-壳聚糖-二氧化硅杂化支架，最后将烘干的支架置于恒温恒湿干燥箱中保存。
优选的，步骤(1)中所述壳聚糖的粘均分子量为10～84万，脱乙酰度为75～95％；所述酸溶液的pH值为2～6；所述壳聚糖溶液的质量分数为4～12％。
优选的，步骤(2)中所述酸溶液的摩尔浓度为1～3.84mol/L；所述搅拌的时间为1-10h。
优选的，步骤(3)中所述钙源和磷源的用量为壳聚糖质量的0～30％，其中钙磷摩尔比为1.67；所述杂化材料包括羟基磷灰石、壳聚糖和二氧化硅。
优选的，步骤(4)中所述溶胶中壳聚糖与SiO2的质量比为1～2。
优选的，步骤(5)中所述静置是将溶胶置于温度为4～40℃，湿度为30％～70％的恒温恒湿箱中静置1～5d。
优选的，步骤(6)中所述打印的参数条件为：挤出气压力为0～0.58MPa，打印速度为10～50mm/min，平台温度为常温。
优选的，步骤(6)中所述打印时设置三维多孔支架的纤维直径为0.2～1mm，纤维间距为0.1～1mm。
优选的，步骤(7)中所述三维多孔支架充分凝胶化的方式是将三维多孔支架置于温度为20～30℃，湿度为30％～70％的恒温恒湿箱中养护3～15d。
优选的，步骤(8)中所述的碱液为氢氧化钠、碳酸钠、碳酸氢钠、磷酸氢二钾、磷酸氢二钠或三羟甲基氨基甲烷(Tris)的水溶液。
优选的，步骤(9)中所述干燥的温度为40℃。
与现有技术相比，本发明具有如下优点和有益效果：
(1)本发明采用生物可降解的聚阳离子多糖壳聚糖作为基体材料，通过溶胶-凝胶法和原位沉淀法引入无机增强体二氧化硅和羟基磷灰石(HA)，实现了有机-无机材料在分子水平的杂化，有效地提高了杂化支架的机械强度，同时又具备良好的生物活性。
(2)本发明借助3D打印技术制备有机-无机杂化支架,在保证支架具有良好机械性能的同时,可通过调整打印参数制备出具有不同宏观形貌和微观结构的三维支架。
附图说明
图1为本发明利用3D打印制备高强度羟基磷灰石-壳聚糖-二氧化硅杂化支架的打印示意图。
图2为本发明实施例1中利用3D打印制备高强度壳聚糖-二氧化硅杂化支架的扫描电镜图。
图3为本发明实施例7中利用3D打印制备高强度羟基磷灰石-壳聚糖-二氧化硅杂化支架的扫描电镜图。
具体实施方式
下面结合附图和实施例对本发明作进一步详细描述,仅用于解释本发明,而不能理解为对本发明的限制。
实施例1
(1)将粘均分子量为47万、脱乙酰度为85％的壳聚糖(CS)粉末加入到4％(v/v)稀醋酸水溶液中，搅拌至完全溶解，制成浓度为8g/100ml的壳聚糖储液，为A液；取20g硅酸乙酯加入到13.85mL乙酸溶液(4％(v/v))中，常温下搅拌6h使其充分水解，得到B液；按照CS/SiO2质量比为10/7的比例将B液加入到A液中，充分搅拌使其混合均匀，真空除泡，得到淡黄色的溶胶，将其装入3D打印料筒中，置于温度为40℃，湿度为50％的恒温恒湿箱中静置56h，使其充分凝胶。
(2)支架预成型：使用3D-BioplotterTM打印设备，打印预先设定模型的三维支架。3D打印过程如图1所示。
设定打印参数为：挤出气压：0.35MPa；打印速度：35mm/s；针头尺寸内径：400μm；平台温度：常温。
3D打印支架的参数：纤维直径：400μm；纤维间距：400μm。
(3)支架后处理：将3D打印得到的支架置于温度为30℃，湿度为50％的恒温恒湿箱中养护4d，使其充分凝胶化；再将其浸入1mol/L的三羟甲基氨基甲烷水溶液(Tris)中，24h后取出，用超纯水洗至中性，在40℃烘箱中干燥，得到三维连通的壳聚糖-二氧化硅杂化支架，如图2所示。
实验测得：壳聚糖-二氧化硅杂化支架的纤维直径约为200μm，纤维间距约为200μm，压缩强度和杨氏模量如表1所示。
实施例2
(1)将粘均分子量为47万、脱乙酰度为85％的壳聚糖(CS)粉末加入到4％(v/v)稀醋酸水溶液中，搅拌至完全溶解，制成浓度为8g/100ml的壳聚糖储液，为A液；取20g硅酸乙酯加入到13.85mL乙酸溶液(4％(v/v))中，常温下搅拌6h使其充分水解，得到B液；按照CS/HA质量比为10/3的比例分别称取Ca(NO3)2.4H2O、H3PO4(保证Ca/P摩尔比为1.67)依次加入到A液中，充分搅拌至混合均匀，得到C液；按照CS/SiO2质量比为10/7的比例称取B液加入到C液中，搅拌使其混合均匀，真空除泡，得到乳白色的溶胶，将其装入3D打印料筒中，置于温度为40℃，湿度为50％的恒温恒湿箱中静置48h，使其充分凝胶。
(2)支架预成型：使用3D-BioplotterTM打印设备，打印预先设定模型的三维支架。
设定打印参数为：挤出气压：0.45MPa；打印速度：35mm/s；针头尺寸内径：400μm；平台温度：常温。
3D打印支架的参数：纤维直径：400μm；纤维间距：400μm。
(3)支架后处理：将3D打印得到的支架置于温度为30℃，湿度为50％的恒温恒湿箱中养护4d，使其充分凝胶化；再将其浸入1mol/L的三羟甲基氨基甲烷水溶液(Tris)中，24h后取出，用超纯水洗至中性，在40℃烘箱中干燥，得到三维连通的羟基磷灰石-壳聚糖-二氧化硅杂化支架。
实验测得：羟基磷灰石-壳聚糖-二氧化硅杂化支架的纤维直径约为200μm，纤维间距约为200μm，压缩强度和杨氏模量如表1所示。
实施例3
(1)将粘均分子量为47万、脱乙酰度为85％的壳聚糖(CS)粉末加入到4％(v/v)稀醋酸水溶液中，搅拌至完全溶解，制成浓度为8g/100ml的壳聚糖储液，为A液；取20g硅酸乙酯加入到13.85mL乙酸溶液(4％(v/v))中，常温下搅拌6h使其充分水解，得到B液；按照CS/HA质量比为5/2的比例分别称取Ca(NO3)2.4H2O、H3PO4(保证Ca/P摩尔比为1.67)依次加入到A液中，充分搅拌至混合均匀，得到C液；按照CS/SiO2质量比为10/7的比例称取B液加入到C液中，搅拌使其混合均匀，真空除泡，得到乳白色的溶胶，将其装入3D打印料筒中，置于温度为40℃，湿度为50％的恒温恒湿箱中静置46h，使其充分凝胶。
(2)支架预成型：使用3D-BioplotterTM打印设备，打印预先设定模型的三维支架。
设定打印参数为：挤出气压：0.48MPa；打印速度：35mm/s；针头尺寸内径：400μm；平台温度：常温。
3D打印支架的参数：纤维直径：400μm；纤维间距：400μm。
(3)支架后处理：将3D打印得到的支架置于温度为30℃，湿度为50％的恒温恒湿箱中养护4d，使其充分凝胶化；再将其浸入1mol/L的三羟甲基氨基甲烷水溶液(Tris)中，24h后取出，用超纯水洗至中性，在40℃烘箱中干燥，得到三维连通的羟基磷灰石-壳聚糖-二氧化硅杂化支架。
实验测得：羟基磷灰石-壳聚糖-二氧化硅杂化支架的纤维直径约为200μm，纤维间距约为200μm，压缩强度和杨氏模量如表1所示。
实施例4
(1)将粘均分子量为47万、脱乙酰度为85％的壳聚糖(CS)粉末加入到4％(v/v)稀醋酸水溶液中，搅拌至完全溶解，制成浓度为8g/100ml的壳聚糖储液，为A液；取20g硅酸乙酯加入到13.85mL乙酸溶液(4％(v/v))中，常温下搅拌6h使其充分水解，得到B液；按照CS/HA质量比为5/1的比例分别称取Ca(NO3)2.4H2O、H3PO4(保证Ca/P摩尔比为1.67)依次加入到A液中，充分搅拌至混合均匀，得到C液；按照CS/SiO2质量比为10/7的比例称取B液加入到C液中，搅拌使其混合均匀，真空除泡，得到乳白色的溶胶，将其装入3D打印料筒中，置于温度为40℃，湿度为50％的恒温恒湿箱中静置50h，使其充分凝胶。
(2)支架预成型：使用3D-BioplotterTM打印设备，打印预先设定模型的三维支架。
设定打印参数为：挤出气压：0.42MPa；打印速度：35mm/s；针头尺寸内径：400μm；平台温度：常温。
3D打印支架的参数：纤维直径：400μm；纤维间距：400μm。
(3)支架后处理：将3D打印得到的支架置于温度为30℃，湿度为50％的恒温恒湿箱中养护4d，使其充分凝胶化；再将其浸入1mol/L的三羟甲基氨基甲烷水溶液(Tris)中，24h后取出，用超纯水洗至中性，在40℃烘箱中干燥，得到三维连通的羟基磷灰石-壳聚糖-二氧化硅杂化支架。
实验测得：羟基磷灰石-壳聚糖-二氧化硅杂化支架的纤维直径约为200μm，纤维间距约为200μm，压缩强度和杨氏模量如表1所示。
实施例5
(1)将粘均分子量为47万、脱乙酰度为85％的壳聚糖(CS)粉末加入到4％(v/v)稀醋酸水溶液中，搅拌至完全溶解，制成浓度为8g/100ml的壳聚糖储液，为A液；取20g硅酸乙酯加入到13.85mL乙酸溶液(4％(v/v))中，常温下搅拌6h使其充分水解，得到B液；按照CS/HA质量比为10/1的比例分别称取Ca(NO3)2.4H2O、H3PO4(保证Ca/P摩尔比为1.67)依次加入到A液中，充分搅拌至混合均匀，得到C液；按照CS/SiO2质量比为10/7的比例称取B液加入到C液中，搅拌使其混合均匀，真空除泡，得到乳白色的溶胶，将其装入3D打印料筒中，置于温度为40℃，湿度为50％的恒温恒湿箱中静置52h，使其充分凝胶。
(2)支架预成型：使用3D-BioplotterTM打印设备，打印预先设定模型的三维支架。
设定打印参数为：挤出气压：0.39MPa；打印速度：35mm/s；针头尺寸内径：400μm；平台温度：常温。
3D打印支架的参数：纤维直径：400μm；纤维间距：400μm。
(3)支架后处理：将3D打印得到的支架置于温度为30℃，湿度为50％的恒温恒湿箱中养护4d，使其充分凝胶化；再将其浸入1mol/L的三羟甲基氨基甲烷水溶液(Tris)中，24h后取出，用超纯水洗至中性，在40℃烘箱中干燥，得到三维连通的羟基磷灰石-壳聚糖-二氧化硅杂化支架。
实验测得：羟基磷灰石-壳聚糖-二氧化硅杂化支架的纤维直径约为200μm，纤维间距约为200μm，压缩强度和杨氏模量如表1所示。
实施例6
(1)将粘均分子量为47万、脱乙酰度为85％的壳聚糖(CS)粉末加入到4％(v/v)稀醋酸水溶液中，搅拌至完全溶解，制成浓度为8g/100ml的壳聚糖储液，为A液；取20g硅酸乙酯加入到13.85mL乙酸溶液(4％(v/v))中，常温下搅拌6h使其充分水解，得到B液；按照CS/SiO2质量比为10/7的比例称取B液加入到A液中，搅拌使其混合均匀，真空除泡，得到乳白色的溶胶，将其装入3D打印料筒中，置于温度为40℃，湿度为50％的恒温恒湿箱中静置56h，使其充分凝胶。
(2)支架预成型：使用3D-BioplotterTM打印设备，打印预先设定模型的三维支架。
设定打印参数为：挤出气压：0.35MPa；打印速度：35mm/s；针头尺寸内径：400μm；平台温度：常温。
3D打印支架的参数：纤维直径：400μm；纤维间距：400μm。
(3)支架后处理：将3D打印得到的支架置于-20℃冰箱预冻48h，再于真空干燥机中冷冻干燥2d；取出冻干的支架，浸入1mol/L的三羟甲基氨基甲烷水溶液(Tris)中，24h后取出；用超纯水反复冲洗至中性，再置于真空干燥机中冷冻干燥48h，即得到三维连通的壳聚糖-二氧化硅杂化支架。
实验测得：壳聚糖-二氧化硅杂化支架的纤维直径约为200μm，纤维间距约为450μm，压缩强度和杨氏模量如表1所示。
实施例7
(1)将粘均分子量为47万、脱乙酰度为85％的壳聚糖(CS)粉末加入到4％(v/v)稀醋酸水溶液中，搅拌至完全溶解，制成浓度为8g/100ml的壳聚糖储液，为A液；取20g硅酸乙酯加入到13.85mL乙酸溶液(4％(v/v))中，常温下搅拌6h使其充分水解，得到B液；按照CS/HA质量比为10/3的比例分别称取Ca(NO3)2.4H2O、H3PO4(保证Ca/P摩尔比为1.67)依次加入到A液中，充分搅拌至混合均匀，得到C液；按照CS/SiO2质量比为10/7的比例称取B液加入到C液中，搅拌使其混合均匀，真空除泡，得到乳白色的溶胶，将其装入3D打印料筒中，置于温度为40℃，湿度为50％的恒温恒湿箱中静置48h，使其充分凝胶。
(2)支架预成型：使用3D-BioplotterTM打印设备，打印预先设定模型的三维支架。
设定打印参数为：挤出气压：0.45MPa；打印速度：35mm/s；针头尺寸内径：400μm；平台温度：常温。
3D打印支架的参数：纤维直径：400μm；纤维间距：400μm。
(3)支架后处理：将3D打印得到的支架置于-20℃冰箱预冻48h，再于真空干燥机中冷冻干燥2d；取出冻干的支架，浸入1mol/L的三羟甲基氨基甲烷水溶液(Tris)中，24h后取出；用超纯水反复冲洗至中性，再置于真空干燥机中冷冻干燥48h，即得到三维连通的羟基磷灰石-壳聚糖-二氧化硅杂化支架，如图3所示。
表1
实验测得：羟基磷灰石-壳聚糖-二氧化硅杂化支架的纤维直径约为200μm，纤维间距约为450μm，压缩强度和杨氏模量如表1所示。