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1、(10)申请公布号 CN 103316380 A (43)申请公布日 2013.09.25 CN 103316380 A *CN103316380A* (21)申请号 201310196824.6 (22)申请日 2013.05.23 A61L 27/46(2006.01) A61L 27/48(2006.01) (71)申请人 深圳先进技术研究院 地址 518055 广东省深圳市南山区西丽大学 城学苑大道 1068 号 (72)发明人 胡阳 潘浩波 周新 (74)专利代理机构 广州华进联合专利商标代理 有限公司 44224 代理人 吴平 (54) 发明名称 骨缺陷修复材料及其制备方法和应用 。
2、(57) 摘要 本发明涉及一种骨缺陷修复材料， 包括细菌 纤维素膜、 沉积在细菌纤维素膜的微纤维表面的 生物陶瓷材料以及分散在细菌纤维素膜中的可降 解细菌纤维素膜的纤维素酶。当将上述骨缺陷修 复材料植入骨缺损部位时， 由于成骨细胞粘附生 长于细菌纤维素膜的微纤维表面上， 而陶瓷材料 沉积在细菌纤维素膜的微纤维表面上， 因此， 生长 于微纤维表面陶瓷材料上的成骨细胞很容易被包 裹并且和成骨细胞产生的胶原蛋白形成完整的骨 组织。而细菌纤维素膜则被嵌入的纤维素酶逐渐 降解掉， 无残留， 并且降解产物葡萄糖对细胞无任 何有害性且还可以作为部分营养物质来支持骨细 胞的复制和生长。 此外， 本发明还涉及上。
3、述骨缺陷 修复材料的制备方法和应用。 (51)Int.Cl. 权利要求书 2 页 说明书 6 页 附图 3 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书2页 说明书6页 附图3页 (10)申请公布号 CN 103316380 A CN 103316380 A *CN103316380A* 1/2 页 2 1. 一种骨缺陷修复材料， 其特征在于， 包括细菌纤维素膜、 沉积在所述细菌纤维素膜 的微纤维表面的生物陶瓷材料以及分散在所述细菌纤维素膜中的可降解所述细菌纤维 素膜的纤维素酶， 所述细菌纤维素膜、 所述生物陶瓷材料及与所述纤维素酶的质量比为 10:1:0.1 0。
4、.17。 2. 如权利要求 1 所述的骨缺陷修复材料， 其特征在于， 所述细菌纤维素膜为葡糖醋杆 菌细胞外纤维素膜。 3. 如权利要求 1 所述的骨缺陷修复材料， 其特征在于， 所述生物陶瓷材料为羟基磷灰 石、 三磷酸钙、 二元磷酸钙系统、 二水磷酸氢钙及磷酸钙镁石中的至少一种。 4. 如权利要求 1 所述的骨缺陷修复材料， 其特征在于， 所述纤维素酶为来自于绿色木 霉属的纤维素酶或来自于里氏木霉属的纤维素酶。 5. 一种骨缺陷修复材料的制备方法， 其特征在于， 包括如下步骤 ： 将可生产纤维素的菌种接种到培养基中培养直至获得厚度为15mm的细菌纤维素膜 后破碎细菌细胞， 去除破碎的细菌细胞，。
5、 收集所述细菌纤维素膜 ； 将所述细菌纤维素膜经冷冻干燥处理后， 置于 0.1 0.3mol/L 的氯化钙溶液中活化 24 48 小时， 漂洗， 去除氯化钙， 得到活化的细菌纤维素膜 ； 将生物陶瓷材料加入到模拟人体体液的溶液中制备浓度为 1 5mg/mL 的生物陶瓷材 料的悬浮液， 将所述活化的细菌纤维素膜置于所述生物陶瓷材料的悬浮液中， 于 35 38 下以 1 2 转 / 分钟的转速旋转进行沉积反应 24 48 小时使所述生物陶瓷材料沉积在所 述细菌纤维素膜的微纤维上， 沉积反应结束后， 用去离子水漂洗， 冷冻干燥， 得到细菌纤维 素陶瓷复合材料， 其中， 所述细菌纤维素膜与所述生物陶瓷。
6、材料的质量比为 10:1 ； 配置浓度为0.51mg/mL的纤维素酶溶液， 按照所述纤维素酶与所述细菌纤维素膜的 质量比为0.10.17:10的比例吸取所述纤维素酶溶液置于所述细菌纤维素陶瓷复合材料 表面， 静置1520分钟使所述纤维素酶分散在所述细菌纤维素膜中， 冷冻干燥后得到所述 骨缺陷修复材料。 6. 如权利要求 5 所述的骨缺陷修复材料的制备方法， 其特征在于， 所述菌种为葡糖醋 杆菌 ； 所述培养基包括如下浓度的各组分 ： 0.10.4g/mL的葡萄糖、 0.030.06g/mL的蛋 白胨、 0.02 0.03g/mL 的无水磷酸氢二钠、 0.01 0.02g/mL 的柠檬酸、 0.。
7、005 0.015g/ mL 的硫酸镁、 0.005 0.01g/mL 的硫酸铵及体积百分数为 0.005 0.015% 的玉米糖浆提 取液， 所述培养基的溶剂为水。 7. 如权利要求 5 所述的骨缺陷修复材料的制备方法， 其特征在于， 所述破碎细菌细胞 的步骤是使用浓度为 0.1 0.2mol/L 的氢氧化钠溶液在 80水浴中振荡破碎细菌细胞 30 分钟， 并反复多次直至所有所述细菌细胞被破碎。 8. 如权利要求 5 所述的骨缺陷修复材料的制备方法， 其特征在于， 所述破碎细菌细胞 是使用浓度为 0.1mol/L 的氢氧化钠溶液破碎细菌细胞 ； 所述去除破碎的细菌细胞是使用 去离子水漂洗破碎。
8、后的细菌细胞溶液， 直至破碎的细菌细胞和残留在细菌纤维素膜中的氢 氧化钠洗出为止。 9. 如权利要求 5 所述的骨缺陷修复材料的制备方法， 其特征在于， 所述生物陶瓷材料 为羟基磷灰石、 三磷酸钙、 二元磷酸钙系统、 二水磷酸氢钙及磷酸钙镁石中的至少一种。 10. 如权利要求 5 所述的骨缺陷修复材料的制备方法， 其特征在于， 所述纤维素酶为来 权 利 要 求 书 CN 103316380 A 2 2/2 页 3 自于绿色木霉属的纤维素酶或来自于里氏木霉属的纤维素酶。 11. 如权利要求 1 4 中任一项所述的骨缺陷修复材料在制备骨缺陷修复药物领域的 应用。 12. 一种骨缺陷修复药物， 包括。
9、如权利要求 1 4 中任一项所述的骨缺陷修复材料， 所 述药物为冻干剂型。 权 利 要 求 书 CN 103316380 A 3 1/6 页 4 骨缺陷修复材料及其制备方法和应用 技术领域 0001 本发明涉及生物医学活性材料领域， 尤其是涉及一种骨缺陷修复材料及其制备方 法和应用。 背景技术 0002 骨缺陷 （bone defects） 疾病通常是由于受伤、 疾病如骨质疏松或者手术介入的原 因造成部分骨组织的缺失， 从而引起缺失部位的功能丧失。在一个大骨中， 如大腿骨， 如果 骨缺陷部位在8mm时， 通常这种缺陷可以自愈。 然而如果缺陷大于8mm， 或者在一个小骨中， 如趾骨， 缺陷甚至小。
10、于 8mm， 这种骨缺陷则不能自愈， 需要骨材料来填充， 或者利用骨材料来 引导缺陷处的骨组织和细胞生长从而修复骨缺陷。 传统的用来填充骨缺陷的材料有来自异 种移植、 同种移植、 同体移植和惰性生物材料等几种。 前三种填充方法和材料由于容易引起 排异反应、 内毒素残留和对病人造成身体其它部位的损伤， 因此利用非移植的活性生物材 料来填充骨缺陷部位越来越成为了当今的材料开发利用的热点。 0003 由于用来填充骨缺陷的活性生物材料需要与后来生长的骨组织和细胞相互融合 和包裹， 与骨折后用来固定的材料不一样， 二次手术不易分离已经融合的材料， 因此用来治 疗骨缺陷的生物材料对材料的生物降解性要求较高。
11、， 材料降解后无有害物质残留， 且最好 能最终进入代谢循环， 同时， 要求材料需要有较高的成骨细胞相容性， 且具有一定生物机械 性能。传统的降解材料运用在骨缺陷治疗中主要是聚酯类高分子、 动物性的胶原蛋白和无 机的陶瓷材料。聚酯类高分子拥有优良的可体内降解性和可控的降解时间， 但是由于降解 产物为偏酸性， 对骨细胞复制生长所需要的中性和偏碱性的微环境产生了一定的负影响。 动物性胶原蛋白的使用由于会产生可能的排异性或者有内毒素的残留， 因此对材料的来源 和使用有很高的要求。无机陶瓷材料， 如羟基磷灰石， 通常就是骨组织的一部分， 由于多孔 性和网状结构上不能达到大分子一样的要求， 因此常常与其他。
12、的材料结合来组成复合的骨 缺陷填充材料。传统的骨缺陷修复材料都具有一定局限性， 因此需要开发新的骨缺陷修复 材料。 发明内容 0004 基于此， 有必要提供一种可生物降解且降解产物无害的骨缺陷修复材料及其制备 方法和应用。 0005 一种骨缺陷修复材料， 包括细菌纤维素膜、 沉积在所述细菌纤维素膜的微纤维表 面的生物陶瓷材料以及分散在所述细菌纤维素膜中的可降解所述细菌纤维素膜的纤维 素酶， 所述细菌纤维素膜、 所述生物陶瓷材料及与所述纤维素酶的质量比为 10:1:0.1 0.17。 0006 在其中一个实施例中， 所述细菌纤维素膜为葡糖醋杆菌细胞外纤维素膜。 0007 在其中一个实施例中， 所。
13、述生物陶瓷材料为羟基磷灰石、 三磷酸钙、 二元磷酸钙系 统、 二水磷酸氢钙及磷酸钙镁石中的至少一种。 说 明 书 CN 103316380 A 4 2/6 页 5 0008 在其中一个实施例中， 所述纤维素酶为来自于绿色木霉属的纤维素酶或来自于里 氏木霉属的纤维素酶。 0009 上述骨缺陷修复材料包含细菌纤维素膜、 生物陶瓷材料及纤维素酶。细菌纤维素 对成骨细胞有较好的亲和性， 且细菌纤维素可携带足够的水分， 能够给骨细胞的生长提供 较好的生长微环境。当将上述骨缺陷修复材料植入骨缺损部位时， 由于成骨细胞粘附生长 于细菌纤维素膜的微纤维表面上， 而陶瓷材料沉积在细菌纤维素膜的微纤维表面上， 因。
14、此， 生长于微纤维表面陶瓷材料上的成骨细胞很容易被包裹并且和成骨细胞产生的胶原蛋白 形成完整的骨组织。 而细菌纤维素膜则被纤维素酶逐渐降解掉， 无残留， 并且降解产物葡萄 糖对细胞无任何有害性且还可以作为部分营养物质来支持骨细胞的复制和生长。 该骨缺陷 修复材料可广泛应用于制备骨缺陷修复药物领域， 如 ： 0010 一种骨缺陷修复药物， 包括上述骨缺陷修复材料， 所述药物为冻干剂型。 0011 一种骨缺陷修复材料的制备方法， 包括如下步骤 ： 0012 将可生产纤维素的菌种接种到培养基中培养直至获得厚度为15mm的细菌纤维 素膜后破碎细菌细胞， 去除破碎的细菌细胞， 收集所述细菌纤维素膜 ； 。
15、0013 将所述细菌纤维素膜经冷冻干燥处理后， 置于0.10.3mol/L的氯化钙溶液中活 化 24 48 小时， 漂洗， 去除氯化钙， 得到活化的细菌纤维素膜 ； 0014 将生物陶瓷材料加入到模拟人体体液的溶液中制备浓度为 1 5mg/mL 的生物陶 瓷材料的悬浮液， 将所述活化的细菌纤维素膜置于所述生物陶瓷材料的悬浮液中， 于 35 38下以 1 2 转 / 分钟的转速旋转进行沉积反应 24 48 小时使所述生物陶瓷材料沉积 在所述细菌纤维素膜的微纤维上， 沉积反应结束后， 用去离子水漂洗， 冷冻干燥， 得到细菌 纤维素陶瓷复合材料， 其中， 所述细菌纤维素膜与所述生物陶瓷材料的质量比为。
16、 10:1 ； 0015 配置浓度为0.51mg/mL的纤维素酶溶液， 按照所述纤维素酶与所述细菌纤维素 膜的质量比为0.10.17:10的比例吸取所述纤维素酶溶液置于所述细菌纤维素陶瓷复合 材料表面， 静置1520分钟使所述纤维素酶分散在所述细菌纤维素膜中， 冷冻干燥后得到 所述骨缺陷修复材料。 0016 在其中一个实施例中， 所述菌种为葡糖醋杆菌 ； 所述培养基包括如下浓度的各组 分 ： 0.1 0.4g/mL 的葡萄糖、 0.03 0.06g/mL 的蛋白胨、 0.02 0.03g/mL 的无水磷酸氢 二钠、 0.010.02g/mL的柠檬酸、 0.0050.015g/mL的硫酸镁、 0。
17、.0050.01g/mL的硫酸 铵及体积百分数为 0.005 0.015% 的玉米糖浆提取液， 所述培养基的溶剂为水。 0017 在其中一个实施例中， 所述破碎细菌细胞的步骤是使用浓度为 0.1mol/L 的氢氧 化钠溶液在 80水浴中振荡破碎细菌细胞 30 分钟， 并反复多次直至所有所述细菌细胞被 破碎。 0018 在其中一个实施例中， 所述破碎细菌细胞是使用浓度为 0.1mol/L 的氢氧化钠溶 液破碎细菌细胞 ； 所述去除破碎的细菌细胞是使用去离子水漂洗破碎后的细菌细胞溶液， 直至破碎的细菌细胞和残留在细菌纤维素膜中的氢氧化钠洗出为止。 0019 在其中一个实施例中， 所述生物陶瓷材料为。
18、羟基磷灰石、 三磷酸钙、 二元磷酸钙系 统、 二水磷酸氢钙及磷酸钙镁石中的至少一种。 0020 在其中一个实施例中， 所述纤维素酶为来自于绿色木霉属的纤维素酶或来自于里 氏木霉属的纤维素酶。 说 明 书 CN 103316380 A 5 3/6 页 6 0021 上述骨缺陷修复材料的制备方法使用生物陶瓷材料分散于模拟人体体液的溶液 中， 模拟人体体液的溶液作为生物陶瓷材料在细菌纤维素膜的微纤维上生长的母液， 此种 悬浮液与单一的生物陶瓷材料水悬浮液和单一的模拟人体体液相比较， 更能使生物陶瓷材 料在微纤维表面的快速沉积和生长。 同时， 采用冷冻干燥技术， 将纤维素酶引入到细菌纤维 素陶瓷复合材。
19、料中， 简单易行， 既保持了复合材料的完整性， 使得纤维素酶顺利分散在复合 材料内部， 又能保持纤维素酶的活性， 当使用时， 组织液侵入复合材料， 纤维素酶活性被激 活， 开始行使降解功能。 附图说明 0022 图 1 为实施例 1 中收获于培养液中细菌纤维素膜 ； 0023 图 2 为细菌纤维素 （左） 和细菌纤维素陶瓷复合材料 （右） 在光学电子显微镜下图 像比较 ； 0024 图 3 为细菌纤维素 （左） 和细菌纤维素陶瓷复合材料 （右） 在扫描电子显微镜下图 像比较 ； 0025 图 4 为细菌纤维素陶瓷复合材料在体外模拟降解实验中的在 5 天 （Day） 内的降解 情况示意图 ； 0。
20、026 图 5 为酶解液中葡萄糖含量的分析示意图 ； 0027 图 6 为酶降解后酶解液中残留物经离心、 去离子水漂洗、 干燥后的红外光谱图， 其 中， 横坐标为波数 （Wavenumber） ， 单位 cm-1， 纵坐标为吸收峰 （Transmittance） ； 0028 图7为骨缺陷修复材料在体外细胞 （人体胚胎成骨细胞） 生长对比实验， 其中， 左图 是人体胚胎成骨细胞在光学显微镜下培养瓶表面的生长情况， 中图是人体胚胎成骨细胞染 色后在光学显微镜下细菌纤维素表面的生长情况， 右图是人体胚胎成骨细胞染色后在光学 显微镜下可生物吸收的细菌纤维素陶瓷复合材料表面的生长情况， 绿色代表活细胞。
21、， 红色 代表死细胞。 具体实施方式 0029 下面主要结合附图及具体实施例对骨缺陷修复材料及其制备方法和应用作进一 步详细的说明。 0030 一实施方式的骨缺陷修复材料， 包括细菌纤维素膜、 沉积在细菌纤维素膜的微纤 维表面的生物陶瓷材料以及分散在细菌纤维素膜中的可降解细菌纤维素膜的纤维素酶。 0031 在本实施方式中， 细菌纤维素膜为葡糖醋杆菌 （Gluconacetobacter xylinum， 又 称木醋杆菌） 细胞外多糖膜。生物陶瓷材料为羟基磷灰石 （HAP） 、 三磷酸钙 （TCP） 、 二元磷酸 钙系统 （BCP） 、 二水磷酸氢钙及磷酸钙镁石中的至少一种。 纤维素酶为在中性条。
22、件下具有较 长生命期和较低活性的绿色木霉属的纤维素酶 （如 Sigma 公司的 C0615 或 C1794 等） 和来自 于里氏木霉属的纤维素酶 （如 Sigma 公司的 C8546） 中的一种。细菌纤维素膜、 生物陶瓷材 料及与纤维素酶的质量比为 10:1:0.1 0.17。 0032 该骨缺陷修复材料包含细菌纤维素膜、 生物陶瓷材料及纤维素酶。细菌纤维素对 成骨细胞有较好的亲和性， 且细菌纤维素可携带足够的水分， 能够给骨细胞的生长提供较 好的生长微环境。当将上述骨缺陷修复材料植入骨缺损部位时， 由于成骨细胞粘附生长于 说 明 书 CN 103316380 A 6 4/6 页 7 细菌纤维。
23、素膜的微纤维表面上， 而陶瓷材料沉积在细菌纤维素膜的微纤维表面上， 因此， 生 长于微纤维表面陶瓷材料上的成骨细胞很容易被包裹并且和成骨细胞产生的胶原蛋白形 成完整的骨组织。 而细菌纤维素膜则被纤维素酶逐渐降解掉， 无残留， 并且降解产物葡萄糖 对细胞无任何有害性且还可以作为部分营养物质来支持骨细胞的复制和生长。 该骨缺陷修 复材料可广泛应用于制备骨缺陷修复药物领域， 如 ： 0033 本实施方式还提供了一种骨缺陷修复药物， 包括上述骨缺陷修复材料， 药物为冻 干剂型。 0034 此外， 本实施方式还提供了一种骨缺陷修复材料的制备方法， 包括如下步骤 ： 0035 步骤一 ： 将可生产纤维素的。
24、菌种接种到培养基中培养直至获得厚度为 1 5mm 的 细菌纤维素膜后破碎细菌细胞， 去除破碎的细菌细胞， 收集细菌纤维素膜。 0036 例如， 可以选取浓度为 0.80to2.30105CFU/mL（CFU:Colony Forming Units， 菌 落个数） 的葡糖醋杆菌菌种溶液， 将该菌种溶液以 1:50 100 的比例接种到培养基中， 在 2832下静态培养。 其中， 培养基的成分如下 ： 0.10.4g/mL的葡萄糖、 0.030.06g/ mL 的蛋白胨、 0.02 0.03g/mL 的无水磷酸氢二钠、 0.01 0.02g/mL 的柠檬酸、 0.005 0.015g/mL 的硫。
25、酸镁、 0.005 0.01g/mL 的硫酸铵及体积百分数为 0.005 0.015% 的玉米 糖浆提取液， 培养基的溶剂为水。当获得 1 5mm 厚度的细菌纤维素膜后， 可以使用浓度为 0.1mol/L 的氢氧化钠溶液在 80水浴中振荡破碎细菌细胞， 反复多次， 直至细菌细胞被完 全破碎， 然后用去离子水洗去破碎的细胞和氢氧化钠， 直至细菌纤维素膜表面的 pH 接近中 性。对于收集的细菌纤维素膜， 经蒸汽灭菌后， 可置于去离子水中于 4环境中保存备用。 0037 步骤二 ： 将细菌纤维素膜经冷冻干燥处理后， 置于 0.1 0.3mol/L 的氯化钙溶液 中活化 24 48 小时， 漂洗， 去。
26、除氯化钙， 得到活化的细菌纤维素膜。 0038 氯化钙活化的目的是使细菌纤维素膜表面生成一种钙离子层， 此钙离子层可以诱 导生物陶瓷材料在其上吸附， 并逐步形成新的 Ca/P（钙 / 磷） 层。 0039 步骤三 ： 将生物陶瓷材料加入到模拟人体体液 （SBF） 的溶液中制备浓度为 1 5mg/mL 的生物陶瓷材料的悬浮液， 将活化的细菌纤维素膜置于生物陶瓷材料的悬浮液中， 与 35 38下以 1 2 转 / 分钟的转速旋转进行沉积反应 24 48 小时使生物陶瓷材料 沉积在细菌纤维素膜的微纤维上， 沉积反应结束后， 用去离子水漂洗， 冷冻干燥， 得到细菌 纤维素陶瓷复合材料， 其中， 细菌纤。
27、维素膜与生物陶瓷材料的质量比为 10:1。 0040 生物陶瓷材料可以为羟基磷灰石 （HAP） 、 三磷酸钙 （TCP） 、 二元磷酸钙系统 （BCP） 、 二水磷酸氢钙及磷酸钙镁石中的至少一种。 0041 步骤四 ： 配置浓度为 0.5-1mg/mL 纤维素酶溶液， 按照纤维素酶与细菌纤维素膜的 质量比为 0.1 0.17:10 的比例吸取纤维素酶溶液置于细菌纤维素陶瓷复合材料表面， 静 置 15 20 分钟使纤维素酶分散在细菌纤维素膜中， 冷冻干燥后得到骨缺陷修复材料。 0042 该骨缺陷修复材料的制备方法使用生物陶瓷材料分散于模拟人体体液的溶液中， 模拟人体体液的溶液作为生物陶瓷材料在细。
28、菌纤维素膜的微纤维上生长的母液， 此种悬浮 液与单一的生物陶瓷材料水悬浮液和单一的模拟人体体液相比较， 更能使生物陶瓷材料在 微纤维表面的快速沉积和生长， 例如， 当采用羟基磷灰石时， 羟基磷灰石分散于模拟人体体 液的溶液中， Ca/P 层极易在细菌纤维素膜的微纤维表面沉积并生长形成层状晶体。同时， 采用冷冻干燥技术， 将纤维素酶引入到细菌纤维素陶瓷复合材料中， 简单易行， 既保持了复 说 明 书 CN 103316380 A 7 5/6 页 8 合材料的完整性， 使得纤维素酶顺利嵌入分散在复合材料内部， 又能保持纤维素酶的活性， 当使用时， 组织液侵入复合材料， 纤维素酶活性被激活， 开始行。
29、使降解功能。 0043 筛选利用在近中性条件下有较长生命期和较低活性的纤维素酶， 如， 可以使 得纤维素能够在体内实现可控缓慢的降解和吸收， 一般能够在37天内， 对细菌纤维素陶 瓷复合材料中纤维素模版进行完全的降解。 此外， 还可以通过调节纤维素酶的种类及含量， 该细菌纤维素膜能够延长到 30 天内降解。 0044 以下为具体实施例部分 ： 0045 实施例 1 0046 步骤一 ： 选取浓度为0.80to2.30105CFU/mL的葡糖醋杆菌菌种溶液， 将该菌种溶 液以 1:100 的比例接种到培养基中， 在 30下静态培养。其中， 培养基的成分如下 ： 0.1 0.4g/mL 的葡萄糖、。
30、 0.03 0.06g/mL 的蛋白胨、 0.02 0.03g/mL 的无水磷酸氢二钠、 0.01 0.02g/mL 的柠檬酸、 0.005 0.015g/mL 的硫酸镁、 0.005 0.01g/mL 的硫酸铵及 体积百分数为 0.005 0.015% 的玉米糖浆提取液， 培养基的溶剂为水。当细胞外纤维素膜 的厚度达到15mm时， 使用浓度为0.1mol/L的氢氧化钠溶液在80水浴中振荡破碎细菌 细胞， 反复多次， 直至细菌细胞被完全破碎， 然后用去离子水洗去破碎的细胞和氢氧化钠， 直至细菌纤维素膜表面的 pH 接近中性， 收集纤维素膜， 如图 1 所示。对收集的细菌纤维素 膜， 经蒸汽灭菌。
31、后， 可置于去离子水中于 4环境中保存备用。 0047 步骤二 ： 将细菌纤维素膜经冷冻干燥处理后， 置于 0.1mol/L 的氯化钙溶液中活化 48 小时， 漂洗， 去除氯化钙， 得到活化的细菌纤维素膜。 0048 步骤三 ： 将羟基磷灰石加入到模拟人体体液 （SBF） 的溶液中制备浓度为 1mg/mL 的 羟基磷灰石的悬浮液， 将活化的细菌纤维素膜置于羟基磷灰石的悬浮液中， 与 37下以 2 转/分钟的转速旋转进行沉积反应48小时使羟基磷灰石沉积在细菌纤维素膜的微纤维上， 沉积反应结束后， 用去离子水漂洗， 冷冻干燥后并裁剪成 2.5cm2大小的小片状， 得到细菌纤 维素陶瓷复合材料。其中。
32、， 细菌纤维素膜与羟基磷灰石的质量比为 10:1。 0049 图 2 所示的是细菌纤维素 （左） 与细菌纤维素陶瓷复合材料 （右） 在光学电子显微 镜下的图像比较， 从图 2 可以看出， 细菌纤维素陶瓷复合材料相比于单一的细菌纤维素材 料致密性有很大的提高， 由此表明羟基磷灰石已经附着及生长在细菌纤维素膜的表面及内 部， 即沉积在微纤维上。 0050 图 3 所示的是细菌纤维素 （左） 和细菌纤维素陶瓷复合材料 （右） 在扫描电子显微 镜下图像比较。从图 3 可以看出， 羟基磷灰石已经稳固地包裹细菌纤维素膜的微纤维， 在其 周围形成了稳固的结晶结构。 0051 由此证明， 羟基磷灰石经过沉积反。
33、应， 已经稳固地与微纤维结合， 并且在微纤维周 围形成了一个多孔性的类球层状结构。 0052 步骤四 ： 配置浓度为 0.1%g/mL 纤维素酶溶液， 按照纤维素酶与细菌纤维素膜的 质量比为 0.1 0.17:10 的比例， 用移液管吸取纤维素酶溶液置于小片上， 静置 15 分钟使 纤维素酶分散在细菌纤维素膜中， 冷冻干燥后得到骨缺陷修复材料。 0053 经过体外降解实验表明， 羟基磷灰石层并不会阻止纤维素酶的嵌入。如图 4 所示， 在 7 天时间内， 细菌纤维素已经被顺利地、 完全地降解。图 4 中可见的模拟体液中的衬垫为 实验设计中考虑到材料接触的环境不可能是一个全溶液的介质。 骨缺陷处的。
34、环境是一个由 说 明 书 CN 103316380 A 8 6/6 页 9 骨组织和组织液组成的介质。材料不会完全浸泡在组织液中， 而是一种材料被骨组织所环 抱而其表面接触组织液。 因此， 实验设计中采用此衬垫模拟骨组织， 让材料表面接触到模拟 体液溶液而不是完全浸泡在其中。 0054 如图5所示， 对降解液中糖的分析发现， 细菌纤维素陶瓷复合材料 （右） 中葡萄糖释 放量与单一的细菌纤维素材料 （左） 相比并没有统计学意义上的变化。在误差范围内， 葡萄 糖的释放量能够高达到 95% 左右。葡萄糖不能达到 100%， 是由于细菌纤维素中细菌纤维素 的含量也并不是 100%， 通常是在 95 9。
35、8%， 其余为非常少量的脂类和糖蛋白等。 0055 如图 6 所示， 降解液里剩余的细小颗粒状白色物质经过红外光谱的检测为附着在 微纤维周围的羟基磷灰石。图 6 中的箭头所标的吸收峰带代表在 800 1100cm-1有非常明 显的吸收峰， 这些吸收峰代表磷酸根离子 （PO43-） ， 磷酸氢根离子 (HPO42-) 的红外吸收光谱， 表明残留物中含有大量的羟基磷灰石。 0056 此实验结果很好的证明了细菌纤维素能够作为一个模版， 引入羟基磷灰石， 并经 过酶作用， 最终被降解， 羟基磷灰石自身不发生任何变化而只是沉积聚集起来。 0057 如图 7 所示， 体外的细胞毒性实验， 左图是人体胚胎成。
36、骨细胞在光学显微镜下培 养瓶表面的生长情况。 中图是人体胚胎成骨细胞染色后在光学显微镜下细菌纤维素表面的 生长情况。 右图是人体胚胎成骨细胞染色后在光学显微镜下本实施例的骨缺陷修复材料表 面的生长情况。绿色代表活细胞， 红色代表死细胞。结果表明， 在本实施例的骨缺陷修复材 料表面， 人体胚胎成骨细胞同样可以良好的附着， 复制和生长， 从而也证实了人胚胎成骨细 胞能够较容易的粘附， 复制， 生长于此细菌纤维素陶瓷复合材料中。 0058 实施例 2 0059 以三磷酸钙替代羟基磷灰石。 0060 配置成 3mg/mL 的三磷酸钙模拟人体体液悬浮液。 0061 其他步骤同实施例 1。 0062 实施。
37、例 3 0063 以二元磷酸钙系统 （BCP） 替换羟基磷灰石。 0064 增加一个 BCP 合成反应。分别按照质量比 3:2 的比例， 称取一定重量的羟基磷灰 石和三磷酸钙粉末， 充分混合后， 在 800煅烧 5 小时。待冷却后， 充分研磨。将合成的 BCP 以 5mg/mL 的浓度比分散于模拟人体体液中制成悬浮液。 0065 其他步骤同实施例 1。 0066 以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式， 其描述较为具体和详细， 但并 不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是， 对于本领域的普通技术人员 来说， 在不脱离本发明构思的前提下， 还可以做出若干变形和改进， 这些都属于本发明的保 护范围。因此， 本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。 说 明 书 CN 103316380 A 9 1/3 页 10 图 1 图 2 图 3 说 明 书 附 图 CN 103316380 A 10 2/3 页 11 图 4 图 5 说 明 书 附 图 CN 103316380 A 11 3/3 页 12 图 6 图 7 说 明 书 附 图 CN 103316380 A 12 。