技术领域
本发明属于长节段外周神经损伤修复技术领域，涉及一种全氟三 乙胺乳液与种子细胞复合的神经导管制备方法。
背景技术
周围神经损伤，尤其是长节段的周围神经缺损的修复以及功能重 建一直是再生医学领域研究的重大课题。
虽然周围神经具有再生的能力，但这种再生能力的效能较低，容 易被周围的疤痕所阻挡，从而使再生轴突分散，最终形成神经瘤。当 前，自体神经移植被认为是治疗周围神经损伤或病灶切除后造成缺损 的最有效的方法。然而，这种组织移植方法往往伴有供区新的创伤、 免疫排斥反应或受到供区或供体其他许多条件的限制，以至于不能达 到理想的修复效果。因此，人工组织工程神经支架则成为了解决这一 问题的重要手段之一。
众所周知，组织工程支架、种子细胞和生长因子（或生物反应器） 是组织工程的三大要素。其中，组织工程支架和种子细胞是其中最重 要的两个因素。将功能性种子细胞接种到支架中修复组织缺损，往往 能达到类似于自体组织移植的良好修复效果。因此，功能性的接种有 种子细胞的神经支架具有非常可观的临床应用前景。然而，随着研究 的进一步深入，学者们发现当组织的体积达到数立方毫米时，其内部 的细胞将难以通过渗透作用获得营养和氧分的支持。如何才能够保证 接种到神经组织工程支架中的功能性细胞既能够大量、均匀的分布， 又能够保持良好的活性和功能状态，成为了目前一个急需要解决的问 题。
发明内容
本发明的目的在于提供一种全氟三乙胺乳液与种子细胞复合的 神经导管制备方法，解决了现有神经导管联合种子细胞修复长节段神 经缺损时出现的早期氧供不足的问题。
本发明所采用的技术方案是，全氟三乙胺乳液与种子细胞复合的 神经导管制备方法，具体按照以下步骤实施：
步骤1、制备多微孔可降解胶原-壳聚糖神经导管；
步骤2、采用京尼平和乙醇混合溶液对经步骤1制得的多微孔可 降解胶原-壳聚糖神经导管进行交联及消毒处理；
步骤3、种子细胞的培养与纯化；
步骤4、制备无菌的全氟三乙胺乳液；
步骤5、将经步骤4配制的全氟三乙胺乳液与经步骤3得到的种 子细胞混合，并用双筒等量注射器注射到步骤2得到的消毒后的多微 孔可降解胶原-壳聚糖神经导管内，得到本发明的全氟三丁胺乳液与 种子细胞复合的神经导管。
本发明的特点还在于，
步骤1具体按照以下步骤实施：
步骤1.1、分别称取I型胶原蛋白和壳聚糖，I型胶原蛋白和壳 聚糖的质量比为1～8:1；
步骤1.2、将经步骤1.1称取的I型胶原蛋白放入冰醋酸中，将 壳聚糖放入配制的醋酸溶液中，待I型胶原蛋白和壳聚糖都充分溶解 后形成两种悬浊液，混合两种悬浊液配制出I型胶原-壳聚糖凝胶状 悬浊液；
步骤1.3、将经步骤1.2.4配制的I型胶原-壳聚糖凝胶状悬浊液 倒入神经导管成形模具中，进行注模和冷淋固形处理；
步骤1.4、制备出多微孔可降解胶原-壳聚糖神经导管。
步骤1.2具体按照以下步骤实施：
步骤1.2.1、配制质量体积百分比浓度为140mg/ml醋酸溶液；
步骤1.2.2、按步骤1.1中称取的I型胶原蛋白的质量取冰醋酸， 每克I型胶原蛋白加入10ml的冰醋酸溶液，将量取的冰醋酸与I型 胶原蛋白混合，经22h～26h的溶解处理，制得I型胶原蛋白和冰醋酸 的悬浊液；
按步骤1.1中称取的壳聚糖的质量取步骤1.2.1中配制的醋酸溶 液，每克的壳聚糖加入37ml的冰醋酸溶液，将量取的醋酸溶液与壳 聚糖混合，经22h～26h的溶解处理，制得壳聚糖和醋酸的悬浊液；
步骤1.2.3、将经步骤1.2.2得到的I型胶原蛋白和醋酸的悬浊液 与壳聚糖和醋酸的悬浊液混合在一起，于2℃～6℃条件下，恒温搅拌 处理70min～110min，得到混合悬浊液；
步骤1.2.4、将经步骤1.2.3得到的混合悬浊液先进行抽真空处理， 之后再静置10h～14h，得到I型胶原-壳聚糖凝胶状悬浊液。
步骤1.3具体按照以下步骤实施：
步骤1.3.1、将经步骤1.2.4得到的I型胶原-壳聚糖凝胶状悬浊液 注入神经导管成形模具中，以小铁夹固定神经导管成形模具的两端；
步骤1.3.2、在微型调速仪作用下，以垂钓的方式将神经导管成形 模具顺轴向以1.2×10-3m/s的速度缓慢浸入液氮中，对注入神经导管 成形模具中的I型胶原-壳聚糖凝胶状悬浊液进行冷淋固形处理，待 神经导管成形模具完全浸入液氮后，继续在液氮中保留10h～14h；
步骤1.3.3、经步骤1.3.2，将神经导管成形模具连同内部注入的 I型胶原-壳聚糖凝胶状悬浊液一同转入-90℃～-70℃的冰箱中冷藏。
步骤1.4具体按照以下步骤实施：
步骤1.4.1、将神经导管成形模具从-90℃～-70℃的冰箱取出，迅 速去除神经导管成形模具两端的铁夹和铜管；
步骤1.4.2、经步骤1.4.1，将神经导管成形模具放置于预冷好的 冷冻干燥机中冻干46h～50h，其中冷冻干燥机设置的预冷参数为： -60℃、100mtorr；
步骤1.4.3、将经步骤1.4.2冻干处理后的神经导管成形模先具放 置于真空状态下并升温至0℃，保持5.5h～6.5h，之后再升温至20℃ ～24℃，保持30min～60min，解除真空状态，最后升至常温；
步骤1.4.4、经步骤1.4.2和步骤1.4.3冻干成形处理后，将神经导 管从神经导管成形模具中取出，按不同的要求，裁剪成不同长度的神 经导管，即制备得到多微孔可降解胶原-壳聚糖神经导管。
步骤2具体按照以下步骤实施：
步骤2.1、分别称取京尼平和无水乙醇，将称取的京尼平与无水 乙醇混合，配制成质量百分比浓度为0.5%～1.5%的京尼平和乙醇混合 溶液；
步骤2.2、将经步骤1制备出的多微孔可降解胶原-壳聚糖神经导 管放入步骤2.1中配制的京尼平和乙醇混合溶液中进行交联处理，交 联时间为46h～50h，每克的多微孔可降解胶原-壳聚糖神经导管要加入 20ml的京尼平和乙醇混合溶液；
步骤2.3、经步骤2.2交联处理后，将多微孔可降解胶原-壳聚糖 神经导管用去离子水和质量百分比浓度为95%的酒精交替清洗 25min～35min；
步骤2.4、将经步骤2.3清洗后的多微孔可降解胶原-壳聚糖神经 导管置于常温下干燥一周，最后用Co60照射多微孔可降解胶原-壳聚 糖神经导管进行消毒处理，得到消毒后的多微孔可降解胶原-壳聚糖 神经导管。
步骤3具体按照以下步骤实施：
步骤3.1、取鼠龄不超过2.5个月的二级雄性SD大鼠，用“改良 Nash差速贴壁联合阿糖胞苷法”进行体外分离、培养出大鼠嗅球及 嗅黏膜源性嗅鞘细胞悬液；
步骤3.2、将经步骤3.1培养出的大鼠嗅球及嗅黏膜源性嗅鞘细 胞悬液进行GFAP及NGFRp75免疫细胞荧光双重染色鉴定，确定嗅 鞘细胞的纯度：
若嗅鞘细胞的纯度达到95%则进入下一步骤；
若嗅鞘细胞的纯度达不到95%，采用细胞差速贴壁的方法进行嗅 鞘细胞的纯化，将经步骤3.1得到的嗅鞘细胞悬液在第12小时的时 候再次接种到新的培养瓶，即得到纯度达到95%的嗅鞘细胞。
步骤4具体按照以下步骤实施：
步骤4.1、称取蛋黄卵磷脂加入到台式液内，配制成质量体积百 分比浓度为15.2%～16.4%的蛋黄卵磷脂与台式液的混合溶液，于 250W～350W功率下，超声乳化1～3次，每次10～20秒，每两次超声 乳化之间间隔1分钟，制备出基础乳液；
步骤4.2、另取全氟三乙胺原液，将经步骤4.1制备出的基础乳 液与全氟三乙胺原液按体积比为3:2混合，并于250W～350W功率下， 超声乳化8～12次，每次10～20秒，每两次超声乳化之间间隔1分钟， 制备出可溶于水的全氟三乙胺乳液；
步骤4.3、将经步骤4.2制备的全氟三乙胺乳液放入高压氧舱内 8min～12min，使全氟三乙胺乳液充分溶解氧气，使其达到饱和状态；
步骤4.4、采用滤膜孔径不大于0.65μm的滤器对经步骤4.3处理 后的全氟三丁胺乳液进行过滤除菌处理，得到无菌的全氟三丁胺乳 液。
步骤4.2中全氟三丁胺原液浓度大于98%。
步骤5具体按照以下步骤实施：
步骤5.1、凝血酶溶液和纤维蛋白原溶液的制备：
将凝血酶冻干粉与凝血酶溶解液混合，制成质量体积百分比浓度 为0.02g/ml的凝血酶溶液；
将纤维蛋白原干粉与纤维蛋白原溶解液混合，制成质量体积百分 比浓度为0.16g/ml纤维蛋白原溶液；
步骤5.2、将经步骤4配制的全氟三乙胺乳液加入到步骤5.1制 备的凝血酶溶液中，其中无菌的全氟三丁胺乳液与凝血酶溶液的体积 比是1～4:8～1，制备出全氟三丁胺-凝血酶的混合溶液；
步骤5.3、将步骤3中制备出的纯化后的嗅鞘细胞加入到步骤5.2 配制的全氟三丁胺-凝血酶的混合溶液中，制成每毫升全氟三乙胺与 水凝胶-凝血酶的混合溶液中含有104～106个嗅鞘细胞的混合溶液A；
步骤5.4、量取等体积的混合溶液A与纤维蛋白原溶液，将混合 溶液A置于双筒等量注射器的一个注射筒内，将纤维蛋白原溶液置 于双筒等量注射器的另一个注射筒内，推动注射筒的顶部，混合溶液 A与纤维蛋白原溶液在双筒等量注射器前端开始反应，形成胶状混合 物，双筒等量注射器再将形成的胶状混合物注射入经步骤2得到的消 毒后的多微孔可降解胶原-壳聚糖神经导管内，即得到本发明的全氟 三丁胺乳液与种子细胞复合的神经导管。
本发明的有益效果在于，
（1）本发明的神经导管制备方法中选择多微孔可降解胶原-壳聚 糖神经导管、全氟三丁胺（Perfluorotributylamine，PFTBA）乳液及 种子细胞，构建“种子细胞早期增氧系统”，其中将全氟三丁胺作为 增氧剂，为植入多微孔可降解胶原-壳聚糖神经导管内的种子细胞提 供早期的氧供，提高了种子细胞的存活率，保持了种子细胞的活性和 功能，从而最大限度的发挥功能性神经支架的修复能力，促进了神经 再生和功能的恢复。
（2）采用本发明的神经导管在受损神经修复再生的过程中，种 子细胞扮演着重要角色，发挥着至关重要的作用，失去必要和充足的 种子细胞的支持，神经再生几乎无法获得成功。
（3）本发明的神经导管制备方法通过改善功能性种子细胞种植 入神经导管内早期的存活效率，提高功能性神经导管的促进神经再生 和功能恢复，提高伤患的生活质量，具有很高的经济和社会效益。
附图说明
图1是本发明中用到的神经导管成形模具的结构图。
图中，1.铜管，2.中空硅胶管，3.实心不锈钢管，4.填充的I型 胶原-壳聚糖凝胶状悬浊液。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施方式对本发明进行详细说明。
本发明的全氟三乙胺乳液与种子细胞复合的神经导管制备方法， 具体按照以下步骤实施：
步骤1、制备多微孔可降解胶原-壳聚糖神经导管：
步骤1.1、分别称取I型胶原蛋白和壳聚糖，I型胶原蛋白和壳 聚糖的质量比为1～8:1；
步骤1.2、将经步骤1.1称取的I型胶原蛋白放入冰醋酸中，将 壳聚糖放入配制的醋酸溶液中，待I型胶原蛋白和壳聚糖都充分溶解 后形成两种悬浊液，混合两种悬浊液配制出I型胶原-壳聚糖凝胶状 悬浊液：
步骤1.2.1、配制质量体积百分比浓度为140mg/ml醋酸溶液；
步骤1.2.2、按步骤1.1中称取的I型胶原蛋白的质量取冰醋酸， 每克I型胶原蛋白加入10ml的冰醋酸，将量取的冰醋酸与I型胶原 蛋白混合，经22h～26h的溶解处理，制得I型胶原蛋白和冰醋酸的悬 浊液；
按步骤1.1中称取的壳聚糖的质量取步骤1.2.1中配制的醋酸溶 液，每克的壳聚糖加入37ml的醋酸溶液，将量取的醋酸溶液与壳聚 糖混合，经22h～26h的溶解处理，制得壳聚糖和醋酸的悬浊液；
步骤1.2.3、将经步骤1.2.2得到的I型胶原蛋白和醋酸的悬浊液 与壳聚糖和醋酸的悬浊液混合在一起，于2℃～6℃条件下，恒温搅拌 处理70min～110min，得到混合悬浊液；
步骤1.2.4、将经步骤1.2.3得到的混合悬浊液先进行抽真空处理， 之后再静置10h～14h，得到I型胶原-壳聚糖凝胶状悬浊液；
步骤1.3、将经步骤1.2.4配制的I型胶原-壳聚糖凝胶状悬浊液 倒入神经导管成形模具中，进行注模和冷淋固形处理：
制备多微孔可降解胶原-壳聚糖神经导管所采用的神经导管成形 模具，如图1所示，包括有中空硅胶管2，中空硅胶管2的两端各连 接有一个大小相同的中空铜管1，中空硅胶管2内的空腔为一个实心 不锈钢管3，实心不锈钢管3与中空硅胶管2之间填充有I型胶原- 壳聚糖凝胶状悬浊液，其中，中空铜管1的尺寸为：长2cm，横截面 外径为2.5mm，横截面内径为1.5mm；中空硅胶管2的尺寸为：长 10cm，横截面外径为3.0mm，横截面内径为2.5mm；实心不锈钢管3 的尺寸为：长10cm，横截面直径为1.5mm。
步骤1.3.1、将经步骤1.2.4得到的I型胶原-壳聚糖凝胶状悬浊 液注入神经导管成形模具中，以小铁夹固定神经导管成形模具的两 端，防止I型胶原-壳聚糖凝胶状悬浊液流出；
其中铁夹上面有个洞，线可以传过去，所以可以固定神经导管成 形模具，然后将神经导管成形模具放入液氮中；
步骤1.3.2、在微型调速仪作用下，以垂钓的方式将神经导管成形 模具顺轴向以1.2×10-3m/s的速度缓慢浸入液氮中，对注入神经导管 成形模具中的I型胶原-壳聚糖凝胶状悬浊液进行冷淋固形处理，待 神经导管成形模具完全浸入液氮后，继续在液氮中保留10h～14h；
步骤1.3.3、经步骤1.3.2，将神经导管成形模具连同内部注入的I 型胶原-壳聚糖凝胶状悬浊液一同转入-90℃～-70℃的冰箱中冷藏；
步骤1.4、制备出多微孔可降解胶原-壳聚糖神经导管：
步骤1.4.1、将神经导管成形模具从-90℃～-70℃的冰箱取出，迅 速去除神经导管成形模具两端的铁夹和铜管；
步骤1.4.2、经步骤1.4.1，将神经导管成形模具放置于预冷好的 冷冻干燥机中冻干46h～50h，其中冷冻干燥机设置的预冷参数为： -60℃、100mtorr；
步骤1.4.3、将经步骤1.4.2冻干处理后的神经导管成形模先具放 置于真空状态下并升温至0℃，保持5.5h～6.5h，之后再升温至20℃ ～24℃，保持30min～60min，解除真空状态，最后升至常温；
步骤1.4.4、经步骤1.4.2和步骤1.4.3冻干成形处理后，将神经导 管从神经导管成形模具中取出，按不同的要求，裁剪成不同长度的神 经导管，即制备得到多微孔可降解胶原-壳聚糖神经导管。
步骤2、采用京尼平和乙醇混合溶液对经步骤1制得的多微孔可 降解胶原-壳聚糖神经导管进行交联及消毒处理：
步骤2.1、分别称取京尼平和无水乙醇，将称取的京尼平与无水 乙醇混合，配制成质量百分比浓度为0.5%～1.5%的京尼平和乙醇混合 溶液；
步骤2.2、将经步骤1制备出的多微孔可降解胶原-壳聚糖神经导 管放入步骤2.1中配制的京尼平和乙醇混合溶液中进行交联处理，交 联时间为46h～50h，每克的多微孔可降解胶原-壳聚糖神经导管要加入 20ml的京尼平和乙醇混合溶液；
步骤2.3、经步骤2.2交联处理后，将多微孔可降解胶原-壳聚糖 神经导管用去离子水和质量百分比浓度为95%的酒精交替清洗 25min～35min；
步骤2.4、将经步骤2.3清洗后的多微孔可降解胶原-壳聚糖神经 导管置于常温下干燥一周，最后用Co60照射多微孔可降解胶原-壳聚 糖神经导管进行消毒处理，获得消毒后的多微孔可降解胶原-壳聚糖 神经导管。
步骤3、种子细胞的培养与纯化：
步骤3.1、取鼠龄不超过2.5个月的二级雄性SD大鼠，用“改良 Nash差速贴壁联合阿糖胞苷法”进行体外分离、培养出大鼠嗅球及 嗅黏膜源性嗅鞘细胞悬液；
步骤3.2、将经步骤3.1培养出的大鼠嗅球及嗅黏膜源性嗅鞘细 胞悬液进行GFAP及NGFRp75免疫细胞荧光双重染色鉴定，确定嗅 鞘细胞的纯度：
若嗅鞘细胞的纯度达到95%则进入下一步骤；
若嗅鞘细胞的纯度达不到95%，采用细胞差速贴壁的方法进行嗅 鞘细胞的纯化，将经步骤3.1得到的嗅鞘细胞悬液在第12小时的时 候再次接种到新的培养瓶中，即得到纯度达到95%的嗅鞘细胞。
其中，细胞差速贴壁的方法就是利用不同细胞贴壁的时间不同的 原理，成纤维细胞会提前贴壁，而嗅鞘细胞会在12小时后才完全贴 壁，所以，只需将细胞悬液在第12小时的时候再次接种到新的培养 瓶就可以得到比较纯的嗅鞘细胞，因为成纤维细胞在前12个小时基 本贴到第一个培养瓶底部了。
步骤4、制备无菌的全氟三乙胺乳液：
步骤4.1、称取蛋黄卵磷脂加入到台式液内，配制成质量体积百 分比浓度为15.2%～16.4%的蛋黄卵磷脂与台式液的混合溶液，于 250W～350W功率下，超声乳化1～3次，每次10～20秒，每两次超声 乳化之间间隔1分钟，制备出基础乳液；
步骤4.2、另取全氟三乙胺原液（全氟三乙胺原液的浓度要大于 98%），将经步骤4.1制备出的基础乳液与全氟三乙胺原液按体积比为 3:2混合，并于250W～350W功率下，超声乳化8～12次，每次10～20 秒，每两次超声乳化之间间隔1分钟，制备出可溶于水的全氟三乙胺 乳液；
步骤4.3、将经步骤4.2制备的全氟三乙胺乳液放入高压氧舱内 8min～12min，使全氟三乙胺乳液充分溶解氧气，使其达到饱和状态；
步骤4.4、采用滤膜孔径不大于0.65μm的滤器对经步骤4.3处理 后的全氟三丁胺乳液进行过滤除菌处理，得到无菌的全氟三丁胺乳 液。
步骤5、将经步骤4配制的全氟三乙胺乳液与经步骤3得到的种 子细胞混合，并用双筒等量注射器注射到步骤2得到的消毒后的多微 孔可降解胶原-壳聚糖神经导管内，得到本发明的全氟三丁胺乳液与 种子细胞复合的神经导管：
步骤5.1、凝血酶溶液和纤维蛋白原溶液的制备：
将凝血酶冻干粉与凝血酶溶解液混合，制成质量体积百分比浓度 为0.02g/ml的凝血酶溶液；
将纤维蛋白原干粉与纤维蛋白原溶解液混合，制成质量体积百分 比浓度为0.16g/ml纤维蛋白原溶液；
步骤5.2、将经步骤4配制的全氟三乙胺乳液加入到步骤5.1制 备的凝血酶溶液中，其中无菌的全氟三丁胺乳液与凝血酶溶液的体积 比是1～4:8～1，制备出全氟三丁胺-凝血酶的混合溶液；
步骤5.3、将步骤3中制备出的纯化后的嗅鞘细胞加入到步骤5.2 配制的全氟三丁胺-凝血酶的混合溶液中，制成每毫升全氟三乙胺与 水凝胶-凝血酶的混合溶液中含有104～106个嗅鞘细胞的混合溶液A；
步骤5.4、量取等体积的混合溶液A与纤维蛋白原溶液，将混合 溶液A置于双筒等量注射器的一个注射筒内，将纤维蛋白原溶液置 于双筒等量注射器的另一个注射筒内，推动注射筒的顶部，混合溶液 A与纤维蛋白原溶液在双筒等量注射器前端开始反应，形成胶状混合 物，双筒等量注射器再将形成的胶状混合物注射入经步骤2得到的消 毒后的多微孔可降解胶原-壳聚糖神经导管内，即得到本发明的全氟 三丁胺乳液与种子细胞复合的神经导管。
其中，制备多微孔可降解胶原-壳聚糖神经导管用到的主要原料 为I型胶原蛋白和壳聚糖。其中I型胶原蛋白主要由成纤细胞或与 其来源相类似的细胞如：成骨细胞、成软骨细胞合成，生物体内胶原 的合成，一般包括一系列的过程，其通过在胞内合成胶原蛋白分子形 成前胶原，进而在胞外进一步聚合成胶原纤维和胶原束，I型胶原蛋 白作为体外细胞培养支架时，有促进细胞黏附和诱导生长分化的作 用，是良好的培养黏附剂。胶原与不同的细胞之间存在很强的亲和力， 与在创伤的愈合过程中起到关键作用的生长因子间也有着特殊的亲 和力，在血液凝固后，还可以通过刺激组织的再生与修复来防止再次 发生出血。
壳聚糖是甲壳素N-脱乙酰基的产物，具有无毒性、无免疫原性、 无热源反应、不溶血等特性，其可生物降解性和良好的生物相容性、 成膜性，使其成为一种理想的安全可靠的天然生物活性支架材料。
本发明中采用广州倍秀公司生产的猪源纤维蛋白水凝胶产品；该 产品主要由A、B两个部分组成，A部分包括有纤维蛋白原干粉、X Ⅲ因子及磷酸盐缓冲液（即纤维蛋白原溶解液），B部分包括有凝血 酶原（即凝血酶冻干粉）及CaCl2溶液（凝血酶溶解液）。将A和B 两个部分混合后形成了纤维蛋白单体，纤维蛋白单体在氢键及静电引 力的作用下，聚合成不稳定的可溶性纤维蛋白，纤维延长、变粗、 形成具有凝胶外观的三维结构，形成纤维蛋白水凝胶，反应时间5～10 秒，3～5分钟后产生明显强化，产生理想的止血、封闭、粘合作用。
采用本发明的全氟三乙胺乳液与种子细胞复合的仿生神经支架 的制备方法制备出的神经支架在SD大鼠体内进行实验，将实验分成 五组：自体神经移植组（A），空管组（CF），空管与种子细胞组（CFO）， 空管与PFTBA组（CFP），空管、种子细胞与PFTBA组（CFOP）。 通过术后4，8，12周分别对各组大鼠坐骨神经指数（SFI），再生轴 突面积，肌纤维百分比，微血管计数，以及术后1，2周，CFO与CFOP 组中存活细胞数等相关指标的比较，本发明的全氟三乙胺乳液与种子 细胞复合的仿生神经支架的坐骨神经指数（SFI）比其他的组都高、 再生轴突面积和肌纤维百分比都较大，只比自体神经移植组略低。
实施例1
分别称取I型胶原蛋白和壳聚糖，I型胶原蛋白和壳聚糖的质量 比为1:1；将称取的I型胶原蛋白放入冰醋酸中，将壳聚糖放入配制 的醋酸溶液中，待I型胶原蛋白和壳聚糖都充分溶解后形成两种悬浊 液，混合两种悬浊液配制出I型胶原-壳聚糖凝胶状悬浊液：配制质 量体积百分比浓度为140mg/ml醋酸溶液；按I型胶原蛋白的质量取 冰醋酸，每克I型胶原蛋白加入10ml的冰醋酸，将量取的冰醋酸与I 型胶原蛋白混合，经22h的溶解处理，制得I型胶原蛋白和冰醋酸的 悬浊液；按壳聚糖的质量取配制的醋酸溶液，每克的壳聚糖加入 37ml的醋酸溶液，将量取的醋酸溶液与壳聚糖混合，经22h的溶解 处理，制得壳聚糖和醋酸的悬浊液；将得到的I型胶原蛋白和醋酸的 悬浊液与壳聚糖和醋酸的悬浊液混合在一起，于2℃条件下，恒温搅 拌处理70min，即得到混合悬浊液；将经得到的混合悬浊液先进行抽 真空处理，之后再静置10h，得到I型胶原-壳聚糖凝胶状悬浊液； 将得到的I型胶原-壳聚糖凝胶状悬浊液注入神经导管成形模具中， 以小铁夹固定神经导管成形模具的两端；在微型调速仪作用下，以 垂钓的方式将神经导管成形模具顺轴向以1.2×10-3m/s的速度缓慢浸 入液氮中，对注入神经导管成形模具中的I型胶原-壳聚糖凝胶状悬 浊液进行冷淋固形处理，待神经导管成形模具完全浸入液氮后，继续 在液氮中保留10h；将神经导管成形模具连同内部注入的I型胶原- 壳聚糖凝胶状悬浊液一同转入-90℃的冰箱中冷藏；将神经导管成形 模具从-90℃的冰箱取出，迅速去除神经导管成形模具两端的铁夹和 铜管；将神经导管成形模具放置于预冷好的冷冻干燥机中冻干46h， 其中冷冻干燥机设置的预冷参数为：-60℃、100mtorr；将冻干处理后 的神经导管成形模先具放置于真空状态下并升温至0℃，保持5.5h之 后再升温至20℃，保持30min，解除真空状态，最后升至常温；将神 经导管从神经导管成形模具中取出，按不同的要求，裁剪成不同长度 的神经导管，即制备得到多微孔可降解胶原-壳聚糖神经导管；
分别称取京尼平和无水乙醇，将称取的京尼平与无水乙醇混合， 配制成质量百分比浓度为0.5%的京尼平和乙醇混合溶液；将多微孔 可降解胶原-壳聚糖神经导管放入京尼平和乙醇混合溶液中进行交联 处理，交联时间为46h，每克的多微孔可降解胶原-壳聚糖神经导管要 加入20ml的京尼平和乙醇混合溶液；将多微孔可降解胶原-壳聚糖神 经导管用去离子水和质量百分比浓度为95%的酒精反复清洗25min； 将清洗后的多微孔可降解胶原-壳聚糖神经导管置于常温下干燥一 周，最后用Co60照射多微孔可降解胶原-壳聚糖神经导管进行消毒处 理，获得消毒后的多微孔可降解胶原-壳聚糖神经导管；
取鼠龄不超过2.5个月的二级雄性SD大鼠，用“改良Nash差速 贴壁联合阿糖胞苷法”进行体外分离、培养出大鼠嗅球及嗅黏膜源性 嗅鞘细胞悬液；将培养出的大鼠嗅球及嗅黏膜源性嗅鞘细胞悬液进行 GFAP及NGFRp75免疫细胞荧光双重染色鉴定，确定种子细胞的纯 度：若种子细胞的纯度达到95%则进入下一步骤；若种子细胞的纯度 达不到95%，则采用细胞差速贴壁的方法进行种子细胞的纯化，将嗅 鞘细胞悬液在第12小时的时候再次接种到新的培养瓶，即得到纯度 达到95%的嗅鞘细胞；
将蛋黄卵磷脂加入到台式液内配制成质量体积百分比浓度为 15.2%的蛋黄卵磷脂与台式液的混合溶液，于250W功率下，超声乳 化1次，每次10秒，制备出基础乳液；将基础乳液与全氟三丁胺 PFTBA原液（浓度大于98%）混合，基础乳液和全氟三丁胺原液的 体积比是3:2，并于250W功率下，超声乳化8次，每次超声乳化10 秒，每两次超声乳化之间的时间间隔为1min，得到全氟三丁胺乳液； 将全氟三丁胺乳液放入高压氧舱内8min；采用滤膜孔径不大于 0.65μm的滤器对全氟三丁胺乳液进行过滤除菌处理，得到无菌的全 氟三丁胺乳液；
将凝血酶冻干粉与凝血酶溶解液混合，制成质量体积百分比浓度 为0.02g/ml的凝血酶溶液；将纤维蛋白原干粉与纤维蛋白原溶解液混 合，制成质量体积百分比浓度为0.16g/ml纤维蛋白原溶液；将无菌的 全氟三丁胺乳液加入到凝血酶溶液中，其中无菌的全氟三丁胺乳液与 凝血酶溶液的体积比是1:8，制备出的全氟三丁胺-凝血酶的混合溶 液；将制备出的纯化后的嗅鞘细胞加入到全氟三丁胺-凝血酶的混合 溶液中，制成每毫升全氟三乙胺与水凝胶-凝血酶的混合溶液中含有 104个嗅鞘细胞的混合溶液A；量取等体积的混合溶液A与纤维蛋白 原溶液，将混合溶液A置于双筒等量注射器的一个注射筒内，将纤 维蛋白原溶液置于双筒等量注射器的另一个注射筒内，推动注射筒的 顶部，混合溶液A与纤维蛋白原溶液在双筒等量注射器前端开始反 应，形成胶状混合物，双筒等量注射器再将形成的胶状混合物注射入 消毒后的多微孔可降解胶原-壳聚糖神经导管内，即得到本发明的全 氟三丁胺乳液与种子细胞复合的神经导管。
实施例2
分别称取I型胶原蛋白和壳聚糖，I型胶原蛋白和壳聚糖的质量 比为4:1；将称取的I型胶原蛋白放入冰醋酸中，将壳聚糖放入配制 的醋酸溶液中，待I型胶原蛋白和壳聚糖都充分溶解后形成两种悬浊 液，混合两种悬浊液配制出I型胶原-壳聚糖凝胶状悬浊液：配制质 量体积百分比浓度为140mg/ml醋酸溶液；按I型胶原蛋白的质量取 冰醋酸，每克I型胶原蛋白加入10ml的冰醋酸溶液，将量取的冰醋 酸与I型胶原蛋白混合，经24h的溶解处理，制得I型胶原蛋白和冰 醋酸的悬浊液；按壳聚糖的质量取配制的醋酸溶液，每克的壳聚糖 加入37ml的冰醋酸溶液，将量取的醋酸溶液与壳聚糖混合，经24h 的溶解处理，制得壳聚糖和醋酸的悬浊液；将得到的I型胶原蛋白和 醋酸的悬浊液与壳聚糖和醋酸的悬浊液混合在一起，于4℃条件下， 恒温搅拌处理90min，即得到混合悬浊液；将经得到的混合悬浊液先 进行抽真空处理，之后再静置12h，得到I型胶原-壳聚糖凝胶状悬 浊液；将得到的I型胶原-壳聚糖凝胶状悬浊液注入神经导管成形模 具中，以小铁夹固定神经导管成形模具的两端；在微型调速仪作用下， 以垂钓的方式将神经导管成形模具顺轴向以1.2×10-3m/s的速度缓慢 浸入液氮中，对注入神经导管成形模具中的I型胶原-壳聚糖凝胶状 悬浊液进行冷淋固形处理，待神经导管成形模具完全浸入液氮后，继 续在液氮中保留12h；将神经导管成形模具连同内部注入的I型胶原 -壳聚糖凝胶状悬浊液一同转入-80℃的冰箱中冷藏；将神经导管成形 模具从-80℃的冰箱取出，迅速去除神经导管成形模具两端的铁夹和 铜管；将神经导管成形模具放置于预冷好的冷冻干燥机中冻干48h， 其中冷冻干燥机设置的预冷参数为：-60℃、100mtorr；将冻干处理后 的神经导管成形模先具放置于真空状态下并升温至0℃，保持6h之 后再升温至22℃，保持45min，解除真空状态，最后升至常温；将神 经导管从神经导管成形模具中取出，按不同的要求，裁剪成不同长度 的神经导管，即制备得到多微孔可降解胶原-壳聚糖神经导管；
分别称取京尼平和无水乙醇，将称取的京尼平与无水乙醇混合， 配制成质量百分比浓度为1%的京尼平和乙醇混合溶液；将多微孔可 降解胶原-壳聚糖神经导管放入京尼平和乙醇混合溶液中进行交联处 理，交联时间为48h，每克的多微孔可降解胶原-壳聚糖神经导管要加 入20ml的京尼平和乙醇混合溶液；将多微孔可降解胶原-壳聚糖神经 导管用去离子水和质量百分比浓度为95%的酒精交替清洗30min；将 清洗后的多微孔可降解胶原-壳聚糖神经导管置于常温下干燥一周， 最后用Co60照射多微孔可降解胶原-壳聚糖神经导管进行消毒处理， 获得消毒后的多微孔可降解胶原-壳聚糖神经导管；
取鼠龄不超过2.5个月的二级雄性SD大鼠，用“改良Nash差速 贴壁联合阿糖胞苷法”进行体外分离、培养出大鼠嗅球及嗅黏膜源性 嗅鞘细胞悬液；将培养出的大鼠嗅球及嗅黏膜源性嗅鞘细胞悬液进行 GFAP及NGFRp75免疫细胞荧光双重染色鉴定，确定种子细胞的纯 度：若种子细胞的纯度达到95%则进入下一步骤；若种子细胞的纯度 达不到95%，则采用细胞差速贴壁的方法进行种子细胞的纯化，将嗅 鞘细胞悬液在第12小时的时候再次接种到新的培养瓶，即得到纯度 达到95%的嗅鞘细胞；
将蛋黄卵磷脂加入到台式液内配制成质量体积百分比浓度为 15.8%的蛋黄卵磷脂与台式液的混合溶液，于300W功率下，超声乳 化2次，每次15秒，每两次之间的间隔为1min，制备出基础乳液； 将基础乳液与全氟三丁胺PFTBA原液（浓度大于98%）混合，基础 乳液和全氟三丁胺原液的体积比是3:2，并于300W功率下，超声乳 化10次，每次超声乳化15秒，每两次超声乳化之间的时间间隔为 1min，得到全氟三丁胺乳液；将全氟三丁胺乳液放入高压氧舱内 10min；采用滤膜孔径不大于0.65μm的滤器对全氟三丁胺乳液进行过 滤除菌处理，得到无菌的全氟三丁胺乳液；
将凝血酶冻干粉与凝血酶溶解液混合，制成质量体积百分比浓度 为0.02g/ml的凝血酶溶液；将纤维蛋白原干粉与纤维蛋白原溶解液混 合，制成质量体积百分比浓度为0.16g/ml纤维蛋白原溶液；将无菌的 全氟三丁胺乳液加入到凝血酶溶液中，其中无菌的全氟三丁胺乳液与 凝血酶溶液的体积比是1:2，制备出的全氟三丁胺-凝血酶的混合溶 液；将制备出的纯化后的嗅鞘细胞加入到全氟三丁胺-凝血酶的混合 溶液中，制成每毫升全氟三乙胺与水凝胶-凝血酶的混合溶液中含有 105个嗅鞘细胞的混合溶液A；量取等体积的混合溶液A与纤维蛋白 原溶液，将混合溶液A置于双筒等量注射器的一个注射筒内，将纤 维蛋白原溶液置于双筒等量注射器的另一个注射筒内，推动注射筒的 顶部，混合溶液A与纤维蛋白原溶液在双筒等量注射器前端开始反 应，形成胶状混合物，双筒等量注射器再将形成的胶状混合物注射入 消毒后的多微孔可降解胶原-壳聚糖神经导管内，即得到本发明的全 氟三丁胺乳液与种子细胞复合的神经导管。
实施例3
分别称取I型胶原蛋白和壳聚糖，I型胶原蛋白和壳聚糖的质量 比为8:1；将称取的I型胶原蛋白放入冰醋酸中，将壳聚糖放入配制 的醋酸溶液中，待I型胶原蛋白和壳聚糖都充分溶解后形成两种悬浊 液，混合两种悬浊液配制出I型胶原-壳聚糖凝胶状悬浊液：配制质 量体积百分比浓度为140mg/ml醋酸溶液；按I型胶原蛋白的质量取 冰醋酸，每克I型胶原蛋白加入10ml的冰醋酸溶液，将量取的冰醋 酸与I型胶原蛋白混合，经26h的溶解处理，制得I型胶原蛋白和冰 醋酸的悬浊液；按壳聚糖的质量取配制的醋酸溶液，每克的壳聚糖 加入37ml的醋酸溶液，将量取的醋酸溶液与壳聚糖混合，经26h的 溶解处理，制得壳聚糖和醋酸的悬浊液；将得到的I型胶原蛋白和醋 酸的悬浊液与壳聚糖和醋酸的悬浊液混合在一起，于6℃条件下，恒 温搅拌处理110min，即得到混合悬浊液；将经得到的混合悬浊液先进 行抽真空处理，之后再静置14h，得到I型胶原-壳聚糖凝胶状悬浊 液；将得到的I型胶原-壳聚糖凝胶状悬浊液注入神经导管成形模具 中，以小铁夹固定神经导管成形模具的两端；在微型调速仪作用下， 以垂钓的方式将神经导管成形模具顺轴向以1.2×10-3m/s的速度缓慢 浸入液氮中，对注入神经导管成形模具中的I型胶原-壳聚糖凝胶状 悬浊液进行冷淋固形处理，待神经导管成形模具完全浸入液氮后，继 续在液氮中保留14h；将神经导管成形模具连同内部注入的I型胶原 -壳聚糖凝胶状悬浊液一同转入-70℃的冰箱中冷藏；将神经导管成形 模具从-70℃的冰箱取出，迅速去除神经导管成形模具两端的铁夹和 铜管；将神经导管成形模具放置于预冷好的冷冻干燥机中冻干50h， 其中冷冻干燥机设置的预冷参数为：-60℃、100mtorr；将冻干处理后 的神经导管成形模先具放置于真空状态下并升温至0℃，保持6.5h之 后再升温至24℃，保持60min，解除真空状态，最后升至常温；将神 经导管从神经导管成形模具中取出，按不同的要求，裁剪成不同长度 的神经导管，即制备得到多微孔可降解胶原-壳聚糖神经导管；
分别称取京尼平和无水乙醇，将称取的京尼平与无水乙醇混合， 配制成质量百分比浓度为1.5%的京尼平和乙醇混合溶液；将多微孔 可降解胶原-壳聚糖神经导管放入京尼平和乙醇混合溶液中进行交联 处理，交联时间为50h，每克的多微孔可降解胶原-壳聚糖神经导管要 加入20ml的京尼平和乙醇混合溶液；将多微孔可降解胶原-壳聚糖神 经导管用去离子水和质量百分比浓度为95%的酒精交替清洗35min； 将清洗后的多微孔可降解胶原-壳聚糖神经导管置于常温下干燥一 周，最后用Co60照射多微孔可降解胶原-壳聚糖神经导管进行消毒处 理，获得消毒后的多微孔可降解胶原-壳聚糖神经导管；
取鼠龄不超过2.5个月的二级雄性SD大鼠，用“改良Nash差速 贴壁联合阿糖胞苷法”进行体外分离、培养出大鼠嗅球及嗅黏膜源性 嗅鞘细胞悬液；将培养出的大鼠嗅球及嗅黏膜源性嗅鞘细胞悬液进行 GFAP及NGFRp75免疫细胞荧光双重染色鉴定，确定种子细胞的纯 度：若种子细胞的纯度达到95%则进入下一步骤；若种子细胞的纯度 达不到95%，则采用细胞差速贴壁的方法进行种子细胞的纯化，将嗅 鞘细胞悬液在第12小时的时候再次接种到新的培养瓶，即得到纯度 达到95%的嗅鞘细胞；
将蛋黄卵磷脂加入到台式液内配制成质量体积百分比浓度为 16.4%的蛋黄卵磷脂与台式液的混合溶液，于350W功率下，超声乳 化3次，每次20秒，每两次之间的间隔为1min，制备出基础乳液； 将基础乳液与全氟三丁胺PFTBA原液（浓度大于98%）混合，基础 乳液和全氟三丁胺原液的体积比是3:2，并于350W功率下，超声乳 化12次，每次超声乳化20秒，每两次超声乳化之间的时间间隔为 1min，得到全氟三丁胺乳液；将全氟三丁胺乳液放入高压氧舱内 12min；采用滤膜孔径不大于0.65μm的滤器对全氟三丁胺乳液进行过 滤除菌处理，得到无菌的全氟三丁胺乳液；
将凝血酶冻干粉与凝血酶溶解液混合，制成质量体积百分比浓度 为0.02g/ml的凝血酶溶液；将纤维蛋白原干粉与纤维蛋白原溶解液混 合，制成质量体积百分比浓度为0.16g/ml纤维蛋白原溶液；将无菌的 全氟三丁胺乳液加入到凝血酶溶液中，其中无菌的全氟三丁胺乳液与 凝血酶溶液的体积比是1:1，制备出的全氟三丁胺-凝血酶的混合溶 液；将制备出的纯化后的嗅鞘细胞加入到全氟三丁胺-凝血酶的混合 溶液中，制成每毫升全氟三乙胺与水凝胶-凝血酶的混合溶液中含有 105个嗅鞘细胞的混合溶液A；量取等体积的混合溶液A与纤维蛋白 原溶液，将混合溶液A置于双筒等量注射器的一个注射筒内，将纤 维蛋白原溶液置于双筒等量注射器的另一个注射筒内，推动注射筒的 顶部，混合溶液A与纤维蛋白原溶液在双筒等量注射器前端开始反 应，形成胶状混合物，双筒等量注射器再将形成的胶状混合物注射入 消毒后的多微孔可降解胶原-壳聚糖神经导管内，即得到本发明的全 氟三丁胺乳液与种子细胞复合的神经导管。