《以兔膝关节软骨单位为种子细胞,体外构建组织工程软骨的实验方法.pdf》由会员分享，可在线阅读，更多相关《以兔膝关节软骨单位为种子细胞,体外构建组织工程软骨的实验方法.pdf（5页珍藏版）》请在专利查询网上搜索。
1、(10)授权公告号 CN 101829362 B (45)授权公告日 2013.04.03 CN 101829362 B *CN101829362B* (21)申请号 201010146946.0 (22)申请日 2010.04.12 A61L 27/38(2006.01) A61L 27/20(2006.01) (73)专利权人 山西医科大学第二医院 地址 030001 山西省太原市五一路 382 号 专利权人 卫小春 (72)发明人 卫小春 段王平 孙振伟 李琦 (74)专利代理机构 太原科卫专利事务所 ( 普通 合伙 ) 14100 代理人 张彩琴 任林芳 CN 1546654 A,20。
2、04.11.17, 权利要求 1-3. US 2007/0184550 A1,2007.08.09,说明书实 施例 1. GRETA M. LEE et alIsolated chondrons: a viable alternative for studies of chondrocyte metabolism in vitro. Osteoarthritis and Cartilage .1997,第5卷 ( 第 4 期 ),261-274. 李雪盛 等 . 自体组织工程软骨研究方法及 其进展 . 国外医学耳鼻咽喉科学分册 .2000, 第 24 卷 ( 第 3 期 ),144 147. 。
3、(54) 发明名称 以兔膝关节软骨单位为种子细胞 , 体外构建 组织工程软骨的实验方法 (57) 摘要 本发明属于组织工程化软骨体外构建的技术 领域， 具体涉及一种以兔膝关节软骨单位为种子 细胞， 体外构建组织工程软骨的实验方法。 其步骤 如下 ： 留取兔膝关节， 将关节软骨反复剪成碎片 组织， 冲洗， 弃上清， 放置于无菌锥形瓶备用 ； 采 用dispase酶和II型胶原酶按12mL DMEM-F12培 养液 /g 软骨加入上述锥形瓶内， 搅拌， 消化， 形成 消化悬液 ； 将消化悬液过滤、 离心， 加入原代软骨 细胞培养液， 制成无菌的软骨单位悬液， 获得的软 骨单位进行海藻酸钠凝胶立体培。
4、养构建组织工程 软骨。本发明的有益效果 ： 软骨单位体外长期培 养过程中形态、 增殖情况稳定， 分泌 II 型胶原等 基质成分生理学功能提高， 有望促进组织工程法 修复软骨损伤的效果。 (51)Int.Cl. (56)对比文件 审查员 王云涛 权利要求书 1 页 说明书 3 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利 权利要求书 1 页 说明书 3 页 1/1 页 2 1. 一种以兔膝关节软骨单位为种子细胞， 体外构建组织工程软骨的实验方法， 其特征 在于步骤如下 ： (1)、 无菌条件下留取兔膝关节， 在超净工作台内将膝关节打开， 刮取膝关节股骨和胫 骨平台全层软骨， 将关节。
5、软骨反复剪成碎片组织， 无菌 D-Hanks 液冲洗， 弃上清， 称重， 放置 于无菌锥形瓶备用 ； (2)、 采用 dispase 酶和 II 型胶原酶按 12mL DMEM-F 12 培养液 /g 软骨加入上述锥形 瓶内， 即每克软骨加入 DMEM-F12 培养液 12mL， DMEM-F12 培养液中含有质量 / 体积浓度为 0.3的 dispase 酶和质量 / 体积浓度为 0.2的 II 型胶原酶， 上述两种酶均采用无菌DMEM-F12培养液溶解， 经过0.22m一次性过滤器过滤、 除菌， 加入培养液的锥形瓶放置于 37 5 CO2培养箱中磁力搅拌器上， 慢速搅拌， 进行联合 酶解搅。
6、拌消化 3h， 形成消化悬液 ； (3)、 将上述消化悬液用100m细胞筛网过滤于离心管中， 1200rpm离心5min， 弃上清， 然后 10mL 无菌 DMEM-F12 培养液反复冲洗、 离心 3 次， 加入原代软骨细胞培养液 10mL， 原代 软骨细胞培养液包括DMEM-F12培养基9mL及胎牛血清1mL， 制成无菌的软骨单位悬液， 即获 得了种子细胞软骨单位 ； (4)、 上述获得的软骨单位进行海藻酸钠凝胶立体培养， 体外构建组织工程软骨， 步骤 如下 ： 、 将 120mg 海藻酸钠粉剂溶解于 10mL0.9 NaCl 溶液， 振荡， 混匀， 0.45m 一次性过 滤器过滤、 除菌备。
7、用， 、 将软骨单位悬液计数、 离心， 弃上清， 按 4106个单位 /mL 海藻酸钠凝胶混合， 用无 菌吸管反复吹打均匀， 、 用微量移液器吸取 40L 混合均匀的海藻酸钠凝胶， 缓慢滴入无菌 102mMCaCl2溶 液， 静置 5 10 分钟， 制成海藻酸钠凝胶球， 0.9 NaCl 溶液蘸洗， 接种于 6 孔板培养， 每孔 接种4粒凝胶球， 加入原代培养基3mL， 原代培养基包括DMEM-F12培养基2.7mL及胎牛血清 0.3mL， 、 将培养板放置于 37 5 CO2培养箱进行培养， 2 3 日更换 1 次培养液， 使关节软 骨单位在海藻酸钠凝胶稳定生长。 权 利 要 求 书 CN 。
8、101829362 B 2 1/3 页 3 以兔膝关节软骨单位为种子细胞， 体外构建组织工程软骨 的实验方法 技术领域 0001 本发明属于组织工程化软骨体外构建的技术领域， 具体涉及一种以兔膝关节软骨 单位为种子细胞， 体外构建组织工程软骨的实验方法。 背景技术 0002 在组织工程化软骨体外构建过程中， 理想种子细胞的选择最为关键， 也是目前研 究的难点。目前， 国内外文献报道中， 最为常用的关节软骨组织工程的种子细胞为软骨细 胞。其体外常规酶解消化方法为 ： 0.4 Pronase 酶按 12mLDMEM-F12 培养液 /g 软骨 37 消化 90 分钟， 更换培养液后， 0.025 。
9、II 型胶原酶过夜消化， 获取膝关节软骨细胞。但软骨 细胞体外培养及传代过程中， 黏弹性逐渐降低， 脆性增加， 软骨细胞功能退变比较快， 体内 修复软骨缺损过程中形不成符合正常软骨特性的透明软骨组织， 成为制约组织工程技术发 展的最大障碍之一。 0003 软骨单位 (Chondron) 作为近年来才逐渐重视的关节软骨功能结构， 由细胞周基 质及包裹在一个或几个软骨细胞共同构成， 其在软骨细胞代谢及力学环境维持方面发挥了 重要作用。我们试图在体外成功酶解消化获取兔膝关节软骨单位的基础上， 以其为种子细 胞， 建立体外体外构建组织工程化关节软骨的实验方法。 发明内容 0004 本发明目的在于针对现。
10、有以软骨细胞为组织工程化软骨种子细胞的不足， 提出一 种新的关节软骨组织工程的种子细胞软骨单位 (Chondron) 的体外获取方法及其体外 组织工程化软骨的构建技术。具体是一种兔膝关节软骨单位体外酶解消化、 分离方法的基 础上， 以软骨单位为种子细胞， 以海藻酸钠凝胶为载体， 建立体外构建组织工程化关节软骨 的实验方法。 0005 本发明采用如下的技术方案实现 ： 一种以兔膝关节软骨单位为种子细胞， 体外构 建组织工程软骨的实验方法， 其特征在于步骤如下 ： 0006 (1)、 无菌条件下留取兔膝关节， 在超净工作台内将膝关节打开， 刮取膝关节股骨 和胫骨平台全层软骨， 将关节软骨反复剪成碎。
11、片组织， 无菌 D-Hanks 液冲洗， 弃上清， 称重， 放置于无菌锥形瓶备用 ； 0007 (2)、 采用 dispase 酶和 II 型胶原酶按 12mL DMEM-F12 培养液 /g 软骨加入上述锥 形瓶内， 即每克软骨加入 DMEM-F12 培养液 12mL， DMEM-F12 培养液中含有质量 / 体积浓度为 0.3的 dispase 酶和质量 / 体积浓度为 0.2的 II 型胶原酶， 0008 上述两种酶均采用无菌 DMEM-F12 培养液溶解， 经过 0.22m 一次性过滤器过滤、 除菌， 0009 加入培养液的锥形瓶放置于 37 5 CO2培养箱中磁力搅拌器上， 慢速搅拌。
12、， 进行 联合酶解搅拌消化 3h， 形成消化悬液 ； 说 明 书 CN 101829362 B 3 2/3 页 4 0010 (3)、 将上述消化悬液用 100m 细胞筛网过滤于离心管中， 1200rpm 离心 5min， 弃 上清， 然后10mL无菌DMEM-F12培养液反复冲洗、 离心3次， 加入原代软骨细胞培养液10mL， 原代软骨细胞培养液包括DMEM-F12培养基9mL及肽牛血清1mL， 制成无菌的软骨单位悬液， 即获得了种子细胞软骨单位 ； 0011 (4)、 上述获得的软骨单位进行海藻酸钠凝胶立体培养， 体外构建组织工程软骨， 步骤如下 ： 0012 、 将 120mg 海藻酸钠。
13、粉剂溶解于 10mL0.9 NaCl 溶液， 振荡， 混匀， 0.45m 一次 性过滤器过滤、 除菌备用， 0013 、 将软骨单位悬液计数、 离心， 弃上清， 按 4106个单位 /mL 海藻酸钠凝胶混合， 用无菌吸管反复吹打均匀， 0014 、 用微量移液器吸取40L混合均匀的海藻酸钠凝胶， 缓慢滴入无菌102mMCaCl2 溶液， 静置 5 10 分钟， 制成海藻酸钠凝胶球， 0.9 NaCl 溶液蘸洗， 接种于 6 孔板培养， 每 孔接种4粒凝胶球， 加入原代培养基3mL， 原代培养基包括DMEM-F12培养基2.7mL及肽牛血 清 0.3mL。 0015 、 将培养板放置于 37 5。
14、 CO2培养箱进行培养， 2 3 日更换 1 次培养液， 使关 节软骨单位在海藻酸钠凝胶稳定生长。 0016 本发明利用软骨单位作为组织工程化软骨种子细胞， 相对现有技术具有如下有益 效果 ： 0017 (1)、 利用 dispase 酶和 II 型胶原酶联合酶解搅拌消化 3 小时可以成功获取兔膝 关节软骨单位， 获取方法简单， 重复性好。 0018 (2)、 酶解消化获得的软骨单位包括完整的细胞周基质及包裹在内的一个或几个 软骨细胞， 使得软骨细胞在体外培养及构建组织工程化软骨过程中更加符合软骨细胞在体 内的生长环境及生物学特性。 0019 (3)、通 过 微 管 吸 吮 生 物 力 学 实。
15、 验 发 现，急 性 消 化 软 骨 单 位 平 衡 模 量 (1.5730.151kPa)、瞬 时 模 量 (6.8500.607kPa) 以 及 黏 弹 性 指 数 (13.4231.027kPas) 明显高于单纯软骨细胞平衡模量 (0.3700.013kPa)、 瞬时模量 (0.6720.015kPa) 以及黏弹性指数 (6.2930.134kPa s)。说明关节软骨单位较单纯细 胞相比生物力学特性明显提高， 改善了软骨细胞作为种子细胞生物力学特性较差的缺点。 0020 (4)、 与软骨细胞相比， 软骨单位体外长期培养过程中形态、 增殖情况稳定， 分泌 II 型胶原等基质成分生理学功能提。
16、高， 有望促进组织工程法修复软骨损伤的效果。 具体实施方式 0021 本发明具体步骤如下 ： 0022 (1)、 无菌条件下留取兔膝关节。在超净工作台内将膝关节打开， 锐刀刮取膝关节 股骨和胫骨平台全层软骨。用小剪刀将关节软骨反复剪成碎片组织， 无菌 D-Hanks 液冲洗， 弃上清， 称重， 放置于无菌锥形瓶备用。 0023 (2)、 采用 0.3 dispase 酶 ( 一种中性裂解酶， 美国 Sigma 公司 ) 和 0.2 II 型 胶原酶 ( 美国 Sigma 公司 ) 按 12mL DMEM-F12 培养液 /g 软骨加入上述锥形瓶内。两种酶 均采用无菌 DMEM-F12 培养液 。
17、( 美国 HyClone 公司 ) 溶解， 经过 0.22m 一次性过滤器过 说 明 书 CN 101829362 B 4 3/3 页 5 滤、 除菌。将加入培养液锥形瓶放置于 37 5 CO2培养箱中磁力搅拌器上， 慢速搅拌， 进 行联合酶解搅拌消化3h(通过我们连续观察发现， 搅拌消化3h时已肉眼看不见剩余软骨组 织块 )。 0024 (3)、 将上述消化悬液用 100m 细胞筛网过滤于 15mL 离心管中， 1200rpm 离心 5min， 弃上清， 10mL 无菌 DMEM-F12 培养液反复冲洗、 离心 3 次。加入原代软骨细胞培养液 10mL(DMEM-F12 培养基 9mL 及肽。
18、牛血清 1mL)， 制成无菌的软骨单位悬液。 0025 (4)、 上述消化获得的软骨单位进行海藻酸钠凝胶立体培养， 步骤如下 ： 0026 、 将 120mg 海藻酸钠 ( 美国 Sigma 公司 ) 粉剂溶解于 10mL0.9 NaCl 溶液， 振 荡， 混匀， 0.45m 一次性过滤器过滤、 除菌备用。 0027 、 将软骨单位悬液计数、 离心， 弃上清。 按4106个单位/mL海藻酸钠凝胶混合， 用无菌吸管反复吹打均匀。 0028 、 用微量移液器吸取40L混合均匀的海藻酸钠凝胶， 缓慢滴入无菌102mMCaCl2 溶液， 静置 5 10 分钟， 制成海藻酸钠凝胶球。0.9 NaCl 溶液蘸洗， 接种于 6 孔板培养， 每孔接种 4 粒凝胶球， 加入原代培养基 3mL(DMEM-F 12 培养基 2.7mL 及肽牛血清 0.3mL)。 0029 、 将培养板放置于 37 5 CO2培养箱进行培养， 2 3 日更换 1 次培养液， 使关 节软骨单位在海藻酸钠凝胶稳定生长。 说 明 书 CN 101829362 B 5 。