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1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201711469204.X (22)申请日 2017.12.29 (71)申请人 山西医科大学 地址 030001 山西省太原市新建南路56号 (72)发明人 解军 傅松涛 索金荣 李静静 郭璇 李英蕊 李建婷 张凯丽 孙雨晴 刘志贞 于保锋 郭睿 刘美林 曾思衡 (74)专利代理机构 太原华弈知识产权代理事务 所 14108 代理人 李毅 (51)Int.Cl. A61L 27/60(2006.01) A61L 27/36(2006.01) A61L 27/38(2006.0。
2、1) A61L 27/50(2006.01) A61L 27/54(2006.01) A61L 27/58(2006.01) A61L 27/24(2006.01) A61L 27/20(2006.01) (54)发明名称 基于复合干细胞的人工皮肤构建方法 (57)摘要 本发明公开了一种基于复合干细胞的人工 皮肤构建方法， 是以脱细胞羊膜作为皮肤组织工 程支架， 将表皮干细胞和骨髓间充质干细胞作为 种子细胞种植于羊膜的基底面上， 置于培养液中 液态培养以构建得到人工皮肤。 本发明构建的人 工皮肤具有抗原性低、 皮肤强度高、 机械性能好、 对创面和机体无害、 可诱导机体自身细胞生长、 促进创面愈。
3、合的优点和效果， 为临床皮肤移植提 供了供体。 权利要求书1页 说明书6页 附图2页 CN 108126246 A 2018.06.08 CN 108126246 A 1.一种基于复合干细胞的人工皮肤构建方法， 是以脱细胞羊膜作为皮肤组织工程支 架， 将表皮干细胞和骨髓间充质干细胞作为种子细胞种植于羊膜的基底面上， 置于培养液 中液态培养以构建得到人工皮肤。 2.根据权利要求1所述的人工皮肤构建方法， 其特征是将所述皮肤组织工程支架浸泡 于含10%胎牛血清的IMDM培养基中， 将骨髓间充质干细胞和表皮干细胞按1 1的比例混合接 种在支架基底面， 培养构建含有骨髓间充质干细胞和表皮干细胞的人工皮。
4、肤。 3.根据权利要求2所述的人工皮肤构建方法， 其特征是接种在支架基底面上的混合干 细胞的密度为2106个/cm2。 4.根据权利要求1所述的人工皮肤构建方法， 其特征是所述用于接种的骨髓间充质干 细胞和表皮干细胞均为传代3代后的干细胞。 5.根据权利要求1所述的人工皮肤构建方法， 其特征是将所述骨髓间充质干细胞和表 皮干细胞加入培养基中制成混悬液使用。 6.根据权利要求5所述的人工皮肤构建方法， 其特征是所述用于配制混悬液的培养基 是由100mg的I型胶原和100mg的硫酸软骨素溶解在100ml IMDM培养基中， 混合后经0.22 m 滤膜过滤除菌后得到的培养基。 7.根据权利要求1所述。
5、的人工皮肤构建方法， 其特征是所述的羊膜是来自于哺乳动物 的羊膜。 8.根据权利要求1所述的人工皮肤构建方法， 其特征是所述羊膜是来自于人的羊膜。 9.根据权利要求1所述的人工皮肤构建方法， 其特征是所述羊膜是经真空冷冻干燥冻 干后， 以Co60射线照射20min。 10.根据权利要求9所述的人工皮肤构建方法， 其特征是所述Co60射线的照射强度为 20kGy。 权 利 要 求 书 1/1 页 2 CN 108126246 A 2 基于复合干细胞的人工皮肤构建方法 技术领域 0001 本发明属于生物组织工程技术领域， 涉及一种真皮等同物的构建方法， 特别是涉 及一种以羊膜为支架， 构建真皮等同。
6、物的方法。 背景技术 0002 骨髓间充质干细胞是一种相对幼稚的细胞， 其具有分化成表皮、 真皮组织的潜能， 可促进创面愈合。 体外培养的骨髓间充质干细胞培养至5代以后， 仍然具有分化潜能， 这就 为利用培养增殖的骨髓间充质干细胞构建人工皮肤奠定了基础。 0003 表皮干细胞是具有自我增殖和多向分化潜能的干细胞， 它的正常增殖和分化是维 持皮肤及其附属器(汗腺 毛发、 皮脂腺)结构和功能完整性的基本要求。 表皮干细胞不仅能 在体外长期传代培养， 并保持其增殖分化潜能， 而且在一定环境条件下还表现出与胚胎干 细胞相似的分化潜能。 因此， 获得纯化的人类和动物表皮干细胞， 可以为构建具有生理功能 。
7、的人工皮肤提供种子细胞。 0004 随着人类技术的不断进步， 伤病员、 特别是大面积深度烧伤病人， 已不再满足目前 临床上常用治疗手段所能提供的治疗效果， 希望修复后的创面在外观形态和功能上要与正 常皮肤相近， 还期望修复后的皮肤要有各种皮肤附属器如毛发、 皮脂腺、 汗腺等， 甚至希望 皮肤修复后能完好如初， 没有任何瘢痕。 因此， 构建具有真正生物学功能的人工皮肤， 实现 “完美皮肤愈合” ， 已成为组织工程皮肤研究的挑战性课题。 发明内容 0005 本发明的目的是提供一种基于复合干细胞的人工皮肤构建方法， 以提供一种类似 于人体皮肤的真皮等同物。 0006 本发明所述的人工皮肤构建方法是以。
8、脱细胞羊膜作为皮肤组织工程支架， 将表皮 干细胞和骨髓间充质干细胞作为种子细胞种植于羊膜的基底面上， 置于培养液中液态培养 以构建得到人工皮肤。 0007 具体地， 本发明是将所述皮肤组织工程支架浸泡于含10%胎牛血清的IMDM培养基 中， 将骨髓间充质干细胞和表皮干细胞按1 1的比例混合后， 接种在支架基底面， 培养构建 含有骨髓间充质干细胞和表皮干细胞的人工皮肤。 0008 其中， 接种在支架基底面上的混合干细胞的密度优选为2106个/cm2。 0009 本发明用于接种的骨髓间充质干细胞和表皮干细胞均为传代3代后的干细胞。 0010 进一步地， 本发明是将所述骨髓间充质干细胞和表皮干细胞加。
9、入培养基中制成混 悬液使用。 更近一步地， 本发明所述用于配制混悬液的培养基是由100mg的I型胶原和100mg 的硫酸软骨素溶解在100ml IMDM培养基中， 混合后经0.22 m滤膜过滤除菌后得到的培养 基。 0011 本发明作为皮肤组织工程支架所使用的羊膜可以是来自于各种哺乳动物的羊膜， 优选地， 本发明使用来自于人的羊膜。 说 明 书 1/6 页 3 CN 108126246 A 3 0012 进而， 本发明作为皮肤组织工程支架的羊膜是采用下述方法处理得到的： 将胎膜用含1%双抗的PBS液清洗干净， 分离掉绒毛膜和血管组织后， 再以含1%双抗的 PBS液冲洗干净， 浸泡于以PBS液稀。
10、释的1% Triton X-100中， 37恒温水浴振荡处理24h； PBS漂洗干净， 再置于含0.02% EDTA的0.25%胰蛋白酶中， 37恒温水浴振荡处理4h， PBS漂 洗30min； 于-80预冷冻1h， 真空冷冻干燥24h； 冻干后， 以Co60射线照射20min。 0013 其中， Co60射线的照射强度为20kGy。 0014 本发明以脱细胞羊膜作为皮肤组织工程支架， 将一定浓度的骨髓间充干细胞和表 皮干细胞混合后接种于支架基底面， 于培养液中培养一段时间后构建得到人工皮肤。 其中， 使用羊膜作为支架， 一方面有利于骨髓间充质干细胞和表皮干细胞的生长， 一方面在皮肤 移植时可。
11、有效防止人工皮肤的撕裂， 增加手术的可操作性。 同时， 皮肤移植手术后羊膜与生 物体组织具有很好的相容性， 在移植初期可以从生物体吸取一些营养成分， 以促进皮肤的 愈合。 0015 I型胶原对于羊膜表面蛋白质分子而言具有较大的亲和力、 较弱的抗原性、 良好的 生物相容性和生物降解安全性， 而且可降解吸收， 粘着力好。 硫酸软骨素具有抗炎、 加速伤 口愈合、 保护胶原纤维的作用， 能促进基质中纤维增长， 增强通透性， 改善血液循环， 加速新 陈代谢， 促进渗透液的吸收及炎症的消除； 其聚阴离子具有强的保水性。 将二者结合起来用 于混悬干细胞， 有助于细胞种植于羊膜基底面， 并且在皮肤移植初期有助。
12、于水分的保持及 对创口的修复。 0016 本发明构建的基于表皮干细胞和骨髓间充质干细胞的组织工程皮肤用于皮肤缺 损移植， 可以解决临床上移植用人工皮肤来源不足的问题， 避免免疫排斥， 并在皮肤移植初 期促进皮肤的愈合。 0017 本发明构建的人工皮肤具有抗原性低、 皮肤强度高、 机械性能好、 对创面和机体无 害、 可诱导机体自身细胞生长、 促进创面愈合的优点和效果， 为临床皮肤移植提供了供体。 附图说明 0018 图1是羊膜脱细胞前后的HE染色观察结果。 0019 图2是骨髓间充质干细胞的流式检测结果。 0020 图3是表皮干细胞免疫荧光显微镜观察结果。 0021 图4是以羊膜脱细胞支架复合干。
13、细胞后的扫描电镜观察结果。 具体实施方式 0022 下述实施例仅为本发明的优选技术方案， 并不用于对本发明进行任何限制。 对于 本领域技术人员而言， 本发明可以有各种更改和变化。 凡在本发明的精神和原则之内， 所作 的任何修改、 等同替换、 改进等， 均应包含在本发明的保护范围之内。 0023 实施例1。 0024 本实施例使用的胎膜是严格按照供体医学标准获取的剖宫产胎膜， 且胎膜肝炎病 毒抗体、 梅毒抗体及人免疫缺陷病毒抗体检测均为阴性。 0025 将胎膜用含有双抗(青霉素、 链霉素)的PBS液反复冲洗三遍， 去除表面凝血块， 置 于4含双抗的PBS缓冲液中保存。 说 明 书 2/6 页 4。
14、 CN 108126246 A 4 0026 取出胎膜， 钝性分离去除残存的绒毛膜和血管组织， 以含双抗的PBS液反复冲洗， 标记基质面后浸泡于以PBS液稀释的1% Triton X-100中， 于台式水浴恒温振荡器中， 37、 100rpm/min条件下反复振荡处理24h。 0027 振荡完成后， 以PBS漂洗， 置于含0.02% EDTA的0.25%胰蛋白酶中， 37振荡处理4h 后取出， PBS漂洗30min， 得到脱细胞羊膜。 0028 分别取0.5cm1cm大小的新鲜羊膜片和脱细胞羊膜片， 经10%中性福尔马林固定 12h， 依次脱水、 浸蜡、 包埋、 切片及苏木素-伊红染色， 光学。
15、显微镜下观察羊膜的脱细胞情 况。 图1中A为羊膜脱细胞前， B为羊膜脱细胞后。 从图中可以看出羊膜经脱细胞处理后细胞 已去尽。 0029 将冲洗干净的脱细胞羊膜在平皿中平整展开， 置于-80冰箱预冷冻1h， 真空冷冻 干燥24h， 冻干后， 剪成2cm2cm的方形小块， 以强度20kGy的Co60射线辐照20min， 消毒后制 成羊膜脱细胞支架(HAAM)。 0030 实施例2。 0031 取实施例1制备的总面积约60cm2经Co60射线辐照过的HAAM， 置于25cm2培养瓶内， 加入IMDM培养基10mL， 于CO2培养箱内37静置24h， 制备得到浸提液， 用于测定HAAM的细胞 毒性。。
16、 0032 取第三代骨髓间充质干细胞， 按1103个细胞/孔的数量接种于96孔板中， 共接种 4个板， 加入含10% FBS的IMDM培养基， 于CO2培养箱中培养24h。 吸去培养基， 每块板上分别 添加含10% FBS的IMDM培养基200L作为对照组， 添加含10% FBS的浸提液200L作为实验 组， 每组6孔设置8个重复。 每组中同时设置一不加干细胞的空白孔。 0033 自第二天开始， 每隔48h取出一块孔板， 加入CCK8溶液10L， 继续培养1h， 取出冷却 至室温， 选择450nm波长， 在酶标仪上测定各孔吸光度值(OD)。 0034 各组所测吸光度值均减去各自组对应空白孔的吸。
17、光度值作为各组的实际吸光度 值进行统计， 结果如表1所示。 结果以表示。 0035 根据所测定各组吸光度值计算出细胞的相对增殖率： 细胞相对增殖率(RGR) = 实 验组吸光度值/对照组吸光度值。 0036 根据表1中数据， 经CCK8法测定每孔吸光度值求得的相对增殖率显示， 羊膜经Co60 射线辐照后的相对毒性很低， 在安全范围内。 0037 实施例3。 0038 取健康清洁级SD大鼠2只， 称重， 腹腔注射0.4%水合氯醛(0.5mL/100g)麻醉， 仰卧 说 明 书 3/6 页 5 CN 108126246 A 5 位固定于无菌手术台上， 棉球蘸取碘伏消毒双后肢及腹部， 反复消毒3次。。
18、 无菌条件下跨关 节取下胸骨， 双侧下肢股骨、 胫骨， 去除附着的软组织， 并将骨骼标本以D-Hank s液冲洗3 遍。 剪断股骨、 胫骨两端， 暴露骨髓腔， 用1mL注射器吸取含有1%双抗的IMDM培养基冲洗骨髓 腔数次， 直到骨髓由红色变为白色， 吹打制成单细胞悬液。 胸骨部分用剪刀剪碎， 置于平面 皿中， 用IMDM培养基吹打， 吸取上层液体于离心管中。 0039 将上述两组液体1000r/min离心5min， 弃上清， 以含10% FBS、 1%双抗的IMDM培养基 重悬， 得到骨髓间充质干细胞细胞。 0040 将得到的骨髓间充质干细胞细胞接种于培养瓶中， 置37、 5%CO2培养箱中。
19、培养。 培养3天后进行半量换液， 5天后全量换液， 于37、 5%CO2培养箱中继续培养。 0041 骨髓间充质干细胞融合度达到90%左右时进行传代。 弃培养基， PBS清洗2遍， 加入 0.25%胰酶(含0.02% EDTA)溶液1mL， 37消化3min， 显微镜下观察细胞变圆漂浮， 加入培养 基终止消化。 用吸管将细胞悬液移入离心管中， 1000rpm离心5min。 弃上清， 加入培养基吹打 细胞进行重悬， 按1 2的比例进行传代， 37、 5%CO2培养箱中培养。 0042 以后骨髓间充质干细胞融合到90%时， 依此方法进行传代， 直到传至第3代， 得到纯 化的骨髓间充质干细胞。 00。
20、43 取融合度90%左右的第3代骨髓间充质干细胞， 弃培养基， PBS清洗2遍， 加入0.25% 胰酶溶液1mL， 37消化5min， 显微镜下观察细胞变圆漂浮， 加入培养基终止消化。 用吸管将 细胞悬液移入离心管中， 1000rpm离心5min， 弃上清， PBS清洗2遍， 再次离心。 弃上清， 加入 1mL PBS， 吹打制成细胞混悬液， 细胞计数， 调整细胞密度为105个/mL。 过滤细胞， 1000rpm离 心5min， 弃上清， 加入PBS调整溶液体积为200 L， 轻轻弹起细胞为混悬液， 分别加入CD105- PE、 CD90-PE、 CD45-FITC抗体， 常温避光孵育30mi。
21、n； 加入45mL PBS洗涤液， 1000rpm离心 5min， 弃上清， 加入200 L缓冲液， 再次轻轻弹起细胞为混悬液， 使用BD FACS Aria III流式 细胞仪进行检测。 通过检测不同细胞与抗体结合后所带荧光强度的不同， 分析细胞所带表 面标志物以及细胞类型。 0044 检测结果如图2所示， 第3代骨髓间充质干细胞表面标记物显示， 间充质干细胞表 面分子CD105、 CD90的表达率分别为(99.540.13)%和(95.741.39)%， 造血细胞表面标记 物CD45的结果为阴性， 表达率(0.871.39)%， 证实所培养细胞为骨髓间充质干细胞。 0045 实施例4。 0。
22、046 无菌采集新生SD大鼠背部皮肤， 用含高浓度双抗的无钙镁PBS充分清洗， 以眼科镊 轻轻剥除真皮层的脂肪组织。 将获得的表皮组织切割成0.1cm0.1cm的小块， 基底面朝下 贴于35mm2培养皿中； 待表皮与皿底贴附紧密而未干时， 滴加少量无血清角质形成细胞培养 基(KSFM)浸润组织块， 置于5%CO2， 37培养箱中培养。 24h后， 添加培养液至正常用量， 隔天 换液。 0047 待组织块周围细胞长至直径12cm时， 进行消化传代。 弃去培养皿内培养液， 用无 钙镁PBS冲洗3遍， 向培养皿内加入400 L 0.25%胰蛋白酶(含0.02% EDTA)， 室温消化约1min 后，。
23、 将胰酶弃去； 再向培养皿内加入400 L 0.25%胰蛋白酶(含0.02% EDTA)， 消化约5min后， 用等体积培养液中和， 吹打均匀。 将细胞混悬液移入离心管中， 1000r/min离心5min。 弃上 清， 用1mL培养液吹打均匀， 接种于培养皿内， 放入37、 5%CO2培养箱中静置培养20min， 轻 轻吸取未贴壁细胞并弃掉， 并向原皿中添加培养液， 放入37、 5%CO2培养箱中培养， 隔天换 说 明 书 4/6 页 6 CN 108126246 A 6 液。 待细胞融合度达到90%左右时进行第2次传代， 弃培养基， PBS清洗2遍， 加入0.25%胰酶 (含0.02% ED。
24、TA)溶液1mL， 37消化3min， 显微镜下观察细胞变圆漂浮， 加入培养基终止消 化。 用吸管将细胞悬液移入离心管中， 1000rpm离心5min。 弃上清， 加入培养基吹打细胞进行 重悬， 按1 2的比例进行传代， 37、 5%CO2培养箱中培养。 以此方法进行传代得到第3代纯化 的表皮干细胞。 0048 取传代至第3代的表皮干细胞， 吸去培养基， 用无钙镁PBS冲洗2遍， 向培养皿内加 入1mL 0.25%胰蛋白酶(含0.02% EDTA)， 待细胞大多变圆悬浮后， 加入等体积的培养基中 和， 移至离心管中， 1000rpm离心5min。 用1mL培养基重悬细胞， 在显微镜下进行细胞计。
25、数， 以 每孔103个细胞种植于96孔板中， 每孔补充培养基至200 L。 次日， 吸去孔板中的培养基， 用 PBS洗涤3min， 吸去PBS。 加入4%多聚甲醛， 4固定30min； 吸去多聚甲醛， 用PBS洗涤3次， 每 次3min。 以0.5% Triton X-100于室温透明15min， 吸去Triton X-100， 用PBS洗涤3次， 每次 3min。 用10%山羊血清于37封闭30min， 加入一抗(K15、 6整联蛋白)， 按1 1000比例稀释 后， 每孔加入200 L， 4避光孵育过夜。 0049 回收一抗于离心管中以备下次使用， 加入PBS洗涤3次， 每次3min； 将。
26、荧光二抗按1 500比例稀释后， 每孔加入200 L， 37避光孵育1h； 吸去二抗， 用PBS洗3次， 每次3min； 加入 DAPI染核， 室温避光10min； 用PBS洗2次， 每次3min； 用10%甘油封片， 在荧光显微镜下观察细 胞表面荧光强度。 0050 如图3所示， 传代后的细胞可以被毛囊干细胞标记分子K15和 6整联蛋白特异性标 记。 利用上述方法培养的细胞培养至第3代时仍然具有克隆形成能力。 实验证明， 本实施例 方法能够实现对表皮干细胞的体外培养。 0051 实施例5。 0052 将经Co60射线辐照过的冻干羊膜浸泡于无菌生理盐水中漂洗5次； 将羊膜基质面朝 上平铺在6孔。
27、培养板中， 置入IMDM培养基浸润预湿2h； 再置入含10%胎牛血清的IMDM完全培 养基浸润预湿2h。 0053 将100mg I型胶原和100mg硫酸软骨素溶解在100mL IMDM培养基中， 配制成混合溶 液， 用0.22 m滤器过滤除菌。 0054 取第3代骨髓间充质干细胞和表皮干细胞， 弃培养基后， 分别用PBS洗两遍， 加入含 0.02% EDTA的0.25%胰酶， 待细胞大部分变圆浮起时， 加入IMDM完全培养基终止消化， 转移 到离心管中， 1000rpm离心5min。 弃上清， 使骨髓间充质干细胞与表皮干细胞以1 1的比例混 合， 加入含I型胶原和硫酸软骨素的培养基混合溶液1。
28、mL， 显微镜计数。 使用含I型胶原和硫 酸软骨素的培养基调整细胞浓度至2106个/mL， 配制成7mL细胞混悬液。 0055 将细胞混悬液缓慢滴加到铺有羊膜的6孔板中， 每孔加1ml细胞悬液， 静置于37、 5%CO2培养箱中培养12h， 使细胞黏附到羊膜材料上。 加入含10%胎牛血清的IMDM完全培养 基1mL， 静置于培养箱内24h， 使干细胞与支架网壁充分粘附。 吸去上清液， 更换培养基， 于37 、 5%CO2培养箱内静置培养， 每3天换一次液。 每天在显微镜下观察细胞生长情况， 细胞生 长旺盛。 0056 8天后， 将羊膜取出， 人工皮肤制备完成。 0057 显微镜下观察细胞生长情。
29、况， 并剪取种植了细胞的0.5cm1cm大小羊膜片， 种植 细胞的一面朝上放置， 2.5%戊二醛4过夜； PBS冲洗35次， 每次1015min； 1%锇酸固定 说 明 书 5/6 页 7 CN 108126246 A 7 30min， 用PBS冲洗35次， 每次1015min； 乙醇30%、 50%、 70%、 80%、 90%各一次， 每次10 15min； 100%乙醇一次、 100%丙酮二次， 每次2030min； 用乙酸已酯置换液与丙酮 （1 1） 混合 液置换一次， 纯乙酸已酯置换液置换一次， 各1020min， 临界点干燥约23h。 干燥后样品 进行表面真空喷金， 扫描电镜观察羊膜表面细胞的生长情况， 选择合适的放大倍数拍摄照 片。 0058 如图4所示， 种植骨髓间充质干细胞和表皮干细胞到羊膜表面， 细胞粘附于羊膜上 并生长状态良好， 培养5天后， 细胞铺满羊膜， 呈放射状的不规则形态。 说 明 书 6/6 页 8 CN 108126246 A 8 图1 图2 图3 说 明 书 附 图 1/2 页 9 CN 108126246 A 9 图4 说 明 书 附 图 2/2 页 10 CN 108126246 A 10 。