《一种人工硬脊膜及其制备方法和使用方法.pdf》由会员分享，可在线阅读，更多相关《一种人工硬脊膜及其制备方法和使用方法.pdf（23页珍藏版）》请在专利查询网上搜索。
1、(10)申请公布号 CN 103480042 A (43)申请公布日 2014.01.01 CN 103480042 A (21)申请号 201310473263.X (22)申请日 2013.10.11 A61L 27/40(2006.01) A61F 2/44(2006.01) (71)申请人 于凤宾 地址 313099 浙江省湖州市吴兴区朝阳街道 车站路 9 号 申请人 岑莲 陈德玉 (72)发明人 于凤宾 岑莲 陈德玉 李强 廖心远 (74)专利代理机构 北京超凡志成知识产权代理 事务所 ( 普通合伙 ) 11371 代理人 吴开磊 (54) 发明名称 一种人工硬脊膜及其制备方法和使用。
2、方法 (57) 摘要 本发明提供了一种人工硬脊膜及其制备方法 和使用方法。 所述人工硬脊膜具有双层结构， 包括 内层和外层， 所述内层是有取向性的聚乳酸 / 乙 醇酸共聚物纳米纤维膜， 所述外层是无取向性的 聚乳酸/乙醇酸共聚物-壳聚糖纳米纤维膜， 所述 内层和所述外层连接。属于生物医学技术领域。 采用本发明提供的人工硬脊膜， 能够实现硬脊膜 再生以及达到预防硬膜外瘢痕及粘连的目的， 并 且能够显著减少术后脑脊液漏发生率。 (51)Int.Cl. 权利要求书 1 页 说明书 8 页 附图 13 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书1页 说明书8页 附图13。
3、页 (10)申请公布号 CN 103480042 A CN 103480042 A 1/1 页 2 1. 一种人工硬脊膜， 其特征在于 ： 所述人工硬脊膜具有双层结构， 包括内层和外层， 所 述内层是有取向性的聚乳酸 / 乙醇酸共聚物纳米纤维膜， 所述外层是无取向性的聚乳酸 / 乙醇酸共聚物 - 壳聚糖纳米纤维膜， 所述内层和所述外层连接。 2. 根据权利要求 1 所述的人工硬脊膜， 其特征在于 ： 所述内层和所述外层采用胶黏剂 粘合， 所述胶黏剂采用生物胶黏剂。 3. 根据权利要求 2 所述的人工硬脊膜， 其特征在于 ： 所述生物胶黏剂采用贻贝粘蛋白。 4. 根据权利要求 1 所述的人工硬脊。
4、膜， 其特征在于 ： 所述无取向性的聚乳酸 / 乙醇酸 共聚物-壳聚糖纳米纤维膜是在无取向性的聚乳酸/乙醇酸共聚物纳米纤维膜表面涂上壳 聚糖涂层。 5. 根据权利要求 4 所述的人工硬脊膜， 其特征在于 ： 所述有取向性的聚乳酸 / 乙醇酸 共聚物纳米纤维膜和所述无取向性的聚乳酸 / 乙醇酸共聚物纳米纤维膜都是用静电纺丝 技术制备的。 6. 根据权利要求 1 所述的人工硬脊膜的制备方法， 其特征在于 ： 包括以下步骤 ： （a） 分别制备有取向性的聚乳酸 / 乙醇酸共聚物纳米纤维膜和无取向性的聚乳酸 / 乙 醇酸共聚物纳米纤维膜 ； （b） 将所述步骤 （a） 中的无取向性的聚乳酸 / 乙醇酸。
5、共聚物纳米纤维膜加上壳聚糖涂 层， 得到无取向性的聚乳酸 / 乙醇酸共聚物 - 壳聚糖纳米纤维膜 ； （c） 用胶黏剂将步骤 （a） 得到的有取向性的聚乳酸 / 乙醇酸共聚物纳米纤维膜与步骤 （b） 得到的无取向性的聚乳酸 / 乙醇酸共聚物 - 壳聚糖纳米纤维膜粘合到一起。 7.根据权利要求6所述的人工硬脊膜的制备方法， 其特征在于 ： 所述步骤 （a） 中制备有 取向性的聚乳酸/乙醇酸共聚物纳米纤维膜和无取向性的聚乳酸/乙醇酸共聚物纳米纤维 膜都是采用静电纺丝技术， 所述静电纺丝技术采用聚乳酸乙醇酸共聚物溶液作为纺丝液制 备聚乳酸 / 乙醇酸共聚物纳米纤维膜。 8. 根据权利要求 7 所述的。
6、人工硬脊膜的制备方法， 其特征在于 ： 所述聚乳酸乙醇酸共 聚物是乳酸与乙醇酸的物质的量之比为 80:20 的共聚物。 9. 根据权利要求 7 所述的人工硬脊膜的制备方法， 其特征在于 ： 所述纺丝液的溶质质 量与溶液体积比为 1:5。 10. 一种根据权利要求 1 所述的人工硬脊膜的使用方法， 其特征在于 ： 包括以下步骤 ： （a） 在缺损口区先覆盖一层比缺损口大的所述的有取向性的聚乳酸 / 乙醇酸共聚物纳 米纤维膜 ； （b） 再剪一块比步骤 （a） 中大的所述的无取向性的聚乳酸 / 乙醇酸共聚物 - 壳聚糖纳 米纤维膜， 涂抹粘合剂， 然后覆盖在先前有取向性的聚乳酸 / 乙醇酸共聚物纳。
7、米纤维膜的 表面。 权 利 要 求 书 CN 103480042 A 2 1/8 页 3 一种人工硬脊膜及其制备方法和使用方法 技术领域 0001 本发明属于生物医学技术领域， 具体涉及一种人工硬脊膜及其制备方法和使用方 法。 背景技术 0002 硬脊膜损伤在脊柱外科及神经外科手术中较为常见。 创伤、 椎管内肿瘤切除、 硬脊 膜发育不良、 硬膜骨化、 累及椎管内的手术等均可造成硬脊膜的破裂或缺损， 导致脑脊液外 渗， 处理不当会引发脑脊液漏、 低颅内压综合征、 急性气道阻塞、 脑脊液囊肿、 粘连性蛛网膜 炎、 椎管感染及颅内感染等多种严重并发症， 甚至可危及生命。此外， 对于涉及椎板开窗或 切。
8、除减压等可造成术后硬脊膜裸露的手术， 术后硬膜外瘢痕形成将导致硬膜外粘连， 尤其 是合并硬脊膜破裂或缺损时， 将会进一步加重瘢痕形成及粘连程度， 极不利于二次翻修手 术， 且可形成新的压迫而诱发神经症状。目前临床上治疗的重点仍然是硬脊膜损伤或缺损 后如何能减少脑脊液漏的发生， 以及脑脊液漏发生后的治疗。 治疗的方法很多， 但治疗疗程 长， 患者痛苦大， 痊愈的标准也仅仅是脑脊漏停止， 组织愈合的形式也以疤痕组织为主， 而 非主动的修复。因此， 寻求理想的硬脊膜修复材料， 对硬脊膜缺损进行 “高质量” 修复， 实现 硬脊膜再生以及预防硬膜外瘢痕及粘连， 是目前亟待解决的问题。 0003 目前已有。
9、一些人工硬脊膜， 其中一种PLGA/I型胶原/壳聚糖人工硬脊膜的制备方 法是 ： 将分子量为50000的PLGA多聚物溶解于氯仿中， 加入粒径为80-100微米的氯化钠晶 体， 干燥后， 双蒸水浸泡脱去氯化钠晶体， 再真空干燥至恒重。 得到多孔PLGA膜， 再将I型胶 原和壳聚糖混合溶液复合到多孔的 PLGA 膜表面， 得到 PLGA/I 型胶原 / 壳聚糖人工硬脊膜。 在进行修复缺损的硬脊膜时， 采用-氰基丙烯酸酯作为胶黏剂。 由于其为PLGA盐析膜， 生 物支架孔径大、 有致密层、 不透气， 不利于营养物质和代谢产物的交换， 且 PLGA 盐析膜无取 向性， 不利于新生胶原的排列， 修复并。
10、改建后的缺损处硬脊膜三维结构与天然硬脊膜不同， 会导致瘢痕及粘连。 采用胶原， 具有抗原活性及潜在致病原传染等风险， 手术中采用的胶黏 剂 - 氰基丙烯酸酯粘度低耐水性差， 且有一定的毒性。并且 PLGA/I 型胶原 / 壳聚糖人工 硬脊膜为单层设计， 在植入体内修复硬脊膜缺损时， 胶黏剂在涂抹以及粘贴过程中， 胶黏剂 与脑脊液有直接接触以及人为封闭膜体的风险。因此， 这种方法制备得到的人工硬脊膜仅 可实现修复硬脊膜缺损， 而不能实现硬脊膜的再生， 且容易产生硬膜粘连及瘢痕。 发明内容 0004 本发明的目的在于提供一种人工硬脊膜， 用于解决硬脊膜的再生以及硬膜外瘢痕 及粘连的问题。 0005。
11、 所述人工硬脊膜具有双层结构， 包括内层和外层， 所述内层是有取向性的聚乳酸 / 乙醇酸共聚物纳米纤维膜， 所述外层是无取向性的聚乳酸 / 乙醇酸共聚物 - 壳聚糖纳米纤 维膜， 所述内层和所述外层连接。 天然硬脊膜具有特定的空间结构， 是由有序排列的胶原纤 维束组成， 本发明提供的人工硬脊膜的所述内层采用有取向性的聚乳酸 / 乙醇酸共聚物纳 说 明 书 CN 103480042 A 3 2/8 页 4 米纤维膜， 与天然硬脊膜空间结构具有相似性， 用作组织工程支架促使种子细胞 （成纤维细 胞） 接种后所合成的胶原束也呈取向性分布， 使新生组织接近天然硬脊膜 ； 所述外层起强化 力学性能作用，。
12、 并预防硬脊膜外粘连及瘢痕形成。并且聚乳酸 / 乙醇酸共聚物是一种可降 解的生物高分子材料， 具有易于加工成形、 生物相容性好以及力学性能佳等优点。 0006 进一步地， 所述内层和所述外层采用胶黏剂粘合， 所述胶黏剂采用生物胶黏剂。 有 些部位的硬脊膜缺损， 直接缝合修复很困难， 采用胶黏剂粘合能够解决此问题。 生物胶黏剂 具有生物相容性好的特点， 使人工硬脊膜在植入体内时排异作用较小。 0007 进一步地， 所述生物胶黏剂采用贻贝粘蛋白， 贻贝粘蛋白的粘合力及防水性能极 强且无毒性， 能将外层和内层牢固粘合成一体。 0008 进一步地， 所述无取向性的聚乳酸 / 乙醇酸共聚物 - 壳聚糖纳。
13、米纤维膜是在无取 向性的聚乳酸 / 乙醇酸共聚物纳米纤维膜表面涂上壳聚糖涂层。壳聚糖作为一种可吸收的 生物材料， 具有良好的生物相容性和可降解性， 无刺激性、 无免疫原性、 无热原反应， 具有抑 制成纤维细胞聚集的作用。利用壳聚糖作为功能性涂层， 可预防或减轻术后的硬脊膜外粘 连及瘢痕形成。 0009 进一步地， 所述有取向性的聚乳酸 / 乙醇酸共聚物纳米纤维膜和所述无取向性的 聚乳酸 / 乙醇酸共聚物纳米纤维膜都是用静电纺丝技术制备的。静电纺丝技术是一种新型 的组织工程多孔支架制备方法， 可以制成直径在微米、 甚至纳米尺度的超细纤维， 用此方法 制备得到的有取向性的以及无取向性的聚乳酸 / 。
14、乙醇酸共聚物纳米纤维膜都是是由纳米 级别的纤维丝组成， 具有多孔的结构， 极高的表面积， 有利于细胞的粘附和生长。 0010 本发明还提供了一种上述人工硬脊膜的制备方法， 包括以下步骤 ： 0011 （a） 分别制备有取向性的聚乳酸 / 乙醇酸共聚物纳米纤维膜和无取向性的聚乳酸 / 乙醇酸共聚物纳米纤维膜 ； 0012 （b） 将所述步骤 （a） 中的无取向性的聚乳酸 / 乙醇酸共聚物纳米纤维膜加上壳聚 糖涂层， 得到无取向性的聚乳酸 / 乙醇酸共聚物 - 壳聚糖纳米纤维膜 ； 0013 （c） 用胶黏剂将步骤 （a） 得到的有取向性的聚乳酸 / 乙醇酸共聚物纳米纤维膜与 步骤 （b） 得到的。
15、无取向性的聚乳酸 / 乙醇酸共聚物 - 壳聚糖纳米纤维膜粘合到一起。 0014 进一步地， 所述步骤 （a） 中制备有取向性的聚乳酸 / 乙醇酸共聚物纳米纤维膜和 无取向性的聚乳酸 / 乙醇酸共聚物纳米纤维膜都是采用静电纺丝技术， 所述静电纺丝技术 采用聚乳酸乙醇酸共聚物溶液作为纺丝液制备聚乳酸 / 乙醇酸共聚物纳米纤维膜。静电纺 丝技术具有如下优点 ： 对设备和环境要求不高， 易于实现 ； 溶剂在纺丝过程中挥发较彻底 ； 可在常温下进行， 可避免高温引起的支架变形、 聚合物降解等情况， 且有利于一些生物活性 因子的复合 ； 制备过程中不需使用致孔剂， 不会出现致孔剂去除不全的问题， 且空隙间。
16、贯通 性好。 静电纺丝技术是一种新型的组织工程多孔支架制备方法， 可以制成直径在微米、 甚至 纳米尺度的超细纤维， 用此方法制备得到的有取向性的和无取向性的聚乳酸 / 乙醇酸共聚 物纳米纤维膜都是由纳米级别的纤维丝组成， 具有多孔的结构， 极高的表面积， 有利于细胞 的粘附和生长。 0015 进一步地， 所述聚乳酸乙醇酸共聚物是乳酸与乙醇酸的物质的量之比为 80:20 的 共聚物， 此种比例的聚乳酸乙醇酸共聚物降解速度较合适， 用此比例聚乳酸乙醇酸共聚物 制备得到人工硬脊膜更适于在体内应用。 说 明 书 CN 103480042 A 4 3/8 页 5 0016 进一步地， 所述纺丝液的溶质质。
17、量与溶液体积比为 1:5， 纺丝液的浓度较合适， 制 备出来的聚乳酸 / 乙醇酸共聚物纳米纤维膜力学性能较好， 且组成所述聚乳酸 / 乙醇酸共 聚物纳米纤维膜的纤维丝直径与天然硬脊膜胶原直径相当， 更适于使用。 0017 本发明还提供了上述的人工硬脊膜的使用方法， 用于解决人工硬脊膜在使用时胶 黏剂在涂抹以及粘贴过程中， 胶黏剂与脑脊液可能会直接接触以及人为封闭膜体， 以及需 要严格控制人工硬脊膜的修剪形状， 操作困难的问题， 包括以下步骤 ： 0018 （a） 在缺损口区先覆盖一层比缺损口大的所述的有取向性的聚乳酸 / 乙醇酸共聚 物纳米纤维膜 ； 0019 （b） 再剪一块比步骤 （a） 。
18、中大的所述的无取向性的聚乳酸 / 乙醇酸共聚物 - 壳聚 糖纳米纤维膜， 涂抹粘合剂， 然后覆盖在先前有取向性的聚乳酸 / 乙醇酸共聚物纳米纤维 膜的表面。 0020 相对于将人工硬脊膜修剪后， 周边涂抹胶黏剂， 直接与缺损口周缘硬膜粘成一体， 实现有效封闭硬脊膜囊的方法， 本发明提供的方法可操作性更强， 不需要严格控制人工硬 脊膜的修剪形状， 更易操作， 并且胶黏剂不会与脑脊液直接接触且不会人为封闭膜体。 0021 本发明提供了一种人工硬脊膜， 具有双层结构， 包括内层和外层， 所述内层是有取 向性的聚乳酸 / 乙醇酸共聚物纳米纤维膜， 所述外层是无取向性的聚乳酸 / 乙醇酸共聚 物 - 壳。
19、聚糖纳米纤维膜， 所述内层和所述外层采用胶黏剂粘合。采用本发明提供的人工硬 脊膜， 其有益效果是 ： 能够实现硬脊膜再生以及达到预防硬膜外瘢痕及粘连的目的。 0022 本发明还提供了一种上述人工硬脊膜的制备方法， 制备得到的人工硬脊膜较好， 适于使用。 0023 本发明还提供了一种上述人工硬脊膜的使用方法， 本发明提供的方法可操作性更 强， 不需要严格控制人工硬脊膜的修剪形状， 更易操作， 并且胶黏剂不会与脑脊液直接接触 且不会人为封闭膜体。 附图说明 0024 图 1 是本发明实施例提供的静电纺丝装置示意图 ； 0025 图 2 是本发明实施例提供的人工硬脊膜的结构示意图 ； 0026 图 。
20、3 是本发明实施例 1 提供的有取向性的聚乳酸 / 乙醇酸共聚物纳米纤维膜的扫 描电镜放大 1200 倍的图片 ； 0027 图 4 是本发明实施例 1 提供的有取向性的聚乳酸 / 乙醇酸共聚物纳米纤维膜的扫 描电镜放大 4000 倍的图片 ； 0028 图 5 是本发明实施例 1 提供的无取向性的聚乳酸 / 乙醇酸共聚物纳米纤维膜的扫 描电镜放大 1200 倍的图片 ； 0029 图 6 是本发明实施例 1 提供的无取向性的聚乳酸 / 乙醇酸共聚物纳米纤维膜的扫 描电镜放大 4000 倍的图片 ； 0030 图 7 是本发明实施例 6 山羊硬脊膜术后三个月硬脊膜修复区采用苏木精 - 伊红染 。
21、色的光镜放大 20 倍的图片 ； 0031 图 8 是本发明实施例 6 山羊硬脊膜术后三个月硬脊膜修复区采用苏木精 - 伊红染 色的光镜放大 40 倍的图片 ； 说 明 书 CN 103480042 A 5 4/8 页 6 0032 图 9 是本发明实施例 6 山羊硬脊膜术后三个月新生硬脊膜脑脊液侧扫描电镜图 ； 0033 图 10 是本发明实施例 6 山羊硬脊膜术后三个月新生硬脊膜背离脑脊液侧扫描电 镜图 ； 0034 图 11 是本发明实施例 6 山羊硬脊膜术后三个月硬脊膜修复区的透射电镜图 ； 0035 图 12 是本发明实施例 6 山羊硬脊膜术后六个月硬脊膜修复区采用苏木精 - 伊红 。
22、染色的光镜放大 20 倍的图片 ； 0036 图 13 是本发明实施例 6 山羊硬脊膜术后六个月硬脊膜修复区采用苏木精 - 伊红 染色的光镜放大 40 倍的图片 ； 0037 图 14 是本发明实施例 6 山羊硬脊膜术后六个月新生硬脊膜脑脊液侧扫描电镜 图 ； 0038 图 15 是本发明实施例 6 山羊硬脊膜术后六个月新生硬脊膜背离脑脊液侧扫描电 镜图 ； 0039 图 16 是本发明实施例 6 山羊硬脊膜术后六个月新生硬脊膜硬膜外腔外层内膜扫 描电镜图 ； 0040 图 17 是本发明实施例 6 山羊硬脊膜术后六个月新生硬脊膜的横截面的透射电镜 图 ； 0041 图 18 是本发明实施例 。
23、6 山羊硬脊膜术后六个月新生硬脊膜的纵截面的透射电镜 图。 具体实施方式 0042 下面通过具体的实施例并结合附图对本发明做进一步的详细描述。 0043 实施例 1 ： 0044 参阅图 1， 有取向性的聚乳酸 / 乙醇酸共聚物纳米纤维膜的制备 ： 0045 根据配方称取聚乳酸 / 乙醇酸共聚物 （乳酸与乙醇酸的物质的量之比为 80:20 的 共聚物， 分子量 100000， 购买于山东济南岱罡生物材料有限公司） ， 配制体积比为 1:1 的 THF 和 DMF 混合溶液， 用上述 5mL 混合溶液溶解聚乳酸 / 乙醇酸共聚物配成溶质质量与溶液体 积比为 1:5 的聚乳酸 / 乙醇酸共聚物溶液。
24、， 搅拌一昼夜后作为纺丝液。将制备得到的纺丝 液装入注射器 6 中， 高压电源 1 的正极 3 和纺丝溶液相连， 高压电源 1 的负极 2 和接收板 4 相连， 纺丝电压稳定在 13-15kV。接收板 4 和针头 7 之间的距离固定在 12cm， 接收板 4 用锡 箔包被。溶液推进速度为 0.6mL/h， 用动力装置 5 控制接收板 4 的水平移动和旋转， 接收板 4 的水平移动速度为 0.00147mm/s。纺丝时接收板 4 旋转速度设置为 2500r/s， 使收集的纤 维取向性一致， 可制成有取向性的聚乳酸 / 乙醇酸共聚物纳米纤维膜。有取向性的聚乳酸 / 乙醇酸共聚物纳米纤维膜与天然硬脊。
25、膜的空间结构相似。 0046 无取向性的聚乳酸 / 乙醇酸共聚物纳米纤维膜的制备 ： 0047 根据配方称取聚乳酸 / 乙醇酸共聚物 （乳酸与乙醇酸的物质的量之比为 80:20 的 共聚物， 分子量 100000， 购买于山东济南岱罡生物材料有限公司） ， 配制体积比为 1:1 的 THF 和 DMF 混合溶液， 用上述 5mL 混合溶液溶解聚乳酸 / 乙醇酸共聚物配成溶质质量与溶液体 积比为 1:5 的聚乳酸 / 乙醇酸共聚物溶液， 搅拌一昼夜后作为纺丝液。将制备得到的纺丝 液装入注射器 6 中， 高压电源 1 的正极 3 和纺丝溶液相连， 高压电源 1 的负极 2 和接收板 4 说 明 书。
26、 CN 103480042 A 6 5/8 页 7 相连， 纺丝电压稳定在 13-15kV。接收板 4 和针头 7 之间的距离固定在 12cm， 接收板 4 用锡 箔包被。溶液推进速度为 0.6mL/h， 用动力装置 5 控制接收板 4 的水平移动， 接收板 4 的水 平移动速度为 0.00147mm/s。纺丝时固定接收板 4， 即静置下制备静电纺丝膜片， 使收集的 纤维任意杂向， 可制成无取向性的聚乳酸 / 乙醇酸共聚物纳米纤维膜。 0048 无取向性的聚乳酸 / 乙醇酸共聚物 - 壳聚糖纳米纤维膜的制备 ： 0049 配制 20g/L 的壳聚糖溶液， 高温灭菌。取无取向性的聚乳酸 / 乙醇。
27、酸共聚物纳米 纤维膜， 放置于培养皿底部， 紫外线消毒 30 分钟， 75% 的酒精中浸泡消毒 20min。用负压吸 引器将材料中的培养液吸干后将壳聚糖溶液均匀滴于无取向性的聚乳酸 / 乙醇酸共聚物 纳米纤维膜上， 置于真空干燥箱晾干后用 4的磷酸盐缓冲液和去离子水反复冲洗， 晾干后 待用。膜片用 Co60 照射灭菌， 剂量为 20kGy。壳聚糖作为一种可吸收的生物材料， 具有良好 的生物相容性和可降解性， 无刺激性、 无免疫原性、 无热原反应， 已广泛用于人体内植入， 具 有抑制成纤维细胞聚集的作用。利用壳聚糖作为功能性涂层， 可预防或减轻术后的硬脊膜 外粘连及瘢痕形成。 0050 实施例 。
28、2 ： 制备有取向性以及无取向性的聚乳酸 / 乙醇酸共聚物纳米纤维膜， 采用 乳酸与乳酸与乙醇酸的物质的量之比为 70:30、 分子量为 80000 的共聚物， 其余操作同实施 例 1。 0051 实施例 3 ： 制备有取向性以及无取向性的聚乳酸 / 乙醇酸共聚物纳米纤维膜， 采用 乳酸与乳酸与乙醇酸的物质的量之比为 85:15、 分子量为 120000 的共聚物， 其余操作同实 施例 1。 0052 实施例 4 ： 制备有取向性以及无取向性的聚乳酸 / 乙醇酸共聚物纳米纤维膜， 根据 配方称取聚乳酸/乙醇酸共聚物 （乳酸与乙醇酸的物质的量之比为80:20的共聚物， 分子量 100000， 购。
29、买于山东济南岱罡生物材料有限公司） ， 配制体积比为 1:1 的 THF 和 DMF 混合溶 液， 用上述 5mL 混合溶液溶解聚乳酸 / 乙醇酸共聚物配成溶质质量与溶液体积比为 3:20 的 聚乳酸 / 乙醇酸共聚物溶液， 搅拌一昼夜后作为纺丝液， 其余同实施例 1。 0053 实施例 5 ： 制备有取向性以及无取向性的聚乳酸 / 乙醇酸共聚物纳米纤维膜， 根据 配方称取聚乳酸/乙醇酸共聚物 （乳酸与乙醇酸的物质的量之比为80:20的共聚物， 分子量 100000， 购买于山东济南岱罡生物材料有限公司） ， 配制体积比为 1:1 的 THF 和 DMF 混合溶 液， 用上述 5mL 混合溶液。
30、溶解聚乳酸 / 乙醇酸共聚物配成溶质质量与溶液体积比为 5:20 的 聚乳酸 / 乙醇酸共聚物溶液， 搅拌一昼夜后作为纺丝液。其余同实施例 1。 0054 如图 3、 4、 5、 6 所示， 用扫描电镜观察实施例 1 提供的有取向性的及无取向性的聚 乳酸 / 乙醇酸共聚物纳米纤维膜。有取向性的聚乳酸 / 乙醇酸共聚物纳米纤维膜是由有取 向性的聚乳酸 / 乙醇酸共聚物纳米纤维丝组成， 纤维丝直径介于 500nm-1200nm 之间， 平均 直径为835102nm。 无取向性的聚乳酸/乙醇酸共聚物纳米纤维膜是由无取向性的聚乳酸 / 乙醇酸共聚物纳米纤维丝组成， 纤维丝取向具有随机性， 纤维丝直径介。
31、于 300nm-800nm 之 间， 平均直径为51285nm。 天然硬脊膜胶原的纤维直径在400nm-1000nm之间， 与本发明实 施例1提供的有取向性的及无取向性的聚乳酸/乙醇酸共聚物纳米纤维膜所含纤维丝的直 径相接近。 0055 通常情况下， 吸水性越高， 亲水性越好， 生物相容性也越好。实施例 1 提供的有序 及无取向性的聚乳酸/乙醇酸共聚物纳米纤维膜吸水率分别为48.54.3%和46.53.1%， 说 明 书 CN 103480042 A 7 6/8 页 8 PLGA/I型胶原/壳聚糖人工硬脊膜的吸水率要小于30.705.51%， 而且壳聚糖的吸水率为 77.8%， 因此本发明实施。
32、例 1 提供的人工硬脊膜的吸水率要大于原有的 PLGA/I 型胶原 / 壳 聚糖人工硬脊膜的吸水率， 从而生物相容性也要比原有的PLGA/I型胶原/壳聚糖人工硬脊 膜要好。 0056 用腰椎穿刺测定人卧位时脑脊液压范围是 ： 7.84-11.8kPa， 站立位时脑脊液压用 正常的脑脊液压头颅及椎管高度的静水压来代替， 头颅及椎管的高度用正常人的坐高即 身高的一半来代替， 算出一米八高的成年男子站立位时的最大脑脊液压力为 11.8 88.2 100kPa。 实施例1提供的有取向性的及无取向性的聚乳酸/乙醇酸共聚物纳米纤维膜抗 拉强度测试结果如下表 ： 0057 0058 0059 由表格可以看出。
33、， 有取向性的及无取向性的聚乳酸 / 乙醇酸共聚物纳米纤维膜最 小的抗拉强度 1.38MPa 也远大于脑积液的最大压力 100kPa， 满足使用要求。 0060 参阅图 2， 本发明实施例提供的人工硬脊膜的使用方法为 ： 首先， 待术区脑脊液流 出量明显减少后， 在缺损口区先覆盖一层比缺损口面积稍大的有取向性的聚乳酸 / 乙醇酸 共聚物纳米纤维膜 8， 利用表面张力的作用贴敷于缺口周缘， 初步实现硬脊膜囊的封闭 ； 然 后， 吸净硬膜外残留脑脊液及血液， 再剪一块比先前有取向性的聚乳酸 / 乙醇酸共聚物纳 米纤维膜 8 稍大一点的无取向性的聚乳酸 / 乙醇酸共聚物 - 壳聚糖纳米纤维膜 10，。
34、 涂抹贻 贝粘蛋白 9， 将之覆盖在先前有取向性的聚乳酸 / 乙醇酸共聚物纳米纤维膜 8 的表面， 进而 实现与硬膜牢固粘合， 达到硬脊膜囊的有效封闭。 0061 实施例 6 ： 0062 因为山羊有六节腰椎， 其中五节腰椎的形态相近， 与人椎骨、 脊髓以及硬膜外腔解 剖结构相似， 所以以山羊为代表， 应用本发明实施例 1 提供的人工硬脊膜去修复山羊腰段 硬脊膜缺损。 说 明 书 CN 103480042 A 8 7/8 页 9 0063 操作步骤 ： 0064 分离山羊的皮肤成纤维细胞， 培养扩增， 收获培养得到的第五代羊成纤维细胞， 调 整细胞密度为 5107 个 / 毫升， 取有取向性的。
35、聚乳酸 / 乙醇酸共聚物纳米纤维膜接种 60 微升上述细胞悬液， 培养箱内孵育 4 小时后， 放入用 10 毫升 DMEM/F12 与 1 毫升的 FBS 配成 的培养液中培养， 隔天换培养液， 接种一周后， 得到接种了羊纤维细胞的有取向性的聚乳酸 /乙醇酸共聚物纳米纤维膜。 取12只健康山羊， 待术区脑脊液流出量明显减少后， 在缺损口 区先覆盖一层比缺损口面积稍大的接种了羊成纤维细胞的有取向性的聚乳酸 / 乙醇酸共 聚物纳米纤维膜， 利用表面张力的作用贴敷于缺口周缘， 初步实现硬脊膜囊的封闭 ； 然后， 吸净硬膜外残留脑脊液及血液， 再剪一块比先前接种了羊成纤维细胞有取向性的聚乳酸 / 乙醇。
36、酸共聚物纳米纤维膜稍大一点的无取向性的聚乳酸/乙醇酸共聚物-壳聚糖纳米纤维 膜， 涂抹贻贝粘蛋白， 将之覆盖在先前有取向性的聚乳酸 / 乙醇酸共聚物纳米纤维膜的表 面， 轻轻按压约 30 秒， 实现与硬脊膜的牢固粘合， 封闭硬脊膜囊。 0065 手术后， 所有山羊均未出现体温升高及饮食改变， 切口均愈合良好， 无切口感染以 及深部感染发生， 均无脑脊液漏现象。 0066 参阅图 7、 8、 9、 10、 11， 三个月后， 随机处死六只山羊， 解剖观察硬脊膜的修复情况， 六只山羊硬脊膜外缺损修复区人工硬脊膜大部分降解， 未有粘连， 修复区胶原纤维呈现有 序排列。 图7是山羊硬脊膜术后三个月硬脊。
37、膜修复区采用苏木精-伊红染色的光镜放大20 倍的图片， 图 8 是山羊硬脊膜术后三个月硬脊膜修复区采用苏木精 - 伊红染色的光镜放大 40 倍的图片， 颜色较深的区域为缺损修复区， 颜色较浅的区域为正常硬脊膜组织， 修复区胶 原纤维排列已逐渐呈有取向性， 与正常硬脊膜之间仍然存在分界线。图 9 是山羊硬脊膜术 后三个月新生硬脊膜脑脊液侧扫描电镜图， 可见人工硬脊膜部分降解， 大部分被胶原纤维 取代， 且胶原纤维呈有取向性的排列 ； 图 10 是山羊硬脊膜术后三个月新生硬脊膜背离脑脊 液侧扫描电镜图， 可见外表面较平整， 新生的胶原纤维呈波浪状， 说明新生硬脊膜具有一定 的弹性， 呈现出与天然硬。
38、脊膜相似的特征。图 11 是山羊硬脊膜术后三个月硬脊膜修复区的 透射电镜图， 可见人工硬脊膜处于降解过程中， 残存的纳米纤维为细条状稀疏有取向性排 列， 残存的纳米纤维之间有大量有取向性的胶原纤维生成。 0067 参阅图 12、 13、 14、 15、 16、 17、 18， 六个月后， 处死剩余六只山羊， 解剖观察硬脊膜的 修复情况， 硬脊膜与脊髓无粘连， 新生的硬脊膜表面光滑， 与周围正常硬脊膜融合较好， 无 脑脊液漏。 图12是山羊硬脊膜术后六个月硬脊膜修复区采用苏木精-伊红染色的光镜放大 20倍的图片， 图13是山羊硬脊膜术后六个月硬脊膜修复区采用苏木精-伊红染色的光镜放 大 40 倍。
39、的图片， 颜色较深的区域为缺损修复区， 颜色较浅的区域为正常硬脊膜组织， 新生 硬脊膜胶原纤维已呈现有取向性的排列， 与正常硬脊膜胶原纤维排列相似， 新生硬脊膜内 成纤维细胞密度与正常硬脊膜内成纤维细胞分布密度相似。图 14 是山羊硬脊膜术后六个 月新生硬脊膜脑脊液侧扫描电镜图， 可见人工硬脊膜大部分降解， 基本被胶原纤维取代， 且 胶原纤维呈有取向性的排列， 呈现连绵不断的山丘状隆起 ； 图 15 是山羊硬脊膜术后六个月 新生硬脊膜背离脑脊液侧扫描电镜图， 可见外表面平整， 新生的胶原纤维呈现连绵不断的 山丘状隆起 ； 图 16 是山羊硬脊膜术后六个月新生硬脊膜硬膜外腔外层内膜扫描电镜图， 。
40、可 见外层内膜较光滑平整。图 17 是山羊硬脊膜术后六个月新生硬脊膜的横截面的透射电镜 图， 图 18 是山羊硬脊膜术后六个月新生硬脊膜的纵截面的透射电镜图， 可见胶原纤维呈有 说 明 书 CN 103480042 A 9 8/8 页 10 取向性的排列。 0068 以上所述仅为本发明的优选实施例而已， 并不用于限制本发明， 对于本领域的技 术人员来说， 本发明可以有各种更改和变化。 凡在本发明的精神和原则之内， 所作的任何修 改、 等同替换、 改进等， 均应包含在本发明的保护范围之内。 说 明 书 CN 103480042 A 10 1/13 页 11 图 1 图 2 说 明 书 附 图 C。
41、N 103480042 A 11 2/13 页 12 图 3 说 明 书 附 图 CN 103480042 A 12 3/13 页 13 图 4 说 明 书 附 图 CN 103480042 A 13 4/13 页 14 图 5 说 明 书 附 图 CN 103480042 A 14 5/13 页 15 图 6 图 7 说 明 书 附 图 CN 103480042 A 15 6/13 页 16 图 8 图 9 说 明 书 附 图 CN 103480042 A 16 7/13 页 17 图 10 说 明 书 附 图 CN 103480042 A 17 8/13 页 18 图 11 图 12 说 明 书 附 图 CN 103480042 A 18 9/13 页 19 图 13 图 14 说 明 书 附 图 CN 103480042 A 19 10/13 页 20 图 15 说 明 书 附 图 CN 103480042 A 20 11/13 页 21 图 16 说 明 书 附 图 CN 103480042 A 21 12/13 页 22 图 17 说 明 书 附 图 CN 103480042 A 22 13/13 页 23 图 18 说 明 书 附 图 CN 103480042 A 23 。