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1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201810401407.3 (22)申请日 2018.04.28 (71)申请人 温州医科大学 地址 325000 浙江省温州市瓯海区东方南 路38号温州市国家大学科技园孵化器 (72)发明人 姚清清 郑晓 刘瑜 程如梅 林蜜蜜 (74)专利代理机构 温州名创知识产权代理有限 公司 33258 代理人 陈加利 (51)Int.Cl. A61L 27/08(2006.01) A61L 27/12(2006.01) A61L 27/56(2006.01) A61L 27/58(20。
2、06.01) (54)发明名称 一种基于石墨烯和58S生物活性玻璃的三维 互穿网络支架及其应用 (57)摘要 本发明公开了一种基于石墨烯和58S生物活 性玻璃的三维互穿网络支架及其应用， 其技术方 案采用泡沫镍为生长基体， 利用化学气相沉积 (CVD)方法， 同时结合生物活性玻璃， 制备出具有 三维互穿网络结构的石墨烯/生物活性玻璃复合 材料。 GF/58S BG互穿网络的构成， 有利于更好的 结合石墨烯优异的导电性和机械性能， 以及生物 活性玻璃良好的生物相容性， 为骨髓间充质干细 胞(rMSCs)的粘附和刺激生长提供良好的三维微 环境。 权利要求书1页 说明书6页 附图8页 CN 1086。
3、53802 A 2018.10.16 CN 108653802 A 1.一种基于石墨烯和58S生物活性玻璃的三维网络复合材料的制备方法， 其特征在于 包括以下步骤： (1)石墨烯基体制备： 以泡沫镍为原料， 以碳氢气体为碳源、 在还原保护气氛下， 通过 CVD法， 在泡沫镍上沉积复合石墨烯， 获得泡沫镍石墨烯复合材料； 将得到的泡沫镍石墨烯 复合材料滴加4的聚甲基丙烯酸甲酯溶液， 180干燥30分钟， 然后用强酸去除泡沫镍， 获 得石墨烯-聚甲基丙烯酸甲酯复合材料， 将该石墨烯-聚甲基丙烯酸甲酯复合支架材料浸泡 在50丙酮溶液中， 去除聚甲基丙烯酸甲酯， 得到具有三维多孔结构的石墨烯基体； (。
4、2)58S生物活性玻璃前驱体溶胶的制备： 以正硅酸乙酯作为Si源， 磷酸三乙酯作为P 源， 四水硝酸钙作为Ca源， 正硅酸乙酯和磷酸三乙酯在硝酸催化作用下， 在水/乙醇溶液中 进行水解， 形成58S BG前驱体溶胶； (3)将步骤(2)制备获得的58S生物活性玻璃前驱体溶胶滴加到所述的石墨烯基体上， 然后用旋涂机500rpm旋涂5min， 重复此过程1次， 然后将旋涂后的复合材料在水浴条件下陈 化， 然后冷冻干燥获得石墨烯和58S生物活性玻璃的三维网络复合材料半成品； (4)将所述的石墨烯和58S生物活性玻璃的三维网络复合材料半成品在管式炉中600 烧结2h， 最后得到石墨烯和58S生物活性玻。
5、璃的三维网络复合材料。 2.根据权利要求1所述的制备方法， 其特征在于： 所述的步骤(1)中以CH4为碳源气体， 以 N2/H2为还原保护气氛。 3.根据权利要求1所述的制备方法， 其特征在于： 所述的用于去除泡沫镍的强酸为80 的HNO3/H2O2/H2O混合溶液， 该HNO3/H2O2/H2O的体积比为1:1:5。 4.根据权利要求1所述的制备方法， 其特征在于： 所述步骤(2)中的正硅酸乙酯、 磷酸三 乙酯和四水硝酸钙的添加量以58S生物活性玻璃的组分配方： SiO2 59wt,P2O5 5wt,CaO 36wt进行计算添加。 5.一种基于石墨烯和58S生物活性玻璃的三维网络复合材料， 。
6、其特征在于： 包括有石墨 烯和58S生物活性玻璃， 所述的石墨烯具有以三维多孔结构， 58S生物活性玻璃以58S生物活 性玻璃前驱体溶胶形式旋涂于石墨烯的结构表面并烧结复合而成， 形成具有三维网络复合 结构的复合材料。 6.根据权利要求5所述的一种基于石墨烯和58S生物活性玻璃的三维网络复合材料， 其 特征在于： 该三维网络复合材料以权利要求1所述方法制备而成。 7.一种基于权利要求5所述的三维网络复合材料在生物组织工程支架的应用。 权 利 要 求 书 1/1 页 2 CN 108653802 A 2 一种基于石墨烯和58S生物活性玻璃的三维互穿网络支架及 其应用 技术领域 0001 本发明属。
7、于生物组织工程支架材料领域， 具体是指一种基于石墨烯和58S 生物活 性玻璃的三维互穿网络支架及其应用。 背景技术 0002 据统计， 在中国每年大约有一千三百万人次发生骨折， 其中有10-15无法愈合， 另外， 每年因为做关节置换手术、 外伤、 骨骼发育异常或是其它原因造成的骨科手术高达一 百万例， 而在这一百万例手术中， 约有四十五万例手术是需要接受骨移植的， 并且随着人口 的增加以及人的寿命的延长， 这一数字还在不断上升中。 目前由创伤、 肿瘤切除、 感染和先 天畸形引起的大块骨缺损的修复是临床面临的一大挑战。 当前对于大块骨缺损主要靠移植 替代治疗， 包括自体骨移植、 同种异体骨移植。。
8、 其中自体骨移植是骨移植的金标准， 但这一 技术受到供体来源有限， 还会在取出骨头的位置引起不适， 痛苦和长期的损害等因素的限 制。 因此， 寻找一种理想的骨组织工程支架材料是本领域科研攻关的重大难题。 0003 理想的骨组织工程支架材料， 不仅可以为成骨细胞生长提供三维空间， 而且具有 骨引导活性及骨诱导活性， 引导成骨细胞粘附、 增殖， 诱导干细胞成骨分化。 纳米材料的众 多独特的优良的性质使得其在众多领域都有广泛的应用前景， 而具有导电性能的纳米材料 更因其特殊的导电性能， 受到了前所未有的重视。 0004 石墨烯具有优异的理化性质， 如独特优良的电学、 光学和力学性质， 已成为备受瞩 。
9、目的申请热点。 同时， 改性后的石墨烯衍生物展现出良好的生物相容性， 近年来在生物医学 领域的应用备受关注， 已被成功用于干细胞工程、 细胞成像、 药物输运及组织工程方面。 目 前国内外有申请发现石墨烯及其复合材料， 有望应用于组织工程中， 但对于石墨烯在电刺 激神经修复中的应用， 科学家们还在探寻合适的石墨烯改性材料， 使其具有合适的导电性、 机械性能和生物相容性， 以应用于神经电刺激修复。 石墨烯的制备方法主要包括机械剥离 法、 化学氧化还原法和化学气相沉积(CVD)法。 机械剥离法是采用机械力从石墨表面直接剥 离得到石墨烯。 这种方法产率低， 成本高,并且较难得到单层的纳米片。 化学氧化。
10、还原法是 通过强氧化剂氧化石墨， 并超声分离得到氧化石墨烯， 然后采用还原剂还原得到石墨烯。 该 方法制备得到的石墨烯缺陷较多， 表面仍含有少量含氧基团， 影响其导电性和热稳定性。 CVD法被认为是最适合大规模制备石墨烯的方法， 自2009年被发现以后， CVD法已经成为大 规模制备石墨烯的主要方法之一。 目前CVD方法多以铜箔、 镍膜等平面型金属作为生长基 体， 只能得到二维平面的石墨烯薄膜， 适用于电子器件和透明导电薄膜的应用， 但难以满足 生物材料、 储能材料应用的要求。 0005 生物活性玻璃是一类能对机体组织进行修复、 替代与再生， 具有能使组织和材料 之间形成键合作用的材料， 同时。
11、具有骨传导性与骨诱导性。 然后现有现有技术中， 生物活性 玻璃自身较差的耐磨性和相对较低断裂韧性阻碍了其作为生物组织支架的应用。 0006 因此有必要对此进行改进。 说 明 书 1/6 页 3 CN 108653802 A 3 发明内容 0007 本发明实施例所要解决的技术问题在于， 提供一种基于石墨烯和58S生物活性玻 璃的三维互穿网络支架及其应用。 0008 作为本发明的第一个方面， 本申请的技术方案提供了一种基于石墨烯和58S 生物 活性玻璃的三维网络复合材料及其制备方法。 0009 作为本发明的第二个方面本申请的技术方案提供了一种基于上述三维网络复合 材料在用于生物组织工程支架的应用。。
12、 0010 为实现本发明的第一个方面， 其技术方案是包括以下步骤： 0011 (1)石墨烯基体制备： 以泡沫镍为原料， 以碳氢气体为碳源、 在还原保护气氛下， 通 过CVD法， 在泡沫镍上沉积石墨烯， 获得泡沫镍石墨烯复合材料； 将得到的泡沫镍石墨烯复 合材料滴加4的聚甲基丙烯酸甲酯溶液， 180干燥 30分钟， 然后用强酸去除泡沫镍， 获 得石墨烯-聚甲基丙烯酸甲酯复合材料， 将该石墨烯-聚甲基丙烯酸甲酯复合支架材料浸泡 在50丙酮溶液中， 去除聚甲基丙烯酸甲酯， 得到具有三维多孔结构的石墨烯基体； 0012 (2)58S生物活性玻璃前驱体溶胶的制备： 以正硅酸乙酯作为Si源， 磷酸三乙酯作。
13、 为P源， 四水硝酸钙作为Ca源， 正硅酸乙酯和磷酸三乙酯在硝酸催化作用下， 在水/乙醇溶液 中进行水解， 形成58S BG前驱体溶胶； 0013 (3)将步骤(2)制备获得的58S生物活性玻璃前驱体溶胶滴加到所述的石墨烯基体 上， 然后用旋涂机500rpm旋涂5min， 重复此过程1次， 然后将旋涂后的复合材料在水浴条件 下陈化， 然后冷冻干燥获得石墨烯和58S生物活性玻璃的三维网络复合材料半成品； 0014 (4)将所述的石墨烯和58S生物活性玻璃的三维网络复合材料半成品在管式炉中 600烧结2h， 最后得到石墨烯和58S生物活性玻璃的三维网络复合材料。 0015 进一步设置是所述的步骤(。
14、1)中以CH4为碳源气体， 以N2/H2为还原保护气氛。 0016 进一步设置是所述的用于去除泡沫镍的强酸为80HNO3/H2O2/H2O混合溶液。 0017 进一步设置是所述步骤(2)中的正硅酸乙酯、 磷酸三乙酯和四水硝酸钙的添加量 以58S生物活性玻璃的组分配方： SiO2 59wt,P2O5 5wt,CaO 36wt进行计算添加。 0018 本发明还提供一种基于石墨烯和58S生物活性玻璃的三维网络复合材料， 包括有 石墨烯和58S生物活性玻璃， 所述的石墨烯具有以三维多孔结构， 58S 生物活性玻璃以58S 生物活性玻璃前驱体溶胶形式旋涂于石墨烯的结构表面并烧结复合而成， 形成具有三维网。
15、 络复合结构的复合材料。 0019 进一步设置是该三维网络复合材料以上述方法制备而成。 0020 本发明还提供给了一种基于所述的三维网络复合材料在生物组织工程支架的应 用。 0021 本发明的创新机理和有益效果是： 0022 本申请中， 我们将采用泡沫镍为生长基体， 利用CVD方法， 同时结合生物活性玻璃， 制备出具有三维互穿网络结构的石墨烯/生物活性玻璃复合材料。 该材料具有极高的孔隙 率和比表面积、 极低的密度， 并因其以无缝连接的方式构成一个全连通的整体， 具有优异的 电荷传导性能， 同时还保持石墨烯原有的优异的热学、 力学、 电学等性能。 0023 本申请中， 我们将采用溶胶-凝胶法制。
16、备微纳米结构的生物活性玻璃， 即采用金属 说 明 书 2/6 页 4 CN 108653802 A 4 醇盐作为生物活性玻璃中氧化物的前驱体， 使用正硅酸乙酯(TEOS)作为SiO2的前驱体， 磷 酸三乙酯(TEP)作为P2O5的前驱体， 碱金属和碱土金属氧化物则采用各自的硝酸盐作为前驱 体。 相比传统熔融法制备的生物活性玻璃， 微纳米溶胶-凝胶生物活性玻璃由于其独特的微 纳米结构而使其具有不同于传统生物活性玻璃的独特性质： 更高的比表面积和孔隙率、 较 快的磷灰石形成能力、 较高的降解速度、 更加优良的细胞相容性等。 将微纳米生物活性玻璃 应用于复合支架材料， 不仅能提高复合支架材料的生物活。
17、性， 还可以显著增强其力学强度。 0024 本申请将构建新型的石墨烯(GF)/58S生物活性玻璃(BG)三维互穿网络支架， 用于 电刺激rMSCs分化。 GF/58S BG互穿网络的构成， 有利于更好的结合石墨烯优异的导电性和 机械性能， 以及生物活性玻璃良好的生物相容性， 为 rMSCs细胞的粘附和刺激生长提供良 好的三维微环境。 本申请将系统考察rMSCs 在GF/58S BG三维互穿网络支架的粘附增殖情 况， 并通过电刺激， 探讨三维支架对于rMSCs存活、 成骨相关基因的表达， 为临床治骨缺损提 供新的技术与方法， 以及人体其它组织的电刺激再生， 为传统医学的突破提供新的思路。 附图说。
18、明 0025 为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案， 下面将对实施例或现 有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍， 显而易见地， 下面描述中的附图仅仅是本 发明的一些实施例， 对于本领域普通技术人员来讲， 在不付出创造性劳动性的前提下， 根据 这些附图获得其他的附图仍属于本发明的范畴。 0026 图1.三维GF支架SEM； 0027 图2.三维GF支架CCK8图； 0028 图3.技术路线流程图； 0029 图4.GF/58S BG支架电刺激实验原理图； 0030 图5.GF支架XPS图； 0031 图6.GF和GF/58S BG支架SEM图； 0032 图7.GF和GF/58。
19、S BG支架Raman图； 0033 图8.Pt电极， GF和GF/58S BG支架的C-V曲线； 0034 图9.(图9a,图9b)GF支架和(图9c,图9d)GF/58S BG支架浸泡在SBF 中7天后的SEM 图； 0035 图10.GF/58S BG支架浸泡在SBF溶液中7天前后XRD图； 0036 图11.GF/58S BG支架浸泡在SBF溶液中7天前后ATR图； 0037 图12.rMSCs细胞种在GF,GF/58S BG支架上培养1天,2天和4天后的 CCK8图和 rMSCs细胞种在GF,GF/58S BG支架上培养4天后的活死细胞图； 0038 图13.rMSCs细胞种在GF,。
20、GF/58S BG支架上培养4天后的SEM图和rMSCs 细胞种在 GF,GF/58S BG支架上培养4天后的共聚焦图； 0039 图14.rMSCs细胞种在GF,GF/58S BG支架上培养7天后的ALP活性图； 0040 图15.电刺激前后rMSCs细胞种植于GF,GF/58S BG支架后成骨相关基因的表达 (Col I,OST,Runx-2)。 具体实施方式 说 明 书 3/6 页 5 CN 108653802 A 5 0041 为使本发明的目的、 技术方案和优点更加清楚， 下面将结合附图对本发明作进一 步地详细描述。 0042 制备实施例 0043 (1)GF/58S BG三维互穿网络。
21、支架的制备 0044 a.泡沫镍(Ni foam)为原料， CH4为气体来源， 在N2/H2气氛下， CVD法制备 Ni-G复合 支架(通过改变CH4气体流量， 通气时间以及CH4:H2比例， 优化GF支架的制备条件)； 0045 将得到的Ni-G复合支架滴加4的聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)溶液， 180干燥 30min， 然后用热稀HNO3/H2O2混合溶液去除Ni， 获得GF-PMMA复合支架材料。 GF-PMMA复合支 架材料浸泡在50丙酮溶液中， 去除PMMA， 得到GF支架。 0046 b.以正硅酸乙酯(TEOs)作为Si源， 磷酸三乙酯(TEP)作为P源， 四水硝酸钙 (Ca (N。
22、O3)4H2O)作为Ca源。 TEOs和TEP在硝酸催化作用下， 在水/乙醇溶液中进行水解， 形成溶 胶。 (58S BG配方： SiO2 59wt,P2O5 5wt,CaO 36wt)。 0047 c.将制备获得的58S BG前驱体溶液滴加到G支架上， 然后用旋涂机500rpm 旋涂 5min， 重复此过程1次。 0048 d.将旋涂后的支架材料放入80水浴中陈化2h。 0049 e.置于-20冰箱中预冻， 冷冻干燥获得GF/58S BG三维支架材料。 0050 f.将冷冻干燥后的GF/58S BG三维支架材料在管式炉中600烧结2h， 最后得到 GF/58S BG三维支架材料。 0051 。
23、(2)GF/58S BG三维支架体外细胞相容性评价 0052 a.CCK8细胞活性检测 0053 将rMSCs以1104/孔接种于含有GF、 GF/58S BG三维互穿网络支架材料的24 孔 板， TCP为空白对照组。 细胞培养1d， 2d， 4d后， PBS溶液润洗23遍， 每孔加入CCK8试剂， 37 CO2恒温培养箱中继续培养2h。 移取上清液至 96孔板， 酶标仪测定450nm下的光密度(OD) 值， 检测细胞活性。 0054 b.活死细胞染色 0055 将10 l Calcein-AM储备液和15 l PI储备液稀释至5ml PBS中配制成染色溶液， 配制成Calcein-AM的终浓。
24、度为2 mol/l， PI的终浓度为4 mol/l的混合染液。 将rMSCs以5 103/孔接种于含GF、 GF/58S BG三维互穿网络支架材料的 24孔板， 细胞培养1d， 4d后， PBS溶 液冲洗2遍， 加入200 l配制好的染液， 在37培养箱孵育15min， 用PBS溶液冲洗3遍， 荧光显 微镜观察。 0056 c.细胞荧光染色 0057 将rMSCs以1105/孔接种于含有GF、 GF/58S BG三维互穿网络支架上， 细胞培养 1d， 4d后， 用PBS溶液冲洗2遍， 每孔加入200 l 4的多聚甲醛固定10min； PBS溶液冲洗2遍， 每孔加入200 l 0.1Triton。
25、 X-100,室温通透5 min,PBS溶液冲洗2遍； 每孔加入200 l 1BSA,室温孵育20min,PBS溶液冲洗2遍； Rhodamine Phalloidin染液室温染色20min， 染 细胞骨架， PBS溶液冲洗3遍； Hochest 33258染液复染5min， 染细胞核， PBS溶液冲洗3遍； 用 抗猝灭剂封片后， 共聚焦显微镜观察。 0058 d.扫描电镜观察细胞形貌 0059 将rMSCs以5103/孔接种于含GF、 GF/58S BG三维互穿网络支架上， 细胞培养1w和 说 明 书 4/6 页 6 CN 108653802 A 6 2w后， 取出24孔板， 用PBS溶液冲。
26、洗2遍， 然后用2.5的戊二醛4固定3h。 接着用梯度浓度 的乙醇脱水(30,50,70,90, 100)， 每步脱水15min,然后从乙醇逐步过渡到叔丁 醇， 纯叔丁醇4过夜。 样品用冷冻干燥4h， 冻干后的样品喷金， 扫描电镜观察细胞在材料上 的形貌。 0060 (3)电刺激GF/58S BG三维支架对rMSCs生长的影响 0061 a.电刺激实验 0062 将rMSCs以5104/孔接种于GF、 GF/58S BG三维互穿网络支架上， 培养24h 后， 采 用恒定电压(1V)对细胞刺激(15min)， 电刺激不同的1w。 装置如图4 所示， 将两根铂电极分 别插入PBS溶液中三维支架材料。
27、两端， 然后外加恒定电场。 电刺激后， 细胞继续培养24h， 观 察rMSCs细胞成骨相关基因(ColI,Runx-2, ALP)表达的影响。 0063 生物组织支架应用检测实施例 0064 (1)GF和GF/58S BG支架理化性能表征： 0065 如图5所示， 利用泡沫Ni为模板， 通过CVD法制备的石墨烯支架在用稀酸去除Ni之 后的XPS图中含有C1s峰， O1s峰， 但不含有Ni峰， 表明模板Ni 去除干净。 图6所示为GF和GF/ 58S BG支架的SEM图。 所制备的三维GF支架具有相互贯通的多孔结构， 孔径大小在100-300 m之间， 孔隙率约为95。 GF表面覆盖了波纹和皱纹。
28、(图6b)， 可能是由于在CVD过程中Ni和 石墨烯的热膨胀系数不同引起的。 将58S BG前驱体通过自旋法涂层到GF支架， 并经过老化 和冷冻干燥过程后， 在石墨烯支架中和石墨烯表面(图6(c,d)中引入58S BG， 将58S BG镶 嵌到GF大孔隙中， 且58S BG表面为多孔结构。 拉曼光谱图(图6) 显示了GF支架含有石墨烯 在2720cm-1处的2D峰和1580cm-1处的G峰。 图7 所示为铁氰化钾(pH6.5)缓冲液中GF和GF/ 58S BG支架的循环伏安图。 与Pt电极相比， GF电极中由Fe(CN)64-/Fe(CN)63-氧还作用产生 的一组峰值分别为0.367 V和0。
29、.166V。 GF的峰值电流与Pt电极之间的显著增加表明了一个 极好的电活性， 是由GF大的表面积引起的。 在GF/58S BG上获得的峰值氧化还原电流与 GF 相比下降了25， 证实了非电活性58S BG的成功加入。 然而， GF/58S BG 的峰值电流和电活 动表面积仍然比Pt电极高得多， 表明GF/58S BG是高电活性且适合电刺激(ES)试验的， 参见 图8。 0066 (2)GF和GF/58S BG支架体外活性 0067 GF和GF/58S BG支架的体外生物活性通过模拟体液(SBF)试验来验证。 在SBF中分 别浸泡4d和7d后， GF支架没有观察到片状沉积， 而添加了58S B。
30、G 后GF支架中， 4d后的SEM图 (图9c)中观察到少量片状沉积， 且沉积物随着SBF浸泡时间延长至7d， 在GF/58S BG的表面 覆盖了一层厚且分布良好沉积物。 GF和GF/58S BG支架在SBF中浸泡7d后的XRD(图10)和 FTIR(图11) 结果显示， GF/58s BG支架中观察到羟基磷灰石在22 和32 附近的特征衍射 峰。 GF/58S BG支架的FTIR谱显示在564和604cm-1处属于P-O键的的弯曲振动峰， 874cm-1处 的碳酸盐峰。 以及在1079cm-1处观察到与58S BG相关的Si-O 拉伸震动峰。 以上结果表明， GF支架是生物惰性的， 随着58。
31、S BG添加到GF 支架中， GF支架的生物活性显著增强。 0068 (3)GF和GF/58S BG细胞相容性评价 0069 图12所示为rMSCs细胞培养于GF,GF/58S BG支架中的CCK8及活死染色数据。 活死 染色图中， 在两个支架上都没有观察到死细胞， 说明这两种支架都适合rMSCs的粘附和生 长。 rMSCs在两个支架上均均匀分布， 在GF/58S BG 上观察到更多的细胞， 表明58S BG的加 说 明 书 5/6 页 7 CN 108653802 A 7 入， 促进了细胞的增殖。 CCK8结果显示， 经过1d,2d和4d的培养， GF/58S BG支架中的细胞活 性都显著高。
32、于GF 支架。 与活死染色结果一致， 表明58S BG的加入， 促进了细胞的增殖。 0070 高比表面积的GF和58S BG上的微孔结构为rMSCs细胞的粘附和增殖提供了一个巨 大的表面。 图13(a-f)显示了rMSCs细胞在GF和GF/58S BG支架上的 SEM和激光共聚焦图像。 SEM结果显示， rMSCs细胞在GF支架中朝各个方向生长， 在石墨烯层与层之间、 石墨烯孔隙之 间形成桥梁。 由此可见， rMSCs细胞可以在GF上生长， 并在内形成三维的细胞-GF结构。 在GF/ 58S BG支架上的rMSCs细胞的SEM图像显示， 细胞大部分集中在58S BG部分， 这是由于58S BG。
33、的微孔结构可以支持细胞的粘附伸展， 且58S BG的生物相容性更好， 可以促进rMSCs细胞 的增殖。 在rMSCs培养之前， GF浸泡入细胞培养基中， 石墨烯的疏水性得到改善。 这与GF表面 的蛋白质积累结合， 使rMSCs在GF中的粘附成为可能。 0071 (4)电刺激试验 0072 为了验证ES对GF和GF/58S BG支架中rMSC细胞分化的影响， 我们检测成骨相关基 因表达。 0073 如图15所示， 在GF/58S BG支架上培养的rMSCs的所有成骨基因的表达均高于GF支 架上的rMSCs。 这可能归因于从58S BG释放的离子(例如Ca2+， SiO44-和PO43-)促进了r。
34、MSCs的 分化。 ES处理后， 两个纳米支架的所有成骨相关基因的表达显着增加， 表明ES对rMSCs成骨 细胞分化具有正面影响。 有趣的是， 在GF/58S BG中ES后基因表达的增加表达高于GF支架， 这可能是由于电场促进了离子定向迁移， 从而促进了从58S BG释放离子。 这些结果表明， 在 ES下的GF/58S BG上的rMSCs的成骨分化是电场和58S BG释放的离子的协同效应。 0074 本申请提供了一种新型的GF/58S BG互穿网络支架用于电刺激辅助干细胞分化的 申请。 三维GF/58S BG支架具有巨大的表面积、 良好的生物活性和良好的导弹性能， 对细胞 粘附、 增殖、 分化。
35、和电刺激具有吸引力。 在添加58S BG后， GF/58S BG支架表明易形成磷灰石 层以改善其生物活性。 体外细胞申请显示， 与GF支架相比， GF/58S BG支架具有更好的粘附 和增殖性能。 GF/58S BG支架能促进rMSCs细胞的成骨分化， ALP水平显著提高， 表明58S BG 及其微孔结构的存在对rMSCs的成骨分化有积极的影响。 电刺激GF， GF/58S BG支架， 种植于 两种支架表面的rMSCs细胞的成骨相关基金的表达都有所提高， 为其在骨再生过程中应用 电刺激辅助分化提供了很好的应用前景。 0075 以上所揭露的仅为本发明较佳实施例而已， 当然不能以此来限定本发明之权。
36、利范 围， 因此依本发明权利要求所作的等同变化， 仍属本发明所涵盖的范围。 说 明 书 6/6 页 8 CN 108653802 A 8 图1 图2 说 明 书 附 图 1/8 页 9 CN 108653802 A 9 图3 说 明 书 附 图 2/8 页 10 CN 108653802 A 10 图4 图5 说 明 书 附 图 3/8 页 11 CN 108653802 A 11 图6 图7 说 明 书 附 图 4/8 页 12 CN 108653802 A 12 图8 图9 说 明 书 附 图 5/8 页 13 CN 108653802 A 13 图10 图11 说 明 书 附 图 6/8 页 14 CN 108653802 A 14 图12 图13 说 明 书 附 图 7/8 页 15 CN 108653802 A 15 图14 图15 说 明 书 附 图 8/8 页 16 CN 108653802 A 16 。