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1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201611208536.8 (22)申请日 2016.12.23 (71)申请人 大连三生科技发展有限公司 地址 116000 辽宁省大连市金州新区东北 六街6-1号 (72)发明人 李丹 郭斌 张久文 蔡俊江 彭鹏 李闪 (74)专利代理机构 大连东方专利代理有限责任 公司 21212 代理人 赵淑梅 (51)Int.Cl. A61L 27/34(2006.01) A61L 27/54(2006.01) A61L 27/58(2006.01) (54)发明名称 具有壳聚糖-A。
2、MP复合物涂层的种植体活性 表面 (57)摘要 本发明公开一种具有壳聚糖-AMP复合物涂 层的种植体活性表面， 具体是带有不同层数涂层 的牙种植体。 其涂层主要依靠阳离子与阴离子相 互之间的静电引力， 在种植体固体表面形成有序 排列的分子涂层， 因为壳聚糖和AMP复合物层是 具有良好生物降解性和生物相容性的生物材料。 由于表层硫酸软骨素层-抗菌肽层复合层结构的 存在， 具有持久、 高效的杀菌、 抗感染能力， 其抗 菌、 抗凋亡活性， 能够支持多种细胞(如成骨细 胞、 软骨细胞)的粘附、 存活、 生长与分化， 具有广 阔的应用前景。 权利要求书1页 说明书4页 CN 106729993 A 20。
3、17.05.31 CN 106729993 A 1.一种具有壳聚糖-AMP复合物涂层的种植体活性表面， 其特征在于： 覆盖于具有二氧 化钛纳米管阵列层的牙种植体表面， 由正电荷壳聚糖层和负电荷AMP复合物层交替组装， 外 层负载硫酸软骨素层-抗菌肽层。 2.根据权利要求1所述的具有壳聚糖-AMP复合物涂层的种植体活性表面， 其特征在于： 所述抗菌肽层的制备方法包括以下操作步骤： (1)将表面为二氧化钛纳米管阵列层的牙种植体清洗备用； (2)制备0.55mg/ml的壳聚糖溶液： 浓度为lmg/ml的AMP复合物溶液； (3)将步骤(1)所述的牙种植体浸没于步骤(2)所得壳聚糖溶液中1020min。
4、， 以使牙种 植体表面带上正电荷； 再用去离子水充分清洗； (4)将步骤(3)所述的牙种植体浸没于浓度为lmg/ml的AMP复合物溶液中510min， 以 使牙种植体表面带上负电荷； 再用去离子水充分清洗； 根据需要组装的层数， 重复步骤(3)、 (4)和(3)即可得到带有不同层数涂层的牙种植 体； (5)将步骤(4)所述的牙种植体在浓度为2mg/mL的硫酸软骨素硫酸钠盐溶液中浸泡5 15min， 溶液体系控制pH值为6， 再用去离子水充分清洗后自然干燥； 再将涂覆有硫酸软骨素 的牙种植体浸泡于pH值为7， 浓度为0.5mg/mL的抗菌肽溶液中515min， 再用去离子水充分 清洗后自然干燥，。
5、 获得涂覆有硫酸软骨素层-抗菌肽层复合层的材料。 3.根据权利要求1所述的具有壳聚糖-AMP复合物涂层的种植体活性表面， 其特征在于： 所述的清洗是指去离子水， 乙醇和丙酮超声清洗， 用氮气吹干后， 放于真空干燥箱中， 在60 的条件下干燥24小时。 4.根据权利要求1所述的具有壳聚糖-AMP复合物涂层的种植体活性表面， 其特征在于： 所述的壳聚糖的脱乙酰度为5098， Mw为1001500kDa。 5.根据权利要求1所述的具有壳聚糖-AMP复合物涂层的种植体活性表面， 其特征在于： 所述的壳聚糖溶液为将壳聚糖溶解在0.33的乙酸溶液中， 配成0.55mg/ml的壳聚糖 溶液， 将所得溶液与液。
6、体石蜡混合， 体积比为0.10.4， 并加入体积浓度为0.51的司盘 80， 同时加入分散剂硬脂酸镁， 司盘80与硬脂酸镁的质量比为24 1， 搅拌所得油包水乳 液， 向其中加入510mg/ml的交联剂香草醛1ml， 4060搅拌状态下反应46小时后； 静置取上清液； 再将所得的壳聚糖微粒以水悬浮， 添加少量的冰醋酸溶液， 磁力搅拌器搅拌 条件下， 再加入NaCl， 使其终浓度达到0.15M； 该溶液带正电荷。 6.根据权利要求5所述的具有壳聚糖-AMP复合物涂层的种植体活性表面， 其特征在于： 所述静置取上清液是指， 静置12小时以上分离油水相， 取下层水溶液， 调节pH值为89， 离 心除。
7、去沉淀物， 取上清液得到壳聚糖微粒悬浮液。 7.根据权利要求1所述的具有壳聚糖-AMP复合物涂层的种植体活性表面， 其特征在于： 所述浓度为lmg/ml的AMP复合物溶液的配置方法为： 秤取50mgAMP复合物粉末加至50ml的灭 菌后去离子水中， 搅拌充分至完全溶解， 加冰醋酸调pH为5.0， 此溶液带有正电荷。 权 利 要 求 书 1/1 页 2 CN 106729993 A 2 具有壳聚糖-AMP复合物涂层的种植体活性表面 技术领域 0001 本发明属于牙种植体技术领域， 具体涉及具有壳聚糖-AMP复合物涂层的种植体活 性表面。 背景技术 0002 随着牙种植体技术的不断发展， 和被医患。
8、者广泛的认可， 也是近年口腔医学里发 展最快的一个专业， 不断取得突破性进展， 正在为更多的牙疾患者提供专业帮助。 然而， 不 得不承认的另一现状是， 现有的介入装置植入体内后很容易发生感染。 主要的感染机制是 进入体内的细菌首先粘附在材料表面， 由于体内丰富的营养环境， 细菌发生繁殖， 形成了一 层保护性的生物膜。 生物膜的存在使得医用装置引发的感染尤为难治。 0003 Roos.Jansaker等对种植术后患者进行多年的随访， 以存在探诊出血同时未出现 骨质丧失为诊断标准进行临床病例统计， 结果显示， 种植体周黏膜炎的发病率约为79； 甚 至有研究表明， 约有超过90的种植体出现过探诊出血。
9、。 而种植体周围炎可导致种植体周 骨组织的缺损、 丧失， 如不及时治疗可导致种植体的松动脱落。 0004 生物活性肽是蛋白质中20个天然氨基酸以不同组成和排列方式构成的从二肽到 复杂的线性、 环形结构的不同肽类的总称， 是源于蛋白质的多功能化合物。 活性肽具有多种 人体代谢和生理调节功能， 易消化吸收， 有促进免疫、 激素调节、 抗菌、 抗病毒、 降血压、 降血 脂等作用。 0005 由于牙种植体表面的主要成分通常处理为带负电状态。 并将含有电正性基团的聚 合物如壳聚糖与牙种植体表面有较好的黏附作用。 另外含有与羟基互为氢键给体/受体的 基团的聚合物， 如海藻酸钠、 羟丙基纤维素等也可能与牙种。
10、植体表面有一定的黏附作用。 0006 所以， 牙种植体对材料的表面性质要求非常高。 因此， 探索新型的牙种植体表面改 性方法逐渐成为了种植领域的科研方向。 发明内容 0007 为解决上述技术问题所采用的技术方案是： 公开一种具有壳聚糖-AMP复合物涂层 的种植体活性表面， 即覆盖于二氧化钛纳米管阵列层的牙种植体表面的涂层， 由正电荷壳 聚糖层和负电荷AMP复合物层交替组装， 外层负载硫酸软骨素层-抗菌肽层。 0008 对于上述技术方案， 优选的情况下， 所述的具有壳聚糖-AMP复合物涂层的种植体 活性表面， 其中， 所述抗菌肽层的制备方法包括以下操作步骤： 0009 (1)将表面为二氧化钛纳米。
11、管阵列层的牙种植体清洗备用； 0010 (2)制备0.55mg/ml的壳聚糖溶液： 浓度为0.5mg/ml透明质酸钠溶液； 浓度为 lmg/ml的AMP复合物溶液； 0011 (3)将步骤(1)所述的牙种植体浸没于步骤(2)所得壳聚糖溶液中1020min， 以使 牙种植体表面带上正电荷； 再用去离子水充分清洗； 0012 (4)将步骤(3)所述的牙种植体浸没于浓度为lmg/ml的AMP复合物溶液中5 说 明 书 1/4 页 3 CN 106729993 A 3 10min， 以使牙种植体表面带上负电荷； 再用去离子水充分清洗； 其中， 所述AMP复合物的制 备方法为， 在pH为7.4的PBS中。
12、， Sulfo-SMPB先与型胶原接枝， 之后再与AMP接枝制得。 0013 根据需要组装的层数， 重复步骤(3)、 (4)和(3)即可得到带有不同层数涂层的牙种 植体； 0014 (5)将步骤(4)所述的牙种植体在浓度为2mg/mL的硫酸软骨素硫酸钠盐溶液中浸 泡515min， 溶液体系控制pH值为6， 再用去离子水充分清洗后自然干燥； 再将涂覆有硫酸 软骨素的牙种植体浸泡于pH值为7， 浓度为0.5mg/mL的抗菌肽溶液中515min， 再用去离子 水充分清洗后自然干燥， 获得涂覆有硫酸软骨素层-抗菌肽层复合层的材料。 0015 上述技术方案中， 所述RGD是Arg-Gly-Asp的短肽序。
13、列， 由精氨酸、 甘氨酸和天冬氨 酸组成； 0016 所述AMP为阳离子抗菌短肽， 英文名称:cationic antimicrobial peptides。 0017 对于上述技术方案， 优选的情况下， 所述的具有壳聚糖-AMP复合物涂层的种植体 活性表面， 其中， 所述的清洗是指去离子水， 乙醇和丙酮超声清洗， 用氮气吹干后， 放于真空 干燥箱中， 在60的条件下干燥24小时。 0018 对于上述技术方案， 优选的情况下， 所述的具有壳聚糖-AMP复合物涂层的种植体 活性表面， 其中， 所述的壳聚糖的脱乙酰度为5098， Mw为1001500kDa。 0019 对于上述技术方案， 优选的情。
14、况下， 所述的具有壳聚糖-AMP复合物涂层的种植体 活性表面， 其中， 所述的壳聚糖溶液为将壳聚糖溶解在0.33的乙酸溶液中， 配成0.5 5mg/ml的壳聚糖溶液， 将所得溶液与液体石蜡混合， 体积比为0.10.4， 并加入体积浓度为 0.51的司盘80， 同时加入分散剂硬脂酸镁， 司盘80与硬脂酸镁的质量比为24 1， 搅拌 所得油包水乳液， 向其中加入510mg/ml的交联剂香草醛1ml， 4060搅拌状态下反应 46小时后； 静置取上清液； 再将所得的壳聚糖微粒以水悬浮， 添加少量的冰醋酸溶液， 磁 力搅拌器搅拌条件下， 再加入NaCl， 使其终浓度达到0.15M； 该溶液带正电荷。 。
15、0020 对于上述技术方案， 优选的情况下， 所述的具有壳聚糖-AMP复合物涂层的种植体 活性表面， 其中， 所述静置取上清液是指， 静置12小时以上分离油水相， 取下层水溶液， 调节 pH值为89， 离心除去沉淀物， 取上清液得到壳聚糖微粒悬浮液。 0021 对于上述技术方案， 优选的情况下， 所述的具有壳聚糖-AMP复合物涂层的种植体 活性表面， 其中， 所述浓度为lmg/ml的AMP复合物溶液的配置方法为： 秤取50mg AMP复合物 粉末加至50ml的灭菌后去离子水中， 搅拌充分至完全溶解， 加冰醋酸调pH为5.0， 此溶液带 有正电荷。 0022 本发明的创新特征是： 0023 本发。
16、明所制备的带有不同层数涂层的牙种植体。 其涂层主要依靠阳离子与阴离子 相互之间的静电引力， 在种植体固体表面形成有序排列的分子涂层， 因为壳聚糖和AMP复合 物层是具有良好生物降解性和生物相容性的生物材料。 由于表层硫酸软骨素层-抗菌肽层 复合层结构的存在， 具有持久、 高效的杀菌、 抗感染能力， 其抗菌、 抗凋亡活性， 能够支持多 种细胞(如成骨细胞、 软骨细胞)的粘附、 存活、 生长与分化， 具有广阔的应用前景。 具体实施方式 0024 下述非限制性实施例可以使本领域的普通技术人员更全面地理解本发明， 但不以 说 明 书 2/4 页 4 CN 106729993 A 4 任何方式限制本发明。
17、。 任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明披露的技术范围内， 根据 本发明的技术方案及其发明构思进行等同替换或改变均属于本发明保护范畴。 0025 配置浓度为lmg/ml的AMP复合物溶液； 0026 秤取50mg AMP复合物粉末加至50ml的灭菌后去离子水中， 搅拌充分至完全溶解， 加冰醋酸调pH为5.0， 此溶液带有正电荷。 0027 配置浓度为0.5mg/mL抗菌肽溶液 0028 称取5mg抗菌肽， 将其溶解于10mL去离子水中， 制备成pH值为7， 浓度为0.5mg/mL抗 菌肽溶液。 0029 实施例1 0030 (1)将表面为二氧化钛纳米管阵列层的牙种植体， 依次用去离子水， 乙醇。
18、和丙酮超 声清洗， 用氮气吹干后， 放于真空干燥箱中， 在60的条件下干燥24小时， 放置备用； 0031 (2)将壳聚糖溶解在0.3的乙酸溶液中， 配成0.5mg/ml的壳聚糖溶液， 所述的壳 聚糖的脱乙酰度为50， Mw为1000kDa。 0032 (3)将步骤(2)所得溶液与液体石蜡混合， 体积比为0.1， 并加入体积浓度为0.5 的司盘80， 同时加入分散剂硬脂酸镁， 司盘80与硬脂酸镁的质量比为2 1， 室温下搅拌1小时 以上， 形成均匀的油包水乳液； 0033 (4)在将步骤(3)所得油包水乳液中加入5mg/ml的交联剂香草醛1ml， 40搅拌状 态下反应4小时， 得到壳聚糖微粒；。
19、 0034 (5)将步骤(4)所得产物静置12小时以上分离油水相， 取下层水溶液， 调节pH值为 8， 离心除去沉淀物， 取上清液得到壳聚糖微粒悬浮液 0035 (6)向去离子水中加入步骤(5)所得的壳聚糖微粒悬浮液， 添加lml的冰醋酸溶液， 磁力搅拌器搅拌条件下， 再加入NaCl， 使其终浓度达到0.15M； 该溶液带正电荷； 0036 实施例2 0037 (1)将表面为二氧化钛纳米管阵列层的牙种植体， 依次用去离子水， 乙醇和丙酮超 声清洗， 用氮气吹干后， 放于真空干燥箱中， 在60的条件下干燥24小时， 放置备用； 0038 (2)将壳聚糖溶解在3的乙酸溶液中， 配成5mg/ml的壳。
20、聚糖溶液， 所述的壳聚糖 的脱乙酰度为98， Mw为1500kDa。 0039 (3)将步骤(2)所得溶液与液体石蜡混合， 体积比为0.4， 并加入体积浓度为1的 司盘80， 同时加入分散剂硬脂酸镁， 司盘80与硬脂酸镁的质量比为4 1， 室温下搅拌1小时以 上， 形成均匀的油包水乳液； 0040 (4)在将步骤(3)所得油包水乳液中加入10mg/ml的交联剂香草醛1ml， 60搅拌状 态下反应6小时， 得到壳聚糖微粒； 0041 (5)将步骤(4)所得产物静置12小时以上分离油水相， 取下层水溶液， 调节pH值为 9， 离心除去沉淀物， 取上清液得到壳聚糖微粒悬浮液 0042 (6)向去离子。
21、水中加入步骤(5)所得的壳聚糖微粒悬浮液， 添加lml的冰醋酸溶液， 磁力搅拌器搅拌条件下， 再加入NaCl， 使其终浓度达到0.15M； 该溶液带正电荷； 0043 实施例3 0044 将实施例1中步骤(1)处理得到的牙种植体浸没于上文实施例1和2所述的壳聚糖 溶液中1020min， 以使牙种植体表面带上正电荷； 再用去离子水充分清洗； 说 明 书 3/4 页 5 CN 106729993 A 5 0045 将上述清洗后的牙种植体浸没于上文所述的浓度为lmg/ml的AMP复合物溶液中10 20min， 以使牙种植体表面带上负电荷； 再用去离子水充分清洗； 0046 处理得到的牙种植体浸没于上。
22、文实施例1和2所述的壳聚糖溶液中1020min， 以 使牙种植体表面带上正电荷； 再用去离子水充分清洗； 0047 根据需要组装的层数， 重复实施例3的步骤2次以上， 即可得到带有不同层数涂层 的牙种植体。 0048 实施例4 0049 将实施例3中根据需要组装不同层数涂层的牙种植体， 在浓度为2mg/mL的硫酸软 骨素硫酸钠盐溶液(带有负电荷的多糖溶液)中浸泡1020min， 溶液体系控制pH值为6， 再 用去离子水充分清洗后自然干燥； 0050 将涂覆该有硫酸软骨素的材料浸泡于pH值为7， 浓度为0.5mg/mL的抗菌肽溶液中 15min， 再用去离子水充分清洗后自然干燥， 获得涂覆有硫酸。
23、软骨素层-抗菌肽层复合层的 材料。 0051 针对上述方法制备获得的牙种植体， 进行表面接触角分析， 其结果从亲水性和润 湿性上也证实了涂层的存在。 根据分析可知， 本发明所制备的带有不同层数涂层的牙种植 体。 其涂层主要依靠阳离子与阴离子相互之间的静电引力， 在种植体固体表面形成有序排 列的分子涂层， 因为壳聚糖和AMP复合物是具有良好生物降解性和生物相容性的生物材料。 由于表层硫酸软骨素层-抗菌肽层复合层结构的存在， 具有持久、 高效的杀菌、 抗感染能力， 其抗菌、 抗凋亡活性， 能够支持多种细胞(如成骨细胞、 软骨细胞)的粘附、 存活、 生长与分 化， 具有广阔的应用前景。 说 明 书 4/4 页 6 CN 106729993 A 6 。