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1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201611213409.7 (22)申请日 2016.12.23 (71)申请人 大连三生科技发展有限公司 地址 116000 辽宁省大连市金州新区东北 六街6-1号 (72)发明人 郭斌 张久文 蔡俊江 彭鹏 李闪 (74)专利代理机构 大连东方专利代理有限责任 公司 21212 代理人 赵淑梅 (51)Int.Cl. A61L 27/34(2006.01) A61L 27/30(2006.01) A61L 27/54(2006.01) A61L 27/58(2006.01)。
2、 (54)发明名称 一种具有壳聚糖-RGD复合涂层的种植体活 性表面 (57)摘要 本发明公开一种具有壳聚糖-RGD复合涂层 的种植体活性表面， 具体是带有不同层数涂层的 牙种植体。 其涂层主要依靠阳离子与阴离子相互 之间的静电引力， 在种植体固体表面形成有序排 列的分子涂层， 因为壳聚糖RGD和AMP复合物是具 有良好生物降解性和生物相容性的生物材料。 由 于表层硫酸软骨素层-抗菌肽层复合层结构的存 在， 具有持久、 高效的杀菌、 抗感染能力， 其抗菌、 抗凋亡活性， 能够支持多种细胞(如成骨细胞、 软 骨细胞)的粘附、 存活、 生长与分化， 具有广阔的 应用前景。 权利要求书2页 说明书5。
3、页 CN 106729994 A 2017.05.31 CN 106729994 A 1.具有壳聚糖-RGD复合涂层的种植体活性表面， 其特征在于： 牙种植体表面顺次涂覆 有二氧化钛层、 正电荷壳聚糖层与负电荷RGD肽层或AMP复合物层交替组装的缓释层， 外层 负载硫酸软骨素层-抗菌肽层。 2.根据权利要求1所述的具有壳聚糖-RGD复合涂层的种植体活性表面， 其特征在于： 其 制备方法包括以下操作步骤： (1)先秤取100mg RGD加至10ml的浓度为1的醋酸-醋酸钠缓冲液中； 缓慢搅拌至溶解 后， 加入EDCHCl 500mg， 再加入NHS 250mg， 经过磁力搅拌器活化12h； 放入。
4、ddH2O中透析， 在磁力搅拌器搅拌状态下隔夜； 获得RGD肽溶液； (2)将种植体表面打磨， 清洗， 烘干； 用50100 mTiO2微粒对种植体表面进行喷砂处理； 再置于氢氟酸与盐酸组成的混合酸蚀剂中进行表面刻蚀处理， 取出种植体超声清洗， 干燥； 再将种植体置于60、 5mol/L NaOH溶液孵育24-48h， 用水超声清洗备用； (3)将步骤(2)所述的牙种植体浸没于0.55mg/ml的壳聚糖溶液中1020min， 以使牙 种植体表面带上正电荷； 再用去离子水充分清洗； (4)将步骤(3)所述的牙种植体浸没于步骤(1)所述的RGD肽溶液中3h以上； 或浸没于浓 度为lmg/ml的AM。
5、P复合物溶液中510min， 以使牙种植体表面带上负电荷； 再用去离子水充 分清洗； 根据需要组装的层数， 重复步骤(3)、 (4)和(3)即可得到带有不同层数涂层的牙种植 体； (5)将步骤(4)所述的牙种植体在浓度为2mg/mL的硫酸软骨素硫酸钠盐溶液中浸泡5 15min， 溶液体系控制pH值为6， 再用去离子水充分清洗后自然干燥； 再将涂覆有硫酸软骨素 的牙种植体浸泡于pH值为7， 浓度为0.5mg/mL的抗菌肽溶液中515min， 再用去离子水充分 清洗后自然干燥， 获得涂覆有硫酸软骨素层-抗菌肽层复合层的材料。 3.根据权利要求1所述的具有壳聚糖-RGD复合涂层的种植体活性表面， 其。
6、特征在于： 所 述的清洗是指去离子水， 乙醇和丙酮超声清洗， 用氮气吹干后， 放于真空干燥箱中， 在60 的条件下干燥24小时。 4.根据权利要求1所述的具有壳聚糖-RGD复合涂层的种植体活性表面， 其特征在于： 所 述的壳聚糖的脱乙酰度为5098， Mw为1001500kDa。 5.根据权利要求1所述的具有壳聚糖-RGD复合涂层的种植体活性表面， 其特征在于： 所 述的壳聚糖溶液为将壳聚糖溶解在0.33的乙酸溶液中， 配成0.55mg/ml的壳聚糖溶 液， 将所得溶液与液体石蜡混合， 体积比为0.10.4， 并加入体积浓度为0.51的司盘 80， 同时加入分散剂硬脂酸镁， 司盘80与硬脂酸镁。
7、的质量比为24 1， 搅拌所得油包水乳 液， 向其中加入510mg/ml的交联剂香草醛1ml， 4060搅拌状态下反应46小时后； 静置取上清液； 再将所得的壳聚糖微粒以水悬浮， 添加少量的冰醋酸溶液， 磁力搅拌器搅拌 条件下， 再加入NaCl， 使其终浓度达到0.15M； 该溶液带正电荷。 6.根据权利要求5所述的具有壳聚糖-RGD复合涂层的种植体活性表面， 其特征在于： 所 述静置取上清液是指， 静置12小时以上分离油水相， 取下层水溶液， 调节pH值为89， 离心 除去沉淀物， 取上清液得到壳聚糖微粒悬浮液。 7.根据权利要求1所述的具有壳聚糖-RGD复合涂层的种植体活性表面， 其特征在。
8、于： 所 述浓度为lmg/ml的AMP复合物溶液的配置方法为： 秤取50mg AMP复合物粉末加至50ml的灭 权 利 要 求 书 1/2 页 2 CN 106729994 A 2 菌后去离子水中， 搅拌充分至完全溶解， 加冰醋酸调pH为5.0， 此溶液带有正电荷。 权 利 要 求 书 2/2 页 3 CN 106729994 A 3 一种具有壳聚糖-RGD复合涂层的种植体活性表面 技术领域 0001 本发明属于牙种植体技术领域， 具体涉及具有壳聚糖-RGD复合涂层的种植体活性 表面。 背景技术 0002 随着牙种植体技术的不断发展， 和被医患者广泛的认可， 也是近年口腔医学里发 展最快的一个。
9、专业， 不断取得突破性进展， 正在为更多的牙疾患者提供专业帮助。 然而， 不 得不承认的另一现状是， 现有的介入装置植入体内后很容易发生感染。 主要的感染机制是 进入体内的细菌首先粘附在材料表面， 由于体内丰富的营养环境， 细菌发生繁殖， 形成了一 层保护性的生物膜。 生物膜的存在使得医用装置引发的感染尤为难治。 0003 Roos.Jansaker等对种植术后患者进行多年的随访， 以存在探诊出血同时未出现 骨质丧失为诊断标准进行临床病例统计， 结果显示， 种植体周黏膜炎的发病率约为79； 甚 至有研究表明， 约有超过90的种植体出现过探诊出血。 而种植体周围炎可导致种植体周 骨组织的缺损、 。
10、丧失， 如不及时治疗可导致种植体的松动脱落。 0004 由于牙种植体表面的主要成分通常处理为带负电状态。 并将含有电正性基团的聚 合物如壳聚糖与牙种植体表面有较好的黏附作用。 另外含有与羟基互为氢键给体/受体的 基团的聚合物， 如海藻酸钠、 羟丙基纤维素等也可能与牙种植体表面有一定的黏附作用。 0005 生物活性肽是蛋白质中20个天然氨基酸以不同组成和排列方式构成的从二肽到 复杂的线性、 环形结构的不同肽类的总称， 是源于蛋白质的多功能化合物。 活性肽具有多种 人体代谢和生理调节功能， 易消化吸收， 有促进免疫、 激素调节、 抗菌、 抗病毒、 降血压、 降血 脂等作用。 0006 RGD序列由。
11、精氨酸、 甘氨酸和天冬氨酸组成， 存在于多种细胞外基质中， 可与11种 整合素特异性结合， 能有效地促进细胞对生物材料的粘附。 将RGD序列固定于钛或钛合金种 植体表面， 可以促进成骨细胞对钛或钛合金表面的粘附， 进一步促进种植体骨整合， 提高种 植义齿的成功率。 RGD序列的空间结构、 修饰密度、 周围序列对其活性都有一定影响。 0007 总之， 牙种植体对材料的表面性质要求非常高。 因此， 探索新型的牙种植体表面改 性方法逐渐成为了种植领域的科研方向。 发明内容 0008 为解决上述技术问题所采用的技术方案是： 公开具有壳聚糖-RGD复合涂层的种植 体活性表面， 所述牙种植体表面顺次涂覆有。
12、二氧化钛层、 正电荷壳聚糖层与负电荷RGD肽层 或AMP复合物层交替组装的缓释层， 外层负载硫酸软骨素层-抗菌肽层。 0009 对于上述技术方案， 优选的情况下， 所述的抗菌肽层的制备方法包括以下操作步 骤： 0010 (1)先秤取100mg RGD肽加至10ml的浓度为1的醋酸-醋酸钠缓冲液中； 缓慢搅拌 至溶解后， 加入EDCHCl 500mg， 再加入NHS 250mg， 经过磁力搅拌器活化12h； 放入ddH2O中 说 明 书 1/5 页 4 CN 106729994 A 4 透析， 在磁力搅拌器搅拌状态下隔夜； 获得RGD肽溶液； 0011 (2)将种植体表面打磨， 清洗， 烘干； 。
13、用50100 mTiO2微粒对种植体表面进行喷砂 处理； 再置于氢氟酸与盐酸组成的混合酸蚀剂中进行表面刻蚀处理， 取出种植体超声清洗， 干燥； 再将种植体置于60、 5mol/L NaOH溶液孵育24-48h， 用水超声清洗备用； 0012 (3)将步骤(2)所述的牙种植体浸没于0.55mg/ml的壳聚糖溶液中1020min， 以 使牙种植体表面带上正电荷； 再用去离子水充分清洗； 0013 (4)将步骤(3)所述的牙种植体浸没于步骤(1)所述的RGD肽溶液中3h以上； 或浸没 于浓度为lmg/ml的AMP复合物溶液中510min， 以使牙种植体表面带上负电荷； 再用去离子 水充分清洗； 00。
14、14 根据需要组装的层数， 重复步骤(3)、 (4)和(3)即可得到带有不同层数涂层的牙种 植体； 0015 (5)将步骤(4)所述的牙种植体在浓度为2mg/mL的硫酸软骨素硫酸钠盐溶液中浸 泡515min， 溶液体系控制pH值为6， 再用去离子水充分清洗后自然干燥； 再将涂覆有硫酸 软骨素的牙种植体浸泡于pH值为7， 浓度为0.5mg/mL的抗菌肽溶液中515min， 再用去离子 水充分清洗后自然干燥， 获得涂覆有硫酸软骨素层-抗菌肽层复合层的材料。 0016 上述技术方案中， 所述RGD是Arg-Gly-Asp的短肽序列， 由精氨酸、 甘氨酸和天冬氨 酸组成； 0017 所述EDCHCl为。
15、1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐， 英文名称： 1- (3-Dimethylaminopropyl)-3-ethylcarbodiimide hydrochloride； 0018 所述NHS为N-羟基琥珀酰亚胺， 英文名称:N-Hydroxysuccinimide； 0019 所述AMP为阳离子抗菌短肽， 英文名称:cationic antimicrobial peptides。 0020 对于上述技术方案， 优选的情况下， 所述的具有壳聚糖-RGD复合涂层的种植体活 性表面， 其中， 所述的清洗是指去离子水， 乙醇和丙酮超声清洗， 用氮气吹干后， 放于真空干 燥箱中， 在6。
16、0的条件下干燥24小时。 0021 对于上述技术方案， 优选的情况下， 所述的具有壳聚糖-RGD复合涂层的种植体活 性表面， 其中， 所述的壳聚糖的脱乙酰度为5098， Mw为1001500kDa。 0022 对于上述技术方案， 优选的情况下， 所述的具有壳聚糖-RGD复合涂层的种植体活 性表面， 其中， 所述的壳聚糖溶液为将壳聚糖溶解在0.33的乙酸溶液中， 配成0.5 5mg/ml的壳聚糖溶液， 将所得溶液与液体石蜡混合， 体积比为0.10.4， 并加入体积浓度为 0.51的司盘80， 同时加入分散剂硬脂酸镁， 司盘80与硬脂酸镁的质量比为24 1， 搅拌 所得油包水乳液， 向其中加入51。
17、0mg/ml的交联剂香草醛1ml， 4060搅拌状态下反应 46小时后； 静置取上清液； 再将所得的壳聚糖微粒以水悬浮， 添加少量的冰醋酸溶液， 磁 力搅拌器搅拌条件下， 再加入NaCl， 使其终浓度达到0.15M； 该溶液带正电荷。 0023 对于上述技术方案， 优选的情况下， 所述的具有壳聚糖-RGD复合涂层的种植体活 性表面， 其中， 所述静置取上清液是指， 静置12小时以上分离油水相， 取下层水溶液， 调节pH 值为89， 离心除去沉淀物， 取上清液得到壳聚糖微粒悬浮液。 0024 对于上述技术方案， 优选的情况下， 所述的具有壳聚糖-RGD复合涂层的种植体活 性表面， 其中， 所述浓。
18、度为lmg/ml的AMP复合物溶液的配置方法为： 所述浓度为lmg/ml的AMP 复合物溶液的配置方法为： 秤取50mg AMP复合物粉末加至50ml的灭菌后去离子水中， 搅拌 说 明 书 2/5 页 5 CN 106729994 A 5 充分至完全溶解， 加冰醋酸调pH为5.0， 此溶液带有正电荷。 0025 本发明的创新特征是： 0026 本发明所制备的带有不同层数涂层的牙种植体。 其涂层主要依靠阳离子与阴离子 相互之间的静电引力， 在种植体固体表面形成有序排列的分子涂层， 因为壳聚糖和RGD层或 AMP复合物层是具有良好生物降解性和生物相容性的生物材料。 由于表层硫酸软骨素层-抗 菌肽层。
19、复合层结构的存在， 具有持久、 高效的杀菌、 抗感染能力， 其抗菌、 抗凋亡活性， 能够 支持多种细胞(如成骨细胞、 软骨细胞)的粘附、 存活、 生长与分化， 具有广阔的应用前景。 具体实施方式 0027 下述非限制性实施例可以使本领域的普通技术人员更全面地理解本发明， 但不以 任何方式限制本发明。 任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明披露的技术范围内， 根据 本发明的技术方案及其发明构思进行等同替换或改变均属于本发明保护范畴。 0028 配置浓度为lmg/ml的AMP复合物溶液； 0029 秤取50mg AMP复合物粉末加至50ml的灭菌后去离子水中， 搅拌充分至完全溶解， 加冰醋酸调pH为。
20、5.0， 此溶液带有正电荷。 0030 配置浓度为0.5mg/mL抗菌肽溶液 0031 称取5mg抗菌肽， 将其溶解于10mL去离子水中， 制备成pH值为7， 浓度为0.5mg/mL抗 菌肽溶液。 0032 配置RGD肽溶液 0033 秤取100mg RGD肽加至10ml的浓度为1的醋酸-醋酸钠缓冲液中； 缓慢搅拌至溶 解后， 加入EDCHCl 500mg， 再加入NHS 250mg， 经过磁力搅拌器活化12h； 放入ddH2O中透 析， 在磁力搅拌器搅拌状态下隔夜获得RGD肽溶液； 0034 实施例1 0035 (1)将表面为二氧化钛层的牙种植体， 依次用去离子水， 乙醇和丙酮超声清洗， 用。
21、 氮气吹干后， 放于真空干燥箱中， 在60的条件下干燥24小时， 放置备用； 0036 (2)将壳聚糖溶解在0.3的乙酸溶液中， 配成0.5mg/ml的壳聚糖溶液， 所述的壳 聚糖的脱乙酰度为50， Mw为1000kDa。 0037 (3)将步骤(2)所得溶液与液体石蜡混合， 体积比为0.1， 并加入体积浓度为0.5 的司盘80， 同时加入分散剂硬脂酸镁， 司盘80与硬脂酸镁的质量比为2 1， 室温下搅拌1小时 以上， 形成均匀的油包水乳液； 0038 (4)在将步骤(3)所得油包水乳液中加入5mg/ml的交联剂香草醛1ml， 40搅拌状 态下反应4小时， 得到壳聚糖微粒； 0039 (5)将。
22、步骤(4)所得产物静置12小时以上分离油水相， 取下层水溶液， 调节pH值为 8， 离心除去沉淀物， 取上清液得到壳聚糖微粒悬浮液 0040 (6)向去离子水中加入步骤(5)所得的壳聚糖微粒悬浮液， 添加lml的冰醋酸溶液， 磁力搅拌器搅拌条件下， 再加入NaCl， 使其终浓度达到0.15M； 该溶液带正电荷； 0041 实施例2 0042 (1)将表面为二氧化钛层的牙种植体， 依次用去离子水， 乙醇和丙酮超声清洗， 用 氮气吹干后， 放于真空干燥箱中， 在60的条件下干燥24小时， 放置备用； 说 明 书 3/5 页 6 CN 106729994 A 6 0043 (2)将壳聚糖溶解在3的乙。
23、酸溶液中， 配成5mg/ml的壳聚糖溶液， 所述的壳聚糖 的脱乙酰度为98， Mw为1500kDa。 0044 (3)将步骤(2)所得溶液与液体石蜡混合， 体积比为0.4， 并加入体积浓度为1的 司盘80， 同时加入分散剂硬脂酸镁， 司盘80与硬脂酸镁的质量比为4 1， 室温下搅拌1小时以 上， 形成均匀的油包水乳液； 0045 (4)在将步骤(3)所得油包水乳液中加入10mg/ml的交联剂香草醛1ml， 60搅拌状 态下反应6小时， 得到壳聚糖微粒； 0046 (5)将步骤(4)所得产物静置12小时以上分离油水相， 取下层水溶液， 调节pH值为 9， 离心除去沉淀物， 取上清液得到壳聚糖微粒。
24、悬浮液 0047 (6)向去离子水中加入步骤(5)所得的壳聚糖微粒悬浮液， 添加lml的冰醋酸溶液， 磁力搅拌器搅拌条件下， 再加入NaCl， 使其终浓度达到0.15M； 该溶液带正电荷； 0048 实施例3 0049 将种植体表面打磨， 清洗， 烘干； 用100 mTiO2微粒对种植体表面进行喷砂处理； 再 置于氢氟酸与盐酸组成的混合酸蚀剂中进行表面刻蚀处理， 取出种植体超声清洗， 干燥； 再 将种植体置于60、 5mol/L NaOH溶液孵育24h， 用水超声清洗备用。 0050 实施例4 0051 (1)将实施例3处理得到的牙种植体浸没于上文实施例2所述的壳聚糖溶液中10 20min， 。
25、以使牙种植体表面带上正电荷； 再用去离子水充分清洗； 0052 (2)将步骤(1)所述的牙种植体浸没于RGD肽溶液中3h以上； 或浸没于浓度为lmg/ ml的AMP复合物溶液中510min， 以使牙种植体表面带上负电荷； 再用去离子水充分清洗； 0053 (3)根据需要组装的层数， 重复步骤(1)、 (2)和(1)即可得到带有不同层数涂层的 牙种植体； 0054 (4)将步骤(3)所述的牙种植体在浓度为2mg/mL的硫酸软骨素硫酸钠盐溶液中浸 泡15min， 溶液体系控制pH值为6， 再用去离子水充分清洗后自然干燥； 再将涂覆有硫酸软骨 素的牙种植体浸泡于pH值为7， 浓度为0.5mg/mL的。
26、抗菌肽溶液中5min， 再用去离子水充分清 洗后自然干燥。 0055 实施例5 0056 将实施例4中根据需要组装不同层数涂层的牙种植体， 在浓度为2mg/mL的硫酸软 骨素硫酸钠盐溶液(带有负电荷的多糖溶液)中浸泡1020min， 溶液体系控制pH值为6， 再 用去离子水充分清洗后自然干燥； 0057 将涂覆该有硫酸软骨素的材料浸泡于pH值为7， 浓度为0.5mg/mL的抗菌肽溶液中 15min， 再用去离子水充分清洗后自然干燥， 获得涂覆有硫酸软骨素层-抗菌肽层复合层的 材料。 0058 针对上述方法制备获得的牙种植体， 进行表面接触角分析， 其结果从亲水性和润 湿性上也证实了涂层的存在。。
27、 0059 根据分析可知， 本发明所制备的带有不同层数涂层的牙种植体。 其涂层主要依靠 阳离子与阴离子相互之间的静电引力， 在种植体固体表面形成有序排列的分子涂层， 因为 壳聚糖和RGD或AMP复合物是具有良好生物降解性和生物相容性的生物材料。 再加上表层硫 酸软骨素层-抗菌肽层复合层结构的存在， 该牙种植体必定具有持久、 高效的杀菌、 抗感染 说 明 书 4/5 页 7 CN 106729994 A 7 能力， 其抗菌、 抗凋亡活性， 能够支持多种细胞(如成骨细胞、 软骨细胞)的粘附、 存活、 生长 与分化， 具有广阔的应用前景。 在种植体临床应用中， 促进种植体.骨组织界面愈合、 提高骨 整合率和提高种植体初期稳定性的益处是显而易见的。 说 明 书 5/5 页 8 CN 106729994 A 8 。