抗FcRH5抗体和免疫偶联物及使用方法关于序列表
本申请含有序列表，已经EFS-Web提交且通过述及完整收入本文。2011
年9月9日创建的所述ASCII拷贝命名为GNE0350P.txt，而且大小为92,654字
节。
发明领域
本发明致力于对于哺乳动物中造血肿瘤(hematopoietic tumor)治疗有用
的组合物和使用那些组合物治疗哺乳动物中造血肿瘤的方法。
发明背景
恶性肿瘤(癌症)是美国第二位死因，排在心脏病之后(Boring等，CA
Cancel J.Clin.43：7(1993))。癌症的特征在于衍生自正常组织的赘生性细胞或
异常细胞的数目增加，所述细胞增殖而形成肿瘤块，这些赘生性肿瘤细胞侵
入邻近组织，和产生经称作转移的过程最终经血液或淋巴系统扩散至局部淋
巴结和远端部位。在癌性状态中，细胞在正常细胞不会生长的条件下增殖。
癌症自身表现为极其多种形式，特征在于不同程度的侵入性和攻击性。
涉及造血(生成血液的细胞要素(诸如淋巴细胞、白细胞、血小板、红
细胞和天然杀伤细胞)的过程)期间生成的细胞的癌症称作造血癌症。能在
血液和淋巴组织中找到且对免疫应答至关重要的淋巴细胞分成两大类淋巴
细胞：B淋巴细胞(B细胞)和T淋巴细胞(T细胞)，它们分别介导体液和细
胞介导的免疫。
B细胞在骨髓内成熟，然后离开骨髓并在其细胞表面上表达抗原结合抗
体。当幼稚B细胞初次遭遇其膜结合抗体对之特异性的抗原时，该细胞开始
快速分裂且其后代分化成记忆B细胞和称作“浆细胞”的效应细胞。记忆B细胞
具有较长的寿命并继续表达与最初的亲本细胞具有相同特异性的膜结合抗
体。浆细胞不生成膜结合抗体，但改为生成可分泌形式的抗体。分泌型抗体
是体液免疫的主要效应分子。
T细胞在胸腺内成熟，胸腺为未成熟T细胞的增殖和分化提供环境。在T
细胞成熟期间，T细胞经历基因重排(这生成T细胞受体)及正和负选择(这
有助于决定成熟T细胞的细胞表面表型)。成熟T细胞的特征性细胞表面标志
物是CD3:T细胞受体复合物和共同受体CD4或CD8之一。
在试图发现癌症疗法的有效细胞靶物的尝试中，研究人员试图鉴定与一
种或多种正常的非癌性细胞相比在一种或多种特定类型的癌细胞的表面上
特异性表达的跨膜的或以其它方式与膜结合的多肽。通常，此类膜结合多肽
在癌细胞表面上表达的丰度要高于非癌性细胞表面上的。此类膜结合细胞表
面抗原多肽的鉴定产生了特异性靶向癌细胞的能力，供经基于抗体的疗法进
行的破坏用。在这点上，注意到基于抗体的疗法在某些癌症的治疗中证明是
非常有效的。例如，![]()
和![]()
(二者都来自Genentech公
司(South San Francisco，California))是分别已经成功用于治疗乳腺癌和非何
杰金氏淋巴瘤的抗体。更具体的说，![]()
是重组DNA衍生的人源
化单克隆抗体，其选择性结合人表皮生长因子受体2(HER2)原癌基因的胞外
结构域。在25-30％的原发性乳腺癌中观察到HER2蛋白过表达。![]()
是遗传工程嵌合鼠/人单克隆抗体，其针对在正常和恶性B淋巴细胞的表面上
找到的CD20抗原。这两种抗体都是在CHO细胞中重组生产的。
在试图发现癌症疗法的有效细胞靶物的其它尝试中，研究人员试图鉴定
(1)与一种或多种特定类型的非癌性正常细胞相比由一种或多种特定类型的
癌细胞特异性生成的非膜结合的多肽，(2)由癌细胞以显著高于一种或多种非
癌性细胞的表达水平生成的多肽，或(3)其表达特异性局限于只有一种(或非
常有限数目的不同)组织类型的多肽，所述组织处于癌性和非癌性两种状态
(例如正常前列腺和前列腺肿瘤组织)。此类多肽可以保持胞内定位，或者
可以由癌细胞分泌。此外，此类多肽可以是不是由癌细胞自身表达的，而是
由生成和/或分泌对癌细胞具有强化或生长增强效果的多肽的细胞表达的。此
类分泌多肽常常是给癌细胞提供胜过正常细胞的生长优势的蛋白质，而且包
括诸如例如血管发生因子、细胞粘附因子、生长因子等等的物质。此类非膜
结合多肽的拮抗剂的鉴定预期会充当此类癌症治疗的有效治疗剂。而且，此
类多肽的表达样式的鉴定对于哺乳动物中特定癌症的诊断会是有用的。
尽管在哺乳动物癌症疗法中有了上述进展，对于能够分别检测哺乳动物
中肿瘤的存在和有效抑制肿瘤性细胞生长的别的治疗剂仍然存在很大的需
要。因此，本发明的一个目标是鉴定其表达特异性地局限于处于癌性和非癌
性状态的单一(或非常有限数目的不同)组织类型即造血组织的，细胞膜结
合的、分泌的或胞内的多肽，及使用那些多肽及其编码核酸来生成在哺乳动
物中造血癌症的治疗性处理和/或检测中有用的组合物。
染色体1q21的异常在B细胞恶性(包括B细胞淋巴瘤和骨髓瘤)中是常
见的，但是这些畸变靶向的基因大多不知道。涉及带1q21-q23的染色体异常
是B细胞非何杰金氏淋巴瘤和多发性骨髓瘤二者中最频繁的遗传损害之一。
在非何杰金氏淋巴瘤亚型中，1q21-q23处的易位断裂点(包括易位和重复)
已有报告，常常作为伯基特淋巴瘤中和边缘区B细胞淋巴瘤中的滤泡和弥漫
大B细胞淋巴瘤(DLCL)中的单一染色体异常。通过克隆骨髓瘤细胞系中的
t(1:14)(q21:q32)染色体易位的断裂点，鉴定出两种基因，称作免疫球蛋白超
家族受体易位有关(IRTA)1和IRTA2。IRTA2与鉴定为BXMAS1(Nakayama et
al.，Biochm.Biophys.Res.Commun.285：830-7，2001)和FcRH5(Davis et al.，
Proc.Natl.Acad.Sci.USA 98：9772-7，2001)的序列相同。IRTA1和IRTA2都是
相关基因家族IRTA的成员。
FcRH5(或IRTA2)是一种与Fc受体家族具有同源性的细胞表面受体。
它在正常情况中在成熟B细胞中表达，而且在外周淋巴样器官中具有与
FcRH4(IRTA1)不同的分布。IRTA1在边缘区B细胞中表达，而IRTA2还在
生发中心中央细胞中和在免疫母细胞中表达。IRTA2表达在具有1q21异常的
多发性骨髓瘤和伯基特淋巴瘤细胞系中失调(参见Miller et al.，Blood
99：2662-2669，2002)。B细胞恶性中高频率涉及1q21结构重排提示IRTA1和
IRTA2对于这些疾病的发病机理是至关重要的(参见已公布的PCT申请No.
WO 01/38490；已公布的美国专利申请No.20080292632，通过述及将其完整
内容收入本文)(还可参见Polson，et al.Int Immunol.2006 Sep；18(9)：1363-73)。
鉴于FcRH5的表达，生成针对FcRH5抗原的治疗性抗体是有益的，其在
施用给患者时(尤其是用于长期治疗)产生最低限度的抗原性或不产生抗原
性。本发明满足了这种需要和其它需要。本发明提供了抗FcRH5抗体，其克
服了当前治疗性组合物的限制且提供别的优点，这根据下文详述是显而易见
的。
抗体-药物偶联物(ADC)，即免疫偶联物在局部递送细胞毒性剂或细胞生
长抑制剂，即在治疗癌症中杀伤或抑制肿瘤细胞的药物中的应用(Lambert，
J.(2005)Curr.Opinion in Pharmacology 5：543-549；Wu等(2005)Nature
Biotechnology 23(9)：1137-1146；Payne，G.(2003)Cancer Cell 3：207-212；Syrigos
和Epenetos(1999)Anticancer Research 19：605-614；Niculescu-Duvaz和
Springer(1997)Adv.Drug Del.Rev.26：151-172；US 4975278)能够将药物模块
靶向递送至肿瘤并且在其中发生胞内蓄积，其中全身给予这些未偶联的药物
活性剂在对肿瘤细胞消除的同时也对正常细胞产生了不可接受水平的毒性
(Baldwin等(1986)Lancet pp.(Mar.15，1986)：603-05；Thorpe，(1985)″Antibody
Carriers Of Cytotoxic Agents In Cancer Therapy：A Review，″-Monoclonal
Antibody′84：Biological and Clinical Applications，A.Pinchera等(ed.s)，pp.
475-506)。提高ADC的治疗指数(即最高的功效与最低的毒性)的努力已经
集中到多克隆抗体(Rowland et al(1986)Cancer Immunol.Immunother.，
21：183-87)和单克隆抗体(mAbs)的特异性以及药物-连接和药物-释放特性上
(Lambert，J.(2005)Curr.Opinion in Pharmacology 5：543-549)。用于抗体-药物
偶联物的药物模块包括：细菌蛋白质毒素，诸如白喉毒素，植物蛋白质毒素，
诸如蓖麻毒素；小分子，诸如auristatin、格尔德霉素(geldanamycin)(Mandler
等(2000)J.of the Nat.Cancer Inst.92(19)：1573-1581；Mandler等(2000)
Bioorganic & Med.Chem.Letters 10：1025-1028；Mandler等(2002)Bioconjugate
Chem.13：786-791)；美登木素生物碱(maytansinoids)(EP 1391213；Liu等
(1996)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 93：8618-8623)；加利车霉素(calicheamicin)
(Lode等(1998)Cancer Res.58：2928；Hinman等(1993)Cancer Res.
53：3336-3342)；柔红霉素(daunomycin)、多柔比星(doxorubicin)、甲氨蝶
呤(methotrexate)和长春地辛(vindesine)(Rowland等(1986)，见上文)。
药物模块可以影响细胞毒性和细胞抑制性机制，包括微管蛋白结合、DNA
结合或拓扑异构酶抑制。某些细胞毒性药物在与大的抗体或蛋白质受体配体
偶联时趋向于失活或活性降低。
Auristatin肽类，auristatin E(AE)和monomethyl auristatin(MMAE)，多拉
司他汀(dolastatin)的合成类似物(WO 02/088172)作为药物模块与下列各项
偶联：(i)嵌合单克隆抗体cBR96(对癌上的Lewis Y具有特异性)；(ii)对血液
恶性肿瘤上的CD30具有特异性的cAC10(Klussman，等(2004)，Bioconjugate
Chemistry 15(4)：765-773；Doronina等(2003)Nature Biotechnology
21(7)：778-784；Francisco等(2003)Blood 102(4)：1458-1465；US 2004/0018194；
(iii)用于治疗表达CD20的癌症和免疫病变的抗-CD20抗体，诸如B细胞单克
隆抗体(rituxan)(WO 04/032828)；(iv)用于治疗结肠直肠癌的抗-EphB2R
抗体2H9(Mao等(2004)Cancer Research 64(3)：781-788)；(v)E-选择蛋白抗体
(Bhaskar等(2003)Cancer Res.63：6387-6394)；(vi)曲妥单抗(trastuzumab，
![]()
US 2005/0238649)；和(vi)其它抗-CD30抗体(WO
03/043583)。auristatin E的变体披露在US 5767237和US 6124431中。与单克隆
抗体偶联的Monoemethyl auristatin E披露在Senter等的Proceedings of the
American Association for Cancer Research，Volume 45，Abstract Number 623中，
2004年3月28日提交。Auristatin类似物MMAE和MMAF与各种抗体偶联(US
2005/0238649)。
常规附着方式，即通过共价键连接，药物模块与抗体一般产生不均一的
(heterogeneous)分子混合物，其中药物模块结合在抗体上的许多位点上。例
如，细胞毒性药物一般与抗体通过抗体的通常大量的赖氨酸残基偶联，从而
产生不均一的抗体-药物偶联物混合物。根据反应条件的不同，所述的不均
一混合物一般含有抗体0-约8个或8个以上附着的药物模块的分布。此外，
在具有特定整数比的药物模块与抗体的偶联物各亚组内可能是不均一的混
合物，其中药物模块结合在抗体上的不同位点上。分析和制备方法可能不足
以分离和表征由偶联反应产生的不均一混合物中的抗体-药物偶联物类分
子。抗体为较大的复杂的并且结构多样的生物分子，通常带有许多反应性官
能基。其与接头试剂和药物-接头中间体的反应性取决于如下因素：诸如pH、
浓度、盐浓度和共溶剂。此外，多步骤偶联过程因控制反应条件和表征反应
剂和中间体方面的困难而可能不可再现。
半胱氨酸硫醇在中性pH具有反应性，这与在接近pH 7时质子化和亲核性
降低的大部分胺类不同。由于游离硫醇(RSH，硫氢基)具有相对的反应性，
所以带有半胱氨酸残基的蛋白质通常以其作为二硫化物-连接的寡聚体的氧
化形式存在或具有内部桥连的二硫化物基团。胞外蛋白一般不带有游离硫醇
(Garman，1997，Non-Radioactive Labelling：A Practical Approach，Academic
Press，London，55页上)。抗体半胱氨酸硫醇一般对亲电子偶联反应剂比对抗
体胺或羟基更具反应性，即更具亲核性。已经通过遗传改造将半胱氨酸残基
引入了蛋白质以便形成与配体的共价结合物或形成新的分子内二硫键(Better
等(1994)J.Biol.Chem.13：9644-9650；Bernhard等(1994)Bioconjugate Chem.
5：126-132；Greenwood等(1994)Therapeutic Immunology 1：247-255；Tu等(1999)
Proc.Natl.Acad.Sci USA 96：4862-4867；Kanno等(2000)J.of Biotechnology，
76：207-214；Chmura等(2001)Proc.Nat.Acad.Sci.USA 98(15)：8480-8484；US
6248564)。然而，通过使蛋白质的不同氨基酸残基突变成半胱氨酸氨基酸来
改造半胱氨酸硫醇可能存在问题，特别是就未配对的(游离Cys)残基或那些相
对易于进行反应或氧化的残基而言。在蛋白质的浓溶液中，无论是在大肠杆
菌(E.coli)的周质中，还是在培养物上清液或部分或完全纯化的蛋白质中，
蛋白质表面上的未配对的Cys残基可以配对并且氧化成分子内二硫化物和由
此的蛋白质二聚体或多聚体。二硫化物二聚体的形成使得新的Cys无法与药
物、配体或其它标记发生偶联反应。此外，如果蛋白质以氧化方式在新改造
的Cys和已存在的Cys残基之间形成分子内二硫键，那么两种Cys硫醇基团对
活性位点的参与和相互作用而言均无法利用。此外，可以通过错误折叠或丧
失三级结构使蛋白质失活或赋予其非特异性(Zhang等(2002)Anal.Biochem.
311：1-9)。
半胱氨酸改造抗体已经设计成Fab抗体片段(thioFab)和表达成全长IgG单
克隆(thioMab)抗体(Junutula，J.R.et al.(2008)J Immunol Methods 332：41-52；
US 2007/0092940，通过述及收录其内容)。ThioFab和ThioMab抗体经新引入
的半胱氨酸硫醇处的接头与硫醇反应性接头试剂和药物-接头试剂偶联以制
备抗体药物偶联物(Thio ADC)。
通过述及完整收录本文中引用的所有参考文献(包括专利申请和出版
物)。
发明概述
本发明提供了抗FcRH5抗体或其功能性片段，及其在造血肿瘤治疗中的
使用方法。
一方面，本发明提供了一种与任何上文或下文所述多肽结合(优选特异
性结合)的抗体。任选的是，所述抗体是单克隆抗体、抗体片段(包括Fab、
Fab′、F(ab′)2和Fv片段)、双抗体、单域抗体、嵌合抗体、人源化抗体、单链
抗体或竞争性抑制抗FcRH5多肽抗体结合其相应抗原性表位的抗体。本发明
的抗体可任选偶联至生长抑制剂或细胞毒剂，诸如毒素，包括例如auristatin、
美登木素生物碱、多拉司他汀衍生物或加利车霉素、抗生素、放射性同位素、
溶核酶、诸如此类。本发明的抗体可任选在CHO细胞或细菌细胞中生成，且
优选诱导它们所结合的细胞死亡。出于检测目的，本发明的抗体可以是可检
测标记的，附着至固体支持物的，诸如此类。
一方面，本发明提供了一种人源化抗FcRH5抗体，其中该抗体对FcRH5
的单价亲和力(例如Fab片段形式的抗体对FcRH5的亲和力)或二价形式的
该抗体对FcRH5的亲和力(例如IgG片段形式的抗体对FcRH5的亲和力)分
别与鼠抗体(例如Fab片段形式或IgG片段形式的鼠抗体对FcRH5的亲和力)
或嵌合抗体(例如Fab片段形式或IgG片段形式的嵌合抗体对FcRH5的亲和
力)的单价亲和力或其二价形式的亲和力基本上相同，分别低于鼠抗体(例
如Fab片段形式或IgG片段形式的鼠抗体对FcRH5的亲和力)或嵌合抗体(例
如Fab片段形式或IgG片段形式的嵌合抗体对FcRH5的亲和力)的单价亲和力
或其二价形式的亲和力，或分别高于鼠抗体(例如Fab片段形式或IgG片段形
式的鼠抗体对FcRH5的亲和力)或嵌合抗体(例如Fab片段形式或IgG片段形
式的嵌合抗体对FcRH5的亲和力)的单价亲和力或其二价形式的亲和力，所
述鼠抗体或嵌和抗体包含图9(SEQ ID NO：19)和图10(SEQ ID NO：21)所示
轻链和重链可变域序列，由图9(SEQ ID NO：19)和图10(SEQ ID NO：21)所示
轻链和重链可变域序列组成，或基本上由图9(SEQ ID NO：19)和图10(SEQ
ID NO：21)所示轻链和重链可变域序列组成。
另一方面，本发明提供了一种人源化抗FcRH5抗体，其中二价形式的该
抗体对FcRH5的亲和力(例如IgG形式的该抗体对FcRH5的亲和力)是0.4nM、
0.2nM或0.5nM。
一方面，提供了一种与FcRH5结合的抗体，其中该抗体包含至少一种、
两种、三种、四种、五种或六种选自下组的HVR：
(i)HVR-L1，其包含序列KASQDVSTAVA(SEQ ID NO：26)
(ii)HVR-L2，其包含序列SASYRYT(SEQ ID NO：27)
(iii)HVR-L3，其包含序列QQHFSSPRT(SEQ ID NO：28)
(iv)HVR-H1，其包含序列GFTFSSYAVS(SEQ ID NO：35)
(v)HVR-H2，其包含序列ATISSGGSLTFYLDSVR(SEQ ID NO：36)和
(vi)HVR-H3，其包含序列PIPDYYALDY(SEQ ID NO：37)。
在另一个实施方案中，所述HVR-H2具有序列SEQ ID NO：36。在另一个
实施方案中，所述抗体包含人κ亚组1共有框架序列。在另一个实施方案中，
所述抗体包含重链人亚组III共有框架序列。在另一个实施方案中，所述抗体
包含与选自SEQ ID NO：19的氨基酸序列具有至少90％氨基酸序列同一性的
轻链可变域。在一个实施方案中，所述抗体包含与选自SEQ ID NO：21的氨
基酸序列具有至少90％氨基酸序列同一性的重链可变域。在另一个实施方案
中，所述抗体包含与选自SEQ ID NO：19的氨基酸序列具有至少90％氨基酸序
列同一性的轻链可变域。
在另一个实施方案中，所述抗体包含与选自SEQ ID NO：21的氨基酸序
列具有至少90％氨基酸序列同一性的重链可变域。在一个实施方案中，所述
抗体包含重链可变域，该重链可变域包含一种、两种、三种或四种选自SEQ
ID NO：31、32、33和34的框架氨基酸序列。在其它实施方案中，所述抗体包
含轻链可变域，该轻链可变域包含一种、两种、三种或四种选自SEQ ID NO：
22、23、24和25的框架氨基酸序列。在另一个实施方案中，所述抗体包含重
链可变域包含一种、两种、三种或四种与选自SEQ ID NO：31、32、33和34
的氨基酸序列具有至少90％氨基酸序列同一性的框架氨基酸序列。在其它实
施方案中，所述抗体包含轻链可变域包含一种、两种、三种或四种与选自SEQ
ID NO：22、23、24和25的氨基酸序列具有至少90％氨基酸序列同一性的框架
氨基酸序列。
一方面，提供了结合FcRH5的抗体，其中所述抗体包含至少一种变异
HVR，其中所述变异HVR序列包含SEQ ID NO：26、27、28、35、36或37所
示序列中的至少一个残基的修饰。在另一个实施方案中，所述修饰是替代、
插入或删除。
在另一个实施方案中，框架序列的至少一部分是人共有框架序列。
另一方面，本发明提供了一种人源化抗FcRH5抗体，其中该抗体对人
FcRH5的单价亲和力与包含图9(SEQ ID NO：19)和图10(SEQ ID NO：21)所
示轻链和重链可变序列的鼠抗体的单价亲和力基本上相同。
一方面，本发明提供了一种人源化抗FcRH5抗体，其中该抗体对人FcRH5
的单价亲和力比包含图9(SEQ ID NO：19)和图10(SEQ ID NO：21)所示轻链
和重链可变序列的鼠抗体或嵌合抗体的单价亲和力高至少1、2、3、4、5、6、
7、8、9或10倍。
另一方面，本发明提供了一种人源化抗FcRH5抗体，其中该抗体对人
FcRH5的单价亲和力比包含图9(SEQ ID NO：18)和图10(SEQ ID NO：20)所
示轻链和重链可变序列的鼠抗体或嵌合抗体的单价亲和力低至少1、2、3、4、
5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、
35、40、45、50、55或60倍。
另一方面，本发明提供了一种人源化抗FcRH5抗体，其中二价形式的该
抗体对人FcRH5的亲和力与二价形式的且包含图9(SEQ ID NO：18)和图10
(SEQ ID NO：20)所示轻链和重链可变序列的鼠抗体的亲和力基本上相同。
一方面，本发明提供了一种人源化抗FcRH5抗体，其中二价形式的该抗
体对人FcRH5的亲和力比二价形式的且包含图9(SEQ ID NO：18)和图10
(SEQ ID NO：20)所示轻链和重链可变序列的鼠抗体或嵌合抗体的亲和力高
至少1、2、3、4、5、6、7、8、9或10倍。
另一方面，本发明提供了一种人源化抗FcRH5抗体，其中二价形式的该
抗体对人FcRH5的亲和力比二价形式的且包含图9(SEQ ID NO：18)和图10
(SEQ ID NO：20)所示轻链和重链可变序列的鼠抗体或嵌合抗体的亲和力低
至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、
19、20、25、30、35、40、45、50、55或60倍。
另一方面，本发明提供了一种人源化抗FcRH5抗体，其中二价形式的该
抗体对人FcRH5的亲和力是0.4nM。在一个实施方案中，二价形式的该抗体
对人FcRH5的亲和力是0.4nM+/-.04。
另一方面，本发明提供了一种人源化抗FcRH5抗体，其中二价形式的该
抗体对人FcRH5的亲和力是0.2nM。在一个实施方案中，二价形式的该抗体
对人FcRH5的亲和力是0.2nM+/-.02。
另一方面，本发明提供了一种人源化抗FcRH5抗体，其中二价形式的该
抗体对人FcRH5的亲和力是0.5nM。在一个实施方案中，二价形式的该抗体
对人FcRH5的亲和力是0.5nM+/-0.1。
在所有方面，所述结合亲和力表述成Kd值。另一方面，所述结合亲和力
是通过Biacore或放射免疫测定法测量的。
另一方面，本发明提供了一种人源化抗FcRH5抗体，其中该人源化抗体
在偶联至细胞毒剂时抑制肿瘤细胞生长。
另一方面，本发明提供了一种人源化抗FcRH5抗体，其中该人源化抗体
在偶联至细胞毒剂时抑制肿瘤细胞生长。
在一个实施方案中，所述人源化抗体和嵌合抗体均是单价的或二价的。
在另一个实施方案中，所述人源化抗体和嵌合抗体均包含连接至Fc区的单一
Fab区
另一方面，本发明提供了一种抗体，其包含重链可变域，该重链可变域
包含图11(SEQ ID NO：35-37)所示HVR1-HC、HVR2-HC和/或HVR3-HC序
列。在一个实施方案中，所述可变域包含图11(SEQ ID NO：31-34)所示
FR1-HC、FR2-HC、FR3-HC和/或FR4-HC序列。在另一个实施方案中，所述
抗体包含图11(SEQ ID NO：38和/或39)所示CH1和/或Fc序列。
另一方面，本发明提供了一种抗体，其包含轻链可变域，该轻链可变域
包含图11(SEQ ID NO：26-28)所示HVR1-LC、HVR2-LC和/或HVR3-LC序列。
在一个实施方案中，所述可变域包含图11(SEQ ID NO：22-25)所示FR1-LC、
FR2-LC、FR3-LC和/或FR4-LC序列。在另一个实施方案中，所述抗体包含图
11(SEQ ID NO：29)所示CL1序列。
一方面，本发明提供了一种多肽，其包含图10(SEQ ID NO：21)所示序
列。另一方面，本发明提供了一种多肽，其包含图9(SEQ ID NO：19)所示序
列。
另一方面，本发明提供了通过如下工艺制备的抗体，所述工艺包括：(a)
培养表达包含本文所述重链可变域和本文所述轻链可变域的抗体的细胞；并
(b)分离自所述培养的细胞分离所述抗体。
另一方面，本发明提供了一种抗体，其包含本文所述重链可变域和本文
所述轻链可变域。在一个实施方案中，所述抗体是单价的且包含Fc区。
一方面，本发明提供了一种多核苷酸，其编码本文所述抗体。在一个实
施方案中，本发明提供了一种载体，其包含所述多核苷酸。在另一个实施方
案中，本发明提供了一种宿主细胞，其包含所述载体。
一方面，本发明包括一种半胱氨酸改造抗FcRH5抗体，其包含一个或多
个游离半胱氨酸氨基酸和选自SEQ ID NO：41-44的序列。所述半胱氨酸改造
抗FcRH5抗体可以与FcRH5多肽结合。所述半胱氨酸改造抗FcRH5抗体可以
通过包括用半胱氨酸替换亲本抗FcRH5抗体的一个或多个氨基酸残基的方
法来制备。
一方面，本发明包括一种半胱氨酸改造抗FcRH5抗体，其包含一个或多
个游离半胱氨酸氨基酸，其中所述半胱氨酸改造抗FcRH5抗体与FcRH5多肽
结合且是通过包括用半胱氨酸替换亲本抗FcRH5抗体的一个或多个氨基酸
残基的方法制备的，其中所述亲本抗体包含至少一种选自下组的HVR序列：
(i)HVR-L1，其包含序列KASQDVSTAVA(SEQ ID NO：26)
(ii)HVR-L2，其包含序列SASYRYT(SEQ ID NO：27)
(iii)HVR-L3，其包含序列QQHFSSPRT(SEQ ID NO：28)
(iv)HVR-H1，其包含序列GFTFSSYAVS(SEQ ID NO：35)
(v)HVR-H2，其包含序列ATISSGGSLTFYLDSVR(SEQ ID NO：36)和
(vi)HVR-H3，其包含序列PIPDYYALDY(SEQ ID NO：37)。
所述半胱氨酸改造抗FcRH5抗体可以是单克隆抗体、抗体片段、嵌合抗
体、人源化抗体、单链抗体或竞争性抑制抗FcRH5多肽抗体结合其相应抗原
性表位的抗体。本发明的抗体可任选偶联至生长抑制剂或细胞毒剂，诸如毒
素，包括例如auristatin或美登木素生物碱。本发明的抗体可任选在CHO细胞
或细菌细胞中生成，且优选抑制它们所结合的细胞生长或增殖或诱导它们所
结合的细胞死亡。出于诊断目的，本发明的抗体可以是可检测标记的，附着
至固体支持物的，诸如此类。
一方面，本发明提供了制备本发明抗体的方法。例如，本发明提供了一
种制备FcRH5抗体(如本文中所定义的，其包括全长抗体及其片段)的方法，
所述方法包括在合适的宿主细胞中表达编码所述抗体(或其片段)的本发明
重组载体，并回收所述抗体。
另一方面，本发明提供了能够结合表达FcRH5的第一细胞和表达细胞表
面靶抗原的第二细胞的双特异性抗体。在一个实施方案中，所述第二细胞是
T细胞。在一个实施方案中，所述细胞表面靶抗原是CD3。在某些实施方案
中，所述双特异性抗体是隆起入空腔抗体(protruberance-into-cavity antibody)。
在一个实施方案中，所述双特异性抗体是无糖基化的。在一个实施方案中，
所述双特异性抗体是在大肠杆菌宿主细胞中生成的。在一个实施方案中，所
述双特异性抗体缺少一种或多种Fc效应器功能。在一个实施方案中，所述双
特异性抗体缺少ADCC活性。
一方面，本发明是一种药物配制剂，其包含本发明的抗体或本发明的抗
体-药物偶联物，及药学可接受稀释剂、载体或赋形剂。
一方面，本发明提供了一种制品，其包含容器；和装在该容器内的组合
物，其中所述组合物包含一种或多种本发明的FcRH5抗体。
一方面，本发明提供了一种试剂盒，其包含第一容器，其中装有包含一
种或多种本发明FcRH5抗体的组合物；及第二容器，其中装有缓冲液。
一方面，本发明提供了本发明的FcRH5抗体在制备用于治疗性和/或预防
性处理疾病(诸如癌症、肿瘤和/或细胞增殖性病症)的药物中的用途。
一方面，本发明提供了本发明的制品在制备用于治疗性和/或预防性处理
疾病(诸如癌症、肿瘤和/或细胞增殖性病症)的药物中的用途。
一方面，本发明提供了本发明的试剂盒在制备用于治疗性和/或预防性处
理疾病(诸如癌症、肿瘤和/或细胞增殖性病症)的药物中的用途。
一方面，本发明提供了一种抑制表达FcRH5的细胞生长的方法，所述方
法包括使所述细胞接触本发明的抗体，由此引起对所述细胞生长的抑制。在
一个实施方案中，所述抗体是偶联至细胞毒剂的。在一个实施方案中，所述
抗体是偶联至生长抑制剂的。
一方面，本发明提供了一种治疗性处理患有癌性肿瘤(所述癌性肿瘤包
含表达FcRH5的细胞)的哺乳动物的方法，所述方法包括给所述哺乳动物施
用治疗性有效量的本发明抗体，由此有效治疗所述哺乳动物。在一个实施方
案中，所述抗体是偶联至细胞毒剂的。在一个实施方案中，所述抗体是偶联
至生长抑制剂的。
一方面，本发明提供了一种用于治疗或预防与FcRH5表达升高有关的细
胞增殖性病症的方法，所述方法包括给需要此类治疗的受试者施用有效量的
本发明抗体，由此有效治疗或预防所述细胞增殖性病症。在一个实施方案中，
所述增殖性病症是癌症。在一个实施方案中，所述抗体是偶联至细胞毒剂的。
在一个实施方案中，所述抗体是偶联至生长抑制剂的。
一方面，本发明提供了一种用于抑制细胞生长的方法，其中所述细胞的
生长至少部分依赖于FcRH5的生长强化效应，所述方法包括使所述细胞接触
有效量的本发明抗体，由此抑制所述细胞的生长。在一个实施方案中，所述
抗体是偶联至细胞毒剂的。在一个实施方案中，所述抗体是偶联至生长抑制
剂的。
一方面，本发明提供了一种治疗性处理哺乳动物中的肿瘤的方法，其中
所述肿瘤的生长至少部分依赖于FcRH5的生长强化效应，所述方法包括使所
述细胞接触有效量的本发明抗体，由此有效治疗所述肿瘤。在一个实施方案
中，所述抗体是偶联至细胞毒剂的。在一个实施方案中，所述抗体是偶联至
生长抑制剂的。
一方面，本发明提供了一种治疗癌症的方法，包括给患者施用药物配制
剂，该药物配制剂包含本文所述免疫偶联物、可接受的稀释剂、载体或赋形
剂。
一方面，本发明提供了一种抑制B细胞增殖的方法，包括在允许下述免
疫偶联物结合至FcRH5的条件下使细胞暴露于包含本发明抗体的免疫偶联
物。
本发明的方法可进一步包括别的治疗步骤。例如在一个实施方案中，方
法进一步包括其中使所靶向的细胞和/或组织(例如癌细胞)暴露于放射治疗
或化疗剂的步骤。
一方面，本发明提供了如下的方法，其包括与有效量的另一治疗剂(诸
如抗血管发生剂、另一抗体、化疗剂、细胞毒剂、免疫抑制剂、前体药物、
细胞因子、细胞毒性放疗、类固醇、止吐药、癌症疫苗、镇痛药、或生长抑
制剂)组合地施用有效量的抗FcRH5抗体。例如，与抗癌剂或抗血管发生剂
组合地使用抗FcRH5抗体以治疗各种赘生性或非赘生性疾患。在具体的例子
中，与![]()
(bortezomib)、![]()
(lenalidomide)、他莫昔芬、来曲唑、
依西美坦、阿那曲唑、伊立替康、西妥昔单抗、氟维司群、长春瑞滨、贝伐
单抗、长春新碱、顺铂、吉西他滨、甲氨蝶呤、长春碱、卡铂、帕利他赛、
多西他赛、培美曲塞、5-氟尿嘧啶、多柔比星、bortezomib、lenalidomide、
地塞米松、美法仑、泼尼松、长春新碱、沙利度胺组合地使用抗FcRH5抗体。
根据要治疗的具体癌症适应证，本发明的组合疗法可以与别的治疗剂诸
如化疗剂或者别的疗法诸如放疗或手术组合。许多已知的化疗剂可以在本发
明的组合疗法中使用。优选地，会使用作为具体适应证标准治疗的那些化疗
剂。组合中要使用的每种治疗剂的剂量或频率优选与相应药剂在没有其它药
剂的情况中使用时的剂量或频率相同，或更少。
另一方面，本发明提供了本文所述任何抗FcRH5抗体，其中所述抗FcRH5
抗体包含可检测标记物。
一方面，本发明提供了一种测定怀疑含有FcRH5的样品中FcRH5的存在
情况的方法，所述方法包括使所述样品暴露于本发明的抗体，并测定所述抗
体对所述样品中FcRH5的结合，其中所述抗体结合所述样品中的FcRH5指示
所述样品中存在所述蛋白质。
一方面，本发明提供了一种诊断与表达FcRH5的细胞(诸如B细胞)增
多有关的细胞增殖性病症的方法，所述方法包括使生物学样品中的测试细胞
接触任何上述抗体；通过检测所述抗体对FcRH5的结合来测定结合至所述样
品中测试细胞的抗体的水平；并比较结合至对照样品中细胞的抗体的水平，
其中将所结合的抗体的水平相对于测试和对照样品中表达FcRH5的细胞的
数目标准化，且其中测试样品中所结合的抗体的水平高于对照样品指明存在
与表达FcRH5的细胞有关的细胞增殖性病症。
一方面，本发明提供了一种检测血液或血清中可溶性FcRH5的方法，所
述方法包括使来自怀疑经历B细胞增殖性病症的哺乳动物的血液或血清测试
样品接触本发明的抗FcRH5抗体，并检测测试样品中可溶性FcRH5相对于来
自正常哺乳动物的血液或血清对照样品的升高。
一方面，本发明提供了一种使本发明的抗体结合至表达FcRH5的细胞的
方法，所述方法包括使所述细胞接触本发明的抗体。在一个实施方案中，所
述抗体是偶联至细胞毒剂的。在一个实施方案中，所述抗体是偶联至生长抑
制剂的。
附图简述
图1描绘嵌合抗人FcRH5 7D11轻链(DNA)。
图2描绘嵌合抗人FcRH5 7D11轻链(氨基酸)。
图3描绘嵌合抗人FcRH5 7D11重链(DNA)。
图4描绘嵌合抗人FcRH5 7D11重链(氨基酸)。
图5描绘嵌合抗人FcRH5(mAb10A8)轻链(DNA)。
图6描绘嵌合抗人FcRH5(mAb10A8)轻链(氨基酸)。
图7描绘嵌合抗人FcRH5(mAb10A8)重链(DNA)。
图8描绘嵌合抗人FcRH5(mAb10A8)重链(氨基酸)。
图9显示鼠10A8和人源化10A8v1的可变轻链与人共有VLκ1(huKI)域
(SEQ ID NO：64)的比对。
图10显示鼠10A8和人源化10A8v1的可变重链与人亚组共有VH(huIII)
域(SEQ ID NO：65)的比对。
图11显示本发明抗体(Hu10A8v1)的氨基酸序列。
图12显示本发明thio-Mab半胱氨酸改造多肽链的氨基酸序列。
图13显示的本发明thio-Mab半胱氨酸改造多肽链的氨基酸序列。
图14显示FcRH5抗体的交叉反应性。
图15显示FcRH5抗体的交叉反应性。
图16显示FcRH5抗体的交叉反应性。
图17显示FcRH5抗体的FACS分析。
图18显示FcRH5抗体滴定。
图19显示FcRH5抗体滴定。
图20显示本发明thio-Mab的FACS分析
图21显示本发明thio-Mab的FACS分析
图22显示本发明thio-Mab的FACS分析
图23显示本发明thio-Mab的FACS分析
图24显示本发明偶联抗体的FACS分析。
图25显示本发明偶联抗体的FACS分析。
图26显示本发明抗体对肿瘤体积均值的影响。
图27显示本发明抗体对体重均值的影响。
图28显示本发明抗体对肿瘤体积均值的影响。
图29显示本发明抗体对体重均值的影响。
图30a显示本发明抗体偶联物对肿瘤体积均值的影响。
图30b显示本发明抗体偶联物对体重均值的影响。
图31显示单一化合物剂量响应分析。
图32显示单一化合物剂量响应分析。
图33显示PRO820 cDNA的核苷酸序列(SEQ ID NO：58)，其中SEQ ID NO：
58是在本文中称作“DNA56041-1416”的克隆(在本文中也称作“FcRH5”)。该
核苷酸序列编码FcRH5，起始和终止密码子以粗体显示且标有下划线(参见
Goddard等人美国专利No.7491529)。
图34显示自图33所示SEQ ID NO：59的编码序列推导的氨基酸序列(SEQ
ID NO：59)(参见Goddard等人美国专利No.7491529)。
图35A-B显示PRO52387 cDNA的核苷酸序列(SEQ ID NO：602)，其中SEQ
ID NO：60是在本文中称作“DNA257845”的克隆(在本文中也称作“FcRH5”)。
该核苷酸序列编码FcRH5，起始和终止密码子以粗体显示且标有下划线(参见
Chang等人已公布的美国专利申请No.20060251662).
图36显示自图36A-B所示SEQ ID NO：61的编码序列推导的氨基酸序列
(SEQ ID NO：61)(参见Chang等人已公布的美国专利申请No.20060251662)。
图37显示PRO314992 cDNA的核苷酸序列(SEQ ID NO：62)，其中SEQ ID
NO：62是来自猕猴，在本文中称作“DNA676969”的克隆(在本文中也称作
“cyno FcRH5”)。
图38显示自图37所示SEQ ID NO：63的编码序列推导的氨基酸序列(SEQ
ID NO：63)。
图39显示小鼠中抗体免疫偶联物和至少一种化疗剂的组合施用对肿瘤
体积均值的影响。
图40显示每个剂量组中动物的百分比体重变化。
图41显示小鼠中抗体免疫偶联物和至少一种化疗剂的组合施用对肿瘤
体积均值的影响。
图42显示每个剂量组中动物的百分比体重变化。
图43显示小鼠中抗体免疫偶联物和至少一种化疗剂的组合施用对肿瘤
体积均值的影响。
图44显示每个剂量组中动物的百分比体重变化。
图45显示本发明抗体偶联物对肿瘤体积均值的影响。
图46显示本发明抗体偶联物对体重均值的影响。
图47显示本发明抗体偶联物对肿瘤体积均值的影响。
图48显示本发明抗体偶联物对体重均值的影响。
发明详述
本发明提供了用于鉴定对于哺乳动物中造血肿瘤治疗有用的组合物的
方法、组合物、试剂盒和制品及使用那些组合物治疗哺乳动物中造血肿瘤的
方法。
本文中提供了这些方法、组合物、试剂盒和制品的详情。
I.通用技术
除非另有说明，本发明的实施将采用分子生物学(包括重组技术)、微
生物学、细胞生物学、生物化学和免疫学的常规技术，这些都在本领域的技
术范围内。文献中充分阐述了此类技术，诸如“Molecular Cloning：A
Laboratory Manual”，second edition(Sambrook et al.，1989)；“Oligonucleotide
Synthesis”(M.J.Gait，ed.，1984)；“Animal Cell Culture”(R.I.Freshney，ed.，
1987)；“Methods in Enzymology”(Academic Press，Inc.)；“Current Protocols in
Molecular Biology”(F.M.Ausubel et al.，eds.，1987，and periodic updates)；
“PCR：The Polymerase Chain Reaction”，(Mullis et al.，ed.，1994)；“A Practical
Guide to Molecular Cloning”(Perbal Bernard V.，1988)；“Phage Display：A
Laboratory Manual”(Barbas et al.，2001)。
II.定义
为了解释本说明书的目的，应用以下定义，而且在任何适宜的时候，以
单数使用的术语也会包括复数，反之亦然。在所列任何定义与通过述及收入
本文的任何文件抵触的情况中，应当以下文所列定义为准。
“B细胞表面标志物”或“B细胞表面抗原”在本文中指在B细胞表面上表达
的抗原，可以用能结合它的拮抗剂来靶向它，包括但不限于B细胞表面抗原
的抗体或能够拮抗配体对天然存在B细胞抗原的结合的可溶形式B细胞表面
抗原的抗体。例示性的B细胞表面标志物包括CD10、CD19、CD20、CD21、
CD22、CD23、CD24、CD37、CD40、CD53、CD72、CD73、CD74、CDw75、
CDw76、CD77、CDw78、CD79a、CD79b、CD80、CD81、CD82、CD83、
CDw84、CD85和CD86白细胞表面标志物(有关说明参见《The Leukocyte
Antigen Facts Book》，第2版，1997，Barclay等编，Academic Press，Harcourt
Brace & Co.，New York)。其它B细胞表面标志物包括RP105、FcRH2、B-cell
CR2、CCR6、P2X5、HLA-DOB、CXCR5、FCER2、BR3、BAFF、BLys、
Btig、NAG14、SLGC16270、FcRH1、IRTA2、ATWD578、FcRH3、IRTA1、
FcRH6、BCMA和239287。特别感兴趣的B细胞表面标志物是在B细胞上较之
哺乳动物的其它非B细胞组织优先表达的，而且可以是在前体B细胞和成熟B
细胞二者上都表达的。
如本文中所使用的，术语“FcRH5”指来自任何脊椎动物来源(包括哺乳
动物，诸如灵长类(例如人、猕猴(cyno))和啮齿类(例如小鼠和大鼠))的
任何天然FcRH5，除非另有说明。人FcRH5在本文中还称作“TAHO18”或
“PRO85143”(SEQ ID NO：2)且由在本文中还称作“DNA340394”的核苷酸序
列(SEQ ID NO：1)编码。猕猴FcRH5在本文中还称作“cyno FcRH5”。术语
“FcRH5”涵盖“全长”、未加工的FcRH5以及自细胞中加工得到的任何形式的
FcRH5。该术语还涵盖天然存在的FcRH5变体，例如剪接变体、等位变体和
同等型(isoform)。本文所述FcRH5多肽可以从多种来源分离，诸如人组织类
型或其它来源，或者通过重组或合成方法制备。“天然序列FcRH5多肽”包括
与自自然界衍生的相应FcRH5多肽具有相同氨基酸序列的多肽。此类天然序
列FcRH5多肽可以从自然界分离，或者可以通过重组或合成方法制备。术语
“天然序列FcRH5多肽”明确涵盖天然存在的截短或分泌形式的特定FcRH5多
肽(例如胞外结构域序列)、该多肽的天然存在变异形式(例如可变剪接形
式)和天然存在等位变体。在本发明的某些实施方案中，本文中所公开的天
然序列FcRH5多肽是包含附图中所示全长氨基酸序列的成熟或全长天然序
列多肽。起始和终止密码子(如果指明的话)在附图中以粗体显示且划有下
划线。图中以“N”表示的核酸残基指任何核酸残基。然而，虽然图中所公开
的FcRH5多肽显示出以本文中在图中标示为第1位氨基酸的甲硫氨酸残基开
始，但是想得到且和有可能的是，可以采用位于图中第1位氨基酸上游或下
游的其它甲硫氨酸残基作为FcRH5多肽的起始氨基酸残基。
“mu10A8”或“MA10A8”或“鼠FcRH5(10A8)抗体”或“鼠抗FcRH5(10A8)
抗体”在本文中用于具体指鼠抗FcRH5单克隆抗体，其中所述鼠抗FcRH5单克
隆抗体包含轻链可变域SEQ ID NO：18(图9)和重链可变域SEQ ID NO：20
(图10)。鼠抗FcRH5单克隆抗体可以自商业来源购买。
“ch10A8”或“chMAFcRH5(10A8)”或“chFcRH5(10A8)”或“嵌合
MAFcRH5(10A8)抗体”在本文中用于具体指嵌合抗人FcRH5抗体，其中所述
嵌合抗FcRH5抗体包含轻链SEQ ID NO：15(图6)。所述轻链SEQ ID NO：15
进一步包含图9所示可变域和人IgG1轻链恒定域。所述嵌合抗FcRH5抗体进
一步包含重链SEQ ID NO：17(图8)。所述重链SEQ ID NO：17进一步包含图
10所示可变域和人IgG1重链恒定域。
“ch7D11”或“chMAFcRH5(7D11)”或“chFcRH5(7D11)”或“嵌合
MAFcRH5(7D11)抗体”在本文中用于具体指嵌合抗人FcRH5抗体，其中所述
嵌合抗FcRH5抗体包含轻链SEQ ID NO：11(图2)，其包含人IgG1轻链恒定
域。所述嵌合抗FcRH5(7D11)抗体进一步包含重链SEQ ID NO：13(图4)，
其包含人IgG1的重链恒定域。
“抗cynoFcRH5”或“抗cyno FcRH5”在本文中用于指与cyno FcRH5结合的
抗体。
“10A8-嫁接物”或“10A8-嫁接的‘人源化’抗体”或“hu10A8嫁接物”在本文
中用于具体指通过将来自鼠抗FcRH5抗体(mu10A8)的高变区嫁接入受体人
共有VLκI(huKI)和人亚组III共有VH(huIII)生成的嫁接物(Carter et al.，Proc.
Natl.Acad.Sci.USA，89：4285(1992))(见实施例1和图9(SEQ ID NO：19)和图
10(SEQ ID NO：21))。“hu10A8”或“hu10A8v1”在本文中用于具体指人源化
10A8抗体。
氨基酸残基/位点的“修饰”在用于本文时指一级氨基酸序列与起始氨基
酸序列相比的变化，其中所述改变源自涉及所述氨基酸残基/位点的序列改
变。例如，典型的修饰包括用另一种氨基酸替代所述残基(或者在所述位置)
(例如保守或非保守替代)、在所述残基/位置插入一个或多个(通常少于5
个或3个)氨基酸、及删除所述残基/位置。“氨基酸替代”或其变体指用不同
氨基酸残基置换预定的(起初的)氨基酸序列中现有的氨基酸残基。通常且
优选的是，修饰导致与包含起始(或“野生型”)氨基酸序列的多肽相比，变
体多肽的至少一种物理生化活性发生改变。例如，在抗体的情况中，发生改
变的物理生化活性可以是对靶分子的结合亲和力、结合能力和/或结合效应。
术语“抗体”以最广义使用，明确覆盖例如单一抗FcRH5单克隆抗体(包
括激动性抗体、拮抗性抗体、中和性抗体、全长或完整单克隆抗体)、具有
多表位特异性的抗FcRH5抗体组合物、多克隆抗体、多价抗体、自至少两种
完整抗体形成的多特异性抗体(例如双特异性抗体，只要它们展现出期望的
生物学活性)、单链抗FcRH5抗体和抗FcRH5抗体片段(见下文)(包括Fab、
Fab’、F(ab’)2和Fv片段)、双抗体、单域抗体(sdAb)，只要它们展现出期望的
生物学或免疫学活性。术语“免疫球蛋白”(Ig)在本文中与“抗体”可互换使
用。抗体可以是人的、人源化的和/或亲和力成熟的。
术语“抗FcRH5抗体”或“与FcRH5结合的抗体”指能够以足够亲和力结合
FcRH5的抗体，使得该抗体作为靶向FcRH5中的诊断剂和/或治疗剂是有用
的。优选的是，抗FcRH5抗体结合无关的非FcRH5蛋白质的程度小于该抗体
对FcRH5的结合的约10％，根据例如放射免疫测定法(RIA)的测量。在某些实
施方案中，与FcRH5结合的抗体具有≤1μM、≤100nM、≤10nM、≤1nM或≤0.1nM
的解离常数(Kd)。在某些实施方案中，抗FcRH5抗体结合在来自不同物种的
FcRH5间保守的FcRH5表位。
“分离的”抗体指已经鉴定且自其天然环境的一种成分分开和/或回收的
抗体。其天然环境的污染性成分指将会干扰该抗体的治疗用途的物质，可包
括酶、激素和其它蛋白质性质或非蛋白质性质的溶质。在优选的实施方案中，
将抗体纯化至(1)根据Lowry法的测定，抗体重量超过95％，最优选重量超过
99％，(2)足以通过使用转杯式测序仪获得至少15个残基的N-末端或内部氨基
酸序列的程度，或(3)根据还原性或非还原性条件下的SDS-PAGE及使用考马
斯蓝或优选的银染色，达到同质。既然抗体天然环境的至少一种成分不会存
在，那么分离的抗体包括重组细胞内的原位抗体。然而，分离的抗体通常将
通过至少一个纯化步骤来制备。
基本的4链抗体单元是由两条相同的轻链(L)和两条相同的重链(H)构成
的异四聚体糖蛋白(IgM抗体由5个基本的异四聚体单元及称作J链的另外多
肽组成，因此包含10个抗原结合位点；而分泌型IgA抗体可聚合而形成包含
2-5个基本的4链单元及J链的多价装配物)。在IgG的情况中，4链单元通常是
约150,000道尔顿。每条轻链通过一个共价二硫键与重链相连，而两条重链通
过一个或多个二硫键彼此相连，二硫键的数目取决于重链的同种型。每条重
链和轻链还具有间隔规律的链内二硫键。每条重链在N-末端具有一个可变区
(VH)，接着是三个(对于α和γ链)或四个(对于μ和ε同种型)恒定区(CH)。
每条轻链在N-末端具有一个可变区(VL)，接着是其另一端的一个恒定区
(CL)。VL与VH排列在一起，而CL与重链第一恒定区(CH1)排列在一起。认
为特定的氨基酸残基在轻链和重链可变区之间形成界面。一个VH和一个VL
一起配对而形成一个抗原结合位点。关于不同类别抗体的结构和性质，参见
例如Basic and Clinical Immunology，8th edition，Daniel P.Stites，Abba I.Terr
and Tristram G.Parslow(eds.)，Appleton & Lange，Norwalk，CT，1994，page 71
and Chapter 6。
根据其恒定域氨基酸序列，来自任何脊椎动物物种的L链可归入两种截
然不同类型中的一种，称作卡帕(κ)和拉姆达(λ)。根据其重链恒定域(CH)氨基
酸序列，免疫球蛋白可归入不同的类别或同种型。有五类免疫球蛋白：IgA、
IgD、IgE、IgG和IgM，分别具有称作α、δ、ε、γ和μ的重链。根据CH序列和
功能的较小差异，γ和α类可进一步分为亚类，例如人类表达下列亚类：IgG1、
IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2。
抗体的“可变区”或“可变域”指抗体重链或轻链的氨基末端结构域。重链
的可变域可以称为“VH”。轻链的可变域可以称为“VL”。这些结构域一般是
抗体的最易变部分且包含抗原结合位点。
术语“可变的”指可变域中的某些区段在抗体间序列差异广泛的实情。V
结构域介导抗原结合并限定特定抗体对其特定抗原的特异性。然而，变异性
并非均匀分布于可变域跨越的110个氨基酸。事实上，V区由15-30个氨基酸，
称作框架区(FR)的相对不变异的区段及将框架区分开的每个长度为9-12个氨
基酸，称作“高变区”的极度变异的较短区域组成。天然重链和轻链的可变域
各自包含四个FR，它们大多采取β-折叠片构象，通过形成环状连接且在有些
情况中形成β-折叠片结构一部分的三个高变区连接。每条链中的高变区通过
FR非常接近地保持在一起，并与另一条链的高变区一起促成抗体的抗原结合
位点的形成(参见Kabat et al.，Sequences of Proteins of Immunological Interest，
5th Ed.Public Health Service，National Institutes of Health，Bethesda，MD
(1991))。恒定域不直接参与抗体与抗原的结合，但展现出多种效应器功能，
诸如抗体依赖性细胞的细胞毒性(ADCC)中抗体的参与。
“完整抗体”指包含抗原结合位点以及CL和至少重链恒定域CH1、CH2和
CH3的抗体。恒定域可以是天然序列恒定区(例如人天然序列恒定区)或其
氨基酸序列变体。优选的是，完整抗体具有一项或多项效应器功能。
“裸抗体(裸露的抗体)”为本发明目的指未偶联细胞毒性模块或放射性
标记物的抗体。
“抗体片段”包含完整抗体的一部分，优选完整抗体的抗原结合或可变
区。抗体片段的例子包括Fab、Fab′、F(ab′)2和Fv片段；双抗体；线性抗体(参
见美国专利5,641,870，实施例2；Zapata et al.，Protein Eng.8(10)：1057-1062
(1995))；单链抗体分子；及由抗体片段形成的多特异性抗体。在一个实施方
案中，抗体片段包含完整抗体的抗原结合位点，如此保留结合抗原的能力。
用木瓜蛋白酶消化抗体产生两个相同的抗原结合片段，称作“Fab”片段，
和残余“Fc”片段，其名称反映了它易于结晶的能力。Fab片段由完整轻链及
重链的可变区(VH)和第一恒定区(CH1)组成。每个Fab片段对于抗原结合是单
价的，即它具有一个抗原结合位点。胃蛋白酶处理抗体产生一个较大F(ab′)2
片段，它粗略相当于两个通过二硫键相连的Fab片段，具有二价抗原结合活
性且仍能够交联抗原。Fab’片段因在CH1结构域的羧基末端增加了少数残基
而与Fab片段有所不同，包括来自抗体铰链区的一个或多个半胱氨酸。
Fab’-SH是本文中对其中恒定区半胱氨酸残基携带一个游离硫醇基的Fab’的
称谓。F(ab′)2抗体片段最初是作为成对Fab’片段生成的，在Fab’片段之间具
有铰链半胱氨酸。还知道抗体片段的其它化学偶联。
Fc片段包含通过二硫键保持在一起的所有两条重链的羧基末端部分。抗
体的效应器功能是由Fc区中的序列决定的，该区还是受到在某些类型的细胞
上找到的Fc受体(FcR)所识别的部分。
“Fv”是包含完整抗原识别和结合位点的最小抗体片段。该片段由紧密、
非共价结合的一个重链可变域和一个轻链可变域的二聚体组成。在单链Fv
种类中，一个重链可变域和一个轻链可变域可以通过柔性肽接头共价相连，
使得轻链和重链在与双链Fv种类类似的“二聚体”结构中相结合。从这两个结
构域的折叠结构中散发出六个高变环(重链和轻链各3个环)，其贡献出供结
合抗原的氨基酸残基并赋予抗体以抗原结合特异性。然而，即使是单个可变
域(或是只包含对抗原特异性的三个CDR的半个Fv)也具有识别和结合抗原
的能力，只是亲和力低于完整结合位点。
“单链Fv”，也可缩写为“sFv”或“scFv”，是包含连接成一条多肽链的抗体
VH和VL结构域的抗体片段。优选的是，sFv多肽在VH和VL结构域之间还包含
多肽接头，使得sFv形成抗原结合期望的结构。关于sFv的综述参见Plückthun，
《The Pharmacology of Monoclonal Antibodies》，vol.113，Rosenburg和Moore
编，Springer-Verlag，New York，pp.269-315，1994；Borrebaeck 1995，见下
文。
术语“双抗体”指具有两个抗原结合位点的抗体片段，该片段在同一条多
肽链(VH-VL)中包含相连的重链可变域(VH)和轻链可变域(VL)。通过在VH
和VL结构域之间使用短接头(约5-10个残基)构建sFv片段(见上一段)来
制备小型抗体片段，由于接头短，使得V结构域实行链间而非链内配对，导
致二价片段，即具有两个抗原结合位点的片段。双抗体可以是二价的或双特
异性的。双特异性双抗体是两个“交叉”sFv片段的异二聚体，其中两种抗体
的VH和VL结构域存在于不同多肽链上。双抗体更完整的描述于例如EP
404,097；WO 93/11161；Hudson et al.，Nat.Med.9：129-134(2003)；及Hollinger
et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，90：6444-6448(1993)。三抗体(Triabody)和四
抗体(tetrabody)也记载于Hudson et al.，Nat.Med.9：129-134(2003)。
术语“单克隆抗体”在用于本文时指从一群基本上同质的抗体获得的抗
体，即构成群体的各抗体个体是相同的，除了可以以极小量存在的可能的天
然存在突变形式外。单克隆抗体是高度特异性的，针对单一抗原性位点。此
外，与包含针对不同决定簇(表位)的不同抗体的多克隆抗体制备物不同，
每种单克隆抗体针对抗原上的单一决定簇。在它们的特异性之外，单克隆抗
体的优势在于它们可以在未受到其它抗体污染的情况中合成。修饰语“单克
隆”不应解释为要求通过任何特定方法来生成抗体。例如，可用于本发明的
单克隆抗体可通过最初由Kohler等(1975)Nature 256：495记载的杂交瘤方法
来制备，或者可通过重组DNA方法在细菌、真核动物或植物细胞中制备(参
见例如美国专利No.4,816,567)。“单克隆抗体”还可使用例如Clackson等
(1991)Nature 352：624-628；和Marks等(1991)J.Mol.Biol.222：581-597中记
载的技术从噬菌体抗体库分离。
单克隆抗体在本文中包括“嵌合”抗体，其中重链和/或轻链的一部分与衍
生自特定物种或属于特定抗体类别或亚类的抗体中的相应序列相同或同源，
而链的剩余部分与衍生自另一物种或属于另一抗体类别或亚类的抗体中的
相应序列相同或同源，以及此类抗体的片段，只要它们展现出期望的生物学
活性(参见美国专利No.4,816,567；Morrison et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA
81：6851-6855(1984))。本文中感兴趣的嵌合抗体包括包含衍生自非人灵长类
动物(例如旧大陆猴类(Old World Monkey)、猿等)的可变域抗原结合序列
和人恒定区序列的“灵长类化”抗体。
非人(例如啮齿类)抗体的“人源化”形式指最低限度包含衍生自非人抗
体的序列的嵌合抗体。在极大程度上，人源化抗体指人免疫球蛋白(受体抗
体)中的高变区残基用具有期望抗体特异性、亲和力和能力的非人物种(供
体抗体)诸如小鼠、大鼠、兔或非人灵长类动物的高变区残基替换的免疫球
蛋白。在有些情况中，将人免疫球蛋白的框架区(FR)残基用相应的非人残基
替换。此外，人源化抗体可包含在受体抗体或供体抗体中没有找到的残基。
进行这些修饰是为了进一步改进抗体的性能。一般而言，人源化抗体将包含
至少一个、通常两个基本上整个如下可变域，其中所有或基本上所有高变环
对应于非人免疫球蛋白的高变环，且所有或基本上所有FR是人免疫球蛋白序
列的FR。人源化抗体任选还将包含至少部分免疫球蛋白恒定区(Fc)，通常是
人免疫球蛋白的恒定区。更多细节参见Jones et al.，Nature 321：522-525(1986)；
Riechmann et al.，Nature 332：323-329(1988)；和Presta，Curr.Op.Struct.Biol.
2：593-596(1992)。还可参见以下综述及其引用的参考文献：Vaswani and
Hamilton，Ann.Allergy，Asthma and Immunol.，1：105-115(1998)；Harris，
Biochem.Soc.Transactions，23：1035-1038(1995)；Hurle and Gross，Curr.Op.
Biotech.，5：428-433(1994)。
“thio”在本文中用于指抗体时指半胱氨酸改造抗体，而“hu”在本文中用
于指抗体时指人源化抗体。
“人抗体”指拥有与由人生成的抗体的氨基酸序列对应的氨基酸序列和/
或使用本文所公开的用于生成人抗体的任何技术生成的抗体。人抗体的这种
定义明确排除包含非人抗原结合残基的人源化抗体。人抗体可使用本领域已
知的多种技术来生成，包括噬菌体展示文库(Hoogenboom and Winter，J.Mol.
Biol.227：381(1991)；Marks et al.，J.Mol.Biol.222：581(1991))。还可用于制备
人单克隆抗体的是以下文献中记载的方法：Cole et al.，Monoclonal Antibodies
and Cancer Therapy，Alan R.Liss，p.77(1985)；Boerner et al.，J.Immunol.
147(1)：86-95(1991)。还可参见van Dijk and van de Winkel，Curr.Opin.
Pharmacol.，5：368-74(2001)。可通过给已经修饰以应答抗原性刺激而生成人
抗体但其内源基因组已经失能的转基因动物例如经过免疫的异种小鼠
(xenomice)施用抗原来制备人抗体(参见例如6,075,181和6,150,584，关于
XENOMOUSETM技术)。还可参见例如Li et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，
103：3557-3562(2006)，关于经人B-细胞杂交瘤技术生成的人抗体。
术语“高变区”、“HVR”或“HV”在用于本文时指抗体可变域中序列上高度
可变和/或形成结构上定义的环的区域。通常，抗体包含六个高变区：三个在
VH中(H1、H2、H3)，三个在VL中(L1、L2、L3)。本文中使用且涵盖许
多高变区的叙述。Kabat互补决定区(CDR)是以序列变异性为基础的且是最常
用的(Kabat et al.，Sequences of Proteins of Immunological Interest，5th Ed.
Public Health Service，National Institutes of Health，Bethesda，MD.(1991))。
Chothia指结构环的位置(Chothia and Lesk J.Mol.Biol.196：901-917(1987))。
Chothia CDR-H1环的末端在使用Kabat编号规则编号时在H32与H34之间变
化，取决于环的长度(这是因为Kabat编号方案在H35A和H35B处放置插入；
如果35A和35B都不存在，那么该环在32处结束；如果只有35A存在，那么该
环在33处结束；如果35A和35B都存在，那么该环在34处结束)。AbM高变区
代表Kabat CDR与Chothia结构环之间的折衷，而且用于Oxford Molecular的
AbM抗体建模软件。“接触”高变区是以对可获得的复合物晶体结构的分析为
基础的。下文记录了这些高变区中每一个的残基。
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高变区可包括如下“延伸的高变区”：VL中的24-36或24-34(L1)、46-56
或50-56(L2)和89-97(L3)及VH中的26-35B(H1)、50-65、47-65或49-65(H2)
和93-102、94-102或95-102(H3)。对于这些定义中的每一个，可变区残基是
依照Kabat等，见上文编号的。
“框架”或“FR”残基指可变域中那些除此处定义的高变区残基以外的残
基。
术语“如Kabat中的可变域残基编号方式”或“如Kabat中的氨基酸位置编
号方式”及其变化形式指Kabat等，《Sequences of Proteins of Immunological
Interest》，第5版，Public Health Service，National Institutes of Health，Bethesda，
MD(1991)中用于抗体重链可变域或轻链可变域编辑的编号系统。使用此编
号系统，实际的线性氨基酸序列可以包含较少的或另外的氨基酸，对应于可
变域FR或CDR的缩短或插入。例如，重链可变域可以包含H2残基52后的单
一氨基酸插入(依照Kabat的残基52a)和重链FR残基82后的插入残基(例如
依照Kabat的残基82a、82b和82c等)。给定抗体的Kabat残基编号可以通过将
抗体序列与“标准”Kabat编号序列对比同源区来确定。
Kabat编号系统一般在提及可变域中的残基(大约是轻链残基1-107和重
链残基1-113)时使用(例如Kabat et al.，Sequences of Immunological Interest.5th
Ed.Public Health Service，National Institutes of Health，Bethesda，Md.(1991))。
“EU编号系统”或“EU指数”一般在提及免疫球蛋白重链恒定区中的残基时使
用(例如Kabat et al.，见上文中报道的EU指数)。“Kabat中的EU指数”指人
IgG1 EU抗体的残基编号方式。除非本文中另有说明，提及抗体可变域中的
残基编号指根据Kabat编号系统的残基编号方式。除非本文中另有说明，提
及抗体恒定域中的残基编号指根据EU编号系统的残基编号方式(例如参见
美国临时申请60/640,323，关于EU编号方式的图)。
“亲和力成熟的”抗体指在抗体的一个或多个HVR中具有一处或多处改
变、导致该抗体对抗原的亲和力与没有这些改变的亲本抗体相比有所改进的
抗体。优选的亲和力成熟的抗体具有纳摩尔或甚至皮摩尔量级的对靶抗原的
亲和力。亲和力成熟的抗体可通过本领域已知规程来生成。Marks et al.，
Bio/Technology 10：779-783(1992)记载了通过VH和VL结构域改组进行的亲和
力成熟。以下文献记载了HVR和/或框架残基的随机诱变：Barbas et al.，Proc.
Nat.Acad.Sci.USA 91：3809-3813(1994)；Schier et al.，Gene 169：147-155
(1995)；Yelton et al.，J.Immunol.155：1994-2004(1995)；Jackson et al.，J.
Immunol.154(7)：3310-9(1995)；Hawkins et al.，J.Mol.Biol.226：889-896
(1992)。
“阻断性”抗体或“拮抗性”抗体指抑制或降低其所结合的抗原的生物学活
性的抗体。优选的阻断性抗体或拮抗性抗体实质或完全抑制抗原的生物学活
性。
“激动性抗体”在用于本文时指模拟目的多肽的至少一项功能性活性的
抗体。
“物种依赖性抗体”，例如哺乳动物抗人IgE抗体，指对来自第一哺乳动
物物种的抗原具有强于对该抗原来自第二哺乳动物物种的同系物的结合亲
和力的抗体。通常，物种依赖性抗体“特异性结合”人类抗原(即具有不超过
约1x10-7M，优选不超过约1x10-8M，最优选不超过约1x10-9M的结合亲
和力(Kd))，但对该抗原来自第二非人哺乳动物物种的同系物具有比其对人
类抗原的结合亲和力弱至少约50倍，或至少约500倍，或至少约1000倍的结
合亲和力。物种依赖性抗体可以是如上定义的各种类型的抗体，但优选人源
化抗体或人抗体。
“结合亲和力”通常指分子(例如抗体)的单一结合位点与其结合配偶体
(例如抗原)之间全部非共价相互作用总和的强度。除非另有说明，在用于
本文时，“结合亲和力”指反映结合对的成员(例如抗体与抗原)之间1∶1相互
作用的内在结合亲和力。分子X对其配偶体Y的亲和力通常可用解离常数(Kd)
来表述。亲和力可通过本领域知道的常用方法来测量，包括本文中所描述的
那些。低亲和力抗体通常缓慢的结合抗原且趋于容易解离，而高亲和力抗体
通常更快速的结合抗原且趋于保持更长时间的结合。本领域知道测量结合亲
和力的多种方法，其中任一种都可用于本发明的目的。下文描述了具体的示
例性实施方案。
“或更好的”在本文中用于指结合亲和力时指分子与其结合配偶之间更
强的结合。“或更好的”在本文中使用时指更强的结合，以更小的Kd值来代表。
例如，具有“.6nM或更好的”对抗原的亲和力的抗体，抗体对抗原的亲和力
＜.6nM，即.59nM、.58nM、.57nM等或任何小于.6nM的值。
在一个实施方案中，依照本发明的“Kd”或“Kd值”是通过如下测定法所述
使用Fab型式的目的抗体及其抗原进行的放射性标记抗原结合测定法(RIA)
来测量的：通过在存在未标记抗原的滴定系列的条件下，用最小浓度的125I
标记抗原平衡Fab，然后用抗Fab抗体包被的平板捕捉结合的抗原来测量Fab
对抗原的溶液结合亲和力(Chen，et al.，J Mol Biol 293：865-881(1999))。为了
确定测定条件，用50mM碳酸钠(pH 9.6)中的5μg/ml捕捉用抗Fab抗体(Cappel
Labs)包被微量滴定板(Dynex)过夜，随后用PBS中的2％(w/v)牛血清清蛋白在
室温(约23℃)封闭2-5小时。在非吸附平板(Nunc #269620)中，将100pM或
26pM[125I]-抗原与连续稀释的目的Fab混合(例如与Presta et al.，Cancer Res.
57：4593-4599(1997)中抗VEGF抗体，Fab-12的评估一致)。然后将目的Fab
保温过夜；不过，保温可持续更长时间(例如65个小时)以保证达到平衡。
此后，将混合物转移至捕捉板以进行室温保温(例如1小时)。然后除去溶液，
并用含0.1％ Tween-20的PBS洗板8次。平板干燥后，加入150μl/孔闪烁液
(MicroScint-20；Packard)，然后在Topcount伽马计数器(Packard)上对平板计数
10分钟。选择各Fab给出小于或等于最大结合之20％的浓度用于竞争性结合
测定法。依照另一实施方案，Kd或Kd值是通过表面等离振子共振测定法使
用BIAcoreTM-2000或BIAcoreTM-3000(BIAcore，Inc.，Piscataway，NJ)在25℃使
用固定化抗原CM5芯片在约10个响应单位(RU)测量的。简而言之，依照供应
商的说明书用盐酸N-乙基-N’-(3-二甲基氨基丙基)-碳化二亚胺(EDC)和N-羟
基琥珀酰亚胺(NHS)活化羧甲基化右旋糖苷生物传感器芯片(CM5，BIAcore
Inc.)。用10mM乙酸钠pH 4.8将抗原稀释至5μg/ml(约0.2μM)，然后以5μl/分
钟的流速注入至获得约10个响应单位(RU)的偶联蛋白质。注入抗原后，注入
1M乙醇胺以封闭未反应基团。为了进行动力学测量，在25℃以约25μl/分钟
的流速注入在含0.05％ Tween-20的PBS(PBST)中两倍连续稀释的Fab
(0.78nM至500nM)。使用简单一对一朗格缪尔(Langmuir)结合模型(BIAcore
Evaluation Software version 3.2)通过同时拟合结合和解离传感图计算结合速
率(kon)和解离速率(koff)。平衡解离常数(Kd)以比率koff/kon计算。参见例如Chen，
Y.，et al.，J Mol Biol 293：865-881(1999)。如果根据上文表面等离振子共振测
定法，结合速率超过106M-1S-1，那么结合速率可使用荧光淬灭技术来测定，
即根据分光计诸如配备了断流装置的分光光度计(a stop-flow equipped
spectrophometer)(Aviv Instruments)或8000系列SLM-Aminco分光光度计
(ThermoSpectronic)中用搅拌比色杯的测量，在存在浓度渐增的抗原的条件
下，测量PBS，pH 7.2中的20nM抗抗原抗体(Fab形式)在25℃的荧光发射强
度(激发＝295nm；发射＝340nm，16nm带通)的升高或降低。
依照本发明的“结合速率”(on-rate，rate of association，association rate)或
“kon”也可通过上文所述相同的表面等离振子共振技术使用BIAcoreTM-2000或
BIAcoreTM-3000(BIAcore，Inc.，Piscataway，NJ)来测定。
短语“基本上相似”或“基本上相同”在用于本文时表示两个数值(通常一
个涉及本发明的抗体而另一个涉及参照/比较抗体)之间足够高的相似程度，
以致本领域技术人员将认为在用所述数值(例如Kd值)所测量的生物学特性
背景内两个数值之间的差异具有很小的或没有生物学和/或统计学显著性。作
为参照/比较抗体该数值的函数，所述两个数值之间的差异优选小于约50％，
优选小于约40％，优选小于约30％，优选小于约20％，优选小于约10％。
短语“实质性降低”或“实质性不同”在用于本文时表示两个数值(通常一
个涉及本发明的抗体而另一个涉及参照/比较抗体)之间足够高的差异程度，
以致本领域技术人员将认为在用所述数值(例如Kd值、HAMA反应)所测量
的生物学特性背景内两个数值之间的差异具有统计学显著性。作为参照/比较
抗体该数值的函数，所述两个数值之间的差异优选大于约10％，优选大于约
20％，优选大于约30％，优选大于约40％，优选大于约50％。
“抗原”指抗体可选择性结合的预定抗原。靶抗原可以是多肽、碳水化合
物、核酸、脂质、半抗原或其它天然存在的或合成的化合物。优选的是，靶
抗原是多肽。
就本文目的而言，“受体人框架”是包含衍生自人免疫球蛋白框架或人共
有框架的VL或VH框架之氨基酸序列的框架。“衍生自”人免疫球蛋白框架或
人共有框架的受体人框架可包含与之相同的氨基酸序列，或者可包含预先存
在的氨基酸序列变化。当存在预先存在的氨基酸变化时，优选存在不超过5
个，优选4个或更少，或者3个或更少预先存在的氨基酸变化。当VH中存在
预先存在的氨基酸变化时，优选那些变化只位于71H、73H和78H中的三个、
两个或一个位置；例如，位于那些位置的氨基酸残基可以是71A、73T和/或
78A。在一个实施方案中，VL受体人框架在序列上与VL人免疫球蛋白框架
序列或人共有框架序列相同。
“人共有框架”指代表人免疫球蛋白VL或VH框架序列选集中最常见的氨
基酸残基的框架。通常，人免疫球蛋白VL或VH序列选集来自可变区序列亚
型。通常，序列亚型是如Kabat等人的亚型。在一个实施方案中，对于VL，
亚型是如Kabat等人的亚型κI。在一个实施方案中，对于VH，亚型是如Kabat
等人的亚型III。
“VH亚型III共有框架”包含从Kabat等人的可变重链亚型III中的氨基酸序
列获得的共有序列。在一个实施方案中，VH亚型III共有框架氨基酸序列包
含下列各序列的至少一部分或整个全部：
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAAS(SEQ ID NO：
49)-H1-WVRQAPGKGLEWV(SEQ ID NO：
50)-H2-RFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYC(SEQ ID NO：
51)-H3-WGQGTLVTVSS(SEQ ID NO：52)。
“VL亚型I共有框架”包含从Kabat等人的可变轻链κ亚型I中的氨基酸序列
获得的共有序列。在一个实施方案中，VL亚型I共有框架氨基酸序列包含下
列各序列的至少一部分或整个：DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITC(SEQ ID
NO：45)-L1-WYQQKPGKAPKLLIY(SEQ ID NO：
46)-L2-GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYC(SEQ ID NO：
47)-L3-FGQGTKVEIKR(SEQ ID NO：48)。
“未修饰的人框架”指与受体人框架具有相同氨基酸序列的人框架，例如
在受体人框架中缺少人到非人的氨基酸替代。
“改变的高变区”就本文目的而言指其中包含一处或多处(例如1处至约
16处)氨基酸替代的高变区。
“未修饰的高变区”就本文目的而言指具有与衍生它的非人抗体相同的
氨基酸序列的高变区，即其中缺少一处或多处氨基酸替代的高变区。
“结合”目的抗原例如肿瘤相关多肽抗原靶物的抗体指以足够亲和力结
合该抗原，使得该抗体可作为治疗剂用于靶向表达该抗原的细胞或组织且不
显著与其它蛋白质发生交叉反应的多肽、抗体、拮抗剂或组合物。在此类实
施方案中，根据荧光激活细胞分选(FACS)分析或放射免疫沉淀(RIA)的测定，
抗体结合“非靶物”蛋白质的程度将小于该抗体对其特定靶物蛋白质的结合
的约10％。对于抗体对靶分子的结合，术语“特异结合”或“特异性结合”特定
多肽或特定多肽靶物上的表位或对其“特异”意味着可测量的不同于非特异
相互作用的结合。特异结合可通过例如测定分子的结合并与对照分子的结合
比较来测量，所述对照分子通常是结构相似但没有结合活性的分子。例如，
特异结合可通过与对照分子的竞争来测定，所述对照分子与靶物相似，例如
过量的未标记靶物。在这种情况中，若经标记靶物与探针的结合受到过量未
标记靶物的竞争性抑制，则指示特异结合。术语“特异结合”或“特异性结合”
特定多肽或特定多肽靶物上的表位或对其“特异”在用于本文时可展现例如
对靶物的Kd为至少约10-4M，或至少约10-5M，或至少约10-6M，或至少约10-7
M，或至少约10-8M，或至少约10-9M，或至少约10-10M，或至少约10-11M，
或至少约10-12M或更大。在一个实施方案中，术语“特异结合”指这样的结合，
其中分子结合特定多肽或特定多肽上的表位，而基本上不结合任何其它多肽
或多肽表位。
“抑制表达FcRH5多肽的肿瘤细胞生长”的抗体或者“生长抑制性”抗体指
导致可测量的表达或共表达适宜FcRH5多肽的癌细胞生长抑制的抗体。所述
FcRH5多肽可以是在癌细胞表面上表达的跨膜多肽，或者可以是由癌细胞生
成并分泌的多肽。优选的生长抑制性抗体与适宜对照相比对表达FcRH5的肿
瘤细胞生长的抑制超过20％、优选大约20％到大约50％和甚至更优选超过
50％(例如大约50％到大约100％)，所述对照通常是未用所测试的抗体处理
的肿瘤细胞。在一个实施方案中，生长抑制可以在细胞培养物中的抗体浓度
为大约0.1-30μg/ml或大约0.5nM到200nM时测量，其中生长抑制在肿瘤细胞
暴露于抗体后1-10天测定。体内肿瘤细胞生长抑制可以以多种方式测定，诸
如下文实验实施例部分所描述的。如果抗FcRH5抗体大约1μg/kg到大约
100mg/kg体重的施用导致在距首次施用抗体大约5天到3个月内(优选大约
5-30天内)肿瘤体积缩小或肿瘤细胞增殖减慢，那么该抗体在体内是生长抑
制性的。
“诱导凋亡”的抗体指根据膜联蛋白V结合、DNA断裂、细胞收缩、内质
网膨胀、细胞破裂和/或膜囊(称作凋亡小体)形成的测定，诱导程序性细胞
死亡的抗体。所述细胞通常是过表达FcRH5多肽受体的细胞。优选的是，所
述细胞是肿瘤细胞，例如造血细胞，诸如B细胞、T细胞、嗜碱性粒细胞、嗜
酸性粒细胞、嗜中性粒细胞、单核细胞、血小板或红细胞。有多种方法可用
于评估与凋亡有关的细胞事件。例如，可通过膜联蛋白结合来测量磷脂酰丝
氨酸(PS)易位；可通过DNA梯化(laddering)来评估DNA断裂；可通过亚二倍
体细胞的任何增加来评估伴随着DNA断裂的核/染色质浓缩。优选的是，诱
导凋亡的抗体是在膜联蛋白结合测定法中导致对膜联蛋白的结合相对于未
处理细胞诱导约2至50倍，优选约5至50倍，最优选约10至50倍的抗体。
“诱导细胞死亡”的抗体指引起可存活细胞变得不能存活的抗体。所述细
胞指表达FcRH5多肽且属于明确表达或共表达FcRH5多肽的类型的细胞。所
述细胞可以是特定细胞类型的癌性或正常细胞。所述FcRH5多肽可以是在癌
细胞表面上表达的跨膜多肽，或者可以是由癌细胞生成和分泌的多肽。所述
细胞可以是癌细胞，例如B细胞或T细胞。体外细胞死亡可在不存在补体或免
疫效应细胞时测定，以区分由抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)或补
体依赖性细胞毒性(CDC)诱导的细胞死亡。如此，用于细胞死亡的测定法可
使用热灭活血清(即不含补体)在不存在免疫效应细胞时进行。为了确定抗
体是否能够诱导细胞死亡，可相对于未处理细胞评估膜完整性的丧失，它是
通过碘化丙啶(propidium iodide)(PI)、锥虫蓝(参见Moore et al.，Cytotechnology
17：1-11(1995))或7AAD的摄取来评估的。优选的诱导细胞死亡的抗体是在PI
摄取测定法中在BT474细胞中诱导PI摄取的抗体。
抗体“效应器功能”指那些可归于抗体Fc区(天然序列Fc区或氨基酸序列
变体Fc区)且随抗体同种型而变化的生物学活性。抗体效应器功能的例子包
括：C1q结合和补体依赖性细胞毒性；Fc受体结合；抗体依赖性细胞介导的
细胞毒性(ADCC)；吞噬作用；细胞表面受体(例如B细胞受体)下调；和B
细胞活化。
术语“Fc区”在本文中用于定义免疫球蛋白重链的C-端区域，包括天然序
列Fc区和变异Fc区。虽然免疫球蛋白重链Fc区的边界可以变化，但是人IgG
重链Fc区通常定义为自其Cys226或Pro230位置的氨基酸残基至羧基末端的
区段。Fc区的C-末端赖氨酸(残基447，依照EU编号系统)可以消除，例如
在生产或纯化抗体的过程中，或者通过对编码抗体重链的核酸进行重组工程
改造。因而，完整抗体组合物可以包括所有K447残基都被消除的抗体群、无
一K447残基被消除的抗体群或者混合了有K447残基的抗体和没有K447残基
的抗体的抗体群。
“功能性Fc区”拥有天然序列Fc区的“效应器功能”。例示性的“效应器功
能”包括C1q结合；CDC；Fc受体结合；ADCC；吞噬作用；细胞表面受体(例
如B细胞受体；BCR)下调等。此类效应器功能一般要求Fc区与结合结构域
(例如抗体可变域)组合，而且可以使用多种测定法来评估，例如本文定义
中所公开的。
“天然序列Fc区”包含与在自然界中找到的Fc区的氨基酸序列相同的氨
基酸序列。天然序列人Fc区包括天然序列人IgG1 Fc区(非A和A同种异型)；
天然序列人IgG2 Fc区；天然序列人IgG3 Fc区；和天然序列人IgG4 Fc区；及
其天然存在变体。
“变异Fc区”包含由于至少一处氨基酸修饰(优选一处或多处氨基酸替
代)而与天然序列Fc区有所不同的氨基酸序列。优选的是，变异Fc区与天然
序列Fc区相比或与亲本多肽的Fc区相比具有至少一处氨基酸替代，例如在天
然序列Fc区中或在亲本多肽的Fc区中具有约1处至约10处氨基酸替代，优选
约1处至约5处氨基酸替代。变异Fc区在本文中优选与天然序列Fc区和/或亲本
多肽的Fc区拥有至少约80％的同源性，最优选与它们具有至少约90％的同源
性，更优选与它们具有至少约95％的同源性。
“抗体依赖性细胞介导的细胞毒性”或“ADCC”指其中结合到某些细胞毒
性细胞(例如天然杀伤(NK)细胞、嗜中性粒细胞和巨噬细胞)上存在的Fc
受体(FcR)上的分泌型Ig使得这些细胞毒性效应细胞能够特异性结合携带抗
原的靶细胞，随后用细胞毒素杀死靶细胞的细胞毒性形式。该抗体“武装”(arm)
细胞毒性细胞，而且是此类杀伤作用绝对要求的。介导ADCC的主要细胞，
NK细胞，只表达FcγRIII，而单核细胞表达FcγRI、FcγRII和FcγRIII。Ravetch
and Kinet，Annu.Rev.Immunol.9：457-92(1991)第464页表3总结了造血细胞
上的FcR表达。为了评估目的分子的ADCC活性，可进行体外ADCC测定法，
诸如美国专利No.5,500,362或5,821,337中所记载的。可用于此类测定法的效
应细胞包括外周血单个核细胞(PBMC)和天然杀伤(NK)细胞。或者/另外，可
在体内评估目的分子的ADCC活性，例如在动物模型中，诸如Clynes et al.，
(USA)95：652-656(1998)中所披露的。
“Fc受体”或“FcR”描述能结合抗体Fc区的受体。优选的FcR是天然序列人
FcR。此外，优选的FcR是能结合IgG抗体的FcR(γ受体)，包括FcγRI、FcγRII
和FcγRIII亚类的受体，包括这些受体的各等位变体和各可变剪接形式。
FcγRII受体包括FcγRIIA(“活化受体”)和FcγRIIB(“抑制受体”)，它们具有
相似的氨基酸序列，区别主要在于其胞质结构域。活化受体FcγRIIA在其胞
质结构域中包含免疫受体基于酪氨酸的活化基序(ITAM)。抑制受体FcγRIIB
在其胞质结构域中包含免疫受体基于酪氨酸的抑制基序(ITIM)(参见综述
Daёron，Annu.Rev.Immunol.15：203-234(1997))。FcR的综述参见Ravetch and
Kinet，Annu.Rev.Immunol.9：457-492(1991)；Capel et al.，Immunomethods
4：25-34(1994)；及de Haas et al.，J.Lab.Clin.Med.126：330-41(1995)。术语
“FcR”在本文中涵盖其它FcR，包括那些未来将会鉴定的。该术语还包括新生
儿受体，FcRn，其负责将母体IgG转移给胎儿(Guyer et al.，J.Immunol.117：587
(1976)及Kim et al.，J.Immunol.24：249(1994))。
可测定人FcRn高亲和力结合多肽与人FcRn的体内结合和血清半衰期，
例如在表达人FcRn的转基因小鼠或经转染的人细胞系中，或者在施用了具有
变异Fc区的多肽的灵长类动物中。WO 00/42072(Presta)记载了对FcR的结合
提高或降低的抗体变体。还可参见Shields et al.，J.Biol.Chem.9(2)：6591-6604
(2001)。
“人效应细胞”指表达一种或多种FcR并行使效应器功能的白细胞。优选
的是，该细胞至少表达FcγRIII并行使ADCC效应器功能。介导ADCC的人白
细胞的例子包括外周血单个核细胞(PBMC)、天然杀伤(NK)细胞、单核细胞、
细胞毒性T细胞和嗜中性粒细胞，优选PBMC和NK细胞。效应细胞可以从其
天然来源分离，例如血液。
“补体依赖性细胞毒性”或“CDC”指存在补体时对靶细胞的溶解。经典补
体途径的激活是由补体系统第一组分(C1q)结合抗体(适宜亚类的)起始的，
该抗体已结合至其关联抗原。为了评估补体激活，可进行CDC测定法，例如
如Gazzano-Santoro et al.，J.Immunol.Methods 202：163(1996)中所记载的。具
有更改的Fc区氨基酸序列(具有变异Fc区的多肽)及提高或降低的C1q结合
能力的多肽变体记载于例如美国专利No.6,194,551 B1和WO 1999/51642。还
可参见例如Idusogie et al.，J.Immunol.164：4178-4184(2000)。
“含Fc区的抗体”指包含Fc区的抗体。Fc区的C-末端赖氨酸(依照EU编号
系统的残基447)可以消除，例如在纯化抗体的过程中或者通过重组改造编
码抗体的核酸。因此，依照本发明包含具有Fc区的抗体的组合物可包含具有
K447的抗体、消除了所有K447的抗体或具有与没有K447残基的抗体的混合
物。
FcRH5多肽“胞外结构域”或“ECD”指FcRH5多肽基本上不含跨膜结构域
和胞质结构域的形式。通常，FcRH5多肽ECD具有少于1％的此类跨膜结构域
和/或胞质结构域，优选具有少于0.5％的此类结构域。可以理解，为本发明
FcRH5多肽鉴定的任何跨膜结构域是依照本领域常规用于鉴定该种类型疏
水结构域的标准鉴定的。跨膜结构域的精确边界可以变化，但最有可能的是
本文中最初鉴定的结构域任一末端不超过约5个氨基酸。因此，任选的是，
FcRH5多肽的胞外结构域可包含实施例或说明书中所鉴定的跨膜结构域/胞
外结构域边界任一侧的约5个或5个以下的氨基酸，而且本发明设想了具有或
没有相关信号肽的此类多肽及编码它们的核酸。
本说明书和/或附图中可能显示了本文中所公开的各种FcRH5多肽的“信
号肽”的大致位置。然而，应当注意，信号肽的C-末端边界可以变化，但最
有可能的是本文中最初鉴定的信号肽C-末端边界任一侧不超过约5个氨基
酸，其中信号肽的C-末端边界可依照本领域常规用于鉴定该种类型氨基酸序
列元件的标准来鉴定(例如Nielsen et al.，Prot.Eng.10：1-6(1997)和von Heinje
et al.，Nucl.Acids.Res.14：4683-4690(1986))。此外，还认识到，在有些情况
中，从分泌多肽上切除信号序列不是完全统一的，导致超过一种分泌种类。
本发明设想了这些成熟多肽，其中信号肽在本文中所鉴定的信号肽C-末端边
界任一侧不超过约5个氨基酸内切除，及编码它们的多核苷酸。
“FcRH5多肽变体”意指与本文中所公开的全长天然序列FcRH5多肽序
列、本文中所公开的缺少信号肽的FcRH5多肽序列、本文中所公开的具有或
没有信号肽的FcRH5多肽胞外结构域或本文中所公开的全长FcRH5多肽序列
的任何其它片段(诸如那些由只代表全长FcRH5多肽完整编码序列的一部分
的核酸编码的)具有至少约80％氨基酸序列同一性的FcRH5多肽，优选本文
中所定义的活性FcRH5多肽。此类FcRH5多肽变体包括例如在全长天然氨基
酸序列的N-或C-末端添加或删除一个或多个氨基酸残基的FcRH5多肽。通
常，FcRH5多肽变体与本文中所公开的全长天然序列FcRH5多肽序列、本文
中所公开的缺少信号肽的FcRH5多肽序列、本文中所公开的具有或没有信号
肽的FcRH5多肽胞外结构域或本文中所公开的全长FcRH5多肽序列的任何其
它明确限定的片段具有至少约80％的氨基酸序列同一性，或者至少约81％、
82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、
94％、95％、96％、97％、98％或99％的氨基酸序列同一性。通常，FcRH5变
异多肽的长度为至少约10个氨基酸，或者长度为至少约20、30、40、50、60、
70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、
210、220、230、240、250、260、270、280、290、300、310、320、330、
340、350、360、370、380、390、400、410、420、430、440、450、460、
470、480、490、500、510、520、530、540、550、560、570、580、590、
600个氨基酸，或更多。任选的是，FcRH5变异多肽与天然FcRH5多肽序列相
比具有不超过一处保守氨基酸替代，或者与天然FcRH5多肽序列相比具有不
超过2、3、4、5、6、7、8、9或10处保守氨基酸替代。
关于肽或多肽序列(即本文中所鉴定的FcRH5多肽序列)的“百分比(％)
氨基酸序列同一性”定义为对比序列并在必要时引入缺口以获取最大百分比
序列同一性后，且不将任何保守替代视为序列同一性的一部分时，候选序列
中与特定肽或多肽序列(即FcRH5多肽序列)中的氨基酸残基相同的氨基酸
残基的百分率。为测定百分比氨基酸序列同一性目的的对比可以本领域技术
范围内的多种方式进行，例如使用公众可得到的计算机软件，诸如BLAST、
BLAST-2、ALIGN或Megalign(DNASTAR)软件。本领域技术人员可决定用
于测量对比的适宜参数，包括对所比较序列全长获得最大对比所需的任何算
法。然而，为了本发明的目的，％氨基酸序列同一性值是使用序列比较计算
机程序ALIGN-2获得的，其中下文表1中提供了ALIGN-2程序的完整源代码。
ALIGN-2序列比较计算机程序由Genentech公司编写，下文表1所示源代码已
经连同用户文档一起提交给美国版权局(US Copyright Office，Washington
D.C.，20559)，并以美国版权注册号TXU510087注册。公众可通过Genentech
公司(South San Francisco，California)得到ALIGN-2程序，或者可从下文表1中
提供的源代码编译。ALIGN2程序应当编译成在UNIX操作系统，优选数码
UNIX V4.0D上使用。所有序列比较参数由ALIGN-2程序设定且不变。
在采用ALIGN-2来比较氨基酸序列的情况中，给定氨基酸序列A相对于
(to)、与(with)或针对(against)给定氨基酸序列B的％氨基酸序列同一性(或者
可表述为具有或包含相对于、与或针对给定氨基酸序列B的某一％氨基酸序
列同一性的给定氨基酸序列A)如下计算：
分数X/Y 乘 100
其中X是由序列对比程序ALIGN-2在该程序的A和B对比中评分为相同匹配
的氨基酸残基数，且其中Y是B中的氨基酸残基总数。可以领会，若氨基酸
序列A的长度与氨基酸序列B的长度不相等，则A相对于B的％氨基酸序列同
一性将不等于B相对于A的％氨基酸序列同一性。
“FcRH5变异多核苷酸”或“FcRH5变异核酸”意指与编码本文中所公开的
全长天然序列FcRH5多肽序列、本文中所公开的缺少信号肽的全长多肽序列
FcRH5多肽序列、本文中所公开的具有或没有信号肽的FcRH5多肽胞外结构
域或本文中所公开的全长FcRH5多肽序列的任何其它片段(诸如那些由只代
表全长FcRH5多肽完整编码序列的一部分的核酸编码的)具有至少约80％核
酸序列同一性的编码FcRH5多肽(优选本文中所定义的活性FcRH5多肽)的
核酸。通常，FcRH5变异多核苷酸与编码本文中所公开的全长天然序列FcRH5
多肽序列、本文中所公开的缺少信号肽的全长天然FcRH5多肽序列、本文中
所公开的具有或没有信号序列的FcRH5多肽胞外结构域或本文中所公开的
全长FcRH5多肽序列的任何其它片段的核酸序列具有至少约80％的核酸序列
同一性，或者至少约81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、
90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的核酸序列
同一性。变体不涵盖天然核苷酸序列。
通常，FcRH5变异多核苷酸的长度为至少约5个核苷酸，或者长度为至
少约6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、
23、24、25、26、27、28、29、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、
80、85、90、95、100、105、110、115、120、125、130、135、140、145、
150、155、160、165、170、175、180、185、190、195、200、210、220、
230、240、250、260、270、280、290、300、310、320、330、340、350、
360、370、380、390、400、410、420、430、440、450、460、470、480、
490、500、510、520、530、540、550、560、570、580、590、600、610、
620、630、640、650、660、670、680、690、700、710、720、730、740、
750、760、770、780、790、800、810、820、830、840、850、860、870、
880、890、900、910、920、930、940、950、960、970、980、990、1000、
1010、1020、1030、1040、1050、1060、1070、1080、1090、1100、1110、
1120、1130、1140、1150、1160、1170、1180、1190、1200、1210、1220、
1230、1240、1250、1260、1270、1280、1290、或1300个核苷酸，其中在此
语境中，术语“约”意指所述核苷酸序列长度加上或减去该所述长度的10％。
关于本文中所鉴定的FcRH5编码核酸序列的“百分比(％)核酸序列同一
性”定义为对比序列并在必要时引入缺口以获取最大百分比序列同一性后，
候选序列中与感兴趣FcRH5核酸序列中的核苷酸相同的核苷酸的百分率。为
测定百分比核酸序列同一性目的的序列对比可以本领域技术范围内的多种
方式进行，例如使用公众可得到的计算机软件，诸如BLAST、BLAST-2、
ALIGN或Megalign(DNASTAR)软件。然而，为了本发明的目的，％核酸序
列同一性值是使用序列比较计算机程序ALIGN-2获得的，其中下文表1中提
供了ALIGN-2程序的完整源代码。ALIGN-2序列比较计算机程序由Genentech
公司编写，下文表1所示源代码已经连同用户文档一起提交给美国版权局(US
Copyright Office，Washington D.C.，20559)，并以美国版权注册号TXU510087
注册。公众可通过Genentech公司(South San Francisco，California)得到
ALIGN-2程序，或者可从下文表1中提供的源代码编译。ALIGN2程序应当编
译成在UNIX操作系统，优选数码UNIX V4.0D上使用。所有序列比较参数由
ALIGN-2程序设定且不变。
在采用ALIGN-2来比较核酸序列的情况中，给定核酸序列C相对于(to)、
与(with)或针对(against)给定氨基酸序列D的％核酸序列同一性(或者可表述
为具有或包含相对于、与或针对给定核酸序列D的某一％核酸序列同一性的
给定核酸序列C)如下计算：
分数W/Z 乘 100
其中W是由序列对比程序ALIGN-2在该程序的C和D对比中评分为相同匹配
的核苷酸数，且其中Z是D中的核苷酸总数。可以领会，若核酸序列C的长度
与核酸序列D的长度不相等，则C相对于D的％核酸序列同一性将不等于D相
对于C的％核酸序列同一性。除非另有具体说明，本文中所使用的所有％核
酸序列同一性值都是依照上一段所述，使用ALIGN-2计算机程序获得的。
在其它实施方案中，FcRH5变异多核苷酸是编码FcRH5多肽且能够与本
文中所公开的编码全长FcRH5多肽的核苷酸序列杂交，优选在严格杂交和洗
涤条件下杂交的核酸分子。FcRH5变异多肽可以是那些由FcRH5变异多核苷
酸编码的。
术语“全长编码区”在述及编码FcRH5多肽的核酸使用时指编码本发明全
长FcRH5多肽的核苷酸序列(常常在附图中起始和终止密码子(含)之间显
示)。术语“全长编码区”在述及ATCC保藏核酸使用时指插入保藏在ATCC的
载体中的cDNA的FcRH5多肽编码部分(常常在附图中起始和终止密码子
(含)之间显示，起始和终止密码子在图中以粗体显示且划有下划线)。
“分离的”，在用于描述本文中所公开的各种FcRH5多肽时，意指已经鉴
定且与/由其天然环境的成分分开和/或回收的多肽。多肽的天然环境的污染
性成分指通常会干扰其治疗用途的物质，可包括酶、激素和其它蛋白质性质
或非蛋白质性质的溶质。在优选的实施方案中，将多肽纯化至(1)足以通过
使用转杯式测序仪获得至少15个残基的N-末端或内部氨基酸序列的程度，或
(2)根据使用考马斯蓝或优选银染色的非还原性或还原性条件下的
SDS-PAGE，达到同质。既然FcRH5多肽的天然环境的至少一种成分不会存
在，那么分离的多肽包括重组细胞内的原位多肽。然而，分离的多肽通常通
过至少一个纯化步骤来制备。
“分离的”FcRH5多肽编码核酸或其它多肽编码核酸指已经鉴定且与多肽
编码核酸的天然来源中通常与之关联的至少一种污染性核酸分子分开的核
酸分子。分离的多肽编码核酸分子不同于在自然界中发现它时的形式或背
景。分离的多肽编码核酸分子因此与存在于天然细胞中时的特定多肽编码核
酸分子有区别。然而，分离的多肽编码核酸分子包括通常表达该多肽的细胞
中所包含的多肽编码核酸分子，例如当所述核酸分子在所述细胞中的染色体
定位不同于它在天然细胞中的染色体定位时。
术语“控制序列”指在特定宿主生物体中表达可操作连接的编码序列所
必需的DNA序列。例如，适于原核生物的控制序列包括启动子、任选的操纵
基因序列和核糖体结合位点。已知真核细胞利用启动子、多腺苷酸化信号和
增强子。
若一段核酸与另一段核酸序列处于功能性相互关系中，则它是“可操作
连接的”。例如，若前序列(presequence)或分泌前导(secretory leader)的DNA
表达成参与多肽分泌的前蛋白质(preprotein)，则它与该多肽的DNA可操作连
接；若启动子或增强子影响编码序列的转录，则它与该序列可操作连接；或
者，若核糖体结合位点的位置促进翻译，则它与编码序列可操作连接。一般
而言，“可操作连接的”意味着相连的DNA序列是相邻的，而且在分泌前导的
情况中意味着相邻且处于阅读状态。然而，增强子不必相邻。连接可以通过
在方便的限制性位点处的连接来实现。若没有此类位点，则依照常规实践使
用合成的寡核苷酸衔接头或接头。
杂交反应的“严格性”容易为本领域普通技术人员所确定，并且通常取决
于探针长度、洗涤温度和盐浓度凭经验计算。一般而言，较长的探针需要较
高的温度用于正确的退火，而较短的探针则需要较低的温度。当互补链存在
于低于它们解链温度的环境中时，杂交通常取决于变性DNA重新退火的能
力。探针和能杂交的序列之间的期望同源性程度越高，就可使用越高的相对
温度。作为结果，推出，更高的相对温度趋向于使反应条件更加严格，而更
低的温度则更不严格。对于杂交反应的严格性的补充细节及解释参见
Ausubel等的《Current Protocols in Molecular Biology》，Wiley Interscience
Publishers，(1995)。
如本文中所定义的，“严格条件”或“高严格条件”可以定义如下：(1)对
于洗涤使用低离子强度和高温，例如0.015M氯化钠/0.0015M柠檬酸钠
/0.1％十二烷基硫酸钠，50℃；(2)在杂交期间使用变性剂，诸如甲酰胺，
例如，50％(v/v)甲酰胺及0.1％牛血清清蛋白/0.1％ Ficoll/0.1％聚乙烯吡咯
烷酮/具有750mM氯化钠，75mM柠檬酸钠的50mM磷酸钠缓冲液pH 6.5，
42℃，或(3)在使用50％甲酰胺，5x SSC(0.75M NaCl，0.075M柠檬酸钠)，
50mM磷酸钠(pH6.8)，0.1％焦磷酸钠，5x Denhardt氏溶液，超声处理的鲑
精DNA(50μg/ml)，0.1％ SDS和10％硫酸右旋糖苷的溶液中于42℃杂交过
夜，于42℃在0.2xSSC(氯化钠/柠檬酸钠)中洗涤10分钟，接着是于55℃由含
有EDTA的0.1xSSC组成的10分钟高严格洗涤。
“中等严格条件”可规定为如Sambrook等的《Molecular Cloning：A
Laboratory Manual》(New York：Cold Spring Harbor Press，1989)所描述的，
而且包括使用与上文所述那些相比较不严格的洗涤溶液和杂交条件(例如温
度、离子强度和％SDS)。中等严格条件的一个例子是在含：20％甲酰胺、
5xSSC(150mM NaCl，15mM柠檬酸三钠)、50mM磷酸钠(pH7.6)、5x
Denhardt氏溶液、10％硫酸右旋糖苷和20mg/ml变性的剪切的鲑精DNA的
溶液中于37℃温育过夜，然后于约37-50℃在1x SSC中洗涤滤膜。本领域熟
练技术人员应当认识到如何根据适应诸如探针长度等因素的需要来调节温
度、离子强度等。
术语“表位标记的”在用于本文时指包含FcRH5多肽或抗FcRH5抗体且其
与“标签多肽”融合的嵌合多肽。标签多肽具有足够残基以提供表位而可制备
针对其的抗体，但又足够短使得其不干扰与其融合的多肽的活性。标签多肽
优选还是相当独特的，使得其抗体基本上不与其它表位发生交叉反应。合适
的标签多肽通常具有至少6个氨基酸残基，通常在约8个和约50个氨基酸残基
之间(优选在约10个和约20个氨基酸残基之间)。
“有活性的”或“活性”为了本发明的目的指FcRH5多肽保留天然或天然存
在FcRH5的生物学和/或免疫学活性的形式，其中“生物学”活性指由天然或天
然存在FcRH5引起的，除诱导针对天然或天然存在FcRH5所拥有的抗原性表
位的抗体生成的能力外的生物学功能(或是抑制性的或是刺激性的)，而“免
疫学”活性指诱导针对天然或天然存在FcRH5所拥有的抗原性表位的抗体生
成的能力。
术语“拮抗剂”以最广义使用，包括部分或完全阻断、抑制或中和天然
FcRH5多肽的生物学活性的任何分子。类似的，术语“激动剂”以最广义使用，
包括模拟天然FcRH5多肽的生物学活性的任何分子。合适的激动剂或拮抗剂
明确包括激动性或拮抗性抗体或抗体片段、天然FcRH5多肽的片段或氨基酸
序列变体、肽、反义寡核苷酸、有机小分子、等。用于鉴定FcRH5多肽的激
动剂或拮抗剂的方法可包括使FcRH5多肽接触候选激动剂或拮抗剂分子，并
测量通常与FcRH5多肽有关的一种或多种生物学活性中的可检测变化。
“纯化的”意味着分子以至少95％(以重量计)或至少98％(以包含它的
样品的重量计)的浓度存在于样品中。
“分离的”核酸分子指与例如该核酸分子的天然来源中通常与之关联的
至少一种其它核酸分子分开的核酸分子。分离的核酸分子进一步包括包含在
通常表达该核酸分子的细胞中的核酸分子，但是所述核酸分子是以染色体外
形式存在的或在染色体上的定位不同于它其天然染色体定位。
术语“载体”在用于本文时意指能够运输与其连接的其它核酸的核酸分
子。一类载体是“质粒”，指其中可连接另外的DNA区段的环状双链DNA环。
另一类载体是噬菌体载体。另一类载体是病毒载体，其中可将另外的DNA
区段连接到病毒基因组中。某些载体能够在其所导入的宿主细胞中自主复制
(例如具有细菌复制起点的细菌载体和附加型哺乳动物载体)。其它载体(例
如非附加型哺乳动物载体)可在导入宿主细胞后整合到宿主细胞的基因组
中，由此随着宿主基因组一起复制。此外，某些载体能够指导与其可操作连
接的基因表达。此类载体在本文中称为“重组表达载体”(或简称为“重组载
体”)。通常，在重组DNA技术中有用的表达载体常常是质粒形式。在本说明
书中，“质粒”和“载体”可互换使用，因为质粒是载体的最常用形式。
“多核苷酸”或“核酸”在本文中可互换使用，指任何长度的核苷酸聚合物，
包括DNA和RNA。核苷酸可以是脱氧核糖核苷酸、核糖核苷酸、经过修饰的
核苷酸或碱基和/或其类似物，或者是可通过DNA或RNA聚合酶或者通过合
成反应掺入聚合物的任何底物。多核苷酸可包含经过修饰的核苷酸，诸如甲
基化核苷酸及其类似物。如果有的话，对核苷酸结构的修饰可以在装配聚合
物之前或之后进行。核苷酸序列可以由非核苷酸组分中断。多核苷酸可以在
合成后进一步修饰，诸如通过与标记物偶联。其它类型的修饰包括例如“帽”，
将一个或多个天然存在的核苷酸用类似物替代，核苷酸间修饰诸如例如具有
不带电荷连接(例如膦酸甲酯、磷酸三酯、磷酰胺酯(phosphoamidate)、氨基
甲酸酯等)和具有带电荷连接(例如硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯等)的修饰，
含有悬垂模块(pendant moiety)诸如例如蛋白质(例如核酸酶、毒素、抗体、
信号肽、聚L-赖氨酸等)的修饰、具有嵌入剂(例如吖啶、补骨脂素等)的
修饰、含有螯合剂(例如金属、放射性金属、硼、氧化性金属等)的修饰、
含有烷化剂的修饰、具有经修饰连接(例如α端基异构核酸(anomeric nucleic
acid)等)的修饰、以及未修饰形式的多核苷酸。另外，通常存在于糖类中的
任何羟基可以用例如膦酸(phosphonate)基团、磷酸(phosphate)基团替换，用
标准保护基团保护，或活化以制备与别的核苷酸的别的连接，或者可偶联至
固体或半固体支持物。5′和3′末端OH可磷酸化或者用胺或1-20个碳原子的有
机加帽基团模块取代。其它羟基也可衍生成标准保护基团。多核苷酸还可含
有本领域普遍知道的核糖或脱氧核糖糖类的类似物形式，包括例如2′-氧-甲
基、2′-氧-烯丙基、2′-氟-或2′-叠氮-核糖，碳环糖类似物，α-端基异构糖，差
向异构糖诸如阿拉伯糖、木糖或来苏糖、吡喃糖、呋喃糖、景天庚酮糖，无
环类似物及脱碱基核苷类似物诸如甲基核糖核苷。可用备选接头团替换一个
或多个磷酸二酯连接。这些备选接头团包括但不限于以下实施方案，其中磷
酸酯用P(O)S(“硫代酸酯”(thioate))、P(S)S(“二硫代酸酯”(dithioate))、(O)NR2
(“酰胺酯”(amidate))、P(O)R、P(O)OR′、CO或CH2(“甲缩醛”(formacetal))
替代，其中R或R′各自独立为H或者取代或未取代的烷基(1-20个C)，任选含
有醚(-O-)连接、芳基、烯基、环烷基、环烯基或芳烷基(araldyl)。并非多核
苷酸中的所有连接都必需是相同的。前述描述适用于本文中提及的所有多核
苷酸，包括RNA和DNA。
“寡核苷酸”在用于本文时一般指短的多核苷酸，一般是单链，一般是合
成的，长度一般但不是必需小于约200个核苷酸。术语“寡核苷酸”与“多核苷
酸”并不互相排斥。上文关于多核苷酸的描述平等且完全适用于寡核苷酸。
术语“癌症”和“癌性”指或描述哺乳动物中特征通常为细胞生长不受调节
的生理疾患。癌症的例子包括但不限于造血癌症或血液相关癌症，诸如淋巴
瘤、白血病、骨髓瘤或淋巴样恶性肿瘤，但是还有脾的癌症和淋巴结的癌症，
而且还有癌瘤(carcinoma)、母细胞瘤(blastoma)和肉瘤(sarcoma)。癌症的更具
体例子包括B细胞相关癌症，包括例如高级、中级和低级淋巴瘤(包括B细
胞淋巴瘤，诸如例如粘膜相关淋巴样组织B细胞淋巴瘤和非何杰金氏淋巴瘤
(NHL)、套细胞淋巴瘤、伯基特氏淋巴瘤(Burkitt’s lymphoma)、小淋巴细胞
性淋巴瘤、边缘区淋巴瘤、弥漫性大细胞淋巴瘤、滤泡性淋巴瘤和何杰金氏
淋巴瘤及T细胞淋巴瘤)和白血病(包括继发性白血病、慢性淋巴细胞性白
血病(CLL)诸如B细胞白血病(CD5+B淋巴细胞)、髓细胞性白血病诸如急性
髓细胞样白血病、慢性髓细胞样白血病、淋巴样白血病诸如急性成淋巴细胞
性白血病(ALL)和脊髓发育不良)和其它血液学和/或B细胞或T细胞相关癌
症。还包括别的造血细胞的癌症，包括多形核白细胞，诸如嗜碱性粒细胞、
嗜酸性粒细胞、嗜中性粒细胞和单核细胞、树突细胞、血小板、红细胞和天
然杀伤细胞。还包括选自下组的癌性B细胞增殖性病症：淋巴瘤(lymphoma)、
非何杰金氏淋巴瘤(non-Hodgkins lymphoma)(NHL)、攻击性NHL(aggressive
NHL)、复发性攻击性NHL(relapsed aggressive NHL)、复发性无痛性
NHL(relapsed indolent NHL)、顽固性NHL(refractory NHL)、顽固性无痛性
NHL(refractory indolent NHL)、慢性淋巴细胞性白血病(refractory indolent
NHL)(CLL)、小淋巴细胞淋巴瘤(small lymphocytic lymphoma)、白血病
(leukemia)、毛细胞白血病(hairy cell leukemia)(HCL)、急性淋巴细胞性白血
病(acute lymphocytic leukemia)(ALL)和套细胞淋巴瘤(mantle cell lymphoma)。
B细胞癌症的起源包括如下：边缘区B细胞淋巴瘤源自边缘区中的记忆B细
胞，滤泡性淋巴瘤和弥漫性大B细胞淋巴瘤源自生发中心的亮区(light zone)
中的中央细胞(centrocyte)，慢性淋巴细胞性白血病和小淋巴细胞性白血病源
自B1细胞(CD5+)，套细胞淋巴瘤源自外套层(mantle zone)中的幼稚B细胞
(![]()
B cell)，而伯基特氏淋巴瘤(Burkitt’s lymphoma)源自生发中心的暗区
(dark zone)中的成中央细胞(centroblast)。包括本文中称作“造血细胞组织”的
造血细胞的组织包括胸腺和骨髓及外周淋巴样组织，诸如脾、淋巴结、与粘
膜有关的淋巴样组织，诸如肠相关淋巴样组织、扁桃体、派伊尔氏斑及与其
它粘膜有关的附件(appendix)和淋巴样组织，例如支气管内衬(lining)。此类
癌症的其它具体例子包括括鳞状细胞癌、小细胞肺癌、非小细胞肺癌、肺的
腺癌、肺的鳞癌、腹膜癌、肝细胞癌、胃肠癌、胰腺癌、胶质瘤、宫颈癌、
卵巢癌、肝癌、膀胱癌、肝肉瘤(hepatoma)、乳腺癌、结肠癌、结肠直肠癌、
子宫内膜癌或子宫癌、唾液腺癌、肾癌、肝癌、前列腺癌、外阴癌、甲状腺
癌、肝癌、白血病和其它淋巴增生性病症、及各种类型的头和颈癌。
“B细胞恶性肿瘤”在本文中包括非何杰金氏淋巴瘤(NHL)，其包括低级/
滤泡性NHL、小淋巴细胞性(SL)NHL、中级/滤泡性NHL、中级弥漫性NHL、
高级成免疫细胞性NHL、高级成淋巴细胞性NHL、高级小无核裂细胞NHL、
大块病NHL、套细胞淋巴瘤、AIDS相关淋巴瘤和瓦尔登斯特伦氏巨球蛋白
血症(Waldenstrom’s Macroglobulinemia)、非何杰金氏淋巴瘤(NHL)、淋巴细
胞为主型的何杰金氏病(LPHD)、小淋巴细胞性淋巴瘤(SLL)、慢性淋巴细胞
性白血病(CLL)、无痛性NHL(包括复发性无痛性NHL和利妥昔单抗不应性
无痛性NHL)；白血病，其包括急性成淋巴细胞性白血病(ALL)、慢性淋巴细
胞性白血病(CLL)、毛细胞白血病、慢性成髓细胞性白血病；套细胞淋巴瘤；
和其它血液学恶性肿瘤。此类恶性肿瘤可以用针对B细胞表面标志物(诸如
FcRH5)的抗体来治疗。此类疾病涵盖在本文中，以通过施用针对B细胞表
面标志物(诸如FcRH5)的抗体来治疗，包括施用未偶联的抗体(“裸抗体”)
或偶联有细胞毒剂的抗体，正如本文中所公开的。此类疾病还涵盖在本文中，
以通过包括本发明的抗FcRH5抗体或抗FcRH5抗体药物偶联物组合另一抗体
或抗体药物偶联物、另一细胞毒剂、放射或其它治疗的组合疗法(同时施用
或顺次施用)来治疗。在本发明的例示性治疗方法中，组合施用本发明的抗
FcRH5抗体及抗CD20抗体、免疫球蛋白或其CD20结合片段，或是一起施用
或是顺次施用。所述抗CD20抗体可以是裸抗体或抗体药物偶联物。在组合
疗法的一个实施方案中，所述抗FcRH5抗体是本发明的抗体，而所述抗CD20
抗体是![]()
(利妥昔单抗，即rituximab)。
术语“非何杰金氏(Hodgkin)淋巴瘤”或“NHL”在用于本文时指何杰金氏
淋巴瘤以外的淋巴系统癌症。通常可通过何杰金氏淋巴瘤中存在里-施
(Reed-Sternberg)细胞而非何杰金氏淋巴瘤中不存在所述细胞将何杰金氏淋
巴瘤与非何杰金氏淋巴瘤区分开来。非何杰金氏淋巴瘤在该术语用于本文时
所涵盖的例子包括本领域技术人员(例如肿瘤学家或病理学家)依照本领域
已知的分类表将鉴定为此类的任何淋巴瘤，诸如Color Atlas of Clinical
Hematology，第3版，Victor A.Hoffbrand和John E.Pettit编，Harcourt Publishers
Ltd.，2000中记载的Revised European-American Lymphoma(REAL)scheme(欧
美淋巴瘤修正表)。具体参见图11.57、11.58和11.59中的表。更具体例子包括
但不限于复发性或顽固性NHL、前线(front line)低级NHL、阶段III/IV NHL、
化疗耐受性NHL、前体B成淋巴细胞性白血病和/或淋巴瘤、小淋巴细胞性淋
巴瘤、B细胞慢性淋巴细胞性白血病和/或前淋巴细胞性白血病和/或小淋巴细
胞性淋巴瘤、B细胞前淋巴细胞性淋巴瘤、免疫细胞瘤和/或淋巴浆细胞性
(lymphoplasmacytic)淋巴瘤、淋巴浆细胞性淋巴瘤、边缘区B细胞淋巴瘤、脾
边缘区淋巴瘤、节外边缘区(extranodal marginal zone)-MALT淋巴瘤、节边
缘区(nodal marginal zone)淋巴瘤、毛细胞性白血病、浆细胞瘤和/或浆细胞骨
髓瘤、低级/滤泡淋巴瘤、中级/滤泡NHL、套细胞淋巴瘤、滤泡中心淋巴瘤
(滤泡的)、中级弥漫性NHL、弥漫性大B细胞淋巴瘤、攻击性(agressive)NHL
(包括攻击性前线NHL和攻击性复发性NHL)、自体干细胞移植后复发性或
顽固性NHL、原发性纵隔大B细胞淋巴瘤、原发性渗出性淋巴瘤、高级成免
疫细胞NHL、高级成淋巴细胞NHL、高级小无核裂细胞NHL、贮积病(bulky
disease)NHL、伯基特氏(Burkitt)淋巴瘤、前体(外周)大粒状淋巴细胞白血
病、蕈样肉芽肿病和/或塞扎里(Sezary)综合征、皮肤淋巴瘤、间变性大细胞
淋巴瘤、血管中心性淋巴瘤。
浆细胞病症源自浆细胞克隆失控的分裂或增殖。浆细胞来自活化的B淋
巴细胞(即B细胞)。每个B细胞生成一种独特的对外来物质即抗原特异性的
受体，称作B细胞受体，排列在其细胞表面上。当B细胞受体结合其关联抗
原时，表达受体的细胞被活化来再次进入细胞周期，生成它自身的许多克隆
拷贝。这些克隆成熟成浆细胞，主要驻留在骨瘤中并特化来生成B细胞受体
的拷贝，作为抗体释放如血流。在浆细胞病症中，浆细胞或亲本B细胞遭受
遗传损伤，导致对细胞分裂和/或活性的正常约束受到阻抑或不敏感。自此类
细胞衍生的子浆细胞是恶性的，即它们可不受检查地分裂和/或生成过量的相
同免疫球蛋白(抗体)。生成的免疫球蛋白常常是不完整的或具有不正确的
构象，可导致该蛋白质(也称作单克隆抗体、M蛋白、副蛋白或淀粉状蛋白，
取决于具体病症)在血清、组织或器官(尤其是肾)中积累，导致器官功能
障碍和/或衰竭。浆细胞病症包括性质未确定的单克隆丙种球蛋白病
(MGUS)、多发性骨髓瘤(MM)、巨球蛋白血症、重链病、和系统性轻链淀粉
样变(AL)，它们基于克隆的增殖性质、骨髓涉及的程度、和表达的M蛋白的
类型来区分。别的浆细胞病症有孤立性浆细胞瘤、髓外浆细胞瘤、多发性孤
立性浆细胞瘤、浆细胞白血病、瓦尔登斯特伦使巨球蛋白血症、B细胞非何
杰金淋巴瘤、B细胞慢性淋巴细胞性白血病。虽然新的免疫疗法(诸如利妥
昔单抗和阿仑单抗)在一些B细胞恶性中具有改善的无疾病和总体存活，但
是此类疗法尚未证明在浆细胞病症的治疗中有效，部分因为恶性克隆浆细胞
对靶抗原CD20和CD52的表达不充分。如此，需要鉴定和开发浆细胞病症的
改良疗法(参见已公布的美国申请No.20080166742和20080317745，通过述及
将其每一篇完整收入本文)。
先前已显示FcRH5(IRTA2)在B细胞、浆细胞、和多发性骨髓瘤细胞(包
括来自MM患者样品的细胞)上的表达(参见已公布的美国申请No.
20060251662，通过述及完整收入本文)。因而，根据多发性骨髓瘤样品中的
FcRH5表达样式，该分子是哺乳动物中肿瘤(包括浆细胞病症，诸如本文所
述那些(即多发性骨髓瘤))和与抗体分泌有关的疾病(诸如变态反应或自
身免疫病)的治疗的一种卓越靶物。
“病症”指任何会受益于使用本发明物质/分子或方法的治疗的疾患。这包
括慢性和急性病症或疾病，包括那些使哺乳动物倾向于所讨论病症的病理状
况。本文中待治疗的病症的非限制性例子包括癌性疾患，诸如恶性和良性肿
瘤；非白血病和淋巴样恶性肿瘤；神经元、神经胶质、星形胶质细胞、下丘
脑和其它腺体、巨噬细胞、上皮、基质/间质和囊胚腔病症；及炎性、免疫学
和其它血管发生相关病症。病症进一步包括癌性疾患，诸如B细胞增殖性病
症和/或B细胞肿瘤，例如淋巴瘤、非何杰金氏淋巴瘤(NHL)、攻击性NHL、
复发性攻击性NHL、复发性无痛性NHL、顽固性NHL、顽固性无痛性NHL、
慢性淋巴细胞性白血病(CLL)、小淋巴细胞性淋巴瘤、白血病、毛细胞白血
病(HCL)、急性淋巴细胞性白血病(ALL)和套细胞淋巴瘤。
术语“细胞增殖性病症”和“增殖性病症”指与一定程度的异常细胞增殖有
关的病症。在一个实施方案中，细胞增殖性病症指癌症。
“肿瘤”在用于本文时指所有赘生性(neoplastic)细胞生长和增殖，无论是
恶性的还是良性的，及所有癌前(pre-cancerous)和癌性细胞和组织。
“自身免疫病”在本文中指源于且针对个体自身组织或器官的疾病或紊
乱或其共分离(co-segregate)或表现或由其导致的状况。在这些自身免疫病和
炎症紊乱的许多中，可以存在许多临床和实验室标志，包括但不限于：高丙
种球蛋白血症、高水平自身抗体、组织中抗原-抗体复合物沉积、得益于皮
质类固醇或免疫抑制治疗、及受侵害组织中的淋巴样细胞集合体。不限于任
意一种有关B细胞介导的自身免疫病的理论，认为B细胞通过众多机械途径
在人自身免疫病中表现出致病作用，包括自身抗体产生、免疫复合物形成、
树突细胞和T细胞活化、细胞因子合成、直接趋化因子释放和提供用于异位
新淋巴生成的巢。这些途径中的每一种可以以不同程度参与自身免疫病的病
理学。
自身免疫病可以为器官特异性疾病(即免疫应答特异性针对一种器官系
统，诸如内分泌系统、造血系统、皮肤、心肺系统、胃肠和肝系统、肾系统、
甲状腺、耳、神经肌肉系统、中枢神经系统等)或可以影响多器官系统的系
统性疾病(例如系统性红斑狼疮(SLE)、类风湿性关节炎、多肌炎等)。优选
的此类疾病包括自身免疫性风湿病学病症(诸如例如类风湿性关节炎、斯耶
格伦氏综合征(![]()
syndrome)、硬皮病、狼疮(诸如SLE和狼疮肾炎)、
多肌炎/皮肌炎、冷球蛋白血症、抗磷脂抗体综合征和银屑病关节炎)、自身
免疫性胃肠和肝病症(诸如例如炎性肠病(例如溃疡性结肠炎和克罗恩氏病
(Crohn′s disease))、自身免疫性胃炎和恶性贫血、自身免疫性肝炎、原发性
胆汁性肝硬化、原发性硬化性胆管炎和乳糜泻)、血管炎(诸如例如ANCA
阴性血管炎和ANCA相关血管炎，包括丘施二氏血管炎(Churg-Strauss
vasculitis)、韦格纳氏肉芽肿病(Wegener′s granulomatosis)和微观多脉管炎)、
自身免疫性神经病学病症(诸如例如多发性氧化、视性眼阵挛肌阵挛综合征、
重症肌无力、视神经脊髓炎、帕金森氏病(Parkinson’s disease)、阿耳茨海默
氏病(Alzheimer’s disease)和自身免疫性多神经病)、肾病症(诸如例如肾小球
肾炎、古德帕斯丘氏综合征(Goodpasture’s syndrome)和贝格尔氏病(Berger’s
disease))、自身免疫性皮肤病学病症(诸如例如银屑病、荨麻疹、hives、寻
常型天疱疮、大疱性类天疱疮、和皮肤红斑狼疮)、血液学病症(诸如例如
血小板减少性紫癜、血栓性血小板减少性紫癜、输血后紫癜和自身免疫性溶
血性贫血)、动脉粥样硬化、葡萄膜炎、自身免疫性听觉疾病(诸如例如内
耳病和听力损失)、贝切特氏病(Behcet′s disease)、雷诺氏综合征(Raynaud′s
syndrome)、器官移植和自身免疫性内分泌病症(诸如例如糖尿病相关自身免
疫病诸如胰岛素依赖性糖尿病(IDDM)、阿狄森氏病(Addison’s disease)和自身
免疫性甲状腺病(例如格雷夫斯氏病(Graves’disease)和甲状腺炎))。更优选
的此类疾病包括例如类风湿性关节炎、溃疡性结肠炎、ANCA相关血管炎、
狼疮、多发性硬化、斯耶格伦氏综合征、格雷夫斯氏病、IDDM、恶性贫血、
甲状腺炎和肾小球肾炎。
本文中所定义的其它自身免疫性疾病的具体例子(在有些情况中涵盖上
文所列举的那些)包括但不限于关节炎(急性的和慢性的，类风湿性关节炎，
包括幼发型类风湿性关节炎和关节炎的各个阶段诸如类风湿性滑膜炎、痛风
或痛风性关节炎、急性免疫性关节炎、慢性炎性关节炎、退行性关节炎、II
型胶原诱发的关节炎、感染性关节炎、莱姆(Lyme)关节炎、增生性关节炎、
银屑病性关节炎、斯提耳氏(Still)病、脊椎关节炎、骨关节炎、慢性进行性
关节炎、变形性关节炎、慢性原发性多关节炎、反应性关节炎、绝经期关节
炎、雌激素消减性关节炎和强直性脊柱炎/类风湿性脊椎炎)，自身免疫性淋
巴细胞增生性疾病，炎性过度增殖性皮肤病，银屑病诸如斑块状银屑病、滴
状银屑病、脓疱性银屑病和指甲银屑病，特应性包括特应性疾病诸如干草热
和乔布氏(Job)综合征，皮炎包括接触性皮炎、慢性接触性皮炎、剥脱性皮炎、
变应性皮炎、变应性接触性皮炎、荨麻疹、疱疹样皮炎、钱币状皮炎、脂溢
性皮炎、非特异性皮炎、原发性刺激性接触性皮炎和特应性皮炎，x连锁的
高IgM综合征，变应性眼内炎性疾病，荨麻疹诸如慢性变应性荨麻疹和慢性
特发性荨麻疹(包括慢性自身免疫性荨麻疹)，肌炎，多肌炎/皮肌炎，青少
年型皮肌炎，中毒性表皮坏死松解症，硬皮病(包括系统性硬皮病)，硬化
诸如系统性硬化、多发性硬化(MS)诸如脊髓-眼(spino-optical)MS、原发性进
行性MS(PPMS)和复发性消退性(relapsing remitting)MS(RRMS)、进行性系
统性硬化、动脉粥样硬化、动脉硬化、播散性硬化、共济失调性(ataxic)硬化，
视神经脊髓炎(NMO)，炎症性肠病(IBD)(例如克罗恩氏(Crohn)病、自身免
疫介导的胃肠病、胃肠炎症、结肠炎诸如溃疡性结肠炎(colitis ulcerosa)、微
观结肠炎、胶原性结肠炎、息肉状结肠炎、坏死性小肠结肠炎和透壁性结肠
炎和自身免疫性炎症性肠病)，肠炎，坏疽性脓皮症，结节性红斑，原发性
硬化性胆管炎，呼吸窘迫综合征包括成人型或急性呼吸窘迫综合征(ARDS)，
脑膜炎，整个或部分葡萄膜的炎症，虹膜炎，脉络膜炎，自身免疫性血液学
病症，移植物抗宿主疾病，血管性水肿诸如遗传性血管性水肿，脑神经损伤
像脑膜炎中的，妊娠疱疹，妊娠性类天疱疮，阴囊瘙癣(pruritis scroti)，自身
免疫性早熟性卵巢衰竭，因自身免疫性疾患引起的突发性听觉丧失，IgE介
导的疾病诸如过敏反应和变应性和特应性鼻炎，脑炎诸如拉斯默森氏
(Rasmussen)脑炎和边缘系和/或脑干脑炎，葡萄膜炎(诸如前葡萄膜炎、急
性前葡萄膜炎、肉芽肿性葡萄膜炎、非肉芽肿性葡萄膜炎、晶状体抗原性葡
萄膜炎、后葡萄膜炎或自身免疫性葡萄膜炎，具有和没有肾病综合征的肾小
球肾炎(GN)诸如慢性或急性肾小球肾炎诸如原发性GN、免疫介导的GN、膜
性GN(膜性肾病)、特发性膜性GN或特发性膜性肾病、膜增殖性或膜性增
殖性GN(MPGN)(包括I型和II型)和急进性GN(RPGN)，增殖性肾炎，自身
免疫性多腺体内分泌衰竭，龟头炎包括浆细胞性局限性龟头炎，龟头包皮炎，
离心性环状红斑，持久性色素异常性红斑，多形性红斑，环状肉芽肿，光泽
苔藓，硬化萎缩性苔藓，慢性单纯苔藓，小棘苔藓，扁平苔藓，片层状鱼鳞
癣，表皮松解性角化过度，恶变前角化，坏疽性脓皮症，变应性疾患和应答，
食物过敏，药物过敏，昆虫过敏，罕见的过敏性病症诸如肥大细胞增生病，
过敏反应，湿疹包括变应性或特应性湿疹、干性湿疹、汗疱和水泡性掌跖湿
疹(vesicular palmoplantar eczema)，哮喘诸如支气管哮喘(asthma bronchiale，
bronchial asthma)和自身免疫性哮喘，涉及T细胞浸润和慢性炎性应答的疾
患，针对外来抗原诸如妊娠期间胎儿A-B-O血型的免疫反应，慢性肺部炎性
疾病，自身免疫性心肌炎，白细胞粘附缺陷，狼疮包括狼疮肾炎、狼疮脑炎、
儿科狼疮、非肾狼疮、肾外狼疮、盘状狼疮和盘状红斑狼疮、狼疮脱发、SLE
(诸如皮肤SLE或亚急性皮肤SLE)、新生儿狼疮综合征(NLE)和播散性红斑
狼疮，幼发型(I型)糖尿病包括儿科IDDM，成人期发作的糖尿病(II型糖
尿病)，自身免疫性糖尿病，特发性尿崩症，糖尿病视网膜病变，糖尿病肾
病，糖尿病结肠炎，糖尿病大动脉病症，与细胞因子和T-淋巴细胞介导的急
性和迟发型超敏感性有关的免疫应答，结核病，结节病，肉芽肿病包括淋巴
瘤样肉芽肿病、粒细胞缺乏，血管炎病(包括大血管血管炎(诸如风湿性多
肌痛和巨细胞(高安氏(Takayasu))动脉炎)、中血管血管炎(诸如川崎氏
(Kawasaki)病和结节性多动脉炎/结节性动脉周围炎)、免疫血管炎、CNS血
管炎、皮肤性血管炎、超敏感性血管炎、坏死性血管炎(诸如类纤维蛋白坏
死性血管炎和系统性坏死性血管炎)、ANCA阴性血管炎和ANCA相关血管炎
诸如丘-施二氏(Churg-Strauss)综合征(CSS)，韦格纳氏(Wegener)肉芽肿病和
微观多脉管炎)，颞动脉炎，再生障碍性贫血，自身免疫性再生障碍性贫血，
库姆斯(Coombs)阳性贫血，戴-布二氏(Diamond Blackfan)贫血，溶血性贫血
或免疫性溶血性贫血包括自身免疫性溶血性贫血(AIHA)，恶性贫血(anemia
perniciosa)，阿狄森氏(Addison)病，单纯红细胞性贫血或再生障碍(PRCA)，
因子VIII缺乏，血友病A，自身免疫性嗜中性粒细胞减少症，细胞减少症诸
如全血细胞减少症，白细胞减少症，涉及白细胞渗出的疾病，CNS炎性病症，
阿耳茨海默氏(Alzheimer)病，帕金森氏(Parkinson)病，多器官损伤综合征诸
如那些脓毒症、外伤或出血继发的，抗原-抗体复合物介导的疾病，抗肾小
球基底膜病，抗磷脂抗体综合征，运动神经炎，变应性神经炎，贝切特氏
(![]()
)病/综合征，卡斯尔曼氏(Castleman)综合征，古德帕斯丘氏
(Goodpasture)综合征，雷诺氏(Reynaud)综合征，斯耶格伦氏(![]()
)综合征，
史-约二氏(Stevens-Johnson)综合征，类天疱疮或天疱疮诸如大疱性类天疱疮、
瘢痕性(粘膜)类天疱疮、皮肤类天疱疮、寻常型天疱疮、副肿瘤性天疱疮、
落叶型天疱疮、粘膜类天疱疮型天疱疮和红斑性天疱疮，获得性大疱性表皮
松解症，眼部炎症(优选变应性眼部炎症，诸如变应性结膜炎、线性IgA大
疱性疾病、自身免疫诱发的结膜炎症)，自身免疫性多内分泌病，莱特氏(Reiter)
病或综合征，由自身免疫性疾患引起的热伤，先兆子痫，免疫复合物病症诸
如免疫复合物肾炎，抗体介导的肾炎，神经炎性病症，多神经病，慢性神经
病诸如IgM多神经病或IgM介导的神经病，血小板减少症(例如心肌梗死患
者发生的)包括血栓性血小板减少性紫癜(TTP)、输血后紫癜(PTP)、肝素诱
发的血小板减少症和自身免疫或免疫介导的血小板减少症(包括例如特发性
血小板减少性紫癜(ITP)包括慢性或急性ITP)，巩膜炎诸如特发性角膜-巩膜
炎、巩膜外层炎，睾丸和卵巢的自身免疫病包括自身免疫性睾丸炎和卵巢炎，
原发性甲状腺功能减退症，甲状旁腺功能减退，自身免疫性内分泌病包括甲
状腺炎(诸如自身免疫性甲状腺炎、桥本氏(Hashimoto)病、慢性甲状腺炎(桥
本氏(Hashimoto)甲状腺炎)或亚急性甲状腺炎)、自身免疫性甲状腺病、特
发性甲状腺功能减退症、格雷夫斯氏(Graves)病，格雷夫斯氏眼病(Grave′s eye
disease)(眼部或甲状腺相关眼部)，多腺性综合征诸如自身免疫性多腺体综
合征例如I型(或多腺性内分泌病综合征)，瘤外综合征包括神经学瘤外综合
征诸如兰伯特-伊顿(Lambert-Eaton)肌无力综合征或伊顿-兰伯特
(Lambert-Eaton)综合征，僵体或僵人综合征，脑脊髓炎诸如变应性脑脊髓炎
(encephalomyelitis allergica)和实验性变应性脑脊髓炎(EAE)，重症肌无力诸如
胸腺瘤相关重症肌无力，小脑变性，神经性肌强直，视性眼阵挛或视性眼阵
挛肌阵挛综合征(OMS)，和感觉神经病，多病灶运动神经病，席汉氏(Sheehan)
综合征，自身免疫性肝炎、慢性肝炎、类狼疮肝炎、巨细胞性肝炎、慢性活
动性肝炎或自身免疫性慢性活动性肝炎，肺炎诸如淋巴样间质性肺炎(LIP)，
梗阻性细支气管炎(非移植物)对NSIP，格-巴二氏(Guillain-Barré)综合征，
贝格尔氏(Berger)病(IgA肾病)，特发性IgA肾病，线性IgA皮肤病，急性热
性嗜中性白细胞皮肤病，角质层下脓疱皮肤病，一过性棘层松解性皮肤病，
硬化诸如原发性胆汁性肝硬化和肺硬变，自身免疫性肠病综合征，乳糜泻，
腹腔或腹部疾病，口炎性腹泻(麸质肠病)，顽固性口炎性腹泻，特发性口
炎性腹泻，冷球蛋白血症诸如混合型冷球蛋白血症、肌萎缩侧索硬化(ALS)
(卢格里克氏(Lou Gehrig)病)，冠状动脉病，自身免疫性耳病诸如自身免疫
性内耳病(AIED)、自身免疫性听觉丧失，多软骨炎诸如顽固性或复发的或复
发性多软骨炎，肺泡蛋白沉着症，角膜炎诸如寇甘氏(Cogan)综合征/非梅毒
性间质性角膜炎，贝耳氏(Bell)麻痹，斯威特氏(Sweet)病/综合征，自身免疫
性酒糟鼻，带状疱疹相关疼痛，淀粉样变，非癌性淋巴细胞增多，原发性淋
巴细胞增多包括单克隆B细胞淋巴细胞增多(例如良性单克隆丙种球蛋白病
和性质未确定的单克隆丙种球蛋白病(MGUS))，周围神经病，瘤外综合征，
通道病诸如癫痫、偏头痛、心率失常、肌肉病症、失聪、失明、周期性瘫痪
和CNS的通道病，孤独症，炎性肌病，局灶性或节段性或局灶性节段性肾小
球硬化(FSGS)，内分泌性眼病，葡萄膜视网膜炎，脉络膜视网膜炎，自身免
疫性肝脏病学病症，纤维肌痛，多发性内分泌衰竭，施密特氏(Schmidt)综合
征，肾上腺炎，胃萎缩，早老性痴呆，脱髓鞘病诸如自身免疫性脱髓鞘病和
慢性炎性脱髓鞘性多神经病，德雷斯勒氏(Dressler)综合征，斑秃，全秃，
CREST综合征(钙质沉着症、雷诺氏(Raynaud)现象、食道运动功能障碍、
指端硬化和毛细管扩张)，男性和女性自身免疫性不孕不育例如由于抗精虫
抗体的，混合性结缔组织病，恰加斯氏(Chagas)病，风湿热，习惯性流产，
农民肺，多形红斑，心脏切开术后综合征，柯兴氏(Cushing)综合征，养鸟者
肺，变应性肉芽肿性血管炎，良性淋巴细胞性血管炎，阿尔波特氏(Alport)
综合征，肺泡炎诸如变应性肺泡炎和纤维化肺泡炎，间质性肺病，输血反应，
麻风，疟疾，寄生虫病诸如利什曼病、锥虫病(kypanosomiasis)、血吸虫病、
蛔虫病，曲霉病，Sampter氏综合征，卡普兰氏(Caplan)综合征，登革，心内
膜炎，心内膜心肌纤维化，弥漫性肺间质纤维化，间质性肺纤维化，纤维性
纵隔炎，肺纤维化，特发性肺纤维化，囊性纤维化，眼内炎，持久隆起性红
斑，胎儿成红细胞增多症，嗜曙红细胞性筋膜炎(faciitis)、舒尔曼氏(Shulman)
综合征，费尔提氏(Felty)综合征，flariasis，睫状体炎诸如慢性睫状体炎、异
时性睫状体炎、虹膜睫状体炎(急性或慢性)或Fuch氏睫状体炎，亨诺-许
兰二氏(Henoch-Schonlein)紫癜，人免疫缺陷病毒(HIV)感染，SCID，获得性
免疫缺陷综合征(AIDS)，艾柯病毒感染，脓毒症(系统性炎性应答综合征
(SIRS))，内毒素血症，胰腺炎，甲状腺毒症(thyroxicosis)，细小病毒感染，
风疹病毒感染，种痘后综合征，先天性风疹感染，爱泼斯坦-巴尔(Epstein-Barr)
病毒感染，腮腺炎，埃文斯(Evans)综合征，自身免疫性性腺衰竭，西登哈姆
氏(Sydenham)舞蹈病，链球菌后肾炎，闭塞性血栓血管炎(thromboangitis
ubiterans)，甲状腺毒症，脊髓痨，脉络膜炎，巨细胞性多肌痛，慢性超敏感
性肺炎，结膜炎，诸如春季卡他、干燥性角膜结膜炎和流行性角膜结膜炎，
特发性肾炎综合征，微小病变肾病，良性家族性和缺血-再灌注损伤，移植
器官再灌注，视网膜自身免疫，关节炎症，支气管炎，慢性阻塞性气道/肺部
疾病，硅沉着病，口疮，口疮性口炎，动脉硬化性病症(大脑血管功能不全)
诸如动脉硬化性脑病和动脉硬化性视网膜病，无精子发生(aspermiogenese)，
自身免疫性溶血，伯克氏(Boeck)病，冷球蛋白血症，杜普伊特伦氏(Dupuytren)
挛缩，晶体过敏性眼内炎(endophthalmia phacoanaphylactica)，变应性小肠炎
(enteritis allergica)，麻风节结性红斑，特发性面瘫，慢性疲乏综合征，风湿
热(febris rheumatica)，哈-里二氏(Hamman-Rich)病，感觉神经性听觉丧失，
阵发性血红蛋白尿(haemoglobinuria paroxysmatica)，性腺功能减退，局限性
回肠炎(ileitis regionalis)，白细胞减少症，传染性单核细胞增多症，横贯性
(traverse)脊髓炎，原发性特发性粘液水肿，肾病，交感性眼炎(ophthalmia
symphatica)(sympathetic ophthalmitis)，新生儿眼炎，视神经炎，肉芽肿性睾
丸炎(orchitis granulomatosa)，胰腺炎，急性多神经根炎，坏疽性脓皮症，奎
尔万氏(Quervain)甲状腺炎，获得性脾萎缩，非恶性胸腺瘤，淋巴滤泡性胸
腺炎，白癜风，中毒性休克综合征，食物中毒，涉及T细胞浸润的疾患，白
细胞粘附缺陷，与细胞因子和T-淋巴细胞介导的急性和迟发性超敏感性有关
的免疫应答，涉及白细胞渗出的疾病，多器官损伤综合征，抗原-抗体复合
物介导的疾病，抗肾小球基底膜病，自身免疫性多内分泌病，卵巢炎，原发
性粘液水肿，自身免疫性萎缩性胃炎，风湿病，混合性结缔组织病，肾病综
合征，胰岛炎，多内分泌衰竭，自身免疫性多腺性综合征，包括多腺性综合
征I型，成人期发作的特发性甲状旁腺功能减退(AOIH)，心肌病诸如扩张型
心肌病，获得性大疱性表皮松解(epidermolisis bullosa acquisita，EBA)，血色
素沉着，心肌炎，肾病综合征，原发性硬化性胆管炎，化脓性或非化脓性鼻
窦炎，急性或慢性鼻窦炎，筛窦炎，额窦炎，上颌窦炎或蝶窦炎，变应性鼻
窦炎，嗜曙红细胞相关病症诸如嗜曙红细胞增多症、肺嗜曙红细胞增多性浸
润、嗜曙红细胞增多-肌痛综合征、吕弗勒氏(Loffler)综合征、慢性嗜曙红细
胞性肺炎、热带肺嗜曙红细胞增多、支气管肺曲霉病、曲霉肿或含有嗜曙红
细胞的肉芽肿，过敏反应，脊椎关节病，血清阴性脊椎关节炎病，多内分泌
自身免疫病，硬化性胆管炎，巩膜、巩膜外层、慢性粘膜皮肤假丝酵母病，
布鲁顿氏(Bruton)综合征，婴儿期一过性低丙种球蛋白血症，威斯科特-奥尔
德里齐(Wiskott-Aldrich)综合征，共济失调性毛细管扩张综合征，血管扩张，
与以下各项有关的自身免疫性病症：胶原病、风湿病诸如慢性关节风湿病、
淋巴结炎、血压应答降低(reduction in blood pressure response)、血管功能障
碍、组织损伤、心血管缺血、痛觉过敏、肾缺血、脑缺血和伴随血管化的疾
病，变应性超敏感性病症，肾小球肾炎病，再灌注损伤，缺血再灌注病症，
心肌或其它组织的再灌注损伤，淋巴瘤气管支气管炎，炎性皮肤病，具有急
性炎性成分的皮肤病，多器官衰竭，大疱病，肾皮质坏死，急性化脓性脑膜
炎或其它中枢神经系统炎性病症，眼和眶炎性病症，粒细胞输血相关综合征，
细胞因子诱发的中毒，发作性睡病，急性重度炎症，慢性顽固性炎症，肾盂
炎，动脉内增生，消化性溃疡，心瓣炎，和子宫内膜异位症。本文中通过施
用与B细胞表面标志物(诸如FcRH5)的抗体来治疗此类疾病，包括施用未
偶联的抗体(裸抗体)或偶联有细胞毒剂的抗体，如本文中所公开的。本文
中还通过包括同时或序贯施用的本发明抗FcRH5抗体或抗FcRH5抗体药物偶
联物与另一种抗体或抗体药物偶联物、另一种细胞毒剂、放射或其它治疗方
法的组合的组合疗法来治疗此类疾病。
“处理”或“治疗”或“缓和”指治疗性处理及预防性或防范性措施二者，其
中目标是预防或减缓(减轻)所针对的病理学状况或紊乱。需要治疗的受试
者包括早就患有紊乱的受试者以及倾向于患上紊乱的受试者或要预防紊乱
的受试者。如果在依照本发明的方法接受治疗量的抗FcRH5抗体后，患者在
如下一项或多项中显示出可观察和/或可测量的降低或消失，那么受试者或哺
乳动物成功“治疗”了表达FcRH5多肽的癌症：癌细胞数减少或癌细胞消失；
肿瘤体积缩小；癌细胞浸润到周围器官中，包括癌传播到软组织和骨中受到
抑制(即一定程度的减缓，优选停止)；肿瘤转移受到抑制(即一定程度的
减缓，优选停止)；肿瘤生长受到一定程度的抑制；和/或与特定癌症有关的
一种或多种症状得到一定程度的减轻；发病率和死亡率降低；及生命质量提
高。就抗FcRH5抗体可预防癌细胞生长和/或杀死现有癌细胞而言，它可能是
抑制细胞的和/或毒害细胞的。这些征候或症状的减轻还可以由患者感受到。
用于评估疾病的成功治疗和改善的上述参数可以容易地通过内科医师
所熟悉的常规流程来测量。对于癌症治疗，可通过例如评估疾病进展时间
(TTP)和/或测定响应速率(RR)来测量功效。转移可通过分期测试(staging test)
来测定，及通过骨扫描及钙水平和其它酶的测试以测定是否传播到骨。还可
进行CT扫描以查明是否传播到骨盆及该区域中的淋巴结。分别使用胸腔X射
线和通过已知方法进行的肝酶水平测量来查明是否转移到肺和肝。用于监测
疾病的其它常规方法包括经直肠超声检查(TRUS)和经直肠针吸活组织检查
(TRNB)。
对于膀胱癌，一种更加局部化的癌症，测定疾病进展的方法包括通过膀
胱镜检术进行的尿细胞学评估、监测尿液中血的存在情况、通过超声波检查
术显现尿路上皮道(urothelial tract)或静脉注射肾盂造影照片(intravenous
pyelogram)、计算机断层摄影术(computed tomography)(CT)和磁共振成像
(magnetic resonance imaging)(MRI)。远程转移的存在情况可通过腹部CT、胸
腔X射线或骨骼放射性核素成像来评估。
“长期”施用指与短期模式相反，以连续模式施用药剂，从而将初始治疗
效果(活性)维持较长一段时间。“间歇”施用指不是无间断连续进行的治疗，
而是本质上周期性的。
“个体”指脊椎动物。在某些实施方案中，脊椎动物指哺乳动物。哺乳动
物包括，但不限于，牲畜(诸如牛)、运动用动物、宠物(诸如猫、犬和马)、
灵长类动物、小鼠和大鼠。在某些实施方案中，哺乳动物指人。
为了治疗癌症或缓和癌症症状的目的，“哺乳动物”指归入哺乳类的任何
动物，包括人，家畜和牲畜，及动物园、运动或宠物动物，诸如犬、猫、牛、
马、绵羊、猪、山羊、家兔、等。优选的是，哺乳动物指人。
与一种或多种其它治疗剂“组合”施用包括同时(共同)施用和任何次序
的序贯施用。
“载体”在用于本文时包括药剂学可接受的载体、赋形剂或稳定剂，它们
在所采用的剂量和浓度对暴露于其的细胞或哺乳动物是无毒的。通常，生理
学可接受的载体是pH缓冲水溶液。生理学可接受载体的例子包括缓冲剂，诸
如磷酸盐、柠檬酸盐和其它有机酸；抗氧化剂，包括抗坏血酸；低分子量(少
于约10个残基)多肽；蛋白质，诸如血清清蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水
性聚合物，诸如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸，诸如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰
胺、精氨酸或赖氨酸；单糖、二糖和其它碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖
或糊精；螯合剂，诸如EDTA；糖醇，诸如甘露醇或山梨醇；成盐反荷离子，
诸如钠；和/或非离子表面活性剂，诸如![]()
聚乙二醇(PEG)和
![]()
“固相”或“固体支持物”意指本发明的抗体可粘着或附着其上的非水性基
质。本文中所涵盖的固相的例子包括那些部分或完全由玻璃(例如可控孔径
玻璃)、多糖(例如琼脂糖)、聚丙烯酰胺、聚苯乙烯、聚乙烯醇和聚硅氧烷
(silicone)制成的固相。在某些实施方案中，根据语境，固相可包括测定板的
孔；在其它实施方案中，它指纯化柱(例如亲和层析柱)。此术语还包括离
散颗粒的不连续固相，诸如美国专利No.4,275,149中所记载的。
“脂质体”指由各种类型的脂质、磷脂和/或表面活性剂构成的，可用于对
哺乳动物投递药物(诸如FcRH5抗体)的小囊泡。脂质体的成分通常排列成
双层形式，与生物膜的脂质排列相似。
“小”分子或有机“小”分子在本文中定义为分子量小于约500道尔顿。
“个体”、“受试者”或“患者”指脊椎动物。在某些实施方案中，脊椎动物
指哺乳动物。哺乳动物包括，但不限于，牲畜(诸如牛)、运动用动物、宠
物(诸如猫、犬和马)、灵长类动物、小鼠和大鼠。在某些实施方案中，哺
乳动物指人。
术语“药物配制剂”指其形式容许活性成分的生物学活性是有效的，且不
含对会施用该配制剂的受试者产生不可接受的毒性的别的成分的制备物。此
类配制剂可以是无菌的。
“无菌”配制剂是无菌的或者不含所有活的微生物及其孢子。
本文中所公开的抗体的“有效量”指足以实现明确规定的目的的量。“有
效量”可凭经验且以常规方式，联系规定的目的来确定。
术语“治疗有效量”指在受试者或哺乳动物中有效“治疗”疾病或紊乱的抗
体的量。在癌症的情况中，药物的治疗有效量可减少癌细胞数；缩小肿瘤体
积；抑制(即一定程度的减缓，优选停止)癌细胞浸润到周围器官中；抑制
(即一定程度的减缓，优选停止)肿瘤转移；一定程度的抑制肿瘤生长；和
/或一定程度的减轻与癌症有关的一种或多种症状。参见本文中“治疗”的定
义。就药物可预防癌细胞生长和/或杀死现有癌细胞的程度而言，它可以是抑
制细胞的和/或毒害细胞的。“预防有效量”指在必需的剂量和时间上有效实现
期望的预防效果的量。通常而非必然，由于预防剂量是在疾病发作之前或在
疾病的早期用于受试者的，因此预防有效量将低于治疗有效量。
抗FcRH5抗体的“生长抑制量”指能够在体外或在体内抑制细胞，尤其是
肿瘤，例如癌细胞生长的数量。抗FcRH5抗体为了抑制肿瘤性细胞生长的“生
长抑制量”可凭经验且以常规方式来确定。
抗FcRH5抗体的“细胞毒性量”指能够在体外或在体内引起细胞，尤其是
肿瘤，例如癌细胞破坏的量。抗FcRH5抗体为了抑制肿瘤性细胞生长的“细
胞毒性量”可凭经验且以常规方式来确定。
“表达FcRH5的细胞”指或在细胞表面上或以分泌形式表达内源或转染的
FcRH5多肽的细胞。“表达FcRH5的癌”指包含在细胞表面上存在FcRH5多肽
或生成和分泌FcRH5多肽的细胞的癌。“表达FcRH5的癌”任选在其细胞表面
上生成足够水平的FcRH5多肽，使得抗FcRH5抗体可与其结合并对癌产生治
疗效果。在另一个实施方案中，“表达FcRH5的癌”任选生成和分泌足够水平
的FcRH5多肽，使得抗FcRH5抗体可与其结合并对癌具有治疗效果。对于后
者，所述拮抗剂可以是降低、抑制或阻止肿瘤细胞生成和分泌分泌型FcRH5
多肽的反义寡核苷酸。“过表达”FcRH5多肽的癌指与同一组织类型的非癌性
细胞相比，在其细胞表面上具有显著更高水平的FcRH5多肽或生成和分泌显
著更高水平的FcRH5多肽的癌。此类过表达可以是由基因扩增或者是由转录
或翻译提高引起的。可在检测或预后测定法中通过评估细胞表面上存在的或
细胞分泌的FcRH5蛋白质水平的升高(例如通过免疫组织化学测定法，使用
针对分离的FcRH5多肽制备的抗FcRH5抗体，所述多肽可使用重组DNA技术
从编码FcRH5多肽的分离的核酸制备；FACS分析；等)来确定FcRH5多肽过
表达。或者/另外，可测量细胞中编码FcRH5多肽的核酸或mRNA的水平，例
如通过荧光原位杂交，使用对应于编码FcRH5的核酸或其互补链的基于核酸
的探针(FISH；参见WO 98/45479，公开于1998年10月)；Southern印迹；
Northern印迹；或聚合酶链式反应(PCR)技术，诸如实时定量PCR(RT-PCR)。
还可使用基于抗体的测定法，通过测量生物学流体诸如血清中的脱落抗原来
研究FcRH5多肽过表达(还可参见例如美国专利4,933,294，授权于1990年6
月12日；WO 91/05264，公开于1991年4月18日；美国专利5,401,638，授权于
1995年3月28日；Sias et al.，J.Immunol.Methods 132：73-80(1990))。除了上述
测定法，熟练从业人员还可利用多种体内测定法。例如，可将患者体内细胞
暴露于任选用可检测标记物例如放射性同位素标记的抗体，并且可评估抗体
与患者体内细胞的结合，例如通过外部扫描放射性或通过分析取自事先已暴
露于所述抗体的患者的活组织检查切片。
在用于本文时，术语“免疫粘附素”指将异源蛋白质(“粘附素”)的结合
特异性与免疫球蛋白恒定域的效应器功能联合起来的抗体样分子。在结构
上，免疫粘附素包括不同于抗体的抗原识别和结合位点(即是“异源”的)、
具有期望结合特异性的氨基酸序列和免疫球蛋白恒定域序列的融合物。免疫
粘附素分子的粘附素部分典型的是至少包含受体或配体的结合位点的连续
氨基酸序列。免疫粘附素中的免疫球蛋白恒定域序列可以从任何免疫球蛋白
获得，诸如IgG-1、IgG-2、IgG-3或IgG-4亚型、IgA(包括IgA-1和IgA-2)、IgE、
IgD或IgM。
“标记物”在本文中使用时指与抗体直接或间接偶联从而生成“带标记物
的”或“经过标记的”抗体的可检测化合物或组合物。标记物可以是通过自身
就可检测的(例如放射性同位素标记物或荧光标记物)，或者在酶标记物的
情况中，可催化可检测的底物化合物或组合物的化学改变。
术语“细胞毒剂”在用于本文时指抑制或防止细胞的功能和/或引起细胞
破坏的物质。该术语意图包括：放射性同位素，例如At211、I131、I125、Y90、
Re186、Re188、Sm153、Bi212、P32和Lu的放射性同位素；化疗剂，例如甲氨蝶
呤(methotrexate)、阿霉素(adriamycin)、长春花生物碱类(vinca alkaloids)(长
春新碱(vincristine)、长春碱(vinblastine)、依托泊苷(etoposide))、多柔比星
(doxorubicin)、美法仑(melphalan)、丝裂霉素(mitomycin)C、苯丁酸氮芥
(chlorambucil)、柔红霉素(daunorubicin)或其它嵌入剂；酶及其片段，诸如溶
核酶；抗生素；和毒素，诸如小分子毒素或者细菌、真菌、植物或动物起源
的酶活毒素，包括其片段和/或变体；及下文披露的各种抗肿瘤药或抗癌药。
下文记载了其它细胞毒剂。杀肿瘤药引起肿瘤细胞的破坏。
“毒素”指能够对细胞的生长或增殖产生有害效果的任何物质。
“化疗剂”指可用于治疗癌症的化学化合物，不管作用机制。化疗剂的例
子包括可用于治疗癌症的化学化合物。化疗剂的例子包括烷化剂类
(alkylating agents)，诸如塞替派(thiotepa)和![]()
环磷酰胺
(cyclophosphamide)；磺酸烷基酯类(alkyl sulfonates)，诸如白消安(busulfan)、
英丙舒凡(improsulfan)和哌泊舒凡(piposulfan)；氮丙啶类(aziridines)，诸如苯
佐替派(benzodepa)、卡波醌(carboquone)、美妥替派(meturedepa)和乌瑞替派
(uredepa)；乙撑亚胺类(ethylenimines)和甲基蜜胺类(methylamelamines)，包
括六甲蜜胺(altretamine)、三乙撑蜜胺(triethylenemelamine)、三乙撑磷酰胺
(triethylenephosphoramide)、三乙撑硫代磷酰胺(triethylenethiophosphoramide)
和三羟甲蜜胺(trimethylolomelamine)；番荔枝内酯类(acetogenins)(尤其是布
拉他辛(bullatacin)和布拉他辛酮(bullatacinone))；喜树碱(camptothecin)(包括
合成类似物托泊替康(topotecan))；苔藓抑素(bryostatin)；callystatin；CC-1065
(包括其阿多来新(adozelesin)、卡折来新(carzelesin)和比折来新(bizelesin)合
成类似物)；隐藻素类(cryptophycins)(特别是隐藻素1和隐藻素8)；多拉司
他汀(dolastatin)；duocarmycin(包括合成类似物，KW-2189和CB1-TM1)；
艾榴塞洛素(eleutherobin)；pancratistatin；sarcodictyin；海绵抑素(spongistatin)；
氮芥类(nitrogen mustards)，诸如苯丁酸氮芥(chlorambucil)、萘氮芥
(chlornaphazine)、胆磷酰胺(cholophosphamide)、雌莫司汀(estramustine)、异
环磷酰胺(ifosfamide)、双氯乙基甲胺(mechlorethamine)、盐酸氧氮芥
(mechlorethamine oxide hydrochloride)、美法仑(melphalan)、新氮芥
(novembichin)、苯芥胆甾醇(phenesterine)、泼尼莫司汀(prednimustine)、曲磷
胺(trofosfamide)、尿嘧啶氮芥(uracil mustard)；亚硝脲类(nitrosoureas)，诸如
卡莫司汀(carmustine)、氯脲菌素(chlorozotocin)、福莫司汀(fotemustine)、洛
莫司汀(lomustine)、尼莫司汀(nimustine)和雷莫司汀(ranimustine)；抗生素类，
诸如烯二炔类抗生素(enediyne)(例如加利车霉素(calicheamicin)，尤其是加
利车霉素γ1I和加利车霉素ωI1(参见例如Agnew，Chem.Intl.Ed.Engl.，
33：183-186(1994))；蒽环类抗生素(dynemicin)，包括dynemicin A；二膦酸盐
类(bisphosphonates)，诸如氯膦酸盐(clodronate)；埃斯波霉素(esperamicin)；
以及新制癌素(neocarzinostatin)发色团和相关色蛋白烯二炔类抗生素发色
团)、阿克拉霉素(aclacinomycin)、放线菌素(actinomycin)、氨茴霉素
(anthramycin)、偶氮丝氨酸(azaserine)、博来霉素(bleomycin)、放线菌素C
(cactinomycin)、carabicin、洋红霉素(carminomycin)、嗜癌霉素(carzinophilin)、
色霉素(chromomycin)、放线菌素D(dactinomycin)、柔红霉素(daunorubicin)、
地托比星(detorubicin)、6-二氮-5-氧-L-正亮氨酸、![]()
多柔比星
(doxorubicin)(包括吗啉代多柔比星、氰基吗啉代多柔比星、2-吡咯代多柔
比星和脱氧多柔比星)、表柔比星(epirubicin)、依索比星(esorubicin)、伊达比
星(idarubicin)、麻西罗霉素(marcellomycin)、丝裂霉素类(mitomycins)诸如丝
裂霉素C、霉酚酸(mycophenolic acid)、诺拉霉素(nogalamycin)、橄榄霉素
(olivomycin)、培洛霉素(peplomycin)、泊非霉素(potfiromycin)、嘌呤霉素
(puromycin)、三铁阿霉素(quelamycin)、罗多比星(rodorubicin)、链黑菌素
(streptonigrin)、链佐星(streptozocin)、杀结核菌素(tubercidin)、乌苯美司
(ubenimex)、净司他丁(zinostatin)、佐柔比星(zorubicin)；抗代谢物类，诸如
甲氨蝶呤(methotrexate)和5-氟尿嘧啶(5-FU)；叶酸类似物，诸如二甲叶酸
(denopterin)、甲氨蝶呤(methotrexate)、蝶罗呤(pteropterin)、三甲曲沙
(trimetrexate)；嘌呤类似物，诸如氟达拉滨(fludarabine)、6-巯基嘌呤
(mercaptopurine)、硫咪嘌呤(thiamiprine)、硫鸟嘌呤(thioguanine)；嘧啶类似
物，诸如安西他滨(ancitabine)、阿扎胞苷(azacitidine)、6-氮尿苷(azauridine)、
卡莫氟(carmofur)、阿糖胞苷(cytarabine)、双脱氧尿苷(dideoxyuridine)、去氧
氟尿苷(doxifluridine)、依诺他滨(enocitabine)、氟尿苷(floxuridine)；雄激素类，
诸如卡鲁睾酮(calusterone)、丙酸屈他雄酮(dromostanolone propionate)、表硫
雄醇(epitiostanol)、美雄烷(mepitiostane)、睾内酯(testolactone)；抗肾上腺类，
诸如氨鲁米特(aminoglutethimide)、米托坦(mitotane)、曲洛司坦(trilostane)；
叶酸补充剂，诸如亚叶酸(folinic acid)；醋葡醛内酯(aceglatone)；醛磷酰胺糖
苷(aldophosphamide glycoside)；氨基乙酰丙酸(aminolevulinic acid)；恩尿嘧
啶(eniluracil)；安吖啶(amsacrine)；bestrabucil；比生群(bisantrene)；依达曲
沙(edatraxate)；地磷酰胺(defosfamide)；地美可辛(demecolcine)；地吖醌
(diaziquone)；elfornithine；依利醋铵(elliptinium acetate)；埃坡霉素(epothilone)；
依托格鲁(etoglucid)；硝酸镓；羟脲(hydroxyurea)；香菇多糖(lentinan)；氯尼
达明(lonidamine)；美登木素生物碱类(maytansinoids)，诸如美登素(maytansine)
和安丝菌素(ansamitocin)；米托胍腙(mitoguazone)；米托蒽醌(mitoxantrone)；
莫哌达醇(mopidamol)；二胺硝吖啶(nitracrine)；喷司他丁(pentostatin)；蛋氨
氮芥(phenamet)；吡柔比星(pirarubicin)；洛索蒽醌(losoxantrone)；鬼臼酸
(podophyllinic acid)；2-乙基酰肼(ethylhydrazide)；丙卡巴肼(procarbazine)；
![]()
多糖复合物(JHS Natural Products，Eugene，OR)；雷佐生(razoxane)；根
霉素(rhizoxin)；西佐喃(sizofiran)；螺旋锗(spirogermanium)；细交链孢菌酮
酸(tenuazonic acid)；三亚胺醌(triaziquone)；2，2′，2″-三氯三乙胺；单端孢菌素
类(trichothecenes)(尤其是T-2毒素、疣孢菌素(verrucarin)A、杆孢菌素(roridin)
A和蛇行菌素(anguidin))；乌拉坦(urethan)；长春地辛(vindesine)；达卡巴嗪
(dacarbazine)；甘露莫司汀(mannomustine)；二溴甘露醇(mitobronitol)；二溴
卫矛醇(mitolactol)；哌泊溴烷(pipobroman)；gacytosine；阿糖胞苷(arabinoside)
(“Ara-C”)；环磷酰胺(cyclophosphamide)；塞替派(thiotepa)；类紫杉醇类
(taxoids)，例如![]()
帕利他塞(paclitaxel)(Bristol-Myers Squibb Oncology，
Princeton，N.J.)、ABRAXANETM不含克列莫佛(Cremophor)、清蛋白改造纳
米颗粒剂型帕利他塞(American Pharmaceutical Partners，Schaumberg，Illinois)
和![]()
多西他塞(doxetaxel)(![]()
-Poulenc Rorer，Antony，France)；
苯丁酸氮芥(chlorambucil)；![]()
吉西他滨(gemcitabine)；6-硫鸟嘌呤
(thioguanine)；巯基嘌呤(mercaptopurine)；甲氨蝶呤(methotrexate)；铂类似物，
诸如顺铂(cisplatin)和卡铂(carboplatin)；长春碱(vinblastine)；铂(platinum)；
依托泊苷(etoposide)(VP-16)；异环磷酰胺(ifosfamide)；米托蒽醌
(mitoxantrone)；长春新碱(vincristine)；![]()
长春瑞滨(vinorelbine)；
能灭瘤(novantrone)；替尼泊苷(teniposide)；依达曲沙(edatrexate)；道诺霉素
(daunomycin)；氨基蝶呤(aminopterin)；希罗达(xeloda)；伊本膦酸盐
(ibandronate)；伊立替康(irinotecan)(Camptosar，CPT-11)(包括伊立替康及
5-FU和亚叶酸的治疗方案)；拓扑异构酶抑制剂RFS 2000；二氟甲基鸟氨酸
(DMFO)；类视黄酸类(retinoids)，诸如视黄酸(retinoic acid)；卡培他滨
(capecitabine)；考布他汀(combretastatin)；VELCADE；![]()
(lenalidomide)；亚叶酸(leucovorin)(LV)；奥沙利铂(oxaliplatin)，包括奥沙利
铂治疗方案(FOLFOX)；PKC-α、Raf、H-Ras、EGFR(例如erlotinib(TarcevaTM))
和VEGF-A的、降低细胞增殖的抑制剂；及任何上述物质的药剂学可接受的
盐、酸或衍生物。
该定义还包括作用于调节或抑制激素对肿瘤作用的抗激素剂诸如抗雌
激素类和选择性雌激素受体调控物类(SERM)，包括例如他莫昔芬(tamoxifen)
(包括![]()
他莫昔芬)、雷洛昔芬(raloxifene)、屈洛昔芬
(droloxifene)、4-羟基他莫昔芬、曲沃昔芬(trioxifene)、那洛昔芬(keoxifene)、
LY117018、奥那司酮(onapristone)和![]()
托瑞米芬(toremifene)；抑
制在肾上腺中调节雌激素生成的芳香酶的芳香酶抑制剂，诸如例如4(5)-咪
唑、氨鲁米特(aminoglutethimide)、![]()
醋酸甲地孕酮(megestrol
acetate)、![]()
依西美坦(exemestane)、福美坦(formestane)、法倔唑
(fadrozole)、![]()
伏罗唑(vorozole)、![]()
来曲唑(letrozole)和
![]()
阿那曲唑(anastrozole)；抗雄激素类，诸如氟他米特(flutamide)、
尼鲁米特(nilutamide)、比卡米特(bicalutamide)、亮丙瑞林(leuprolide)、和戈
舍瑞林(goserelin)；以及曲沙他滨(troxacitabine)(1，3-二氧戊环核苷胞嘧啶类
似物)；反义寡核苷酸，特别是抑制涉及异常(abherant)细胞增殖的信号途经
中的基因表达的反义寡核苷酸，诸如例如PKC-α、Raf和H-Ras；核酶，诸如
VEGF表达抑制剂(例如![]()
核酸)和HER2表达抑制剂；疫苗，
诸如基因疗法疫苗，例如![]()
疫苗、![]()
疫苗和
![]()
疫苗；![]()
rIL-2；![]()
拓扑异构酶1抑制剂；
![]()
rmRH；长春瑞滨(Vinorelbine)和埃斯波霉素(Esperamicins)(见
美国专利No.4,675,187)；及任何上述物质的药剂学可接受的盐、酸或衍生物。
“化疗剂”的定义中还包括治疗性抗体，诸如阿伦单抗(alemtuzumab)
(Campath)、贝伐单抗(bevacizumab)(![]()
Genentech)、西妥昔单抗
(cetuximab)(![]()
Imclone)、panitumumab(![]()
Amgen)、利
妥昔单抗(rituximab)(![]()
Genentech/Biogen Idec)、pertuzumab
(OMNITARGTM，2C4，Genentech)、曲妥单抗(trastuzumab)(![]()
Genentech)、托西莫单抗(tositumomab)(Bexxar，Corixia)、及抗体药物偶联物、
吉姆单抗奥佐米星(gemtuzumab ozogamicin)(![]()
Wyeth)。
“生长抑制剂”在用于本文时指在体外或在体内抑制细胞，尤其是表达
FcRH5的癌细胞生长的化合物或组合物。因此，生长抑制剂可以是显著降低
处于S期的表达FcRH5的细胞百分比的药剂。生长抑制剂的例子包括阻断细
胞周期行进(处于S期以外的位置)的药剂，诸如诱导G1停滞和M期停滞的
药剂。经典的M期阻断剂包括长春药类(vincas)(长春新碱(vincristine)和长春
碱(vinblastine))、紫杉烷类(taxanes)和拓扑异构酶II抑制剂诸如多柔比星
(doxorubicin)、表柔比星(epirubicin)、柔红霉素(daunorubicin)、依托泊苷
(etoposide)和博来霉素(bleomycin)。那些阻滞G1的药剂也溢出进入S期停滞，
例如DNA烷化剂类诸如他莫昔芬(tamoxifen)、泼尼松(prednisone)、达卡巴嗪
(dacarbazine)、双氯乙基甲胺(mechlorethamine)、顺铂(cisplatin)、甲氨蝶呤
(methotrexate)、5-氟尿嘧啶(5-fluorouracil)和ara-C。更多信息可参见《The
Molecular Basis of Cancer》，Mendelsohn和Israel编，第1章，题为“Cell cycle
regulation，oncogenes，and antieioplastic drugs”，Murakaini等人，WB Saunders，
Philadelphia，1995，尤其是第13页。紫杉烷类(紫杉醇(paclitaxel)和多西他
赛(docetaxel))是衍生自紫杉树的抗癌药。衍生自欧洲紫杉的多西他赛
(![]()
Rhone-Poulenc Rorer)是紫杉醇(![]()
Bristol-Myers
Squibb)的半合成类似物。紫杉醇和多西他赛促进由微管蛋白二聚体装配成微
管并通过防止解聚使微管稳定，导致对细胞中有丝分裂的抑制。
“多柔比星(Doxorubicin)”是蒽环类抗生素。多柔比星的完整化学名是
(8S-顺式)-10-[(3-氨基-2，3，6-三脱氧-α-L-来苏-吡喃己糖基)氧基]-7，8，9，10-四
氢-6，8，11-三羟基-8-(羟基乙酰基)-1-甲氧基-5，12-萘二酮。
(8S-cis)-10-[(3-amino-2，3，6-trideoxy-α-L-lyxo-hexapyranosyl)oxy]-7，8，9，10-tetra
hydro-6，8，11-trihydroxy-8-(hydroxyacetyl)-1-methoxy-5，12-naphthacenedione
术语“细胞因子”是由一种细胞群释放，作为细胞间介质作用于另一细胞
的蛋白质的通称。此类细胞因子的例子有淋巴因子、单核因子和传统的多肽
激素。细胞因子中包括生长激素，诸如人生长激素、N-甲硫氨酰人生长激素
和牛生长激素；甲状旁腺素；甲状腺素；胰岛素；胰岛素原；松驰素；松驰
素原；糖蛋白激素类，诸如促卵泡激素(FSH)、促甲状腺激素(TSH)和促黄体
激素(LH)；肝生长因子；成纤维细胞生长因子；促乳素；胎盘催乳激素；肿
瘤坏死因子-α和-β；穆勒氏(Mullerian)抑制性物质；小鼠促性腺激素相关肽；
抑制素；激活素；血管内皮生长因子；整联蛋白；血小板生成素(TPO)；神
经生长因子，诸如NGF-β；血小板生长因子；转化生长因子(TGF)，诸如TGF-α
和TGF-β；胰岛素样生长因子-I和-II；红细胞生成素(EPO)；骨诱导因子
(osteoinductive factor)；干扰素，诸如干扰素-α、-β和-γ；集落刺激因子(CSF)，
诸如巨噬细胞CSF(M-CSF)、粒细胞-巨噬细胞CSF(GM-CSF)和粒细胞CSF
(G-CSF)；白介素(IL)，诸如IL-1、IL-1α、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、
IL-8、IL-9、IL-11、IL-12；肿瘤坏死因子，诸如TNF-α或TNF-β；及其它多
肽因子，包括LIF和kit配体(KL)。在用于本文时，术语细胞因子包括来自天
然来源或来自重组细胞培养物的蛋白质及天然序列细胞因子的生物学活性
等效物。
“包装插页”用于指通常包括在治疗用产品的商业包装中的说明书，它们
包含有关涉及此类治疗用产品应用的适应征、用法、剂量、施用、禁忌症和
/或警告的信息。
术语“胞内代谢物”指由细胞内对抗体-药物偶联物(ADC)的代谢过程或
反应产生的化合物。所述代谢过程或反应可以是酶促过程，诸如ADC的肽接
头的蛋白水解切割或官能基诸如腙、酯或酰胺的水解。胞内代谢物包括但不
限于在进入、扩散、摄取或转运进入细胞后经历胞内切割的抗体和游离药物。
术语“胞内切割的”和“胞内切割”指细胞内对抗体-药物偶联物(ADC)的
代谢过程或反应，由此共价附着，即药物模块(D)与抗体(Ab)之间的接头被打
断，导致在细胞内游离药物与抗体解离。ADC别切割的模块因而是胞内代谢
物。
术语“生物利用度”指施用于患者的给定量的药物的系统利用度(即血液
/血浆水平)。生物利用度是表明药物从所施用的剂量形式到达大循环的时间
(速率)和总量(程度)二者度量的绝对项。
术语“细胞毒活性”指ADC或ADC的胞内代谢物的细胞杀伤、细胞抑制或
生长抑制效果。细胞毒活性可以表述为IC50值，即半数细胞存活时每单位体
积的浓度(摩尔或质量)。
如本文中所使用的，术语“烷基”指1-12个碳原子(C1-C12)的饱和的、
直链的或支链的单价烃基，其中烷基可以是任选用下文所述一种或多种取代
基独立取代的。在另一个实施方案中，烷基指1-8个碳原子(C1-C8)或1-6
个碳原子(C1-C6)的。烷基的实例包括但不限于甲基(Me，-CH3)、乙基(Et，
-CH2CH3)、1-丙基(n-Pr，正丙基，-CH2CH2CH3)、2-丙基(i-Pr，异丙基，
-CH(CH3)2)、1-丁基(n-Bu，正丁基，-CH2CH2CH2CH3)、2-甲基-1-丙基(i-Bu，异
丁基，-CH2CH(CH3)2)、2-丁基(s-Bu，仲丁基，-CH(CH3)CH2CH3)、2-甲基-2-
丙基(t-Bu，叔丁基，-C(CH3)3)、1-戊基(n-戊基，-CH2CH2CH2CH2CH3)、2-戊基
(-CH(CH3)CH2CH2CH3)、3-戊基(-CH(CH2CH3)2)、2-甲基-2-丁基
(-C(CH3)2CH2CH3)、3-甲基-2-丁基(-CH(CH3)CH(CH3)2)、3-甲基-1-丁基
(-CH2CH2CH(CH3)2)、2-甲基-1-丁基(-CH2CH(CH3)CH2CH3)、1-己基
(-CH2CH2CH2CH2CH2CH3)、2-己基(-CH(CH3)CH2CH2CH2CH3)、3-己基
(-CH(CH2CH3)(CH2CH2CH3))、2-甲基-2-戊基(-C(CH3)2CH2CH2CH3)、3-甲基
-2-戊基(-CH(CH3)CH(CH3)CH2CH3)、4-甲基-2-戊基(-CH(CH3)CH2CH(CH3)2)、
3-甲基-3-戊基(-C(CH3)(CH2CH3)2)、2-甲基-3-戊基(-CH(CH2CH3)CH(CH3)2)、
2，3-二甲基-2-丁基(-C(CH3)2CH(CH3)2)、3，3-二甲基-2-丁基(-CH(CH3)C(CH3)3、
1-庚基、1-辛基、等等。
术语“烯基”指2-8个碳原子(C2-C8)的、有至少一个不饱和位点(即碳
-碳，sp2双键)的、直链的或支链的单价烃基，其中烯基可以是任选用下文
所述一种或多种取代基独立取代的，而且包括具有“顺式”和“反式”取向或者
“E”和“Z”取向的基团。实例包括但不限于乙烯基(-CH＝CH2)、烯丙基
(-CH2CH＝CH2)、等等。
术语“炔基”指2-8个碳原子(C2-C8)的、有至少一个不饱和位点(即碳
-碳，sp三键)的、直链的或支链的单价烃基，其中炔基可以是任选用下文所
述一种或多种取代基独立取代的。实例包括但不限于乙炔基(-C≡CH)、丙炔
基(炔丙基，-CH2C≡CH)、等等。
术语“碳环(carbocycle)”、“碳环基”、“碳环(carbocyclic ring)”和“环烃基”
指作为单环具有3-12个碳原子(C3-C12)或作为双环具有7-12个碳原子的、
单价的、非芳族的、饱和的或部分不饱和的环。具有7-12个碳的双环碳环可
以排列成例如双环[4，5]、[5，5]、[5，6]或[6，6]体系，而具有9或10个环原子的双
环碳环可以排列成双环[5，6]或[6，6]体系，或者桥连体系诸如双环[2.2.1]庚烷、
双环[2.2.2]辛烷和双环[3.2.2]壬烷。单环碳环的实例包括但不限于环丙基、
环丁基、环戊基、1-环戊-1-烯基、1-环戊-2-烯基、1-环戊-3-烯基、环己基、
1-环己-1-烯基、1-环己-2-烯基、1-环己-3-烯基、环己二烯基、环庚基、环辛
基、环壬基、环癸基、环十一烷基、环十二烷基、等等。
“芳基”指6-20个碳原子(C6-C20)的、通过从母体芳族环体系的一个碳
原子除去一个氢原子而衍生的单价芳族烃基。有些芳基在例示结构中以“Ar”
来代表。芳基包括包含与饱和的、部分不饱和的环或芳族碳环稠合的芳香环
的双环基。典型的芳基包括但不限于自苯(苯基)、取代的苯、萘、蒽、联
苯、茚基、茚满基、1，2-二氢萘、1，2，3，4-四氢萘基等等衍生的基团。芳基可
以是任选用本文所述一种或多种取代基独立取代的。
术语“杂环(heterocycle)”、“杂环基”和“杂环(heterocyclic ring)”在本文中
可互换使用，指3-20个环原子的(其中至少一个环原子是选自氮、氧、磷和
硫的杂原子，其余环原子是C)、饱和的或部分不饱和的(即在环内具有一个
或多个双键和/或三键)碳环基，其中一个或多个环原子是任选用下文所述一
种或多种取代基独立取代的。杂环可以是具有3-7个环成员(2-6个碳原子和
1-4个选自N、O、P和S的杂原子)的单环或具有7-10个环成员(4-9个碳原子
和1-6个选自N、O、P和S的杂原子)的双环，例如双环[4，5]、[5，5]、[5，6]或
[6，6]体系，而具有9或10个环原子的双环碳环可以排列成双环[5，6]或[6，6]体
系。杂环记载于Paquette，Leo A.；″Principles of Modern Heterocyclic Chemistry″
(W.A.Benjamin，New York，1968)，特别是第1，3，4，6，7，和9章；″The
Chemistry of Heterocyclic Compounds，A series of Monographs″(John Wiley &
Sons，New York，1950至今)，特别是第13，14，16，19，和28卷；及J.Am.Chem.
Soc.(1960)82：5566。“杂环基”还包括其中杂环基与饱和的、部分不饱和的环
或芳族碳环或杂环稠合的基团。杂环的实例包括但不限于吡咯烷基
(pyrrolidinyl)、四氢呋喃基(tetrahydrofuranyl)、二氢呋喃基(dihydrofuranyl)、
四氢噻吩基(tetrahydrothienyl)、四氢吡喃基(tetrahydropyranyl)、二氢吡喃基
(dihydropyranyl)、四氢噻喃基(tetrahydrothiopyranyl)、哌啶子基(piperidino)、
吗啉代(morpholino)、硫吗啉代(thiomorpholino)、硫杂氧杂环己基(thioxanyl)、
哌嗪基(piperazinyl)、高哌嗪基(homopiperazinyl)、氮杂环丁烷基(azetidinyl)、
氧杂环丁烷基(oxetanyl)、硫杂环丁烷基(thietanyl)、高哌啶基
(homopiperidinyl)、氧杂环庚烷基(oxepanyl)、硫杂环庚烷基(thiepanyl)、氧氮
杂![]()
基oxazepinyl、二氮杂![]()
基(diazepinyl)、硫杂![]()
基(thiazepinyl)、2-吡咯啉
基(2-pyrrolinyl)、3-吡咯啉基(3-pyrrolinyl)、二氢吲哚基(indolinyl)、2H-吡喃
基(2H-pyranyl)、4H-吡喃基(4H-pyranyl)、二![]()
烷基(dioxanyl)、1，3-二氧戊环
基(1，3-dioxolanyl)、吡唑啉基(pyrazolinyl)、二硫杂环己基(dithianyl)、二硫杂
环戊基(dithiolanyl)、二氢吡喃基(dihydropyranyl)、二氢噻吩基
(dihydrothienyl)、二氢呋喃基(dihydrofuranyl)、吡唑烷基(pyrazolidinyl)咪唑啉
基(imidazolinyl)、咪唑烷基(imidazolidinyl)、3-氮杂双环[3.1.0]己烷基
(3-azabicyco[3.1.0]hexanyl)、3-氮杂双环[4.1.0]庚烷基
(3-azabicyclo[4.1.0]heptanyl)、氮杂双环[2.2.2]己烷基
(azabicyclo[2.2.2]hexanyl)、3H-吲哚基(3H-indolyl)、喹嗪基(quinolizinyl)和N-
吡啶基脲(N-pyridyl urea)。螺环部分也包括在此定义的范围内。其中2个环碳
原子被氧代(＝O)部分取代的杂环基的实例有嘧啶酮基(pyrimidinonyl)和1，1-
二氧代-硫吗啉基(1，1-dioxo-thiomorpholinyl)。本文中的杂环基是任选用本文
所述一种或多种取代基独立取代的。
术语“杂芳基”指五、六或七元环的单价芳香基，而且包括5-20个原子(含
有一个或多个独立选自氮、氧和硫的杂原子)的稠环体系(其中至少一个是
芳族的)。杂芳基的实例有吡啶基(pyridinyl)(包括例如2-羟基吡啶基)、咪唑
基(imidazolyl)、咪唑并吡啶基(imidazopyridinyl)、嘧啶基(pyrimidinyl)(包括
例如4-羟基嘧啶基)、吡唑基(pyrazolyl)、三唑基(triazolyl)、吡嗪基(pyrazinyl)、
四唑基(tetrazolyl)、呋喃基(furyl)、噻吩基(thienyl)、异![]()
唑基(isoxazolyl)、噻
唑基(thiazolyl)、![]()
唑基(oxazolyl)、异噻唑基(isothiazolyl)、吡咯基(pyrrolyl)、
喹啉基(quinolinyl)、异喹啉基(isoquinolinyl)、吲哚基(indolyl)、苯并咪唑基
(benzimidazolyl)、苯并呋喃基(benzofuranyl)、噌啉基(cinnolinyl)、吲唑基
(indazolyl)、吲嗪基(indolizinyl)、酞嗪基(phthalazinyl)、哒嗪基(pyridazinyl)、
三嗪基(triazinyl)、异吲哚基(isoindolyl)、喋啶基(pteridinyl)、嘌呤基(purinyl)、
![]()
二唑基(oxadiazolyl)、三唑基(triazolyl)、噻二唑基(thiadiazolyl)、噻二唑基
(thiadiazolyl)、呋咱基(furazanyl)、苯并呋咱基(benzofurazanyl)、苯并噻吩基
(benzothiophenyl)、苯并噻唑基(benzothiazolyl)、苯并![]()
唑基(benzoxazolyl)、
喹唑啉基(quinazolinyl)、喹![]()
啉基(quinoxalinyl)、二氮杂萘基(naphthyridinyl)
和呋喃并吡啶基(furopyridinyl)。杂芳基是任选用本文所述一种或多种取代基
独立取代的。
如果可能，杂环或杂芳基可以是碳(碳连的)或氮(氮连的)键合的。
举例而非限制，碳键合的杂环或杂芳基在吡啶的2、3、4、5或6位，哒嗪的3、
4、5或6位，嘧啶的2、4、5或6位，吡嗪的2、3、5或6位，呋喃、四氢呋喃、
硫代呋喃(thiofuran)、噻吩、吡咯或四氢吡咯的2、3、4或5位，![]()
唑、咪唑或
噻唑的2、4或5位，异![]()
唑、吡唑或异噻唑的3、4或5位，氮丙啶的2或3位，
吖丁啶的2、3或4位，喹啉的2、3、4、5、6、7或8位，或异喹啉的1、3、4、
5、6、7或8位处键合。
举例而非限制，氮键合的杂环或杂芳基在氮丙啶、吖丁啶、吡咯、吡咯
烷、2-吡咯啉、3-吡咯啉、咪唑、咪唑烷、2-咪唑啉、3-咪唑啉、吡唑、吡
唑啉、2-吡唑啉、3-吡唑啉、哌啶、哌嗪、吲哚、二氢吲哚、1H-吲唑的1位，
异吲唑或异二氢吲哚的2位，吗啉的4位，和咔唑或β-咔啉的9位处键合。
“亚烷基”指1-18个碳原子且具有两个单价基团中心(radical center)(通过
从母体烷烃的同一碳原子或两个不同碳原子除去两个氢原子而衍生的)的饱
和的、支链的或直链的或环状的烃基。典型的亚烷基包括但不限于：亚甲基
(-CH2-)、1，2-乙基(亚乙基)(-CH2CH2-)、1，3-丙基(亚丙基)(-CH2CH2CH2-)、
1，4-丁基(亚丁基)(-CH2CH2CH2CH2-)等等。
“C1-C10亚烷基”指通式-(CH2)1-10-的直链、饱和烃基。C1-C10亚烷基的实
例包括亚甲基、亚乙基、亚丙基、亚丁基、亚戊基、亚己基、亚庚基、亚辛
基、亚壬基和亚癸基。
“亚烯基”指2-18个碳原子且具有两个单价基团中心(radical center)(通过
从母体烯烃的同一碳原子或两个不同碳原子除去两个氢原子而衍生的)的不
饱和的、支链的或直链的或环状的烃基。典型的亚烯基包括但不限于：1，2-
亚乙烯基(-CH＝CH-)。
“亚炔基”指指2-18个碳原子且具有两个单价基团中心(radical center)(通
过从母体炔烃的同一碳原子或两个不同碳原子除去两个氢原子而衍生的)的
不饱和的、支链的或直链的或环状的烃基。典型的亚炔基包括但不限于：亚
乙炔基(-C≡C-)、炔丙基(-CH2C≡C-)和4-戊炔基(-CH2CH2CH2C≡C-)。
“亚芳基”指具有两个共价键且可以是邻位、间位或对位构型的芳基，如
下述结构所示：
![]()
其中苯基可以是未取代的，或者是被至多四个下述基团取代的，包括但不限
于-C1-C8烷基、-O-(C1-C8烷基)、-芳基、-C(O)R’、-OC(O)R’、-C(O)OR’、
-C(O)NH2、-C(O)NHR’、-C(O)N(R’)2、-NHC(O)R’、-S(O)2R’、-S(O)R’、-OH、
-卤素、-N3、-NH2、-NH(R’)、-N(R’)2和-CN；其中每个R’独立选自H、-C1-C8
烷基和芳基。
“芳烃基”指键合至碳原子(通常是末端或sp3碳原子)的氢原子之一被芳
基取代的非环烃基。典型的芳烃基包括但不限于苄基、2-苯基乙烷-1-基、2-
苯基乙烯-1-基、萘甲基、2-萘基乙烷-1-基、2-萘基乙烯-1-基、萘并苄基、2-
萘并苯基乙烷-1-基等等。芳烃基包含6-20个碳原子，例如芳烃基的烃基部分
(包括烷基、烯基或炔基)是1-6个碳原子，芳基部分是5-14个碳原子。
“杂芳烃基”指键合至碳原子(通常是末端或sp3碳原子)的氢原子之一被
杂芳基取代的非环烃基。典型的杂芳烃基包括但不限于2-苯并咪唑基甲基、
2-呋喃基乙基、等等。杂芳烃基包含6-20个碳原子，例如杂芳烃基的烃基部
分(包括烷基、烯基或炔基)是1-6个碳原子，杂芳基部分是5-14个碳原子和
1-3个选自N、O、P和S的杂原子。杂芳烃基的杂芳基部分可以是具有3-7个环
成员(2-6个碳原子和1-3个选自N、O、P和S的杂原子)的单环或具有7-10
个环成员(4-9个碳原子和1-3个选自N、O、P和S的杂原子)的双环，例如双
环[4，5]、[5，5]、[5，6]或[6，6]体系。
术语“前体药物”在用于本申请时指与母体药物相比对肿瘤细胞的细胞
毒性较小并能够酶促活化或转变为更具活性母体形式的药学活性物质的前
体或衍生物形式。参见例如Wilman，“Prodrugs in Cancer Chemotherapy”，
Biochemical Society Transactions，14，pp.375-382，615th Meeting Belfast(1986)
和Stella等，“Prodrugs：A Chemical Approach to Targeted Drug Delivery”，
Directed Drug Delivery，Borchardt等，编，pp.247-267，Humana Press(1985)。本
发明的前体药物包括但不限于含磷酸盐/酯前体药物、含硫代磷酸盐/酯前体
药物、含硫酸盐/酯前体药物、含肽前体药物、D-氨基酸修饰前体药物、糖
基化前体药物、含β-内酰胺前体药物、含任选取代苯氧基乙酰胺的前体药物、
或含任选取代苯乙酰胺的前体药物、可转化为更具活性而无细胞毒性的药物
的5-氟胞嘧啶和其它5-氟尿苷前体药物。可衍生为本发明使用的前体药物形
式的细胞毒性药物的例子包括但不限于上文所描述的那些化疗剂。
“放射疗法”或“放疗”指使用定向伽马射线或贝塔射线来诱发对细胞的足
够损伤，以限制细胞正常发挥功能的能力或全然破坏细胞。应当领会，本领
域知道许多方式来确定治疗的剂量和持续时间。典型的治疗作为一次施用来
给予，而典型的剂量范围为每天10-200个单位(戈瑞(Gray))。
“代谢物”指特定化合物或其盐在身体中经由代谢生成的产物。化合物的
代谢物可以使用本领域已知的常规技术来鉴定，而且它们的活性可以使用诸
如本文中所描述的测试来测定。此类产物可能源自例如所施用化合物的氧
化、还原、水解、酰胺化、脱酰胺、酯化、脱酯、酶促切割、等等。因而，
本发明包括本发明化合物的代谢物，包括通过如下过程生成的化合物，所述
过程包括使本发明的化合物接触哺乳动物一段时间，该段时间足以生成其代
谢产物。
“脂质体”指由各种类型的脂质、磷脂和/或表面活性剂构成的，可用于对
哺乳动物投递药物的小囊泡。脂质体的成分通常排列成双层形式，与生物膜
的脂质排列相似。
“接头”指包含将抗体共价附着于药物模块的共价键或原子链的化学模
块。在各个实施方案中，接头包括诸如烃基二基、芳基二基、杂芳基二基的
二价基，诸如-(CR2)nO(CR2)n-的模块，烃基氧(例如聚乙烯氧、PEG、聚亚
甲基氧)和烃基氨基(例如聚乙烯氨基、JeffamineTM)的重复单元；及二酸
酯和酰胺，包括琥珀酸酯、琥珀酰胺、二乙醇酸酯、丙二酸酯和己酰胺
(caproamide)。
术语“手性”指分子具有镜像对映体不可重叠的特性，而术语“非手性”指
分子可重叠于其镜像对映体上。
术语“立体异构体”指具有相同的化学结构，但是在原子或基团的空间排
列方面有所不同的化合物。
“非对映异构体”指具有两个或多个手性中心且其分子彼此不为镜像对
映体的空间异构体。非对映体具有不同的物理特性，例如熔点、沸点、光谱
特征和反应性。非对映异构体的混合物可以在高分辨力的分析规程下分开，
诸如电泳和层析。
“对映异构体”指化合物的彼此为不可重叠镜像的两种空间异构体。
本文中所使用的立体化学定义和规则一般遵循S.P.Parker，Ed.，
McGraw-Hill Dictionary of Chemical Terms(1984)McGraw-Hill Book
Company，New York；及Eliel，E.and Wilen，S.，Stereochemistry of Organic
Compounds(1994)John Wiley & Sons，Inc.，New York。许多有机化合物以旋光
型存在，即它们具有旋转平面偏振光的平面的能力。在描述旋光性化合物时，
使用前缀D和L，或者R和S来表示分子关于其手性中心的绝对构型。采用前
缀d和l或者(+)和(-)来指示化合物对平面偏振光的旋转，(-)或l意味着化合物
是左旋的。带有前缀(+)或d的化合物是右旋的。对于给定的化学结构，这些
立体异构体是相同的，只是它们互为镜像。特定的立体异构体还可以称为对
映异构体，而且此类异构体的混合物常常称为对映混合物。对映异构体的
50∶50混合物称为外消旋混合物或外消旋物，其可以在化学反应或过程中没有
立体选择或立体特异性时发生。术语“外消旋混合物”和“外消旋物”指两种对
映异构体的等摩尔混合物，其没有旋光性。
术语“互变异构体”或“互变异构体形式”指具有不同能量的结构同分异构
体，它们经由低能障可互变。例如，质子互变异构体(也称作质子移变互变
异构体)包括经由质子迁移发生的互变，诸如酮-烯醇和亚胺-烯胺异构化。
化合价互变异构体包括通过一些成键电子的重新组织发生的互变。
短语“药学可接受盐”在用于本文时指本发明化合物的药学可接受的有
机或无机盐。例示性的盐包括但不限于硫酸盐、柠檬酸盐、乙酸盐、草酸盐、
氯化物、溴化物、碘化物、硝酸盐、硫酸氢盐、磷酸盐、酸式磷酸盐、异烟
酸盐、乳酸盐、水杨酸盐、酸式柠檬酸盐、酒石酸盐、油酸盐、丹宁酸盐、
泛酸盐、酒石酸氢盐、抗坏血酸盐、琥珀酸盐、马来酸盐、龙胆酸盐、富马
酸盐、葡糖酸盐、葡糖醛酸盐、糖酸盐、甲酸盐、苯甲酸盐、谷氨酸盐、甲
磺酸盐、乙磺酸盐、苯磺酸盐、对甲苯磺酸盐和扑酸盐(即1，1’-亚甲基-双(2-
羟基-3-萘甲酸盐))。药学可接受盐可能涉及包含另一种分子，诸如乙酸盐离
子、琥珀酸盐离子或其它抗衡离子。抗衡离子可以是稳定母体化合物电荷的
任何有机或无机模块。另外，药学可接受盐可以在其结构中具有超过一种带
电荷原子。在多种带电荷原子作为药学可接受盐的组成部分的情况中可以具
有多种抗衡离子。因此，药学可接受盐可具有一种或多种带电荷原子和/或一
种或多种抗衡离子。
如果本发明的化合物是碱，那么期望的药学可接受的盐可以通过本领域
可得的任何合适方法来制备，例如用无机酸(诸如氢氯酸、氢溴酸、硫酸、
硝酸、甲磺酸、磷酸等等)或用有机酸(诸如乙酸、三氟乙酸、马来酸、琥
珀酸、扁桃酸、富马酸/延胡索酸、丙二酸、丙酮酸、草酸、乙醇酸、水杨酸、
吡喃糖苷酸(pyranosidyl acid)(诸如葡萄糖醛酸或半乳糖醛酸)、α羟酸(诸
如柠檬酸或酒石酸)、氨基酸(诸如天冬氨酸或谷氨酸)、芳香酸(诸如苯甲
酸或肉桂酸)、磺酸(诸如对甲苯磺酸或乙磺酸)、等等)处理游离碱。
如果本发明的化合物是酸，那么期望的药学可接受的盐可以通过任何合
适方法来制备，例如用无机或有机碱(诸如胺(伯、仲或叔))、碱金属氢氧
化物或碱土金属氢氧化物、等等处理游离酸。合适的盐的例示性例子包括但
不限于自氨基酸(诸如甘氨酸和精氨酸)、铵、伯/仲/叔胺和环胺(诸如哌啶、
吗啉和哌嗪)衍生的有机盐，和自钠、钙、钾、镁、锰、铁、铜、锌、铝和
锂衍生的无机盐。
短语“药学可接受的”指明该物质或组合物必须是在化学和/或毒理学方
面与构成配制剂的其它成分和/或用它治疗的哺乳动物相容的。
“溶剂合物”指一个或多个溶剂分子与本发明化合物的缔合物或复合物。
形成溶剂合物的溶剂的例子包括但不限于水、异丙醇、乙醇、甲醇、DMSO、
乙酸乙酯、乙酸和乙醇胺。术语“水合物”指其中的溶剂分子是水的复合物。
术语“保护基团”指常用于使化合物上的其它官能团起反应的同时封闭
或保护特定官能度的取代基。例如“氨基保护基团”指连接于化合物中的氨基
并阻断或保护氨基官能度的取代基。合适的氨基保护基团包括乙酰基、三氟
乙酰基、叔-丁氧羰基(BOC)、苄氧羰基(CBZ)和9-芴甲氧羰基(Fmoc)。类似
的，“羟基保护基团”指阻断或保护羟基官能度的羟基取代基。合适的保护基
团包括乙酰基和甲硅烷基。“羧基保护基团”指阻断或保护羧基官能度的羟基
取代基。常用的羧基保护基团包括苯基磺酰基乙基、氰乙基、2-(三甲基甲硅
烷基)乙基、2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基甲基、2-(对甲苯磺酰基)乙基、2-(对
硝基苯基亚磺酰基)乙基、2-(联苯基膦基)-乙基、硝基乙基等等。关于保护基
团及其用途的一般性说明参见T.W.Greene，Protective Groups in Organic
Synthesis，John Wiley & Sons，New York，1991。
“离去基团”指可以被另一官能基取代的官能基。某些离去基团是本领域
公知的，实例包括但不限于卤化物(例如氯化物、溴化物、碘化物)、甲基
磺酰基(甲磺酰基)、对甲苯磺酰基(甲苯磺酰基)、三氟甲基磺酰基(triflate)
和三氟甲基磺酸酯基。
缩写
接头组件：
MC＝6-马来酰亚氨基己酰基
Val-Cit或“vc”＝缬氨酸-瓜氨酸(蛋白酶可切割接头中的例示二肽)
瓜氨酸＝2-氨基-5-脲基戊酸
PAB＝对氨基苯甲基氧羰基(“自我牺牲”接头构件的例示)
Me-Val-Cit＝正甲基-缬氨酸-瓜氨酸(其中接头肽键已经修饰以防止其受到
组织蛋白酶B的切割)
MC(PEG)6-OH＝马来酰亚氨基己酰基-聚乙二醇(可连接于抗体半胱氨酸)。
细胞毒性药物：
MMAE＝单甲基auristatin E(MW 718)
MMAF＝auristatin E(MMAE)的变体，其在药物的C-末端处有苯丙氨酸(MW
731.5)
MMAF-DMAEA＝有DMAEA(二甲基氨基乙胺)以酰胺键连接至C-末端苯
丙氨酸的MMAF(MW 801.5)
MMAF-TEG＝有四乙二醇酯化至苯丙氨酸的MMAF
MMAF-NtBu＝正叔丁基作为酰胺连接于MMAF的C-末端
DM1＝N(2′)-脱乙酰基-N(2′)-(3-巯基-1-氧代丙基)-美登素
DM3＝N(2′)-脱乙酰基-N2-(4-巯基-1-氧代戊基)-美登素
DM4＝N(2′)-脱乙酰基-N2-(4-巯基-4-甲基-1-氧代戊基)-美登素
别的缩写如下：AE指auristatin E；Boc指N-(叔丁氧羰基)；cit指瓜氨酸；
dap指dolaproine；DCC指1，3-二环己基碳二亚胺；DCM指二氯甲烷；DEA指
二乙胺；DEAD指偶氮二羧酸二乙酯；DEPC指氰基磷酸二乙酯；DIAD指偶
氮二羧酸二异丙酯；DIEA指N，N-二异丙基乙胺；dil指dolaisoleucine；DMA
指二甲基乙酰胺；DMAP指4-二甲基氨基吡啶；DME指乙二醇二甲基醚(或
1，2-二甲氧乙烷)；DMF指N，N-二甲基甲酰胺；DMSO指二甲基亚砜；doe指
dolaphenine；dov指N，N-二甲基缬氨酸；DTNB指5，5’-二硫双(2-硝基苯甲酸)；
DTPA指二乙烯三胺五乙酸；DTT指二硫苏糖醇；EDCI指1-(3-二甲基氨基丙
基)-3-乙基碳二亚胺氢氯化物；EEDQ指2-乙氧基-1-乙氧羰基-1，2-二氢喹啉；
ES-MS指电喷雾质谱；EtOAc指乙酸乙酯；Fmoc指N-(9-芴基甲氧羰基)；gly
指甘氨酸；HATU指O-(7-氮杂苯并三唑-1-基)-N，N，N’，N’-四甲基![]()
六氟磷酸
盐；HOBt指1-羟基苯并三唑；HPLC指高压液相色谱；ile指异亮氨酸；lys指
赖氨酸；MeCN(CH3CN)指乙腈；MeOH指甲醇；Mtr指4-茴香基联苯基甲基
(或4-甲氧基三苯甲基)；nor指(1S；2R)-(+)-去甲麻黄碱；PBS指磷酸盐缓冲
盐水(pH 7.4)；PEG指聚乙二醇；Ph指苯基；Pnp指对硝基苯基；MC指6-马来
酰亚氨基己酰基；phe指L-苯丙氨酸；PyBrop指溴代三吡咯烷子基鳞六氟磷
酸盐；SEC指尺寸排阻色谱；Su指琥珀酰亚胺；TFA指三氟乙酸；TLC指薄
层色谱；UV指紫外线；而val指缬氨酸。
“游离半胱氨酸”指已经工程改造入亲本抗体的、具有硫醇官能基(-SH)
的、且没有配对成为分子内或分子间二硫桥的半胱氨酸残基。
术语“硫醇反应性值(thio reactivity value)”是游离半胱氨酸氨基酸的反应
性的定量表征。硫醇反应性值指经过半胱氨酸工程改造的抗体中与硫醇反应
性试剂反应的游离半胱氨酸氨基酸的百分比，且换算成最大值1。例如，经
过半胱氨酸工程改造的抗体上与硫醇反应性试剂(诸如生物素-马来酰亚胺
试剂)以100％产率反应(以形成生物素标记的抗体)的游离半胱氨酸氨基
酸具有1.0的硫醇反应性值。已工程改造入相同或不同亲本抗体、与硫醇反应
性试剂以80％产率反应的另一个半胱氨酸氨基酸具有0.8的硫醇反应性值。已
工程改造入相同或不同亲本抗体、完全不能与硫醇反应性试剂反应的另一个
半胱氨酸氨基酸具有0的硫醇反应性值。特定半胱氨酸的硫醇反应性值的测
定可以通过ELISA测定法、质谱、液相层析、放射自显影或其它定量分析测
试来进行。
“亲本抗体”指包含其中一个或多个氨基酸残基有待用一个或多个半胱
氨酸残基替换的氨基酸序列的抗体。亲本抗体可以包含天然的或野生型的序
列。亲本抗体可具有相对于其它天然的、野生型的或修饰形式的抗体而言的
现有氨基酸序列修饰(诸如添加、删除和/或替代)。亲本抗体可以针对感兴
趣的靶抗原，例如生物学重要的多肽。还涵盖针对非多肽抗原(诸如肿瘤相
关糖脂抗原；参见US 5091178)的抗体。
表1
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表1(续)
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表1(续)
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表1(续)
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III.本发明的组合物和方法
本发明提供了抗FcRH5抗体或其功能性片段，及其在造血肿瘤治疗中的
使用方法。
一方面，本发明提供了一种与任何上文或下文所述多肽结合(优选特异
性结合)的抗体。任选的是，所述抗体是单克隆抗体、抗体片段(包括Fab、
Fab′、F(ab′)2和Fv片段)、双抗体、单域抗体、嵌合抗体、人源化抗体、单链
抗体或竞争性抑制抗FcRH5多肽抗体结合其相应抗原性表位的抗体。本发明
的抗体可任选偶联至生长抑制剂或细胞毒剂，诸如毒素，包括例如auristatin、
美登木素生物碱、多拉司他汀衍生物或加利车霉素、抗生素、放射性同位素、
溶核酶、诸如此类。本发明的抗体可任选在CHO细胞或细菌细胞中生成，且
优选诱导它们所结合的细胞死亡。出于检测目的，本发明的抗体可以是可检
测标记的，附着至固体支持物的，诸如此类。
一方面，本发明提供了一种人源化抗FcRH5抗体，其中该抗体对FcRH5
的单价亲和力(例如Fab片段形式的抗体对FcRH5的亲和力)与鼠抗体(例
如Fab片段形式的鼠抗体对FcRH5的亲和力)或嵌合抗体(例如Fab片段形式
的嵌合抗体对FcRH5的亲和力)的单价亲和力基本上相同，所述鼠抗体或嵌
和抗体包含图9(SEQ ID NO：18)和图10(SEQ ID NO：20)所示轻链和重链可
变域序列，由图9(SEQ ID NO：18)和图10(SEQ ID NO：20)所示轻链和重链可
变域序列组成，或基本上由图9(SEQ ID NO：18)和图10(SEQ ID NO：20)所示
轻链和重链可变域序列组成。
另一方面，本发明提供了一种人源化抗FcRH5抗体，其中该抗体对FcRH5
的单价亲和力(例如Fab片段形式的抗体对FcRH5的亲和力)比鼠抗体(例
如Fab片段形式的鼠抗体对FcRH5的亲和力)或嵌合抗体(例如Fab片段形式
的嵌合抗体对FcRH5的亲和力)的单价亲和力低，例如低至少1、2、3、4、
5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、
35、40、45、50、55或60倍，所述鼠抗体或嵌和抗体包含图9(SEQ ID NO：18)
和图10(SEQ ID NO：20)所示轻链和重链可变域序列，由图9(SEQ ID NO：18)
和图10(SEQ ID NO：20)所示轻链和重链可变域序列组成，或基本上由图9
(SEQ ID NO：18)和图10(SEQ ID NO：20)所示轻链和重链可变域序列组成。
另一方面，本发明提供了一种人源化抗FcRH5抗体，其中该抗体对FcRH5
的单价亲和力(例如Fab片段形式的抗体对FcRH5的亲和力)比鼠抗体(例
如Fab片段形式的鼠抗体对FcRH5的亲和力)或嵌合抗体(例如Fab片段形式
的嵌合抗体对FcRH5的亲和力)的单价亲和力高，例如高至少1、2、3、4、
5、6、7、8、9或10倍，所述鼠抗体或嵌和抗体包含图9(SEQ ID NO：18)和
图10(SEQ ID NO：20)所示轻链和重链可变域序列，由图9(SEQ ID NO：18)
和图10(SEQ ID NO：20)所示轻链和重链可变域序列组成，或基本上由图9
(SEQ ID NO：18)和图10(SEQ ID NO：20)所示轻链和重链可变域序列组成。
一方面，本发明提供了一种人源化抗FcRH5抗体，其中二价形式的该抗
体对FcRH5的亲和力(例如IgG形式的抗体对FcRH5的亲和力)与二价形式
的鼠抗体(例如IgG形式的抗体对FcRH5的亲和力)或嵌合抗体(例如Fab片
段形式的嵌合抗体对FcRH5的亲和力)的亲和力基本上相同，所述鼠抗体或
嵌和抗体包含图9(SEQ ID NO：18)和图10(SEQ ID NO：20)所示轻链和重链
可变域序列，由图9(SEQ ID NO：18)和图10(SEQ ID NO：20)所示轻链和重链
可变域序列组成，或基本上由图9(SEQ ID NO：18)和图10(SEQ ID NO：20)
所示轻链和重链可变域序列组成。
另一方面，本发明提供了一种人源化抗FcRH5抗体，其中二价形式的该
抗体对FcRH5的亲和力(例如IgG形式的抗体对FcRH5的亲和力)比二价形
式的鼠抗体(例如IgG形式的抗体对FcRH5的亲和力)或嵌合抗体(例如IgG
片段形式的嵌合抗体对FcRH5的亲和力)的亲和力低，例如低至少1、2、3、
4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、
30、35、40、45、50、55或60倍，所述鼠抗体或嵌和抗体包含图9(SEQ ID NO：
18)和图10(SEQ ID NO：20)所示轻链和重链可变域序列，由图9(SEQ ID NO：
18)和图10(SEQ ID NO：20)所示轻链和重链可变域序列组成，或基本上由图9
(SEQ ID NO：18)和图10(SEQ ID NO：20)所示轻链和重链可变域序列组成。
另一方面，本发明提供了一种人源化抗FcRH5抗体，其中二价形式的该
抗体对FcRH5的亲和力(例如IgG形式的抗体对FcRH5的亲和力)比二价形
式的鼠抗体(例如IgG形式的抗体对FcRH5的亲和力)或嵌合抗体(例如IgG
片段形式的嵌合抗体对FcRH5的亲和力)的亲和力高，例如高至少1、2、3、
4、5、6、7、8、9或10倍，所述鼠抗体或嵌和抗体包含图9(SEQ ID NO：18)
和图10(SEQ ID NO：20)所示轻链和重链可变域序列，由图9(SEQ ID NO：18)
和图10(SEQ ID NO：20)所示轻链和重链可变域序列组成，或基本上由图9
(SEQ ID NO：18)和图10(SEQ ID NO：20)所示轻链和重链可变域序列组成。
另一方面，本发明提供了一种人源化抗FcRH5抗体，其中二价形式的该
抗体对FcRH5的亲和力(例如IgG形式的抗体对FcRH5的亲和力)是0.4nM。
在另一个方面，本发明提供了一种人源化抗FcRH5抗体，其中二价形式的该
抗体对FcRH5的亲和力(例如IgG形式的抗体对FcRH5的亲和力)是0.4nM+/-
0.04。
另一方面，本发明提供了一种人源化抗FcRH5抗体，其中二价形式的该
抗体对FcRH5的亲和力(例如IgG形式的抗体对FcRH5的亲和力)是0.3nM或
更好。另一方面，本发明提供了一种人源化抗FcRH5抗体，其中二价形式的
该抗体对FcRH5的亲和力(例如IgG形式的抗体对FcRH5的亲和力)是0.32nM
或更好。另一方面，本发明提供了一种人源化抗FcRH5抗体，其中二价形式
的该抗体对FcRH5的亲和力(例如IgG形式的抗体对FcRH5的亲和力)是0.36
nM或更好。另一方面，本发明提供了一种人源化抗FcRH5抗体，其中二价形
式的该抗体对FcRH5的亲和力(例如IgG形式的抗体对FcRH5的亲和力)是
0.4nM或更好。另一方面，本发明提供了一种人源化抗FcRH5抗体，其中二
价形式的该抗体对FcRH5的亲和力(例如IgG形式的抗体对FcRH5的亲和力)
是0.44nM或更好。另一方面，本发明提供了一种人源化抗FcRH5抗体，其中
二价形式的该抗体对FcRH5的亲和力(例如IgG形式的抗体对FcRH5的亲和
力)是0.48nM或更好。另一方面，本发明提供了一种人源化抗FcRH5抗体，
其中二价形式的该抗体对FcRH5的亲和力(例如IgG形式的抗体对FcRH5的
亲和力)是0.5nM或更好。另一方面，本发明提供了一种人源化抗FcRH5抗
体，其中二价形式的该抗体对FcRH5的亲和力(例如IgG形式的抗体对FcRH5
的亲和力)是介于0.3nM和0.5nM之间。另一方面，本发明提供了一种人源
化抗FcRH5抗体，其中二价形式的该抗体对FcRH5的亲和力(例如IgG形式
的抗体对FcRH5的亲和力)介于0.32nM和0.48nM之间。另一方面，本发明
提供了一种人源化抗FcRH5抗体，其中二价形式的该抗体对FcRH5的亲和力
(例如IgG形式的抗体对FcRH5的亲和力)介于0.36nM和0.44nM之间。
另一方面，本发明提供了一种人源化抗FcRH5抗体，其中二价形式的该
抗体对FcRH5的亲和力(例如IgG形式的抗体对FcRH5的亲和力)是0.2nM。
在又一个方面，本发明提供了一种人源化抗FcRH5抗体，其中二价形式的该
抗体对FcRH5的亲和力(例如IgG形式的抗体对FcRH5的亲和力)是0.2nM+/-
0.02。
另一方面，本发明提供了一种人源化抗FcRH5抗体，其中二价形式的该
抗体对FcRH5的亲和力(例如IgG形式的抗体对FcRH5的亲和力)是0.1nM或
更好。另一方面，本发明提供了一种人源化抗FcRH5抗体，其中二价形式的
该抗体对FcRH5的亲和力(例如IgG形式的抗体对FcRH5的亲和力)是0.12nM
或更好。另一方面，本发明提供了一种人源化抗FcRH5抗体，其中二价形式
的该抗体对FcRH5的亲和力(例如IgG形式的抗体对FcRH5的亲和力)是0.14
nM或更好。另一方面，本发明提供了一种人源化抗FcRH5抗体，其中二价形
式的该抗体对FcRH5的亲和力(例如IgG形式的抗体对FcRH5的亲和力)是
0.16nM或更好。另一方面，本发明提供了一种人源化抗FcRH5抗体，其中二
价形式的该抗体对FcRH5的亲和力(例如IgG形式的抗体对FcRH5的亲和力)
是0.18nM或更好。另一方面，本发明提供了一种人源化抗FcRH5抗体，其中
二价形式的该抗体对FcRH5的亲和力(例如IgG形式的抗体对FcRH5的亲和
力)是0.2nM或更好。另一方面，本发明提供了一种人源化抗FcRH5抗体，
其中二价形式的该抗体对FcRH5的亲和力(例如IgG形式的抗体对FcRH5的
亲和力)是0.22nM或更好。另一方面，本发明提供了一种人源化抗FcRH5
抗体，其中二价形式的该抗体对FcRH5的亲和力(例如IgG形式的抗体对
FcRH5的亲和力)是0.24nM或更好。另一方面，本发明提供了一种人源化抗
FcRH5抗体，其中二价形式的该抗体对FcRH5的亲和力(例如IgG形式的抗
体对FcRH5的亲和力)是0.26nM或更好。另一方面，本发明提供了一种人源
化抗FcRH5抗体，其中二价形式的该抗体对FcRH5的亲和力(例如IgG形式
的抗体对FcRH5的亲和力)是0.28nM或更好。另一方面，本发明提供了一种
人源化抗FcRH5抗体，其中二价形式的该抗体对FcRH5的亲和力(例如IgG
形式的抗体对FcRH5的亲和力)是0.30nM或更好。另一方面，本发明提供了
一种人源化抗FcRH5抗体，其中二价形式的该抗体对FcRH5的亲和力(例如
IgG形式的抗体对FcRH5的亲和力)介于0.1nM和0.3nM之间。另一方面，本
发明提供了一种人源化抗FcRH5抗体，其中二价形式的该抗体对FcRH5的亲
和力(例如IgG形式的抗体对FcRH5的亲和力)介于0.12nM和0.28nM之间。
另一方面，本发明提供了一种人源化抗FcRH5抗体，其中二价形式的该抗体
对FcRH5的亲和力(例如IgG形式的抗体对FcRH5的亲和力)介于0.14nM和
0.26nM之间。另一方面，本发明提供了一种人源化抗FcRH5抗体，其中二价
形式的该抗体对FcRH5的亲和力(例如IgG形式的抗体对FcRH5的亲和力)
介于0.16nM和0.24nM之间。另一方面，本发明提供了一种人源化抗FcRH5
抗体，其中二价形式的该抗体对FcRH5的亲和力(例如IgG形式的抗体对
FcRH5的亲和力)介于0.18nM和0.22nM之间。
另一方面，本发明提供了一种人源化抗FcRH5抗体，其中二价形式的该
抗体对FcRH5的亲和力(例如IgG形式的抗体对FcRH5的亲和力)是0.5nM。
在又一个方面，本发明提供了一种人源化抗FcRH5抗体，其中二价形式的该
抗体对FcRH5的亲和力(例如IgG形式的抗体对FcRH5的亲和力)是0.5nM+/-
0.1。
另一方面，本发明提供了一种人源化抗FcRH5抗体，其中二价形式的该
抗体对FcRH5的亲和力(例如IgG形式的抗体对FcRH5的亲和力)是0.4nM或
更好。另一方面，本发明提供了一种人源化抗FcRH5抗体，其中二价形式的
该抗体对FcRH5的亲和力(例如IgG形式的抗体对FcRH5的亲和力)是0.5nM
或更好。另一方面，本发明提供了一种人源化抗FcRH5抗体，其中二价形式
的该抗体对FcRH5的亲和力(例如IgG形式的抗体对FcRH5的亲和力)是0.6
nM或更好。另一方面，本发明提供了一种人源化抗FcRH5抗体，其中二价形
式的该抗体对FcRH5的亲和力(例如IgG形式的抗体对FcRH5的亲和力)是
0.7nM或更好。另一方面，本发明提供了一种人源化抗FcRH5抗体，其中二
价形式的该抗体对FcRH5的亲和力(例如IgG形式的抗体对FcRH5的亲和力)
介于0.3nM和0.7nM之间。另一方面，本发明提供了一种人源化抗FcRH5抗
体，其中二价形式的该抗体对FcRH5的亲和力(例如IgG形式的抗体对FcRH5
的亲和力)介于0.4nM和0.6nM之间。另一方面，本发明提供了一种人源化
抗FcRH5抗体，其中二价形式的该抗体对FcRH5的亲和力(例如IgG形式的
抗体对FcRH5的亲和力)介于0.5nM和0.55nM之间。
一方面，所述鼠抗体对FcRH5的单价亲和力与包含图9(SEQ ID NO：18)
和图10(SEQ ID NO：20)可变域序列的Fab片段的结合亲和力基本上相同。
如本领域中所完善确立的，配体对其受体的结合亲和力可以使用多种测
定法之任一种来测定，并以多种定量数值表示。因而，在一个实施方案中，
结合亲和力以Kd值表示，并反映内在结合亲和力(例如具有最小化的亲合效
应)。一般且优选地，结合亲和力是在体外测量的，无论在无细胞的或细胞
相关的环境中。如本文中更为详细描述的，结合亲和力的倍数差异可根据人
源化抗体(例如以Fab形式)的单价结合亲和力数值和参照/比较抗体(例如
以Fab形式)(例如具有供体高变区序列的鼠抗体)的单价结合亲和力数值的
比率量化，其中所述结合亲和力数值是在相似测定条件下测定的。如此，在
一个实施方案中，结合亲和力的倍数差异是作为Fab形式人源化抗体和所述
参比/比较Fab抗体的Kd值比率测定。例如，在一个实施方案中，如果本发明
抗体(A)具有比参比抗体(M)的亲和力“低3倍”的亲和力，那么A的Kd值是3x，
M的Kd值是1x，而A的Kd对M的Kd的比率是3∶1。相反，在一个实施方案中，
如果本发明抗体(C)具有比参比抗体(R)的亲和力“高3倍”的亲和力，那么C的
Kd值是1x，R的Kd值是3x，而C的Kd对R的Kd的比率是1∶3。本领域已知的许
多测定法中的任一种，包括那些本文所描述的，都可用于获取结合亲和力测
量，包括例如Biacore、放射免疫测定法(RIA)和ELISA。
一方面，提供了一种与FcRH5结合的抗体，其中该抗体包含：
(a)至少一种、两种、三种、四种、五种或六种选自下组的HVR：
(i)HVR-L1，其包含序列KASQDVSTAVA(SEQ ID NO：26)
(ii)HVR-L2，其包含序列SASYRYT(SEQ ID NO：27)
(iii)HVR-L3，其包含序列QQHFSSPRT(SEQ ID NO：28)
(iv)HVR-H1，其包含序列GFTFSSYAVS(SEQ ID NO：35)
(v)HVR-H2，其包含序列ATISSGGSLTFYLDSVR(SEQ ID NO：36)和
(vi)HVR-H3，其包含序列PIPDYYALDY(SEQ ID NO：37)。
在一个实施方案中，本发明抗体的HVR-L1包含序列SEQ ID NO：26。在
一个实施方案中，本发明抗体的HVR-L2包含序列SEQ ID NO：27。在一个实
施方案中，本发明抗体的HVR-L3包含序列SEQ ID NO：28。在一个实施方案
中，本发明抗体的HVR-H1包含序列SEQ ID NO：35。在一个实施方案中，本
发明抗体的HVR-H2包含序列SEQ ID NO：36。在一个实施方案中，本发明抗
体的HVR-H3包含序列SEQ ID NO：37。在一个实施方案中，包含这些序列(以
本文所述方式组合的)的本发明抗体是人源化的或人的。
一方面，提供了一种与FcRH5结合的抗体，其中该抗体包含：
(a)至少一种、两种、三种、四种、五种或六种选自下组的HVR：
(i)HVR-L1，其包含序列KASQDVSTAVA(SEQ ID NO：26)
(ii)HVR-L2，其包含序列SASYRYT(SEQ ID NO：27)
(iii)HVR-L3，其包含序列QQHFSSPRT(SEQ ID NO：28)
(iv)HVR-H1，其包含序列GFTFSSYAVS(SEQ ID NO：35)
(v)HVR-H2，其包含序列ATISSGGSLTFYLDSVR(SEQ ID NO：36)和
(vi)HVR-H3，其包含序列PIPDYYALDY(SEQ ID NO：37)；和
(b)至少一种变异HVR，其中所述变异HVR序列包含SEQ ID NO：26、27、
28、35、36或37的所示序列中的至少一个残基的修饰。
在一个实施方案中，本发明抗体的HVR-L1包含序列SEQ ID NO：26。在
一个实施方案中，本发明抗体的HVR-L2包含序列SEQ ID NO：27。在一个实
施方案中，本发明抗体的HVR-L3包含序列SEQ ID NO：28。在一个实施方案
中，本发明抗体的HVR-H1包含序列SEQ ID NO：35。在一个实施方案中，本
发明抗体的HVR-H2包含序列SEQ ID NO：36。在一个实施方案中，本发明抗
体的HVR-H3包含序列SEQ ID NO：37。在一个实施方案中，包含这些序列(以
本文所述方式组合的)的本发明抗体是人源化的或人的。
一方面，本发明提供了包含一种、两种、三种、四种、五种或六种HVR
的抗体，其中每种HVR包含选自下组的序列、由选自下组的序列组成或基本
上由选自下组的序列组成：SEQ ID NO：26、27、28、35、36和37，且其中
SEQ ID NO：26对应于HVR-L1，SEQ ID NO：27对应于HVR-L2，SEQ ID NO：
28对应于HVR-L3，SEQ ID NO：35对应于HVR-H1，SEQ ID NO：36对应于
HVR-H2，而SEQ ID NO：37对应于HVR-H3。在一个实施方案中，本发明的
抗体包含HVR-L1、HVR-L2、HVR-L3、HVR-H1、HVR-H2和HVR-H3，其
中每个依次包含SEQ ID NO：26、27、28、35、36和37。
本发明抗体中的变异HVR可具有该HVR内一个或多个残基的修饰。
用于在宿主受试者中使用的治疗剂优选在所述受试者中针对所述药剂
引发很小的免疫原性应答至没有引发免疫原应答。在一个实施方案中，本发
明提供了这样的药剂。在一个实施方案中，本发明提供了一种人源化抗体，
其在宿主受试者中引发和/或预期引发与包含序列SEQ ID NO：18和20的抗体
相比实质性降低水平的人抗小鼠抗体应答(HAMA)。在另一个例子中，本发
明提供了一种人源化抗体，其引发和/或期望引发最低限度的人抗小鼠抗体应
答(HAMA)，或其不引发和/或期望不引发人抗小鼠抗体应答(HAMA)。在一
个例子中，本发明的抗体引发临床可接受水平的或临床可接受水平以下的抗
小鼠抗体应答。
本发明的人源化抗体可在其重链和/或轻链可变域中包含一种或多种人
和/或人共有非高变区(例如框架)序列。在一些实施方案中，所述人和/或
人共有非高变区序列内存在一处或多处别的修饰。在一个实施方案中，本发
明抗体的重链可变域包含人共有框架序列，其在一个实施方案中是亚组III
共有框架序列。在一个实施方案中，本发明的抗体包含修饰了至少一个氨基
酸位置的变异亚组III共有框架序列。在一个实施方案中，本发明抗体的轻链
可变域包含人共有框架序列，其在一个实施方案中是κI共有框架序列。在一
个实施方案中，本发明的抗体包含修饰了至少一个氨基酸位置的变异κI共有
框架序列。
正如本领域已知的，和正如下文更为详细描述的，描述抗体高变区的氨
基酸位置/边界可以有所变化，这取决于本领域中已知的背景和各种定义(如
下文所述的)。可变域(区)内的有些位置可以看作杂合高变位置，因为这
些位置在一组标准下可认为在高变区内，而在不同的一组标准下被认为在高
变区外。在延伸的高变区(如下文进一步定义的)中也能找到这些位置中的
一处或多处。本发明提供了在这些杂合高变位置中包含修饰的抗体。在一个
实施方案中，这些高变位置包括重链可变域中位置26-30、33-35B、47-49、
57-65、93、94和101-102中的一处或多处。在一个实施方案中，这些杂合高
变位置包括轻链可变域中位置24-29、35-36、46-49、56和97中的一处或多处。
在一个实施方案中，本发明的抗体包含修饰了一个或多个杂合高变位置的人
变异人亚组共有框架序列。
一方面，本发明的抗体包含重链可变域，该重链可变域包含在位置
26-30、33-35、48-49、58、60-63、93和101中的一处或多处有修饰的变异人
亚组III共有框架序列。
一方面，本发明的抗体包含轻链可变域，该轻链可变域包含在位置24、
27-29、56和97中的一处或多处有修饰的变异人κ亚组I共有框架序列。
一方面，本发明的抗体包含重链可变域，该重链可变域包含在位置
26-30、33-35、48-49、58、60-63、93和101中的1、2、3、4、5、6、7、8、
9、10、11、12、13、14、15、16处或所有处有修饰的变异人亚组III共有框
架序列。
一方面，本发明的抗体包含轻链可变域，该轻链可变域包含在位置24、
27-29、56和97中的1、2、3、4、5处或所有处有修饰的变异人κ亚组I共有框
架序列。
本发明的抗体可包含任何合适的人轻链框架序列或人共有轻链框架序
列，前提是该抗体展现期望的生物学特征(例如期望的结合亲和力)。在一
个实施方案中，本发明的抗体包含至少部分(或整个)人κ轻链框架序列。
在一个实施方案中，本发明的抗体包含至少部分(或整个)人κ亚组I框架共
有序列。
一方面，本发明的抗体包含重链和/或轻链可变域，该重链和/或轻链可
变域包含图9-11之一所示框架序列。
一方面，本发明抗体是偶联至细胞毒剂的人源化抗FcRH5抗体。一方面，
所述偶联至细胞毒剂的人源化抗FcRH5抗体在异种移植物中抑制肿瘤进展。
一方面，所述人源化抗体和嵌合抗体都是单价的。在一个实施方案中，
所述人源化和嵌合抗体都包含单个连接至Fc区的Fab区。在一个实施方案中，
所述参比嵌合抗体包含连接至人Fc区的图2(SEQ ID NO：11)和图4(SEQ ID
NO：13)所示可变域序列。在一个实施方案中，所述人Fc区是IgG(例如IgG1、
2、3或4)的。
一方面，本发明提供了一种抗体，其包含重链可变域，该重链可变域包
含图9-11所示HVR1-HC、HVR2-HC和/或HVR3-HC序列。在一个实施方案中，
所述可变域包含图9-11所示FR1-HC、FR2-HC、FR3-HC和/或FR4-HC序列。
在一个实施方案中，所述抗体包含图15所示CH1和/或Fc序列。在一个实施方
案中，本发明的抗体包含重链可变域，该重链可变域包含HVR1-HC、
HVR2-HC和/或HVR3-HC序列(图10-11)，及FR1-HC、FR2-HC、FR3-HC和/
或FR4-HC序列(图10-11)。在一个实施方案中，本发明的抗体包含重链可变
域，该重链可变域包含HVR1-HC、HVR2-HC和/或HVR3-HC序列(图10-11)，
及图11所示CH1和/或Fc序列。在一个实施方案中，本发明的抗体包含重链可
变域，该重链可变域包含HVR1-HC、HVR2-HC和/或HVR3-HC序列(图10-11)，
及FR1-HC、FR2-HC、FR3-HC和/或FR4-HC序列(图10-11)，及CH1和/或Fc(图
11)。
一方面，本发明提供了一种抗体，其包含轻链可变域，该轻链可变域包
含图19和11所示HVR1-LC、HVR2-LC和/或HVR3-LC序列。在一个实施方案
中，所述可变域包含图9和11所示FR1-LC、FR2-LC、FR3-LC和/或FR4-LC序
列。在一个实施方案中，所述抗体包含图11所示CL1序列。在一个实施方案
中，本发明的抗体包含轻链可变域，该轻链可变域包含HVR1-LC、HVR2-LC
和/或HVR3-LC序列，及图9和11所示FR1-LC、FR2-LC、FR3-LC和/或FR4-LC
序列。在一个实施方案中，本发明的抗体包含轻链可变域，该轻链可变域包
含HVR1-LC、HVR2-LC和/或HVR3-LC序列，及图9和11所示CL1序列。在一
个实施方案中，本发明的抗体包含轻链可变域，该轻链可变域包含HVR1-LC、
HVR2-LC和/或HVR3-LC序列，及图9和11所示FR1-LC、FR2-LC、FR3-LC
和/或FR4-LC序列，及图11所示CL1序列。
在一个方面，本发明的抗体包括半胱氨酸改造抗体，其中用游离半胱氨
酸氨基酸替代亲本抗体的一个或多个氨基酸，正如WO2006/034488；US
2007/0092940中所披露的(完整收入本文作为参考)。可以对任何形式的抗
FcRH5抗体进行如此改造，即突变。例如，可以改造亲本Fab抗体片段以形
成半胱氨酸改造的Fab，在本文中称为“ThioFab”。类似地，可以改造亲本单
克隆抗体以形成“ThioMab”。应当注意，单位点突变在ThioFab中产生单个改
造的半胱氨酸残基，而单位点突变在ThioMab中产生两个改造的半胱氨酸残
基，由于IgG抗体的二聚体特性。本发明的半胱氨酸改造抗FcRH5抗体包括
单克隆抗体，人源化的或嵌合的单克隆抗体，及抗体的抗原结合片段、融合
多肽和类似物，其优先结合细胞相关FcRH5多肽(cell-associated FcRH5
polypeptide)。或者，半胱氨酸改造抗体可以包括下述抗体，其在抗体或Fab
中在本文中所公开的位置包含半胱氨酸，该抗体由抗体的序列设计和/或选择
产生，而不必改变亲本抗体，诸如通过噬菌体展示抗体设计和选择或经由轻
链和/或重链框架序列和恒定区的重新设计。半胱氨酸改造抗体包含一个或多
个游离半胱氨酸氨基酸，其具有范围为0.6至1.0；0.7至1.0；或0.8至1.0的硫
醇反应性值(thiol reactivity value)。游离的半胱氨酸氨基酸指已经被改造入亲
本抗体且不是二硫桥的一部分的半胱氨酸残基。半胱氨酸改造抗体可用于在
改造的半胱氨酸位点连接细胞毒性化合物和/或成像化合物，所述连接例如经
由马来酰亚胺或卤代乙酰基进行。Cys残基的硫醇官能度对马来酰亚胺基团
的亲核反应性比蛋白质中任何其它氨基酸官能度(诸如赖氨酸残基的氨基或
N末端氨基)高大约1000倍。碘代乙酰基和马来酰亚胺试剂中的硫醇特异性
官能度可以与胺基团起反应，但需要较高的pH(＞9.0)和较长的反应时间
(Garman，1997，Non-Radioactive Labelling：A Practical Approach，Academic
Press，London)。
在一个方面，本发明的半胱氨酸改造抗FcRH5抗体包含合适位置的改造
的半胱氨酸，其中该位置是轻链中依照Kabat等的编号(参见Kabat等(1991)
Sequences of Proteins of Immunological Interest，第5版，Public Health Service，
National Institutes of Health，Bethesda，MD)和重链(包括Fc区)中依照EU编
号方式(参见Kabat等(1991)，见上文)的编号。
在一个方面，本发明包括包含一个或多个游离的半胱氨酸氨基酸的半胱
氨酸改造抗FcRH5抗体，其中该半胱氨酸改造抗FcRH5抗体结合FcRH5多肽，
且是通过包括用半胱氨酸替代亲本抗FcRH5抗体的一个或多个氨基酸残基
的方法来制备的，其中该亲本抗体包含至少一种本文所述HVR序列。
在某个方面中，本发明涉及一种半胱氨酸改造抗FcRH5抗体，其包含与
具有如本文中所公开的全长氨基酸序列的半胱氨酸改造抗体具有至少约
80％氨基酸序列同一性，或者至少约81％、82％、83％、84％、85％、86％、
87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、
99％或100％氨基酸序列同一性的氨基酸序列；或缺乏如本文中所公开的信号
肽的半胱氨酸改造抗体。
在又一个方面中，本发明涉及一种分离的半胱氨酸改造抗FcRH5抗体，
其包含由如下核苷酸序列所编码的氨基酸序列，该核苷酸序列能与编码下列
各项的DNA分子的互补链发生杂交：(a)半胱氨酸改造抗体，其具有如本文中
所公开的全长氨基酸序列，(b)半胱氨酸改造抗体氨基酸序列，其缺乏如本文
中所公开的信号肽，(c)跨膜的半胱氨酸改造抗体蛋白的胞外结构域，其带有
或不带有如本文中所公开的信号肽，(d)由任何在本文中所公开的核酸序列所
编码的氨基酸序列，或(e)如本文中所公开的全长的半胱氨酸改造抗体氨基酸
序列的任何其它明确限定的片段。
在一个具体的方面中，本发明提供了一种分离的半胱氨酸改造抗FcRH5
抗体，其不带有N末端信号序列和/或不带有起始甲硫氨酸，并且是由编码如
本文中所描述的氨基酸序列的核苷酸序列所编码的。其制备方法在本文中也
有描述，其中那些方法包括在适于表达半胱氨酸改造抗体的条件下培养包含
含有合适的编码核酸分子的载体的宿主细胞和从该细胞培养物中回收半胱
氨酸改造抗体。
本发明的另一个方面提供了一种分离的半胱氨酸改造抗FcRH5抗体，其
或是跨膜结构域删除的或是跨膜结构域失活的。其制备方法在本文中也有描
述，其中那些方法包括在适于表达半胱氨酸改造抗体的条件下培养包含含有
合适的编码核酸分子的载体的宿主细胞和从该细胞培养物中回收半胱氨酸
改造抗体。
在其它方面，本发明提供了分离的抗FcRH5嵌合半胱氨酸改造抗体，其
包含与异源(非FcRH5)多肽融合的任何本文所述半胱氨酸改造抗体。此类
嵌合分子的例子包括与异源多肽(诸如例如表位标签序列或免疫球蛋白Fc
区)融合的任何本文所述半胱氨酸改造抗体。
半胱氨酸改造抗FcRH5抗体可以是单克隆抗体、抗体片段、嵌合抗体、
人源化抗体、单链抗体或竞争性抑制抗FcRH5多肽抗体与其相应抗原表位结
合的抗体。本发明的抗体可以任选地偶联至生长抑制剂或细胞毒剂，诸如毒
素，包括例如auristatin、美登木素生物碱、多拉司他汀衍生物或加利车霉素、
抗生素、放射性同位素、溶核酶等。本发明的抗体可以任选地在CHO细胞或
细菌细胞中产生，且优选地抑制它们所结合的细胞的生长或增殖或诱导与它
们所结合的细胞的死亡。为了诊断目的，本发明的抗体可以带上可检测标记
物、附着至固体支持物、等等。
在本发明的其它方面，本发明提供了包含编码任何本文所述抗FcRH5抗
体和抗FcRH5半胱氨酸改造抗体的DNA的载体。还提供了包含任何此类载体
的宿主细胞。举例而言，宿主细胞可以是CHO细胞、大肠杆菌细胞或酵母细
胞。用于产生任何本文所述多肽的方法有进一步的提供，且包括在适于表达
期望多肽的条件下培养宿主细胞和从该细胞培养物中回收期望多肽。
半胱氨酸改造抗体可用于治疗癌症，并包括对细胞表面和跨膜受体及肿
瘤相关抗原(TAA)特异性的抗体。此类抗体可以以裸抗体(未偶联至药物或
标记物模块)或抗体-药物偶联物(ADC)的形式使用。本发明的半胱氨酸改造
抗体可以位点特异性地且高效地偶联硫醇反应性试剂。该硫醇反应性试剂可
以是多功能接头试剂、捕获标记物试剂、荧光团试剂或药物-接头中间体。
半胱氨酸改造抗体可以用可检测标记物标记，在固相支持物上固定化和/或与
药物模块偶联。可以将硫醇反应性普及至任何抗体，其中可以用反应性半胱
氨酸氨基酸进行氨基酸替代，这发生在轻链中选自下列氨基酸范围的范围
内：L10-L20，L105-L115，L109-L119，L116-L126，L122-L132，L163-L173，
L200-L210，及重链中选自下列氨基酸范围的范围内：H1-H10，H18-H28，
H79-H89，H107-H117，H109-H119，H111-H121，及Fc区中选自下组的范围
内：H270-H280，H366-H376，H391-401，其中氨基酸位置的编号方式开始
于Kabat编号系统(Kabat等(1991)Sequences of Proteins of Immunological
Interest，第5版，Public Health Service，National Institutes of Health，Bethesda，
MD)的第1位并在其后顺序延续，正如WO2006034488；US 2007/0092940中
所披露的。还可以将硫醇反应性普及至抗体的某些结构域，诸如轻链恒定域
(CL)和重链恒定域(CH1、CH2和CH3)。可以进行导致0.6和更高的硫醇反应
性值的半胱氨酸替换，这分别发生在完整抗体：IgA、IgD、IgE、IgG和IgM
(包括IgG亚类：IgG1、IgG2、IgG3、IgG4，IgA1和IgA2)的重链恒定域α、
δ、ε、γ和μ中。此类抗体及其用途在WO 2006/034488；US 2007/0092940中
有披露。
本发明的半胱氨酸改造抗体优选地保留它们野生型、亲本抗体对应物的
抗原结合能力。如此，半胱氨酸改造抗体能够结合(优选特异性地)抗原。
此类抗原包括例如肿瘤相关抗原(TAA)、细胞表面受体蛋白和其它细胞表面
分子、跨膜蛋白、信号传导蛋白、细胞存活调节因子、细胞增殖调节因子、
与组织发育或分化有关的(例如已知或怀疑在功能上促进的)分子、淋巴因
子、细胞因子、涉及细胞周期调控的分子、涉及脉管发生(vasculogenesis)的
分子和与血管发生(angiogenesis)有关的(例如已知或怀疑在功能上促进的)
分子。肿瘤相关抗原可以是簇分化因子(cluster differentiation factor)(即CD
蛋白，包括但不限于FcRH5)。本发明的半胱氨酸改造抗FcRH5抗体保留它们
亲本抗FcRH5抗体对应物的抗原结合能力。如此，本发明的半胱氨酸改造抗
FcRH5抗体能够结合(优选特异性地)FcRH5抗原，包括人抗FcRH5同种型β
和/或α，包括此类抗原在细胞(包括但不限于B细胞)表面上表达时。
在一个方面，本发明的抗体可以与任何标记物模块偶联，所述标记物模
块可以通过反应性模块、活化的模块或反应性半胱氨酸硫醇基团共价连接至
抗体(Singh等(2002)Anal.Biochem.304：147-15；Harlow E.和Lane，D.(1999)
Using Antibodies：A Laboratory Manual，Cold Springs Harbor Laboratory Press，
Cold Spring Harbor，NY；Lundblad R.L.(1991)Chemical Reagents for Protein
Modification，第2版，CRC Press，Boca Raton，FL)。所连接的标记物可以发挥
下列功能：(i)提供可检测信号；(ii)与第二标记物相互作用以修饰由第一或第
二标记物所提供的可检测信号，例如以给出FRET(荧光共振能量转移)；(iii)
稳定与抗原或配体的相互作用或提高与抗原或配体结合的亲和力；(iv)通过
电荷、疏水性、形状或其它物理参数来影响迁移率，例如电泳迁移率或细胞
通透性；或(v)提供捕获模块以调控配体亲和力、抗体/抗原结合或离子络合。
经过标记的半胱氨酸改造抗体可以用于诊断测定法，例如用于在特定细
胞、组织或血清中检测感兴趣抗原的表达。为了诊断应用，典型地用可检测
模块标记抗体。许多标记物是可获得的，一般可将它们分组成下列种类：
放射性同位素(放射性核素)，诸如3H、11C、14C、18F、32P、35S、64Cu、
68Ga、86Y、99Tc、111In、123I、124I、125I、131I、133Xe、177Lu、211At或213Bi。放
射性同位素标记的抗体可用于受体靶向成像实验。使用Current Protocols in
Immunology，卷1和2，Coligen等编，Wiley-Interscience，New York，NY，Pubs.
(1991)中记载的技术，可以用结合、螯合或以其它方式络合放射性同位素金
属的配体试剂来标记抗体，其中该试剂与该抗体的改造的半胱氨酸硫醇具有
反应性。可以络合金属离子的螯合配体包括DOTA、DOTP、DOTMA、DTPA
和TETA(Macrocyclics，Dallas，TX)。放射性核素可以通过与本发明的抗体-药
物偶联物络合来靶向(Wu等(2005)Nature Biotechnology 23(9)：1137-1146)。
接头试剂，诸如DOTA-马来酰亚胺(4-马来酰亚氨基丁酰氨基苄基
-DOTA)(4-maleimidobutyramidobenzyl-DOTA)可以通过氨基苄基-DOTA与用
氯甲酸异丙酯(isopropylchloroformate)(Aldrich)活化的4-马来酰亚氨基丁酸
(Fluka)反应来制备，其遵循Axworthy等(2000)Proc.Natl.Acad.Sci.USA
97(4)：1802-1807的规程。DOTA-马来酰亚胺试剂与半胱氨酸改造抗体的游离
半胱氨酸氨基酸起反应，并在该抗体上提供金属络合配体(Lewis等(1998)
Bioconj.Chem.9：72-86)。螯合接头标记试剂，诸如DOTA-NHS(1，4，7，10-四
氮杂环十二烷-1，4，7，10-四乙酸单(N-羟基琥珀酰亚胺酯))(1，4，7，10-tetra
azacyclododecane-1，4，7，10-tetraacetic acid mono(N-hydroxysuccinimideester))
是商品化的(Macrocyclics，Dallas，TX)。用放射性核素标记的抗体进行的受体
靶物成像可以通过检测和定量抗体在肿瘤组织中的逐渐积累来提供途径活
化的标志(Albert等(1998)Bioorg.Med.Chem.Lett.8：1207-1210)。在溶酶体
降解后，所偶联的放射性金属可以保留在细胞内。
适合作为用于成像实验的抗体标记物的金属-螯合剂复合体披露于：US
5,342,606；US 5,428,155；US 5,316,757；US 5,480,990；US 5,462,725；US
5,428,139；US 5,385,893；US 5,739,294；US 5,750,660；US 5,834,456；
Hnatowich等(1983)J.Immunol.Methods 65：147-157；Meares等(1984)Anal.
Biochem.142：68-78；Mirzadeh等(1990)Bioconjugate Chem.1：59-65；Meares
等(1990)J.Cancer 1990，Suppl.10：21-26；Izard等(1992)Bioconjugate Chem.
3：346-350；Nikula等(1995)Nucl.Med.Biol.22：387-90；Camera等(1993)
Nucl.Med.Biol.20：955-62；Kukis等(1998)J.Nucl.Med.39：2105-2110；Verel
等(2003)J.Nucl.Med.44：1663-1670；Camera等(1994)J.Nucl.Med.
21：640-646；Ruegg等(1990)Cancer Res.50：4221-4226；Verel等(2003)J.Nucl.
Med.44：1663-1670；Lee等(2001)Cancer Res.61：4474-4482；Mitchell等
(2003)J.Nucl.Med.44：1105-1112；Kobayashi等(1999)Bioconjugate Chem.
10：103-111；Miederer等(2004)J.Nucl.Med.45：129-137；DeNardo等(1998)
Clinical Cancer Research 4：2483-90；Blend等(2003)Cancer Biotherapy &
Radiopharmaceuticals 18：355-363；Nikula等(1999)J.Nucl.Med.40：166-76；
Kobayashi等(1998)J.Nucl.Med.39：829-36；Mardirossian等(1993)Nucl.
Med.Biol.20：65-74；Roselli等(1999)Cancer Biotherapy &
Radiopharmaceuticals，14：209-20。
荧光标记物，诸如稀土螯合物(铕螯合物)；荧光素类，包括FITC、5-
羧基荧光素、6-羧基荧光素；罗丹明类，包括TAMRA；丹酰(dansyl)；丽丝
胺(Lissamine)；花青(cyanines)；藻红蛋白；德克萨斯红(Texas Red)；和它们
的类似物。使用例如Current Protocols in Immunology(见上文)中披露的技
术，可以将荧光标记物偶联至抗体。荧光染料和荧光标记物试剂包括那些可
购自Invitrogen/Molecular Probes(Eugene，OR)和Pierce Biotechnology，Inc.
(Rockford，IL)的。
各种酶-底物标记物是可获得的或有披露的(US 4275149)。该酶一般催化
显色底物的化学改变，其可以使用各种技术来测量。例如，该酶可以催化底
物的颜色变化，其可以用分光光度法来测量。或者，该酶可以改变底物的荧
光或化学发光。用于定量荧光变化的技术在上文有描述。化学发光底物通过
化学反应而成为电子激发的，然后可以发射可测量的光(例如使用化学发光
计)或给荧光受体贡献能量。酶标记物的例子包括萤光素酶(例如萤火虫萤
光素酶和细菌萤光素酶；US 4,737,456)、萤光素、2，3-二氢酞嗪二酮、苹果
酸脱氢酶、脲酶、过氧化物酶诸如辣根过氧化物酶(HRP)、碱性磷酸酶(AP)、
β-半乳糖苷酶、葡糖淀粉酶、溶菌酶、糖氧化酶(例如葡萄糖氧化酶、半乳
糖氧化酶和葡萄糖-6-磷酸脱氢酶)、杂环氧化酶(诸如尿酸酶和黄嘌呤氧化
酶)、乳过氧化物酶、微过氧化物酶等。用于将酶偶联至抗体的技术披露于：
O′Sullivan等(1981)“Methods for the Preparation of Enzyme-Antibody
Conjugates for use in Enzyme Immunoassay”，于Methods in Enzym.(J.
Langone和H.Van Vunakis编)，Academic Press，New York，73：147-166。
酶-底物组合的例子包括例如：
(i)辣根过氧化物酶(HRP)与作为底物的过氧化氢，其中该过氧化氢氧化染料
前体(例如邻苯二胺(OPD)或3，3′，5，5′-四甲基联苯胺盐酸盐(TMB))；
(ii)碱性磷酸酶(AP)与作为显色底物的对硝基苯基磷酸酯；和
(iii)β-D-半乳糖苷酶(β-D-Gal)与显色底物(例如对硝基苯基-β-D-半乳糖苷)
或荧光底物4-甲基伞形基-β-D-半乳糖苷)。
许多其它的酶-底物组合对本领域技术人员而言是可获得的。一般综述
参见US 4275149和US 4318980。
标记物可以间接地与氨基酸侧链、活化的氨基酸侧链、半胱氨酸改造抗
体等偶联。例如，抗体可以与生物素偶联，并且任何上述三大类标记物可以
与亲合素或链霉亲合素偶联，反之亦然。生物素选择性结合链霉亲合素，如
此，标记物可以以该间接方式与抗体偶联。或者，为了实现标记物与多肽变
体的间接偶联，多肽变体与小的半抗原(例如地高辛)偶联，并且上述不同
类型的标记物之一与抗半抗原多肽变体(例如抗地高辛抗体)偶联。如此，
可以实现标记物与多肽变体的间接偶联(Hermanson，G.(1996)Bioconjugate
Techniques Academic Press，San Diego)。
可以在任何已知的测定方法中使用本发明的抗体，诸如ELISA、竞争性
结合测定法、直接和间接三明治式(或夹心式)测定法和免疫沉淀测定法(Zola，
(1987)Monoclonal Antibodies：A Manual of Techniques，pp.147-158，CRC Press，
Inc.)。
检测标记物可用于对结合或识别事件进行定位、显现和定量。经过标记
的本发明抗体可检测细胞表面受体。经过可检测标记的抗体的另一种用途是
基于珠子的免疫捕获方法，其包括使珠子与荧光标记的抗体偶联，和在配体
结合后检测荧光信号。类似的结合检测方法学利用表面等离振子共振(SPR)
效应来测量和检测抗体-抗原相互作用。
检测标记物(诸如荧光染料和化学发光染料)(Briggs等(1997)″Synthesis
of Functionalised Fluorescent Dyes and Their Coupling to Amines and Amino
Acids″，J.Chem.Soc.，Perkin-Trans.1：1051-1058)提供可检测的信号，并且一
般可用于标记抗体，优选具有下列性质：(i)经过标记的抗体应产生很高的信
号但低的背景，使得在无细胞测定法和基于细胞的测定法中都能灵敏地检测
出少量的抗体；和(ii)经过标记的抗体应是光稳定的，使得可以观察、监测和
记录到荧光信号，但没有显著的光漂白。对于涉及经标记抗体对膜或细胞表
面(尤其是活细胞)的细胞表面结合的应用，标记物优选地(iii)具有优秀的
水溶性以实现有效的偶联物浓度和检测灵敏度，和(iv)对活细胞是无毒性的，
免得破坏细胞的正常代谢过程或引起过早的细胞死亡。
可以在用活细胞或珠子自动实施混合和读取(mix-and-read)、非放射性测
定法的系统(![]()
8100 HTS System，Applied Biosystems，Foster City，Calif.)
上进行细胞荧光强度的直接定量和荧光标记事件(例如肽-染料偶联物的细
胞表面结合)的点查(Miraglia，″Homogeneous cell-and bead-based assays for
high throughput screening using fluorometric microvolume assay technology″，
(1999)J.of Biomolecular Screening 4：193-204)。经过标记的抗体的用途还包括
细胞表面受体结合测定法、免疫捕获测定法、荧光连接的免疫吸附测定法
(FLISA)、胱天蛋白酶切割(Zheng，″Caspase-3 controls both cytoplasmic and
nuclear events associated with Fas-mediated apoptosis in vivo″，(1998)Proc.Natl.
Acad.Sci.USA 95：618-23；US 6,372,907)、凋亡(Vermes，″A novel assay for
apoptosis.Flow cytometric detection of phosphatidylserine expression on early
apoptotic cells using fluorescein labelled Annexin V″(1995)J.Immunol.
Methods 184：39-51)和细胞毒性测定法。可以使用荧光计量微体积测定法
(fluorometric microvolume assay)技术鉴定由靶向细胞表面的分子所引起的上
调或下调(Swartzman，″A homogeneous and multiplexed immunoassay for
high-throughput screening using fluorometric microvolume assay technology″，
(1999)Anal.Biochem.271：143-51)。
经过标记的本发明抗体可通过生物医学和分子成像的各种方法和技术
用作成像生物标志物和探针，诸如：(i)MRI(磁共振成像)；(ii)microCT(计
算机化断层成像)；(iii)SPECT(单光子发射计算机化断层成像)；(iv)PET
(正电子发射断层成像)Chen等(2004)Bioconjugate Chem.15：41-49；(v)生
物发光；(vi)荧光；和(vii)超声。免疫闪烁成像是一种成像规程，其中给动物
或人患者施用用放射性物质标记的抗体，并拍摄身体中该抗体定位的部位的
照片(US 6528624)。可以将成像生物标志物作为正常生物学过程、致病过程
或对治疗性干涉的药理学应答的指示客观地测量并评估。生物标志物可以是
数种类型：类型0是疾病的天然历史标志物，并与已知临床指标纵向相关，
例如类风湿性关节炎中滑膜炎症的MRI评估；类型I标志物捕获干预的依照作
用机制的效应，即使该机制可能与临床结果无关；类型II标志物发挥代用终
点(surrogate endpoint)的功能，其中该生物标志物的改变或来自该生物标志物
的信号预示临床益处以“证实”靶向应答，诸如通过CT在类风湿性关节炎中测
量到的骨侵蚀。如此，成像生物标志物可以提供关于下列各项的药效学(PD)
治疗信息：(i)靶蛋白的表达，(ii)治疗剂对靶蛋白的结合，即选择性，和(iii)
清除和半衰期药动学数据。体内成像生物标志物相对于基于实验室的生物标
志物的优点包括：非侵入性处理，可定量，全身评估，重复定量给药和评估
(即多个时间点)，及从临床前结果(小动物)至临床结果(人)的潜在可
转换效应。对于一些应用，生物成像代替或最少化临床前研究中动物实验的
数目。
肽标记方法是公知的。参见Haugland，2003，Molecular Probes Handbook
of Fluorescent Probes and Research Chemicals，Molecular Probes，Inc.；Brinkley，
1992，Bioconjugate Chem.3:2；Garman，(1997)Non-Radioactive Labelling：A
Practical Approach，Academic Press，London；Means(1990)Bioconjugate Chem.
1:2；Glazer等(1975)Chemical Modification of Proteins.Laboratory Techniques
in Biochemistry and Molecular Biology(T.S.Work和E.Work编)American
Elsevier Publishing Co.，New York；Lundblad，R.L.和Noyes，C.M.(1984)
Chemical Reagents for Protein Modification，卷I和II，CRC Press，New York；
Pfleiderer，G.(1985)“Chemical Modification of Proteins”，Modern Methods in
Protein Chemistry，H.Tschesche编，Walter DeGryter，Berlin和New York；及
Wong(1991)Chemistry of Protein Conjugation and Cross-linking，CRC Press，
Boca Raton，Fla.)；De Leon-Rodriguez等(2004)Chem.Eur.J.10：1149-1155；
Lewis等(2001)Bioconjugate Chem.12：320-324；Li等(2002)Bioconjugate
Chem.13：110-115；Mier等(2005)Bioconjugate Chem.16：240-237。
用两种模块即荧光报道物和淬灭剂标记的肽和蛋白质在足够接近时经
历荧光共振能量转移(FRET)。报道物基团典型地是荧光染料，其由某个波长
的光激发并转移能量给受体或淬灭剂基团，这具有合适的斯托克司频移
(Stokes shift)以在最高亮度发光。荧光染料包括具有扩展芳香性(extended
aromaticity)的分子，诸如荧光素和罗丹明及其衍生物。荧光报道物可以由完
整肽中的淬灭剂模块部分地或显著地淬灭。在肽酶或蛋白酶切割肽后，可以
测量可检测的荧光增加(Knight，C.(1995)“Fluorimetric Assays of Proteolytic
Enzymes”，Methods in Enzymology，Academic Press，248：18-34)。
经过标记的本发明抗体还可以用作亲和纯化剂。在该方法中，使用本领
域公知的方法将经过标记的抗体固定化在固相(诸如Sephadex树脂或滤纸)
上。使固定化的抗体与含有待纯化抗原的样品接触，其后用合适的溶剂清洗
支持物，这会清除该样品中除待纯化抗原(其结合至固定化的多肽变体)以
外的基本上所有材料。最后，用另一种合适的溶剂(诸如甘氨酸缓冲液，pH
5.0)清洗支持物，这会从多肽变体中释放抗原。
标记试剂典型地具有反应性官能度，其可以(i)与半胱氨酸改造抗体的半
胱氨酸硫醇直接反应以形成经过标记的抗体，(ii)与接头试剂反应以形成接头
-标记物中间体，或(iii)与接头抗体反应以形成经过标记的抗体。标记试剂的
反应性官能度包括：马来酰亚胺、卤乙酰基、碘乙酰胺琥珀酰亚氨基酯(例
如NHS，N-羟基琥珀酰亚胺)、异硫氰酸盐/酯、磺酰氯、2，6-二氯三嗪基、
五氟苯基酯和亚磷酰胺，尽管还可以使用其它官能团。
例示性的反应性官能团是可检测标记物(例如生物素或荧光染料)的羧
基取代基的N-羟基琥珀酰亚氨基酯(NHS)。可以预制、分离、纯化和/或表征
该标记物的NHS酯，或者可以使其原位形成并与抗体的亲核基团起反应。典
型地，将羧基形式的标记物通过与碳二亚胺试剂(例如二环己基碳二亚胺、
二异丙基碳二亚胺)或脲阳离子试剂(例如TSTU(O-(N-琥珀酰亚氨
基)-N，N，N’，N’-四甲基脲四氟硼酸盐/酯)、HBTU((O-苯并三唑-1-
基)-N，N，N’，N’-四甲基脲六氟磷酸盐/酯)或HATU((O-(7-氮杂苯并三唑-1-
基)-N，N，N’，N’-四甲基脲六氟磷酸盐/酯)、活化剂(诸如1-羟基苯并三唑
(HOBt))和N-羟基琥珀酰亚胺的一些组合起反应而活化以给出该标记物的
NHS酯。在一些情况中，可以通过标记物的原位活化和与抗体反应来偶联标
记物和抗体以在一个步骤中形成标记物-抗体偶联物。其它活化和偶联试剂
包括TBTU(2-(1H-苯并三唑-1-基)-1-1，3，3-四甲基脲六氟磷酸盐/酯)、TFFH
(N，N’，N”，N”’-四甲基脲2-氟-六氟磷酸盐/酯)、PyBOP(苯并三唑-1-基-氧-三吡
咯烷膦六氟磷酸盐/酯)、EEDQ(2-乙氧基-1-乙氧羰基-1，2-二氢-喹啉)、DCC
(二环己基碳二亚胺)、DIPCDI(二异丙基碳二亚胺)、MSNT(1-(均三甲基苯-2-
磺酰)-3-硝基-1H-1，2，4-三唑和芳基磺酰卤化物(例如三异丙基苯磺酰氯)。
本发明的清蛋白结合肽-Fab化合物：
在一个方面，本发明的抗体融合至清蛋白结合蛋白。血浆蛋白结合可以
是改善短命分子的药动学性质的有效手段。清蛋白是血浆中最丰富的蛋白
质。血清清蛋白结合肽(ABP)可以改变所融合的活性结构域蛋白质的药效学，
包括改变组织摄取、渗透和扩散。可以通过合适的血清清蛋白结合肽序列的
具体选择来调控这些药效学参数(US 20040001827)。通过噬菌体展示筛选鉴
定了一系列清蛋白结合肽(Dennis等(2002)“Albumin Binding As A General
Strategy For Improving The Pharmacokinetics Of Proteins”J Biol Chem.
277：35035-35043；WO 01/45746)。本发明的化合物包括由下列文献所教导的
ABP序列：(i)Dennis等(2002)J Biol Chem.277：35035-35043表III和IV，第
35038页；(ii)US 20040001827段[0076]SEQ ID NO：9-22；和(iii)WO
01/45746，第12-13页，都收入本文作为参考。通过以1∶1化学计量比(1 ABP
/1 Fab)将清蛋白结合肽融合至Fab重链的C末端来改造清蛋白结合
(ABP)-Fab。显示了这些ABP-Fab与清蛋白的结合使抗体在家兔和小鼠中的半
衰期增加了25倍多。因此，可以将上述反应性Cys残基导入这些ABP-Fab，
并用于与细胞毒性药物的位点特异性偶联，接着是体内动物研究。
例示性的清蛋白结合肽序列包括但不限于SEQ ID NO：53-57中列出的氨
基酸序列：
CDKTHTGGGSQRLMEDICLPRWGCLWEDDF SEQ ID NO：53
QRLMEDICLPRWGCLWEDDF SEQ ID NO：54
QRLIEDICLPRWGCLWEDDF SEQ ID NO：55
RLIEDICLPRWGCLWEDD SEQ ID NO：56
DICLPRWGCLW SEQ ID NO：57
抗体-药物偶联物
在另一个方面，本发明提供了包含偶联有细胞毒剂的抗体的免疫偶联物
或抗体-药物偶联物(ADC)，所述细胞毒剂诸如化疗剂、药物、生长抑制剂、
毒素(例如细菌、真菌、植物或动物起源的酶活性毒素或其片段)或放射性
同位素(即放射偶联物)。在另一个方面，本发明进一步提供了使用免疫偶
联物的方法。在一个方面，免疫偶联物包含共价附着至细胞毒剂或可检测试
剂的任何上述抗FcRH5抗体。
一方面，本发明的FcRH5抗体结合FcRH5上另一种FcRH5抗体所结合的
同一表位。
另一方面，本发明的FcRH5抗体结合FcRH5上与另一种FcRH5抗体所结
合的表位不同的表位。
一方面，本发明抗体特异性结合第一动物物种的FcRH5，且不特异性结
合第二动物物种的FcRH5。在一个实施方案中，所述第一物种是人和/或灵长
类(例如猕猴)，而所述第二动物物种是鼠(例如小鼠)和/或犬科动物。在
一个实施方案中，所述第一动物物种是人。在一个实施方案中，所述第一动
物物种是灵长类，例如猕猴。在一个实施方案中，所述第二动物物种是鼠，
例如小鼠。在一个实施方案中，所述第二动物物种是犬。
一方面，本发明提供了包含一种或多种本发明抗体和载体的组合物。在
一个实施方案中，所述载体是药学可接受的。
一方面，本发明提供了编码本发明FcRH5抗体的核酸。
一方面，本发明提供了包含本发明核酸的载体。
一方面，本发明提供了包含本发明核酸或载体的宿主细胞。载体可以是
任何类型的，例如重组载体，正如表达载体。可以使用多种宿主细胞之任一
种。在一个实施方案中，宿主细胞是原核细胞，例如大肠杆菌(E.coli)。在一
个实施方案中，宿主细胞是真核细胞，例如哺乳动物细胞，诸如中国仓鼠卵
巢(CHO)细胞。
一方面，本发明提供了用于制备本发明抗体的方法。例如，本发明提供
了制备FcRH5抗体(如本文中所定义的，包括其全长和片段)的方法，所述
方法包括在合适的宿主细胞中表达编码所述抗体(或其片段)的本发明载体
并回收所述抗体。
一方面，本发明提供了制品，其包括容器；和装在该容器内的组合物，
其中所述组合物包含一种或多种本发明FcRH5抗体。在一个实施方案中，所
述组合物包含本发明的核酸。在一个实施方案中，包含抗体的组合物进一步
包含载体，其在一些实施方案中是药学可接受的。在一个实施方案中，本发
明的制品进一步包含关于给受试者施用所述组合物(例如所述抗体)的指令。
一方面，本发明提供了试剂盒，其包括第一容器，其中装有包含一种或
多种本发明FcRH5抗体的组合物；和第二容器，其中装有缓冲液。在一个实
施方案中，所述缓冲液是药学可接受的。在一个实施方案中，包含拮抗性抗
体的组合物进一步包含载体，其在一些实施方案中是药学可接受的。在一个
实施方案中，试剂盒进一步包含关于向受试者施用所述组合物(例如所述抗
体)的指令。
一方面，本发明提供了本发明的FcRH5抗体在制备用于疾病(诸如癌症、
肿瘤和/或细胞增殖性病症)治疗性和/或预防性处理的药物中的用途。在一
个实施方案中，癌症、肿瘤和/或细胞增殖性病症选自淋巴瘤、非何杰金氏淋
巴瘤(NHL)、攻击性NHL、复发性攻击性NHL、复发性无痛性NHL、顽固性
NHL、顽固性无痛性NHL、慢性淋巴细胞性白血病(CLL)、小淋巴细胞淋巴
瘤、白血病、毛细胞白血病(HCL)、急性淋巴细胞性白血病(ALL)和套细胞淋
巴瘤。
一方面，本发明提供了本发明的核酸在制备用于疾病(诸如癌症、肿瘤
和/或细胞增殖性病症)治疗性和/或预防性处理的药物中的用途。在一个实
施方案中，癌症、肿瘤和/或细胞增殖性病症选自淋巴瘤、非何杰金氏淋巴瘤
(NHL)、攻击性NHL、复发性攻击性NHL、复发性无痛性NHL、顽固性NHL、
顽固性无痛性NHL、慢性淋巴细胞性白血病(CLL)、小淋巴细胞淋巴瘤、白
血病、毛细胞白血病(HCL)、急性淋巴细胞性白血病(ALL)和套细胞淋巴瘤。
一方面，本发明提供了本发明的表达载体在制备用于疾病(诸如癌症、
肿瘤和/或细胞增殖性病症)治疗性和/或预防性处理的药物中的用途。在一
个实施方案中，癌症、肿瘤和/或细胞增殖性病症选自淋巴瘤、非何杰金氏淋
巴瘤(NHL)、攻击性NHL、复发性攻击性NHL、复发性无痛性NHL、顽固性
NHL、顽固性无痛性NHL、慢性淋巴细胞性白血病(CLL)、小淋巴细胞淋巴
瘤、白血病、毛细胞白血病(HCL)、急性淋巴细胞性白血病(ALL)和套细胞淋
巴瘤。
一方面，本发明提供了本发明的宿主细胞在制备用于疾病(诸如癌症、
肿瘤和/或细胞增殖性病症)治疗性和/或预防性处理的药物中的用途。在一
个实施方案中，癌症、肿瘤和/或细胞增殖性病症选自淋巴瘤、非何杰金氏淋
巴瘤(NHL)、攻击性NHL、复发性攻击性NHL、复发性无痛性NHL、顽固性
NHL、顽固性无痛性NHL、慢性淋巴细胞性白血病(CLL)、小淋巴细胞淋巴
瘤、白血病、毛细胞白血病(HCL)、急性淋巴细胞性白血病(ALL)和套细胞淋
巴瘤。
一方面，本发明提供了本发明的制品在制备用于疾病(诸如癌症、肿瘤
和/或细胞增殖性病症)治疗性和/或预防性处理的药物中的用途。在一个实
施方案中，癌症、肿瘤和/或细胞增殖性病症选自淋巴瘤、非何杰金氏淋巴瘤
(NHL)、攻击性NHL、复发性攻击性NHL、复发性无痛性NHL、顽固性NHL、
顽固性无痛性NHL、慢性淋巴细胞性白血病(CLL)、小淋巴细胞淋巴瘤、白
血病、毛细胞白血病(HCL)、急性淋巴细胞性白血病(ALL)和套细胞淋巴瘤。
一方面，本发明提供了本发明的试剂盒在制备用于疾病(诸如癌症、肿
瘤和/或细胞增殖性病症)治疗性和/或预防性处理的药物中的用途。在一个
实施方案中，癌症、肿瘤和/或细胞增殖性病症选自淋巴瘤、非何杰金氏淋巴
瘤(NHL)、攻击性NHL、复发性攻击性NHL、复发性无痛性NHL、顽固性NHL、
顽固性无痛性NHL、慢性淋巴细胞性白血病(CLL)、小淋巴细胞淋巴瘤、白
血病、毛细胞白血病(HCL)、急性淋巴细胞性白血病(ALL)和套细胞淋巴瘤。
一方面，本发明提供了抑制表达FcRH5的细胞生长的方法，所述方法包
括使所述细胞接触本发明抗体，由此引起对所述细胞生长的抑制。在一个实
施方案中，所述抗体是偶联至细胞毒剂的。在一个实施方案中，所述抗体是
偶联至生长抑制剂的。
一方面，本发明提供了治疗性处理患有包含表达FcRH5的细胞的癌性肿
瘤的哺乳动物的方法，所述方法包括给所述哺乳动物施用治疗性有效量的本
发明抗体，由此有效治疗所述哺乳动物。在一个实施方案中，所述抗体是偶
联至细胞毒剂的。在一个实施方案中，所述抗体是偶联至生长抑制剂的。
一方面，本发明提供了用于治疗或预防与FcRH5表达升高有关的细胞增
殖性病症的方法，所述方法包括给需要此类治疗的受试者施用有效量的本发
明抗体，由此有效治疗或预防所述细胞增殖性病症。在一个实施方案中，所
述增殖性病症是癌症。在一个实施方案中，所述抗体是偶联至细胞毒剂的。
在一个实施方案中，所述抗体是偶联至生长抑制剂的。
一方面，本发明提供了抑制细胞生长的方法，其中所述细胞的生长至少
部分依赖于FcRH5的生长强化效应，所述方法包括使所述细胞接触有效量的
本发明抗体，由此抑制所述细胞的生长。在一个实施方案中，所述抗体是偶
联至细胞毒剂的。在一个实施方案中，所述抗体是偶联至生长抑制剂的。
一方面，本发明提供了治疗性处理哺乳动物中的肿瘤的方法，其中所述
肿瘤的生长至少部分依赖于FcRH5的生长强化效应，所述方法包括使所述细
胞接触有效量的本发明抗体，由此有效治疗所述肿瘤。在一个实施方案中，
所述抗体是偶联至细胞毒剂的。在一个实施方案中，所述抗体是偶联至生长
抑制剂的。
一方面，本发明提供了治疗癌症的方法，包含给患者施用包含本文所述
免疫偶联物、可接受的稀释剂、载体或赋形剂的药物配制剂。在一个实施方
案中，所述癌症选自淋巴瘤、非何杰金氏淋巴瘤(NHL)、攻击性NHL、复发
性攻击性NHL、复发性无痛性NHL、顽固性NHL、顽固性无痛性NHL、慢性
淋巴细胞性白血病(CLL)、小淋巴细胞淋巴瘤、白血病、毛细胞白血病(HCL)、
急性淋巴细胞性白血病(ALL)和套细胞淋巴瘤。在一个实施方案中，与所述
抗体-药物偶联物化合物组合地给所述患者施用细胞毒剂。
一方面，本发明提供了抑制B细胞增殖的方法，包括在允许下述免疫偶
联物结合至FcRH5的条件下使细胞暴露于包含本发明抗体的免疫偶联物。在
一个实施方案中，所述B细胞增殖选自淋巴瘤、非何杰金氏淋巴瘤(NHL)、
攻击性NHL、复发性攻击性NHL、复发性无痛性NHL、顽固性NHL、顽固性
无痛性NHL、慢性淋巴细胞性白血病(CLL)、小淋巴细胞淋巴瘤、白血病、
毛细胞白血病(HCL)、急性淋巴细胞性白血病(ALL)和套细胞淋巴瘤。在一个
实施方案中，所述B细胞是异种移植物。在一个实施方案中，所述暴露发生
于体外。在一个实施方案中，所述暴露发生于体内。
一方面，本发明提供了测定怀疑含有FcRH5的生物学样品中FcRH5的存
在情况的方法，所述方法包括使所述样品暴露于本发明的抗体，并测定所述
抗体对所述样品中FcRH5的结合，其中所述抗体结合至所述样品中的FcRH5
指示所述样品中存在所述蛋白质。在一个实施方案中，所述样品是生物学样
品。在又一个实施方案中，所述生物学样品包含B细胞。在一个实施方案中，
所述生物学样品来自经历或怀疑经历B细胞病症和/或B细胞增殖性病症的哺
乳动物，所述B细胞病症和/或B细胞增殖性病症包括但不限于淋巴瘤、非何
杰金氏淋巴瘤(NHL)、攻击性NHL、复发性攻击性NHL、复发性无痛性NHL、
顽固性NHL、顽固性无痛性NHL、慢性淋巴细胞性白血病(CLL)、小淋巴细
胞淋巴瘤、白血病、毛细胞白血病(HCL)、急性淋巴细胞性白血病(ALL)和套
细胞淋巴瘤。
一方面，提供了诊断与表达FcRH5的细胞(诸如B细胞)增多有关的细
胞增殖性病症的方法，所述方法包括使生物学样品中的测试细胞接触任何上
述细胞；通过检测所述抗体对FcRH5的结合来测定结合至所述样品中测试细
胞的抗体的水平；并比较结合至对照样品中细胞的抗体的水平，其中将所结
合的抗体的水平相对于测试和对照样品中表达FcRH5的细胞的数目标准化，
且其中测试样品中所结合的抗体的水平高于对照样品指明存在与表达
FcRH5的细胞有关的细胞增殖性病症。
一方面，提供了检测血液或血清中可溶性FcRH5的方法，所述方法包括
使来自怀疑经历B细胞增殖性病症的哺乳动物的血液或血清测试样品接触本
发明的抗FcRH5抗体，并检测测试样品中可溶性FcRH5相对于来自正常哺乳
动物的血液或血清对照样品的升高。在一个实施方案中，所述检测方法作为
诊断与哺乳动物血液或血清中可溶性FcRH5升高有关的B细胞增殖性病症的
方法是有用的。
一方面，提供了使本发明的抗体结合至表达FcRH5的细胞的方法，所述
方法包括使所述细胞接触本发明的抗体。在一个实施方案中，所述抗体是偶
联至细胞毒剂的。在一个实施方案中，所述抗体是偶联至生长抑制剂的。
本发明的方法可用于改变任何合适的病理状态，例如与FcRH5表达有关
的细胞和/或组织。在一个实施方案中，本发明方法中所靶向的细胞是造血细
胞。例如，造血细胞可以是选自下组的细胞：淋巴细胞、白细胞、血小板、
红细胞和天然杀伤细胞。在一个实施方案中，本发明方法中所靶向的细胞是
B细胞或T细胞。在一个实施方案中，本发明方法中所靶向的细胞是癌细胞。
例如，癌症细胞可以是选自下组的细胞：淋巴瘤细胞、白血病细胞或骨髓瘤
细胞。
本发明的方法可进一步包括别的治疗步骤。例如在一个实施方案中，所
述方法进一步包括其中使所靶向的细胞和/或组织(例如癌细胞)暴露于放射
治疗或化疗剂的步骤。
如本文中所描述的，已经观察到多发性骨髓瘤和伯基特淋巴瘤细胞系中
的FcRH5(或IRTA2)表达失调。因而，在本发明方法的一个实施方案中，
所靶向的细胞(例如癌细胞)是与不表达FcRH5的细胞相比表达FcRH5的细
胞。在又一个实施方案中，所靶向的细胞是其中FcRH5表达与同一组织类型
的正常非癌细胞相比得到增强的癌细胞。在一个实施方案中，本发明的方法
引起所靶向的细胞死亡。
在本发明的其它方面，本发明提供了包含编码任何本文所述抗体的DNA
的载体。还提供了包含任何此类载体的宿主细胞。举例而言，所述宿主细胞
可以是CHO细胞、大肠杆菌细胞或酵母细胞。进一步提供了用于生成任何本
文所述抗体的方法，包括在适合于期望抗体表达的条件下培养宿主细胞并自
所述细胞培养物回收所述期望抗体。
在有一个方面，本发明关注包含与载体组合的本文所述抗FcRH5抗体的
组合物。任选的是，所述载体是药学可接受载体。
本发明的另一个方面致力于本文所述抗FcRH5多肽抗体用于制备在对
所述抗FcRH5多肽抗体有响应的疾患的治疗中有用的药物的用途。
本发明的另一个方面是包含式I的抗体-药物化合物的混合物的组合物，
其中每个抗体的平均药物载荷是约2个至约5个或约3个至约4个。
本发明的另一个方面是包含式IADC化合物、式IADC化合物的混合物或
其药学可接受盐或溶剂合物、及药学可接受稀释剂、载体或赋形剂的药物组
合物。
另一个方面提供了包含式IADC化合物和具有抗癌特性或其它治疗效果
的第二化合物的药物组合。
另一个方面是用于杀死肿瘤细胞或癌细胞或抑制肿瘤细胞或癌细胞增
殖的方法，包括用有效杀死肿瘤细胞或癌细胞或抑制肿瘤细胞或癌细胞增殖
的量的式I抗体-药物偶联物或其药学可接受盐或溶剂合物处理所述细胞。
另一个方面是治疗癌症的方法，包括给患者施用治疗性有效量的包含式
IADC的药物组合物。
另一个方面包括制品，即试剂盒，其包括抗体-药物偶联物、容器和指
示治疗方法的包装插页或标签。
本发明的一个方面是制备式I抗体-药物偶联物化合物的方法，包含下列
步骤：(a)使半胱氨酸改造抗体的改造半胱氨酸基团与接头试剂起反应以形成
抗体-接头中间体Ab-L；并(b)使Ab-L与活化的药物模块D起反应；由此抗体-
药物偶联物形成；或包括下列步骤：(c)使药物模块的亲核基团与接头试剂起
反应以形成药物-接头中间体D-L；并(d)使D-L与半胱氨酸改造抗体的改造半
胱氨酸基团起反应；由此抗体-药物偶联物形成。
本发明的一个方面是用于检测癌细胞的测定法，包括：(a)使细胞暴露于
半胱氨酸改造抗FcRH5抗体-药物偶联物；并(b)测定所述半胱氨酸改造抗
FcRH5抗体-药物偶联物化合物对所述细胞的结合程度。
A.抗FcRH5抗体
在一个实施方案中，本发明提供了可在本文中用作治疗剂的抗FcRH5抗
体。例示性的抗体包括多克隆的、单克隆的、人源化的、双特异性的和异源
偶联的抗体。
1.多克隆抗体
多克隆抗体优选通过在动物中多次皮下(sc)或腹膜内(ip)注射相关抗原
和佐剂来生成。将相关抗原(尤其在使用合成肽时)与在待免疫的物种中有
免疫原性的蛋白质偶联可能是有用的。例如，可使用双功能或衍生化试剂，
例如马来酰亚胺苯甲酰磺基琥珀酰亚胺酯(经半胱氨酸残基的偶联)、N-羟
基琥珀酰亚胺(经赖氨酸残基)、戊二醛、琥珀酸酐、SOCl2或R1N＝C＝NR，
其中R和R1是不同的烃基，将抗原与匙孔![]()
血蓝蛋白(KLH)、血清清蛋白、
牛甲状腺球蛋白或大豆胰蛋白酶抑制剂偶联。
通过将例如100μg或5μg蛋白质或偶联物(分别用于家兔或小鼠)与3倍
体积的弗氏完全佐剂混和，并将溶液皮内注射于多个部位，由此将动物针对
抗原、免疫原性偶联物或衍生物进行免疫。一个月后，通过多个部位的皮下
注射，用弗氏完全佐剂中1/5-1/10初始量的肽或偶联物对动物进行强化免疫。
7-14天后，采集动物的血液，并测定血清的抗体滴度。对动物进行强化直到
滴度达到稳定的高水平。偶联物还可在重组细胞培养物中作为蛋白质融合物
来制备。同样，适当使用凝聚剂诸如明矾来增强免疫应答。
2.单克隆抗体
单克隆抗体可以使用最初由Kohler等，Nature 256：495(1975)记载的杂交
瘤方法来制备，或者可以通过重组DNA方法来制备(美国专利No.
4,816,567)。
在杂交瘤方法中，如上所述免疫小鼠或其它合适的宿主动物，诸如仓鼠，
以引发生成或能够生成如下抗体的淋巴细胞，所述抗体会特异性结合用于免
疫的蛋白质。或者，可以在体外免疫淋巴细胞。免疫后，分离淋巴细胞，然
后使用合适的融合剂诸如聚乙二醇将淋巴细胞与骨髓瘤细胞系融合，形成杂
交瘤细胞(Goding，Monoclonal Antibodies：Principles and Practice，pp.59-103，
Academic Press，1986)。
将如此制备的杂交瘤细胞在合适的培养基中接种和培养，所述培养基优
选含有抑制未融合的亲本骨髓瘤细胞(也称作融合配偶)生长或存活的一种
或多种物质。例如，如果亲本骨髓瘤细胞缺乏次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移
酶(HGPRT或HPRT)，那么用于杂交瘤的选择性培养基通常会含有次黄嘌呤、
氨基喋呤和胸苷(HAT培养基)，这些物质阻止HGPRT缺陷细胞生长。
优选的融合配偶骨髓瘤细胞是那些高效融合、支持选择的抗体生成细胞
稳定地高水平生成抗体、并对针对未融合亲本细胞进行选择的选择性培养基
敏感的骨髓瘤细胞。优选的骨髓瘤细胞系是鼠骨髓瘤系，诸如可从索尔克研
究所细胞分配中心(Salk Institute Cell Distribution Center，San Diege，
California，USA)获得的MOPC-21和MPC-11小鼠肿瘤所衍生的细胞系，以
及可从美国典型培养物保藏中心(American Type Culture Collection，
Manassas，Virginia，USA)获得的SP-2及衍生物，例如X63-Ag8-653细胞。
用于生成人单克隆抗体的人骨髓瘤和小鼠-人异源骨髓瘤细胞系也已有描述
(Kozbor，J.Immunol.133：3001(1984)；及Brodeur等，Monoclonal Antibody
Production Techniques and Applications，pp.51-63，Marcel Dekker，Inc.，New
York，1987)。
可对杂交瘤细胞正在其中生长的培养基测定针对抗原的单克隆抗体的
生成。优选的是，通过免疫沉淀或通过体外结合测定法，诸如放射性免疫测
定法(RIA)或酶联免疫吸附测定法(ELISA)，测定由杂交瘤细胞生成的单克隆
抗体的结合特异性。
单克隆抗体的结合亲和力可通过例如Munson等，Anal.Biochem.107：
220(1980)中记载的Scatchard分析来测定。
一旦鉴定得到生成具有所需特异性、亲和力和/或活性的抗体的杂交瘤细
胞，所述克隆可通过有限稀释流程进行亚克隆，并通过标准方法进行培养
(Goding，Monoclonal Antibodies：Principles and Practice，pp.59-103，
Academic Press，1986)。适于这一目的的培养基包括例如D-MEM或
RPMI-1640培养基。另外，杂交瘤细胞可在动物中作为腹水瘤进行体内培养，
例如通过将细胞i.p.注射到小鼠中。
可通过常规抗体纯化流程，诸如例如亲和层析(例如使用蛋白A或蛋白
G-Sepharose)或离子交换层析、羟磷灰石层析、凝胶电泳、透析等，将亚克
隆分泌的单克隆抗体与培养基、腹水或血清适当分开。
编码单克隆抗体的DNA易于使用常规流程分离并测序(例如通过使用能
够与编码鼠抗体重链和轻链的基因特异性结合的寡核苷酸探针)。以杂交瘤
细胞作为此类DNA的优选来源。一旦分离，可将DNA置于表达载体中，然
后将该表达载体转染到不另外产生抗体蛋白质的宿主细胞中，诸如大肠杆菌
细胞、猿COS细胞、中国仓鼠卵巢(CHO)细胞或骨髓瘤细胞，以在重组宿主
细胞中获得单克隆抗体的合成。关于编码抗体的DNA在细菌中的重组表达的
综述性论文包括Skerra等，Curr.Opinion in Immunol.5：256-262(1993)及
Plückthun，Immunol.Revs.130：151-188(1992)。
在另一个实施方案中，可从使用McCafferty等，Nature 348：552-554(1990)
所述技术构建的噬菌体抗体文库中分离单克隆抗体或抗体片段。Clackson等，
Nature 352：624-628(1991)及Marks等，J.Mol.Biol.222：581-597(1991)分别
描述了使用噬菌体文库分离鼠抗体和人抗体。后续出版物描述了通过链改组
(Marks等，Bio/Technology 10：779-783(1992))，以及组合感染和体内重组作
为构建非常大的噬菌体文库的策略(Waterhouse等，Nuc.Acids Res.21：
2265-2266(1993))，生成高亲和力(nM范围)的人抗体。如此，这些技术是
用于分离单克隆抗体的传统单克隆抗体杂交瘤技术的可行替换方法。
可以修饰编码抗体的DNA以生成嵌合或融合抗体多肽，例如通过用人重
链和轻链恒定域(CH和CL)序列替代同源鼠序列(美国专利No.4,816,567；及
Morrison等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 81：6851(1984))，或通过融合免疫球蛋
白编码序列和非免疫球蛋白多肽(异源多肽)的整个或部分编码序列。非免
疫球蛋白多肽序列可替代抗体的恒定域，或者用它们替代抗体的一个抗原结
合位点的可变域，以产生嵌合二价抗体，它包含对一种抗原具有特异性的一
个抗原结合位点以及对不同抗原具有特异性的另一个抗原结合位点。
3.人抗体和人源化抗体
本发明的抗FcRH5抗体可进一步包括人源化抗体或人抗体。非人(例如
鼠)抗体的人源化形式指最低限度包含自非人免疫球蛋白衍生的序列的嵌合
免疫球蛋白、免疫球蛋白链或其片段(诸如Fv、Fab、Fab′、F(ab′)2或抗体的
其它抗原结合子序列)。人源化抗体包括人免疫球蛋白(受体抗体)中的互
补决定区(CDR)残基用具有期望特异性、亲和力和能力的非人物种(供体抗
体)诸如小鼠、大鼠或家兔的CDR残基替换而得到的免疫球蛋白。在有些情
况中，将人免疫球蛋白的Fv框架残基用相应的非人残基替换。人源化抗体还
可包含在受体抗体或所输入的CDR或框架序列中没有发现的残基。通常，人
源化抗体包含至少一个、通常两个基本上整个如下的可变域，其中所有或基
本上所有CDR区对应于非人免疫球蛋白的CDR区，且所有或基本上所有FR
区是人免疫球蛋白共有序列的FR区。人源化抗体最好还包含至少部分免疫球
蛋白恒定区(Fc)，通常是人免疫球蛋白的恒定区(Jones等，Nature 321：522-525
(1986)；Riechmann等，Nature 332：323-329(1988)；及Presta，Curr.Op.Struct.
Biol.2：593-596(1992))。
用于将非人抗体人源化的方法在本领域是众所周知的。通常，人源化抗
体具有一个或多个从非人来源引入的氨基酸残基。这些非人氨基酸残基常常
称作“输入”残基，它们通常取自“输入”可变域。人源化可基本上依照Winter
及其同事的方法实施(Jones等，Nature 321：522-525(1986)；Riechmann等，
Nature 332：323-327(1988)；Verhoeyen等，Science 239：1534-1536(1988))，通
过用啮齿类CDR序列替代相应的人抗体序列来进行。因而，此类“人源化”抗
体是嵌合抗体(美国专利No.4,816,567)，其中基本上少于整个人可变域用来
自非人物种的相应序列替代。在实践中，人源化抗体通常是将人抗体中的一
些CDR残基和可能的一些FR残基用来自啮齿类抗体中类似位点的残基替代
而得到的抗体。
当抗体意图在于人类治疗性用途时，用于生成人源化抗体的人可变域的
选择，包括轻链和重链二者，对于降低抗原性和HAMA应答(人抗小鼠抗体)
非常重要。HAMA应答降低或消除是合适治疗剂的临床开发的一个重要方
面。参见例如Khaxzaeli等，J.Natl.Cancer Inst.(1988)，80：937；Jaffers等，
Transplantation(1986)，41：572；Shawler等，J.Immunol.(1985)，135：1530；Sears
等，J.Biol.Response Mod(1984)，3：138；Miller等，Blood(1983)，62：988；
Hakimi等，J.Immunol.(1991)，147：1352；Reichmann等，Nature(1988)，332：323；
Junghans等，Cancer Res(1990)，50：1495。如本文中所描述的，本发明提供了
经人源化使得HAMA应答降低或消除的抗体。可使用本领域已知的常规方法
(其中有些在下文中有进一步描述)进一步获得这些抗体的变体。依照所谓
的“最适(best-fit)”方法，用啮齿类抗体可变域序列对已知的人可变域序列的
整个文库进行筛选。鉴定与啮齿类最接近的人V结构域序列，并接受其中的
人框架区(FR)用于人源化抗体(Sims等，J.Immunol.151：2296(1993)；Chothia
等，J.Mol.Biol.196：901(1987))。另一种方法使用自轻链或重链特定亚型的
所有人抗体的共有序列衍生的特定框架区。同一框架可用于数种不同的人源
化抗体(Carter等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89：4285(1992)；Presta等，J.
Immunol.151：2623(1993))。
例如，来自本文所述抗体的氨基酸序列可充当框架和/或高变序列多样化
的起始(亲本)序列。起始高变序列所连接的选定框架序列在本文中称为受
体人框架。尽管受体人框架可来自或衍生自人免疫球蛋白(其VL和/或VH
区)，优选受体人框架来自或衍生自人共有框架序列，因为这样的框架已证
实在人类患者中具有最小免疫原性或者没有免疫原性。
当受体衍生自人免疫球蛋白时，可任选选择根据它与供体框架序列的同
源性而选择的人框架序列，即将供体框架序列与人框架序列集合中的各种人
框架序列比对，并选择最具同源性的框架序列作为受体。
在一个实施方案中，本文中的人共有框架来自或衍生自VH亚组III和/或
VLκ亚组I共有框架序列。
虽然受体可在序列上与选定的人框架序列相同，无论它是来自人免疫球
蛋白或人共有框架，在本发明中，受体序列可包含相对于人免疫球蛋白序列
或人共有框架序列而言预先存在的氨基酸替代。这些预先存在的替代优选是
最小限度的；通常相对于人免疫球蛋白序列或共有框架序列而言的仅四处、
三处、两处或一处氨基酸差异。
将非人抗体的高变区残基掺入VL和/或VH受体人框架。例如，可掺入对
应于Kabat CDR残基、Chothia高变环残基、Abm残基和/或接触残基的残基。
任选的是，掺入如下延伸的高变区残基：24-34(L1)、50-56(L2)和89-97(L3)，
26-35B(H1)、50-65、47-65或49-65(H2)和93-102、94-102或95-102(H3)。
虽然本文中讨论了高变区残基的“掺入”，但是应当领会这可以各种方式
实现，例如编码期望氨基酸序列的核酸可通过突变编码小鼠可变域序列的核
酸使得其框架残基改变成受体人框架残基，或者通过突变编码人可变域序列
的核酸使得高变域残基改变成非人残基，或者通过合成编码期望序列的核酸
等等而产生。
在本文的例子中，高变区嫁接(graft)变体是使用各个高变区的各个寡核
苷酸通过编码人受体序列的核酸的Kunkel诱变而产生的。Kunkel等，Methods
Enzymol.154：367-382(1987)。可利用常规技术在框架和/或高变区内引入合
适的改变以纠正和重建正确的高变区-抗原相互作用。
噬菌体(噬菌粒)展示(本文在有些内容中也称为噬菌体展示)可作为
方便快捷的方法用于在通过序列随机化构建的文库中生成和筛选许多不同
的潜在变体抗体。然而，熟练技术人员可利用其它方法来制备和筛选改变的
抗体。
噬菌体(噬菌粒)展示技术为生成和选择与配体诸如抗原结合的新蛋白
质提供了有力的工具。噬菌体(噬菌粒)展示技术的使用容许构建大型蛋白
质变体文库，可从中快速分拣以高亲和力与靶分子结合的那些序列。通常将
编码变体多肽的核酸与编码病毒外壳蛋白诸如基因III蛋白或基因VIII蛋白的
核酸序列融合。已经开发出了其中编码蛋白质或多肽的核酸序列与编码基因
III蛋白一部分的核酸序列融合的单价噬菌粒展示系统(Bass，S.，Proteins，8：
309(1990)；Lowman和Wells，Methods：A Companion to Methods in
Enzymology，3：205(1991))。在单价噬菌粒展示系统中，基因融合物以低水
平表达，而且野生型基因III蛋白也表达，从而保留了粒子的侵染性。许多专
利中已经公开了构建肽库和筛选那些文库的方法(例如美国专利No.
5,723,286；美国专利No.5,432,018；美国专利No.5,580,717；美国专利No.
5,427,908；和美国专利No.5,498,530)。
已经以许多方式制备了抗体或抗原结合多肽的文库，包括通过插入随机
DNA序列或通过克隆一族相关基因来改变单个基因。利用噬菌体(噬菌粒)
展示来展示抗体或抗原结合片段的方法记载于美国专利No.5,750,373、
5,733,743、5,837,242、5,969,108、6,172,197、5,580,717和5,658,727。然后对
文库筛选具期望特性的抗体或抗原结合蛋白的表达。
本领域已经建立了将所选择的氨基酸替代入模板核酸中的方法，本文中
描述了其中的一些。例如，可使用Kunkel方法来替代高变区残基(参见例如
Kunkel et al.，Methods Enzymol.154：367-382(1987))。
寡核苷酸序列包含待改变高变区残基的一个或多个期望密码子集合。密
码子集合是用于编码期望变体氨基酸的不同核苷酸三联体序列的集合。密码
子集合可用如下所示依照IUB密码指定特定核苷酸或等摩尔核苷酸混合物的
符号来表示。
IUB代码
G 鸟嘌呤
A 腺嘌呤
T 胸腺嘧啶
C 胞嘧啶
R (A或G)
Y (C或T)
M (A或C)
K (G或T)
S (C或G)
W (A或T)
H (A或C或T)
B (C或G或T)
V (A或C或G)
D (A或G或T)
N (A或C或G或T)
例如，在密码子集合DVK中，D可以是核苷酸A或G或T；V可以是A或G
或C；而K可以是G或T。此密码子集合可代表18种不同的密码子，而且可编
码氨基酸Ala、Trp、Tyr、Lys、Thr、Asn、Lys、Ser、Arg、Asp、Glu、Gly
和Cys。
寡核苷酸或引物集合可用标准方法合成。可通过例如固相合成来合成包
含如下序列的一套寡核苷酸，所述序列代表密码子集合所提供的核苷酸三联
体所有可能组合且会编码期望氨基酸集合。在某些位置具有选定核苷酸“简
并性”的寡核苷酸的合成是本领域众所周知的。具有某些密码子集合的此类
核苷酸集合可使用商品化核酸合成仪(可从例如Applied Biosystems，Foster
City，CA购买)来合成，或者可通过商业途径获得(例如Life Technologies，
Rockville，MD)。因此，具有特定密码子集合的合成寡核苷酸集合会通常包
括具有不同序列的众多寡核苷酸，所述差异由整个序列内的密码子集合确
定。依照本发明使用的寡核苷酸具有容许与可变域核酸模板杂交的序列且还
可包含用于克隆目的的限制酶位点。
在一种方法中，可通过寡核苷酸介导的诱变来产生编码变体氨基酸的核
酸序列。此技术是本领域众所周知的，如Zoller等，Nucleic Acids Res.10：
6487-6504(1987)中所述。简单的说，编码变体氨基酸的核酸序列是如下产生
的，将编码期望密码子集合的寡核苷酸集合与DNA模板杂交，其中模板是包
含可变区核酸模板序列的单链形式质粒。杂交后，用DNA聚合酶合成模板的
完整第二条互补链，其由此会掺入寡核苷酸引物，并会含有寡核苷酸集合所
提供的密码子集合。
通常使用长度为至少25个核苷酸的寡核苷酸。最佳寡核苷酸会有12至15
个核苷酸与编码突变的核苷酸任一侧的模板完全互补。这确保了寡核苷酸会
与单链DNA模板分子正确杂交。寡核苷酸易于使用本领域已知的技术合成，
诸如Crea等，Proc.Nat′l.Acad.Sci.USA，75：5765(1978)中所述。
DNA模板是由衍生自噬菌体M13载体(商品化M13mp18和M13mp19载
体是合适的)的那些载体或如Viera等，Meth.Enzymol.，153：3(1987)中所述包
含单链噬菌体复制起点的那些载体产生的。因此，为了产生单链模板，可将
待突变的DNA插入这些载体之一。Sambrook等(见上文)在第4.21-4.41节中
记载了单链模板的产生。
为了改变天然DNA序列，在合适的杂交条件下将寡核苷酸与单链模板杂
交。然后加入DNA聚合酶，通常是T7 DNA聚合酶或DNA聚合酶I的Klenow
片段，以所述寡核苷酸作为合成的引物合成所述模板的互补链。由此形成异
源双链体分子，其中DNA的一条链编码基因1的突变形式，另一条链(最初
的模板)编码天然的、未改变的基因1序列。然后将此异源双链体分子转化
到合适的宿主细胞中，通常是原核生物，诸如大肠杆菌JM101。培养细胞后，
将它们涂布到琼脂糖平板上，并用32-磷酸盐放射性标记的寡核苷酸引物进
行筛选，以鉴定包含突变DNA的细菌菌落。
可修改上文刚刚描述的方法，以便产生其中质粒两条链均包含突变的同
源双链体分子。修改如下：如上所述将单链寡核苷酸与单链模板退火。将三
种脱氧核糖核苷酸：脱氧核糖腺苷酸(dATP)、脱氧核糖鸟苷酸(dGTP)和脱氧
核糖胸苷酸(dTT)的混合物与称为dCTP-(aS)(可从Amersham购买)的修饰硫
代脱氧核糖胞苷酸混合。将此混合物加入模板-寡核苷酸复合物中。向此混
合物中添加DNA聚合酶后，产生了除突变碱基外与模板相同的一条DNA链。
此外，这条新的DNA链会包含dCTP-(aS)替代dCTP，这用于保护它不受限制
性内切核酸酶的消化。在用恰当的限制酶对双链异源双链体的模板链造成缺
刻后，可用ExoIII核酸酶或其它适当的核酸酶消化模板链，越过包含待诱变
位点的区域。然后终止反应，剩下只有部分是单链的分子。然后在存在所有
四种脱氧核糖核苷三磷酸、ATP和DNA连接酶的条件下用DNA聚合酶形成完
整的双链DNA同源双链体。然后可将此同源双链体分子转化到合适的宿主细
胞中。
正如先前所指出的，寡核苷酸集合的序列在长度上足以与模板核酸杂
交，而且还可以，但不是必须的，包含限制性位点。可由衍生自噬菌体M13
载体或如Viera等，Meth.Enzymol.，153：3(1987)中所述包含单链噬菌体复制
起点的载体的那些载体生成DNA模板。因此，为了生成单链模板，必须将待
突变DNA插入这些载体之一。Sambrook等人(见上文)在第4.21-4.41节中记
载了单链模板的产生。
依照另一种方法，可以在抗体人源化期间经由对修复的高变区的选择来
恢复抗原结合(参见2005年2月18日提交的申请No.11/061,841)。该方法包括
将非人高变区掺到受体框架上并进一步在一个或多个高变区中引入一处或
多处替代，而不修饰受体框架序列。或者，一处或多处氨基酸替代的引入可
伴有受体框架序列中的修饰。
依照另一种方法，可如下构建文库，即提供上游和下游寡核苷酸集合，
每个集合含有具有不同序列的众多寡核苷酸，即由寡核苷酸序列内所提供的
密码子集合确定的不同序列。上游和下游寡核苷酸集合，与可变域模板核酸
序列一起，可用于聚合酶链式反应(PCR)，以产生PCR产物“文库”。PCR产物
可称为“核酸盒”，因为利用已建立的分子生物学技术，可将它们与其它相关
或无关的核酸序列融合，例如病毒外壳蛋白和二聚化结构域。
PCR引物序列包含高变区中溶剂可及的且高度多样的位置的一个或多
个设计密码子集合。如上所述，密码子集合是用于编码期望变体氨基酸的不
同核苷酸三联体序列的集合。
通过适当的筛选/选择步骤选定的符合预期标准的抗体选出物(selectant)
可使用标准重组技术进行分离和克隆。
更为重要的是，抗体在人源化后保持对抗原的高结合亲和力及其它有利
的生物学特性。为了实现这一目的，依照一种优选的方法，通过使用亲本和
人源化序列的三维模型分析亲本序列和各种概念性人源化产物的方法来制
备人源化抗体。三维免疫球蛋白模型通常是可获得的，且为本领域熟练技术
人员所熟悉。还可获得图解和显示所选择的候选免疫球蛋白序列的可能三维
构象结构的计算机程序。检查这些显示图像能够分析残基在候选免疫球蛋白
序列行使功能中的可能作用，即分析影响候选免疫球蛋白结合其抗原的能力
的残基。这样，可从受体和输入序列中选出FR残基并进行组合，从而获得所
需抗体特征，诸如对靶抗原的亲和力提高。通常，高变区残基直接且最实质
的涉及对抗原结合的影响。
本发明涵盖人源化抗FcRH5抗体的各种形式。例如，人源化抗体可以是
抗体片段，诸如Fab，任选偶联有一种或多种细胞毒剂以生成免疫偶联物。
或者，人源化抗体可以是完整的抗体，诸如完整的IgG1抗体。
作为人源化的替代方法，可生成人抗体。例如，现在有可能生成在缺乏
内源免疫球蛋白生成的情况下能够在免疫后生成人抗体完整全集的转基因
动物(例如小鼠)。例如，已经描述了嵌合和种系突变小鼠中抗体重链连接
区(JH)基因的纯合删除导致对内源抗体生成的完全抑制。将人种系免疫球蛋
白基因阵列(array)转移到此类种系突变小鼠中会导致在抗原攻击后生成人抗
体。参见例如Jakobovits等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90：2551(1993)；
Jakobovits等，Nature 362：255-258(1993)；Bruggemann等，Year in Immuno.7：
33(1993)；美国专利No.5,545,806，5,569,825，5,591,669(都是GenPharm的)；
5,545,807；及WO 97/17852。
或者，噬菌体展示技术(McCafferty等，Nature 348：552-553(1990))可
用于在体外从来自未免疫供体的免疫球蛋白可变(V)域基因全集生成人抗体
和抗体片段。依照这种技术，将抗体V结构域基因以符合读码框的方式克隆
到丝状噬菌体诸如M13或fd的主要或次要外壳蛋白基因中，并在噬菌体颗粒
表面上展示为功能性抗体片段。因为丝状颗粒包含噬菌体基因组的单链DNA
拷贝，以抗体的功能特性为基础进行的选择也导致编码展示那些特性的抗体
的基因的选择。如此，噬菌体模拟B细胞的一些特性。噬菌体展示可以多种
形式进行，综述参见例如Johnson，Kevin S.和Chiswell，David J.，Current
Opinion in Structural Biology 3：564-571(1993)。V基因区段的数种来源可用于
噬菌体展示。Clackson等，Nature 352：624-628(1991)从衍生自免疫小鼠脾的
小型V基因随机组合文库分离得到大量不同的抗![]()
唑酮抗体。可基本上遵循
Marks等，J.Mol.Biol.222：581-597(1991)或Griffith等，EMBO J.12：725-734
(1993)所述技术，由未免疫人供体构建V基因全集，并分离针对大量不同抗
原(包括自身抗原)的抗体。还可参见美国专利No.5,565,332和5,573,905。
如上所述，还可通过体外激活B细胞(参见美国专利No.5,567,610和
5,229,275)来生成人抗体。
4.抗体片段
在某些情况中，使用抗体片段而非完整抗体是有利的。片段的体积较小，
容许快速清除，并且可导致对实体瘤的接近和进入提高。
已经开发了用于生成抗体片段的多种技术。传统上，通过蛋白水解消化
完整抗体来衍生这些片段(参见例如Morimoto等，Journal of Biochemical and
Biophysical Methods 24：107-117(1992)；及Brennan等，Science 229：81
(1985))。然而，现在可直接由重组宿主细胞生成这些片段。Fab、Fv和scFv
抗体片段都可在大肠杆菌中表达和由大肠杆菌分泌，如此容许容易地生成大
量的这些片段。可从上文讨论的抗体噬菌体文库分离抗体片段。或者，可直
接从大肠杆菌回收Fab′-SH片段，并通过化学方法偶联以形成F(ab′)2片段
(Carter等，Bio/Technology 10：163-167(1992))。依照另一种方法，可直接从
重组宿主细胞培养物分离F(ab′)2片段。包含补救受体结合表位残基、具有延
长的体内半衰期的Fab和F(ab′)2片段描述于美国专利No.5,869,046。用于生成
抗体片段的其它技术对熟练从业人员是显而易见的。在其它实施方案中，选
择的抗体是单链Fv片段(scFv)。参见WO 93/16185；美国专利No.5,571,894；
及美国专利No.5,587,458。Fv和sFv是具有完整结合位点且缺乏恒定区的唯一
种类；如此，它们是合适的，因为在体内使用过程中具有降低的非特异性结
合。可构建sFv融合蛋白以生成效应物蛋白质位于sFv氨基或羧基末端的融合
物。参见《Antibody Engineering》，Borrebaeck编，见上文。抗体片段还可以
是“线性抗体”，例如如美国专利No.5,641,870中所描述的。此类线性抗体片
段可以是单特异性的或双特异性的。
5.双特异性抗体
双特异性抗体指对至少两种不同表位具有结合特异性的抗体。例示性的
双特异性抗体可结合本文所述FcRH5蛋白质的两种不同表位。其它此类抗体
可将FcRH5结合位点与针对另一种蛋白质的结合位点组合。或者，可以将抗
FcRH5臂与结合白细胞上触发分子诸如T细胞受体分子(例如CD3)或IgG的
Fc受体(FcγR)诸如FcγRI(CD64)、FcγRII(CD32)和FcγRIII(CD16)的臂组合，
从而将细胞防御机制聚焦和定位于表达FcRH5的细胞。双特异性抗体还可用
于将细胞毒剂定位于表达FcRH5的细胞。这些抗体拥有FcRH5结合臂及结合
细胞毒剂(例如肥皂草毒蛋白(saporin)、抗干扰素-α、长春花生物碱(vinca
alkaloid)、蓖麻毒蛋白A链、甲氨蝶呤或放射性同位素半抗原)的臂。可将双
特异性抗体制备成全长抗体或抗体片段(例如F(ab′)2双特异性抗体)。
WO 96/16673描述了双特异性抗ErbB2/抗FcγRIII抗体，而美国专利No.
5,837,234公开了双特异性抗ErbB2/抗FcγRI抗体。双特异性抗ErbB2/Fcα抗体
显示于WO 98/02463。美国专利No.5,821,337和6,407,213教导了双特异性抗
ErbB2/抗CD3抗体。别的结合CD3抗原上表位和第二表位的双特异性抗体已
有记载。参见例如美国专利No.5,078,998(抗CD3/肿瘤细胞抗原)；5,601,819
(抗CD3/IL-2R；抗CD3/CD28；抗CD3/CD45)；6,129,914(抗CD3/恶性B细
胞抗原)；7,112,324(抗CD3/CD19)；6,723,538(抗CD3/CCR5)；7,235,641
(抗CD3/EpCAM)；7,262,276(抗CD3/卵巢肿瘤抗原)；和5,731,168(抗
CD3/CD4IgG)。
用于生成双特异性抗体的方法是本领域已知的。全长双特异性抗体的传
统生成基于两种免疫球蛋白重链-轻链对的共表达，其中两种链具有不同的
特异性(Millstein等，Nature 305：537-539(1983))。由于免疫球蛋白重链和轻
链的随机分配，这些杂交瘤(四源杂交瘤(quadroma))生成10种不同抗体分
子的潜在混合物，其中只有一种具有正确的双特异性结构。通常通过亲和层
析步骤进行的正确分子的纯化相当麻烦，且产物产量低。WO 93/08829及
Traunecker等，EMBO J.10：3655-3659(1991)中公开了类似的流程。
依照一种不同的方法，将具有所需结合特异性(抗体-抗原结合位点)
的抗体可变域与免疫球蛋白恒定域序列融合。优选的是，融合使用包含至少
部分铰链、CH2和CH3区的免疫球蛋白重链恒定域。优选的是，在至少一种
融合物中具有包含轻链结合所必需的位点的第一重链恒定区(CH1)。将编码免
疫球蛋白重链融合物以及，如果需要，免疫球蛋白轻链的DNA插入分开的表
达载体中，并共转染到合适的宿主细胞中。在用于构建的三种多肽链比例不
等时提供期望双特异性抗体的最佳产量的实施方案中，这为调整三种多肽片
段的相互比例提供了更大的灵活性。然而，在至少两种多肽链以相同比率表
达导致高产量时或在该比率对期望链组合的产量没有显著影响时，有可能将
两种或所有三种多肽链的编码序列插入同一表达载体。
在本方法的一个优选实施方案中，双特异性抗体由一个臂上具有第一结
合特异性的杂合免疫球蛋白重链，和另一个臂上的杂合免疫球蛋白重链-轻
链对(提供第二结合特异性)构成。由于免疫球蛋白轻链仅在半个双特异性
分子中的存在提供了分离的便利途径，因此发现这种不对称结构便于将所需
双特异性化合物与不想要的免疫球蛋白链组合分开。该方法公开于WO
94/04690。关于生成双特异性抗体的其它细节参见例如Suresh等，Methods in
Enzymology 121：210(1986)。
依照美国专利No.5,731,168中描述的另一种方法，可改造一对抗体分子
之间的界面，将从重组细胞培养物中回收的异二聚体的百分比最大化。优选
的界面包含至少部分CH3结构域。在该方法中，将第一抗体分子界面的一个
或多个小型氨基酸侧链用较大侧链(例如酪氨酸或色氨酸)替换。通过用较
小氨基酸侧链(例如丙氨酸或苏氨酸)替换大型氨基酸侧链，在第二抗体分
子的界面上产生大小与大型侧链相同或相似的补偿性“空腔”。这提供了较之
其它不想要的终产物诸如同二聚体提高异二聚体产量的机制。依照此办法生
成的双特异性抗体在本文中称作“隆起入空腔”抗体。
双特异性抗体包括交联或“异源偶联”抗体。例如，异源偶联物中的一种
抗体可与亲合素偶联，另一种抗体与生物素偶联。例如，此类抗体建议用于
将免疫系统细胞靶向不想要的细胞(美国专利No.4,676,980)，及用于治疗
HIV感染(WO 91/00360、WO 92/200373及EP 03089)。可使用任何便利的交
联方法制备异源偶联抗体。合适的交联剂是本领域众所周知的，并且连同许
多交联技术一起公开于美国专利No.4,676,980。
文献中还描述了由抗体片段生成双特异性抗体的技术。例如，可使用化
学连接来制备双特异性抗体。Brennan等，Science 229：81(1985)描述了一种规
程，其中通过蛋白水解切割完整抗体以生成F(ab′)2片段。将这些片段在存在
二硫醇络合剂亚砷酸钠的情况下还原，以稳定邻近的二硫醇并防止分子间二
硫键的形成。然后将产生的Fab′片段转变为硫代硝基苯甲酸酯(TNB)衍生物。
然后将Fab′-TNB衍生物之一通过巯基乙胺的还原重新恢复成Fab′-硫醇，并与
等摩尔量的另一种Fab′-TNB衍生物混合，以形成双特异性抗体。产生的双特
异性抗体可用作酶的选择性固定化试剂。
最近的进展使得从大肠杆菌中直接回收Fab′-SH片段变得更加容易，这些
片段可化学偶联以形成双特异性抗体。Shalaby等，J.Exp.Med.175：217-225
(1992)描述了完全人源化的双特异性抗体F(ab′)2分子的生成。每个Fab′片段由
大肠杆菌分开分泌，并在体外进行定向化学偶联以形成双特异性抗体。如此
形成的双特异性抗体能够结合过表达ErbB2受体的细胞和正常人T细胞，以及
触发人细胞毒性淋巴细胞针对人乳房肿瘤靶的溶解活性。
还描述了从重组细胞培养物直接制备和分离双特异性抗体片段的多种
技术。例如，已使用亮氨酸拉链生成双特异性抗体。Kostelny等，J.Immunol.
148(5)：1547-1553(1992)。将来自Fos和Jun蛋白的亮氨酸拉链肽通过基因融合
与两种不同抗体的Fab′部分连接。抗体同二聚体在铰链区还原而形成单体，
然后重新氧化而形成抗体异二聚体。这种方法也可用于生成抗体同二聚体。
由Hollinger等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90：6444-6448(1993)描述的“双抗体
(diabody)”技术提供了制备双特异性抗体片段的替代机制。该片段包含通过
接头相连的VH和VL，所述接头太短使得同一条链上的两个结构域之间不能
配对。因而，迫使一个片段上的VH和VL结构域与另一个片段上的互补VL和
VH结构域配对，由此形成两个抗原结合位点。还报道了通过使用单链Fv(scFv)
二聚体制备双特异性抗体片段的另一种策略。参见Gruber等，J.Immunol.152：
5368(1994)。
涵盖具有超过两个效价的抗体。例如，可制备三特异性抗体。Tutt等，J.
Immunol.147：60(1991)。
6.异源偶联抗体
异源偶联抗体也在本发明的范围之内。异源偶联抗体由两种共价连接的
抗体构成。此类抗体建议例如用于将免疫系统细胞靶向不想要的细胞(美国
专利No.4,676,980)及用于治疗HIV感染(WO 91/00360；WO 92/200373；EP
03089)。可在体外使用合成蛋白质化学的已知方法制备抗体，包括那些涉及
交联剂的方法。例如，可使用二硫化物交换反应或通过形成硫醚键来构建免
疫毒素。适于此目的的试剂的例子包括亚氨基硫醇酯/盐(iminothiolate)和4-
巯基丁亚氨酸甲酯(methyl-4-mercaptobutyrimidate)及例如美国专利No.
4,676,980中所公开的。
7.多价抗体
多价抗体可以比二价抗体更快地受到表达该抗体所结合抗原的细胞的
内化(和/或异化)。本发明的抗体可以是具有三个或更多抗原结合位点(例
如四价抗体)的多价抗体(不同于IgM类)，其可容易地通过编码抗体多肽链
的核酸的重组表达来生成。多价抗体可包含二聚化结构域和三个或更多抗原
结合位点。优选的二聚化结构域包含(或由其组成)Fc区或铰链区。在这种
情况中，抗体可包含Fc区及Fc区氨基末端的三个或更多抗原结合位点。本文
中优选的多价抗体包含(或由其组成)三个至约八个，但优选四个抗原结合
位点。多价抗体包含至少一条多肽链(且优选两条多肽链)，其中所述多肽
链包含两个或多个可变域。例如，多肽链可包含VD1-(X1)n-VD2-(X2)n-Fc，
其中VD1是第一可变域，VD2是第二可变域，Fc是Fc区的一条多肽链，X1
和X2代表氨基酸或多肽，而n是0或1。例如，多肽链可包含：VH-CH1-柔性
接头-VH-CH1-Fc区链；或VH-CH1-VH-CH1-Fc区链。本文中的多价抗体优
选进一步包含至少两条(且优选四条)轻链可变域多肽。本文中的多价抗体
可包含例如约两条至约八条轻链可变域多肽。本文涵盖的轻链可变域多肽包
含轻链可变域，且任选进一步包含CL结构域。
8.效应器功能的工程改造
可能希望在效应器功能方面修饰本发明的抗体，例如为了增强抗体的抗
体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)和/或补体依赖性细胞毒性(CDC)。这
可通过在抗体Fc区中引入一个或多个氨基酸替代来实现。或者/另外，可在
Fc区中引入半胱氨酸残基，从而容许在该区中形成链间二硫键。如此生成的
同二聚体抗体可具有改善的内化能力和/或提高的补体介导的细胞杀伤和抗
体依赖性细胞毒性(ADCC)。参见Caron等，J.Exp.Med.176：1191-1195(1992)
及Shopes，B.，J.Immunol.148：2918-2922(1992)。具有增强的抗肿瘤活性的同
二聚体抗体还可使用如Wolff等，Cancer Research 53：2560-2565(1993)中描述
的异双功能交联剂来制备。或者，抗体可改造成具有双重Fc区，由此可具有
增强的补体溶解和ADCC能力。参见Stevenson等，Anti-Cancer Drug Design 3：
219-230(1989)。为了提高抗体的血清半衰期，可如例如美国专利No.
5,739,277中所述将补救受体结合表位掺入抗体(尤其是抗体片段)中。在用
于本文时，术语“补救(salvage)受体结合表位”指IgG分子(例如IgG1、IgG2、
IgG3或IgG4)Fc区中负责提高IgG分子体内血清半衰期的表位。
9.免疫偶联物
本发明还关于包含偶联有细胞毒剂的抗体的免疫偶联物(可互换地称作
“抗体-药物偶联物”或“ADC”)，所述细胞毒剂诸如化疗剂、生长抑制剂、毒
素(例如细菌、真菌、植物或动物起源的酶活性毒素或其片段)或放射性同
位素(即放射偶联物)。
在某些实施方案中，免疫偶联物包含抗体和化疗剂或其它毒素。上文已
经描述了可用于生成此类免疫偶联物的化疗剂。可使用的酶活性毒素及其片
段包括白喉毒素A链、白喉毒素的非结合活性片段、外毒素A链(来自铜绿
假单胞菌)、蓖麻毒蛋白A链、相思豆毒蛋白A链、蒴莲根毒蛋白A链、α-帚
曲霉素、油桐(Aleurites fordii)蛋白、香石竹蛋白(dianthin proteins)、美洲商陆
(Phytolaca americana)蛋白(PAPI、PAPII和PAP-S)、苦瓜(momordica charantia)
抑制剂、麻疯树毒蛋白、巴豆毒蛋白、肥皂草(sapaonaria officinalis)抑制剂、
白树毒蛋白、丝林霉素(mitogellin)、局限曲菌素、酚霉素、依诺霉素和单端
孢菌素。多种放射性核素可用于生成放射偶联抗体。实例包括212Bi、131I、131In、
90Y和186Re。抗体和细胞毒剂的偶联物可使用多种双功能蛋白质偶联剂来制
备，诸如N-琥珀酰亚氨基-3-(2-吡啶基二硫代)丙酸酯(SPDP)、亚氨基硫杂环
戊烷(IT)、亚氨酸酯(诸如盐酸己二酰亚氨酸二甲酯)、活性酯类(诸如辛二
酸二琥珀酰亚氨基酯)、醛类(诸如戊二醛)、双叠氮化合物(诸如双(对-叠
氮苯甲酰基)己二胺)、双重氮衍生物(诸如双(对-重氮苯甲酰基)乙二胺)、
二异氰酸酯(诸如甲苯2，6-二异氰酸酯)和双活性氟化合物(诸如1，5-二氟-2，4-
二硝基苯)的双功能衍生物。例如，可如Vitetta等，Science 238：1098(1987)
中所述制备蓖麻毒蛋白免疫毒素。碳-14标记的1-异硫氰酸苯甲基-3-甲基二
亚乙基三胺五乙酸(MX-DTPA)是用于将放射性核苷酸与抗体偶联的示例性
的螯合剂。参见WO 94/11026。
本文还设想了抗体与一种或多种小分子毒素(如加利车霉素、auristatin
肽诸如monomethylauristatin(MMAE)(多拉司他汀的合成类似物)、美登木
素生物碱类诸如DM1、单端孢霉素和CC1065，及这些毒素具有毒素活性的
衍生物)的偶联物。
例示性的免疫偶联物-抗体-药物偶联物
本发明的免疫偶联物(或“抗体-药物偶联物”(“ADC”))可以是下文通式
I，其中抗体经任选的接头(L)与一个或多个药物模块(D)偶联(即共价附着)。
ADC可以包括thioMAb药物偶联物(“TDC”)。
Ab-(L-D)p 式I
因而，抗体可直接地或经接头地偶联至药物。在通式I中，p是每个抗体
的平均药物模块数，其范围可以是例如每个抗体约1个到约20个药物模块，
在某些实施方案中是每个抗体1个到约8个药物模块。本发明包括包含式I抗
体-药物偶联物的混合物的组合物，其中每个抗体的平均药物载荷是约2个至
约5个或约3个至约4个。
a.例示性的接头
接头可以包含一种或多种接头构件。例示性的接头构件包括6-马来酰亚
氨基己酰基(“MC”)、马来酰亚氨基丙酰基(“MP”)、缬氨酸-瓜氨酸(“val-cit”
或“vc”)、丙氨酸-苯丙氨酸(“ala-phe”)、对氨基苄氧羰基(“PAB”)、及那些源
自与接头试剂的偶联的：N-琥珀酰亚氨基4-(2-吡啶基硫基)戊酸酯形成接头
模块4-巯基戊酸(“SPP”)，N-琥珀酰亚氨基4-(N-马来酰亚氨基甲基)环己烷-1
羧酸酯形成接头模块4-((2，5-二氧代吡咯烷-1-基)甲基)环己烷羧酸(“SMCC”，
在本文中也称作“MCC”)，2，5-二氧代吡咯烷-1-基4-(吡啶-2-基二硫烷基)丁酸
酯形成接头模块4-巯基丁酸(“SPDB”)，N-琥珀酰亚氨基(4-碘-乙酰基)氨基苯
甲酸酯(“SIAB”)，亚乙基氧基-CH2CH2O-作为一个或多个重复单元(“EO”或
“PEO”)。本领域已知其他的接头构件，本文中描述了一些。
接头可以是便于在细胞中释放药物的“可切割接头”。例如，可使用酸不
稳定接头(例如腙)、蛋白酶敏感(例如肽酶敏感)接头、光不稳定接头、
二甲基接头或含二硫化物接头(Chari等，Cancer Research 52：127-131(1992)；
美国专利No.5,208,020)。
在某些实施方案中，接头是如下面式II所示的：
-Aa-Ww-Yy- II
其中A是延伸物(stretcher)单元，而a是0到1的整数；W是氨基酸单元，而w是
0到12的整数；Y是间隔物单元，而y是0、1或2；且Ab、D和p如上文通式I
的定义。此类接头的例示性实施方案记载于US 2005-0238649A1，明确收入
本文作为参考。
在有些实施方案中，接头构件可以包含将抗体连接至另一接头构件或药
物模块的“延伸物单元”。例示性的延伸物单元显示于下文(其中波形线指示
共价附着至抗体的位点)：
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在有些实施方案中，接头构件可以包含氨基酸单元。在一个这样的实施
方案中，氨基酸单元容许蛋白酶切割接头，由此便于在暴露于胞内蛋白酶(诸
如溶酶体酶)后从免疫偶联物释放药物。参见例如Doronina等(2003)Nat.
Biotechnol.21：778-784。例示性的氨基酸单元包括但不限于二肽、三肽、四
肽和五肽。例示性的二肽包括：缬氨酸-瓜氨酸(vc或val-cit)；丙氨酸-苯丙氨
酸(af或ala-phe)；苯丙氨酸-赖氨酸(fk或phe-lys)；或N-甲基-缬氨酸-瓜氨酸
(Me-val-cit)。例示性的三肽包括：甘氨酸-缬氨酸-瓜氨酸(gly-val-cit)和甘氨
酸-甘氨酸-甘氨酸(gly-gly-gly)。氨基酸单元可以包含天然存在的氨基酸残
基，以及次要氨基酸(minor amino acid)和非天然存在氨基酸类似物，诸如瓜
氨酸。氨基酸单元可以在它们对特定酶(例如肿瘤相关蛋白酶，组织蛋白酶
B、C和D，或血浆蛋白酶)的酶促切割的选择性方面进行设计和优化。
在有些实施方案中，接头构件可以包含将抗体连接(或是直接的或是通
过延伸物单元和/或氨基酸单元)至药物模块的“间隔物”单元。间隔物单元可
以是“自我牺牲的”(self-immolative)或“非自我牺牲的”。“非自我牺牲的”间隔
物单元指间隔物单元的部分或整体在ADC的酶促(蛋白水解)切割后保持结
合于药物模块的间隔物单元。非自我牺牲的间隔物单元的例子包括但不限于
甘氨酸间隔物单元和甘氨酸-甘氨酸间隔物单元。还涵盖对序列特异性酶促
切割敏感的肽间隔物的其它组合。例如，肿瘤细胞相关蛋白酶对含甘氨酸-
甘氨酸间隔物单元的ADC的酶促切割将导致甘氨酸-甘氨酸-药物模块从
ADC的剩余部分释放。在一个这样的实施方案中，甘氨酸-甘氨酸-药物模块
然后在肿瘤细胞中进行分开的水解步骤，如此从药物模块切割甘氨酸-甘氨
酸间隔物单元。
“自我牺牲的”间隔物单元容许释放药物模块而没有分开的水解步骤。在
某些实施方案中，接头的间隔物单元包含对氨基苄基单元。在一个这样的实
施方案中，将对氨基苯甲醇经酰胺键附着至氨基酸单元，并且在苯甲醇与细
胞毒剂之间生成氨基甲酸酯、甲基氨基甲酸酯或碳酸酯。参见例如Hamann
等(2005)Expert Opin.Ther.Patents(2005)15：1087-1103。在一个实施方案中，
间隔物单元是对氨基苄氧羰基(PAB)。在某些实施方案中，对氨基苄基单元
的亚苯基部分是用Qm取代的，其中Q是-C1-C8烃基、-O-(C1-C8烃基)、-卤素、
-硝基或-氰基；而m是范围为0-4的整数。自我牺牲的间隔物单元的例子进一
步包括但不限于在电子上与对氨基苯甲醇相似的芳族化合物(参见例如US
2005/0256030 A1)，诸如2-氨基咪唑-5-甲醇衍生物(Hay等(1999)Bioorg.Med.
Chem.Lett.9：2237)和邻位或对位氨基苄基乙缩醛。可以使用在酰胺键水解后
发生环化的间隔物，诸如取代的和未取代的4-氨基丁酸酰胺(Rodrigues等，
Chemistry Biology，1995，2，223)；适当取代的双环[2.2.1]和双环[2.2.2]环体系
(Storm，等，J.Amer.Chem.Soc.，1972，94，5815)；及2-氨基苯基丙酸酰胺
(Amsberry等，J.Org.Chem.，1990，55，5867)。消除在甘氨酸a位取代的含胺药
物(Kingsbury等，J.Med.Chem.，1984，27，1447)也是可用于ADC的自我牺牲
的间隔物的例子。
在一个实施方案中，间隔物单元是下文所示分支的双(羟甲基)苯乙烯
(BHMS)单元，其可用于掺入和释放多个药物。
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其中Q是-C1-C8烃基、-O-(C1-C8烃基)、-卤素、硝基或氰基；m是范围为0-4
的整数；n是0或1；而p的范围是1到约20。
在另一个实施方案中，接头L可以为树枝状类型接头，其用于通过支化
多官能接头模块与抗体共价结合一个以上药物模块(Sun等(2002)Bioorganic
& Medicinal Chemistry Letters 12：2213-2215；Sun等(2003)Bioorganic &
Medicinal Chemistry 11：1761-1768)。树枝状接头可以增加药物与抗体的摩尔
比，即载荷，它与ADC的效能相关。因此，如果半胱氨酸改造的抗体仅带有
一个反应性半胱氨酸巯基，那么可以通过树枝状接头结合众多药物模块。
显示了下文通式II的ADC背景中的例示性接头构件及其组合：
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接头构件，包括延伸物、间隔物和氨基酸单元，可以通过本领域已知方
法合成，诸如US 2005-0238649A1中所记载的。
b.例示性的药物模块
(1)美登素和美登木素生物碱类
在有些实施方案中，免疫偶联物包含偶联有一个或多个美登木素生物碱
分子的抗体。美登木素生物碱类是通过抑制微管蛋白多聚化来发挥作用的有
丝分裂抑制剂。美登素最初从东非灌木齿叶美登木(Maytenus serrata)分离
得到(美国专利3,896,111)。随后发现某些微生物也生成美登木素生物碱类，
诸如美登醇和C-3美登醇酯(美国专利4,151,042)。例如下列美国专利公开了
合成美登醇及其衍生物和类似物：4,137,230；4,248,870；4,256,746；4,260,608；
4,265,814；4,294,757；4,307,016；4,308,268；4,308,269；4,309,428；4,313,946；
4,315,929；4,317,821；4,322,348；4,331,598；4,361,650；4,364,866；4,424,219；
4,450,254；4,362,663；及4,371,533。
美登木素生物碱类药物模块在抗体药物偶联物中是有吸引力的药物模
块，因为它们：(i)相对易于通过发酵或发酵产物的化学修饰或衍生化来制备；
(ii)易于用适于通过二硫化物和非二硫化物接头的偶联的官能基衍生化；(iii)
在血浆中稳定；且(iv)有效针对多种肿瘤细胞系。
适于用作美登木素生物碱类药物模块的美登素化合物是本领域公知的，
而且可以依照已知方法从天然来源分离，或是使用遗传工程和发酵技术生产
(US 6790952；US 2005/0170475；Yu et al(2002)PNAS 99：7968-7973)。美登醇
和美登醇类似物也可以依照已知方法合成制备。
例示性的美登木素生物碱类药物模块包括那些具有修饰的芳香环的，诸
如：C-19-脱氯(美国专利No.4256746)(通过安丝菌素(ansamytocin)P2的氢化
铝锂还原来制备)；C-20-羟基(或C-20-脱甲基)+/-C-19-脱氯(美国专利No.
4361650和4307016)(通过使用链霉菌或放线菌的脱甲基化或使用LAH的脱
氯化来制备)；及C-20-脱甲氧基，C-20-酰氧基(-OCOR)，+/-脱氯(美国专利No.
4,294,757)(通过使用酰氯的酰化来制备)，以及在其它位置具有修饰的。
例示性的美登木素生物碱类药物模块还包括那些具有修饰的，诸如：
C-9-SH(美国专利No.4424219)(通过美登醇与H2S或P2S5的反应来制备)；
C-14-烷氧基甲基(脱甲氧基/CH2OR)(US 4331598)；C-14-羟甲基或酰氧甲
基(CH2OH或CH2OAc)(美国专利No.4450254)(自诺卡氏菌制备)；C-15-
羟基/酰氧基(US 4364866)(通过链霉菌对美登醇的转化来制备)；C-15-甲氧
基(美国专利No.4313946和4315929)(自Trewia nudlflora分离)；C-18-N-脱甲
基(美国专利No.4362663和4322348)(通过链霉菌对美登醇的脱甲基化来制
备)；及4，5-脱氧(US 4371533)(通过美登醇的三氯化钛/LAH还原来制备)。
已知美登素化合物上的许多位置作为连接位置是有用的，这取决于连接
的类型。例如，为了形成酯键，具有羟基的C-3位、用羟甲基修饰的C-14位、
用羟基修饰的C-15位和具有羟基的C-20位均是合适的(US 5208020；US
RE39151；US 6913748；US 7368565；US 2006/0167245；US 2007/0037972)。
美登木素生物碱药物模块包括那些具有如下结构的：
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其中波状线表示美登木素生物碱药物模块的硫原子附着至ADC的接头。
R可以独立为H或C1-C6烃基。使酰胺基附着至硫原子的亚烃基链可以为甲基
(methanyl)、乙基(ethanyl)或丙基，即m为1、2或3(US 633410；US 5208020；US
7276497；Chari et al(1992)Cancer Res.52：127-131；Liu et al(1996)Proc.Natl.
Acad.Sci USA 93：8618-8623)。
本发明的化合物涵盖美登木素生物碱药物模块的所有立体异构体，即D
的手性碳处的R和S构型的任何组合。在一个实施方案中，美登木素生物碱药
物模块会具有如下的立体化学：
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美登木素生物碱类药物模块的例示性实施方案包括具有如下结构的
DM1、DM3和DM4：
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其中波形线指示药物的硫原子对抗体-药物偶联物的接头(L)的共价附着(WO
2005/037992；US 2005/0276812A1)。
其它例示性的美登木素生物碱类抗体-药物偶联物具有如下结构和缩写
(其中Ab是抗体，而p是1到约8)：
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在一个实施方案中，当DM4经由SPDB接头连接至抗体的硫醇基时，形
成抗体-药物偶联物(参见美国专利No.6913748和7276497，通过述及将其完
整内容收入本文)。其中DM1经BMPEO接头连接抗体硫醇基的例示性抗体-
药物偶联物具有如下结构和缩写：
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其中Ab是抗体；n是0、1或2；而p是1、2、3或4。
例如下列专利公开了包含美登木素生物碱类的免疫偶联物及其制备方
法和治疗用途：Erickson，et al(2006)Cancer Res.66(8)：4426-4433；美国专利
5,208,020；5,416,064；US 2005/0276812 A1；及欧洲专利EP 0 425 235 B1，明
确将其公开内容收入本文作为参考。
抗体-美登木素生物碱偶联物通过将抗体与美登木素生物碱分子化学连
接且不显著削弱抗体或美登木素生物碱分子的生物学活性来制备。参见例如
美国专利No.5,208,020，明确将其公开内容收入本文作为参考。美登木素生
物碱类可通过已知技术合成或从天然来源分离。例如美国专利5,208,020和上
文提及的其它专利及非专利发表物中公开了合适的美登木素生物碱类，诸如
美登醇和美登醇分子的芳香环或其它位置经过修饰的美登醇类似物，诸如各
种美登醇酯。
本领域知道许多接头团可用于制备抗体-美登木素生物碱偶联物，包括
例如美国专利5,208,020或欧洲专利0 425 235 B1；Chari et al.，Cancer Research
52：127-131(1992)；及US 2005/016993 A1中所公开的，明确将其公开内容收
入本文作为参考。包含接头构件SMCC的抗体-美登木素生物碱类偶联物可以
如US 2005/0276812 A1，“Antibody-drug conjugates and Methods”中所披露的
来制备。接头包含二硫化物基团、硫醚基团、酸不稳定基团、光不稳定基团、
肽酶不稳定基团或酯酶不稳定基团，正如上文所述专利中所公开的。本文中
描述和例示了别的接头。
可使用多种双功能蛋白质偶联剂来制备抗体和美登木素生物碱的偶联
物，诸如N-琥珀酰亚氨基-3-(2-吡啶基二硫代)丙酸酯(SPDP)、琥珀酰亚氨基
-4-(N-马来酰亚氨基甲基)环己烷-1-羧酸酯(SMCC)、亚氨基硫杂环戊烷(IT)、
亚氨酸酯(诸如盐酸己二酰亚氨酸二甲酯)、活性酯类(诸如辛二酸二琥珀
酰亚氨基酯)、醛类(诸如戊二醛)、双叠氮化合物(诸如双(对-叠氮苯甲酰
基)己二胺)、双重氮衍生物(诸如双(对-重氮苯甲酰基)-乙二胺)、二异氰酸
酯(诸如甲苯2，6-二异氰酸酯)和双活性氟化合物(诸如1，5-二氟-2，4-二硝基
苯)的双功能衍生物。在某些实施方案中，偶联剂是N-琥珀酰亚氨基-3-(2-
吡啶基二硫代)丙酸酯(SPDP)(Carlsson et al.，Biochem.J.173：723-737
(1978))或N-琥珀酰亚氨基-4-(2-吡啶基硫代)戊酸酯(SPP)，由此提供二硫键
连接。
根据连接的类型，可将接头附着于美登木素生物碱分子的多个位置。例
如，可使用常规偶联技术通过与羟基的反应来形成酯键。反应可发生在具有
羟基的C-3位置、经羟甲基修饰的C-14位置、经羟基修饰的C-15位置和具有
羟基的C-20位置。在一个实施方案中，在美登醇或美登醇类似物的C-3位置
形成键连接。
(2)Auristatin和多拉司他汀
在有些实施方案中，免疫偶联物包含与多拉司他汀(dolastatin)或多拉司
他汀肽类似物或衍生物(例如auristatin)(美国专利No.5,635,483；5,780,588)
偶联的抗体。多拉司他汀类和auristatin类已经显示出干扰微管动力学、GTP
水解、及核和细胞分裂(Woyke et al(2001)Antimicrob.Agents and Chemother.
45(12)：3580-3584)且具有抗癌(美国专利No.5663149)和抗真菌活性(Pettit et al
(1998)Antimicrob.Agents Chemother.42：2961-2965)。多拉司他汀或auristatin
药物模块可经由肽药物模块的N(氨基)末端或C(羧基)末端附着于抗体(WO
02/088172)。
例示性的auristatin实施方案包括N-末端连接的单甲基auristatin药物模块
DE和DF(US 2005/0238649，披露于Senter et al，Proceedings of the American
Association for Cancer Research，Volume 45，Abstract Number 623，presented
March 28，2004，明确将其公开内容完整收入本文作为参考)。
肽药物模块可以选自下文通式DE和DF：
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其中DE和DF的波形线指示抗体或抗体-接头构件的共价附着位点，且每个位
置是独立的
R2选自H和C1-C8烷基；
R3选自H、C1-C8烷基、C3-C8碳环、芳基、C1-C8烷基-芳基、C1-C8烷基-(C3-C8
碳环)、C3-C8杂环和C1-C8烷基-(C3-C8杂环)；
R4选自H、C1-C8烷基、C3-C8碳环、芳基、C1-C8烷基-芳基、C1-C8烷基-(C3-C8
碳环)、C3-C8杂环和C1-C8烷基-(C3-C8杂环)；
R5选自H和甲基；
或者R4与R5一起形成碳环且具有通式-(CRaRb)n-，其中Ra和Rb独立地选自
H、C1-C8烷基和C3-C8碳环，而n选自2、3、4、5和6；
R6选自H和C1-C8烷基；
R7选自H、C1-C8烷基、C3-C8碳环、芳基、C1-C8烷基-芳基、C1-C8烷基-(C3-C8
碳环)、C3-C8杂环和C1-C8烷基-(C3-C8杂环)；
每个R8独立地选自H、OH、C1-C8烷基、C3-C8碳环和O-(C1-C8烷基)；
R9选自H和C1-C8烷基；
R10选自芳基或C3-C8杂环；
Z为O、S、NH或NR12，其中R12为C1-C8烷基；
R11选自H、C1-C20烷基、芳基、C3-C8杂环、-(R13O)m-R14或
-(R13O)m-CH(R15)2；
m是范围为1-1000的整数；
R13为C2-C8烷基；
R14为H或C1-C8烷基；
R15每次出现独立为H、COOH、-(CH2)n-N(R16)2、-(CH2)n-SO3H或
-(CH2)n-SO3-C1-C8烷基；
R16每次出现独立为H、C1-C8烷基或-(CH2)n-COOH；
R18选自-C(R8)2-C(R8)2-芳基、-C(R8)2-C(R8)2-(C3-C8杂环)和
-C(R8)2-C(R8)2-(C3-C8碳环)；且
n是范围为0到6的整数。
在一个实施方案中，R3、R4和R7独立为异丙基或仲丁基，而R5为-H或甲
基。在一个例示性的实施方案中，R3和R4各自为异丙基，R5为-H，而R7为仲
丁基。
在又一个实施方案中，R2和R6各自为甲基，而R9为-H。
在又一个实施方案中，R8每次出现为-OCH3。
在一个例示性的实施方案中，R3和R4各自为异丙基，R2和R6各自为甲基，
R5为-H，R7为仲丁基，R8每次出现为-OCH3，而R9为-H。
在一个实施方案中，Z为-O-或-NH-。
在一个实施方案中，R10为芳基。
在一个例示性的实施方案中，R10为-苯基。
在一个例示性的实施方案中，若Z为-O-，则R11为-H、甲基或叔丁基。
在一个实施方案中，若Z为-NH，则R11为-CH(R15)2，其中R15为
-(CH2)n-N(R16)2，而R16为-C1-C8烷基或-(CH2)n-COOH。
在另一个实施方案中，若Z为-NH，则R11为-CH(R15)2，其中R15为
-(CH2)n-SO3H。
通式DE的一种例示性auristatin实施方案是MMAE，其中波形线指示共价
附着至抗体-药物偶联物的接头(L)：
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通式DF的一种例示性auristatin实施方案是MMAF，其中波形线指示共价
附着至抗体-药物偶联物的接头(L)(参见US 2005/0238649及Doronina et al.
(2006)Bioconjugate Chem.17：114-124)：
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其它例示性的实施方案包括在五肽auristatin药物模块的C末端具有苯丙
氨酸羧基修饰的单甲基缬氨酸化合物(WO 2007/008848)和在五肽auristatin药
物模块的C末端具有苯丙氨酸侧链修饰的单甲基缬氨酸化合物(WO
2007/008603)。
其它药物模块包括以下MMAF衍生物，其中波形线指示共价附着至抗体
-药物偶联物的接头(L)：
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一方面，可以将亲水性基团在R11处附着于药物模块，所述亲水性基团包
括但不限于三乙二醇酯(triethylene glycol ester，TEG)，如上所述。不限于任何
特定理论，所述亲水性基团有助于药物模块的内在化和不聚集
(non-agglomeration)。
包含auristatin/多拉司他汀或其衍生物的通式I ADC的例示性实施方案记
载于US 2005-0238649及Doronina et al.(2006)Bioconjugate Chem.
17：114-124，明确收入本文作为参考。包含MMAE或MMAF及各种接头构件
的通式I ADC的例示性实施方案具有如下结构和缩写(其中“Ab”是抗体；p
是1到约8；“Val-Cit”或“vc”是缬氨酸-瓜氨酸二肽；而“S”是硫原子)。应当注
意，在本文中硫连接的ADC的某些结构描述中，抗体表示成“Ab-S”，仅仅用
于指明硫连接特征而非指明一个特定硫原子携带多个接头-药物模块。以下
结构左边的圆括号也可以放置在硫原子的左边，在Ab与S之间，这会是本文
全文描述的发明的ADC的等同描述。
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包含MMAF及各种接头构件的通式I ADC的例示性实施方案进一步包括
Ab-MC-PAB-MMAF和Ab-PAB-MMAF。有趣的是，包含经不可蛋白水解切
割的接头附着于抗体的MMAF的免疫偶联物显示出具有与包含经可蛋白水
解切割的接头附着于抗体的MMAF的免疫偶联物相当的活性。参见Doronina
et al.(2006)Bioconjugate Chem.17：114-124。在这种情况中，认为药物释放是
由细胞中的抗体降解来实现的。同上。
典型的是，基于肽的药物模块可通过在两个或多个氨基酸和/或肽片段之
间形成肽键来制备。此类肽键可依照例如肽化学领域众所周知的液相合成法
来制备(参见E.![]()
and K.Lübke，“The Peptides”，volume 1，pp 76-136，
1965，Academic Press)。auristatin/多拉司他汀药物模块可依照以下文献中的方
法来制备：US 2005-0238649 A1；美国专利No.5635483；美国专利No.5780588；
Pettit et al(1989)J.Am.Chem.Soc.111：5463-5465；Pettit et al(1998)
Anti-Cancer Drug Design 13：243-277；Pettit，G.R.，et al.Synthesis，1996，
719-725；Pettit et al(1996)J.Chem.Soc.Perkin Trans.1 5：859-863；及
Doronina(2003)Nat.Biotechnol.21(7)：778-784。
具体而言，通式DF诸如MMAF及其衍生物的auristatin/多拉司他汀药物模
块可以使用US 2005-0238649 A1及Doronina et al.(2006)Bioconjugate Chem.
17：114-124中记载的方法来制备。通式DE诸如MMAE及其衍生物的auristatin/
多拉司他汀药物模块可以使用Doronina et al.(2003)Nat.Biotech.21：778-784
中加载的方法来制备。可以通过常规方法方便地合成药物-接头模块
(moiety)MC-MMAF、MC-MMAE、MC-vc-PAB-MMAF和MC-vc-PAB-MMAE，
例如Doronina et al.(2003)Nat.Biotech.21：778-784及美国专利申请公开号US
2005/0238649 A1中所记载的，然后将它们偶联至感兴趣的抗体。
(3)加利车霉素
在其它实施方案中，免疫偶联物包含偶联有一个或多个加利车霉素分子
的抗体。加利车霉素抗生素家族能够在亚皮摩尔浓度生成双链DNA断裂。关
于加利车霉素家族偶联物的制备参见美国专利No.5,712,374；5,714,586；
5,739,116；5,767,285；5,770,701；5,770,710；5,773,001；5,877,296(都授予美国
Cyanamid公司)。可用的加利车霉素结构类似物包括但不限于γ1I、α2I、α3I、
N-乙酰基-γ1I、PSAG和θI1(Hinman et al.，Cancer Research 53：3336-3342
(1993)；Lode et al.，Cancer Research 58：2925-2928(1998)；及上述授予美国
Cyanamid公司的美国专利)。可与抗体偶联的另一种抗肿瘤药物是QFA，它
是一种抗叶酸药物。加利车霉素和QFA都具有胞内作用位点，且不易穿过质
膜。因此，这些试剂经由抗体介导的内在化的细胞摄取大大增强了它们的细
胞毒效应。
c.其它细胞毒剂
可与抗体偶联的其它抗肿瘤剂包括BCNU、链佐星(streptozoicin)、长春
新碱(vincristine)、5-氟尿嘧啶、美国专利No.5,053,394、5,770,710中记载的
统称为LL-E33288复合物的试剂家族、及埃斯波霉素类(esperamicins)(美国
专利No.5,877,296)。
可用的酶活性毒素及其片段包括白喉毒素A链、白喉毒素的非结合活性
片段、外毒素A链(来自铜绿假单胞菌Pseudomonas aeruginosa)、蓖麻毒蛋
白(ricin)A链、相思豆毒蛋白(abrin)A链、蒴莲根毒蛋白(modeccin)A链、α-
帚曲霉素(sarcin)、油桐(Aleutites fordii)毒蛋白、香石竹(dianthin)毒蛋白、美
洲商陆(Phytolaca americana)毒蛋白(PAPI、PAPII和PAP-S)、苦瓜(Momordica
charantia)抑制物、麻疯树毒蛋白(curcin)、巴豆毒蛋白(crotin)、肥皂草
(sapaonaria officinalis)抑制物、白树毒蛋白(gelonin)、丝林霉素(mitogellin)、
局限曲菌素(restrictocin)、酚霉素(phenomycin)、依诺霉素(enomycin)和单端
孢菌素(trichothecenes)。参见例如1993年10月28日公布的WO 93/21232。
本发明还设想了抗体和具有核酸降解活性的化合物(如核糖核酸酶或
DNA内切核酸酶，诸如脱氧核糖核酸酶；DNA酶)之间形成的免疫偶联物。
在某些实施方案中，免疫偶联物可包含高度放射性原子。多种放射性同
位素可用于生成放射偶联抗体。实例包括At21、I131、I125、Y90、Re186、Re188、
Sm153、Bi212、P32、Pb212和Lu的放射性同位素。在将免疫偶联物用于检测时，
可包含放射性原子用于闪烁照相研究，例如Tc99m或I123，或是包含自旋标记
物用于核磁共振(NMR)成像(也称为磁共振成像，MRI)，诸如碘-123、
碘-131、铟-111、氟-19、碳-13、氮-15、氧-17、钆、锰或铁。
可以已知方式将放射性或其它标记物掺入免疫偶联物。例如，可生物合
成肽，或是通过化学氨基酸合成法合成肽，其中使用涉及例如氟-19代替氢
的合适氨基酸前体。可经肽中的半胱氨酸残基来附着标记物，诸如Tc99m或
I123、Re186、Re188和In111。可以经赖氨酸残基来附着钇-90。IODOGEN法(Fraker
et al.(1978)Biochem.Biophys.Res.Commun.80：49-57)可用于掺入碘-123。
《Monoclonal Antibodies in Immunoscintigraphy》(Chatal，CRC Press，1989)
详细记载了其它方法。
在某些实施方案中，免疫偶联物可以包含偶联至前体药物活化酶的抗
体，所述前体药物活化酶能将前体药物(例如肽基化疗剂，参见WO 81/01145)
转变成活性药物，诸如抗癌药。此类免疫偶联物可用于抗体依赖性酶介导的
前体药物疗法(“ADEPT”)。可以偶联至抗体的酶包括但不限于可将含磷酸盐/
酯的前体药物转变为游离药物的碱性磷酸酶；可将含硫酸盐/酯的前体药物转
变为游离药物的芳基硫酸酯酶；可将无毒5-氟胞嘧啶转变为抗癌药物5-氟尿
嘧啶的胞嘧啶脱氨酶；可将含肽的前体药物转变为游离药物的蛋白酶，诸如
沙雷氏菌蛋白酶、嗜热菌蛋白酶、枯草杆菌蛋白酶、羧肽酶和组织蛋白酶(诸
如组织蛋白酶B和L)；可转化含D-氨基酸替代的前体药物的D-丙氨酰羧肽
酶；可将糖基化前体药物转变为游离药物的碳水化合物切割酶类，诸如β-半
乳糖苷酶和神经氨酸酶；可将β-内酰胺衍生的药物转变为游离药物的β-内酰
胺酶；及可将在其胺氮处分别用苯氧乙酰基或苯乙酰基衍生的药物转变成游
离药物的青霉素酰胺酶，诸如青霉素V酰胺酶或青霉素G酰胺酶。可以通过
本领域众所周知的重组DNA技术将酶共价结合至抗体。参见例如Neuberger
et al.，Nature 312：604-608(1984)。
d.药物载荷
药物载荷(loading)由p表示，即通式I的分子中每个抗体的平均药物模块
数。药物载荷的范围可以为每个抗体1-20个药物模块(D)。通式I的ADC包括
偶联有一定范围(1-20个)药物模块的抗体的集合。来自偶联反应的ADC制
备物中每个抗体的平均药物模块数可以通过常规手段来表征，诸如质谱、
ELISA测定法和HPLC。还可以测定ADC在p方面的定量分布。在有些情况中，
将p为某数值时的同质ADC从具有其它药物载荷的ADC中分离、纯化和表征
可以通过诸如反相HPLC或电泳的手段来实现。式I抗体-药物偶联物的药物配
制剂可以如此是抗体连接1、2、3、4或更多个药物模块的此类偶联物的异质
混合物。
对于有些抗体-药物偶联物，p可能受到抗体上附着位点数目的限制。例
如，若附着是半胱氨酸硫醇，正如上文例示性实施方案中的那样，则抗体可
能只有一个或数个半胱氨酸硫醇基，或者可能只有一个或数个有足够反应性
的硫醇基，可附着接头。在某些实施方案中，较高的药物载荷，例如p＞5，
可引起某些抗体-药物偶联物的聚集、不溶性、毒性或丧失细胞通透性。在
某些实施方案中，本发明ADC的药物载荷的范围为1到约8；约2到约6；或约
3到约5。事实上，对于某些ADC已经显示了每个抗体的药物模块的最佳比率
可以为小于8，可以为约2到约5。参见US 2005-0238649A1。
在某些实施方案中，在偶联反应中少于理论最大值的药物模块偶联至抗
体。抗体可包含例如赖氨酸残基，其不与药物-接头中间物或接头试剂起反
应，如下文所讨论的。一般而言，抗体不包含许多游离的和反应性的半胱氨
酸硫醇基，其可连接药物模块；事实上，抗体中的大多数半胱氨酸硫醇基以
二硫桥形式存在。在某些实施方案中，可以在部分或完全还原性条件下用还
原剂诸如二硫苏糖醇(DTT)或三羰基乙基膦(TCEP)还原抗体以产生反应性半
胱氨酸硫醇基。在某些实施方案中，将抗体置于变性条件以暴露反应性亲核
基团，诸如赖氨酸或半胱氨酸。
ADC的载荷(药物/抗体比率)可以以不同方式来控制，例如通过：(i)限
制药物-接头中间物或接头试剂相对于抗体的摩尔过量，(ii)限制偶联反应的
时间或温度，和(iii)半胱氨酸硫醇修饰的部分或限制还原性条件。
应当理解，若超过一个亲核基团与药物-接头中间物或者与接头试剂和
接下来的药物模块试剂起反应，则所得产物是具有一个或多个药物模块附着
于抗体之分布的ADC化合物混合物。可以通过对抗体特异性的和对药物特异
性的双重ELISA抗体测定法自混合物计算每个抗体的平均药物数。混合物中
的各种ADC分子可以通过质谱来鉴定，并通过HPLC来分离，例如疏水相互
作用层析(参见例如McDonagh et al(2006)Prot.Engr.Design & Selection
19(7)：299-307；Hamblett et al(2004)Clin.Cancer Res.10：7063-7070；Hamblett，
K.J.等，“Effect of drug loading on the pharmacology，pharmacokinetics，and
toxicity of an anti-CD30 antibody-drug conjugate，”摘要号624，American
Association for Cancer Research，2004 Annual Meeting，2004年3月27-31日，
Proceedings of the AACR，卷45，March 2004；Alley，S.C.等，“Controlling the
location of drug attachment in antibody-drug conjugates，”摘要号627，American
Association for Cancer Research，2004 Annual Meeting，2004年3月27-31日，
Proceedings of the AACR，卷45，March 2004)。在某些实施方案中，可以通过
电泳或层析从偶联混合物中分离具有均一载荷值的同质ADC。
e.制备免疫偶联物的某些方法
可以采用本领域技术人员知道的有机化学反应、条件和试剂通过数种路
径来制备通式I的ADC，包括：(1)抗体的亲核基团经共价键与二价接头试剂
反应，经共价键形成Ab-L，接着与药物模块D反应；和(2)药物模块的亲核基
团与二价接头试剂反应，经共价键形成D-L，接着与抗体的亲核基团反应。
经后一种路径制备通式I的ADC的例示性方法记载于US 2005-0238649A1，明
确收入本文作为参考。
抗体的亲核基团包括但不限于：(i)N末端胺基；(ii)侧链胺基，例如赖
氨酸；(iii)侧链硫醇基，例如半胱氨酸；和(iv)糖基化抗体中糖的羟基或氨
基。胺、硫醇和羟基是亲核的，能够与接头模块上的亲电子基团反应而形成
共价键，而接头试剂包括：(i)活性酯类，诸如NHS酯、HOBt酯、卤代甲酸
酯和酸性卤化物；(ii)烷基和苄基卤化物，诸如卤代乙酰胺；(iii)醛类、酮
类、羧基和马来酰亚胺基团。某些抗体具有可还原的链间二硫键，即半胱氨
酸桥。可通过还原剂诸如DTT(二硫苏糖醇)或三羰基乙基膦(TCEP)处理使
抗体完全或部分还原，从而具有与接头试剂偶联的反应活性。每个半胱氨酸
桥理论上将形成两个反应性硫醇亲核体。可经由赖氨酸的修饰将额外亲核基
团引入抗体，例如通过使赖氨酸残基与2-亚氨基硫杂环戊烷(Traut氏试剂)
起反应，导致胺转变为硫醇。可以通过导入一个、两个、三个、四个或更多
个半胱氨酸残基(例如通过制备包含一个或多个非天然半胱氨酸氨基酸残基
的变体抗体)而将反应性硫醇基导入抗体。
还可通过抗体上的亲电子基团(诸如醛或酮羰基)与接头试剂或药物上
的亲核基团之间的反应来生成本发明的抗体-药物偶联物。接头试剂上的有
用亲核基团包括但不限于酰肼、肟、氨基、肼、缩氨基硫脲、肼羧酸酯和芳
基酰肼。在一个实施方案中，修饰抗体以导入能够与接头试剂或药物上的亲
核取代基起反应的亲电子模块。在另一个实施方案中，可以用例如高碘酸盐
氧化剂氧化糖基化抗体的糖，从而形成可与接头试剂或药物模块的胺基团反
应的醛或酮基团。所得亚胺Schiff碱基可形成稳定的连接，或者可以用例如
硼氢化物试剂还原而形成稳定的胺连接。在一个实施方案中，糖基化抗体的
碳水化合物部分与半乳糖氧化酶或偏高碘酸钠的反应可以在抗体中生成羰
基(醛基和酮基)，它可与药物上的适宜基团反应(Hermanson，Bioconjugate
Techniques)。在另一个实施方案中，包含N-末端丝氨酸或苏氨酸残基的抗体
可以与偏高碘酸钠反应，导致在第一个氨基酸处生成醛(Geoghegan & Stroh，
(1992)Bioconjugate Chem.3：138-146；US 5362852)。这样的醛可与药物模块
或接头亲核体反应。
药物模块上的亲核基团包括但不限于：胺、硫醇、羟基、酰肼、肟、肼、
缩氨基硫脲、肼羧酸酯和芳基酰肼基团，它们能够与接头模块上的亲电子基
团反应而形成共价键，而接头试剂包括：(i)活性酯类，诸如NHS酯、HOBt
酯、卤代甲酸酯和酸性卤化物；(ii)烷基和苯甲基卤化物，诸如卤代乙酰胺；
(iii)醛类、酮类、羧基和马来酰亚胺基团。
本发明的化合物明确涵盖但不限于用如下交联试剂制备的ADC：BMPS、
EMCS、GMBS、HBVS、LC-SMCC、MBS、MPBH、SBAP、SIA、SIAB、
SMCC、SMPB、SMPH、磺基-EMCS、磺基-GMBS、磺基-KMUS、磺基-MBS、
磺基-SIAB、磺基-SMCC和磺基-SMPB、及SVSB(琥珀酰亚氨基-(4-乙烯基
砜)苯甲酸酯)，它们可通过商业途径获得(例如Pierce Biotechnology，Inc.，
Rockford，IL.，U.S.A；参见2003-2004年度应用手册和产品目录(2003-2004
Applications Handbook and Catalog)第467-498页)。
还可使用多种双功能蛋白质偶联剂来制备包含抗体和细胞毒剂的免疫
偶联物，诸如N-琥珀酰亚氨基-3-(2-吡啶基二硫代)丙酸酯(SPDP)、琥珀酰亚
氨基-4-(N-马来酰亚氨基甲基)环己烷-1-羧酸酯(SMCC)、亚氨基硫杂环戊烷
(IT)、亚氨酸酯(诸如盐酸己二酰亚氨酸二甲酯)、活性酯类(诸如辛二酸二
琥珀酰亚氨基酯)、醛类(诸如戊二醛)、双叠氮化合物(诸如双(对-叠氮苯
甲酰基)己二胺)、双重氮衍生物(诸如双(对-重氮苯甲酰基)-乙二胺)、二异
硫氰酸酯(诸如甲苯2，6-二异氰酸酯)和双活性氟化合物(诸如1，5-二氟-2，4-
二硝基苯)的双功能衍生物。例如，可如Vitetta et al.，Science 238：1098(1987)
中所述制备蓖麻毒蛋白免疫毒素。碳-14标记的1-异硫氰酸苯甲基-3-甲基二
亚乙基三胺五乙酸(MX-DTPA)是用于将放射性核苷酸与抗体偶联的例示性
螯合剂。参见WO94/11026。
或者，可通过例如重组技术或肽合成来制备包含抗体和细胞毒剂的融合
蛋白。重组DNA分子可以包含各自编码偶联物的抗体和细胞毒部分的区域，
彼此或是毗邻或是由编码接头肽的区域分开，该接头肽不破坏偶联物的期望
特性。
在又一个实施方案中，可以将抗体与“受体”(诸如链霉亲合素)偶联从
而用于肿瘤预先靶向，其中对患者施用抗体-受体偶联物，接着使用清除剂
由循环中清除未结合的偶联物，然后施用与细胞毒剂(如放射性核苷酸)偶
联的“配体”(如亲合素)。
例示性的免疫偶联物-Thio-抗体药物偶联物
a.半胱氨酸改造抗FcRH5抗体的制备
可通过多种方法制备编码本发明的亲本抗FcRH5抗体和半胱氨酸改造
抗FcRH5抗体的氨基酸序列变体的DNA，包括但不限于自天然来源分离(在
天然存在的氨基酸序列变体的情况中)、通过定点诱变(或寡核苷酸介导的
诱变)(Carter等(1985)Nucleic Acids Res.13：4431-4443；Ho等(1989)Gene
(Amst.)77：51-59；Kunkel等(1987)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 82：488；Liu等
(1998)J.Biol.Chem.273：20252-20260)、PCR诱变(Higuchi，(1990)于PCR
Protocols，pp.177-183，Academic Press；Ito等(1991)Gene 102：67-70；Bernhard
等(1994)Bioconjugate Chem.5：126-132；及Vallette等(1989)Nuc.Acids Res.
17：723-733)和对较早制备的编码多肽的DNA的盒式诱变(Wells等(1985)
Gene 34：315-323)来制备。诱变方案、试剂盒和试剂可通过商业途径获得，
例如![]()
多重定点诱变试剂盒(Stratagene，La Jolla，CA)。还可以使
用双链质粒DNA作为模板通过基于PCR的诱变通过寡核苷酸介导的诱变来
生成单一诱变(Sambrook和Russel，(2001)Molecular Cloning：A Laboratory
Manual，第3版；Zoller等(1983)Methods Enzymol.100：468-500；Zoller，M.J.
和Smith，M.(1982)Nucl.Acids Res.10：6487-6500)。还可以通过限制性片段操
作或通过使用合成寡核苷酸的交叠延伸PCR构建重组抗体的变体。诱变引物
编码半胱氨酸密码子替换物。标准诱变技术可以用于产生编码此类突变型半
胱氨酸改造抗体的DNA(Sambrook等，Molecular Cloning，A Laboratory
Manual，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，N.Y.，1989；
及Ausubel等，Current Protocols in Molecular Biology，Greene Publishing and
Wiley-Interscience，New York，N.Y.，1993)。
噬菌体展示技术(McCafferty等，(1990)Nature 348：552-553)可用于在体
外从来自未免疫供体的免疫球蛋白可变域(V)基因全集生成抗FcRH5人抗体
和抗体片段。依照这种技术，将抗体可变域基因以符合读码框的方式克隆入
丝状噬菌体诸如M13或fd的主要或次要外壳蛋白基因，并在噬菌体颗粒表面
上展示为功能性抗体片段。因为丝状噬菌体颗粒包含噬菌体基因组的单链
DNA拷贝，以抗体的功能特性为基础进行的选择也导致编码展示那些特性的
抗体的基因得到选择。如此，噬菌体模拟B细胞的一些特性(Johnson等(1993)
Current Opinion in Structural Biology 3：564-571；Clackson等(1991)Nature，
352：624-628；Marks等(1991)J.Mol.Biol.222：581-597；Griffith等(1993)
EMBO J.12：725-734；US 5565332；US 5573905；US 5567610；US 5229275)。
抗FcRH5抗体可以使用已知的寡肽合成方法来化学合成，或者可以使用
重组技术来制备和纯化。适宜的氨基酸序列或其部分可以使用固相技术通过
直接肽合成来生成(Stewart等，Solid-Phase Peptide Synthesis，(1969)W.H.
Freeman Co.，San Francisco，CA；Merrifield，(1963)J.Am.Chem.Soc.，
85：2149-2154)。体外蛋白质合成可以使用手动技术或通过自动化来进行。自
动化固相合成可以例如采用受t-BOC或Fmoc保护的氨基酸并使用Applied
Biosystems肽合成仪(Foster City，CA)依照制造商的说明书来进行。抗FcRH5
抗体或FcRH5多肽的各个部分可以分开地化学合成，并使用化学或酶促方法
联合以生成期望的抗FcRH5抗体或FcRH5多肽。
已经开发了用于生成抗体片段的多种技术。传统上，通过蛋白水解消化
完整抗体来衍生这些片段(Morimoto等(1992)Journal of Biochemical and
Biophysical Methods 24：107-117；及Brennan等(1985)Science，229：81)，或者
直接由重组宿主细胞生成这些片段。Fab、Fv和scFv抗FcRH5抗体片段都可
在大肠杆菌中表达及由大肠杆菌分泌，如此容许容易地生成大量的这些片
段。可以从上文讨论的噬菌体抗体库中分离抗体片段。或者，可以直接从大
肠杆菌回收Fab′-SH片段并化学偶联以形成F(ab′)2片段(Carter等(1992)
Bio/Technology 10：163-167)，或者，直接从重组宿主细胞培养物分离F(ab′)2
片段。抗FcRH5抗体可以是单链Fv片段(scFv)(WO 93/16185；US 5571894；US
5587458)。抗FcRH5抗体片段还可以是“线性抗体”(US 5,641,870)。此类线性
抗体片段可以是单特异性的或双特异性的。
下文描述主要涉及通过培养经包含抗FcRH5抗体编码核酸的载体转化
或转染的细胞来生成抗FcRH5抗体。编码抗FcRH5抗体的DNA可以得自认为
具有抗FcRH5抗体mRNA且以可检测水平表达之的组织制备的cDNA文库。
因而，人抗FcRH5抗体或FcRH5多肽DNA可以方便地得自自人组织制备的
cDNA文库。抗FcRH5抗体编码基因还可以得自基因组文库或已知的合成规
程(例如自动化核酸合成)。
本发明的设计、选择和制备方法能够得到具有亲电子官能度
(functionality)反应性的半胱氨酸改造抗FcRH5抗体。这些方法进一步能够获
得抗体偶联物化合物，诸如在指定的、设计的、选择性的位点上具有药物分
子的抗体-药物偶联物(ADC)化合物。抗体表面上的反应性半胱氨酸残基容许
通过硫醇反应性基团，诸如马来酰亚胺或卤代乙酰基特异性地偶联药物模
块。Cys残基的硫醇官能度与马来酰亚胺基团的亲核反应性高于蛋白质中任
何其它氨基酸官能度，诸如赖氨酸残基的氨基或N-末端氨基约1000倍。碘乙
酰基和马来酰亚胺试剂中的硫醇特异性官能度可以与胺基团反应，但需要更
高的pH(＞9.0)和更长的反应时间(Garman，1997，Non-Radioactive Labelling：A
Practical Approach，Academic Press，London)。可以通过标准Ellman测定法来
估计蛋白质中游离硫醇的量。免疫球蛋白M为二硫化物连接的五聚体的例
子，而免疫球蛋白G为内部二硫桥将各亚基键合在一起的蛋白质的例子。在
诸如这种蛋白质中，用诸如二硫苏糖醇(DTT)或硒醇还原二硫键(Singh等
(2002)Anal.Biochem.304：147-156)是产生反应性游离硫醇所需的。这种方法
可以导致抗体的三级结构和抗原结合特异性丧失。
PHESELECTOR(用于选择反应性硫醇的噬菌体ELISA)测定法容许以
ELISA噬菌体形式检测抗体中反应性半胱氨酸基团，由此辅助半胱氨酸改造
抗体的设计(Junutula，J.R.et al.(2008)J Immunol Methods 332：41-52；WO
2006/034488；US 2007/0092940)。在孔表面上包被半胱氨酸改造抗体，随后
与噬菌体颗粒一起温育，添加HRP标记的二抗，并检测吸光度。可以以快速、
有力和高流通量方式筛选噬菌体上展示的突变蛋白。可以使用与从抗体或其
它蛋白质的随机蛋白质-噬菌体文库鉴定游离Cys掺入的适当反应性位点相
同的方法生成半胱氨酸改造抗体的文库并且进行结合选择。这项技术包括使
噬菌体上展示的半胱氨酸突变蛋白与也为硫醇反应性的亲和试剂或报告基
团反应。
PHESELECTOR测定法容许筛选抗体中的反应性硫醇基团。通过该方法
鉴定A121C变体是例示性的。可以高效地搜索整个Fab分子以鉴定更多的带
有反应性硫醇基团的ThioFab变体。采用参数，表面可及分数(fractional surface
accessibility)来鉴定和量化溶剂对多肽中氨基酸残基的可及性。将表面可及性
表述为可以由溶剂分子，例如水接触的表面积![]()
水占据的空间近似为![]()
半径球体。软件为自由可获得的或可许可的(Secretary to CCP4，Daresbury
Laboratory，Warrington，WA4 4AD，United Kingdom，Fax：(+44)1925 603825，
或通过因特网：www.ccp4.ac.uk/dist/html/INDEX.html)，如使用计算具有已知
X射线晶体学衍生坐标的蛋白质的每个氨基酸的表面可及性的算法的晶体学
程序CCP4 Suite(“The CCP4 Suite：Programs for Protein Crystallography”
(1994)Acta.Cryst.D50：760-763)。执行表面可及性计算的两种例示性软件模
块为“AREAIMOL”和“SURFACE”，其基于B.Lee和F.M.Richards(1971)J.Mol.
Biol.55：379-400的算法。AREAIMOL将蛋白质的溶剂可及表面定义为探针球
(probe sphere)(代表溶剂分子)在蛋白质的Van der Waals表面上翻转时其中心
的位置。AREAIMOL如下计算溶剂可及表面积，即在关于每个原子的扩充球
体上产生表面点(距原子中心的距离等于原子和探针半径的总和)，并且消
除那些位于与相邻原子相关的等同球体内的点。AREAIMOL找到了PDB坐标
文件中原子的溶剂可及面积并概括了残基、链和整个分子的可及面积。可以
将各原子的可及面积(或面积差)存储成假拟-PDB输出文件。AREAIMOL
假设了每个成分的单一半径并仅识别有限数量的不同成分。
AREAIMOL和SURFACE报导了绝对可及性，即平方埃![]()
数。通过参比
多肽内氨基酸相关标准状态来计算表面可及分数。参比状态为三肽
Gly-X-Gly，其中X为感兴趣的氨基酸，且参比状态应为“扩展的”构象，即像
那些在β链中的构象。扩展的构象使X的可及性达到最大值。用计算的可及面
积除以Gly-X-Gly三肽参比状态中的可及面积并报告商数，其为可及性分数。
可及性百分比为可及性分数乘以100。计算表面可及性的另一种例示性算法
基于程序xsae的SOLV模块(Broger，C.，F.Hoffman-LaRoche，Basel)，它基于多
肽的X射线坐标计算氨基酸残基对水球体的可及性分数。可以使用可得到的
晶体结构信息来计算抗体中每个氨基酸的表面可及性分数(Eigenbrot等
(1993)J Mol Biol.229：969-995)。
编码半胱氨酸改造抗体的DNA易于使用常规规程来分离和测序(例如通
过使用能够与编码鼠抗体重链和轻链的基因特异性结合的寡核苷酸探针)。
杂交瘤细胞充当此类DNA的来源。一旦分离，可以将DNA置入表达载体，
然后转染入原本不生成抗体蛋白质的宿主细胞，诸如大肠杆菌细胞、猿COS
细胞、中国仓鼠卵巢(CHO)细胞或其它哺乳动物宿主细胞，诸如骨髓瘤细胞
(US 5807715；US 2005/0048572；US 2004/0229310)，以获得单克隆抗体在重
组宿主细胞中的合成。
在设计和选择后，可如下生成具有改造的、高度反应性的未配对的Cys
残基的半胱氨酸改造抗体，例如ThioFab：(i)在细菌例如大肠杆菌系统(Skerra
等(1993)Curr.Opinion in Immunol.5：256-262；Plückthun(1992)Immunol.
Revs.130：151-188)或哺乳动物细胞培养物系统(WO 01/00245)例如中国仓鼠
卵巢细胞(CHO)中表达；和(ii)使用常用的蛋白质纯化技术纯化(Lowman等
(1991)J.Biol.Chem.266(17)：10982-10988)。
改造的Cys硫醇基团与亲电子的接头试剂和药物-接头中间体起反应而
形成半胱氨酸改造抗体-药物偶联物和其它经标记的半胱氨酸改造抗体。半
胱氨酸改造抗体的和存在于亲本抗体中的、配对并形成链间和链内二硫键的
Cys残基不具有任何反应性硫醇基团(除非用还原剂处理)且不与亲电子的
接头试剂或药物-接头中间体起反应。新近改造的Cys残基可以保持不配对，
而且能够与亲电子的接头试剂或药物-接头中间体(诸如药物-马来酰亚胺)
起反应(即偶联)。例示性的药物-接头中间体包括：MC-MMAE、MC-MMAF、
MC-vc-PAB-MMAE和MC-vc-PAB-MMAF。重链和轻链中经改造的Cys残基
的结构位置依照连续编号系统来编号。此连续编号系统与自N末端起始的
Kabat编号系统(Kabat等(1991)Sequences of Proteins of Immunological
Interest，第5版，Public Health Service，National Institutes of Health，Bethesda，
MD)有关，与Kabat编号方案(底行)的区别在于标示为a、b、c的插入。使
用Kabat编号系统，实际的线性氨基酸序列可包含减少的或添加的氨基酸，
对应于可变域FR或CDR中的缩短或插入。经半胱氨酸改造的重链变体位点通
过连续编号方式和Kabat编号方案来标示。
在一个实施方案中，通过包括下列步骤的方法制备半胱氨酸改造的抗
FcRH5抗体：
(a)用半胱氨酸替代亲代抗FcRH5抗体的一个或多个氨基酸残基；和
(b)通过使半胱氨酸改造的抗FcRH5抗体与巯基-反应试剂反应测定半胱氨
酸改造的抗体的巯基反应性(thiol reactivity)。
半胱氨酸改造的抗体可以比亲代抗体更具与巯基-反应试剂的反应性。
游离半胱氨酸氨基酸残基可以位于重链或轻链中或恒定域或可变域
(区)中。还可以通过用一个或多个半胱氨酸氨基酸替代抗体片段的氨基酸
来改造抗体片段，例如Fab，以便形成半胱氨酸改造的抗体片段。
本发明的另一个实施方案提供了制备半胱氨酸改造的抗FcRH5抗体的
方法，包括：
(a)将一个或多个半胱氨酸氨基酸引入亲代抗FcRH5抗体以便生成半胱氨
酸改造的抗FcRH5抗体；和
(b)测定半胱氨酸改造的抗体与巯基-反应试剂的巯基反应性；
其中半胱氨酸改造的抗体比亲代抗体更具与巯基-反应试剂的反应性。
制备半胱氨酸改造的抗体的方法的步骤(a)可以包含：
(i)诱变编码半胱氨酸改造的抗体的核酸序列；
(ii)表达半胱氨酸改造的抗体；和
(iii)分离和纯化半胱氨酸改造的抗体。
制备半胱氨酸改造的抗体的方法的步骤(b)可以包含表达选自噬菌体或
噬菌粒颗粒的病毒颗粒上的半胱氨酸改造的抗体。
制备半胱氨酸改造的抗体的方法的步骤(b)还可以包含：
(i)使半胱氨酸改造的抗体与巯基-反应性亲和试剂反应而生成亲和标记的
半胱氨酸改造的抗体；和
(ii)测定亲和标记的半胱氨酸改造的抗体与俘获介质的结合。
本发明的另一个实施方案为筛选带有高反应性的未配对的半胱氨酸氨
基酸的半胱氨酸改造的抗体的巯基反应性的方法，包含：
(a)将一个或多个半胱氨酸氨基酸导入亲代抗体以便产生半胱氨酸改造的
抗体；
(b)使半胱氨酸改造的抗体与巯基-反应性亲和试剂反应而生成亲和标记的
半胱氨酸改造的抗体；和
(c)测定亲和标记的半胱氨酸改造的抗体与俘获介质的结合；和
(d)测定半胱氨酸改造的抗体与巯基-反应试剂的巯基反应性。
筛选半胱氨酸改造的抗体的方法的步骤(a)可以包含：
(i)诱变编码半胱氨酸改造的抗体的核酸序列；
(ii)表达半胱氨酸改造的抗体；和
(iii)分离和纯化半胱氨酸改造的抗体。
筛选半胱氨酸改造的抗体的方法的步骤(b)可以包含表达选自噬菌体或
噬菌粒颗粒的病毒颗粒上的半胱氨酸改造的抗体。
筛选半胱氨酸改造的抗体的方法的步骤(b)还可以包含：
(i)使半胱氨酸改造的抗体与巯基-反应性亲和试剂反应而生成亲和标记的
半胱氨酸改造的抗体；和
(ii)测定亲和标记的半胱氨酸改造的抗体与俘获介质的结合。
b.抗FcRH5 IgG变体的半胱氨酸改造
通过本文所述半胱氨酸工程改造方法，将半胱氨酸在重链118(EU编号
方式)(相当于连续编号方式的重链第118位)位点处导入全长、嵌合亲本单
克隆抗FcRH5抗体，或者在轻链205(Kabat编号方式)(相当于连续编号方式
的轻链第209位)位点处导入全长、嵌合亲本单克隆抗FcRH5抗体。
生成了在重链118(EU编号方式)处具有半胱氨酸的半胱氨酸改造抗体：
(a)thio-hu10A8 v1-HC(A118C)，其具有重链序列(SEQ ID NO：42)和轻链序列
(SEQ ID NO：41)，图12。
生成了在轻链205(Kabat编号方式)处具有半胱氨酸的半胱氨酸改造抗
体：(a)thio-hu10A8 v1-LC9(V205C)，其具有重链序列(SEQ ID NO：44)和轻
链序列(SEQ ID NO：43)，图13。
通过含1mM半胱氨酸的培养基中的瞬时发酵，在CHO(中国仓鼠卵巢)
细胞中表达这些半胱氨酸改造的单克隆抗体。
c.经过标记的半胱氨酸改造的抗FcRH5抗体
半胱氨酸改造的抗FcRH5抗体可以位点特异性地和有效地与硫醇反应
性试剂偶联。硫醇反应性试剂可以是多官能接头试剂(multifunctional linker
reagent)；捕捉(即亲和、标记)试剂(例如生物素-接头试剂)；检测标记物
(例如荧光团试剂)；固相固定化试剂(例如SEPHAROSETM、聚苯乙烯或玻
璃)；或药物-接头中间体。硫醇反应性试剂的一个例子是N-乙基马来酰亚胺
(NEM)。在一个例示性的实施方案中，ThioFab与生物素-接头试剂反应得到
生物素化的ThioFab，通过这种方式可以检测和测量改造的半胱氨酸残基的
存在和反应性。ThioFab与多官能接头试剂反应得到带有可以与药物模块试
剂或其它标记物进一步反应的官能化接头的ThioFab。ThioFab与药物-接头中
间体反应得到ThioFab药物偶联物。
本文所述例示性方法一般可应用于鉴定和生产抗体，并且更一般地通过
应用本文所述的设计和筛选步骤用于其它蛋白质。
此类办法可应用于偶联其它硫醇反应性试剂，其中反应性基团是例如马
来酰亚胺、碘乙酰胺、吡啶基二硫化物或其它硫醇反应性偶联配偶体
(Haugland，2003，Molecular Probes Handbook of Fluorescent Probes and
Research Chemicals，Molecular Probes，Inc.；Brinkley，1992，Bioconjugate Chem.
3:2；Garman，1997，Non-Radioactive Labelling：A Practical Approach，Academic
Press，London；Means(1990)Bioconjugate Chem.1:2；Hermanson，G.in
Bioconjugate Techniques(1996)Academic Press，San Diego，pp.40-55，
643-671)。硫醇反应性试剂可以是药物模块；荧光团，诸如荧光染料，像荧
光素或若丹明；用于成像的螯合剂或放射性治疗金属；肽基或非肽基标记物
或检测标记；或清除改性剂(clearance-modifying agent)，诸如聚乙二醇的各
种异构体；结合第三种成分的肽或另一种碳水化合物或亲脂性试剂。
d.半胱氨酸改造的抗FcRH5抗体的用途
半胱氨酸改造的抗FcRH5抗体及其偶联物可用作治疗和/或诊断试剂。本
发明进一步提供了预防、管理、治疗或改善与B细胞相关病症有关的一种或
多种症状的方法。具体而言，本发明提供了预防、管理、治疗或改善与细胞
增殖性病症有关的一种或多种症状的方法，诸如癌症，例如淋巴瘤、非何杰
金氏淋巴瘤(NHL)、攻击性NHL、复发性攻击性NHL、复发性无痛性NHL、
顽固性NHL、顽固性无痛性NHL、慢性淋巴细胞性白血病(CLL)、小淋巴细
胞淋巴瘤、白血病、毛细胞白血病(HCL)、急性淋巴细胞性白血病(ALL)和套
细胞淋巴瘤。本发明还进一步提供了诊断FcRH5相关病症或发生此类病症的
素因的方法，以及鉴定优先结合B细胞结合(cell-associated)FcRH5多肽的抗
体和抗体的抗原结合片段的方法。
本发明的另一个实施方案致力于半胱氨酸改造的抗FcRH5抗体用于制
备药物的用途，所述药物在对B细胞相关病症有响应的疾患的治疗中是有用
的。
e.半胱氨酸改造的抗体药物偶联物(Thio-抗体药物偶联物(TDC))
本发明的另一个方面是抗体-药物偶联物化合物，其包含半胱氨酸改造
的抗FcRH5抗体(Ab)和auristatin药物模块(D)，其中半胱氨酸改造的抗体经由
一个或多个游离的半胱氨酸氨基酸通过接头模块(L)附着至D；该化合物具有
式I：
Ab-(L-D)p I
其中p为1，2，3，或4；且其中所述半胱氨酸改造的抗体是通过如下方法制备
的，即包括用一个或多个游离的半胱氨酸氨基酸替换亲本抗FcRH5抗体的一
个或多个氨基酸残基。
本发明的另一个方面是包含式I的抗体-药物化合物的混合物的组合物，
其中每个抗体的平均药物载荷是约2个至约5个或约3个至约4个。
半胱氨酸改造的抗FcRH5抗体药物偶联物的潜在优点包括安全性改善
(治疗指数更大)；PK参数改善；抗体链间二硫键得到保留，这可稳定偶联
物并保留其活性结合构象；药物偶联位点确定；及自半胱氨酸改造抗体与药
物-接头试剂的偶联制备半胱氨酸改造抗体药物偶联物导致更均一的产物。
接头
“接头”、“接头单元”或“连接”指包含使抗体共价附着于药物模块的共价
键或原子链的化学模块。在各个实施方案中，接头以L表示。“接头”(L)为可
用于连接一个或多个药物模块(D)和抗体单元(Ab)而形成通式I的抗体-药物
偶联物(ADC)的双功能或多功能模块。可以使用具有供结合药物和抗体用的
反应性官能度的接头而便利地制备抗体-药物偶联物(ADC)。半胱氨酸改造抗
体(Ab)的半胱氨酸硫醇可以与接头试剂、药物模块或药物-接头中间体的亲电
子官能团形成键。
一方面，接头具有反应性位点，该位点具有与存在于抗体上的亲核半胱
氨酸具有反应性的亲电子基团。抗体的半胱氨酸硫醇与接头上的亲电子基团
具有反应性并且与接头形成共价键。有用的亲电子基团包括但不限于马来酰
亚胺和卤代乙酰胺基团。
接头包括：二价基，诸如烷基二基(alkyldiyl)、亚芳基、亚杂芳基；部分
诸如-(CR2)nO(CR2)n-、烷氧基重复单元(例如聚亚乙基氧基(polyethylenoxy)、
PEG、聚亚甲基氧基(polymethyleneoxy))和烷氨基(例如聚亚乙基氨基，
JeffamineTM)；及二酸酯和酰胺，包括琥珀酸酯、琥珀酰胺、二乙醇酸酯、
丙二酸酯和己酰胺。
半胱氨酸改造抗体与接头试剂或药物-接头中间体，与亲电子官能团诸
如马来酰亚胺或α-卤代羰基依照Klussman等(2004)Bioconjugate Chemistry
15(4)：765-773，766页上的结合方法起反应。
接头可以由一种或多种接头构件构成。例示性的接头构件包括6-马来酰
亚氨基己酰基(“MC”)、马来酰亚氨基丙酰基(“MP”)、缬氨酸-瓜氨酸(“val-cit”
或“vc”)、丙氨酸-苯丙氨酸(“ala-phe”或“af”)、对氨基苄氧羰基(“PAB”)、N-
琥珀酰亚氨基4-(2-吡啶基硫基)戊酸酯(“SPP”)、N-琥珀酰亚氨基4-(N-马来酰
亚氨基甲基)环己烷-1羧酸酯(“SMCC”)和N-琥珀酰亚氨基(4-碘-乙酰基)氨基
苯甲酸酯(“SIAB”)、亚乙基氧基-CH2CH2O-作为一个或多个重复单元(“EO”
或“PEO”)。本领域已知其他的接头构件，本文中也描述了一些。
在一个实施方案中，ADC的接头L具有通式：
-Aa-Ww-Yy-
其中：
-A-为共价连接于抗体(Ab)半胱氨酸硫醇的延伸物单元；
a为0或1；
每个-W-独立为氨基酸单元；
w独立为0-12的整数；
-Y-为共价连接于药物部分的间隔物(spacer)单元；且
y为0、1或2。
延伸物单元
当存在时，延伸物单元(-A-)能够连接抗体单元与氨基酸单元(-W-)。在这
方面，抗体(Ab)具有能与延伸物的官能团形成键的官能团。抗体上能存在(天
然的或经化学操作的)的有用的官能团包括但不限于硫氢基(-SH)、氨基、羟
基、羧基、碳水化合物的异头羟基，和羧基。在一个方面，所述抗体官能团
是硫氢基或氨基。可以通过还原抗体的分子内二硫键来生成硫氢基。或者，
可以通过用2-亚氨基硫杂环戊烷(2-iminothiolane，Traut氏试剂)或其它硫
氢基生成试剂使抗体的赖氨酸部分的氨基反应来生成硫氢基。在一个实施方
案中，抗体(Ab)具有能与延伸物单元的亲电子官能团形成键的游离半胱氨酸
硫醇基团。式II和III描绘了式I中的例示性延伸物单元，其中Ab-、-W-、-Y-、
-D、w和y如上文所定义且R17为选自下列的二价基：(CH2)r、C3-C8碳环基、
O-(CH2)r、亚芳基、(CH2)r-亚芳基、-亚芳基-(CH2)r-、(CH2)r-(C3-C8碳环基)、
(C3-C8碳环基)-(CH2)r、C3-C8杂环基、(CH2)r-(C3-C8杂环基)、-(C3-C8杂环
基)-(CH2)r-、-(CH2)rC(O)NRb(CH2)r-、-(CH2CH2O)r-、-(CH2CH2O)r-CH2-、
-(CH2)rC(O)NRb(CH2CH2O)r-、-(CH2)rC(O)NRb(CH2CH2O)r-CH2-、
-(CH2CH2O)rC(O)NRb(CH2CH2O)r-、-(CH2CH2O)rC(O)NRb(CH2CH2O)r-CH2-
和-(CH2CH2O)rC(O)NRb(CH2)r-；其中Rb为H、C1-C6烷基、苯基或苄基；且r
独立地为范围1-10的整数。
亚芳基包括通过从芳族环体系中除去两个氢原子而衍生的6-20个碳原
子的二价芳族烃基。典型的亚芳基包括但不限于衍生自苯、取代的苯、萘、
蒽、联苯等的基团。
杂环基包括一个或多个环原子为杂原子(例如氮、氧和硫)的环体系。
杂环基包含1-20个碳原子和1-3个选自N、O、P和S的杂原子。杂环可以为具
有3-7个环成员的单环(2-6个碳原子和1-3个选自N、O、P和S的杂原子)或
具有7-10个环成员的双环(4-9个碳原子和1-3个选自N、O、P和S的杂原子)，
例如：双环[4，5]，[5，5]，[5，6]或[6，6]体系。杂环记载于Paquette，Leo A.；
“Principles of Modern Heterocyclic Chemistry”，W.A.Benjamin，New York，
1968，特别是1，3，4，6，7，和9章；“The Chemistry of Heterocyclic Compound，A
series of Monographs”，John Wiley & Sons，New York，1950至今，特别是卷13，
14，16，19，和28；及J.Am.Chem.Soc.(1960)82：5566。
举例而言而非限制，杂环的例子包括：吡啶基、二氢吡啶基、四氢吡啶
基(哌啶基)、噻唑基、四氢噻吩基(tetrahydrothiophenyl)、硫氧化的四氢噻吩
基、嘧啶基、呋喃基、噻吩基(thienyl)、吡咯基、吡唑基、咪唑基、四唑基、
苯并呋喃基、硫茚基(thianaphthalenyl)、吲哚基、3H-吲哚基(indolenyl)、喹
啉基、异喹啉基、苯并咪唑基、哌啶基、4-哌啶酮基、吡咯烷基、2-吡咯烷
酮基、吡咯啉基、四氢呋喃基、双-四氢呋喃基(bis-tetrahydrofuranyl)、四氢
吡喃基、双-四氢吡喃基(bis-tetrahydropyranyl)、四氢喹啉基、四氢异喹啉基、
十氢喹啉基、八氢喹啉基、吖辛因基(azocinyl)、三嗪基、6H-1，2，5-噻二嗪基、
2H，6H-1，5，2-二噻嗪基、噻吩基、噻蒽基、吡喃基、异苯并呋喃基、色烯基、
呫吨基、酚![]()
噻基(phenoxathinyl)、2H-吡咯基、异噻唑基、异![]()
唑基、吡嗪
基、哒嗪基、吲嗪基、异吲哚基、3H-吲哚基、1H-吲唑基、嘌呤基、4H-喹
嗪基、酞嗪基、萘啶基、喹喔啉基、喹唑啉基、噌啉基、蝶啶基、4Ah-咔唑
基、咔唑基、β-咔啉基、菲啶基、吖啶基、嘧啶基、菲咯啉基、吩嗪基、吩
噻嗪基、呋咱基、吩![]()
嗪基、异色满基、色满基、咪唑烷基、咪唑啉基、吡
唑烷基、吡唑啉基、哌嗪基、二氢吲哚基、异二氢吲哚基、奎宁环基、吗啉
基、![]()
唑烷基、苯并三唑基、苯并异![]()
唑基、羟吲哚基、苯并![]()
唑啉基和靛
红酰基(isatinoyl)。
碳环基包括具有3-7个碳原子(作为单环)或7-12个碳原子(作为双环)
的饱和或不饱和环。单环碳环具有3-6个环原子，更通常地为5或6个环原子。
双环碳环具有7-12个环原子，例如排列成双环[4，5]，[5，5]，[5，6]或[6，6]体系，
或者9或10个环原子，排列成双环[5，6]或[6，6]体系。单环碳环的例子包括环
丙基、环丁基、环戊基、1-环戊-1-烯基、1-环戊-2-烯基、1-环戊-3-烯基、环
己基、1-环己-1-烯基、1-环己-2-烯基、1-环己-3-烯基、环庚基和环辛基。
根据式I ADC的所有例示性实施方案诸如II-VI应当理解，即使在未明确
表述的情况中，有1-4个药物部分与抗体连接(p＝1-4)，这取决于改造的半
胱氨酸残基的数目。
![]()
一种例示性式II延伸物单元衍生自马来酰亚氨基-己酰基(MC)，其中R17
为-(CH2)5-：
![]()
一种例示性式II延伸物单元衍生自马来酰亚氨基-丙酰基(MP)，其中R17
为-(CH2)2-：
![]()
另一种例示性式II延伸物单元，其中R17为-(CH2CH2O)r-CH2-且r为2：
![]()
另一种例示性式II延伸物单元，其中R17为
-(CH2)rC(O)NRb(CH2CH2O)r-CH2-，其中Rb为H且每个r为2：
![]()
另一种例示性式III延伸物单元，其中R17为-(CH2)5-：
![]()
在另一个实施方案中，延伸物单元通过抗体的改造半胱氨酸的硫原子与
延伸物单元的硫原子之间的二硫键与半胱氨酸改造抗FcRH5抗体连接。该实
施方案的代表性延伸物单元以式IV描绘，其中R17、Ab-、-W-、-Y-、-D、w
和y如上文所定义。
![]()
在又一个实施方案中，延伸物的反应性基团含有能与抗体的游离半胱氨
酸巯基形成键的巯基反应性官能团。巯基反应性官能团的例子包括但不限
于：马来酰亚胺；α-卤代乙酰基；活化的酯类，诸如琥珀酰亚胺酯、4-硝基
苯基酯、五氟苯基酯、四氟苯基酯；酸酐类；酰基氯类(acid chloride)；磺酰
氯类；异氰酸酯类和异硫氰酸酯类。该实施方案的代表性延伸物单元以式Va
和Vb描绘，其中-R17-、Ab-、-W-、-Y-、-D、w和y如上文所定义。
![]()
在另一个实施方案中，接头可以为树状类型接头(dendritic type linker)，
其用于通过分支的多功能接头模块将超过一个药物模块共价附着于抗体
(Sun等(2002)Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters 12：2213-2215；Sun等
(2003)Bioorganic & Medicinal Chemistry 11：1761-1768；King(2002)
Tetrahedron Letters 43：1987-1990)。树状接头能增加药物与抗体的摩尔比，即
载荷，它与ADC的效能相关。如此，如果半胱氨酸改造抗体仅携带一个反应
性半胱氨酸硫醇基团，那么可以通过树状接头附着众多药物模块。
氨基酸单元
接头可以包含氨基酸残基。如果存在，那么氨基酸单元(-Ww-)使本发明
的半胱氨酸改造抗体-药物偶联物(ADC)的抗体(Ab)与药物模块(D)连接。
-Ww-为二肽、三肽、四肽、五肽、六肽、七肽、八肽、九肽、十肽、十
一肽或十二肽单元。包含氨基酸单元的氨基酸残基包括那些天然存在的以及
次要的氨基酸和非天然存在的氨基酸类似物，诸如瓜氨酸。各个-W-单元独
立地具有如下所示的方括号内的通式，且w为范围0-12的整数：
![]()
其中R19为氢、甲基、异丙基、异丁基、仲丁基、苄基、对羟基苄基、-CH2OH、
-CH(OH)CH3、-CH2CH2SCH3、-CH2CONH2、-CH2COOH、-CH2CH2CONH2、
-CH2CH2COOH、-(CH2)3NHC(＝NH)NH2、-(CH2)3NH2、-(CH2)3NHCOCH3、
-(CH2)3NHCHO、-(CH2)4NHC(＝NH)NH2、-(CH2)4NH2、-(CH2)4NHCOCH3、
-(CH2)4NHCHO、-(CH2)3NHCONH2、-(CH2)4NHCONH2、
-CH2CH2CH(OH)CH2NH2、2-吡啶基甲基-、3-吡啶基甲基-、4-吡啶基甲基-、
苯基、环己基、
![]()
当R19不为氢时，R19所附着的碳原子为手性的。R19所附着的各个碳原子
独立地以(S)或(R)构型或外消旋混合物附着。氨基酸单元如此可以为对映体
方面纯的、外消旋的或非对映异构体的。
例示性的-Ww-氨基酸单元包括二肽、三肽、四肽或五肽。例示性的二
肽包括：缬氨酸-瓜氨酸(vc或val-cit)、丙氨酸-苯丙氨酸(af或ala-phe)。例示性
的三肽包括：甘氨酸-缬氨酸-瓜氨酸(gly-val-cit)和甘氨酸-甘氨酸-甘氨酸
(gly-gly-gly)。构成氨基酸接头构件的氨基酸残基包括天然存在的氨基酸，以
及次要氨基酸和非天然存在的氨基酸类似物，诸如瓜氨酸。
可以用一种或多种酶(包括肿瘤相关蛋白酶)酶促切割氨基酸单元，以
释放药物模块(-D)，其在一个实施方案中在体内释放时被质子化以提供药物
(D)。可以在特定酶(例如肿瘤相关蛋白酶，组织蛋白酶B、C和D，或纤溶
酶蛋白酶)的酶促切割的选择性方面设计和优化氨基酸接头构件。
间隔物单元
在氨基酸单元存在时(w＝1-12)，间隔物单元(-Yy-)(在存在时，y＝1
或2)使氨基酸单元(-Ww-)与药物模块(D)连接。或者，在氨基酸单元不存在
时，间隔物单元使延伸物单元与药物模块连接。在氨基酸单元和延伸物单元
都不存在时(w，y＝0)，间隔物单元还使药物模块与抗体单元连接。间隔物单
元有两大类：自我牺牲的(self-immolative)和非自我牺牲的。非自我牺牲的间
隔物单元为部分或所有间隔物单元在从抗体-药物偶联物或药物模块-接头切
割(特别是酶促切割)氨基酸单元后保持与药物模块结合的间隔物单元。当
含有甘氨酸-甘氨酸间隔物单元或甘氨酸间隔物单元的ADC通过肿瘤细胞相
关蛋白酶、癌细胞相关蛋白酶或淋巴细胞相关蛋白酶进行酶促切割时，甘氨
酸-甘氨酸-药物模块或甘氨酸-药物模块从Ab-Aa-Ww-上切割下来。在一个实
施方案中，在靶细胞内发生独立的水解反应，其切割甘氨酸-药物模块的键
并释放药物。
在另一个实施方案中，-Yy-为对氨基苄基氨甲酰基(PAB)单元，其亚苯基
部分被Qm取代，其中Q为-C1-C8烃基(烷基，alkyl)、-O-(C1-C8烃基(烷基，
alkyl))、-卤素、-硝基或-氰基；且m为范围0-4的整数。
非自我牺牲的间隔物单元(-Y-)的例示性实施方案为：-Gly-Gly-；-Gly-；
-Ala-Phe-；-Val-Cit-。
在一个实施方案中，提供了药物模块-接头或ADC或其药学可接受的盐
或溶剂化物，其中间隔物单元不存在(y＝0)。
或者，含有自我牺牲的间隔物单元的ADC能释放-D。在一个实施方案中，
-Y-为通过PAB基团的氨基氮原子连接至-Ww-，且通过碳酸酯、氨基甲酸酯
或醚基团直接连接至-D的PAB基团，其中ADC具有如下例示性结构：
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其中Q为-C1-C8烃基(烷基，alkyl)、-O-(C1-C8烃基(烷基，alkyl))、-卤素、
-硝基或-氰基；m为范围0-4的整数；且p范围为1-4。
自我牺牲的间隔物的其它例子包括但不限于在电子方面与PAB基团类
似的芳族化合物，诸如2-氨基咪唑-5-甲醇衍生物(Hay等(1999)Bioorg.Med.
Chem.Lett.9：2237)、杂环PAB类似物(US 2005/0256030)、β-葡糖苷酸(WO
2007/011968)和邻位或对位氨基苄基乙缩醛。可以使用在酰胺键水解时进行
环化的间隔物，诸如取代和未取代的4-氨基丁酸酰胺类(Rodrigues等(1995)
Chemistry Biology 2：223)、适当取代的双环[2.2.1]和双环[2.2.2]环体系(Storm
等(1972)J.Amer.Chem.Soc.94：5815)和2-氨基苯基丙酸酰胺类(Amsberry等
(1990)J.Org.Chem.55：5867)。消去在甘氨酸上取代的含胺药物(Kingsbury等
(1984)J.Med.Chem.27：1447)也是可用于ADC的自我牺牲的间隔物的例子。
例示性的间隔物单元(-Yy-)以式X-XII表示：
![]()
树状接头
在另一个实施方案中，接头L可以为树状类型接头(dendritic type linker)，
其用于通过分支的多功能接头部分将超过一个药物部分共价连接于抗体
(Sun等(2002)Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters 12：2213-2215；Sun等
(2003)Bioorganic & Medicinal Chemistry 11：1761-1768)。树状接头能增加药物
与抗体的摩尔比，即载荷，它与ADC的效能相关。如此，如果半胱氨酸改造
抗体仅携带一个反应性半胱氨酸硫醇基团，那么可以通过树状接头连接众多
药物部分。分支的树状接头的例示性实施方案包括2，6-双(羟甲基)-对甲酚和
2，4，6-三(羟甲基)-酚树状聚物单元(dendrimer unit)(WO 2004/01993；Szalai等
(2003)J.Amer.Chem.Soc.125：15688-15689；Shamis等(2004)J.Amer.Chem.
Soc.126：1726-1731；Amir等(2003)Angew.Chem.Int.Ed.42：4494-4499)。
在一个实施方案中，间隔物单元为分支的双(羟甲基)苯乙烯(BHMS)，它
可以用于掺入和释放众多药物，其具有如下结构：
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其包含2-(4-氨基亚苄基)丙烷-1，3-二醇树状聚物单元(WO 2004/043493；de
Groot等(2003)Angew.Chem.Int.Ed.42：4490-4494)，其中Q为-C1-C8烷基，
-O-(C1-C8烷基)、-卤素、-硝基或-氰基；m为范围0-4的整数；n为0或1；且p
范围为1-4。
式I抗体-药物结合物化合物的例示性实施方案包括XIIIa(MC)、XIIIb
(val-cit)、XIIIc(MC-val-cit)和XIIId(MC-val-cit-PAB)：
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式Ia抗体-药物结合物化合物的其它例示性实施方案包括XIVa-e：
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其中X为：
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Y为：
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且R独立为H或C1-C6烷基；且n为1-12。
在另一个实施方案中，接头具有反应性官能团，该反应性官能团具有与
存在于抗体上的亲电子基团具有反应性的亲核基团。抗体上有用的亲电子基
团包括但不限于醛和酮羰基。接头的亲核基团的杂原子能与抗体上的亲电子
基团反应并且与抗体单元形成共价键。接头上有用的亲核基团包括但不限于
酰肼、肟、氨基、肼、缩氨基硫脲(thiosemicarbazone)、肼羧酸酯和芳基酰肼。
抗体上的亲电子基团提供了用于连接接头的便利位点。
典型地，可以通过在两个或更多氨基酸和/或肽片段之间形成肽键来制备
肽类型的接头。例如，可以按照肽化学领域众所周知的液相合成法(E.
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和K.Lübke(1965)“The Peptides”，卷1，pp 76-136，Academic Press)来
制备此类肽键。可以通过包括间隔物、延伸物和氨基酸单元的任意组合或反
应顺序来装配接头中间体。间隔物、延伸物和氨基酸单元可以采用本质上为
亲电子、亲核或游离基的反应性官能团。反应性官能团包括但不限于羧基、
羟基、对硝基苯基碳酸酯基、异硫氰酸酯基和离去基团，诸如O-甲磺酰基、
O-甲苯磺酰基、-Cl、-Br、-I；或马来酰亚胺。
例如，带电荷的取代基，诸如磺酸根(-SO3-)或铵可以增加试剂的水溶性
并且有利于接头试剂与抗体或药物部分的偶联反应，或有利于Ab-L(抗体-
接头中间体)与D的偶联反应或D-L(药物-接头中间体)与Ab的偶联反应，
这取决于用于制备ADC的合成途径。
接头试剂
可以使用多种双功能接头试剂来制备包含抗体和auristatin的偶联物，诸
如N-琥珀酰亚氨基3-(2-吡啶基二硫基)丙酸酯(SPDP)，琥珀酰亚氨基-4-(N-
马来酰亚氨基甲基)环己烷-1-羧酸酯(SMCC)，亚氨基硫杂环戊烷(IT)，亚氨
酸酯(诸如盐酸己二酰亚氨酸二甲酯)、活性酯类(诸如辛二酸二琥珀酰亚
氨基酯)、醛类(诸如戊二醛)、双叠氮化合物(诸如双(对-叠氮苯甲酰基)
己二胺)、双重氮衍生物(诸如双(对-重氮苯甲酰基)-乙二胺)、二异硫酸酯
(诸如甲苯2，6-二异氰酸酯)和双活性氟化合物(诸如1，5-二氟-2，4-二硝基苯)
的双功能衍生物。
抗体药物偶联物还可以用下列接头试剂来制备：BMPEO、BMPS、
EMCS、GMBS、HBVS、LC-SMCC、MBS、MPBH、SBAP、SIA、SIAB、
SMPB、SMPH、磺基-EMCS、磺基-GMBS、磺基-KMUS、磺基-MBS、磺基
-SIAB、磺基-SMCC和磺基-SMPB、及SVSB(琥珀酰亚氨基-(4-乙烯基砜)苯
甲酸酯)；并且包括双马来酰亚胺试剂：DTME、BMB、BMDB、BMH、BMOE、
1，8-双-马来酰亚氨基二甘醇(BM(PEO)2)和1，11-双-马来酰亚氨基三甘醇
(BM(PEO)3)，它们可购自Pierce Biotechnology，Inc.、ThermoScientific
(Rockford，IL)、及其它试剂供应商。双马来酰亚胺试剂容许将半胱氨酸改造
抗体的硫醇基团按照依次或同时的方式连接至含硫醇药物部分、标记物或接
头中间体。除马来酰亚胺外的其它与半胱氨酸改造抗体、药物部分、标记物
或接头中间体的硫醇基团具有反应性的官能团包括碘乙酰胺、溴乙酰胺、乙
烯基吡啶、二硫化物、吡啶基二硫化物、异氰酸酯和异硫氰酸酯。
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还可以通过其它商业(诸如Molecular Biosciences Inc.(Boulder，CO))来
源获得或按照下列文献中所述的规程合成有用的接头试剂：Toki等(2002)J.
Org.Chem.67：1866-1872；Walker，M.A.(1995)J.Org.Chem.60：5352-5355；
Frisch等(1996)Bioconjugate Chem.7：180-186；US 6214345；WO 02/088172；
US 2003130189；US2003096743；WO 03/026577；WO 03/043583；和WO
04/032828。
可以通过使下列接头试剂与氨基酸单元的N-末端反应将式(IIIa)的延伸
物引入接头：
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其中n为范围1-10的整数且T为-H或-SO3Na；
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其中n为范围0-3的整数；
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可以通过使下列双官能试剂与氨基酸单元的N-末端反应将延伸物单元
引入接头：
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其中X为Br或I。
还可以通过使下列双官能试剂与氨基酸单元的N-末端反应将式的延伸
物单元引入接头：
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具有马来酰亚胺延伸物和对氨基苄基氨甲酰基(PAB)自我牺牲间隔物的
例示性缬氨酸-瓜氨酸(val-cit或vc)二肽接头试剂具有如下结构：
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具有马来酰亚胺延伸物单元和PAB自我牺牲间隔物单元的例示性phe-lys
(Mtr，单-4-甲氧基三苯甲基)二肽接头试剂可以按照Dubowchik等(1997)
Tetrahedron Letters，38：5257-60所述制备且具有如下结构：
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半胱氨酸改造抗FcRH5抗体-药物偶联物的制备
可以通过数种途径，采用本领域技术人员公知的有机化学反应、条件和
试剂来制备式I的ADC，包括：(1)使半胱氨酸改造抗体的半胱氨酸基团与接
头试剂反应，从而通过共价键形成抗体-接头中间体Ab-L，随后与活化的药
物模块D反应；和(2)使药物模块的亲核基团与接头试剂反应，从而通过共
价键形成药物-接头中间体D-L，随后与半胱氨酸改造抗体的半胱氨酸基团反
应。偶联方法(1)和(2)可以与各种半胱氨酸改造抗体、药物模块和接头一起
使用以制备式I的抗体-药物偶联物。
抗体半胱氨酸硫醇基团为亲核性的并且能够与接头试剂和药物-接头中
间体上的亲电子基团反应而形成共价键，所述亲电子基团包括：(i)活性酯
类，诸如NHS酯类、HOBt酯类、卤代甲酸酯类和酸性氯化物类；(ii)烃基和
苄基卤化物，诸如卤代乙酰胺类；(iii)醛类、酮类、羧基和马来酰亚胺基团；
和(iv)通过硫化物交换的二硫化物，包括吡啶基二硫化物。药物模块上的亲
核基团包括但不限于：胺、硫醇、羟基、酰肼、肟、肼、缩氨基硫脲、肼羧
酸酯和芳基酰肼基团，它们能够与接头模块和接头试剂上的亲电子基团反应
而形成共价键。
可以如下使半胱氨酸改造抗体变成反应性的以便偶联接头试剂，即用还
原剂，诸如DTT(Cleland氏试剂，二硫苏糖醇)或TCEP(三(2-羧乙基)膦盐
酸盐)处理(Getz等(1999)Anal.Biochem.273：73-80；Soltec Ventures，Beverly，
MA)，接着再氧化以再形成链间和链内二硫键(实施例5)。例如，在37℃用
约50倍摩尔过量的TCEP将在CHO细胞中表达的全长半胱氨酸改造的单克隆
抗体(ThioMab)还原3小时以还原半胱氨酸加合物中的二硫键，其可以在新引
入的半胱氨酸残基与存在于培养基中的半胱氨酸之间形成。用10mM乙酸钠，
pH 5稀释还原后的ThioMab并且加载至10mM乙酸钠，pH 5中的HiTrap S柱上
并且用含有0.3M氯化钠的PBS洗脱。在室温用稀(200nM)硫酸铜(CuSO4)水溶
液重新建立亲本Mab中存在的半胱氨酸残基之间的二硫键过夜。或者，脱氢
抗坏血酸(DHAA)是有效的氧化剂，用于在半胱氨酸加合物的还原性切割之
后重新建立半胱氨酸改造抗体的链内二硫化物基团。可以使用本领域公知的
其它氧化剂，即氧化性试剂和氧化性条件。环境空气氧化也是有效的。这种
温和的部分再氧化步骤有效地高保真度地形成链内二硫键并保护新引入的
半胱氨酸残基的硫醇基团。加入约10倍过量的药物-接头中间体，例如
MC-vc-PAB-MMAE，混合并且在室温放置约1小时，以进行偶联并形成抗
FcRH5抗体-药物偶联物。将偶联混合物进行凝胶过滤、加载和通过HiTrap S
柱洗脱以除去过量的药物-接头中间体和其它杂质。
制备由细胞培养物表达的用于偶联的半胱氨酸改造抗体的一般方法如
下。当细胞培养基含有半胱氨酸时，可以在新引入的半胱氨酸氨基酸和培养
基中的半胱氨酸之间形成二硫化物加合物。必须将这些半胱氨酸加合物(描
绘为例示性ThioMab中的环)还原以生成具有偶联反应性的半胱氨酸改造抗
体。将半胱氨酸加合物，可能还有多个链间二硫键用还原剂诸如TCEP还原
性切割以产生还原形式的抗体。在部分氧化条件下，用硫酸铜、DHAA或暴
露于环境氧而重新形成配对半胱氨酸残基之间的链间二硫键。新引入的、改
造的和未配对的半胱氨酸残基仍然可用于与接头试剂或药物-接头中间体反
应而形成本发明的抗体偶联物。哺乳动物细胞系中表达的ThioMabs通过-S-S-
键形成产生外部偶联至改造的Cys的Cys加合物。因此，纯化的ThioMabs通过
还原和再氧化规程处理以产生反应性ThioMabs。这些ThioMabs用于偶联含有
马来酰亚胺的细胞毒性药物、荧光团和其它标记物。
10.免疫脂质体
本文中所公开的抗FcRH5抗体还可配制成免疫脂质体。“脂质体”指由各
种类型的脂质、磷脂和/或表面活性剂构成的，可用于对哺乳动物投递药物的
小囊泡。脂质体的成分通常排列成双层形式，与生物膜的脂质排列相似。含
有抗体的脂质体可通过本领域已知方法来制备，诸如Epstein et al.，Proc.Natl.
Acad.Sci.USA 82：3688(1985)；Hwang et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 77：
4030(1980)；美国专利4,485,045和4,544,545；及1997年10月23日公布的
WO97/38731。循环时间延长的脂质体披露于美国专利5,013,556。
可用包含磷脂酰胆碱、胆固醇和PEG衍生化磷脂酰乙醇胺(PEG-PE)的脂
类组合物通过反相蒸发法生成特别有用的脂质体。将脂质体挤过具有设定孔
径的滤器，产生具有期望直径的脂质体。可如Martin et al.，J.Biol.Chem.257：
286-288(1982)中所述，将本发明抗体的Fab’片段经二硫化物交换反应与脂质
体偶联。任选在脂质体中包含化疗剂。参见Gabizon et al.，J.National Cancer
Inst.81(19)：1484(1989)。
B.制备抗体的某些方法
1.筛选具有期望特性的抗FcRH5抗体
上文已经描述了用于生成与FcRH5多肽结合的抗体的方法。可以根据需
要进一步选择具有某些生物学特征的抗体。
本发明抗FcRH5抗体的生长抑制效果可通过本领域知道的方法来评估，
例如使用内源性的或在用FcRH5基因转染后表达FcRH5多肽的细胞。例如，
可将适宜肿瘤细胞系和FcRH5转染细胞用多种浓度的本发明抗FcRH5单克隆
抗体处理数天(例如2-7天)，并用结晶紫或MTT染色，或者通过一些其它比
色测定法进行分析。测量增殖的另一种方法将是通过比较在存在或缺乏本发
明抗FcRH5抗体时处理的细胞的3H-胸苷摄取。处理后，收获细胞并在闪烁计
数器中对掺入DNA的放射性的量定量。适宜的阳性对照包括用已知抑制选定
细胞系生长的生长抑制性抗体处理该细胞系。可以本领域知道的多种方法来
测定体内肿瘤细胞的生长抑制。所述肿瘤细胞可以是过表达FcRH5多肽的肿
瘤细胞。与未处理的肿瘤细胞相比，抗FcRH5抗体会在体外或在体内抑制表
达FcRH5的肿瘤细胞的细胞增殖达约25-100％，更优选约30-100％，甚至更优
选约50-100％或70-100％，在一个实施方案中，抗体浓度为约0.5-30μg/ml。
可在细胞培养物中在抗体浓度为约0.5-30μg/ml或约0.5nM至200nM时测量生
长抑制，其中在使肿瘤细胞暴露于抗体后1-10天测量生长抑制。如果以约
1μg/kg至约100mg/kg体重施用抗FcRH5抗体导致在自首次施用抗体起约5天
至3个月内、优选约5至30天内肿瘤体积缩小或肿瘤细胞增殖降低，那么该抗
体是体内生长抑制性的。
为了选择诱导细胞死亡的抗FcRH5抗体，可相对于对照评估通过例如碘
化丙啶(PI)、锥虫蓝或7AAD摄取显示的膜完整性丧失。PI摄取测定法可在缺
乏补体和免疫效应细胞时进行。在单独的培养基或含有适宜抗FcRH5抗体
(例如约10μg/ml)的培养基中温育表达FcRH5多肽的肿瘤细胞。将细胞温育
3天的时限。每次处理后，将细胞清洗并等分到35mm盖有滤网(strainer-capped)
的12x75管中(每管1ml，每个处理组3管)以除去细胞团块。然后向管中加
入PI(10μg/ml)。可以使用![]()
流式细胞仪和![]()
CellQuest软件(Becton Dickinson)分析样品。可以将那些根据PI摄取的测定诱
导统计学显著水平的细胞死亡的抗FcRH5抗体选作诱导细胞死亡的抗FcRH5
抗体。
为了筛选结合FcRH5多肽上目的抗体所结合的表位的抗体，可进行常规
交叉阻断测定法，诸如Antibodies，A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor
Laboratory，Ed Harlow and David Lane，1988中所记载的。此测定法可用于测
定测试抗体是否与已知的抗FcRH5抗体结合相同位点或表位。或者/另外，可
通过本领域知道的方法进行表位作图。例如，可对抗体序列进行诱变，诸如
通过丙氨酸扫描，以鉴定接触残基。首先对突变型抗体测试多克隆抗体的结
合以确保正确折叠。在一种不同的方法中，可将对应于FcRH5不同区域的肽
与测试抗体或者与测试抗体及具有已表征或已知表位的抗体一起用于竞争
测定法。
2.某些文库筛选方法
本发明的抗FcRH5抗体可以通过使用组合库筛选具有期望活性的抗体
来生成。例如，本领域知道用于构建噬菌体展示库及对此类文库筛选具有期
望的结合特性的抗体的多种方法。此类方法一般记载于Hoogenboom等(2001)
于：Methods in Molecular Biology 178：1-37(O’Brien等编，Human Press，
Totowa，NJ)，在某些实施方案中是Lee等(2004)J.Mol.Biol.340：1073-1093。
在原理上，通过筛选噬菌体文库来选择合成抗体克隆，所述噬菌体文库
含有展示融合至噬菌体外壳蛋白的各种抗体可变区(Fv)片段的噬菌体。通过
针对所需抗原的亲和层析来淘选此类噬菌体文库。表达能够结合所需抗原的
Fv片段的克隆被吸附至抗原，从而与文库中不结合的克隆分开。然后将结合
的克隆从抗原上洗脱，而且可以通过额外的抗原吸附/洗脱循环进一步富集。
本发明的任何抗FcRH5抗体可以如下获得，即设计合适的抗原筛选规程来选
择感兴趣的噬菌体克隆，接着使用来自感兴趣的噬菌体克隆的Fv序列和
Kabat等，Sequences of Proteins of Immunological Interest，第5版，NIH
Publication 91-3242，Bethesda MD(1991)，卷1-3中记载的合适的恒定区(Fc)
序列来构建全长抗FcRH5抗体克隆。
在某些实施方案中，抗体的抗原结合域由两个约110个氨基酸的可变(V)
区形成，分别来自轻链(VL)和重链(VH)，都呈现三个高变环(HVR)或互补决
定区(CDR)。可变域可以功能性的展示在噬菌体上，或是作为单链Fv(scFv)
片段(其中VH和VL通过短的、柔性的接头共价相连)，或者作为Fab片段(其
中它们各自与恒定域融合且非共价相互作用)，如Winter等，Ann.Rev.
Immunol.，12：433-455(1994)所述。在用于本文时，编码scFv的噬菌体克隆和
编码Fab的噬菌体克隆统称为“Fv噬菌体克隆”或“Fv克隆”。
VH和VL基因的全集可以通过聚合酶链式反应(PCR)分开克隆，并在噬
菌体文库中随机重组，然后可以搜索抗原结合克隆，如Winter等，Ann.Rev.
Immunol.，12：433-455(1994)所述。来自经免疫来源的文库提供对免疫原有高
亲和力的抗体，无需构建杂交瘤。或者，可以克隆未免疫的全集，用于为广
泛的非自身的及自身的抗原提供单一人抗体来源，无需任何免疫，如Griffiths
等，EMBO J，12：725-734(1993)所述。最后，未免疫的文库还可以以合成方
式来构建，即从干细胞克隆未重排的V基因区段，并使用包含随机序列的PCR
引物来编码高度可变的CDR3区及用来在体外实现重排，如Hoogenboom和
Winter，J.Mol.Biol.，227：381-388(1992)所述。
在某些实施方案中，通过与次要外壳蛋白pIII融合，使用丝状噬菌体来
展示抗体片段。抗体片段可以展示为单链Fv片段，其中VH与VL结构域通过
柔性多肽间隔物在同一多肽链上相连，例如如Marks等，J.Mol.Biol.，222：
581-597(1991)所述，或者展示为Fab片段，其中一条链与pIII融合，另一条链
分泌入细菌宿主细胞周质，在此装配Fab-外壳蛋白结构，其通过替换一些野
生型外壳蛋白而展示在噬菌体表面上，例如如Hoogenboom等，Nucl.Acids
Res.，19：4133-4137(1991)所述。
一般而言，从收获自人或动物的免疫细胞获得编码抗体基因片段的核
酸。如果希望文库偏向抗FcRH5克隆，那么可以给受试者免疫FcRH5以产生
抗体应答，并回收脾细胞和/或循环B细胞或其它外周血淋巴细胞(PBL)用于
文库构建。在一个优选的实施方案中，如下得到了偏向抗FcRH5克隆的人抗
体基因片段文库，即在携带功能性人免疫球蛋白基因阵列(且缺乏功能性内
源抗体生成系统)的转基因小鼠中产生抗FcRH5抗体应答，使得FcRH5免疫
产生生成针对FcRH5的人抗体的B细胞。生成人抗体的转基因小鼠的生成在
下文中有描述。
可以如下获得抗FcRH5反应性细胞群的进一步富集，即使用合适的筛选
规程来分离表达FcRH5特异性膜结合抗体的B细胞，例如通过使用FcRH5亲
和层析进行的细胞分离或者细胞对荧光染料标记的FcRH5的吸附及后续的
荧光激活细胞分选(flow-activated cell sorting，FACS)。
或者，来自未免疫供体的脾细胞和/或B细胞或其它PBL的使用提供了可
能的抗体全集的更佳展现，而且还容许使用FcRH5在其中没有抗原性的任何
动物(人或非人的)物种构建抗体文库。对于构建体外掺入抗体基因的文库，
从受试者收获干细胞以提供编码未重排抗体基因区段的核酸。可以从多种动
物物种(诸如人、小鼠、大鼠、兔类、luprine、犬、猫、猪、牛、马和禽类
物种等)获得感兴趣的免疫细胞。
从感兴趣的细胞回收编码抗体可变基因区段(包括VH和VL区段)的核
酸并扩增。就重排的VH和VL基因文库而言，可以如下获得所需DNA，即从
淋巴细胞分离基因组DNA或mRNA，接着用与重排的VH和VL基因的5′和3′
末端匹配的引物进行聚合酶链式反应(PCR)，如Orlandi等，Proc.Natl.Acad.
Sci.(USA)，86：3833-3837(1989)所述，由此构建多样性V基因全集供表达。
可以从cDNA和基因组DNA扩增V基因，反向引物位于编码成熟V结构域的外
显子的5′末端，正向引物基于J区段内部，如Orlandi等(1989)和Ward等，Nature，
341：544-546(1989)所述。然而，为了从cDNA进行扩增，反向引物还可基于
前导外显子内，如Jones等，Biotechnol.，9：88-89(1991)所述，正向引物基于恒
定区内，如Sastry等，Proc.Natl.Acad.Sci.(USA)，86：5728-5732(1989)所述。
为了使互补性最大化，引物中可以掺入简并性，如Orlandi等(1989)或Sastry
等(1989)所述。在某些实施方案中，如下将文库多样性最大化，即使用靶向
每个V基因家族的PCR引物来扩增免疫细胞核酸样品中存在的所有可获得的
VH和VL重排，例如如Marks等，J.Mol.Biol.，222：581-597(1991)的方法中所
述或Orum等，Nucleic Acids Res.，21：4491-4498(1993)的方法中所述。为了将
所扩增的DNA克隆入表达载体，可以在PCR引物的一端引入罕见的限制性位
点作为标签，如Orlandi等(1989)所述，或者用带标签的引物进行进一步的
PCR扩增，如Clackson等，Nature，352：624-628(1991)所述。
合成重排的V基因全集可以在体外从V基因区段衍生。大多数人VH基因
区段已经克隆和测序(Tomlinson等，J.Mol.Biol.，227：776-798(1992))，并定位
(Matsuda等，Nature Genet.，3：88-94(1993))；这些克隆的区段(包括H1和H2
环的所有主要构造)可用于生成多样性VH基因全集，用到编码序列和长度
多样性的H3环的PCR引物，如Hoogenboom和Winter，J.Mol.Biol.，227：
381-388(1992)所述。VH全集还可如下生成，所有序列多样性集中于单一长
度的长H3环，如Barbas等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，89：4457-4461(1992)所
述。人Vκ和Vλ区段已经克隆和测序(Williams和Winter，Eur.J.Immunol.，23：
1456-1461(1993))，而且可用于生成合成轻链全集。基于一系列VH和VL折
叠结构及L3和H3长度的合成V基因全集将编码具有可观结构多样性的抗体。
扩增编码V基因的DNA后，依照Hoogenboom和Winter，J.Mol.Biol.，227：
381-388(1992)的方法，可以在体外重排种系V基因区段。
抗体片段全集可以如下构建，即以数种方式将VH与VL基因全集联合在
一起。可以在不同载体中创建各个全集，并在体外重组载体，例如如Hogrefe
等，Gene，128：119-126(1993)所述，或者在体内通过组合感染来重组载体，
例如Waterhouse等，Nucl.Acids Res.，21：2265-2266(1993)中记载的loxP系统。
体内重组方法利用Fab片段的双链性质来克服因大肠杆菌转化效率施加的库
容量限制。分开克隆未免疫的VH和VL全集，一个克隆入噬菌粒，另一个克
隆入噬菌体载体。然后通过用噬菌体感染含噬菌粒的细菌使得每个细胞包含
一种不同组合来联合两个文库，库容量只受细胞存在数的限制(约1012个克
隆)。两种载体都包含体内重组信号，使得VH与VL基因重组到单一复制子上，
并共包装成噬菌体病毒粒。这些巨型文库提供了大量的具有优良亲和力(Kd-1
为约10-8M)的多样性抗体。
或者，可以将全集序贯克隆入同一载体，例如如Barbas等，Proc.Natl.
Acad.Sci.USA，88：7978-7982(1991)所述，或者通过PCR装配到一起，然后
克隆，例如如Clackson等，Nature，352：624-628(1991)所述。PCR装配还可用
于将VH和VL DNA与编码柔性肽间隔物的DNA连接以形成单链Fv(scFv)全
集。在另一种技术中，“细胞内PCR装配”用于通过PCR在淋巴细胞内联合VH
与VL基因，然后克隆所述连接基团的全集，如Embleton等，Nucl.Acids Res.，
20：3831-3837(1992)所述。
未免疫文库(天然的或合成的)生成的抗体可具有中等亲和力(Kd-1为
约106-107M-1)，但还可以如下在体外模拟亲和力成熟，即构建次生文库并再
次选择，如Winter等(1994)，见上文所述。例如，在Hawkins等，J.Mol.Biol.，
226：889-896(1992)的方法或Gram等，Proc.Natl.Acad.Sci USA，89：
3576-3580(1992)的方法中，使用易错聚合酶在体外随机引入突变(Leung等，
Technique，1：11-15(1989))。另外，可以通过随机突变一个或多个CDR来进行
亲和力成熟，例如在选定的个别Fv克隆中使用携带跨越感兴趣CDR的随机序
列的引物进行PCR并筛选更高亲和力的克隆。WO 9607754(公布于1996年3
月14日)记载了用于在免疫球蛋白轻链的互补决定区中诱导诱变以创建轻链
基因文库的方法。另一种高效方法是将通过噬菌体展示选出的VH或VL结构
域与得自未免疫供体的天然存在V结构域变体全集重组，并在数轮链改组中
筛选更高亲和力，如Marks等，Biotechnol.，10：779-783(1992)所述。此技术容
许生成亲和力约10-9M或更低的抗体和抗体片段。
文库的筛选可通过本领域已知的多种技术来实现。例如，FcRH5可用于
包被吸附板的孔，在附着至吸附板的宿主细胞上表达，或用于细胞分选，或
者偶联至生物素以用链霉亲合素包被的珠捕捉，或者用于淘选噬菌体展示库
的任何其它方法。
在适于至少部分噬菌体颗粒结合吸附剂的条件下，使噬菌体文库样品接
触固定化的FcRH5。正常情况下，选择包括pH、离子强度、温度等等的条件
来模拟生理学条件。结合至固相的噬菌体进行清洗，然后用酸洗脱，例如如
Barbas等，Proc.Natl.Acad.Sci USA，88：7978-7982(1991)所述，或者用碱洗
脱，例如如Marks等，J.Mol.Biol.，222：581-597(1991)所述，或者通过FcRH5
抗原竞争洗脱，例如在与Clackson等，Nature，352：624-628(1991)的抗原竞争
法类似的规程中。噬菌体在单轮选择中可以富集20-1,000倍。此外，富集的
噬菌体可以在细菌培养物中进行培养，并进行更多轮选择。
选择的效率取决于许多因素，包括清洗过程中解离的动力学，及单个噬
菌体上的多个抗体片段是否能同时结合抗原。具有较快解离动力学(和弱结
合亲和力)的抗体可以通过使用短时间的清洗、多价噬菌体展示、及固相中
的高抗原包被密度来保留。高密度不仅通过多价相互作用而稳定了噬菌体，
而且有利于已解离的噬菌体的再结合。具有较慢解离动力学(和强结合亲和
力)的抗体的选择可以通过使用长时间的清洗和单价噬菌体展示(如Bass等，
Proteins，8：309-314(1990)和WO 92/09690所述)及低抗原包被密度(如Marks
等，Biotechnol.，10：779-783(1992)所述)来促进。
有可能在对FcRH5具有不同亲和力的噬菌体抗体之间进行选择，甚至是
亲和力略有差异的。然而，选定抗体的随机突变(例如如有些亲和力成熟技
术中所进行的)有可能产生许多突变体，多数结合抗原，少数具有更高的亲
和力。通过限制FcRH5，罕见的高亲和力噬菌体能竞争胜出。为了保留所有
较高亲和力的突变体，可以将噬菌体与过量的生物素化FcRH5一起温育，但
是生物素化FcRH5的浓度以摩尔计低于FcRH5的目标摩尔亲和常数。然后可
以用链霉亲合素包被的顺磁珠捕捉高亲和力的结合噬菌体。此类“平衡捕捉”
容许依照结合亲和力来选择抗体，其灵敏性容许从大大过量的低亲和力噬菌
体中分离出亲和力只有原值2倍的突变体克隆。还可以操作用于清洗结合至
固相的噬菌体的条件来进行基于解离动力学的区分。
抗FcRH5克隆可以基于活性进行选择。在某些实施方案中，本发明提供
了结合天然表达FcRH5的活细胞的抗FcRH5抗体。在一个实施方案中，本发
明提供了阻断FcRH5配体与FcRH5之间的结合但不阻断FcRH5配体与第二蛋
白质之间的结合的抗FcRH5抗体。对应于此类抗FcRH5抗体的Fv克隆可以如
下选出：(1)如上所述从噬菌体文库分离抗FcRH5克隆，并任选通过在合适
的细菌宿主中培养所分离的噬菌体克隆群来扩增该群体；(2)选出分别想要
阻断和不阻断其活性的第二蛋白质和FcRH5；(3)使抗FcRH5噬菌体克隆吸
附至固定化的FcRH5；(4)使用过量的第二蛋白质来洗脱任何不想要的、识
别FcRH5结合决定簇(其与第二蛋白质的结合决定簇交叠或共享)的克隆；
并(5)洗脱在步骤(4)后仍然吸附的克隆。任选的是，具有期望的阻断/不阻断
特性的克隆可以通过一次或多次重复本文所述选择规程来进一步富集。
编码本发明杂交瘤衍生单克隆抗体或噬菌体展示Fv克隆的DNA易于使
用常规规程分离和测序(例如通过使用设计成自杂交瘤或噬菌体DNA模板特
异性扩增感兴趣的重链和轻链编码区的寡核苷酸引物)。一旦分离，可将DNA
置于表达载体中，然后将该表达载体转染入原本不生成免疫球蛋白蛋白质的
宿主细胞，诸如大肠杆菌细胞、猿COS细胞、中国仓鼠卵巢(CHO)细胞或骨
髓瘤细胞，以在重组宿主细胞中获得所需单克隆抗体的合成。关于编码抗体
的DNA在细菌中的重组表达的综述性论文包括Skerra等，Curr.Opinion in
Immunol.，5：256(1993)及Pluckthun，Immunol.Revs，130：151(1992)。
编码本发明Fv克隆的DNA可以联合编码重链和/或轻链恒定区的已知
DNA序列(例如适宜的DNA序列可得自Kabat等，见上文)以形成编码全长
或部分长度重链和/或轻链的克隆。应当领会，任何同种型的恒定区都可用于
此目的，包括IgG、IgM、IgA、IgD和IgE恒定区，而且此类恒定区可以得自
任何人或动物物种。衍生自一种动物(诸如人)物种的可变域DNA，然后与
另一动物物种的恒定区DNA融合以形成“杂合的”全长重链和/或轻链的编码
序列的Fv克隆包括在本文所用“嵌合”和“杂合”抗体的定义中。在某些实施方
案中，衍生自人可变DNA的Fv克隆与人恒定区DNA融合以形成全长或部分
长度人重链和/或轻链的编码序列。
还可以修饰编码衍生自杂交瘤的抗FcRH5抗体的DNA，例如通过替代，
即用人重链和轻链恒定域的编码序列替换衍生自杂交瘤克隆的同源鼠序列
(例如如Morrison等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，81：6851-6855(1984)中的方
法)。可以进一步修饰编码杂交瘤或Fv克隆衍生抗体或片段的DNA，通过共
价连接免疫球蛋白编码序列和非免疫球蛋白多肽的整个或部分编码序列。可
以以该方式制备具有本发明的Fv克隆或杂交瘤克隆衍生抗体的结合特异性
的“嵌合”或“杂合”抗体。
C.依赖抗体的酶介导的前体药物疗法(ADEPT)
通过将抗体与前体药物活化酶偶联，本发明的抗体还可用于ADEPT，所
述前体药物活化酶将前体药物(例如肽基化疗剂，参见WO 81/01145)转变
为活性抗癌药。参见例如WO 88/07378和美国专利4,975,278。
可用于ADEPT的免疫偶联物的酶组分包括能够以这样一种方式作用于
前体药物从而将其转变为更有活性的细胞毒性形式的任何酶。
可用于本发明方法的酶包括但不限于可将含磷酸盐/酯的前体药物转变
为游离药物的碱性磷酸酶；可将含硫酸盐/酯的前体药物转变为游离药物的芳
基硫酸酯酶；可将无毒5-氟胞嘧啶转变为抗癌药5-氟尿嘧啶的胞嘧啶脱氨酶；
可将含肽的前体药物转变为游离药物的蛋白酶，诸如沙雷氏菌蛋白酶(serratia
protease)、嗜热菌蛋白酶(thermolysin)、枯草杆菌蛋白酶(subtilisin)、羧肽酶
和组织蛋白酶(诸如组织蛋白酶B和L)；可转化含D-氨基酸替代的前体药物
的D-丙氨酰羧肽酶；可将糖基化前体药物转变为游离药物的碳水化合物切割
酶，诸如β-半乳糖苷酶和神经氨酸酶；可将用β-内酰胺衍生的药物转变为游
离药物的β-内酰胺酶；及可将在其氨基氮处分别用苯氧乙酰基或苯乙酰基衍
生的药物转变成游离药物的青霉素酰胺酶，诸如青霉素V酰胺酶或青霉素G
酰胺酶。或者，可使用具有酶活性的抗体，本领域也称作“抗体酶”，将本发
明的前体药物转变为游离活性药物(参见例如Massey，Nature 328：457-458
(1987))。可如本文所述制备抗体-抗体酶偶联物，用于将抗体酶递送至肿瘤
细胞群。
可通过本领域众所周知的技术将本发明的酶与抗FcRH5抗体共价结合，
诸如使用上文所讨论的异双功能交联剂。或者，可使用本领域众所周知的重
组DNA技术构建包含与本发明酶的至少功能活性部分连接的本发明抗体的
至少抗原结合区的融合蛋白(参见例如Neuberger等，Nature 312：604-608
(1984))。
D.抗FcRH5抗体
除了本文所述抗FcRH5抗体，可制备抗FcRH5抗体变体。抗FcRH5抗体
变体可通过将适宜的核苷酸改变引入编码DNA和/或通过合成期望抗体或多
肽来制备。本领域技术人员将领会，氨基酸改变可改变抗FcRH5抗体的翻译
后加工，诸如改变糖基化位点的数目或位置或者改变膜锚定特征。
可在本文所述抗FcRH5抗体中进行变异，例如使用例如美国专利
5,364,934所述的保守和非保守突变的任何技术和指导方针。变异可以是编码
抗体或多肽的一个或多个密码子的替代、删除或插入，其导致氨基酸序列相
对于天然序列抗体的改变。任选的是，变异是通过抗FcRH5抗体的一个或多
个结构域中至少一个氨基酸为任何其它氨基酸所替代。通过比较抗FcRH5抗
体的序列与同源已知蛋白质分子的序列，并将高同源区中进行的氨基酸序列
改变的数目最少化，可发现确定哪些氨基酸残基可插入、替代或删除而不会
对期望活性有不利影响的方针。氨基酸替代可以是将一种氨基酸用具有相似
结构和/或化学特性的另一种氨基酸替代的结果，诸如用丝氨酸替代亮氨酸，
即保守氨基酸替代。插入或删除可任选在约1个至5个氨基酸的范围内。可通
过在序列中系统进行氨基酸插入、替代或删除，并对所得变体测试由全长或
成熟天然序列展示的活性来确定可容许的变异。
本文提供了抗FcRH5抗体片段。例如，在与全长天然抗体或蛋白质比较
时，此类片段可在N-末端或C-末端截短，或者可缺少内部残基。某些片段缺
少对于抗FcRH5抗体的期望生物学活性不是至关重要的氨基酸残基。
抗FcRH5抗体可通过多种常规技术中的任一种来制备。期望肽片段可化
学合成。一种备选方法涉及通过酶促消化产生抗体或多肽片段，例如通过用
已知在由特定氨基酸残基限定的位点处切割蛋白质的酶处理蛋白质，或者通
过用合适的限制酶消化DNA，并分离期望片段。还有一种合适的技术涉及分
离并通过聚合酶链式反应(PCR)扩增编码期望抗体或多肽片段的DNA片段。
限定DNA片段期望末端的寡核苷酸在PCR中用作5′和3′引物。优选的是，抗
FcRH5抗体片段与本文所公开的天然抗FcRH5抗体共享至少一种生物学和/
或免疫学活性。
在具体实施方案中，感兴趣的保守替代见表8标题“优选替代”下所示。
如果此类替代导致生物学活性的改变，那么可引入表8中称为“例示替代”的
更实质性改变，或者如下文关于氨基酸类别进一步所述的，并筛选产物。
表8
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对抗FcRH5抗体的功能或免疫学身份的实质性修饰通过选择在保持以
下方面的效果上显著不同的替代来完成：(a)替代区域的多肽主链的结构，
例如作为折叠片或螺旋构象，(b)靶位点处分子的电荷或疏水性，或(c)侧链
的体积。根据共同的侧链特性，天然存在残基可如下分组：
(1)疏水性的：正亮氨酸、Met、Ala、Val、Leu、Ile；
(2)中性、亲水性的：Cys、Ser、Thr、Asn、Gln；
(3)酸性的：Asp、Glu；
(4)碱性的：His、Lys、Arg；
(5)影响侧链取向的残基：Gly、Pro；和
(6)芳族的：Trp、Tyr、Phe。
非保守替代将需要用这些类别之一中的一个成员交换另一个类别的。还
可以将此类替代残基引入保守替代位点，或者更优选的是，引入剩余的(非
保守)位点。
变异可使用本领域知道的方法来进行，诸如寡核苷酸介导的(定点)诱
变、丙氨酸扫描、及PCR诱变。可对克隆的DNA进行定点诱变(Carter等，Nucl.
Acids Res.13：4331(1986)；Zoller等，Nucl.Acids Res.10：6487(1987))、盒式诱
变(Wells等，Gene 34：315(1985))、限制性选择诱变(restriction selection
mutagenesis)(Wells等，Philos.Trans.R.Soc.London SerA 317：415(1986))或其
它已知技术以产生抗FcRH5抗体变体DNA。
还可采用扫描氨基酸分析来鉴定沿着连续序列的一个或多个氨基酸。在
优选的扫描用氨基酸中有相对较小的中性氨基酸。此类氨基酸包括丙氨酸、
甘氨酸、丝氨酸和半胱氨酸。丙氨酸通常是这组中的优选扫描用氨基酸，因
为它消除了β-碳上的侧链，而且不大可能改变变体的主链构象(Cunningham
和Wells，Science 244：1081-1085(1989))。丙氨酸通常也是优选的，因为它是
最常见的氨基酸。另外，常常在隐蔽位置和暴露位置都能发现它(Creighton，
The Proteins，W.H.Freeman & Co.，N.Y.；Chothia，J.Mol.Biol.150：1(1976))。
如果丙氨酸替代不产生足够量的变体，那么可使用等排(isoteric)氨基酸。
任何不涉及保持抗FcRH5抗体正确构象的半胱氨酸残基也可被替代，通
常用丝氨酸，以改进分子的氧化稳定性和防止异常交联。相反，可向抗FcRH5
抗体中添加半胱氨酸键以改善其稳定性(特别是当抗体是抗体片段诸如Fv
片段时)。
特别优选的一类替代变体涉及替代亲本抗体的一个或多个高变区残基
(例如人源化或人抗体)。通常，选择用于进一步开发的所得变体相对于产
生它们的亲本抗体将具有改进的生物学特性。产生此类替代变体的一种便利
方法涉及使用噬菌体展示进行的亲和力成熟。简而言之，将数个高变区位点
(例如6-7个位点)突变，在各个位点产生所有可能的氨基酸替代。如此产
生的抗体变体以单价形式展示在丝状噬菌体颗粒上，作为与各个颗粒内包装
的M13基因III产物的融合物。然后如本文所公开的对噬菌体展示的变体筛选
其生物学活性(例如结合亲和力)。为了鉴定用于修饰的候选高变区位点，
可进行丙氨酸扫描诱变以鉴定对抗原结合有重要贡献的高变区残基。或者/
另外，分析抗原-抗体复合物的晶体结构以鉴定抗体和FcRH5多肽之间的接触
点可能是有益的。此类接触残基及邻近残基是依照本文详述技术进行替代的
候选位点。一旦产生此类变体，如本文所述对该组变体进行筛选，可选择在
一种或多种相关测定法中有优良特性的抗体用于进一步的开发。
编码抗FcRH5抗体的氨基酸序列变体的核酸分子可通过本领域已知的
多种方法来制备。这些方法包括但不限于从天然来源分离(在天然存在氨基
酸序列变体的情况中)，或者通过对早期制备的变体或非变体形式的抗
FcRH5抗体进行寡核苷酸介导的(或定点)诱变、PCR诱变和盒式诱变来制
备。
E.对抗FcRH5抗体的修饰
对抗FcRH5抗体的共价修饰包括在本发明的范围内。一种类型的共价修
饰包括使抗FcRH5抗体的靶氨基酸残基与有机衍生化试剂反应，该有机衍生
化试剂能够与抗FcRH5抗体的选定侧链或者N-或C-末端残基起反应。用双功
能试剂进行的衍生化可用于例如使抗FcRH5抗体与不溶于水的支持基质或
表面交联，以用于抗FcRH5抗体的纯化方法，反之亦然。常用的交联剂包括
例如1，1-双(重氮-乙酰基)-2-苯乙烷、戊二醛、N-羟基琥珀酰亚胺酯例如与4-
叠氮水杨酸形成的酯、同双功能亚氨酸酯包括二琥珀酰亚胺酯诸如3，3′-二硫
代双(琥珀酰亚氨基丙酸酯)、双功能马来酰亚胺诸如双-N-马来酰亚胺-1，8-
辛烷和诸如甲基-3-[(对-叠氮苯基)二硫代]丙酰亚胺酯等试剂。
其它修饰包括谷氨酰胺酰和天冬酰胺酰残基分别脱酰胺为谷氨酰和天
冬氨酰残基，脯氨酸和赖氨酸的羟基化，丝氨酰或苏氨酰残基的羟基的磷酸
化，赖氨酸、精氨酸和组氨酸侧链的α-氨基的甲基化(T.E.Creighton，Proteins：
Structure and Molecular Properties，W.H.Freeman & Co.，San Francisco，pp.
79-86(1983))，N-末端胺的乙酰化，及任何C-末端羧基的酰胺化。
本发明范围内所包括的对抗FcRH5抗体的另一类共价修饰包括改变抗
体或多肽的天然糖基化样式。“改变天然糖基化样式”在本文中意图指删除一
个或多个在天然序列抗FcRH5抗体中发现的碳水化合物模块(moiety)(或是
通过消除潜在糖基化位点，或是通过以化学和/或酶促手段删除糖基化)，和/
或添加一个或多个在天然序列抗FcRH5抗体中不存在的糖基化位点。另外，
此短语包括天然蛋白质糖基化中的质的改变，涉及所存在的多种碳水化合物
模块的本质和比例的改变。
抗体和其它多肽的糖基化通常或是N-连接的或是O-连接的。N-连接指碳
水化合物模块附着于天冬酰胺残基的侧链。三肽序列天冬酰胺-X-丝氨酸和
天冬酰胺-X-苏氨酸(其中X是除脯氨酸外的任何氨基酸)是将碳水化合物模
块酶促附着于天冬酰胺侧链的识别序列。由此，多肽中这些三肽序列其中任
一的存在产生潜在的糖基化位点。O-连接的糖基化指将糖类N-乙酰半乳糖
胺、半乳糖或木糖之一附着于羟基氨基酸，最常见的是丝氨酸或苏氨酸，但
也可使用5-羟脯氨酸或5-羟赖氨酸。
向抗FcRH5抗体中添加糖基化位点通过改变氨基酸序列使其包含一个
或多个上述三肽序列而便利地完成(用于N-连接的糖基化位点)。这种改变
还可通过向原始抗FcRH5抗体的序列中添加或替代一个或多个丝氨酸或苏
氨酸残基来进行(用于O-连接的糖基化位点)。可任选通过DNA水平的变化
来改变抗FcRH5抗体的氨基酸序列，特别是通过在预先选择的碱基处突变编
码抗FcRH5抗体的DNA，从而产生将翻译成期望氨基酸的密码子。
增加抗FcRH5抗体上糖模块的数目的另一种方法是通过使糖苷与多肽
化学或酶促偶联。本领域对此类方法有描述，例如1987年9月11日公开的WO
87/05330，及Aplin和Wriston，CRC Crit.Rev.Biochem.，pp.259-306(1981)。
去除抗FcRH5抗体上存在的糖模块可通过化学或酶促方法来实现，或者
通过编码充当糖基化靶物的氨基酸残基的密码子的突变替代。化学脱糖基化
技术是本领域已知的，而且描述于例如Hakimuddin等，Arch.Biochem.
Biophys.259：52(1987)和Edge等，Anal.Biochem.118：131(1981)。酶促切割多
肽上的糖模块可通过使用多种内切和外切糖苷酶来实现，如Thotakura等，
Meth.Enzvmol.138：350(1987)所述。
对抗FcRH5抗体的另一类共价修饰包括，以美国专利4,640,835；
4,496,689；4,301,144；4,670,417；4,791,192或4,179,337所述方式，将抗体与多
种非蛋白质性质的聚合物之一连接，例如聚乙二醇(PEG)、聚丙二醇或聚氧
亚烷(polyoxyalkylene)。抗体还可包载于例如通过凝聚技术或通过界面聚合
制备的微胶囊中(例如分别是羟甲基纤维素或明胶微胶囊和聚(甲基丙烯酸
甲酯)微胶囊)、在胶状药物递送系统中(例如脂质体、清蛋白微球体、微乳
剂、纳米颗粒和纳米胶囊)或在粗滴乳状液中。此类技术公开于例如
Remington′s Pharmaceutical Sciences，16th edition，Osol，A.Ed.，1980。
还可以形成嵌合分子的方式修饰本发明的抗FcRH5抗体，所述嵌合分子
包含与另一种异源多肽或氨基酸序列融合的抗FcRH5抗体。
在一个实施方案中，此类嵌合分子包括带有标签多肽的抗FcRH5抗体的
融合物，所述标签多肽提供了抗标签抗体可选择性结合的表位。表位标签通
常位于抗FcRH5抗体的氨基或羧基末端。此类表位标记形式的抗FcRH5抗体
的存在可使用针对所述标签多肽的抗体来检测。而且，表位标签的提供使抗
FcRH5抗体易于使用抗标签抗体或另一类结合所述表位标签的亲和基质通
过亲和纯化来纯化。多种标签多肽及其各自抗体是本领域公知的。例子包括
多组氨酸(poly-his)或多-组氨酸-甘氨酸(poly-his-gly)标签；流感HA标签多肽
及其抗体12CA5(Field等，Mol.Cell.Biol.8：2159-2165(1988))；c-myc标签及
其抗体8F9，3C7，6E10，G4，B7和9E10抗体(Evan等，Molecular and Cellular
Biology 5：3610-3616(1985))；及单纯疱疹病毒糖蛋白D(gD)标签及其抗体
(Paborsky等，Protein Engineering 3(6)：547-553(1990))。其它标签多肽包括
Flag肽(Hopp等，BioTechnology 6：1204-1210(1988))；KT3表位肽(Martin等，
Science 255：192-194(1992))；α-微管蛋白表位肽(Skinner等，J.Biol.Chem.266：
15163-15166(1991))；及T7基因10蛋白肽标签(Lutz-Freyermuth等，Proc.Natl.
Acad.Sci.USA 87：6393-6397(1990))。
在一个备选实施方案中，嵌合分子可包括抗FcRH5抗体与免疫球蛋白或
免疫球蛋白特定区域的融合物。对于二价形式的嵌合分子(也称为“免疫粘
附素”)，此类融合物可以是与IgG分子Fc区的融合。Ig融合物优选包含用可
溶形式(跨膜结构域删除或失活)的抗FcRH5抗体置换Ig分子内至少一个可
变区的替代。在一个特别优选的实施方案中，免疫球蛋白融合物包含IgG1
分子的铰链区、CH2区和CH3区，或者铰链区、CH1区、CH2区和CH3区。关
于免疫球蛋白融合物的制备还可参见1995年6月27日授权的美国专利
5,428,130。
F.抗FcRH5抗体的制备
下面的描述主要涉及通过培养用包含编码抗FcRH5抗体的核酸的载体
转化或转染的细胞来制备抗FcRH5抗体。当然可采用本领域公知的备选方法
来制备抗FcRH5抗体。例如，可使用固相技术通过直接肽合成来生成适宜的
氨基酸序列或其部分(参见例如Stewart等，Solid-Phase Peptide Synthesis，W.H.
Freeman Co.，San Francisco，CA，1969；Merrifield，J.Am.Chem.Soc.85：
2149-2154(1963))。体外蛋白质合成可使用手工技术或通过自动化来进行。
自动化合成可例如使用Applied Biosystems Peptide Synthesizer(Foster City，
CA)依照制造商的说明书来完成。抗FcRH5抗体的多个部分可分开化学合成，
并使用化学或酶促方法组合以生成期望的抗FcRH5抗体。
1.编码抗FcRH5抗体的DNA的分离
编码抗FcRH5抗体的DNA可以从cDNA文库获得，所述cDNA文库从认为
具有所述抗FcRH5抗体mRNA且以可检测水平表达它的组织制备。因此，人
的抗FcRH5抗体DNA可以方便地从以人组织制备的cDNA文库获得。抗
FcRH5抗体编码基因也可从基因组文库或通过已知的合成流程(例如自动化
核酸合成)获得。
可以用设计用于鉴定目的基因或由其编码的蛋白质的探针(诸如至少约
20-80个碱基的寡核苷酸)筛选文库。用选定探针筛选cDNA或基因组文库可
使用标准流程进行，诸如Sambrook等，Molecular Cloning：A Laboratory
Manual，New York，Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989所述。分离编码
抗FcRH5抗体的基因的一种备选方法是使用PCR方法学(Sambrook等，见上
文；Dieffenbach等，PCR Primer：A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor
Laboratory Press，1995)。
用于筛选cDNA文库的技术是本领域公知的。选作探针的寡核苷酸序列
应该足够长且足够明确(unambiguous)，使得假阳性降到最低。寡核苷酸优选
是标记的，使得它在与所筛选文库中的DNA杂交时可检测出。标记方法是本
领域公知的，包括使用放射标记物，像32P-标记的ATP、生物素化或酶标记。
杂交条件，包括中等严格性和高度严格性，见Sambrook等，见上文。
在此类文库筛选方法中鉴定的序列可以与保藏的和公共数据库诸如
GenBank或其它私有序列数据库中可得到的其它已知序列比较和对比。所述
分子限定区域内的或跨越全长序列的序列同一性(或是在氨基酸水平上或是
在核苷酸水平上)可使用本领域知道的和本文描述的方法来测定。
具有蛋白质编码序列的核酸可通过使用本文首次公开的推断的氨基酸
序列筛选选定的cDNA或基因组文库来获得，并且必要时，使用Sambrook等，
见上文所述常规引物延伸流程来检测可能不会逆转录为cDNA的mRNA的前
体和加工的中间产物。
2.宿主细胞的选择和转化
将宿主细胞用本文所述用于抗FcRH5抗体生成的表达或克隆载体转染
或转化，并在为了诱导启动子、选择转化子或扩增编码期望序列的基因而恰
当调整的常规营养培养基中培养。培养条件，诸如培养基、温度、pH等等，
可以由本领域技术人员无需过多实验就选择。通常，用于使细胞培养物生产
力最大化的原理、方案和实用技术可参见Mammalian Cell Biotechnology：a
Practical Approach，M.Butler，ed.，IRL Press，1991和Sambrook等，见上文。
真核细胞转染和原核细胞转化(即将DNA导入宿主中，使得DNA能够
进行复制，或是作为染色体外元件或是通过染色体整合)的方法是普通技术
人员所知道的，例如CaCl2、CaPO4、脂质体介导的、聚乙二醇/DMSO和电穿
孔。根据所用宿主细胞，转化使用对此类细胞适宜的标准技术进行。采用氯
化钙的钙处理，如Sambrook等，见上文所述，或电穿孔通常用于原核细胞。
用根瘤土壤杆菌(Agrobacterium tumefaciens)的感染用于某些植物细胞的转
化，如Shaw等，Gene 23：315(1983)和1989年6月29日公开的WO 89/05859所
述。对于没有此类细胞壁的哺乳动物细胞，可采用Graham和van der Eb，
Virology 52：456-457(1978)的磷酸钙沉淀法。哺乳动物细胞宿主系统转染的
一般情况参见美国专利4,399,216。进入酵母的转化通常依照Van Solingen等，J.
Bact.130：946(1977)和Hsiao等，Proc.Natl.Acad.Sci.(USA)76：3829(1979)
的方法来进行。然而，也可使用用于将DNA导入细胞的其它方法，诸如核显
微注射、电穿孔、细菌原生质体与完整细胞的融合或聚阳离子例如polybrene、
聚鸟氨酸。关于用于转化哺乳动物细胞的多种技术见Keown等，Methods in
Enzvmology 185：527-537(1990)和Mansour等，Nature 336：348-352(1988)。
适于克隆或表达本文载体中的DNA的宿主细胞包括原核生物、酵母或高
等真核细胞。
a.原核宿主细胞
合适的原核生物包括但不限于古细菌和真细菌，诸如革兰氏阴性或革兰
氏阳性生物体，例如肠杆菌科，诸如大肠杆菌。多种大肠杆菌菌株是公众可
获得的，诸如大肠杆菌K12菌株MM294(ATCC 31,446)；大肠杆菌X1776
(ATCC 31,537)；大肠杆菌菌株W3110(ATCC 27,325)和K5 772(ATCC
53,635)。其它合适的原核生物宿主细胞包括肠杆菌科，诸如埃希氏菌属
(Escherichia)例如大肠埃希氏菌(大肠杆菌)(E.coli)、肠杆菌属
(Enterobacter)、欧文氏菌属(Erwinia)、克雷伯氏菌属(Klebsiella)、变形
菌属(Proteus)、沙门氏菌属(Salmonella)例如鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella
typhimurium)、沙雷氏菌属(Serratia)例如粘质沙雷氏菌(Serratia marcescans)
和志贺氏菌属(Shigella)，以及芽孢杆菌属(Bacilli)诸如枯草芽孢杆菌(B.
subtilis)和地衣芽孢杆菌(B.licheniformis)(例如1989年4月12日出版的DD
266,710中公开的地衣芽孢杆菌41P)、假单胞菌属(Pseudomonas)诸如铜绿
假单胞菌(P.aeruginosa)、根瘤菌属(Rhizobia)、透明颤菌属(Vitreoscilla)
副球菌属(Paracoccus)和链霉菌属(Streptomyces)。这些例子是例示性的
而非限制性的。菌株W3110是一个特别优选的宿主或亲本宿主，因为它是用
于重组DNA产物发酵的常用宿主菌株。优选的是，宿主细胞分泌最小量的蛋
白水解酶。例如，菌株W3110(Bachmann，Cellular and Molecular Biology，vol.
2(Washington，D.C.：American Society for Microbiology，1987)，pp.1190-1219；
ATCC保藏号27,325)可以修饰，在编码对宿主而言内源的蛋白质的基因中产
生遗传突变，此类宿主的例子包括大肠杆菌W3110菌株1A2，其具有完整基
因型tonA；大肠杆菌W3110菌株9E4，其具有完整基因型tonA ptr3；大肠杆菌
W3110菌株27C7(ATCC 55,244)，其具有完整基因型tonA ptr3 phoA E15
(argF-lac)169 degP ompT kanr；大肠杆菌W3110菌株37D6，其具有完整基因
型tonA ptr3 phoA E15(argF-lac)169 degP ompT rbs7 ilvG kanr；大肠杆菌
W3110菌株40B4，它是具有非卡那霉素抗性degP删除突变的菌株37D6；大
肠杆菌W3110菌株33D3，它具有基因型W3110ΔfhuA(ΔtonA)ptr3 lac Iq lacL8
ΔompTΔ(nmpc-fepE)degP41 kanR(美国专利No.5,639,635)；及具有1990年8月
7日授权的美国专利4,946,783中公开的突变型周质蛋白酶的大肠杆菌菌株。
其它菌株及其衍生物，诸如大肠杆菌294(ATCC 31,446)、大肠杆菌B、大肠
杆菌λ1776(ATCC 31,537)和大肠杆菌RV308(ATCC 31,608)也是合适的。
这些例子只是例示而非限制。本领域知道用于构建具有指定基因型的任何上
述细菌衍生物的方法，参见例如Bass等，Proteins 8：309-314(1990)。通常必需
考虑复制子在细菌细胞中的可复制性来选择适宜的细菌。例如，在使用众所
周知的质粒诸如pBR322、pBR325、pACYC177或pKN410来提供复制子时，
大肠杆菌、沙雷氏菌属或沙门氏菌属物种可能适于用作宿主。通常，宿主细
胞应当分泌最小量的蛋白水解酶，而且可能希望在细胞培养中掺入额外的蛋
白酶抑制剂。或者，体外克隆方法，例如PCR或其它核酸聚合酶反应也是合
适的。
全长抗体、抗体片段及抗体融合物蛋白质可在细菌中制备，特别是在不
需要糖基化和Fc效应器功能时，诸如当治疗用抗体与细胞毒剂(例如毒素)
偶联且免疫偶联物自身显示出肿瘤细胞破坏的效力时。全长抗体在循环中具
有较长半衰期。大肠杆菌中的制备更快且更加省钱。对于抗体片段和多肽在
细菌中的表达，参见例如US 5,648,237(Carter等人)，US 5,789,199(JoIy等人)，
和US 5,840,523(Simmons等人)，它们描述了用于优化表达和分泌的翻译起始
区(TIR)和信号序列，在此收入这些专利作为参考。表达后，从大肠杆菌细胞
糊在可溶性级分中分离抗体，并且可例如根据同种型通过蛋白A或G柱来纯
化。最终的纯化可以与用于纯化例如在CHO细胞中表达的抗体的方法类似的
进行。
b.真核宿主细胞
除了原核生物以外，真核微生物，诸如丝状真菌或酵母也是编码抗
FcRH5抗体的载体的合适克隆或表达宿主。酿酒糖酵母(Saccharomyces
cerevisiae)是常用的低等真核宿主微生物。其它的包括粟酒裂殖糖酵母
(Schizosaccharomyces pombe)(Beach和Nurse，Nature 290：140(1981)；EP
139,383，1985年5月2日公开)；克鲁维酵母属(Kluyveromyces)宿主(美国专
利4,943,529；Fleer等，Bio/Technology 9：968-975(1991))诸如例如乳酸克鲁维
酵母(K.lactis)(MW98-8C，CBS683，CBS4574；Louvencourt等，J.Bacteriol.
154(2)：737-742(1983))、脆壁克鲁维酵母(K.fragilis)(ATCC 12,424)、保加
利亚克鲁维酵母(K.bulgaricus)(ATCC 16,045)、威克克鲁维酵母(K.
wickeramii)(ATCC 24,178)、K.waltii(ATCC 56,500)、果蝇克鲁维酵母(K.
drosophilarum)(ATCC 36,906；Van den Berg等，Bio/Technology 8：135(1990))、
耐热克鲁维酵母(K.thermotolerans)和马克思克鲁维酵母(K.marxianus)；
亚罗酵母属(Yarrowia)(EP 402,226)；巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)(EP
183,070；Sreekrishna等，J.Basic Microbiol.28：265-278(1988))；假丝酵母属
(Candida)；瑞氏木霉(Trichoderma reesia)(EP 244,234)；粗糙脉孢菌
(Neurospora crassa)(Case等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 76：5259-5263
(1979))；许旺酵母属(Schwanniomyces)诸如许旺酵母(Schwanniomyces
occidentalis)(EP 394,538，1990年10月31日公开)；和丝状真菌诸如例如脉孢
菌属(Neurospora)、青霉属(Penicillium)、弯颈霉属(Tolypocladium)(WO
91/00357，1991年1月10日公开)和曲霉属(Aspergillus)宿主诸如构巢曲霉(A.
nidulans)(Balance等，Biochem.Biophys.Res.Commun.112：284-289(1983)；
Tilburn等，Gene 26：205-221(1983)；Yelton等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 81：
1470-1474(1984))和黑曲霉(A.niger)(Kelly和Hynes，EMBO J.4：475-479
(1985))。甲基营养型酵母(Methylotropic yeast)适于本发明，包括但不限于能
够在甲醇上生长的、选自以下属的酵母：汉逊氏酵母属(Hansenula)、假丝酵
母属(Candida)、克勒克氏酵母属(Kloeckera)、毕赤氏酵母属(Pichia)、糖酵母
属(Saccharomyces)、球拟酵母属(Torulopsis)和红酵母属(Rhodotorula)。作为
这类酵母的例子的具体物种列表可参见C.Anthony，The Biochemistry of
Methylotrophs，269(1982)。
适用于表达糖基化抗FcRH5抗体的宿主细胞衍生自多细胞生物体。无脊
椎动物细胞的例子包括昆虫细胞诸如果蝇S2和夜蛾Sf9，以及植物细胞诸如
棉、玉米、马铃薯、大豆、矮牵牛、番茄、烟草的细胞培养物。。已经鉴定
了许多杆状病毒株和变体及相应的允许的昆虫宿主细胞，它们来自诸如草地
夜蛾Spodoptera frugiperda(毛虫)、埃及伊蚊Aedes aegypti(蚊子)、白纹伊
蚊Aedes albopictus(蚊子)、黑腹果蝇Drosophila melanogaster(果蝇)和家
蚕Bombyx mori等宿主。公众可获得多种病毒株用于转染，例如苜蓿尺蠖
(Autographa californica)NPV的L-1变体和家蚕(Bombyx mori)NPV的Bm-5
株，而且此类病毒可依照本发明用作本文的病毒，特别是用于转染草地夜蛾
细胞。
然而，对脊椎动物细胞最感兴趣，而且通过培养(组织培养)脊椎动物
细胞来繁殖已经成为常规流程。有用的哺乳动物宿主细胞系的例子是用SV40
转化的猴肾CV1系(COS-7，ATCC CRL 1651)；人胚肾系(293或为了在悬
浮培养中生长而亚克隆的293细胞，Graham等，1977，J.Gen Virol.36：59)；幼
仓鼠肾细胞(BHK，ATCC CCL 10)；中国仓鼠卵巢细胞/-DHFR(CHO，Urlaub
等，1980，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 77：4216)；小鼠塞托利(sertoli)细胞(TM4，
Mather，1980，Biol.Reprod.23：243-251)；猴肾细胞(CV1，ATCC CCL 70)；
非洲绿猴肾细胞(VERO-76，ATCC CRL-1587)；人宫颈癌细胞(HELA，
ATCC CCL 2)；犬肾细胞(MDCK，ATCC CCL 34)；牛鼠(buffalo rat)肝细胞
(BRL 3A，ATCC CRL 1442)；人肺细胞(W138，ATCC CCL 75)；人肝细
胞(Hep G2，HB 8065)；小鼠乳腺肿瘤(MMT 060562，ATCC CCL 51)；
TRI细胞(Mather等，1982，Annals N.Y.Acad.Sci.383：44-68)；MRC5细胞；
FS4细胞；和人肝肉瘤系(Hep G2)。
用上述用于抗FcRH5抗体生成的表达或克隆载体转化宿主细胞，并在为
了诱导启动子、选择转化子或扩增编码期望序列的基因而恰当调整的常规营
养培养基中培养。
3.复制型载体的选择和使用
为了重组生产本发明的抗体，分离编码它的核酸(例如cDNA或基因组
DNA)，并将其插入可复制载体，用于进一步克隆(DNA扩增)或表达。可
使用常规规程容易的分离编码抗体的DNA并测序(例如使用能够与编码抗体
重链和轻链的基因特异性结合的寡核苷酸探针)。可利用许多载体。载体的
选择部分取决于将要使用的宿主细胞。一般而言，优选的宿主细胞或是原核
或是真核(通常是哺乳动物)起源的。
载体可以是例如质粒、粘粒、病毒颗粒或噬菌体的形式。可以通过多种
方法将适宜的核酸序列插入载体。通常，使用本领域已知的技术将DNA插入
适宜的限制性内切酶位点。载体构件通常包括但不限于下列一种或多种：信
号序列、复制起点、一种或多种标记基因、增强子元件、启动子和转录终止
序列。包含一种或多种这些构件的合适载体的构建采用技术人员已知的标准
连接技术。
FcRH5不仅可以直接重组生产，而且可以作为与异源多肽的融合多肽，
所述异源多肽可以是在成熟蛋白质或多肽的N-末端具有特定切割位点的信
号序列或其它多肽。通常，信号序列可以是载体的构件，或者它可以是插入
载体的编码抗FcRH5抗体的DNA的一部分。信号序列可以是原核信号序列，
选自例如碱性磷酸酶、青霉素酶、lpp或热稳定的肠毒素II前导序列。为了酵
母分泌，信号序列可以是例如酵母转化酶前导序列、α因子前导序列(包括
糖酵母和克鲁维酵母的α-因子前导序列，后者见美国专利5,010,182)或酸性
磷酸酶前导序列、白色假丝酵母葡糖淀粉酶前导序列(1990年4月4日公开的
EP 362,179)或1990年11月15日公开的WO 90/13646中描述的信号。在哺乳动
物细胞表达中，可以使用哺乳动物信号序列来指导蛋白质的分泌，诸如来自
相同或相关物种的分泌型多肽的信号序列，以及病毒分泌前导序列。
a.原核宿主细胞
可使用标准重组技术来获得编码本发明抗体多肽构件的多核苷酸序列。
可以从抗体生成细胞诸如杂交瘤细胞分离期望的多核苷酸序列并测序。或
者，可使用核苷酸合成仪或PCR技术合成多核苷酸。一旦得到，将编码多肽
的序列插入能够在原核宿主中复制并表达异源多核苷酸的重组载体。为了本
发明目的，可使用本领域可获得的且知道的许多载体。适宜载体的选择会主
要取决于将要插入载体的核酸的大小和将要用载体转化的具体宿主细胞。根
据其功能(扩增或表达异源多核苷酸，或二者兼之)及其与它在其中驻留的
具体宿主细胞的相容性，每种载体含有多种构件。
一般而言，与宿主细胞一起使用包含衍生自与这些宿主相容物种的复制
子和控制序列的质粒载体。表达和克隆载体都包含使载体能够在一种或多种
所选择的宿主细胞中复制的核酸序列，以及能够在转化细胞中提供表型选择
的标志序列。众所周知多种细菌、酵母和病毒的此类序列。来自质粒pBR322
(其包含编码氨苄青霉素(Amp)和四环素(Tet)抗性的基因，由此提供轻松鉴
定转化细胞的手段)的复制起点适合于大多数革兰氏阴性细菌，2μ质粒起点
适合于酵母，而各种病毒起点(SV40、多瘤病毒、腺病毒、VSV或BPV)可
用于哺乳动物细胞中的克隆载体。pBR322、其衍生物或其它微生物质粒或
噬菌体还可包含或经修饰而包含可被微生物生物体用于表达内源蛋白质的
启动子。Carter等，美国专利No.5,648,237中详细记载了用于表达特定抗体的
pBR322衍生物的例子。
另外，可以将包含与宿主微生物相容的复制子和控制序列的噬菌体载体
用作这些宿主的转化载体。例如，可使用噬菌体诸如λGEM.TM.-11来构建可
用于转化易感宿主细胞诸如大肠杆菌LE392的重组载体。
本发明的表达载体可包含两种或更多启动子-顺反子对，它们编码每一
种多肽构件。启动子是位于顺反子上游(5′)的非翻译调控序列，它调控顺
反子的表达。原核启动子通常分成两类，诱导型的和组成性的。诱导型启动
子指响应培养条件的变化(例如营养物的存在与否或温度变化)而启动受其
控制的顺反子的升高水平转录的启动子。
众所周知受到多种潜在宿主细胞识别的大量启动子。通过限制酶消化切
下源DNA中的启动子并将分离的启动子序列插入本发明的载体，由此可以将
选择的启动子与编码轻链或重链的顺反子DNA可操作连接。天然启动子序列
和许多异源启动子都可用于指导靶基因的扩增和/或表达。在有些实施方案
中，使用异源启动子，因为与天然靶多肽启动子相比，它们通常容许所表达
靶基因的更高转录和更高产量。
众所周知受到多种潜在宿主细胞识别的启动子。适用于原核宿主的启动
子包括PhoA启动子、β-半乳糖苷酶和乳糖启动子系统[Chang et al.，Nature，
275：615(1978)；Goeddel et al.，Nature，281：544(1979)]、碱性磷酸酶、色氨酸
(trp)启动子系统[Goeddel，Nucleic Acids Res.，8：4057(1980)；EP 36,776]和杂
合启动子诸如tac或trc启动子。用于细菌系统的启动子还将包含与编码抗
FcRH5抗体的DNA可操作连接的Shine-Dalgarno(S.D.)序列。然而，在细菌中
有功能的其它启动子(诸如其它已知的细菌或噬菌体启动子)也是合适的。
它们的核苷酸序列已经发表，由此熟练工作人员能够使用提供任何所需限制
性位点的接头或衔接头将它们与编码靶轻链和重链的顺反子可操作连接
(Siebenlist等(1980)Cell 20：269)。
在本发明的一个方面，重组载体内的每个顺反子都包含指导所表达多肽
穿膜转运的分泌信号序列构件。一般而言，信号序列可以是载体的构件，或
者它可以是插入载体的靶多肽DNA的一部分。为了本发明目的而选择的信号
序列应当是受到宿主细胞识别并加工(即被信号肽酶切除)的信号序列。对
于不识别并加工异源多肽的天然信号序列的原核宿主细胞，将信号序列用选
自例如下组的原核信号序列替代：碱性磷酸酶、青霉素酶、Ipp或热稳定的
肠毒素II(STII)前导序列、LamB、PhoE、PelB、OmpA和MBP。在本发明的
一个实施方案中，表达系统的两个顺反子中都使用的信号序列是STII信号序
列或其变体。
在另一方面，依照本发明的免疫球蛋白的生成可以在宿主细胞的细胞质
中发生，因此不需要在每个顺反子内存在分泌信号序列。在那点上，免疫球
蛋白轻链和重链在细胞质内表达、折叠和装配而形成功能性免疫球蛋白。某
些宿主菌株(例如大肠杆菌trxB-菌株)提供有利于二硫键形成的细胞质条件，
从而容许所表达蛋白质亚基的正确折叠和装配。Proba和Pluckthun，Gene 159：
203(1995)。
本发明提供了如下表达系统，其中所表达多肽构件的数量比率可以受到
调控，从而将分泌且正确装配的本发明抗体的产量最大化。此类调控是至少
部分通过同时调控多肽构件的翻译强度而实现的。
Simmons等，美国专利No.5,840,523中公开了用于调控翻译强度的一种
技术。它在顺反子内利用翻译起始区(TIR)的变体。对于指定的TIR，可创建
具有一定范围翻译强度的一系列氨基酸或核酸序列变体，由此提供针对特定
链的期望表达水平调节此因素的方便手段。可通过常规诱变技术导致能改变
氨基酸序列的密码子变化来生成TIR变体，尽管核苷酸序列中的沉默变化是
优选的。TIR中的改变可包括例如Shine-Dalgarno序列的数目或间距的改变，
及信号序列中的改变。用于生成突变型信号序列的一种方法是在编码序列的
开始端生成不改变信号序列氨基酸序列的“密码子库”(即变化是沉默的)。
这可通过改变每个密码子的第三个核苷酸位置来实现；另外，有些氨基酸，
诸如亮氨酸、丝氨酸和精氨酸，具有多种第一个和第二个位置，这可在建库
中增加复杂性。Yansura等(1992)METHODS：A Companion to Methods in
Enzymol.4：151-158中详细记载了这种诱变方法。
优选的是，对于载体中的每个顺反子，生成具有一定范围TIR强度的一
组载体。这个有限集合提供了每条链的表达水平以及期望抗体产物的产量在
各种TIR强度组合下的比较。可通过量化报道基因的表达水平来测定TIR强
度，Simmons等，美国专利No.5,840,523中有详细描述。根据翻译强度的比较，
选择期望的个别TIR在本发明的表达载体构建物中进行组合。
b.真核宿主细胞
载体构件通常包括但不限于下列一种或多种：信号序列、复制起点、一
种或多种标志基因、增强子元件、启动子和转录终止序列。
(1)信号序列构件
在真核宿主细胞中使用的载体还可在感兴趣成熟蛋白质或多肽的N端包
含信号序列或具有特异性切割位点的其它多肽。异源信号序列优选是受到宿
主细胞识别并加工(即被信号肽酶切除)的。在哺乳动物细胞表达中，可利
用哺乳动物信号序列以及病毒分泌前导，例如单纯疱疹gD信号。
将此类前体区的DNA连接到编码抗体的DNA的读码框中。
(2)复制起点
通常，哺乳动物表达载体不需要复制起点构件。例如，通常可使用SV40
起点，只因其包含早期启动子。
(3)选择基因构件
表达和克隆载体通常会包含选择基因，也称为选择标志。典型的选择基
因编码如下蛋白质：(a)赋予对抗生素或其它毒素的抗性，例如氨苄青霉素、
新霉素、甲氨蝶呤或四环素；(b)补足营养缺陷；或(c)提供不能从复合培养基
获得的关键营养物，例如用于芽孢杆菌的编码D-丙氨酸消旋酶的基因。
选择方案的一个例子利用药物来阻滞宿主细胞的生长。经异源基因成功
转化的那些细胞生成赋予药物抗性的蛋白质，因而幸免于选择方案。此类显
性选择的例子使用药物新霉素、霉酚酸和潮霉素。
适于哺乳动物细胞的选择标志的一个例子是能够鉴定有能力摄取抗
FcRH5抗体编码核酸的细胞的选择标志，诸如DHFR或胸苷激酶、金属硫蛋
白I和II(优选灵长类金属硫蛋白基因)、腺苷脱氨酶、鸟氨酸脱羧酶等。在
采用野生型DHFR时，适宜的宿主细胞是DHFR活性缺陷的CHO细胞系(例
如ATCC CRL-9096)，其制备和繁殖如Urlaub等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 77：
4216(1980)所述。例如，首先通过将所有转化子在含有甲氨蝶呤(Mtx，DHFR
的一种竞争性拮抗剂)的培养基中进行培养来鉴定经DHFR选择基因转化的
细胞。或者，可通过在含有针对选择标志的选择剂诸如氨基糖苷抗生素例如
卡那霉素、新霉素或G418的培养基中培养细胞来选择经编码抗体、野生型
DHFR蛋白和另一种选择标志诸如氨基糖苷3′-磷酸转移酶(APH)的DNA序列
转化或共转化的宿主细胞(特别是包含内源DHFR的野生型宿主)。参见美国
专利No.4,965,199。
适用于酵母的选择基因是存在于酵母质粒YRp7中的trp1基因
[Stinchcomb et al.，Nature，282：39(1979)；Kingsman et al.，Gene，7：141(1979)；
Tschemper et al.，Gene，10：157(1980)]。trp1基因为缺乏在色氨酸中生长能力
的酵母突变株，例如ATCC No.44076或PEP4-1[Jones，Genetics，85：12(1977)]
提供了选择标志。Jones，Genetics 85：12(1977)。
(4)启动子构件
表达和克隆载体通常包含与编码抗FcRH5抗体的核酸序列可操作连接
的启动子以指导mRNA合成。受到多种潜在宿主细胞识别的启动子是众所周
知的。
事实上所有真核基因都具有富含AT区，它位于起始转录的位点上游约25
至30个碱基处。在许多基因的转录起点上游70至80个碱基处发现的另一种序
列是CNCAAT区，其中N可以是任何核苷酸。在大多数真核基因的3′端是
AATAAA序列，它可能是向编码序列的3′端添加聚腺苷酸(polyA)尾的信号。
将所有这些序列合适地插入真核表达载体。
适用于酵母宿主的启动子序列的例子包括3-磷酸甘油酸激酶(Hitzeman
等，J.Biol.Chem.255：2073(1980))或其它糖酵解酶(Hess等，J.Adv.Enzyme
Reg.7：149(1968)；Holland，Biochemistry 17：4900(1978))的启动子，诸如烯醇
酶、甘油醛-3-磷酸脱氢酶、己糖激酶、丙酮酸脱羧酶、磷酸果糖激酶、葡萄
糖-6-磷酸异构酶、3-磷酸甘油酸变位酶、丙酮酸激酶、磷酸丙糖异构酶、磷
酸葡萄糖异构酶和葡糖激酶。
作为具有由生长条件控制转录的额外优点的诱导型启动子的其它酵母
启动子是醇脱氢酶2、异细胞色素C、酸性磷酸酶、与氮代谢有关的降解酶、
金属硫蛋白、甘油醛-3-磷酸脱氢酶、及负责麦芽糖和半乳糖利用的酶的启动
子区。适用于酵母表达的载体和启动子进一步描述于EP 73,657。
在哺乳动物宿主细胞中由载体转录抗FcRH5抗体受到例如从病毒(诸如
多瘤病毒、禽痘病毒(1989年7月5日公布的UK 2,211,504)、腺病毒(诸如2型
腺病毒)、牛乳头瘤病毒、禽类肉瘤病毒、巨细胞病毒、逆转录病毒、乙肝
病毒和猿病毒40(SV40))基因组获得的、来自异源哺乳动物启动子(例如肌
动蛋白启动子或免疫球蛋白启动子)的和来自热休克启动子的启动子的控
制，倘若此类启动子与宿主细胞系统相容的话。
方便的以SV40限制性片段的形式获得SV40病毒的早期和晚期启动子，
该片段还包含SV40病毒复制起点。方便的以HindIII E限制性片段的形式获得
人巨细胞病毒的立即早期启动子。美国专利No.4,419,446中公开了使用牛乳
头瘤病毒作为载体在哺乳动物宿主中表达DNA的系统。美国专利No.
4,601,978中记载了该系统的一种修改。还可参见Reyes等，Nature 297：598-601
(1982)，其记载了在小鼠细胞中在来自单纯疱疹病毒的胸苷激酶启动子的控
制下表达人β-干扰素cDNA。或者，可使用劳氏肉瘤病毒长末端重复序列作
为启动子。
(5)增强子元件构件
可通过在载体中插入增强子序列来提高高等真核细胞对编码抗FcRH5
抗体的DNA的转录。增强子是DNA的顺式作用元件，通常大约10至300bp，
作用于启动子以增加转录。已知来自哺乳动物基因(球蛋白、弹性蛋白酶、
清蛋白、α-胎蛋白和胰岛素)的许多增强子序列。然而，通常使用来自真核
细胞病毒的增强子。例子包括SV40复制起点晚期一侧的增强子(bp
100-270)、巨细胞病毒早期启动子增强子、多瘤病毒复制起点晚期一侧的增
强子和腺病毒增强子。还可参见Yaniv，Nature 297：17-18(1982)，其记载了激
活真核启动子的增强子元件。增强子可以剪接到载体中，位于抗FcRH5抗体
编码序列的5′或3′位置，但是优选位于启动子的5′位点。
(6)转录终止构件
用于真核宿主细胞(酵母、真菌、昆虫、植物、动物、人或来自其它多
细胞生物体的有核细胞)的表达载体还将包含终止转录和稳定mRNA所必需
的序列。此类序列通常可以由真核或病毒DNA或cDNA非翻译区的5′端和偶
尔的3′端获得。这些区域包含在编码抗FcRH5抗体的mRNA的非翻译部分中
转录成聚腺苷酸化片段的核苷酸区段。一种有用的转录终止构件是牛生长激
素聚腺苷酸化区。参见WO94/11026及其中公开的表达载体。
适合在改动后在重组脊椎动物细胞培养物中合成抗FcRH5抗体的其它
方法、载体和宿主细胞见Gething等，Nature 293：620-625(1981)；Mantei等，
Nature 281：40-46(1979)；EP 117,060；和EP 117,058。
4.培养宿主细胞
可以在多种培养基中培养用于生产本发明抗FcRH5抗体的宿主细胞。
a.原核宿主细胞
在本领域知道的且适于培养选定宿主细胞的培养基中培养用于生成本
发明多肽的原核细胞。合适培养基的例子包括添加了必需营养补充物的LB
培养基(Luria broth)。在有些实施方案中，培养基还含有根据表达载体的构建
而选择的选择剂，以选择性容许包含表达载体的原核细胞生长。例如，向用
于培养表达氨苄青霉素抗性基因的细胞的培养基中添加氨苄青霉素。
在碳源、氮源和无机磷酸盐源以外，还可含有适当浓度的任何必需补充
物，或是单独加入或是作为与另一种补充物或培养基的混合物，诸如复合氮
源。任选的是，培养基可含有一种或多种选自下组的还原剂：谷胱甘肽、半
胱氨酸、胱胺、巯基乙酸盐/酯、二硫赤藓糖醇和二硫苏糖醇。
在合适的温度培养原核宿主细胞。例如，对于培养大肠杆菌，优选的温
度范围为约20℃至约39℃，更优选约25℃至约37℃，甚至更优选约30℃。主
要取决于宿主生物体，培养基的pH可以是范围为约5至约9的任何pH。对于
大肠杆菌，pH优选是约6.8至约7.4，更优选约7.0。
如果本发明的表达载体中使用诱导型启动子，那么在适于激活启动子的
条件下诱导蛋白质表达。在本发明的一个方面，使用PhoA启动子来控制多肽
的转录。因此，为了诱导，在磷酸盐限制培养基中培养经过转化的宿主细胞。
优选的是，磷酸盐限制培养基是C.R.A.P培养基(参见例如Simmons等，J.
Immunol.Methods 263：133-147(2002))。根据所采用的载体构建物，可采用
多种其它诱导物，正如本领域所知道的。
在一个实施方案中，所表达的本发明多肽分泌入宿主细胞的周质并从中
回收。蛋白质回收通常涉及破坏微生物，通常通过诸如渗压震扰(osmotic
shock)、超声处理或裂解等手段。一旦细胞遭到破坏，可通过离心或过滤清
除细胞碎片或整个细胞。可以通过例如亲和树脂层析进一步纯化蛋白质。或
者，蛋白质可以转运入培养液并从中分离。可以从培养液清除细胞，并将培
养物上清液过滤和浓缩，用于进一步纯化所生成蛋白质。可使用普遍知道的
方法诸如聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)和Western印迹分析进一步分离和鉴定
所表达多肽。
在本发明的一个方面，通过发酵过程大量进行抗体生产。多种大规模补
料-分批发酵规程可用于生产重组蛋白。大规模发酵具有至少1000升的容量，
优选是约1,000至100,000升的容量。这些发酵罐使用搅拌器叶轮来分配氧和
养分，尤其是葡萄糖(优选的碳源/能源)。小规模发酵通常指在体积容量不
超过约100升的发酵罐中进行的发酵，范围可以是约1升至约100升。
在发酵过程中，通常在将细胞在合适条件下培养至期望密度(例如OD550
约180-220，在此阶段细胞处于早期稳定期)后启动蛋白质表达的诱导。根
据所采用的载体构建物，可使用多种诱导物，正如本领域知道的和上文描述
的。可以在诱导前将细胞培养更短的时间。通常将细胞诱导约12-50小时，
但是可使用更长或更短的诱导时间。
为了提高本发明多肽的产量和质量，可修改多项发酵条件。例如，为了
改善所分泌抗体多肽的正确装配和折叠，可使用过表达伴侣蛋白诸如Dsb蛋
白(DsbA、DsbB、DsbC、DsbD和/或DsbG)或FkpA(具有伴侣活性的一种
肽基脯氨酰-顺式，反式-异构酶)的额外载体来共转化宿主原核细胞。已经证
明伴侣蛋白促进在细菌宿主细胞中生成的异源蛋白质的正确折叠和溶解度。
Chen等(1999)J.Bio.Chem.274：19601-19605；Georgiou等，美国专利No.
6,083,715；Georgiou等，美国专利No.6,027,888；Bothmann和Pluckthun(2000)
J.Biol.Chem.275：17100-17105；Ramm和Pluckthun(2000)J.Biol.Chem.275：
17106-17113；Arie等(2001)Mol.Microbiol.39：199-210)。
为了将所表达异源蛋白质(尤其是对蛋白水解敏感的异源蛋白质)的蛋
白水解降至最低，可以将蛋白水解酶缺陷的某些宿主菌株用于本发明。例如，
可修饰宿主细胞菌株，在编码已知细菌蛋白酶的基因中进行遗传突变，诸如
蛋白酶III、OmpT、DegP、Tsp、蛋白酶I、蛋白酶Mi、蛋白酶V、蛋白酶VI
及其组合。可以获得有些大肠杆菌蛋白酶缺陷菌株，参见例如Joly等(1998)
见上文；Georgiou等，美国专利No.5,264,365；Georgiou等，美国专利No.
5,508,192；Hara等，Microbial Drug Resistance 2：63-72(1996)。
在一个实施方案中，在本发明的表达系统中使用蛋白水解酶缺陷且经过
过表达一种或多种伴侣蛋白的质粒转化的大肠杆菌菌株作为宿主细胞。
b.真核宿主细胞
商品化培养基诸如Ham氏F10(Sigma)、极限必需培养基(MEM，Sigma)、
RPMI-1640(Sigma)和Dulbecco氏改良的Eagle氏培养基(DMEM，Sigma)适于
培养宿主细胞。另外，可以使用下列文献中记载的任何培养基作为宿主细胞
的培养基：Ham et al.，Meth.Enz.58：44(1979)；Barnes et al.，Anal.Biochem.
102：255(1980)；美国专利No.4,767,704；4,657,866；4,927,762；4,560,655；
或5,122,469；WO 90/03430；WO 87/00195；或美国专利复审30,985。任何这
些培养基可以根据需要补充激素和/或其它生长因子(诸如胰岛素、运铁蛋白
或表皮生长因子)、盐(诸如氯化钠、钙、镁和磷酸盐)、缓冲剂(诸如HEPES)、
核苷酸(诸如腺苷和胸苷)、抗生素(诸如GENTAMYCINTM药物)、痕量元
素(定义为通常以摩尔范围的终浓度存在的无机化合物)和葡萄糖或等效
能源。还可以以适宜浓度包含本领域技术人员知道的任何其它必需补充物。
培养条件，诸如温度、pH等，就是先前为表达而选择用于宿主细胞的，这对
于普通技术人员而言是显而易见的。
5.检测基因扩增/表达
基因的扩增和/或表达可以在样品中直接测量，例如根据本文提供的序
列，使用适宜的标记探针，通过常规的Southern印迹、对mRNA转录定量的
Northern印迹(Thomas，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 77：5201-5205(1980))、点印
迹(DNA分析)或原位杂交。或者，可采用能识别特定双链体的抗体，所述
双链体包括DNA双链体、RNA双链体、及DNA-RNA杂合双链体或DNA-蛋
白质双链体。继而可标记抗体，并可进行测定法，其中将双链体结合到表面
上，从而在双链体在表面上形成时，可检测与双链体结合的抗体的存在。
或者，为了直接对基因产物的表达定量，可通过免疫学方法测量基因表
达，诸如细胞或组织切片的免疫组化染色和细胞培养物或体液的测定法。可
用于免疫组化染色和/或样品液体测定法的抗体可以是单克隆的或多克隆的，
而且可以在任何哺乳动物中制备。方便的是，可针对天然序列FcRH5多肽或
针对基于本文提供的DNA序列的合成肽或针对与FcRH5 DNA融合且编码特
定抗体表位的外源序列来制备抗体。
6.纯化抗FcRH5抗体
可以从培养液或从宿主细胞裂解物中回收各种形式的抗FcRH5抗体。如
果是膜结合的，那么可使用合适的去污剂溶液(例如Triton-X 100)或通过酶
促裂解使其从膜释放。抗FcRH5抗体表达中所采用的细胞可通过多种物理或
化学手段破裂，诸如冻融循环、超声处理、机械破裂或细胞溶解剂。
可能期望从重组细胞蛋白质或多肽纯化抗FcRH5抗体。下面的流程是合
适纯化流程的例示：在离子交换柱上的分级；乙醇沉淀；反相HPLC；在硅
土或阳离子交换树脂诸如DEAE上的层析；层析聚焦；SDS-PAGE；硫酸铵
沉淀；使用例如Sephadex G-75的凝胶过滤；蛋白A Sepharose柱以除去污染物
诸如IgG；及结合抗FcRH5抗体的表位标记形式的金属螯合柱。可采用多种
蛋白质纯化方法，此类方法是本领域已知的，并描述于例如Deutscher，
Methods in Enzymology，182(1990)；Scopes，Protein Purification：Principes and
Practice，Springer-Verlag，New York(1982)。纯化步骤的选择将取决于例如所
用生成方法的性质和所产生的具体抗FcRH5抗体。
在使用重组技术时，可以在细胞内、在周质空间中生成抗体，或者直接
分泌到培养基中。如果在细胞内生成抗体，那么作为第一步，通过例如离心
或超滤清除宿主细胞或裂解片段的微粒碎片。Carter等，Bio/Technology 10：
163-167，1992描述了用于分离分泌到大肠杆菌周质空间的抗体的流程。简单
地说，在存在乙酸钠(pH 3.5)、EDTA和苯甲基磺酰氟(PMSF)时使细胞糊融化
约30分钟。可以通过离心除去细胞碎片。如果将抗体分泌到培养基中，那么
通常首先使用商品化蛋白质浓缩滤器，例如Amicon或Millipore Pellicon超滤
单元浓缩来自此类表达系统的上清液。在任何上述步骤中，可以包括蛋白酶
抑制剂诸如PMSF来抑制蛋白水解，而且可以包括抗生素来防止外来污染物
的生长。
可以使用例如羟磷灰石层析、凝胶电泳、透析和亲和层析来纯化由细胞
制备的抗体组合物，优选的纯化技术是亲和层析。蛋白A作为亲和配体的适
宜性取决于抗体中存在的任何免疫球蛋白Fc区的种类和同种型。蛋白A可用
于纯化基于人γ1、γ2或γ4重链的抗体(Lindmark等，1983，J.Immunol.Meth.62：
1-13)。蛋白G推荐用于所有小鼠同种型和人γ3(Guss等，1986，EMBO J.5：
1567-1575)。亲和配体所附着的基质最常用的是琼脂糖，但是可以使用其它
基质。物理稳定的基质诸如可控孔径玻璃或聚(苯乙烯二乙烯)苯能够获得比
琼脂糖更快的流速和更短的加工时间。对于包含CH3结构域的抗体而言，可
使用Bakerbond ABXTM树脂(J.T.Baker，Phillipsburg，NJ)进行纯化。根据待
回收的抗体，也可使用其它蛋白质纯化技术，诸如离子交换柱上的分级分离、
乙醇沉淀、反相HPLC、硅土上的层析、肝素SEPHAROSETM上的层析、阴离
子或阳离子交换树脂(诸如聚天冬氨酸柱)上的层析、层析聚焦、SDS-PAGE
和硫酸铵沉淀。
在任何初步的纯化步骤后，包含目的抗体和污染物的混合物可以使用pH
约2.5-4.5的洗脱缓冲液，优选在低盐浓度(例如约0-0.25M盐)进行低pH疏
水相互作用层析。
G.药物配制剂
可以通过适合于待治疗疾患的任何路径来施用本发明的抗体-药物偶联
物(ADC)。典型地，胃肠外施用ADC，即输注，皮下、肌肉内、静脉内、真
皮内、鞘内和硬膜外。
为了治疗这些癌症，在一个实施方案中，抗体-药物偶联物经静脉内输
注来施用。经输注而施用的剂量范围为大约1μg/m2至大约10,000μg/m2每剂，
一般是每周一剂，总共一剂、两剂、三剂或四剂。或者，剂量范围是大约1μg/m2
至大约1000μg/m2、大约1μg/m2至大约800μg/m2、大约1μg/m2至大约600μg/m2、
大约1μg/m2至大约400μg/m2、大约10μg/m2至大约500μg/m2、大约10μg/m2至
大约300μg/m2、大约10μg/m2至大约200μg/m2和大约1μg/m2至大约200μg/m2。
剂量施用可以每天一次、每周一次、每周多次但少于每天一次、每月多次但
少于每天一次、每月多次但少于每周一次、每月一次或间歇地施用以减轻或
缓解疾病的症状。施用可以以任何已公开的间隔持续进行，直至所治疗的白
血病、淋巴瘤的症状或肿瘤消退。施用可以在实现症状消退或减轻后继续进
行，其中所述消退或减轻因所述继续施用而延长。
本发明还提供了缓解自身免疫性疾病的方法，包括给患有自身免疫性疾
病的患者施用治疗有效量的任一前述实施方案的人源化10A8抗体-药物偶联
物。在优选的实施方案中，所述抗体是静脉内或皮下施用的。该抗体-药物
偶联物以大约1μg/m2至大约100mg/m2每剂范围内的剂量静脉内施用，而且在
一个具体的实施方案中，剂量是大约1μg/m2至大约500mg/m2。剂量施用可以
每天一次、每周一次、每周多次但少于每天一次、每月多次但少于每天一次、
每月多次但少于每周一次、每月一次或间歇地施用以减轻或缓解疾病的症
状。施用可以以任何已公开的间隔持续进行，直至所治疗的自身免疫性疾病
的症状缓解。施用可以在实现症状减轻或缓解后继续进行，其中所述缓解或
减轻因所述继续施用而延长。
本发明还提供了治疗B细胞病症的方法，包括给患有B细胞病症(诸如B
细胞增殖性病症(包括但不限于淋巴瘤和白血病)或自身免疫性疾病)的患
者施用治疗有效量的任一前述实施方案的人源化10A8抗体，该抗体未偶联至
细胞毒性分子或可检测分子。该抗体通常在大约1μg/m2至大约1000mg/m2的
剂量范围内施用。
一方面，本发明还提供了包含至少一种本发明抗FcRH5抗体和/或至少一
种其免疫偶联物和/或至少一种本发明抗FcRH5抗体-药物偶联物的药物配制
剂。在有些实施方案中，药物配制剂包含：(1)本发明的抗FcRH5抗体和/或
其免疫偶联物，和(2)药学可接受载体。在有些实施方案中，药物配制剂包
含：(1)本发明的抗FcRH5抗体和/或其免疫偶联物，和任选的(2)至少一种
别的治疗剂。别的治疗剂包括但不限于下文所述的那些。典型地，胃肠外施
用ADC，即输注，皮下、肌肉内、静脉内、真皮内、鞘内和硬膜外。
依照本发明使用的治疗性配制剂(例如包含抗FcRH5抗体或FcRH5免疫
偶联物的)通过将具有期望纯度的活性组分(例如抗体或免疫偶联物)与任
选的药学可接受载体、赋形剂或稳定剂(《Remington′s Pharmaceutical
Sciences》，第16版，Osol，A.编，1980)混合来制备成冻干剂型或水溶液的形
式供贮存。可接受的载体、赋形剂或稳定剂在所采用的剂量和浓度对接受者
是无毒的，并且包括：缓冲剂，诸如乙酸盐、Tris、磷酸盐、柠檬酸盐和其
它有机酸；抗氧化剂，包括抗坏血酸和甲硫氨酸；防腐剂(诸如氯化十八烷
基二甲基苄基铵；氯己双铵；苯扎氯铵、苄索氯铵；酚、丁醇或苄醇；对羟
基苯甲酸烃基酯，诸如对羟基苯甲酸甲酯或对羟基苯甲酸丙酯；邻苯二酚；
间苯二酚；环己醇；3-戊醇；和间甲酚)；低分子量(少于约10个残基)多
肽；蛋白质，诸如血清清蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水性聚合物，诸如聚
乙烯吡咯烷酮；氨基酸，诸如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、组氨酸、精氨
酸或赖氨酸；单糖、二糖和其它碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；
螯合剂，诸如EDTA；张力调节剂(tonicifier)，诸如海藻糖和氯化钠；糖类，
诸如蔗糖、甘露醇、海藻糖或山梨醇；表面活性剂，诸如聚山梨醇酯；成盐
抗衡离子，诸如钠；金属复合物(例如Zn-蛋白质复合物)；和/或非离子表面
活性剂，诸如![]()
或聚乙二醇(PEG)。
任选但优选的是，配制剂含有药学可接受盐，优选氯化钠，且优选大约
为生理浓度。任选的是，本发明的配制剂可含有药学可接受防腐剂。在一些
实施方案中，防腐剂的浓度范围为0.1-2.0％，典型的是v/v。合适的防腐剂包
括药学领域已知的那些。苯甲醇、酚、间甲酚、对羟基苯甲酸甲酯、和对羟
基苯甲酸丙酯是优选的防腐剂。任选的是，本发明的配制剂可包括药学可接
受表面活性剂，其浓度为0.005-0.02％。
用于体内施用的药物配制剂一般是无菌的。这易于通过无菌滤膜过滤来
实现。
本文中的配制剂还可含有超过一种所治疗具体适应症所必需的活性化
合物，优选活性互补且彼此没有不利影响的。例如，在抗FcRH5抗体之外，
可能还期望在一种配制剂中含有另一种抗体，例如结合FcRH5多肽上不同表
位的第二抗FcRH5抗体，或针对一些其它靶物诸如影响特定癌生长的生长因
子的抗体。或者/另外，所述组合物还可包含化疗剂、细胞毒剂、细胞因子、
生长抑制剂、抗激素剂和/或心脏保护剂。合适的是，此类分子以对于预定目
的有效的量组合存在。
活性成分还可包载于例如通过凝聚技术或通过界面聚合制备的微胶囊
中(例如分别是羟甲基纤维素或明胶微胶囊和聚(甲基丙烯酸甲酯)微胶囊)、
在胶状药物投递系统中(例如脂质体、清蛋白微球体、微乳剂、纳米颗粒和
纳米胶囊)或在粗滴乳状液中。此类技术公开于Remington′s Pharmaceutical
Sciences，第16版，Osol，A.编(1980)。
可以制备持续释放制剂。持续释放制剂的合适例子包括含有抗体的固体
疏水聚合物的半透性基质，该基质是定型产品的形式，例如薄膜或微胶囊。
持续释放基质的例子包括聚酯、水凝胶(例如聚(2-羟乙基-甲基丙烯酸酯)或
聚(乙烯醇))、聚交酯(美国专利No.3,773,919)、L-谷氨酸和γ-乙基L-谷氨酸酯
的共聚物、不可降解的乙烯-乙酸乙烯、可降解的乳酸-乙醇酸共聚物诸如
LUPRON![]()
(由乳酸-乙醇酸共聚物和醋酸亮丙瑞林构成的可注射微
球体)及聚-D-(-)-3-羟基丁酸。虽然诸如乙烯-乙酸乙烯和乳酸-乙醇酸的聚合
物能够释放分子达100天以上，但是某些水凝胶释放蛋白质的时间较短。当
所封装的免疫球蛋白在体内长时间维持时，它们可能由于暴露于37℃的潮湿
环境而变性或聚集，导致生物学活性损失和免疫原性可能改变。可以根据相
关机制来设计合理的稳定化策略。例如，如果发现聚集机制是经由硫-二硫
化物互换的分子间S-S键形成，那么可通过修饰巯基、自酸性溶液冻干、控
制含水量、使用适宜添加剂和开发特定聚合物基质组合物来实现稳定化。
抗体可配制成任何对于投递至靶细胞/组织合适的形式。例如，抗体可配
制成免疫脂质体。“脂质体”指由各种类型脂质、磷脂和/或表面活性剂构成的，
可用于对哺乳动物递送药物的小囊泡。与生物膜的脂质排列相似，脂质体的
成分通常排列成双层形式。含有抗体的脂质体可通过本领域已知方法来制
备，诸如Epstein等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 82：3688(1985)；Hwang等，Proc.
Natl.Acad.Sci.USA 77：4030(1980)；美国专利No.4,485,045和4,544,545；及
1997年10月23日公布的WO 97/38731中所述。循环时间延长的脂质体披露于
美国专利No.5,013,556。
可用包含磷脂酰胆碱、胆固醇和PEG衍生化磷脂酰乙醇胺(PEG-PE)的脂
类组合物通过反相蒸发法生成特别有用的脂质体。将脂质体挤过具有设定孔
径的滤器，以产生具有期望直径的脂质体。可如Martin等，J.Biol.Chem.257：
286-288(1982)中所述，将本发明抗体的Fab’片段经二硫化物交换反应与脂质
体偶联。任选在脂质体中包含化疗剂。参见Gabizon等，J.National Cancer Inst.
81(19)：1484(1989)。
用于体内施用的配制剂必须是无菌的。这可容易地通过无菌滤膜过滤来
实现。
H.使用抗FcRH5抗体的治疗
为了测定癌症中的FcRH5表达，可利用多种检测测定法。在一个实施方
案中，可通过免疫组化(IHC)来分析FcRH5多肽过表达。可对来自肿瘤活组织
检查的石蜡包埋组织切片进行IHC测定法，并给予如下FcRH5蛋白质染色强
度标准：
得分0：未观察到染色或者在少于10％的肿瘤细胞中观察到膜染色。
得分1+：在超过10％的肿瘤细胞中检测到微弱的/刚刚可察觉的膜染色。所述
细胞只在其部分膜上有染色。
得分2+：在超过10％的肿瘤细胞中观察到微弱至中等的完全膜染色。
得分3+：在超过10％的肿瘤细胞中观察到中等至强烈的完全膜染色。
那些FcRH5多肽表达得分0或1+的肿瘤可鉴定为未过表达FcRH5，而那
些得分2+或3+的肿瘤可鉴定为过表达FcRH5。
或者/另外，可对福尔马林固定、石蜡包埋的肿瘤组织进行FISH测定法
诸如![]()
(由Ventana，Arizona销售)或![]()
(Vysis，Illinois)
以测定肿瘤中FcRH5过表达的程度(如果有的话)。
还可使用体内检测测定法来评估FcRH5过表达或扩增，例如通过施用结
合待检测分子且标记有可检测标记物(例如放射性同位素或荧光标记物)的
分子(诸如抗体)，然后对患者进行外部扫描以定位所述标记物。
如上文所述，本发明的抗FcRH5抗体具有多种非治疗性应用。本发明的
抗FcRH5抗体可用于表达FcRH5多肽的癌症的分级(例如在放射成像中)。抗
体还可用于从细胞中纯化或免疫沉淀FcRH5多肽，用于FcRH5多肽的体外检
测和定量例如在ELISA或Western印迹中，作为纯化其它细胞的一个步骤从混
合细胞群中杀死和消除表达FcRH5的细胞。
现在，根据癌症的分级，癌症的治疗涉及下列疗法中的一种或组合：手
术去除癌性组织，放疗和化疗。抗FcRH5抗体疗法对于不能很好承受化疗的
毒性和副作用的老年患者和放疗具有有限效用的转移性疾病可能是尤其想
要的。本发明的靶向肿瘤的抗FcRH5抗体可用于在疾病的最初诊断时或在复
发期间减轻表达FcRH5的癌症。对于治疗性应用，可单独使用抗FcRH5抗体，
或者用于与例如激素、抗血管发生剂(antiangiogen)或放射标记的化合物，或
者与手术、冷冻疗法和/或放疗的组合疗法。抗FcRH5抗体的治疗可与其它形
式的常规疗法组合施用，与常规疗法连续、在之前或之后。化疗药物诸如
![]()
多西他塞(doxetaxel)、![]()
帕利他塞(paclitaxel)、雌莫司汀
(estramustine)和米托蒽醌(mitoxantrone)用于治疗癌症，特别是无风险(good
risk)的患者。在本发明治疗或减轻癌症的方法中，可给癌症患者施用抗FcRH5
抗体并组合一种或多种前述化疗剂的治疗。具体而言，设想了与紫杉醇及改
良衍生物的组合疗法(参见例如EP 0 600 517)。将抗FcRH5抗体与治疗有效
剂量的化疗剂一起施用。在另一个实施方案中，组合化疗施用抗FcRH5抗体
以提高化疗剂例如紫杉醇的活性和功效。Physicians′Desk Reference(PDR)公
开了已经在多种癌症的治疗中使用的这些药剂的剂量。这些前述化疗药物在
治疗上有效的剂量给药方案和剂量将取决于所治疗的具体癌症、疾病的程
度、及有本领域技术的内科医师所熟悉的其它因素、且可以由内科医师确定。
在一个具体的实施方案中，将包含与细胞毒剂偶联的抗FcRH5抗体的偶
联物施用于患者。优选的是，与FcRH5蛋白质结合的免疫偶联物由细胞内在
化，导致免疫偶联物在杀死其所结合的癌细胞方面的治疗功效提高。在一个
优选的实施方案中，细胞毒剂靶向或干扰癌细胞中的核酸。此类细胞毒剂的
例子上文已有描述，包括美登木素生物碱类、加利车霉素、核糖核酸酶及DNA
内切核酸酶。
将本发明的治疗剂(例如抗FcRH5抗体或其毒素偶联物)依照已知方法
施用给人类患者，诸如静脉内施用，例如作为推注或一段时间的连续输注，
通过肌肉内、腹膜内、脑脊髓内、皮下、关节内、滑膜内、鞘内、口服、局
部或吸入路径。优选静脉内或皮下施用治疗剂。
回体(ex vivo)策略也可用于治疗性应用。回体策略涉及用编码FcRH5拮
抗剂的多核苷酸转染或转导自受试者获得的细胞。然后将经过转染或转导的
细胞返回受试者。细胞可以是极其多种类型之任一，包括但不限于造血细胞
(例如，骨髓细胞、巨噬细胞、单核细胞、树突细胞、T细胞、或B细胞)、
成纤维细胞、上皮细胞、内皮细胞、角质形成细胞、或肌肉细胞。
例如，如果FcRH5拮抗剂是抗体或免疫偶联物，那么通过任何合适手段
施用拮抗剂，包括胃肠外、皮下、腹膜内、肺内、和鼻内，及(如果想要局
部免疫抑制治疗的话)病灶内施用。胃肠外输注包括肌肉内、静脉内、动脉
内、腹膜内、或皮下施用。另外，合适的是，通过脉冲输注来施用拮抗剂，
特别是使用递减剂量的抗体。优选的是，通过注射给予剂量给药，最优选的
是，通过静脉内或皮下注射给予剂量给药，这部分取决于施药是短期的还是
长期的。
在另一个例子中，在病症或肿瘤位置允许时，局部施用FcRH5拮抗性化
合物，例如通过直接注射，而且可以周期性重复注射。也可以在手术切除肿
瘤后系统地/全身地将FcRH5拮抗剂投递至受试者或直接投递至肿瘤细胞，例
如肿瘤或肿瘤床，用以预防或降低局部复发或转移。
组合中的治疗剂的施用通常在规定的时间段里进行(通常是数分钟、数
小时、数天或数周，这取决于所选择的组合)。组合疗法旨在涵盖这些治疗
剂以序贯方式的施用(也就是说，其中在不同时间施用每一种治疗剂)，以
及这些治疗剂或治疗剂中至少两种以基本上同时的方式的施用。
可以通过相同路径或不同路径来施用治疗剂。例如，可以通过静脉内注
射来施用组合中的抗FcRH5抗体或免疫偶联物，同时可以口服施用所述组合
中的化疗剂。或者，例如，可以口服施用这两种治疗剂，或者可以通过静脉
内注射来施用这两种治疗剂，这取决于具体的治疗剂。治疗剂的施用次序也
随着具体药剂而变化。
根据疾病的类型和严重程度，施用于患者的初始候选剂量是约1μg/kg
至100mg/kg每种治疗剂，例如或是通过一次或多次分开施药或是通过连续
输注。根据上文所述因素，典型日剂量的范围可以是约1μg/kg至100mg/kg
或更多。对于持续数天或更长的重复施药，根据状况，持续治疗直至根据上
文所述方法的测量，癌症得到治疗。然而，其它剂量方案也可能是有用的。
本申请涵盖通过基因疗法来施用抗FcRH5抗体。参见例如1996年3月14
日公布的WO96/07321，其关注使用基因疗法来产生胞内抗体。
抗FcRH5抗体的施用可组合其它治疗方案。组合施用包括使用分开的配
制剂或单一的药用配制剂的共施用，及任意顺序的连续施用，其中优选有一
段时间所有两种(或多种)活性剂同时发挥其生物学活性。优选的是，此类
组合疗法导致协同治疗效果。
可能还期望将一种或多种抗FcRH5抗体的施用与针对与特定癌症有关
的另一种肿瘤抗原的抗体的施用组合。
在另一个实施方案中，本发明的治疗性处理方法涉及(一种或多种)抗
FcRH5抗体与一种或多种化疗剂或生长抑制剂的组合施用，包括不同化疗剂
的混合物(cocktail)的共施用或者一种或多种也抑制肿瘤生长的其它细胞毒
剂或其它治疗剂。化疗剂包括磷酸雌莫司汀(estramustine phosphate)、泼尼莫
司汀(prednimustine)、顺铂、5-氟尿嘧啶、美法仑(melphalan)、环磷酰胺、羟
基脲和羟基脲紫杉烷(hydroxyureataxane)(诸如紫杉醇和多西他塞
(doxetaxel))和/或蒽环类(anthracycline)抗生素。此类化疗剂的制剂和剂量给
药方案可依照制造商的说明书使用或由熟练从业人员根据经验确定。此类化
疗的制备和剂量给药方案还可参阅Chemotherapy Service Ed.，M.C.Perry，
Williams & Wilkins，Baltimore，MD(1992)。抗体可与抗激素化合物以此类分
子的已知剂量组合，例如抗雌激素化合物，诸如他莫昔芬(tamoxifen)；抗孕
酮化合物，诸如奥那司酮(onapristone)(见EP 616,812)；或抗雄激素化合物，
诸如氟他米特(flutamide)。当待治疗癌症是雄激素非依赖性癌症时，患者可
能先前已经接受过抗雄激素疗法，并在癌症变成雄激素非依赖性时，可以给
患者施用抗FcRH5抗体(及任选的本文所述其它药剂)。
有时，还给患者共施用心脏保护剂(以预防或降低与疗法有关的心肌功
能障碍)或一种或多种细胞因子可能也是有益的。除了上述治疗方案，在抗
体疗法之前、同时或之后，可给患者进行手术去除癌细胞和/或放疗(例如外
部射束照射或使用放射性标记药剂诸如抗体的疗法)。任何上述共施用药剂
的合适剂量就是那些目前所使用的剂量，而且可由于该药剂与抗FcRH5抗体
的联合作用(协同作用)而降低。
可以与优良医学实践一致的方式配制、剂量给药和施用本发明的抗体组
合物。在此内容中考虑的因素包括所治疗的具体病症、所治疗的具体哺乳动
物、患者个体的临床状况、病症的起因、投递药剂的部位、施药的方法、施
药的日程安排和医学从业人员知道的其它因素。不是必需而是任选将抗体与
目前用于预防或治疗所讨论病症的一种或多种药剂一起配制。此类其它药剂
的有效量取决于配制剂中存在的本发明抗体的量、病症或治疗的类型和上文
讨论的其它因素。这些通常是以与上文所用相同剂量和施用路径使用，或是
迄今所用剂量的大约1-99％。
为了预防或治疗疾病，施用的剂量和模式可以由内科医师依照已知标准
来选择。抗体的适宜剂量将取决于如上定义的待治疗疾病的类型、疾病的严
重程度和进程、是为了预防还是治疗目的施用抗体、先前的疗法、患者的临
床史及对抗体的响应、及主治医师的判断。恰当的将抗体一次性或在一系列
治疗中施用给患者。优选的是，将抗体通过静脉内输注或通过皮下注射来施
用。根据疾病的类型和严重程度，约1μg/kg至约50mg/kg体重(例如约
0.1-15mg/kg/剂)的抗体可作为初始侯选剂量施用给患者，无论是例如通过
一次或多次分开的施用，或是通过连续输注。剂量给药方案可包括施用约
4mg/kg的初始加载剂量，后续约2mg/kg抗FcRH5抗体的每周维持剂量。然而，
其它剂量方案也可使用。根据上述因素，典型的每日剂量可在约1μg/kg到
100mg/kg或更多的范围内。对于持续几天或更长时间的重复施用，根据状况，
维持治疗直到发生对疾病症状的期望遏制。这种疗法的进展可容易的通过常
规方法和测定法，并基于内科医师或其它本领域技术人员知道的标准来监
测。
除了将抗体蛋白质施用给患者，本申请设想通过基因疗法来施用抗体。
编码抗体的核酸的此类施用涵盖在表述“施用治疗有效量的抗体”中。关于使
用基因疗法来产生胞内抗体的用途参见例如1996年3月14日公开的WO
96/07321。
有两种主要方法使核酸(任选包含在载体中)进入患者的细胞，即体内
和回体(ex vivo)。对于体内投递，通常在需要抗体的部位将核酸直接注射到
患者体内。对于回体治疗，采集患者的细胞，将核酸导入这些分离的细胞，
并将经过修饰的细胞或是直接施用于患者，或是例如装入多孔膜内并植入患
者体内(参见例如美国专利4,892,538和5,283,187)。有多种技术可用于将核
酸导入活细胞。这些技术根据是将核酸转移至预期宿主的体外培养细胞还是
体内细胞而有所变化。适于在体外将核酸转移到哺乳动物细胞中的技术包括
使用脂质体、电穿孔、显微注射、细胞融合、DEAE-右旋糖苷、磷酸钙沉淀
法等。常用于回体投递基因的载体是逆转录病毒。
目前优选的体内核酸转移技术包括用病毒载体(诸如腺病毒、I型单纯
疱疹病毒或腺伴随病毒)和基于脂质的系统(可用于脂质介导的基因转移的
脂质有例如DOTMA、DOPE和DC-Chol)进行的转染。关于目前已知的基因
标记和基因治疗方案的综述参见Anderson et al.，Science 256：808-813(1992)。
还可参见WO 93/25673及其引用的参考文献。
本发明的抗FcRH5抗体可以是本文中“抗体”定义所涵盖的不同形式。因
此，抗体包括全长或完整抗体，抗体片段，天然序列抗体或氨基酸变体，人
源化的、嵌合的或融合抗体，免疫偶联物，及其功能性片段。在融合抗体中，
抗体序列与异源多肽序列融合。可在Fc区中修饰抗体以提供期望的效应物功
能。如本文的部分更为详细讨论的，凭借适宜的Fc区，结合在细胞表面上的
裸抗体可诱导细胞毒性，例如经由抗体依赖性细胞细胞毒性(ADCC)，或通
过在补体依赖性细胞毒性中募集补体，或一些其它机制。或者，在期望消除
或降低效应物功能从而使副作用或治疗并发症降至最低时，可使用某些其它
Fc区。
在一个实施方案中，抗体与本发明抗体竞争对相同表位的结合或基本上
结合相同表位。还设想了具有本发明抗FcRH5抗体的生物学特征的抗体，明
确包括体内肿瘤靶向和任何细胞增殖抑制或细胞毒性特征。
本文详细描述了生成上述抗体的方法。
本发明抗FcRH5抗体可用于治疗哺乳动物中表达FcRH5的癌症或减轻所
述癌症的一种或多种症状。此类癌症包括但不限于造血癌症或血液相关癌
症，诸如淋巴瘤、白血病、骨髓瘤或淋巴样恶性肿瘤，但是还有脾的癌症和
淋巴结的癌症。此类B细胞相关癌症的更具体例子包括例如高级、中级和低
级淋巴瘤(包括B细胞淋巴瘤，诸如例如粘膜相关淋巴样组织B细胞淋巴瘤
和非何杰金氏淋巴瘤、套细胞淋巴瘤、伯基特氏淋巴瘤(Burkitt’s lymphoma)、
小淋巴细胞性淋巴瘤、边缘区淋巴瘤、弥漫性大细胞淋巴瘤、滤泡性淋巴瘤
和何杰金氏淋巴瘤及T细胞淋巴瘤)和白血病(包括继发性白血病、慢性淋
巴细胞性白血病诸如B细胞白血病(CD5+B淋巴细胞)、髓细胞性白血病诸
如急性髓细胞样白血病、慢性髓细胞样白血病、淋巴样白血病诸如急性成淋
巴细胞性白血病和脊髓发育不良)和其它血液学和/或B细胞或T细胞相关癌
症。所述癌症涵盖任何前述的转移癌。所述抗体能够结合哺乳动物中表达
FcRH5多肽的癌细胞的至少一部分。在一个优选的实施方案中，抗体在体外
或在体内在结合细胞上的FcRH5多肽时有效破坏或杀死表达FcRH5的肿瘤细
胞或抑制此类肿瘤细胞的生长。此类抗体包括裸露的抗FcRH5抗体(未与任
何药剂偶联)。具有细胞毒性或细胞生长抑制特性的裸抗体可以进一步与细
胞毒剂合作(harness)，使得它们在破坏肿瘤细胞上更有效。可以通过例如将
抗体与细胞毒剂偶联形成本文所述免疫偶联物，而赋予抗FcRH5抗体以细胞
毒性特性。细胞毒剂或生长抑制剂优选是小分子。优选毒素诸如加利车霉素
或美登木素生物碱类及其类似物或衍生物。
本发明提供了包含本发明抗FcRH5抗体及载体的组合物。为了治疗癌症
的目的，可以将组合物施用于需要此类治疗的患者，其中组合物可包含一种
或多种呈现为免疫偶联物或裸抗体的抗FcRH5抗体。在另一个实施方案中，
组合物可包含这些抗体并组合其它治疗剂诸如细胞毒剂或生长抑制剂，包括
化疗剂。本发明还提供了包含本发明抗FcRH5抗体及载体的配制剂。在一个
实施方案中，配制剂是包含药学可接受载体的治疗用配制剂。
本发明的另一个方面是编码抗FcRH5抗体的分离核酸。设想了编码重链
和轻链二者，尤其是高变区残基的核酸，编码天然序列抗体以及所述抗体的
变体、修饰和人源化型式的链。
本发明还提供了可用于治疗哺乳动物中表达FcRH5多肽的癌症或减轻
所述癌症的一种或多种症状的方法，包括给哺乳动物施用治疗有效量的抗
FcRH5抗体。抗体治疗用组合物可由内科医师指导，短期或长期或间断施用。
还提供了抑制表达FcRH5多肽的细胞生长和杀死它的方法。
本发明还提供了包含至少一种抗FcRH5抗体的试剂盒和制品。包含抗
FcRH5抗体的试剂盒可用于例如FcRH5细胞杀伤测定法，从细胞中纯化或免
疫沉淀FcRH5多肽。例如，为了分离和纯化FcRH5，试剂盒可包含与珠子(例
如sepharose珠子)偶联的抗FcRH5抗体。可以提供包含抗体的试剂盒，用于
FcRH5的体外检测和定量，例如在ELISA或Western印迹中。可用于检测的此
类抗体可以与标记物诸如荧光或放射标记物一起提供。
I.抗体-药物偶联物治疗
本发明的抗体-药物偶联物(ADC)可用于治疗各种疾病或病症，例如特征
为肿瘤抗原过表达的。例示性的疾患或过度增殖性病症包括良性或恶性肿
瘤；白血病和淋巴样恶性肿瘤。其它包括神经元的、神经胶质的、星形胶质
细胞的、下丘脑的、腺体的、巨噬细胞的、上皮的、基质的、囊胚腔的、炎
性的、血管发生性的和免疫学的(包括自身免疫性的)病症。
可以在具有肿瘤的高级灵长类和人体临床试验中进一步测试在动物模
型和基于细胞的试验中鉴定的ADC化合物。可以设计人体临床试验以测试本
发明的抗FcRH5单克隆抗体或免疫偶联物在经历B细胞增殖性病症的患者中
的功效，所述B细胞增殖性病症包括但不限于淋巴瘤、非何杰金氏淋巴瘤
(NHL)、攻击性NHL、复发性攻击性NHL、复发性无痛性NHL、顽固性NHL、
顽固性无痛性NHL、慢性淋巴细胞性白血病(CLL)、小淋巴细胞淋巴瘤、白
血病、毛细胞白血病(HCL)、急性淋巴细胞性白血病(ALL)和套细胞淋巴瘤。
可以设计临床试验以便评价ADC与已知治疗方案的组合的功效，所述的已知
治疗方案诸如包括已知化疗剂和/或细胞毒性剂的放疗和/或化疗。
一般而言，所治疗的疾病或病症为过度增殖性疾病，诸如B细胞增殖性
病症和/或癌症。癌症的实例包括，但不局限于B细胞增殖性病症，其选自淋
巴瘤、非何杰金氏淋巴瘤(NHL)、攻击性NHL、复发性攻击性NHL、复发性
无痛性NHL、顽固性NHL、顽固性无痛性NHL、慢性淋巴细胞性白血病(CLL)、
小淋巴细胞淋巴瘤、白血病、毛细胞白血病(HCL)、急性淋巴细胞性白血病
(ALL)和套细胞淋巴瘤。
癌症可包含表达FcRH5的细胞，使得本发明的ADC能够结合癌细胞。为
了测定癌症中的FcRH5表达，可利用多种诊断/预后测定法。在一个实施方案
中，可通过IHC来分析FcRH5过表达。可以对来自肿瘤活检的石蜡包埋组织
切片进行IHC测定法并根据染色程度和所检查肿瘤细胞中的比例而给予
(accord)FcRH5蛋白质染色强度标准。
为了预防或治疗疾病，ADC的适当剂量取决于如上述定义的所治疗的疾
病类型、疾病的严重程度和时程、给予所述分子是为了预防还是为了治疗目
的、先前的治疗、患者的临床病史和对抗体的反应以及主治医师的判定。将
所述的分子适当对患者给予一次或在一系列治疗过程中给予。根据疾病类型
和严重程度的不同，对患者给药的分子的初始候选剂量约为1μg/kg-15
mg/kg(例如0.1-20mg/kg)，例如，无论是通过一次或多次分开的给药，还
是通过连续输注。典型的每日剂量可以在约1μg/kg-100mg/kg或更大的范
围，这取决于上述因素。对患者给予的典型的ADC的剂量在约0.1-约10
mg/kg患者体重的范围。
为了在几天或几天以上时程中反复给药，根据病情的不同，将治疗持续
至对疾病症状的所需抑制发生为止。典型的给药方案包含给予约4mg/kg的
起始负荷剂量，随后给予约2mg/kg抗ErbB2抗体的每周维持剂量。其它剂量
方案也是有用的。该疗法的进展易于通过常规技术和测定法监测。
J.组合疗法
可以将本发明的抗体-药物偶联物(ADC)与第二种具有抗癌特性的化合
物在药物组合配制剂中组合或作为组合疗法以给药方案组合。所述药物组合
配制剂或给药方案中的第二种化合物优选具有对组合中的ADC的补充活性，
使得它们彼此不会产生不利影响。
所述第二种化合物可以为化疗剂、细胞毒剂、细胞因子、生长抑制剂、
抗激素剂和/或心脏保护剂。此类分子以对指定目的有效的量适当地组合存
在。含有本发明ADC的药物组合物还可以具有治疗有效量的化疗剂，诸如微
管蛋白形成抑制剂、拓扑异构酶抑制剂或DNA结合剂。
一方面，所述第一化合物是本发明的抗FcRH5 ADC，且所述第二化合物
是抗CD20抗体(或是裸抗体或是ADC)。在一个实施方案中，所述第二化合
物是抗CD20抗体利妥昔单抗(rituximab，![]()
)或2H7(Genentech，Inc.，
South San Francisco，CA)。对于与本发明抗FcRH5 ADC的组合免疫疗法有用
的另一种抗体包括但不限于抗VEGF(例如![]()
)。
可以将其它治疗方案与依照本发明所鉴定的抗癌药施用组合，包括但不
限于放射疗法和/或骨髓和外周血移植和/或细胞毒剂、化疗剂或生长抑制剂。
在一个这样的实施方案中，化疗剂是以下药剂或药剂组合，诸如例如环磷酰
胺、羟基柔红霉素、阿霉素、多柔比星、长春新碱(OncovinTM)、泼尼松龙、
CHOP、CVP或COP，或者免疫治疗剂，诸如抗CD20(例如![]()
)或抗
VEGF(例如![]()
)。
组合疗法可以作为同时或序贯方案施用。当序贯施用时，可以以两次或
更多次施用来施用所述组合。组合施用包括使用分开的配制剂或单一药物配
制剂的共施用，和任意次序的序贯施用，其中优选有一段时间所有活性剂同
时发挥其生物学活性。
在一个实施方案中，使用ADC的治疗涉及组合施用本文中所鉴定的抗癌
剂和一种或多种化疗剂或生长抑制剂，包括共施用不同化疗剂鸡尾酒样混合
物。化疗剂包括紫杉烷类(诸如帕利他赛(paclitaxel)和多西他赛(docetaxel))
和/或蒽环类抗生素。熟练从业人员可以按照制造商的说明书或凭经验确定地
使用此类化疗剂的制备和剂量给药方案。此类化疗剂的制备和剂量给药方案
还记载于“Chemotherapy Service”，(1992)M.C.Perry编，Williams & Wilkins，
Baltimore，Md。
任何上述共施用的药剂的合适剂量就是那些当前使用的剂量，而且可以
由于新鉴定的药剂和其它化疗剂或治疗的联合作用(协同作用)而降低。
组合疗法可以提供“协同作用”并且证实是“协同性”的，即当一起使用活
性组分时所实现的效果大于分开使用所述化合物时所产生的效果之和。当活
性组分为如下情况时可以获得协同效应：(1)共同配制和施用或在合并的单
位剂量配制剂中同时投递；(2)作为分开的配制剂交替或平行投递；或(3)通
过一些其它方案。当在交替疗法中投递时，在序贯施用或投递所述化合物时，
例如通过不同注射器中的不同注射，可以获得协同效应。一般而言，在交替
疗法中，序贯地，即依序地施用每种活性组分的有效剂量，而在组合疗法中，
一起施用两种或更多活性组分的有效剂量。
本发明的组合疗法可进一步包含一种或多种化疗剂。组合施用包括使用
分开的配制剂或单一药物配制剂的共施用或同时施用和任一次序的序贯施
用，其中优选有一段时间所有活性剂同时发挥它们的生物学活性。
如果施用的话，由于药物的组合作用或可归于抗代谢物化疗剂施用的消
极副作用，通常以关于它们已知的或任选降低的剂量施用化疗剂。可依照制
造商的说明书或根据从业人员凭经验确定的那样使用此类化疗剂的制备和
剂量给药日程。
本文中公开了可组合的多种化疗剂。
在一些实施方案中，要组合的化疗剂选自下组：免疫调节剂(IMid)(包
括沙利度胺和![]()
(lenalidomide))，蛋白酶体抑制剂(诸如![]()
(bortezomib)和PS342)，bora类紫杉烷(包括多西他赛和帕利他赛)，长春药
(诸如长春瑞滨或长春碱)，铂化合物(诸如卡铂或顺铂)，芳香酶抑制剂(诸
如来曲唑、阿那曲唑、或依西美坦)，抗雌激素(例如氟维司群或他莫昔芬)，
依托泊苷，塞替派，环磷酰胺，培美曲塞，甲氨蝶呤，脂质体多柔比星，PEG
化脂质体多柔比星，卡培他滨，吉西他滨，美法仑(melthalin)，多柔比星，
长春新碱，COX-2抑制剂(例如塞来考昔)，或类固醇(例如地塞米松和泼
尼松)。在一些实施方案(例如涉及治疗多发性骨髓瘤的实施方案)中，组
合地塞米松和lenalidomide，或地塞米松，或bortezomib，或长春新碱、多柔
比星和地塞米松，或沙利度胺和地塞米松，或脂质体多柔比星、长春新碱和
地塞米松，或lenalidomide和地塞米松，或bortezomib和地塞米松，或
bortezomib、多柔比星、和地塞米松。
在一些实施方案中，要组合的化疗剂选自下组：![]()
(lenalidomide)，蛋白酶体抑制剂(诸如![]()
(bortezomib)和PS342)，bora
类紫杉烷(包括多西他赛和帕利他赛)，长春药(诸如长春瑞滨或长春碱)，
铂化合物(诸如卡铂或顺铂)，芳香酶抑制剂(诸如来曲唑、阿那曲唑、或
依西美坦)，抗雌激素(例如氟维司群或他莫昔芬)，依托泊苷，塞替派，环
磷酰胺，培美曲塞，甲氨蝶呤，脂质体多柔比星，PEG化脂质体多柔比星，
卡培他滨，吉西他滨，美法仑(melthalin)，多柔比星，长春新碱，COX-2抑
制剂(例如塞来考昔)，或类固醇(例如地塞米松和泼尼松)。
在一些实施方案(例如涉及治疗恶性骨髓瘤的实施方案)中，组合地塞
米松和lenalidomide，或地塞米松，和bortezomib。
在另一个实施方案中，组合疗法包含抗体或免疫偶联物和超过一种化疗
剂。例如，抗体或免疫偶联物可组合(i)长春新碱、多柔比星(在脂质体或非
脂质体配制剂中)、和地塞米松；(ii)沙利度胺和地塞米松；(iii)![]()
(bortezomib)、多柔比星、和地塞米松；(iv)![]()
(bortezomib)、沙利度胺、
和地塞米松；(v)美法仑和泼尼松；(vi)美法仑、泼尼松、和沙利度胺；(vii)美
法仑、泼尼松、和![]()
(bortezomib)；(viii)长春新碱、多柔比星、和地
塞米松；或(ix)沙利度胺和地塞米松。
在一个实施方案中，组合疗法可包含本文所述抗体或免疫偶联物，还包
含下述一种或多种：(i)![]()
(bortezomib)，(ii)地塞米松，(iii)![]()
(lenalidomide)。在另一个实施方案中，组合疗法包含抗体或免疫偶联物，还
包含地塞米松和![]()
(lenalidomide)二者或![]()
(bortezomib)和地
塞米松二者。在另一个实施方案中，组合疗法包含抗体或免疫偶联物，还包
含![]()
(bortezomib)、地塞米松和![]()
(lenalidomide)中每一种。
K.制品和试剂盒
本发明的另一个方面是包含可用于治疗、预防和/或诊断表达FcRH5的癌
症的物质的制品。制品包括容器和所述容器上或与其相关的标签或包装插
页。合适的容器包括例如瓶子、小管、注射器等。容器可用各种材料制成，
诸如玻璃或塑料。容器中装有有效治疗、预防和/或诊断癌症状况的组合物，
而且可具有无菌存取口(例如容器可以是具有皮下注射针头可刺穿的塞子的
静脉内溶液袋或小管)。组合物中的至少一种活性剂是本发明的抗FcRH5抗
体。标签或包装插页指示该组合物用于治疗癌症。标签或包装插页进一步包
含给癌症患者施用抗体组合物的说明书。另外，制品还可包括第二容器，其
中装有药学可接受的缓冲剂，诸如注射用抑菌水(BWFI)、磷酸盐缓冲盐水、
林格氏(Ringer)溶液和右旋糖溶液。它还可包括商业和用户立场上所需的其
它物质，包括其它缓冲剂、稀释剂、滤器、针头和注射器。
还提供了可用于多种目的的试剂盒，例如用于表达FcRH5的细胞的杀伤
测定法，用于从细胞中纯化或免疫沉淀FcRH5多肽。为了分离和纯化FcRH5，
试剂盒可包含与珠子(例如sepharose珠子)偶联的抗FcRH5抗体。可以提供
包含抗体的试剂盒，用于FcRH5多肽的体外检测和定量，例如在ELISA或
Western印迹中。与制品相同，试剂盒包括容器和所述容器上或与其相关的标
签或包装插页。容器中装有包含至少一种本发明抗FcRH5抗体的组合物。可
包括另外的容器，其中装有例如稀释剂和缓冲剂、对照抗体。标签或包装插
页可提供对组合物的描述以及用于预期体外或检测用途的说明书。
L.FcRH5多肽的用途
本发明涵盖筛选化合物以鉴定那些模拟FcRH5多肽(激动剂)或阻止
FcRH5多肽产生效果((拮抗剂)的化合物的方法。用于拮抗剂药物候选物的
筛选测定法设计成鉴定与本文鉴定的基因所编码的FcRH5多肽结合或复合，
或者以其它方式干扰所编码多肽与其它细胞蛋白质相互作用的化合物，包括
例如抑制细胞表达FcRH5多肽。此类筛选测定法包括适应高通量筛选化学文
库的测定法，使得它们特别适用于鉴定小分子药物候选物。
可以多种形式进行测定法，包括本领域已经很好表征的蛋白质-蛋白质
结合测定法、生物化学筛选测定法、免疫测定法和基于细胞的测定法。
用于拮抗剂的所有测定法的共同之处在于它们需要使药物候选物接触
本文鉴定的核酸所编码的FcRH5多肽，其条件和时间足以使这两种组分相互
作用。
在结合测定法中，相互作用指结合，所形成的复合物可在反应混合物中
分离或检测。在一个具体的实施方案中，将本文鉴定的基因所编码的FcRH5
多肽或药物候选物通过共价或非共价附着固定在固相上，例如微量滴定板
上。非共价附着通常通过用FcRH5多肽溶液包被固相表面并干燥来实现。或
者，对待固定的FcRH5多肽特异的固定化抗体例如单克隆抗体可用于将它锚
定到固相表面上。测定法如下进行，将可以用可检测标记物标记的非固定化
组分加到固定化组分例如包含锚定组分的包被表面上。在反应完成时，例如
通过清洗除去未反应的组分，并检测锚定到固相表面上的复合物。若最初的
非固定化组分携带可检测标记物，检测出固定到表面上的标记物表明发生了
复合作用。若最初的非固定化组分不携带标记物，可例如通过使用特异性结
合已固定复合物的标记抗体来检测复合作用。
如果候选化合物与本文鉴定的基因所编码的特定FcRH5多肽相互作用
但不结合，那么它与该多肽的相互作用可通过用于检测蛋白质-蛋白质相互
作用的公知方法来测定。此类测定法包括传统方法，诸如例如交联、免疫共
沉淀和通过梯度或层析柱的共纯化。另外，可以如Chevray and Nathans，1991，
Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89：5789-5793所公开的，使用Fields及其同事
(Fields and Song，1989，Nature(London)340：245-246；Chien et al.，1991，Proc.
Natl.Acad.Sci.USA 88：9578-9582)描述的基于酵母的遗传系统来监测蛋白
质-蛋白质相互作用。许多转录激活物，诸如酵母GAL4，由两个空间上离散
的模块结构域组成，一个起DNA结合结构域的作用，另一个起转录激活结构
域的功能。上述出版物中描述的酵母表达系统(通称为“双杂交系统”)利用
了此特性，采用两种杂合蛋白质，在一个中将靶蛋白质与GAL4的DNA结合
结构域融合，而在另一个中将候选激活蛋白质与激活结构域融合。GAL1-lacZ
报道基因在GAL4激活的启动子控制下的表达依赖于GAL4活性经由蛋白质-
蛋白质相互作用的重建。用β-半乳糖苷酶的显色底物检测包含相互作用多肽
的菌落。使用双杂交技术鉴定两种特定蛋白质之间的蛋白质-蛋白质相互作
用的完整试剂盒(MATCHMAKERTM)可从Clontech购买。此系统还可延伸到
对参与特定蛋白质相互作用的蛋白质结构域的作图以及指出对这些相互作
用至关重要的氨基酸残基。
干扰本文鉴定的基因所编码的FcRH5多肽与其它胞内或胞外组分相互
作用的化合物可如下测试：通常在足以使两种产物相互作用和结合的条件和
时间下制备包含基因产物及胞内或胞外组分的反应混合物。为了测试候选化
合物抑制结合的能力，在缺乏和存在测试化合物时进行反应。另外，可以向
第三份反应混合物中加入安慰剂，作为阳性对照。如上所述监测混合物中存
在的FcRH5多肽和胞内或胞外组分之间的结合(复合物形成)。对照反应物
中形成复合物但含有测试化合物的反应混合物中没有形成复合物表明，测试
化合物干扰FcRH5多肽与其反应配偶体的相互作用。
为了测定拮抗剂，可将FcRH5多肽与要筛选特定活性的化合物一起加到
细胞中，在存在FcRH5多肽时该化合物抑制目的活性的能力表明，该化合物
是FcRH5多肽的拮抗剂。或者，可如下检测拮抗剂，将FcRH5多肽和潜在的
拮抗剂与膜结合的FcRH5多肽受体或重组受体在适于竞争性抑制测定法的
条件下组合。FcRH5多肽可进行标记，诸如通过放射性，使得与受体结合的
FcRH5多肽分子的数目可用于测定潜在拮抗剂的效力。编码受体的基因可通
过本领域技术人员知道的多种方法来鉴定，例如配体淘选和FACS分选。
Coligan et al.，1991，Current Protocols in Immun.1(2)：Chapter 5。优选的是，采
用表达克隆，其中从对FcRH5多肽有响应的细胞制备多腺苷酸化RNA，将从
此RNA构建的cDNA文库分成几个集合，并用于转染COS细胞或对FcRH5多
肽没有响应的其它细胞。使在载玻片上培养的转染细胞暴露于经过标记的
FcRH5多肽。可通过多种手段来标记FcRH5多肽，包括碘化或包含位点特异
性蛋白质激酶的识别位点。固定和温育后，将载玻片进行放射自显影分析。
鉴定阳性集合，制备子集，并用相互作用的子集进行再次转染和再次筛选过
程，最后产生编码推定受体的单个克隆。
作为受体鉴定的备选方法，可使经标记的FcRH5多肽与表达受体分子的
细胞膜或提取制备物光亲和性相连。通过PAGE解析交联物质并对X-射线胶
片曝光。可切下包含受体的标记复合物，解离成肽片段，并进行蛋白质微量
测序。从微量测序获得的氨基酸序列可用于设计一组简并寡核苷酸探针，用
于筛选cDNA文库以鉴定编码推定受体的基因。
在用于拮抗剂的另一种测定法中，在存在候选化合物时将表达受体的哺
乳动物细胞或膜制备物与经过标记的FcRH5多肽一起温育。然后测量所述化
合物增强或阻断此相互作用的能力。
潜在拮抗剂的更具体的例子包括结合免疫球蛋白与FcRH5多肽的融合
物的多肽，特别是抗体，包括但不限于多克隆和单克隆抗体及抗体片段，单
链抗体，抗独特型抗体，和嵌合的或人源化型式的此类抗体或片段，以及人
抗体和抗体片段。或者，潜在的拮抗剂可以是密切相关的蛋白质，例如识别
受体但不起作用，由此竞争性抑制FcRH5多肽的作用的突变形式的FcRH5多
肽。
本文鉴定的特异性结合FcRH5多肽的抗体以及通过上文公开的筛选测
定法鉴定的其它分子可以以药用组合物的形式施用，用于治疗多种紊乱，包
括癌症。
如果FcRH5多肽在胞内，而且使用完整抗体作为抑制剂，那么优选使抗
体内在化。然而，还可以用脂转染或脂质体将抗体或抗体片段投递到细胞中。
在使用抗体片段时，优选特异性结合靶蛋白质的结合结构域的最小抑制性片
段。例如，根据抗体的可变区序列，可以设计保留与靶蛋白质序列结合能力
的肽分子。此类肽可以化学合成和/或通过重组DNA技术生成。参见例如
Marasco et al.，1993，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90：7889-7893。
本文中的配制剂还可含有所治疗具体适应症所必需的超过一种活性化
合物，优选那些活性互补且彼此没有不利影响的。或者/另外，所述组合物可
包含增强其功能的药剂，诸如例如细胞毒剂、细胞因子、化疗剂或生长抑制
剂。合适的是，此类分子以对于预定目的有效的量组合存在。
M.抗体衍生物
可进一步修饰本发明的抗体以包含本领域知道的且易于获得的额外非
蛋白质性质模块。优选的是，适于抗体衍生化的模块是水溶性聚合物。水溶
性聚合物的非限制性例子包括但不限于聚乙二醇(PEG)、乙二醇/丙二醇共聚
物、羧甲基纤维素、右旋糖苷、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、聚-1，3-二氧戊
环、聚-1，3，6-三![]()
烷、乙烯/马来酸酐共聚物、聚氨基酸(均聚物或随机共聚
物)、右旋糖苷或聚(n-乙烯吡咯烷酮)聚乙二醇、丙二醇均聚物、环氧丙烷/
环氧乙烷共聚物、聚氧乙烯化多元醇(例如甘油)、聚乙烯醇、及其混合物。
由于其在水中的稳定性，聚乙二醇丙醛在生产中可能具有优势。聚合物可以
是任何分子量，而且可以是分支的或不分支的。附着于抗体的聚合物数目可
以变化，而且如果附着了超过一个聚合物，那么它们可以是相同或不同的分
子。一般而言，可根据下列考虑来确定用于衍生化的聚合物的数目和/或类型，
包括但不限于待改进抗体的具体特性或功能、抗体衍生物是否将用于指定条
件下的治疗等。
N.筛选方法
本发明的又一个实施方案致力于测定怀疑含有FcRH5多肽的样品中该
FcRH5多肽的存在的方法，其中该方法包括使所述样品暴露于结合所述
FcRH5多肽的其抗体药物偶联物，并测定所述样品中所述其抗体药物偶联物
与所述FcRH5多肽的结合，其中此类结合的存在表明所述样品中存在所述
FcRH5多肽。任选的是，所述样品可包括怀疑表达FcRH5多肽的细胞(可以
是癌细胞)。本发明方法中所采用的抗体药物偶联物可任选被可检测地标记、
附着于固相支持物，或诸如此类。
本发明的又一个实施方案致力于诊断哺乳动物中肿瘤的存在的方法，其
中该方法包括(a)使包含从所述哺乳动物获得的组织细胞的测试样品接触结
合FcRH5多肽的其抗体药物偶联物，并(b)检测所述测试样品中所述其抗体药
物偶联物和所述FcRH5多肽之间复合物的形成，其中复合物的形成表明所述
哺乳动物中存在肿瘤。任选的是，所采用的其抗体药物偶联物被可检测地标
记，附着于固相支持物，或诸如此类，和/或所述组织细胞的测试样品是从怀
疑具有癌性肿瘤的个体获得的。
IV.使用抗FcRH5抗体和免疫偶联物的其它方法
A.诊断方法和检测方法
一方面，本发明的抗FcRH5抗体和免疫偶联物可用于检测生物学样品中
FcRH5的存在。术语“检测”在用于本文时涵盖定量或定性检测。在某些实施
方案中，生物学样品包含细胞或组织。在某些实施方案中，此类组织包括相
对于其它组织以更高水平表达FcRH5的正常的和/或癌性的组织，例如B细胞
和/或B细胞相关组织。
一方面，本发明提供了检测生物学样品中FcRH5的存在的方法。在某些
实施方案中，所述方法包括在容许抗FcRH5抗体结合FcRH5的条件下使生物
学样品接触抗FcRH5抗体，并检测在抗FcRH5抗体与FcRH5之间是否形成复
合物。
一方面，本发明提供了诊断与FcRH5表达升高有关的病症的方法。在某
些实施方案中，所述方法包括使测试细胞接触抗FcRH5抗体；通过检测抗
FcRH5抗体对FcRH5的结合，测定测试细胞的FcRH5表达水平(或是定量的
或是定性的)；并比较测试细胞的FcRH5表达水平与对照细胞(例如与测试
细胞相同组织起源的正常细胞或以与这样的正常细胞相当的水平表达
FcRH5的细胞)的FcRH5表达水平，其中测试细胞的FcRH5表达水平比对照
细胞高指示存在与FcRH5表达升高有关的病症。在某些实施方案中，测试细
胞得自怀疑患有与FcRH5表达升高有关的病症的患者。在某些实施方案中，
所述病症是细胞增殖性病症，诸如癌症或肿瘤。
可以使用本发明的抗体诊断的例示性细胞增殖性病症包括B细胞病症和
/或B细胞增殖性病症，包括但不限于淋巴瘤、非何杰金氏淋巴瘤(NHL)、攻
击性NHL、复发性攻击性NHL、复发性无痛性NHL、顽固性NHL、顽固性无
痛性NHL、慢性淋巴细胞性白血病(CLL)、小淋巴细胞淋巴瘤、白血病、毛
细胞白血病(HCL)、急性淋巴细胞性白血病(ALL)和套细胞淋巴瘤。
在某些实施方案中，诊断或检测方法，诸如上文所述，包括检测抗FcRH5
抗体对在细胞表面上表达的FcRH5或在得自在其表面上表达FcRH5的细胞的
膜制备物中的FcRH5的结合。在某些实施方案中，所述方法包括在容许抗
FcRH5抗体结合FcRH5的条件下使细胞接触抗FcRH5抗体，并检测在抗
FcRH5抗体与细胞表面上的FcRH5之间是否形成复合物。用于检测抗FcRH5
抗体对在细胞表面上表达的FcRH5的结合的例示性测定法是“FACS”测定法。
可以使用某些其它方法来检测抗FcRH5抗体对FcRH5的结合。此类方法
包括但不限于本领域公知的抗原结合测定法，诸如Western印迹、放射免疫测
定法、ELISA(酶联免疫吸附测定法)、“三明治/夹心式”免疫测定法、免疫
沉淀测定法、荧光免疫测定法、蛋白A免疫测定法和免疫组化(IHC)。
在某些实施方案中，抗FcRH5抗体是经过标记的。标记物包括但不限于
直接检测的标记物或模块(诸如荧光、显色、电子密度、化学发光和放射性
标记物)，以及间接检测的模块，诸如酶或配体，例如通过酶促反应或分子
相互作用。例示性的标记物包括但不限于放射性同位素32P、14C、125I、3H和
131I，荧光团诸如稀土螯合物或荧光素及其衍生物，罗丹明及其衍生物，丹酰，
伞形酮，萤光素酶例如萤火虫萤光素酶和细菌萤光素酶(美国专利No.
4,737,456)，萤光素，2，3-二氢萘嗪二酮，辣根过氧化物酶(HRP)，碱性磷酸
酶，β-半乳糖苷酶，葡糖淀粉酶，溶菌酶，糖氧化酶例如葡萄糖氧化酶、半
乳糖氧化酶和葡萄糖-6-磷酸脱氢酶，杂环氧化酶诸如尿酸酶和黄嘌呤氧化
酶，偶联利用过氧化氢氧化染料前体的酶HRP、乳过氧化物酶或微过氧化物
酶，生物素/亲合素，自旋标记物，噬菌体标记物，稳定自由基等等。
在某些实施方案中，抗FcRH5抗体是固定在不溶性基质上的。固定化能
够将抗FcRH5抗体与仍然在溶液中游离的任何FcRH5分开。这可以如下常规
进行：或是通过在测定规程之前使抗FcRH5抗体不溶解，即通过吸附至水不
溶性基质或表面(Bennich et al.，U.S.3,720,760)或通过共价偶联(例如使用戊
二醛交联)；或者通过在抗FcRH5抗体与FcRH5之间形成复合物之后使抗
FcRH5抗体不溶解，即例如通过免疫沉淀。
可以使用本发明的免疫偶联物来实施诊断或检测的任何上述实施方案，
或是将所述免疫偶联物替换为抗FcRH5抗体或是所述免疫偶联物与抗FcRH5
抗体一起使用。
B.治疗方法
本发明的抗体或免疫偶联物可用于例如体外、回体(ex vivo)和体内治疗
方法。一方面，本发明提供了在体内或在体外抑制细胞生长或增殖的方法，
所述方法包括在容许免疫偶联物结合FcRH5的条件下使细胞暴露于抗FcRH5
抗体或其免疫偶联物。“抑制细胞生长或增殖”意味着将细胞的生长或增殖降
低至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％或100％，
而且包括诱导细胞死亡。在某些实施方案中，所述细胞是肿瘤细胞。在某些
实施方案中，所述细胞是B细胞。在某些实施方案中，所述细胞是异种移植
物，例如本文中所例示的。
一方面，本发明的抗体或免疫偶联物可用于治疗或预防B细胞增殖性病
症。在某些实施方案中，所述细胞增殖性病症与FcRH5的表达和/或活性升高
有关。例如，在某些实施方案中，所述B细胞增殖性病症与B细胞表面上的
FcRH5表达升高有关。在某些实施方案中，所述B细胞增殖性病症是肿瘤或
癌症。有待于用本发明的抗体或免疫偶联物治疗的B细胞增殖性病症的实例
包括但不限于淋巴瘤、非何杰金氏淋巴瘤(NHL)、攻击性NHL、复发性攻击
性NHL、复发性无痛性NHL、顽固性NHL、顽固性无痛性NHL、慢性淋巴细
胞性白血病(CLL)、小淋巴细胞淋巴瘤、白血病、毛细胞白血病(HCL)、急性
淋巴细胞性白血病(ALL)和套细胞淋巴瘤。
一方面，本发明提供了治疗B细胞增殖性病症的方法，包括给个体施用
有效量的抗FcRH5抗体或其免疫偶联物。在某些实施方案中，用于治疗B细
胞增殖性病症的方法包括给个体施用有效量的药用组合物，其包含包含抗
FcRH5抗体或抗FcRH5免疫偶联物和任选的至少一种别的治疗剂，诸如下文
所提供的。在某些实施方案中，用于治疗B细胞增殖性病症的方法包括给个
体施用有效量的药物组合物，其包含1)包含抗FcRH5抗体与细胞毒剂的免
疫偶联物；和任选地2)至少一种别的治疗剂，诸如下文所提供的。
一方面，本发明的至少有些抗体或免疫偶联物可结合来自人以外物种的
FcRH5。因而，本发明的抗体或免疫偶联物可用于结合例如包含FcRH5的细
胞培养物中的、人中的或具有本发明与其交叉反应的FcRH5的其它哺乳动物
(例如黑猩猩、狒狒、狨、猕猴和恒河猴，猪或小鼠)中的FcRH5。在一个
实施方案中，抗FcRH5抗体或免疫偶联物可用于靶向B细胞上的FcRH5，其
通过使所述抗体或免疫偶联物接触FcRH5以形成抗体或免疫偶联物-抗原复
合物，使得免疫偶联物所偶联的细胞毒素到达细胞内部。在一个实施方案中，
所述FcRH5是人FcRH5。
在一个实施方案中，抗FcRH5抗体或免疫偶联物可用于结合患有与
FcRH5表达和/或活性升高有关的病症的个体中的FcRH5的方法，所述方法包
括给个体施用抗体或免疫偶联物使得个体中的FcRH5得到结合。在一个实施
方案中，FcRH5结合的抗体或免疫偶联物被内化入表达FcRH5的细胞中。在
一个实施方案中，所述FcRH5是人FcRH5，所述个体是人个体。或者，所述
个体可以是表达抗FcRH5抗体与其结合的FcRH5的哺乳动物。还有，所述个
体可以是导入了FcRH5的个体(例如通过施用FcRH5或通过表达编码FcRH5
的转基因)。
可以出于治疗目的将抗FcRH5抗体或免疫偶联物施用于人。此外，可以
出于兽医目的或作为人类疾病的动物模型将抗FcRH5抗体或免疫偶联物施
用于表达抗体与其交叉反应的FcRH5的非人哺乳动物(例如灵长类动物、猪、
大鼠或小鼠)。关于后者，此类动物模型可用于评估本发明抗体或免疫偶联
物的疗效(例如测试施用的剂量和时间进程)。
本发明的抗体或免疫偶联物可以在治疗中单独使用或组合其它组合物
施用。例如，本发明的抗体或免疫偶联物可以与至少一种别的治疗剂和/或佐
剂共施用。在某些实施方案中，别的治疗剂是细胞毒剂、化疗剂或生长抑制
剂。在一个这样的实施方案中，化疗剂是以下药剂或药剂组合，诸如例如环
磷酰胺、羟基柔红霉素、阿霉素、多柔比星、长春新碱(OncovinTM)、泼尼松
龙、CHOP、CVP或COP，或者免疫治疗剂，诸如抗CD20(例如![]()
)
或抗VEGF(例如![]()
)，其中所述组合疗法在以下癌症和/或B细胞病症
的治疗中是有用的，包括淋巴瘤、非何杰金氏淋巴瘤(NHL)、攻击性NHL、
复发性攻击性NHL、复发性无痛性NHL、顽固性NHL、顽固性无痛性NHL、
慢性淋巴细胞性白血病(CLL)、小淋巴细胞淋巴瘤、白血病、毛细胞白血病
(HCL)、急性淋巴细胞性白血病(ALL)和套细胞淋巴瘤。
上文所述此类组合疗法涵盖组合施用(其中两种或多种治疗剂包含在同
一配制剂中或分开的配制剂中)和分开施用，其中本发明抗体或免疫偶联物
的施用可以在别的治疗剂和/或佐剂的施用之前、同时和/或之后进行。本发
明的抗体或免疫偶联物还可以与放疗组合。
本发明的抗体或免疫偶联物(及任何别的治疗剂或佐剂)可以通过任何
合适的手段来施用，包括胃肠外、皮下、腹膜内、肺内和鼻内，及损伤内施
用(如果希望局部治疗的话)。胃肠外输注包括肌肉内、静脉内、动脉内、
腹膜内或皮下施用。另外，通过脉冲输注来施用抗体或免疫偶联物是合适的，
特别是使用递减剂量的抗体或免疫偶联物。剂量给药可以通过任何合适的路
径，例如通过注射，诸如静脉内或皮下注射，这部分取决于施用是短暂的还
是长时间的。
可以与优良医学实践一致的方式配制、剂量给药和施用本发明中使用的
治疗剂(例如本发明的抗体或免疫偶联物)。在此内容中考虑的因素包括所
治疗的具体病症、所治疗的具体哺乳动物、患者个体的临床状况、病症的起
因、投递药剂的部位、施药的方法、施药的日程安排和医学从业人员知道的
其它因素。不是必需而是任选将抗体或免疫偶联物与目前用于预防或治疗所
讨论病症的一种或多种药剂一起配制。此类其它药剂的有效量取决于配制剂
中存在的抗体或免疫偶联物的量、病症或治疗的类型和上文讨论的其它因
素。这些通常是以与本文所用相同剂量和施用路径使用，或是本文所述剂量
的大约1-99％，或是凭经验/在临床上确定为适宜的任何剂量和任何路径。
对于疾病的预防或治疗，本发明抗体或免疫偶联物的适宜剂量(在单独
使用或组合一种或多种其它别的药剂诸如化疗剂时)将取决于待治疗疾病的
类型、抗体或免疫偶联物的类型、疾病的严重程度和进程、施用抗体或免疫
偶联物是出于预防还是治疗目的、先前的疗法、患者的临床病史和对抗体或
免疫偶联物的响应、及主治医师的判断。合适的是，一次性或通过一系列治
疗将抗体或免疫偶联物施用于患者。根据疾病的类型和严重程度，施用于患
者的初始候选剂量可以是约1μg/kg至100mg/kg(例如0.1mg/kg-20mg/kg)抗
体或免疫偶联物，例如或是通过一次或多次分开施药或是通过连续输注。根
据上文所述因素，典型日剂量的范围可以是约1μg/kg至100mg/kg或更多。对
于持续数天或更长的重复施药，根据状况，通常持续治疗直至疾病症状发生
期望的抑制。抗体或免疫偶联物的例示剂量的范围可以是约0.05mg/kg至约
10mg/kg。如此，可对患者施用约0.5mg/kg、2.0mg/kg、4.0mg/kg或10mg/kg
(或其任意组合)的一剂或多剂抗体或免疫偶联物。这些剂量可间歇施用，
例如每周或每三周(例如使得患者接受约2剂至约20剂，例如约6剂抗体或免
疫偶联物)。可施用一剂较高的初始加载剂量，后续一剂或多剂较低剂量。
例示性剂量给药方案包括施用一剂约4mg/kg抗体的初始加载剂量，后续每周
一剂约2mg/kg的维持剂量。然而，其它剂量方案也可能是有用的。这种疗法
的进程易于通过常规技术和测定法来监测。
C.活性测定法
本发明的抗FcRH5抗体和免疫偶联物可以通过本领域知道的各种测定
法来表征其物理/化学特性和/或生物学活性。
1.活性测定法
一方面，提供了用于鉴定具有生物学活性的抗FcRH5抗体或其免疫偶联
物的方法。生物学活性可以包括例如抑制细胞生长或增殖的能力(例如“细
胞杀伤”活性)或诱导细胞死亡(包括程序性细胞死亡(凋亡))的能力。还
提供了在体内和/或在体外具有此类生物学活性的抗体或免疫偶联物。
在某些实施方案中，测试抗FcRH5抗体或其免疫偶联物在体外抑制细胞
生长或增殖的能力。抑制细胞生长或增殖的测定法是本领域公知的。细胞增
殖的某些测定法，以本文所述“细胞杀伤”测定法为例，测量细胞存活力
(viability)。一种这样的测定法是CellTiter-GloTM发光细胞存活力测定法，其
可购自Promega(Madison，WI)。该测定法基于存在的ATP(有代谢活性的细
胞的一项指标)的定量来测定培养物中的存活细胞数。参见Crouch et al(1993)
J.Immunol.Meth.160：81-88；美国专利No.6602677。该测定法可以以96孔或
384孔形式进行，使之适应自动化高通量筛选(HTS)。参见Cree et al(1995)
AntiCancer Drugs 6：398-404。该测定法规程涉及直接向培养细胞添加单一试
剂(CellTiter-![]()
试剂)。这导致细胞溶解和通过萤光素酶反应产生的发光
信号的生成。发光信号与存在的ATP的量成正比，后者直接与培养物中存在
的存活细胞数成正比。可以通过光度计或CCD照相机成像装置来记录数据。
发光输出表述成相对光单位(RLU)。
细胞增殖的另一种测定法是“MTT”测定法，一种测量3-(4，5-二甲基噻唑
-2-基)-2，5-二苯基四唑氮溴化物被线粒体还原酶氧化成甲![]()
(formazan)的比色
测定法。与CellTiter-GloTM测定法一样，此测定法指示细胞培养物中存在的
有代谢活性的细胞的量。参见例如Mosmann(1983)J.Immunol.Meth.
65：55-63；Zhang et al.(2005)Cancer Res.65：3877-3882。
一方面，测试抗FcRH5抗体在体内诱导细胞死亡的能力。诱导细胞死亡
的测定法是本领域公知的。在有些实施方案中，此类测定法测量例如膜完整
性的丧失，其通过碘化丙啶(PI)、锥虫蓝(参见Moore et al.(1995)
Cytotechnology，17：1-11)或7AAD的摄取来指示。在一种例示性PI摄取测定法
中，将细胞在补充有10％热灭活FBS(Hyclone)和2mM L-谷氨酰胺的Dulbecco
氏改良Eagle培养基(D-MEM)∶Ham′s F-12(50∶50)中培养。如此，该测定法在
缺乏补体和免疫效应细胞时进行。将细胞以3x106个/盘接种入100x20mm盘，
并容许附着过夜。除去培养基，并用单独的培养基或含有各种浓度抗体或免
疫偶联物的培养基更换。将细胞温育3天时间段。处理后，将细胞单层用PBS
清洗，并通过胰蛋白酶处理而脱离。然后将细胞于4℃以1200rpm离心5分钟，
将沉淀物重悬于3ml冷的Ca2+结合缓冲液(10mM Hepes，pH 7.4，140mM NaCl，
2.5mM CaCl2)，并等分入35mm盖有滤网(strainer-capped)的12x75mm管(1ml/
管，3管/处理组)以除去细胞团快。然后向管中加入PI(10μg/ml)。使用
FACSCANTM流式细胞仪和FACSCONVERTTM CellQuest软件(Becton
Dickinson)分析样品。根据PI摄取的测定诱导统计学显著水平的细胞死亡的
抗体或免疫偶联物如此得到鉴定。
一方面，测试抗FcRH5抗体或免疫偶联物诱导凋亡(程序性细胞死亡)
的能力。诱导凋亡的抗体或免疫偶联物的一种例示性测定法是膜联蛋白结合
测定法。在一种例示性的膜联蛋白结合测定法中，将细胞如上一段所述培养
并接种入盘。除去培养基，并用单独的新鲜培养基或含有0.001-10μg/ml抗体
或免疫偶联物的培养基更换。3天温育期后，将细胞单层用PBS清洗，并通过
胰蛋白酶处理脱离。然后将细胞如上一段所述离心，重悬于Ca2+结合缓冲液，
并等分入管。然后向管中加入标记的膜联蛋白(例如膜联蛋白V-FITC)
(1μg/ml)。使用FACSCANTM流式细胞仪和FACSCONVERTTM CellQuest软件
(Becton Dickinson)分析样品。相对于对照诱导统计学显著水平的膜联蛋白结
合的抗体或免疫偶联物如此得到鉴定。诱导凋亡的抗体或免疫偶联物的另一
种例示性测定法是组蛋白DNA ELISA比色测定法，其用于检测基因组DNA
的核小体间降解。这样的测定法可使用例如细胞死亡检测ELISA试剂盒
(Roche，Palo Alto，CA)来进行。
可用于任何上述体外测定法的细胞包括在正常情况下表达FcRH5或经
改造而表达FcRH5的细胞或细胞系。此类细胞包括相对于同一组织起源的正
常细胞过表达FcRH5的肿瘤细胞。此类细胞还包括表达FcRH5的细胞系(包
括肿瘤细胞系)和在正常情况下不表达FcRH5但经FcRH5编码核酸转染的细
胞系。
一方面，测试抗FcRH5抗体或其免疫偶联物在体内抑制细胞生长或增殖
的能力。在某些实施方案中，测试抗FcRH5抗体其或免疫偶联物在体内抑制
肿瘤生长的能力。体内模型系统，诸如异种移植物模型，可用于此类测试。
在一种例示性异种移植物系统中，将人肿瘤细胞导入合适的免疫受损的非人
动物，例如SCID小鼠。将本发明的抗体或免疫偶联物施用于所述动物。测量
抗体或免疫偶联物抑制或降低肿瘤生长的能力。在上述异种移植物系统的某
些实施方案中，所述人肿瘤细胞是来自人类患者的肿瘤细胞。此类对于制备
异种移植物模型有用的细胞包括人白血病和淋巴瘤细胞系，其包括但不限于
BJAB-luc细胞(一种经萤光素酶报告基因转染的EBV阴性伯基特氏淋巴瘤
(Burkitt’s lymphoma)细胞系)、Ramos细胞(ATCC，Manassas，VA，
CRL-1923)、SuDHL-4细胞(DSMZ，Braunschweig，Germany，AAC 495)、
DoHH2细胞(参见Kluin-Neilemans，H.C.et al.，Leukemia 5：221-224(1991)，及
Kluin-Neilemans，H.C.et al.，Leukemia 8：1385-1391(1994))、Granta-519细胞
(参见Jadayel，D.M.et al，Leukemia 11(1)：64-72(1997))。在某些实施方案中，
通过皮下注射或通过移植入合适的位点(诸如乳房脂肪垫)，将人肿瘤细胞
导入合适的免疫受损的非人动物。
2.结合测定法和其它测定法
一方面，对抗FcRH5抗体测试其抗原结合活性。例如，在某些实施方案
中，对抗FcRH5抗体测试其结合在细胞表面上表达的FcRH5的能力。可以将
FACS测定法用于此类测试。
一方面，可以将竞争测定法用于鉴定与鼠10A8抗体(mu10A8抗体和/
或人源化10A8v1抗体(hu10A8v1))竞争结合FcRH5的单克隆抗体。在某些实
施方案中，这样的竞争性抗体与鼠10A8抗体(mu10A8)和/或人源化10A8
v1(hu10A8 v1)结合相同的表位(例如线性表位或构象表位)。例示性的竞争
测定法包括但不限于常规测定法，诸如Harlow and Lane(1988)Antibodies：A
Laboratory Manual ch.14(Cold Spring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor，
NY)中所提供的。定位抗体所结合表位的详细的例示性方法见Morris(1996)
“Epitope Mapping Protocols，”于：Methods in Molecular Biology vol.66(人a
Press，Totowa，NJ)。若两种抗体各自阻断彼此50％或更多的结合，则说这两
种抗体结合相同表位。
在一种例示性的竞争测定法中，将固定化的FcRH5在包含能结合FcRH5
的第一经标记抗体(例如鼠10A8抗体(mu10A8)、嵌合10A8抗体(ch10A8)和/
或人源化10A8抗体(hu10A8v1))和要测试其与第一抗体竞争结合FcRH5的第
二未标记抗体的溶液中温育。所述第二抗体可以存在于杂交瘤上清液中。作
为对照，将固定化的FcRH5在包含第一经标记抗体但没有第二未标记抗体的
溶液中温育。在容许第一抗体结合FcRH5的条件下温育后，除去过量的未结
合抗体，并测量与固定化的FcRH5结合的标记物的量。如果测试样品中与固
定化FcRH5结合的标记物的量相对于对照样品有实质性降低，那么这指示所
述第二抗体与所述第一抗体竞争结合FcRH5。在某些实施方案中，固定化的
FcRH5存在于细胞表面上或得自在其表面上表达FcRH5的细胞的膜制备物
中。
一方面，纯化的抗FcRH5抗体可以通过一系列测定法进一步表征，包括
但不限于N-末端测序、氨基酸分析、非变性大小排阻、高压液相层析(HPLC)、
质谱、离子交换层析和木瓜蛋白酶消化。
在一个实施方案中，本发明涵盖了改良的抗体，其具有一些但非所有效
应器功能，这使之成为其中抗体体内半衰期是重要的但某些效应器功能(诸
如补体和ADCC)不是必需的或有害的许多应用的期望候选物。在某些实施
方案中，测量抗体的Fc活性以确保只保留了期望的特性。可进行体外和/或体
内细胞毒性测定法来证实CDC和/或ADCC活性的降低/消除。例如，可以进
行Fc受体(FcR)结合测定法来确认抗体缺乏FcγR结合(因此有可能缺乏ADCC
活性)，但保留FcRn结合能力。介导ADCC的主要细胞，NK细胞，只表达
FcγRIII，而单核细胞表达FcγRI、FcγRII和FcγRIII。Ravetch and Kinet，Annu.
Rev.Immunol.9：457-92(1991)第464页表3总结了造血细胞上的FcR表达。美国
专利No.5,500,362或5,821,337中记载了评估感兴趣分子的ADCC活性的体外
测定法的实例。可用于此类测定法的效应细胞包括外周血单个核细胞(PBMC)
和天然杀伤(NK)细胞。或者/另外，可以在体内评估感兴趣分子的ADCC活性，
例如在动物模型中，诸如Clynes et al.PNAS(USA)95：652-656(1998)中所披露
的。还可以进行C1q结合测定法来证实抗体不能结合C1q及由此缺乏CDC活
性。为了评估补体激活，可进行CDC测定法，例如如Gazzano-Santoro et al.，J.
Immunol.Methods 202：163(1996)中所记载的。还可以使用本领域知道的方法
进行FcRn结合和体内清除/半衰期测定。
提供下列实施例仅仅为了例示目的，而非意图以任何方式限制本发明的
范围。
在此完整收入本说明书中引用的所有专利和文献作为参考。
实施例
除非另有说明，实施例中提及的商品化试剂依照制造商的说明书使用。
实施例中使用的抗体是商品化抗体或本文所述抗体。下文实施例和整篇说明
书中以ATCC编号所鉴别的那些细胞的来源是美国典型培养物保藏中心
(American Type Culture Collection，VA)。
实施例1：结合FcRH5的抗体的制备
此实施例例示了能特异性结合FcRH5的单克隆抗体的制备。
用于生成单克隆抗体的技术是本领域已知的，且描述于例如Goding，同
上。可采用的免疫原包括纯化的FcRH5、含FcRH5的融合蛋白、和在细胞表
面上表达重组FcRH5的细胞。熟练技术人员无需过度实验就可做出免疫原的
选择。
使用在完全弗氏佐剂中乳化的FcRH5免疫原通过1-100微克量的皮下或
腹膜内注射免疫小鼠诸如Balb/c。或者，将免疫原在MPL-TDM佐剂(Ribi
Immunochemical Research，Hamilton，MT)中乳化并注射到动物的后爪垫中。
10至12天后用在选定佐剂中乳化的追加免疫原对已免疫小鼠进行加强免疫。
此后，持续数周，还可通过追加免疫注射对小鼠进行加强免疫。可通过眼窝
后放血定期从小鼠获取血清样品，用于在ELISA测定法中测试以检测抗
FcRH5抗体。
在检测到合适的抗体滴度后，对抗体呈“阳性”的动物可进行最后的免疫
原静脉内注射。3至4天后，处死小鼠并收获脾细胞。然后将脾细胞与选定的
鼠骨髓瘤细胞系融合(使用35％聚乙二醇)，所述细胞系诸如P3X63AgU.1，
可从ATCC，No.CRL 1597获取。融合产生杂交瘤细胞，然后可分配到96孔组
织培养板中，其中装有HAT(次黄嘌呤、氨基喋呤和胸苷)培养基以抑制未
融合细胞、骨髓瘤杂合体和脾细胞杂合体的增殖。
在ELISA中对杂交瘤细胞筛选针对免疫原的反应性。分泌针对免疫原的
期望单克隆抗体的“阳性”杂交瘤细胞的确定在本领域技术范围内。
阳性杂交瘤细胞可腹膜内注射到同基因Balb/c小鼠中以生成含有抗免疫
原单克隆抗体的腹水。或者，可在组织培养瓶或滚瓶中培养杂交瘤细胞。腹
水中生成的单克隆抗体的纯化可使用硫酸胺沉淀后续凝胶排阻层析来完成。
或者，可采用基于抗体与蛋白A或蛋白G结合的亲和层析。
针对本文所公开的FcRH5多肽的抗体可使用此技术成功生成。更具体的
说，可针对以下本文所公开的FcRH5蛋白成功生成能够识别并结合FcRH5蛋
白质(根据标准ELISA、FACS分选分析和/或免疫组化分析的测量)的功能
性单克隆抗体：PRO820(DNA56041)，PRO52387(DNA257845)。
除了制备针对本文所述FcRH5多肽的单克隆抗体之外，所述单克隆抗体
中的许多可成功地与细胞毒素偶联以用于将细胞毒素引导至表达目的
FcRH5多肽的细胞(或组织)(在体外和在体内)。例如，针对以下本文所述
FcRH5多肽可成功生成毒素(例如DM1)衍生化单克隆抗体：PRO820
(DNA56041)，PRO52387(DNA257845)。
A.FcRH5/IRTA2(PRO820、PRO52387)稳定细胞系的生成
为了制备用于筛选FcRH5抗体的细胞系，生成了稳定表达带标签的和不
带标签的FcRH5/IRTA2的SVT2小鼠成纤维细胞细胞系。FcRH5/IRTA2 cDNA
自脾细胞文库PCR扩增并TA克隆(Invitrogen)入pCR4中。为了制备不带标签
的表达构建物，将可读框(ORF)克隆入哺乳动物表达载体pCMV.PD.nbe中，
即使用PCR来添加限制性位点，消化PCR产物，并连接入载体中。制备N端
带标签的表达构建物，即扩增不带信号序列的FcRH5/IRTA2 ORF，并将PCR
产物连接入含有gD标签和信号序列(MGGTAA RLGAVI LFVVIV
G HGVRGKYALADASLKMADPNRFRGKDLPVLDQLL)
(SEQ ID NO：1)的pMSCVneo(Clontech)载体中。对于每种FcRH5/IRTA2，建
立了两种稳定细胞系，用于对单克隆抗体筛选FACS特异性反应性和
FcRH/IRTA间交叉反应性。通过标准Lipofectamine 2000(Invitrogen；Carlsbad，
Ca)方案将带和不带gD标签的表达载体转染入SVT2细胞(在高葡萄糖DMEM
+10％ FBS+2mM L-谷氨酰胺中培养)中。将带gD标签的转染子置于0.5
mg/ml遗传霉素(Invitrogen；Carlsbad，Ca)选择下1周，然后用gD标签特异性单
克隆抗体(gD：952，Genentech；South San Francisco)FACS分选单细胞以获取
最高表达克隆。将不带标签的转染子置于5.0ug/ml嘌呤霉素(Calbiochem；La
Jolla，Ca)选择下直至长出可见菌落。通过标准![]()
(Invitrogen；Carlsbad，Ca)
方案自每个菌落分离RNA，并运行![]()
(ABI；Foster City，Ca)以确定最高
生产克隆。
B.针对FcRH5/IRTA2(PRO820、PRO52387)的单克隆抗体的生成
制备了能够结合人FcRH5的鼠单克隆抗体。
通过将表达带His标签的FcRH5/IRTA2胞外域(ECD)的载体瞬时转染入
CHO细胞中来生成用于免疫小鼠的蛋白质。在镍柱上自转染细胞上清液纯化
蛋白质，并通过N端测序来证实蛋白质的身份。
给10只Balb/c小鼠(Charles River Laboratories，Hollister，CA)超免疫Ribi佐
剂(Ribi Immunochem Research，Inc.，Hamilton，MO)中重组的带多组氨酸标签
(HIS6(SEQ ID NO：68))的蛋白。使用与先前记载的方案(Kohler and Milstein，
1975；Hongo et al.，1995)类似的改良方案将来自展现出针对免疫原的高抗体
滴度(通过直接ELISA)和对稳定表达感兴趣FcRH的SVT2小鼠成纤维细胞
细胞的特异性结合(通过FACS)的小鼠的B细胞与小鼠骨髓瘤细胞
(X63.Ag8.653；American Type Culture Collection，Rockville，MD)融合。10-12
天后，收获上清液并通过直接ELISA和FACS来筛选抗体生成和结合。在第二
轮通过有限稀释进行的亚克隆后，扩增并培养显示最高免疫结合的阳性克
隆，用于进一步表征，包括FcRH1，-2，-3，-4，和-5特异性和交叉反应性。通过
亲和层析(Pharmacia快速蛋白质液相层析[FPLC]；Pharmacia，Uppsala，
Sweden)使用与先前记载的方案(Hongo et al.，1995)类似的改良方案来纯化自
每种杂交瘤谱系收获的上清液。然后将经过纯化的抗体制备物无菌过滤
(0.2μm孔径；Nalgene，Rochester NY)并在磷酸盐缓冲盐水(PBS)中保存于4℃。
已经针对PRO52837(FcRH5c/IRTA2c)成功生成了能够识别并结合
FcRH5蛋白(如通过标准ELISA、FACS分选分析和/或免疫组织化学分析测
量的)的单克隆抗体并命名为：
抗FcRH5-9E2(本文中称作9E2或9E2.1.1)(ATCC No.PTA-7207，保藏于
2005年11月9日)，
抗FcRH5-1H4(本文中称作1H4或1H4.1.1)(ATCC No.PTA-7208，保藏
于2005年11月9日)，
抗FcRH5-13G9(本文中称作13G9或13G9.1.1)(记载于美国临时专利申
请2009年4月1日提交的No.61/211,695和2009年4月2日提交的No.
61/166,214)，
抗FcRH5-4D10(本文中称作4D10或4D10.1.1)(ATCC No.PTA-7210，保
藏于2005年11月9日)，
抗FcRH5-6H1(本文中称作6H1或6H1.1.1)(ATCC No.PTA-7211，保藏于
2005年11月9日)，
抗FcRH5-8H6(本文中称作8H6或8H6.1.1)(ATCC No.PTA-7212，保藏
于2005年11月9日)，
抗FcRH5-7D11(本文中称作7D11或7D11.1.1)(本文中描述的)，
抗FcRH5-10A8(本文中称作10A8或10A8.1.1)(本文中描述的)。
亲和力测定(Biacore分析)
自使用Biacore 2000表面等离振子共振系统(BIAcore，Inc.)测量的结合和
解离速率常数计算IgG的FcRH结合亲和力。使用N-乙基-N′-(3-二甲基氨基丙
基)-碳二亚胺氢氯化物(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)依照供应商的指令
(BIAcore，Inc.)活化生物传感器芯片以共价偶联任一抗鼠IgG(BR-1008-338)。
简言之，对于动力学分析的每个循环，在芯片上捕捉5ul 100nM IgG，以20
ul/min的流速注射两倍连续稀释的各种FcRH 150秒。监测抗原解离180秒，之
后再生。通过用1∶1 Langmuir结合模型拟合数据来计算25℃的平衡解离常数。
运行缓冲液是含0.05％ Tween-20的PBS。结果显示于下文表9。所有抗体以足
以用作治疗剂的亲和力结合抗原。
表9
鼠抗体
对人抗原(Hu antigen)的亲和
稳定转染细胞上的
力(Biacore)
猕猴交叉反应性(FACS)
1H4
6nM
X*
4D10
3nM
6H1
＜0.1nM
X
7D11
6nM
X*
8H6
20nM
X(通过IHC)
9E2
0.2nM
10A8
N/A
X
10F5
N/A
X
13G9
19nM
X
*在饱和浓度时很轻微
C.嵌合抗人FcRH5抗体的构建和测序
1.嵌合抗人FcRH5抗体7D11(ch7D11)
为了构建嵌合7D11 IgG1，使用Qiagen RNeasy迷你试剂盒(目录号74104)
和制造商建议的方案自7D11杂交瘤细胞提取总RNA。使用对7D11单克隆抗
体的轻链和重链获得的N端氨基酸序列，设计对每条链特异性的PCR引物。
设计用于RT-PCR的反向引物，匹配与N端序列对应的基因家族的框架4。引
物还设计成添加用于克隆的期望限制性位点。对于轻链，这些是N端的EcoRV
和框架4 3’端的KpnI。对于重链，添加的位点是N端的BsiWI和VH-CH1接点
略下游的ApaI。引物序列如下：
7D11LCF.EcoRV(7D11轻链正向引物)：
5’-GATCGATATCYTGCTSACMCARTGTCCAGC-3’(SEQ ID NO：2)
(B＝G/T/C，K＝G/T，Y＝C/T，M＝A/C，R＝A/G，D＝G/A/T，S＝G/C，H＝A/T/C)
C7F7LCR.KpnI(7D11轻链反向引物)：
5’-TTTDAKYTCCAGCTTGGTACC-3’(SEQ ID NO：3)
(B＝G/T/C，K＝G/T，Y＝C/T，M＝A/C，R＝A/G，D＝G/A/T，S＝G/C，H＝A/T/C)
1D1(IIID-2)HC F.BsiWI(7D11重链正向引物)：
5’-GATCGACGTACGCTGARGTGCARYTGGTGGARTCTGG-3’(SEQ ID
NO：4)
(B＝G/T/C，K＝G/T，Y＝C/T，M＝A/C，R＝A/G，D＝G/A/T，S＝G/C，H＝A/T/C)
C7F7HCR.ApaI(7D11重链反向引物)：
5’-ACAGTGGGCCCTTGGTGGAGGCTGMRGAGACDGTGASHRDRGT-3’
(SEQ ID NO：5)
(B＝G/T/C，K＝G/T，Y＝C/T，M＝A/C，R＝A/G，D＝G/A/T，S＝G/C，H＝A/T/C)
使用Qiagen一步RT-PCR试剂盒(目录号210210)和建议的反应混合物和
条件进行轻链和重链的RT-PCR反应。用于IgG的哺乳动物细胞表达的pRK载
体先前已有记载(Gorman et al.，DNA Prot Eng Tech 2：3-10(1990)。载体经过修
饰，已经掺入某些内切核酸酶限制酶识别位点以便于克隆和表达(Shields et
al.，J Biol Chem 2000；276：6591-6604)。将扩增的VL克隆入含有人κ恒定域的
pRK哺乳动物细胞表达载体(pRK.LPG3.HumanKappa)。将扩增的VH插入编
码全长人IgG1恒定域的pRK哺乳动物细胞表达载体(pRK.LPG4.HumanHC)。
为抗人FcRH5(ch7D11)获得所得小鼠-人嵌合轻链(图1)和重链(图3)
的整个编码区的DNA序列。由该DNA编码的小鼠-人嵌合轻链和重链的编码
多肽分别显示于图2和4。DNA测序后，分析质粒的表达。
在293(一种经腺病毒转化的人胚肾细胞系(Graham et al.，J.Gen.Virol.，
36：59-74(1977)))中瞬时转染质粒。具体而言，在转染前那天分拆293细胞，
并在含有血清的培养基中分配。次日，添加作为磷酸钙沉淀物制备的双链
DNA，接着是pAdVAntageTM DNA(Promega，Madison，WI)，并将细胞于37℃
温育过夜。在无血清培养基中培养细胞，并在4天后收获。在蛋白A柱上自转
染细胞上清液纯化抗体蛋白，然后缓冲液交换入10mM琥珀酸钠、140mM
NaCl，pH 6.0，并使用Centricon-10(Amicon)浓缩。通过N端测序来验证蛋白
质的身份。通过定量氨基酸分析来测定蛋白质浓度。如下所述在SVT2细胞
中通过FACS对抗体测试对人FcRH5的结合。
2.嵌合抗人FcRH5抗体10A8(ch10A8)
抗体10A8是作为一组抗人FcRH5杂交瘤的成员而衍生的。如上所述使用
RT-PCR构建这些抗体的小鼠/人嵌合物，以使用总mRNA作为底物扩增杂交
瘤轻链和重链的可变域。将轻链可变域克隆入含有人κ恒定域的载体
pRK.LPG3.HumanKappa，而将重链可变域克隆入编码全长人IgG1恒定域的
载体pRK.LPG4.HumanHC。为抗人FcRH5(ch10A8)获得所得小鼠-人嵌合轻
链(图5)和重链(图7)的整个编码区的DNA序列，这容许鉴定可变域的框
架和CDR区。由该DNA编码的10A8小鼠-人嵌合轻链和重链的编码多肽分别
显示于图6和8。
用于RT-PCR克隆10A8的引物的序列如下：
10A8LCF.EcoRV(10A8轻链正向引物)：
5’-GATCGATATCGTGATGACCCARTCTCAYAA-3’(SEQ ID NO：6)
(B＝G/T/C，K＝G/T，Y＝C/T，M＝A/C，R＝A/G，D＝G/A/T，S＝G/C，H＝A/T/C)
10A8LCR.KpnI(10A8轻链反向引物)：
5’-TTTDAKYTCCAGCTTGGTACC-3’(SEQ ID NO：7)
(B＝G/T/C，K＝G/T，Y＝C/T，M＝A/C，R＝A/G，D＝G/A/T，S＝G/C，H＝A/T/C)
10A8HCF.BsiWI(10A8重链正向引物)：
5’-GATCGACGTACGCTGARGTGCARYTGGTGGARTCTGG-3’(SEQ ID
NO：8)
(B＝G/T/C，K＝G/T，Y＝C/T，M＝A/C，R＝A/G，D＝G/A/T，S＝G/C，H＝A/T/C)
10A8HCR(10A8重链反向引物)：
5’-CTGGWCAGGGMTCCAGAGTTCCA-3’(SEQ ID NO：9)
(B＝G/T/C，K＝G/T，Y＝C/T，M＝A/C，R＝A/G，D＝G/A/T，S＝G/C，H＝A/T/C)
3.嵌合抗人FcRH5抗体13G9(ch13G9)
抗体13G9是作为一组抗人FcRH5杂交瘤的成员而衍生的。使用RT-PCR
构建这些抗体的小鼠/人嵌合物，以使用总mRNA作为底物扩增杂交瘤轻链和
重链的可变域。将轻链可变域克隆入含有人κ恒定域的载体
pRK.LPG3.HumanKappa，而将重链可变域克隆入编码全长人IgG1恒定域的
载体pRK.LPG4.HumanHC。DNA测序容许鉴定可变域的框架和CDR区。13G9
的嵌合和人源化型式记载于2009年4月1日提交的美国临时专利申请No.
61/211,695和2009年4月2日提交的美国临时专利申请No.61/166,214，通过述
及将每一篇完整收入本文。
D.人源化抗人FcRH5抗体10A8的生成
残基编号依照Kabat(Kabat et al.，Sequences of proteins of immunological
interest，5th Ed.，Public Health Service，National Institutes of Health，Bethesda，
MD(1991))。使用单字母氨基酸缩写。使用IUB代码代表DNA简并性(N＝
A/C/G/T，D＝A/G/T，V＝A/C/G，B＝C/G/T，H＝A/C/T，K＝G/T，M＝A/C，R＝
A/G，S＝G/C，W＝A/T，Y＝C/T)。
1.人源化抗FcRH5抗体嫁接物
生成了多种人源化抗FcRH5抗体。将来自小鼠FcRH5抗体(10A8)的VL和
VH域与人共有VLκI(huKI)和人亚组III共有VH(huIII)域比对。小鼠10A8的轻
链可变域与人共有序列κI的比对显示于图9。将来自小鼠10A8(mu10A8)的超
变区改造入受体人共有框架以生成MA10A8直接HVR嫁接物(本文中称作
“10A8嫁接物”或“10A8嫁接的‘人源化’抗体”或“hu10A8嫁接
物”(HVR-graft))。将10A8的CDR改造到含有哺乳动物信号序列、人VκI可变
域的共有序列、和人κI恒定域的哺乳动物表达载体上。没有将小鼠残基自供
体单抗转移至受体质粒。使用编码每种CDR的单一寡核苷酸和受体质粒的
ssDNA遵循Kunkle诱变方案来转移CDR。嫁接的残基和所得人10A8型式1
(hu10A8v1)轻链可变域(SEQ ID NO：19)显示于图9。
类似地，将小鼠10A8(mu10A8)的重链可变域的CDR改造到含有哺乳动
物信号序列、人重链亚组III的共有序列和编码全长人IgG1恒定域的序列的载
体上。没有将小鼠残基自供体转移至受体质粒。小鼠10A8重链可变域、嫁接
的人亚组III可变域残基、和所得人10A8型式1(hu10A8v1)重链可变域(SEQ
ID NO：21)的比对显示于图10。
对于初始研究，在经腺病毒转化的人胚肾细胞系293(Graham et al.，1977)
中瞬时表达嵌合物和人源化型式1(hu10A8v1)。对于每种变体，将10μg上文
所述轻链和重链质粒添加至含有0.1ml FuGene的0.9ml DMEM培养基。此混
合物足以添加至一个T250烧瓶的75％汇合293细胞及24ml培养基，并将烧瓶
于37℃和5％ CO2温育过夜。次日，用PBS清洗细胞，并用补充有胰岛素和痕
量元素的无血清表达培养基替换培养基。5天后，收获条件化培养基，并在
蛋白A Sepharose上通过亲和层析来纯化抗体。
通过FACS和Scatchard分析(见下文)来测量人源化型式1(hu10A8 v1)
和嵌合物的相对结合亲和力。由于人源化型式1的亲和力表现为与嵌合物相
当，因此没有生成10A8别的型式来提高亲和力，而且进一步的研究基于此型
式及其缀合衍生物(见下文)。
2.IgG生成
在293(一种经腺病毒转化的人胚肾细胞系(Graham et al.，J.Gen.Virol.，
36：59-74(1977)))中瞬时表达质粒。具体而言，在转染前那天分拆293细胞，
并在含有血清的培养基中分配。次日，添加作为磷酸钙沉淀物制备的双链
DNA，接着是pAdVAntageTM DNA(Promega，Madison，WI)，并将细胞于37℃
温育过夜。在无血清培养基中培养细胞，并在4天后收获。在蛋白A柱上自转
染细胞上清液纯化抗体蛋白，然后缓冲液交换入10mM琥珀酸钠、140mM
NaCl，pH 6.0，并使用Centricon-10(Amicon)浓缩。通过N端测序来验证蛋白
质的身份。通过定量氨基酸分析来测定蛋白质浓度。如下所述在SVT2细胞
中通过FACS对抗体测试对人FcRH5的结合。
3.结合分析(FACS分析)
为了测定FcRH5抗体的交叉反应性，使用FACS分析方法分析了IgG变体
对表达人FcRH1-6的SVT2细胞的结合。
简言之，将稳定表达带gD标签的huFcRH1-6的SVT2细胞的大约106个细
胞在100μl中与1.0μg小鼠或嵌合抗体[小鼠抗gD(Mu anti-gD)(阳性对照)、小
鼠抗FcRH5(1H4)(“mu1H4”)、小鼠抗FcRH5(4D10)(“mu4D10”)、小鼠抗
FcRH5(6H1)(“mu6H1”)、小鼠抗FcRH5(7D11)(“mu7D11”)、嵌合抗FcRH5
(7D11)(“ch7D11”)、小鼠抗FcRH5(8H6)(“mu8H6”)、小鼠抗FcRH5(9E2)
(“mu9E2”)、或小鼠抗FcRH5(13G9)(“mu13G9”)]一起温育。将稳定表达空载
体的SVT2细胞与相同的抗体一起温育，并用作阴性对照。PE偶联的大鼠抗
MuIgG1、大鼠抗MuIgG2a+b、或小鼠抗HuIgG用作检测二抗。结果显示于图14。
所有测试的抗体特异性结合FcRH5，除了小鼠抗FcRH5(6H1)，它与FcRH1
起交叉反应。根据FACS分析，小鼠抗FcRH5(8H6)是一种弱的但FcRH5特异
性的抗体。
为了进一步测定FcRH5抗体的交叉反应性，使用FACS分析分析了IgG变
体上清液对表达人FcRH1-6的SVT2细胞的结合。
简言之，将稳定表达带gD标签的huFcRH1-6的SVT2细胞的大约106个细
胞与1.0μg纯化的Ms抗gD抗体或100μl(浓度未知)小鼠抗体杂交瘤上清液
(小鼠抗FcRH5(10A8)(“mu10A8”)、小鼠抗FcRH5(10F5)(“mu10F5”))一
起温育。将稳定表达空载体的SVT2细胞与相同的抗体一起温育，并用作阴
性对照。PE偶联的大鼠抗MsIgG1用作检测二抗。结果显示于图15。mu10A8
和mu10F5抗体都特异性结合FcRH5。
为了进一步测定小鼠FcRH5抗体的结合，使用FACS分析分析了IgG变体
对表达人FcRH5的Raji细胞和表达猕猴FcRH5的293T细胞的结合。
简言之，将大约106个经人FcRH5稳定转染的Raji细胞和经带gD标签的猕
猴FcRH5瞬时转染的293T细胞与生物素化小鼠同种型对照、生物素化小鼠抗
gD、生物素化mu6H1、生物素化mu13G9、或生物素化mu7D11一起在100μl
FACS缓冲液(PBS、0.5％BSA、0.05％叠氮化钠)中温育。PE偶联的链霉
亲合素用作第二检测试剂。结果显示于图16和17。
对于FcRH5抗体别的FACS分析，对稳定表达huFcRH5的BJAB细胞和稳
定表达猕猴FcRH5的SVT2细胞的每百万个细胞滴定1.0μg、0.1μg或0.01μg抗
体。简言之，将大约106个细胞在100μl中与不同量(稳定表达人FcRH5的BJAB
细胞和稳定表达猕猴FcRH5的SVT2细胞的每百万个细胞，1.0ug、0.1ug或
0.01ug)的小鼠抗体mu1H4、mu6H1、mu7D11、mu9E2、mu10A8、mu10F5、
或mu13G9一起温育。1.0ug/106个细胞与适宜小鼠IgG同种型对照的温育用作
阴性对照。PE偶联的大鼠抗MuIgG1或大鼠抗MuIgG2a+b用作检测二抗。结果
显示于图18和19。根据FACS分析，mu1H4、mu6H1、mu7D11、mu9E2、mu10A8、
mu10F5、或mu13G9与猕猴FcRH5起交叉反应，而且它们可用于评估靶物依
赖性毒性的临床前安全性研究。
对于FcRH5抗体药物偶联物的FACS分析(见实施例2)，将FcRH5 ADC
以渐增浓度(0.1、1.0、和10μg/mL)添加至106个经转染稳定表达人FcRH5
的OPM2细胞或经转染稳定表达猕猴FcRH5的SVT2细胞，反应体积100μL。
然后将样品在FACS缓冲液(PBS、0.5％ BSA、0.1％叠氮化钠)中于室温温
育1小时以抑制内化。清洗后，将细胞在FACS缓冲液中重悬浮，并与20μL
偶联有藻红蛋白的小鼠抗人IgG(Ms抗人-PE)二抗一起在100μL反应体积中
于室温温育30分钟。清洗后，将细胞在200μL 2％低聚甲醛/PBS中固定，并
实施流式细胞术。相同的规程用于HuIgG，然而，只在最高的浓度(10μg/mL)。
HuIgG用作同种型对照来设置每种细胞系的基线PMT。流式细胞术在BD
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上实施，并对每份样品记录几何均值荧光强度。使用FlowJo
v8.4.5软件分析记录的数据(见图20-25)。根据FACS分析，
thio-hu10A8-HC(A118C)和thio-hu10A8-LC(V205C)以不同浓度的未偶联抗体
形式类似地结合稳定表达人FcRH5的OPM2细胞和稳定表达猕猴FcRH5的
SVT2细胞。根据FACS分析，thio-ch10A8-HC(A118C)-MC-vc-PAB-MMAE、
thio-hu10A8-HC(A118C)-MC-vc-PAB-MMAE、
thio-hu10A8-LC(V205C)-MC-vc-PAB-MMAE、ch10A8-SPDB-DM4、和
hu10A8-SPDB-DM4以不同浓度的ADC形式类似地结合稳定表达人FcRH5的
OPM2细胞。
4.亲和力测定(Scatchard分析)
为了进一步测定FcRH5小鼠抗体和IgG克隆的结合、碘化IgG变体对表达
人FcRH5的OPM2细胞和表达猕猴FcRH5的SVT2细胞的结合，实施了
Scatchard分析。
对于Scatchard分析，在经转染稳定表达人FcRH5的OPM2系和经转染稳
定表达猕猴FcRH5的SVT2系的存在下，使0.5nM I125标记的小鼠或IgG克隆抗
FcRH5分别与范围为50至0.02nM(12步1∶2连续稀释)的未标记的小鼠或IgG
克隆抗FcRH5竞争。于4℃温育4小时后，清洗细胞，并通过伽马计数器(1470
WIZARD Automatic Gamma Counter；Perkin Elmer，Walthem，MA)读取细胞团
粒计数。所有点一式三份进行，并计数10分钟。将平均CPM用于使用New
Ligand(Genentech，South San Francisco，CA)程序进行的Kd计算。结果显示于
表10(“ms”指小鼠抗体)。
表10：通过Scatchard分析测定的亲和力测定
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实施例2：抗FcRH5抗体药物偶联物(ADC)的制备
用于为抗人FcRH5生成抗体药物偶联物(ADC)的药物包括美登木素生物
碱DM1和DM4和多拉司他汀10衍生物单甲基auristatin E((monomethyl
auristatin E)MMAE)(参见2005年5月31日提交的US20050276812和2004年11
月5日提交的US20050238649，通过述及都完整收入本文)。DM1、DM4、和
MMAE是细胞毒性比NHL化疗中所使用的长春花生物碱类有丝分裂抑制剂
高至少100倍的有丝分裂抑制剂(Doronina et al.，Bioconjug.Chem.，17：114-123
(2006)；Doronina et al.，Nat.Biotechnol.，21：778-784(2003)；Erickson et al.，
Cancer Res.，66：4426-4433(2006))。用于生成ADC的接头是SMCC(用于
DM1)、SPDB(用于DM4)和MC(用于MMAF)或MC-vc-PAB(用于MMAE)。
对于DM1和DM4，使用稳定的硫酯接头SMCC经由赖氨酸的ε-氨基将抗体连
接至DM1和DM4(称作偶联后的MCC)。或者，对于DM4，使用SPDB接头
经由赖氨酸的e-氨基将抗体连接至DM4。经SMCC接头附着的DM1对还原性
条件中的切割有抗性。另外，如果ADC被内化并靶向溶酶体，引起赖氨酸
-Nε-DM1(其是在细胞内部有效的抗有丝分裂剂)释放的话，SMCC-DM1和
SPDB-DM4 ADC诱导细胞毒性，而且在自细胞释放时，赖氨酸-Nε-DM1是无
毒的(Erickson et al.，Cancer Res.，66：4426-4433(2006))。对于MMAE，通过马
来酰亚氨基己酰基-缬氨酸-瓜氨酸(vc)-对氨基苄氧羰基(MC-vc-PAB)经由半
胱氨酸将抗体连接至MMAE。MC-vc-PAB接头可被胞内蛋白酶切割，诸如组
织蛋白酶B，而且在切割时，释放游离药物(Doronina et al.，Nat.Biotechnol.，21：
778-784(2003))，而MC接头对胞内蛋白酶的切割有抗性。
与2005年5月31日提交的美国申请No.11/141,344(通过述及将其完整收
入本文)中记载的规程类似，使用SMCC-DM1生成了抗人FcRH5的抗体药物
偶联物(ADC)。将抗人FcRH5的纯化的抗体更换缓冲液入含有50mM磷酸钾
和2mM EDTA的pH 7.0溶液。将SMCC(Pierce Biotechnology，Rockford，IL)在
二甲基乙酰胺(DMA)中溶解，并添加至抗体溶液，以得到最终SMCC/Ab摩尔
比10∶1。容许反应在混合中于室温进行3小时。随后在用含150mM NaCl和
2mM EDTA的35mM柠檬酸钠pH 6.0平衡的GE Healthcare HiTrap脱盐柱
(G-25)上纯化SMCC修饰的抗体。将在DMA中溶解的DM1添加至SMCC抗体
制备物以得到DM1对抗体的摩尔比10∶1。容许反应在混合中于室温进行4-20
小时。将DM1修饰的抗体溶液用20倍体积的PBS渗滤以除去未反应的DM1，
无菌过滤，并保存于4℃。典型的是，经此工艺实现40-60％的抗体收率。根
据凝胶过滤和激光散射的评估，通常＞95％的制备物是单体。由于DM1在
252nm处具有最大吸收，因此可以通过252和280nm处的差异吸收度量来确
定结合至抗体的药物的量。典型的是，药物对抗体的比为3-4。
为了生成3-4药物/抗体的抗人FcRH5 SPDB DM4抗体-药物偶联物，首先
用SPDB[4-(2-吡啶基二硫代)丁酸-N-羟基琥珀酰亚胺酯]修饰抗体以生成二
硫代吡啶基团。添加对抗体4-6倍摩尔过量的SPDB并容许于室温反应90分
钟。反应在50mM磷酸钾，pH 7及50mM NaCl、2mM EDTA中进行，抗体
浓度5-10mgs/ml。SPDB反应后，添加乙醇至终浓度5％V/V，并以对SPDB 1.7
倍摩尔过量添加含硫醇的DM4药物。于室温进行温育16小时。偶联物通过透
析、凝胶过滤、或阳离子交换层析来纯化。
与2004年11月5日提交的US申请No.10/983,340(通过述及将其完整收入
本文)中记载的规程类似，使用MC-val-cit(vc)-PAB-MMAE药物接头生成了
抗人FcRH5的抗体药物偶联物(ADC)。将纯化的抗人FcRH5抗体在500mM硼
酸钠和500mM氯化钠pH 8.0中溶解，并用过量的100MM二硫苏糖醇(DTT)
进一步处理。于37℃温育约30分钟后，更换缓冲液，即在Sephadex G25树脂
上用含1mM DTPA的PBS洗脱。检查硫醇/抗体值(thiol/Ab value)，即根据溶
液在280nm处的吸光度测定还原的抗体浓度，通过与DTNB(Aldrich，
Milwaukee，WI)反应并测定412nm处的吸光度测定硫醇浓度。将还原的抗体
在PBS中溶解，在冰上冷却。将DMSO中的药物接头MC-val-cit
(vc)-PAB-MMAE在乙腈和水中溶解，并添加至冷却的、PBS中的还原的抗体。
温育1小时后，添加过量的马来酰亚胺以淬灭反应并给任何未反应的抗体硫
醇基加帽。将反应混合物通过离心超滤来浓缩，并将抗体药物偶联物通过经
PBS中G25树脂的洗脱来纯化和脱盐，在无菌条件下经0.2μm滤器过滤，并
冷冻贮存。
实施例3：半胱氨酸改造的抗FcRH5抗体的制备
如本文中所公开的，实施半胱氨酸改造的抗FcRH5抗体的制备。可以将
半胱氨酸残基添加至抗体的轻链、重链或Fc区，从而能够偶联至各种药物。
在制备半胱氨酸改造的抗FcRH5抗体10A8时，诱变编码轻链的DNA，用半胱
氨酸替代Kabat第205位缬氨酸，如图13所示。诱变编码重链的DNA，用半胱
氨酸替代重链中EU第118位(连续第118位，Kabat编号114)丙氨酸，如图12
所示。可以诱变抗FcRH5抗体的Fc区，用半胱氨酸替代重链Fc区中EU第400
位(连续第400位，Kabat编号396)丝氨酸。
实施例4：使用小鼠抗FcRH5抗体药物偶联物的体内肿瘤细胞杀伤测定法
A.异种移植物
为了测试各种抗FcRH5抗体的功效，将小鼠抗人抗体偶联至DM1并分析
偶联变体对小鼠中肿瘤的效果。
具体而言，在BJAB-萤光素酶细胞(经人FcRH5稳定转染的伯基特氏淋
巴瘤细胞系)中，抗体使肿瘤消退的能力。
将pRK.CMV.PD.nbe.FcRH5转染入BJAB-萤光素酶细胞和嘌呤霉素
(Calbiochem，San Diego，CA)选择后，用抗FcRH5抗体(7D11)对存活细胞FACS
自动克隆中等范围表达者。自动克隆后，使用抗FcRH5抗体(7D11)通过FACS
分析选择根据FACS的测定，最密切类似浆细胞表达的表达FcRH5的BJAB-
萤光素酶细胞系。作为阴性对照，使用以相同方式经空载体pRK.CMV.PD.nbe
转染的BJAB-萤光素酶。
为了分析小鼠抗体的功效，经注射入CB17 ICR SCID小鼠体侧，给雌性
CB17 ICR SCID小鼠(6-8周龄，来自Charles Rivers Laboratories；Hollister，CA)
皮下接种2X107个BJAB-FcRH5细胞，并容许异种移植物肿瘤生长至平均128
mm3。第0天指肿瘤平均100-250mm3且施用第一剂/或唯一一剂处理那天，除
非下文明确指示。肿瘤体积是基于二维计算的，使用测径器来测量，并依照
公式表述成mm3：V＝0.5aXb2，其中a和b分别是肿瘤的长径和短径。将自每
个实验组收集的数据表述成均值+SE。以每周一剂静脉内(i.v.)400μg抗体
连接的药物/m2小鼠(相当于约8-10mg ADC/kg小鼠)，在第0天和第7天用抗
FcRH5 ADC或对照抗体-药物偶联物处理8只一组的小鼠。整个实验期间每周
两次测量肿瘤。整个实验期间每周一次测量小鼠体重。在肿瘤体积达到2000
mm3之前或在肿瘤显示出即将溃疡的迹象时，对小鼠处以安乐死。所有动物
方案都得到了实验动物护理和使用委员会(IACUC)的批准。
所使用的抗体和毒素之间的接头是硫醚交联剂SMCC，其用于DM1。别
的接头可包括二硫化物接头SPP或硫醚交联剂SMCC(其用于DM1)或MC或
MC-缬氨酸-瓜氨酸(vc)-PAB或(一种具有马来酰亚胺构件和对氨基苯甲基氧
羰基(PAB)自我牺牲构件的缬氨酸-瓜氨酸(vc))二肽接头试剂)(其用于单甲基
auristatin E(MMAE)或单甲基auristan F(MMAF))。所使用的毒素是DM1。别
的毒素可包括MMAE或MMAF。
用于此实验的抗体包括mu7D11，其记载于Chang et al.
PCT/US2004/043514(WO 2005/063299)，通过述及将其完整收入本文；以及
本文所述抗FcRH5(见实施例1B，诸如mu7D11、mu6H1、mu10A8、mu13G9、
和mu9E2)。
阴性对照包括基于抗gp-120的偶联物(SMCC-DM1)。
B.结果
1.BJAB-FcRH5异种移植物
在所示药物偶联物和剂量的48天时间过程中，与阴性对照抗gp-120
SMCC-DM1相比，抗FcRH5 mu7D11、mu6H1、mu10A8、mu13G9、和mu9E2
ADC在具有BJAB-FcRH5肿瘤的SCID小鼠中显示出抑制肿瘤生长。对于所有
ADC和对照，ADC在第0天和第7天以两剂施用(如下文表11所示)。具体而
言，所有抗FcRH5 ADC显著抑制肿瘤生长(图26)。
另外，在相同研究中，在每个剂量组中测定头17天的百分比体重变化。
结果(图27)指示施用这些小鼠抗FcRH5 ADC在此时间期间没有引起显著体
重减轻或重量损失。
再者，在表11中，显示了测试总数中显示部分消退(PR；其中施药后任
何时间的肿瘤体积下降至低于第0天测得的肿瘤体积的50％)、完全消退(CR；
其中施药后任何时间的肿瘤体积下降至0mm3)的小鼠数目(NA＝不适用)；
(TI＝研究结束时可观察肿瘤的数目)。
表11
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实施例5：抗FcRH5 ThioMab药物偶联物的体内肿瘤生长抑制测定法
A.异种移植物
为了测试带有MC-vc-PAB-MMAE的hu10A8 thioMAb药物偶联物和带有
SPDB-DM4的hu10A8药物偶联物的功效，分析10A8 thioMab药物偶联物和
10A8药物偶联物对小鼠中肿瘤的效果。
具体而言，在经人FcRH稳定转染的OPM2细胞(多发性骨髓瘤细胞系)
中检查了抗体使肿瘤消退的能力。
将线性化pRK.CMV.PD.nbe.FcRH5转染入OPM2细胞和嘌呤霉素
(Calbiochem，San Diego，CA)选择后，用生物素(Pierce Biotechnology，Rockford，
Il)标记的抗FcRH5.7D11和MACS抗生物素微珠在MACS LS柱(Miltenyi
Biotec，Auburn，Ca)上对存活细胞分离表达FcRH5的细胞。分离后，使用抗
FcRH5抗体(10A8)通过FACS分析确认FcRH5表达，并使用以相同方式经空载
体pRK.CMV.PD.nbe转染的OPM2细胞系作为阴性对照。
为了分析带有MC-vc-PAB-MMAE的hu10A8 thioMAb药物偶联物和带有
SPDB-DM4的hu10A8药物偶联物的功效，经注射入CB17 ICR SCID小鼠体
侧，给雌性CB 17 ICR SCID小鼠(6-8周龄，来自Charles Rivers Laboratories；
Hollister，CA)皮下接种2X107个OPM2-FcRH5细胞，并容许异种移植物肿瘤
生长至平均180mm3。第0天指肿瘤平均100-250mm3且施用第一剂/或唯一一
剂处理那天，除非下文明确指示。肿瘤体积是基于二维计算的，使用测径器
来测量，并依照公式表述成mm3：V＝0.5aXb2，其中a和b分别是肿瘤的长径
和短径。将自每个实验组收集的数据表述成均值+SE。以单剂静脉内(i.v.)2、
4、或8mg ADC/kg，用抗FcRH5 ADC或对照抗体-药物偶联物处理8只一组的
小鼠。整个实验期间每周两次测量肿瘤。整个实验期间每周一次测量小鼠体
重。在肿瘤体积达到3000mm3之前或在肿瘤显示出即将溃疡的迹象时，对小
鼠处以安乐死。所有动物方案都得到了实验动物护理和使用委员会(IACUC)
的批准。
阴性对照包括基于抗HER2(![]()
)(trastuzumab)的偶联物
(SPDB-DM4和MC-vc-PAB-MMAE)。
B.结果
1.OPM2-FcRH5异种移植物
在表12所示药物偶联物和剂量的35天时间过程中，与阴性对照偶联有
SPDB-DM4的人源化抗HER2(Hu-anti-HER2(4D5)-SPDB-DM4)和偶联有
MC-vc-PAB-MMAE的人源化抗HER2(4D5)thioMAb(“thio-hu-anti-HER2
(4D5)-vc-E)相比，偶联有SPDB-DM4的hu10A8(Hu-anti-FcRH5
(10A8)-SPDB-DM4)和偶联有MC-vc-PAB-MMAE的hu10A8 thioMAb
(“thio-HC-hu-anti-FcRH5(10A8)-vc-E”)在具有OPM2-FcRH5肿瘤的SCID小鼠
中显示出抑制肿瘤生长。对于所有ADC和对照，ADC在第0天以单剂施用(如
表12所示)。具体而言，所有人源化抗FcRH5和人源化抗FcRH5 thioMAb ADC
显著抑制肿瘤生长(图28)。使用基于抗HER2的偶联物作为阴性对照
(“Thio-hu-anti-Her2(4D5)-vc-E”和“Anti-Her2(4D5)-spdb-dm4”)。
另外，在相同研究中，在每个剂量组中测定头14天的百分比体重变化。
结果(图29)指示施用这些人源化抗FcRH5和人源化抗FcRH5 thioMAb ADC
在此时间期间没有引起显著体重减轻或重量损失。
再者，在表12中，显示了测试总数中显示部分消退(PR；其中施药后任
何时间的肿瘤体积下降至低于第0天测得的肿瘤体积的50％)、完全消退(CR；
其中施药后任何时间的肿瘤体积下降至0mm3)的小鼠数目(NA＝不适用)；
(TI＝研究结束时可观察肿瘤的数目)。
表12
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*媒介＝20mM组氨酸乙酸酯，pH 5.5，240mM蔗糖，0.02％ PS20
实施例6：人源化抗FcRH5药物偶联物的体内肿瘤生长抑制测定法
A.异种移植物
为了测试不同剂量的带有SPDB-DM4的hu10A8药物偶联物
(“hu-Anti-FcRH5(10A8)-SPDB-DM4”)的功效，分析偶联抗体对小鼠中肿瘤
的效果。
具体而言，在经人FcRH稳定转染的OPM2细胞(多发性骨髓瘤细胞系)
中检查了抗体使肿瘤消退的能力。
将线性化pRK.CMV.PD.nbe.FcRH5转染入OPM2细胞和嘌呤霉素
(Calbiochem，San Diego，CA)选择后，用生物素(Pierce Biotechnology，Rockford，
Il)标记的抗FcRH5.7D11和MACS抗生物素微珠在MACS LS柱(Miltenyi
Biotec，Auburn，Ca)上对存活细胞分离表达FcRH5的细胞。分离后，使用抗
FcRH5抗体(10A8)通过FACS分析确认FcRH5表达，并使用以相同方式经空载
体pRK.CMV.PD.nbe转染的OPM2细胞系作为阴性对照。
为了分析带有SPDB-DM4的hu10A8药物偶联物的功效，经注射入CB17
ICR SCID小鼠体侧，给雌性CB17 ICR SCID小鼠(6-8周龄，来自Charles Rivers
Laboratories；Hollister，CA)皮下接种2X107个OPM2-FcRH5细胞，并容许异
种移植物肿瘤生长至平均180mm3。第0天指肿瘤平均100-250mm3且施用第
一剂/或唯一一剂处理那天，除非下文明确指示。肿瘤体积是基于二维计算的，
使用测径器来测量，并依照公式表述成mm3：v＝0.5aXb2，其中a和b分别是
肿瘤的长径和短径。将自每个实验组收集的数据表述成均值+SE。以单剂
静脉内(i.v.)范围为0.5至12mg ADC/kg，用抗FcRH5 ADC或对照抗体-药物偶
联物(ADC)处理9只一组的小鼠。整个实验期间每周两次测量肿瘤。整个实验
期间每周一次测量小鼠体重。在肿瘤体积达到3000mm3之前或在肿瘤显示出
即将溃疡的迹象时，对小鼠处以安乐死。所有动物方案都得到了实验动物护
理和使用委员会(IACUC)的批准。
阴性对照包括基于抗HER2(![]()
)(trastuzumab)的偶联物
(SPDB-DM4)。
B.结果
1.OPM2-FcRH5异种移植物
在表13所示药物偶联物和剂量的50天时间过程中，与阴性对照偶联有
SPDB-DM4的人源化抗HER2(“hu-anti-HER2(4D5)-SPDB-DM4”)相比，偶联
有SPDB-DM4的人源化抗FcRH5(10A8)(hu10A8)(“hu-anti-FcRH5
(10A8)-SPDB-DM4”)在具有OPM2-FcRH5肿瘤的SCID小鼠中显示出抑制肿
瘤生长。对于所有ADC和对照，ADC在第0天以单剂施用(如表13所示)。具
体而言，8mg/kg和12mg/kg人源化抗FcRH5 ADC显著抑制肿瘤生长(图30a)。
另外，在相同研究中，在每个剂量组中测定头14天的百分比体重变化。
结果(图30b)指示施用这些人源化抗FcRH5和人源化抗FcRH5 thioMAb ADC
在此时间期间没有引起显著体重减轻或重量损失。
再者，在表13中，显示了测试总数中显示部分消退(PR；其中施药后任
何时间的肿瘤体积下降至低于第0天测得的肿瘤体积的50％)、完全消退(CR；
其中施药后任何时间的肿瘤体积下降至0mm3)的小鼠数目(NA＝不适用)；
(TI＝研究结束时可观察肿瘤的数目)。
表13
![]()
*媒介＝20mM组氨酸乙酸酯，pH 5.5，240mM蔗糖，0.02％ PS20
实施例7：抗FcRH5 ThioMab药物偶联物的体外细胞增殖降低测定法
用经过转染稳定表达人FcRH5的OMP2系(OPM2.CMV.PD.FcRH5.SP.2)
通过细胞增殖测定法测量了hu10A8和hu10A8 thioMAb(HC(A118C)药物偶
联物(包括hu anti-FcRH5(10A8)-Naked、thio-HC(A118C)-hu-anti-FcRH5
(10A8)-Naked、hu anti-FcRH5(10A8)-SPDB-DM4、
thio-HC(A118C)-hu-anti-FcRH5(10A8)-MC-vc-PAB-MMAE)的体外功效。
CellTiter-![]()
Luminescent Cell Viability Assay为商购的(Promega Corp.，
Madison，WI)基于鞘翅目(Coleoptera)萤光素酶的重组表达的同质性测定方
法(homogeneous assay method)(US5583024；US 5674713；US5700670)。该细
胞增殖测定法基于对存在的ATP进行定量，测定培养物中存活细胞的数目，
其中存在的ATP为代谢活性细胞的指示剂(Crouch等，J.Immunol.Metho.
160：81-88(1993)；US 6602677)。以96孔形式进行CellTiter-![]()
测定法，使得
它易于进行自动化高流通量筛选(HTS)(Cree等，AntiCancer Drugs 6：398-404
(1995))。同质性测定法规程包括将单一试剂(CellTiter-![]()
试剂)直接加入
到在血清补充的培养基中培养的细胞中。
同质性“添加-混合-测定”方式导致细胞裂解并且产生与存在的ATP量成
比例的发光信号。底物甲虫萤光素被重组萤火虫萤光素酶氧化脱羧化，而同
时ATP转化成AMP并且产生光子。以相对发光单位(RLU)反映出存活细胞。
通过发光计或CCD照相机成像装置记录数据。将发光输出表示为在一段时间
内测定的RLU。％RLU是与“非药物偶联物”对照相比的标准化RLU百分比。
或者，可以在有闪烁剂存在下在闪烁计数器中对来自发光的光子进行计数。
然后可以将光单位表示为CPS(每秒计数)。
通过使用下列方案的细胞增殖测定法测定人源化抗体-药物偶联物的功
效(改编自CellTiter Glo Luminescent Cell Viability Assay，Promega Corp.
Technical Bulletin TB288；Mendoza等，Cancer Res.62：5485-5488(2002))：
1.使在培养基中含有约75,000个OPM2.CMV.PD.FcRH5.SP.2细胞的50
μl细胞培养物等份沉积在96孔不透明壁的平板的各孔中。
2.将hu10A8或thio-HC(A118C)-hu-anti-FcRH5(10A8)Ab或ADC(50ul)
添加至一式三份的实验孔至终浓度10000、3333、1111、370、123、41、14、
4.6或1.5ng/mL，“无药物偶联物”对照孔只接受培养基，并温育3天。
3.使平板平衡至室温约30分钟。
4.添加CellTiter-Glo试剂(100μl)。
5.将内含物在定轨振荡器上混合2分钟以便诱导细胞裂解。
6.将平板于室温温育10分钟以便稳定发光信号。
7.记录发光并作为％RLU(相对发光单位)在图中报告。
8.作为对照，用无关的不结合的人源化抗Her2.4D5抗体或ADC(包括
hu-anti-Her2.4D5-Naked、hu-anti-Her2.4D5.HC.A118C-Naked、hu
anti-Her2.4D5-SPDB-DM4、hu anti-Her2.4D5.HC.A118C-MC-vc-PAB-MMAE)
平行运行相同细胞系。
培养基：OPM2.CMV.PS.FcRH5.SP.2细胞在RPMI1640/20％ FBS/2mM
谷氨酰胺/1.0μg/ml嘌呤霉素中生长。
小鼠抗体-药物偶联物的功效显示于图31和32。此测定法的结果表述为
以mg/ml计的IC50。IC50为细胞生长抑制50％所需抗体或ADC浓度。未偶联
hu10A8和thio-hu anti-FcRH5(10A8)-HC(A118C)没有显示出对
OPM2.CMV.PS.FcRH5.SP.2细胞的体外细胞生长抑制，IC50为10mg/ml(该
测定法的浓度滴定的上限)。hu anti-FcRH5(10A8)-SPDB-DM4和thio-hu
anti-FcRH5(10A8)-HC(A118C)-MC-vc-PAB-MMAE均显示出
OPM2.CMV.PS.FcRH5.SP.2细胞生长抑制，IC50分别为0.03和0.04mg/ml。另
外，hu anti-FcRH5(10A8)-SPDB-DM4在更高浓度引起完全
OPM2.CMV.PS.FcRH5.SP.2细胞生长抑制。在对照抗体和ADC中，只有hu
anti-Her2.4D5-SPDB DM4显示出OPM2.CMV.PS.FcRH5.SP.2细胞生长抑制，
IC50为1.8mg/ml。因为SPDB DM4是一种可切割接头药物，所以此生长抑制
很可能是旁路药物活性(bystander drug activity)。
实施例8：人源化抗FcRH5药物偶联物的体内肿瘤生长抑制测定法
A.异种移植物
为了测试与![]()
(bortezomib)组合的人源化(10A8)药物偶联物(hu
Anti-FcRH5(10A8)-MC-vc-PAB-MMAE)的功效，分析单独的或与![]()
组合的偶联抗体对小鼠中肿瘤(多发性骨髓瘤OPM2-FcRH5异种移植物)的
效果。
具体而言，在经人FcRH稳定转染的OPM2细胞(多发性骨髓瘤细胞系)
中检查了所述抗体和![]()
使肿瘤消退的能力。将线性化
pRK.CMV.PD.nbe.FcRH5转染入OPM2细胞和嘌呤霉素(Calbiochem，San
Diego，CA)选择后，用生物素(Pierce Biotechnology，Rockford，Il)标记的抗
FcRH5.7D11和MACS抗生物素微珠在MACS LS柱(Miltenyi Biotec，Auburn，
Ca)上对存活细胞分离表达FcRH5的细胞。分离后，使用抗FcRH5抗体(10A8)
通过FACS分析确认FcRH5表达，并使用以相同方式经空载体
pRK.CMV.PD.nbe转染的OPM2细胞系作为阴性对照。
为了分析单独的和与![]()
组合的偶联有MC-vc-PAB-MMAE的hu
anti-FcRH5 10A8的功效，经注射入CB17 ICR SCID小鼠体侧，给雌性CB17
ICR SCID小鼠(6-8周龄，来自Charles Rivers Laboratories；Hollister，CA)皮
下接种2X107个OPM2-FcRH5细胞，并容许异种移植物肿瘤生长至平均331
mm3。第0天指肿瘤172-511mm3且施用第一剂/或唯一一剂处理那天，除非下
文明确指示。肿瘤体积是基于二维计算的，使用测径器来测量，并依照公式
表述成mm3：V＝0.5aXb2，其中a和b分别是肿瘤的长径和短径。将自每个实
验组收集的数据表述成均值+SE。将小鼠随机分成9组，每组9只小鼠，并
服药。第1组接受第0天单次静脉内(IV)注射组氨酸缓冲液加两周每周两次(即
第0天、第3天、第7天、和第10天)IV注射0.9％氯化钠(盐水)，作为媒介对
照。第2组接受第0天单次IV注射10mg/kg Hu anti-Her2
Trastuzumab-MC-vc-PAB-MMAE，CNJ 1135，作为偶联物对照。第3组接受
两周每周两次(即第0天、第3天、第7天、和第10天)IV注射1mg/kg![]()
第4-5组分别接受第0天单次IV注射4或10mg/kg thio hu
anti-FcRH5(10A8)-HC-MC-vc-PAB-MMAE，CNJ 1465。第6-7组分别接受第0
天单次IV注射4或10mg/kg hu anti-FcRH5(10A8)-MC-vc-PAB-MMAE，CNJ
1575。第8组接受第0天单次IV注射4mg/kg hu
anti-FcRH5(10A8)-MC-vc-PAB-MMAE，CNJ 1575加两周每周两次(即第0天、
第3天、第7天、和第10天)IV注射1mg/kg![]()
整个实验期间每周两
次测量肿瘤。头三周每周两次测量小鼠体重。在肿瘤体积达到3000mm3之前
或在肿瘤显示出即将溃疡的迹象时，对小鼠处以安乐死。所有动物方案都得
到了实验动物护理和使用委员会(IACUC)的批准。
阴性对照包括基于抗HER2(![]()
)(trastuzumab)的偶联物
(MC-vc-PAB-MMAE)。
B.结果
1.OPM2-FcRH5异种移植物
在单独的或与![]()
组合的药物偶联物的45天时间过程中，与阴性对
照偶联有MC-vc-PAB-MMAE的人源化抗Her2(Hu anti-Her2
Trastuzumab-MC-vc-PAB-MMAE)相比，与![]()
组合的偶联有
MC-vc-PAB-MMAE的hu10A8(hu anti-FcRH5(10A8)-MC-vc-PAB-MMAE)在
具有OPM2-FcRH5肿瘤的SCID小鼠中显示出抑制肿瘤生长(图39)。对于所
有药物偶联物和对照，ADC在第0天以单剂施用。![]()
每周两次施用两
周，即第0天、第3天、第7天和第10天施用。另外，与服用4和10mg/kg Thio
Hu anti-FcRH5 10A8-MC-vc-PAB-MMAE、4和10mg/kg Hu anti-FcRH5
10A8-MC-vc-PAB-MMAE、和1mg/kg![]()
的单一药剂组相比，与1mg/kg
![]()
组合的4mg/kg Hu anti-FcRH5 10A8-MC-vc-PAB-MMAE显著抑制
肿瘤生长(图39)。
另外，在相同研究中，在每个剂量组中测定头24天的百分比体重变化(图
40)。结果指示施用![]()
在整个治疗持续期间引起体重减轻或重量损失，
但是重量在服药完成后回弹。
再者，在表14中，显示了测试总数中显示部分消退(PR；其中施药后任
何时间的肿瘤体积下降至低于第0天测得的肿瘤体积的50％)、完全消退(CR；
其中施药后任何时间的肿瘤体积下降至0mm3)的小鼠数目(NA＝不适用)；
(TI＝研究结束时可观察肿瘤的数目)。
表14
![]()
![]()
*媒介＝20mM组氨酸乙酸酯，240mM蔗糖，0.02％ PS20，pH 5.5
实施例9：人源化抗FcRH5药物偶联物的体内肿瘤生长抑制测定法
A.异种移植物
为了测试与![]()
组合的人源化(10A8)药物偶联物(Hu Anti-FcRH5
10A8-SPDB-DM4)的功效，分析单独的或与![]()
组合的偶联抗体对小鼠
中肿瘤(多发性骨髓瘤OPM2-FcRH5异种移植物)的效果。
具体而言，在经人FcRH稳定转染的OPM2细胞(多发性骨髓瘤细胞系)
中检查了抗体和![]()
使肿瘤消退的能力。
将线性化pRK.CMV.PD.nbe.FcRH5转染入OPM2细胞和嘌呤霉素
(Calbiochem，San Diego，CA)选择后，用生物素(Pierce Biotechnology，Rockford，
Il)标记的抗FcRH5.7D11和MACS抗生物素微珠在MACS LS柱(Miltenyi
Biotec，Auburn，Ca)上对存活细胞分离表达FcRH5的细胞。分离后，使用抗
FcRH5抗体(10A8)通过FACS分析确认FcRH5表达，并使用以相同方式经空载
体pRK.CMV.PD.nbe转染的OPM2细胞系作为阴性对照。
为了分析单独的和与![]()
组合的偶联至SPDB-DM4的Hu
anti-FcRH5 10A8的功效，经注射入CB17 ICR SCID小鼠体侧，给雌性CB17
ICR SCID小鼠(6-8周龄，来自Charles Rivers Laboratories；Hollister，CA)皮
下接种2X107个OPM2-FcRH5细胞，并容许异种移植物肿瘤生长至平均306
mm3。第0天指肿瘤197-499mm3且施用第一剂/或唯一一剂处理那天，除非下
文明确指示。肿瘤体积是基于二维计算的，使用测径器来测量，并依照公式
表述成mm3：V＝0.5aXb2，其中a和b分别是肿瘤的长径和短径。将自每个实
验组收集的数据表述成均值+SE。将小鼠随机分成6组，每组9只小鼠，并
服药。第1组接受两周每周两次(即第0天、第3天、第7天、和第10天)静脉
内(IV)注射1mg/kg![]()
第2组接受第0天单次IV注射组氨酸缓冲液加两
周每周两次(即第0天、第3天、第7天、和第10天)IV注射0.9％氯化钠(盐
水)，作为媒介对照。第3组接受第0天单次IV注射4mg/kg Hu anti-Her2
Trastuzumab-SPDB-DM4，CNJ 1433，作为偶联物对照。第4组接受第0天单
次IV注射4mg/kg Hu anti-FcRH5 10A8 SPDB-DM4，CNJ 1503。第5组接受第
0天单次IV注射4mg/kg Hu anti-Her2 Trastuzumab-SPDB-DM4，CNJ 1433加两
周每周两次(即第0天、第3天、第7天、和第10天)IV注射1mg/kg![]()
第6组接受第0天单次IV注射4mg/kg Hu anti-FcRH5 10A8 SPDB-DM4，CNJ
1503加两周每周两次(即第0天、第3天、第7天、和第10天)IV注射1mg/kg
![]()
整个实验期间每周两次测量肿瘤。头三周每周两次测量小鼠体重。
在肿瘤体积达到3000mm3之前或在肿瘤显示出即将溃疡的迹象时，对小鼠处
以安乐死。所有动物方案都得到了实验动物护理和使用委员会(IACUC)的批
准。
阴性对照包括基于抗HER2(![]()
)(trastuzumab)的偶联物
(SPDB-DM4)。
B.结果
1.OPM2-FcRH5异种移植物
在单独的或与![]()
组合的药物偶联物的37天时间过程中，与阴性对
照偶联有SPDB-DM4的人源化抗Her2(Hu anti-Her2 Trastuzumab-SPDB-DM4)
相比，与![]()
组合的偶联有SPDB-DM4的人源化抗FcRH5(10A8)(Hu
anti-FcRH5 10A8-SPDB-DM4)在具有OPM2-FcRH5肿瘤的SCID小鼠中显示
出抑制肿瘤生长(图41)。对于所有药物偶联物和对照，ADC在第0天以单剂
施用。![]()
每周两次施用两周，即第0天、第3天、第7天和第10天。另
外，与服用4mg/kg Hu anti-FcRH5 10A8-SPDB-DM4和1mg/kg![]()
的单
一药剂组和服用Hu anti-Her2 Trastuzumab-SPDB-DM4加1mg/kg![]()
的
组合组相比，与1mg/kg![]()
组合的4mg/kg Hu anti-FcRH5
10A8-SPDB-DM4显著抑制肿瘤生长(图41)。
另外，在相同研究中，在每个剂量组中测定头21天的百分比体重变化(图
42)。结果指示施用人源化抗FcRH5 ADC和![]()
在此时间期间没有引起
显著体重减轻或重量损失。
再者，在表15中，显示了测试总数中显示部分消退(PR；其中施药后任
何时间的肿瘤体积下降至低于第0天测得的肿瘤体积的50％)、完全消退(CR；
其中施药后任何时间的肿瘤体积下降至0mm3)的小鼠数目(NA＝不适用)；
(TI＝研究结束时可观察肿瘤的数目)。
表15
![]()
![]()
*媒介＝20mM组氨酸乙酸酯，240mM蔗糖，0.02％ PS20，pH 5.5
实施例10：人源化抗FcRH5药物偶联物的体内肿瘤生长抑制测定法
A.异种移植物
为了测试与![]()
和![]()
加地塞米松组合的人源化(10A8)药
物偶联物(Hu Anti-FcRH5 10A8-MC-vc-PAB-MMAE)的功效，分析与
![]()
和![]()
加地塞米松组合的偶联抗体对小鼠中肿瘤(多发性骨
髓瘤OPM2-FcRH5异种移植物)的效果。
具体而言，在经人FcRH稳定转染的OPM2细胞(多发性骨髓瘤细胞系)
中检查了与![]()
和![]()
加地塞米松组合的抗体使肿瘤消退的能
力。
将线性化pRK.CMV.PD.nbe.FcRH5转染入OPM2细胞和嘌呤霉素
(Calbiochem，San Diego，CA)选择后，用生物素(Pierce Biotechnology，Rockford，
Il)标记的抗FcRH5.7D11和MACS抗生物素微珠在MACS LS柱(Miltenyi
Biotec，Auburn，Ca)上对存活细胞分离表达FcRH5的细胞。分离后，使用抗
FcRH5抗体(10A8)通过FACS分析确认FcRH5表达，并使用以相同方式经空载
体pRK.CMV.PD.nbe转染的OPM2细胞系作为阴性对照。
为了分析与![]()
和![]()
加地塞米松组合的偶联至
MC-vc-PAB-MMAE的Hu anti-FcRH5 10A8的功效，经注射入CB17 ICR SCID
小鼠体侧，给雌性CB17 ICR SCID小鼠(6-8周龄，来自Charles Rivers
Laboratories；Hollister，CA)皮下接种2X107个OPM2-FcRH5细胞，并容许异
种移植物肿瘤生长至平均446mm3。第0天指肿瘤263-630mm3且施用第一剂/
或唯一一剂处理那天，除非下文明确指示。肿瘤体积是基于二维计算的，使
用测径器来测量，并依照公式表述成mm3：V＝0.5aXb2，其中a和b分别是肿
瘤的长径和短径。将自每个实验组收集的数据表述成均值+SE。将小鼠随
机分成9组，每组8只小鼠，并服药。第1组接受第0-13天每天腹膜内(IP)注射
DMSO和MCT缓冲液的混合物，作为媒介对照。第2组接受第0天单次静脉内
(IV)注射6mg/kg Hu anti-Her2 Trastuzumab-MC-vc-PAB-MMAE，CNJ 1135，
作为偶联物对照。第3组接受第0天单次IV注射6mg/kg Hu anti-FcRH5
10A8-MC-vc-PAB-MMAE，CNJ 1672。第4组接受第0-13天每天IP注射50
mg/kg![]()
第5组接受4天每天口服(PO)3mg/kg地塞米松，接着停药3
天，进行2个周期，即第0-3天和第7-10天。第6组接受第0-13天每天IP注射50
mg/kg![]()
加4天每天口服(PO)3mg/kg地塞米松，接着停药3天，进行2
个周期，即第0-3天和第7-10天。第7组接受第0天单次IV注射6mg/kg Hu
anti-Her2 Trastuzumab-MC-vc-PAB-MMAE，CNJ 1135加第0-13天每天IP注射
50mg/kg![]()
和4天每天口服(PO)3mg/kg地塞米松，接着停药3天，进
行2个周期，即第0-3天和第7-10天。第8组接受第0天单次IV注射6mg/kg Hu
anti-FcRH5 10A8-MC-vc-PAB-MMAE，CNJ 1672加第0-13天每天IP注射50
mg/kg![]()
和4天每天口服(PO)3mg/kg地塞米松，接着停药3天，进行2
个周期，即第0-3天和第7-10天。第9组接受第0天单次IV注射6mg/kg Hu
anti-FcRH5 10A8-MC-vc-PAB-MMAE，CNJ 1672加第0-13天每天IP注射50
mg/kg![]()
整个实验期间每周两次测量肿瘤。整个实验期间每周两次
测量小鼠体重。如果小鼠经历体重减轻与它们第0天的体重相比大于15％，
那么每天对小鼠称重，直至重量恢复或直至体重减轻达到大于20％。在小鼠
体重减轻与它们第0天的体重相比大于20％时、在肿瘤体积达到3000mm3之
前、或在肿瘤显示出即将溃疡的迹象时，对小鼠处以安乐死。所有动物方案
都得到了实验动物护理和使用委员会(IACUC)的批准。
阴性对照包括基于抗HER2(![]()
)(trastuzumab)的偶联物
(MC-vc-PAB-MMAE)。
B.结果
1.OPM2-FcRH5异种移植物
在与![]()
和![]()
加地塞米松组合的药物偶联物的38天时间
过程中，与阴性对照偶联有MC-vc-PAB-MMAE的人源化抗HER2(Hu
anti-Her2 Trastuzumab-MC-vc-PAB-MMAE)相比，与![]()
和![]()
加地塞米松组合的偶联有MC-vc-PAB-MMAE的人源化抗FcRH5(10A8)(Hu
anti-FcRH5 10A8-MC-vc-PAB-MMAE)在具有OPM2-FcRH5肿瘤的SCID小鼠
中显示出抑制肿瘤生长(图43)。对于所有药物偶联物和对照，ADC在第0
天以单剂施用。![]()
作为每天IP注射50mg/kg![]()
在第0-13天施
用。地塞米松作为每天PO给药地塞米松施用4天，接着停药3天，进行两个周
期，即第0-3天和第7-10天。另外，与服用6mg/kg Hu anti-FcRH5
10A8-MC-vc-PAB-MMAE、50mg/kg![]()
(lenalidomide)、和3mg/kg地
塞米松的单一药剂组相比，与50mg/kg![]()
组合的6mg/kg Hu
anti-FcRH5 10A8-MC-vc-PAB-MMAE和与50mg/kg![]()
加3mg/kg地
塞米松组合的6mg/kg Hu anti-FcRH5 10A8-MC-vc-PAB-MMAE都显著抑制
肿瘤生长(图43)。
另外，在相同研究中，在每个剂量组中测定头17天的百分比体重变化(图
44)。结果指示施用地塞米松和![]()
引起显著体重减轻或重量损失。
再者，在表16中，显示了测试总数中显示部分消退(PR；其中施药后任
何时间的肿瘤体积下降至低于第0天测得的肿瘤体积的50％)、完全消退(CR；
其中施药后任何时间的肿瘤体积下降至0mm3)的小鼠数目(NA＝不适用)；
(TI＝研究结束时可观察肿瘤的数目)。
表16
![]()
![]()
认为前述书面说明足以使本领域技术人员能够实践本发明。本发明并不
限于所保藏构建体的范围，因为所保藏实施方案意图作为本发明某些方面的
单一例示，而且功能上相当的任何构建物都在本发明的范围内。本文中的材
料保藏并非承认本文中所包含的书面说明不足以能够实践本发明的任何方
面，包括其最佳模式，也不能解释为将权利要求的范围限制于它所描述的具
体例示。实际上，根据上面的描述，除了本文所显示和描述的，本发明的多
种修饰对于本领域技术人员是显而易见的，而且在所附权利要求的范围内。
实施例11：FcRH5双特异性抗体的生成和表征
抗CD3/FcRH5双特异性抗体的构建和生成。下文描述了FcRH5双特异性
抗体，具体是抗CD3/FcRH5隆起入空腔双特异性抗体的构建。
先前已经记载了多种隆起入空腔双特异性抗体。参见例如美国专利No.
5,731,168和No.7,183,076；Ridgway et al.，Prot.Eng.9：617-621(1996)；Atwell
et al.，J.Mol.Biol.270：26-35(1997)；Merchant et al.，Nat.Biotechn.16：677-681
(1998)。在某些情况中，改造先前由Chamow et al.，J.Immunol.153：4268(1994)
记载的人源化抗CD3/CD4-IgG嵌合物之间的CH3界面以最大化能自经表达
构建物共转染的哺乳动物细胞系回收的异多聚体百分比。如本文中使用的，
“异多聚体”指至少包含第一多肽和第二多肽的分子，例如双特异性抗体，
其中在氨基酸序列方面所述第二多肽与所述第一多肽相差至少一个氨基酸
残基。
如前一段中引用的文件中记载的，用于驱动异多聚体形成的策略依赖于
将一处或多处“隆起”突变引入第一多肽，例如第一抗体H链的CH3域，而
且还将一处或多处“口腔”突变引入第二多肽，例如第二抗体H链的CH3域。
“隆起”突变用较大氨基酸替换较小氨基酸，而“空腔”突变用较小氨基酸
替换较大氨基酸。另外，在隆起和空腔突变之外，在两条多肽(例如两个CH3
域)的界面处引入含游离硫醇的残基，这显示出增强异多聚体的形成。已经
记载了多种例示性隆起入空腔突变和在多肽界面处引入的含游离硫醇的残
基。参见例如美国专利No.5,731,168和No.7,183,076；Ridgway et al.，Prot.Eng.
9：617-621(1996)；Atwell et al.，J.Mol.Biol.270：26-35(1997)；Merchant et al.，
Nat.Biotechn.16：677-681(1998)。
进行下述步骤来生成抗CD3/FcRH5双特异性抗体。构建编码小鼠抗CD3
单克隆抗体UCHT1(美国专利No.5,821,337和No.6,407,213；Shalaby et al.，J.
Exp.Med.175：217[1992]；Rodrigues et al.，Int.J.Cancer(Suppl.)7：45[1992])
的人源化抗CD3轻(L)和重(H)链变体的大肠杆菌表达质粒。本领域已知许多
合适大肠杆菌表达质粒，包括pAK19(Carter et al.，Bio/Tehcnology 10：163-167
(1992))。例如通过定点诱变在人源化抗CD3H链的CH3域(如上所述)中进
行引入隆起或空腔的突变。本领域公知多种定点诱变方法。参见例如Kunkel
et al.，Methods Enzymol.154：367-382(1987)。另外，构建编码人源化抗FcRH5
轻和重链，诸如本文所述人源化抗FcRH5轻和重链的大肠杆菌表达质粒。例
如通过定点诱变在人源化抗FcRH5 H链的CH3域(如上所述)中进行引入相
应空腔(如果抗CD3 CH3域具有隆起突变的话)或相应隆起(如果抗CD3 CH3
域具有空腔突变的话)的突变。
通过使用本领域公知方法将上文所述大肠杆菌表达质粒转化入适宜大
肠杆菌菌株例如33B6来生成双特异性抗CD3/FcRH5抗体。参见例如
Rodrigues et al.，Cancer Res.55：63-70(1995)。如先前所述由在10L发酵罐中培
养的转化大肠杆菌分泌抗体(Carter et al.，Bio/Technology 10：163-167(1992))。
使用本领域已知规程纯化和分析抗体。参见例如Atwell et al.，J.Mol.Biol.
270：26-35(1997)。
细胞结合测定法：为了评估抗CD3/FcRH5双特异性抗体结合B细胞和T
细胞的能力，依照本领域已知标准规程使用Ficoll梯度自来自健康供体的全
血分离人外周白血球。将约1百万个细胞与抗CD3/FcRH5双特异性抗体一起
在冰上在缓冲液(在PBS中含有0.5％ BSA和2mM EDTA)中温育。然后清洗
细胞，并用FITC偶联的山羊(Fab’)2抗人IgG连同抗CD8-APC和抗CD138-PE和
抗CD38-PerCP-Cy5抗体遵循制造商方案染色(BD Biosciences，San Diego，
CA)。使用FACSCaliburTM流式细胞仪(BD Biosciences，San Diego，CA)用基于
FACS的测定法评估结合活性，并使用Flowjo软件(Tree Star，Ashland，OR)进行
分析。
体外细胞杀伤测定法：EJM-FcRH5.LSP.2多发性骨髓瘤细胞系(EJM细
胞，DSMZ ACC-560，经人FcRH5稳定转染的)用作靶细胞并与总人外周白
血球或CD8+T细胞一起共培养。如果使用CD8+T细胞的话，在96孔圆底板
中使用CD8+T细胞分离试剂盒(Miltenyi Biotech，Auburn，CA)通过负分选自
人PBMC纯化它们。每个孔添加20,000个EJM-FcRH5.LSP.2细胞，靶∶效应细
胞比＝1∶10，有或无抗CD3/FcRH5双特异性抗体。大约19小时后，将细胞用
经标记抗CD38-FITC和抗CD138-PE遵循制造商的方案(BD Biosciences，San
Diego，CA)染色并与![]()
Calibration Grade 6.0 Micron YG微球体
(Polysciences，Inc.，Warrington，PA)混合。通过正向/侧向散射门控和
CD38-CD138染色来进行FACS分析。使用依照标准规程的碘化丙啶染色来排
除死细胞。依照下述方程计算抗CD3/FcRH5双特异性抗体的比杀伤活性：％
比杀伤＝(1-处理下的活EJM-FCRH5.LSP.2细胞数目/无抗CD3/FcRH5双
特异性抗体的效应和EJM-FCRH5.LSP.2下的活EJM-FCRH5.LSP.2细胞数目)
x100。
体内功效：将EJM-FcRH5.LSP.2多发性骨髓瘤细胞与外周血单个核细胞
混合，并皮下注射入雌性NOD.CD17-Prkdcscid/J小鼠(Charles Rivers
Laboratories，Wilmington，MA)的右胸侧。然后将经过接种的小鼠随机分成对
照和处理组。对照组施用媒介或抗CD3/Her2对照双特异性抗体。处理组施用
抗CD3/FcRH5双特异性抗体。双特异性抗体在0.01至10mg/kg的范围里施用。
对照或处理在细胞接种后1-2小时内静脉内施用，并每天重复，连续5天。每
周两次使用测径器以二维(长度和宽度)测量肿瘤。每周两次临床监测小鼠。
实验结束时，将对照处理动物中的肿瘤尺寸与抗CD3/FcRH5双特异性抗体处
理动物中的肿瘤尺寸比较，以评估抗CD3/FcRH5双特异性抗体处理的功效。
实施例12：人源化抗FcRH5药物偶联物的体内肿瘤生长抑制测定法
A.异种移植物
为了测试不同剂量的带有MC-vc-PAB-MMAE的hu10A8药物偶联物
(“hu-Anti-FcRH5(10A8)-MC-vc-PAB-MMAE”)的功效，分析偶联抗体对小鼠
中肿瘤的效果。
具体而言，在经人FcRH5稳定转染的EJM细胞(多发性骨髓瘤细胞系)
中检查了抗体使肿瘤消退的能力。
EJM(ACC-560)细胞是一种商品化的人多发性骨髓瘤细胞系(DSMZ，
Germany)。因为EJM细胞不内源表达FcRH5，所以用人FcRH5稳定转染EJM
细胞，产生EJM.CMV.PD.FcRH5.LSP.2细胞系。
为了分析带有MC-vc-PAB-MMAE的hu10A8药物偶联物的功效，经注射
入CB17 ICR SCID小鼠体侧，给雌性CB17 ICR SCID小鼠(6-8周龄，来自
Charles Rivers Laboratories；Hollister，CA)皮下接种2X107个
EJM2-FcRH5.LSP.2细胞，并容许异种移植物肿瘤生长至平均134mm3。第0
天指肿瘤平均100-250mm3且施用第一剂/或唯一一剂处理那天，除非下文明
确指示。肿瘤体积是基于二维计算的，使用测径器来测量，并依照公式表述
成mm3：V＝0.5aXb2，其中a和b分别是肿瘤的长径和短径。将自每个实验组
收集的数据表述成均值+SE。以单剂静脉内(i.v.)范围为1至8mg ADC/kg，
用抗FcRH5 ADC或对照抗体-药物偶联物(ADC)处理8只一组的小鼠。整个实
验期间每周两次测量肿瘤。2周每周一次测量小鼠体重。在肿瘤体积达到3000
mm3之前或在肿瘤显示出即将溃疡的迹象时，对小鼠处以安乐死。所有动物
方案都得到了实验动物护理和使用委员会(IACUC)的批准。
阴性对照包括基于抗HER2(![]()
)(trastuzumab)的偶联物
(MC-vc-PAB-MMAE)。
B.结果
1.EJM-FcRH5.LSP.2异种移植物
在表17所示药物偶联物和剂量的80天时间过程中，与阴性对照偶联有
MC-vc-PAB-MMAE的人源化抗HER2(“Hu-anti-HER2
(4D5)-MC-vc-PAB-MMAE”)相比，偶联有MC-vc-PAB-MMAE的人源化抗
FcRH5(10A8)(hu10A8)(“hu-anti-FcRH5(10A8)-MC-vc-PAB-MMAE”)在具
有EJM-FcRH5.LSP.2肿瘤的SCID小鼠中显示出抑制肿瘤生长。对于所有ADC
和对照，ADC在第0天以单剂施用。具体而言，所有剂量水平的人源化抗
FcRH5 ADC显著抑制肿瘤生长(图45)。
另外，在相同研究中，在每个剂量组中测定头7天的百分比体重变化。
结果指示施用这些人源化抗FcRH5 ADC在此时间期间没有引起显著体重减
轻或重量损失(图46)。
再者，在表17中，显示了测试总数中显示部分消退(PR；其中施药后任
何时间的肿瘤体积下降至低于第0天测得的肿瘤体积的50％)、完全消退(CR；
其中施药后任何时间的肿瘤体积下降至0mm3)的小鼠数目(NA＝不适用)；
(TI＝研究结束时可观察肿瘤的数目)。
表17
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*媒介＝20mM组氨酸乙酸酯，pH 5.5，240mM蔗糖，0.02％ PS20
实施例13：人源化抗FcRH5药物偶联物的体内肿瘤生长抑制测定法
A.异种移植物
为了测试不同剂量的带有SPDB-DM4的hu10A8药物偶联物
(“hu-Anti-FcRH5(10A8)-SPDB-DM4”)的功效，分析偶联抗体对小鼠中肿瘤
的效果。
具体而言，在经人FcRH稳定转染的EJM细胞(多发性骨髓瘤细胞系)中
检查了抗体使肿瘤消退的能力。
EJM(ACC-560)细胞是一种商品化的人多发性骨髓瘤细胞系(DSMZ，
Germany)。因为EJM细胞不内源表达FcRH5，所以用人FcRH5稳定转染EJM
细胞，产生EJM.CMV.PD.FcRH5.LSP.2细胞系。
为了分析带有SPDB-DM4的hu10A8药物偶联物的功效，经注射入CB17
ICR SCID小鼠体侧，给雌性CB17 ICR SCID小鼠(6-8周龄，来自Charles Rivers
Laboratories；Hollister，CA)皮下接种2X107个EJM2-FcRH5.LSP.2细胞，并容
许异种移植物肿瘤生长至平均134mm3。第0天指肿瘤平均100-250mm3且施
用第一剂/或唯一一剂处理那天，除非下文明确指示。肿瘤体积是基于二维计
算的，使用测径器来测量，并依照公式表述成mm3：V＝0.5aXb2，其中a和b
分别是肿瘤的长径和短径。将自每个实验组收集的数据表述成均值+SE。
以单剂静脉内(i.v.)范围为2至8mg ADC/kg，用抗FcRH5 ADC或对照抗体-药
物偶联物(ADC)处理8只一组的小鼠。整个实验期间每周两次测量肿瘤。2周
每周一次测量小鼠体重。在肿瘤体积达到3000mm3之前或在肿瘤显示出即将
溃疡的迹象时，对小鼠处以安乐死。所有动物方案都得到了实验动物护理和
使用委员会(IACUC)的批准。
阴性对照包括基于抗HER2(![]()
)(trastuzumab)的偶联物
(SPDB-DM4)。
B.结果
1.EJM-FcRH5.LSP.2异种移植物
在表18所示药物偶联物和剂量的24天时间过程中，与阴性对照偶联有
SPDB-DM4的人源化抗HER2(“Hu-anti-HER2(4D5)-SPDB-DM4”)相比，偶联
有SPDB-DM4的人源化抗FcRH5(10A8)(hu10A8)(“hu-anti-FcRH5
(10A8)-SPDB-DM4”)在具有EJM-FcRH5.LSP.2肿瘤的SCID小鼠中显示出抑
制肿瘤生长。对于所有ADC和对照，ADC在第0天以单剂施用。具体而言，
8mg/kg人源化抗FcRH5 ADC显著抑制肿瘤生长(图47)。
另外，在相同研究中，在每个剂量组中测定头7天的百分比体重变化。
结果指示施用这些人源化抗FcRH5 ADC在此时间期间没有引起显著体重减
轻或重量损失(图48)。
再者，在表18中，显示了测试总数中显示部分消退(PR；其中施药后任
何时间的肿瘤体积下降至低于第0天测得的肿瘤体积的50％)、完全消退(CR；
其中施药后任何时间的肿瘤体积下降至0mm3)的小鼠数目(NA＝不适用)；
(TI＝研究结束时可观察肿瘤的数目)。
表18
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*媒介＝20mM组氨酸乙酸酯，pH 5.5，240mM蔗糖，0.02％ PS20
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