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ε- 聚赖氨酸缀合物及其用途
    本发明涉及 ε( 伊普西隆 )- 聚赖氨酸缀合物， 尤其是 ε- 聚赖氨酸与携带羧基的 化合物的缀合物， 以及其制备和在靶向于肾脏中的用途。
     肾脏是重要的器官， 尤其是对于各种物质的转运和排泄以及激素的产生而言。肾 脏的一个功能是排泄代谢的终产物 ( 即所谓的尿返物质 ) 以及通过形成尿而从身体排出毒 素， 尿最终由尿道排出人体。肾脏调节水平衡并因此用于长期的血压调节。其通过控制尿 的组成调节电解质平衡和酸碱平衡。此外， 肾脏是体内中间代谢的重要器官 ( 其影响糖原 异生作用 )。肾脏产生激素， 例如促红细胞生成素用于造血， 并且也是肽激素降解的部位。 然而， 肾脏本身的许多功能同样受激素控制。
     因此肾脏是对生命很重要的器官， 针对其已经开发了许多诊断和治疗方法。 例如， 免疫抑制剂、 细胞生长抑制剂、 免疫治疗剂、 消炎药、 抗生素、 抑制病毒生长剂、 抗高血压药、 排尿酸剂或利尿剂已用于肾脏的治疗或影响肾脏的功能。 这里尤其重要的是药物以尽可能 靶向的方式到达肾脏。
     同样， 肾脏在成像方法中的表现也很重要。
     在已建立的核医学和放射学方法， 例如 SPECT、 PET、 超声和 MRT 的帮助下， 除了形 态学结构以外的酶加工、 代谢过程、 特定基因的表达和分子反应均可通过所谓的分子成像 描述。如果需要的话， 上述提到的显像模式可进一步通过计算机断层摄影和视觉成像方法 补充 ( 近红外成像、 荧光断层摄影 )。目前， “分子成像” 的焦点仍然在于癌症的诊断、 神经 问题和基因治疗的监测， 但在将来会扩展至需要尽早发现细胞变化的所有领域。
     作为成像方法的信号源， “信号分子” 通常与 “载体分子” 偶联。 “载体分子” 保证 了高度特异性的靶向， 其通过例如特异性结合靶细胞或被捕获入其中进行。 例如， 载体分子 可以是受体的配体或酶的底物。 “信号分子” 可以通过一种或多种成像技术可见。信号分子 的实例有， 例如络合剂或螯合剂， 其金属离子可通过成像技术检测。 包含信号分子和载体分 子的化合物或缀合物称为 “诊断试剂” 。下文将详细讨论各种成像技术。
     计算机体层扫描摄影术 (CT)
     在经典的放射照相术中， X 射线的组织特异性衰减在 X 射线胶片上显示。与诸如 脂肪和肌肉的 “软” 组织相反， 诸如骨骼的 “硬组织” 吸收大量的辐射。所使用的 X- 射线造 影剂是含有高原子序数的物质， 例如用于血管造影术的含碘的分子。 随着进一步发展， 放射 照相术提供了切面显像。在 CT 中， 通过传感器 ( 检测器 ) 从不同的方向记录放射图片， 并 经计算机再现为三维照相术。由于 CT 的广泛应用， 该方法被称为 “经典放射学的主力军” 。 然而， 该方法的低灵敏度限制了其作为分子成像方法的用途。
     单光子发射计算体层摄影 (SPECT)
     闪烁照相术使用放射性标记物 ( 放射性示踪剂 ) 的 γ 辐射， 其由短半衰期的放射 性核素发射。它们特异性地蓄积在人体的靶组织中。在 γ 照相机的帮助下， 释放的辐射被 记录并转化为图像。 单光子发射计算体层摄影 (SPECT) 是闪烁照相术的三维变体。 在 SPECT 中， 如 CT 那样从不同的角度记录辐射， 并在计算机中获得三维图像。在静态 SPECT 中， 放射 性示踪剂的浓度在特定的时间点被测定。在动态 SPECT 中， 所述测定在特定的时间间隔重
     复。由此可研究蓄积的变化。
     正电子发射断层摄影 (PET)
     在临床应用中， PET 提供了更加结构性导向的放射诊断学成像方法。正电子发射 断层摄影 (PET) 是现代的功能性成像方法。在发射正电子的原子的帮助下， 其在检测放射 性同位素中能够获得良好的分辨率 ( 现代的 PET 仪器能获得 2-3mm 的分辨率， 即使在整体 68 断层摄影中 )。如果这些放射性同位素， 例如 Ga 被用于标记生物分子， 则可以成像有机体 的单个器官中的生化过程。核医学方法的一个基本优点是高灵敏度， 从而可以仅仅使用少 量的示踪剂 ( 纳克级 )。今天， PET 照相机已整合了 CT 装置 ( 其提供了小于约 1mm 的高局 部分辨率 )。PET/CT 技术近年来引起了诊断学的革命。因此， 在单次呈现中即可获得同一 解剖学结构的 PET 功能显像和 CT 形态学信息。
     肾脏是医学诊断中经常和广泛研究的器官。 这里最常用的研究方法是肾闪烁照相 术。
     肾闪烁照相术
     肾闪烁照相术是允许从静态和动态的角度评价肾功能的核医学研究方法。 这里评 估的是每个肾的供血、 功能和排泄。 它是用于了解薄壁组织瘢痕化的公认方法， 尤其是对儿 童而言， 并且还用于评价区域和分侧的肾功能。 两种形式的肾闪烁照相术之间存在差异 ：
     静态肾闪烁照相术
     在静态肾闪烁照相术中， 功能性肾组织使用放射性核素 99mTc 标记。这里锝以络合 的形式与例如 2， 3- 二巯基丁二酸 (DMSA) 结合。因此静态的肾闪烁照相术主要适用于描述 具有异常 ( 例如萎缩症、 马蹄肾等 ) 或炎症后状态的肾。
     动态肾闪烁照相术
     相反， 动态肾闪烁照相术研究肾功能。 因此， 可针对肾功能及其清除研究肾小球滤 过率、 肾血流量 (RBF) 和肾小管分泌。
     目前使用的放射性药物如下 ： 99m
     · Tc-MAG3 巯基乙酰基三甘氨酸 99m
     · Tc-DMSA 2， 3- 二巯基丁二酸 99m
     · Tc-DTPA 二乙烯三胺五乙酸 123
     · I-OIH 希普兰 ( 邻碘马尿酸 )
     图 3 显示了 MAG3、 DMSA 和 DTPA 的化学结构。
     肾功能闪烁照相术 ( ＝动态肾闪烁照相术 ) 用于以下适应症 ：
     · 用于在肾脏疾病中鉴别分侧的肾功能， 例如肾结石 ( 肾石病 )、 肾脏肿瘤、 营养不 良 ( 不正确定位 ) 的肾脏或发育不良 ( 畸形 ) 的肾脏
     ·用于研究双肾的部分功能
     ·用于研究尿路疾病
     ·用于鉴别膀胱肾的返流 ( 尿道异常 )
     ·如果怀疑为肾血管性高血压
     ·用于在活体肾捐献前检查肾功能
     ·用于手术修复的血管缩窄或梗阻的进程控制
     ·用于评估移植的肾
     ·在怀疑肾损伤 ( 肾创伤 ) 的急诊中
     ·在突发性尿液分泌大量减少 ( 无尿症 ) 的情况下， 排除肾栓塞或急性尿路梗阻
     ·用来确定总清除率
     ·用来检测或排除尿渗漏
     目前， 肾功能闪烁照相术通常通过 SPECT 方式进行， 因为认可的示踪剂 MAG3 和 99m DMSA 仅可用 SPECT 核素 Tc 标记。因此， 目前还不能使用显著改善肾功能诊断的 PET 和 PET/CT。
     如果肾脏靶向改善， 同样有助于治疗目的。今天约有 2.8 亿人患有慢性肾脏疾病。 用于治疗肾脏疾病的药物的应用或剂型经常受到其副作用的限制。如果能开发靶向的药 物， 由此将已知的或新的药物以靶向的方式到达肾脏， 则肾脏疾病的治疗将得到显著改善。
     WO 03/086293 描述了通过与聚赖氨酸或聚精氨酸形成复合物改善药物性质的方 法。这里的复合物由有机盐构成， 即， 聚赖氨酸 / 聚精氨酸和药物之间没有任何共价键， 而 代之以离子键。未公开任何关于该聚赖氨酸缀合物在药物靶向于肾脏中的可能用途。
     Ing-Lung Shih 等， Bioresource Technology 97(2006)1148-1159 披露了 ε- 聚 赖氨酸在药物靶向中的用途。其提出 ε- 聚赖氨酸与活性化合物共价结合。所述的研究的 目的是增加细胞中的吸收率。未针对或解决对特定组织的特异性问题。
     因此本发明的目标是提供用于治疗剂或诊断剂的载体或载体分子， 其对于肾脏具 有最高的可能的亲和性和选择性。
     令人惊讶地， 已发现 ε- 聚赖氨酸或 ε- 聚赖氨酸衍生物与携带羧基的化合物的 缀合物对于肾脏具有非常高的选择性。这表示事实上这些缀合物被肾脏组织排他性地吸 收。这些与信号分子 ( 例如放射性同位素和 / 或活性化合物 ) 偶联的缀合物可用于肾脏的 诊断和 / 或治疗。
     本发明因此涉及缀合物， 其包含至少一种携带羧基的化合物和线性或支链的寡聚 物， 该寡聚物由肽键连接的单体单元组成， 其总体上由 50％以上 ( 基于单体单元数目 ) 的 ε- 赖氨酸单体单元构成， 或包含至少 10 个连续的由至少 70 ％的 ( 基于单体单元数目 ) ε- 赖氨酸单体单元构成的单体单元。优选使用这类携带羧基的化合物 ： 其中羧基在携带 羧基的化合物中的摩尔质量比例大于 30％、 尤其优选大于 40％。
     在优选的实施方案中， 特别是用于治疗应用， 所述缀合物还包括至少一种活性化 合物， 优选是共价结合的。
     在优选的实施方案中， 所述寡聚物链长为 10-50 个单体单元。
     在一个特别优选的实施方案中， 所述寡聚物仅由 ε- 赖氨酸单体单元组成， 尤其 是仅由 ε- 赖氨酸单元组成。
     在一个优选的实施方案中， 至少一种携带羧基的化合物通过 ε- 赖氨酸单体单元 的氨基结合， 即一个或多个 ε- 赖氨酸单体单元在其氨基上携带含有羧基的化合物， 其直 接缀合或通过间隔物缀合。
     在尤其优选用于诊断应用的实施方案中， 携带羧基的化合物是络合剂， 尤其优选 DOTA( ＝ 1， 4， 7， 10- 四氮杂环十二烷 -N， -N′， -N″， -N′″ - 四乙酸 ) 或 DTPA( 二乙烯三 胺五乙酸 )。本发明还涉及用于制备根据本发明的化合物的方法， 其包括至少下列方法步骤 ：
     a) 提供根据本发明的寡聚物， 其至少含有一个反应性基团，
     b) 使至少一个任选活化的携带羧基的化合物与所述步骤 a) 的寡聚物缀合。
     在根据本发明的方法的一个实施方案中， 如果所述缀合物包含络合剂， 则步骤 b) 中获得的化合物在步骤 c) 中进一步与金属盐接触， 这样所述金属离子可通过络合剂进行 络合。
     本发明还涉及作为药物的根据本发明的缀合物， 例如尤其是作为治疗组合物或增 强成像的组合物。
     本发明还涉及药物或药物组合物， 尤其是治疗性或增强成像的组合物， 其至少包 含根据本发明的缀合物。
     本发明还涉及用于制备药物或药物组合物、 尤其是治疗性或增强成像的组合物的 试剂盒， 其至少包含根据本发明的缀合物。 该缀合物能够随后根据应用， 例如与适当的活性 化合物反应， 用于制备治疗性组合物， 或者如果存在络合剂， 则与具有增强成像和 / 或治疗 作用的金属离子反应。
     本发明还涉及根据本发明的缀合物在制备大分子缀合物中的用途， 其中根据本发 明的两个或多个缀合物与大分子结合， 并且大分子缀合物由与大分子共价结合的至少两个 或多个根据本发明的缀合物构成。 本发明还涉及根据本发明的缀合物用来靶向于肾脏中的用途。 这里的靶向于肾脏 优选用于在肾脏富集用于治疗或诊断应用的药物， 即， 使肾脏相对于身体其余部分而言的 吸收增加。
     图 1 显示了在合成实施例 1 中获得的根据本发明的化合物的图解示意图。
     图 2 显示了负载着 111In 的 ε- 聚赖氨酸 -DOTA 的器官分布。其他详细情形在用 途实施例 1 中给出。
     图 3 显示了 MAG3、 DMSA 和 DTPA 的化学结构。
     图 4 显示了对应于实施例 7 的依那普利衍生物。
     在某些诊断方法中， 改善靶器官呈现的物质作为增强成像的组合物或对比剂或增 强成像剂使用， 其通常通过增加与环境的差别或靶器官信号相对于环境的差别而进行。
     根据本发明的携带羧基的化合物是含有至少一个羧基 (-COOH) 和至少一个用于 结合根据本发明缀合物的寡聚物的基团或官能团的化合物。 与寡聚体的结合可以任何已知 的方式发生， 其导致寡聚物和携带羧基的化合物之间的共价结合。可经其发生结合的官能 团的实例有 -NH2、 -SH、 -OH、 -Hal( 例如 -Cl、 -Br、 -I)、 - 炔基、 -NCS、 -NCO、 -SO2Cl、 - 叠氮 化物、 - 碳酸酯、 - 醛、 - 环氧化物、 -COOH、 -COOR， 其中 R 优选为卤素或优选为活化剂， 即， 好 的离去基团， 例如 N- 羟基琥珀酰亚胺、 五氟苯基或对硝基苯基。关于偶联的可能共价类型 的综述参见例如 “Bioconjugate Techniques” ， GregT.Hermanson， Academic Press， 1996， 137-165 页。
     携带羧基的化合物优选含有两个或多个羧基。 适用于本发明的携带羧基的化合物 实例有 ： 柠檬酸、 琥珀酸、 富马酸、 马来酸、 戊二酸、 脂肪酸、 酒石酸、 草酸、 丙二酸、 丁二酸、 戊 二酸、 脂肪酸、 辛二酸、 壬二酸、 癸二酸， 相应的支链的脂肪酸、 马来酸、 富马酸、 环己烷二羧 酸和相应的位置异构体以及类似的脂肪族二元酸 ； 四氢苯二甲酸、 5- 降冰片烯 -2， 3- 二羧
     酸和类似的脂环二元酸 ； 丙烷三羧酸、 乌头酸、 苯均三酸和类似的三元酸 ； 金刚烷四羧酸、 丁烷四羧酸、 环戊烷四羧酸、 四氢呋喃四羧酸和类似的四元酸 ； 糖酸， 尤其是醛糖二酸， 例 如葡糖二酸、 半乳糖二酸 ； 苹果酸、 酒石酸、 柠檬酸和类似的羟基脂肪酸 ； 偏苯三酸、 苯均四 酸、 联苯四羧酸、 二苯酮四羧酸、 二苯砜四羧酸和类似的芳族多元羧酸。
     根据本发明， 携带羧基的化合物还可以是络合剂， 其含有至少一个羧基， 优选两个 或更多个羧基， 以及至少一个与根据本发明的缀合物的寡聚物结合的基团或官能团。其实 例有 NOTA、 TETA、 EDTA， 或优选 DOTA 或 DTPA。在此情况下， 携带羧基的化合物同时满足了络 合剂的功能， 其在诊断应用中是尤其有利的。
     优选的携带羧基的化合物是与寡聚物缀合后含有两个或更多个游离羧基的那些。
     已发现如果携带羧基的化合物的羧基占携带羧基化合物的摩尔质量比例越大的 话， 肾脏的靶向特异性越高。因此优选羧基摩尔质量比例高于 30％、 优选高于 40％的携带 羧基的化合物。
     例如， DOTA 的摩尔质量是 404g/mol。 其四个羧基占了 180g/mol(4xCOOH ＝ 4x45g/ mol)。因此 DOTA 中羧基的摩尔质量比例约为 44％。
     柠檬酸的摩尔质量是 192g/mol。羧基占了 135g/mol(3x45g/mol)。因此柠檬酸中 羧基的摩尔质量比例约为 70％。 因此， 根据本发明， 优选的携带羧基的化合物是那些在与寡聚物缀合后含有 2 个 或更多个游离羧基的化合物， 其中羧基的摩尔质量比例高于 30 ％， 优选高于 40 ％， 例如 DOTA、 DTPA 和柠檬酸。
     间隔物， 通常也称为接头， 在两部分分子间产生共价键， 在本文中例如在本发明的 寡聚物和携带羧基的化合物或活性化合物之间。如果两部分间不是仅通过直接化学键连 接， 而是要产生两部分间的某种分离时， 通常引入间隔物。同样， 间隔物能提供连接分子的 不相互反应的两部分所必需的化学官能团。间隔物与寡聚物、 携带羧基的化合物或活性化 合物的缀合优选通过酰胺或酯键发生。间隔物可以是， 例如脂肪族烃、 聚醚 ( 例如聚乙二 醇 )、 寡肽或具有链结构的类似元件。 间隔物可以是稳定的， 即在生理条件下不能被解离， 或 只能被轻微解离， 或者可以是不稳定的， 即至少在某些特定的生理条件下可以被解离。
     活性化合物、 肽类、 络合剂或其他官能团可以与寡聚物直接结合或通过间隔物结 合。
     可发生直接结合的官能团实例有 -NH2、 -SH、 -OH、 -Hal( 例如 -Cl、 -Br、 -I)、 - 炔、 NCS、 -NCO、 -SO2Cl、 - 叠氮化物、 - 碳酸酯、 - 醛、 环氧化物、 -COOH、 -COOR， 其中 R 在此优选卤 素或优选活化剂， 即， 好的离去基团， 例如 N- 羟基琥珀酰亚胺、 五氟苯基或对硝基苯基。关 于偶联的可能共价类型的综述参见例如 “Bioconjugate Techniques” ， Greg T.Hermanson， Academic Press， 1996， 137-165 页。
     例如， 活性化合物可与本发明的缀合物通过可解离接头结合。该接头随后在特定 条件下体内解离， 例如酶促或化学解离， 释放活性化合物。 适用于该目的的接头含有羧酸酯 和二硫键， 其中前者通过酶促或化学水解， 后者通过二硫化物交换解离， 例如在谷胱甘肽存 在下。
     可解离的间隔物的一个实例是能在特异性内源性或外源性酶帮助下解离的寡 肽。因此， 例如肽序列 DEVD(Asp-Glu-Val-Asp) 在经 Caspase-3 凋亡诱导后解离。因此，
     例如通过该类间隔物结合的活性化合物或携带羧基的化合物可以在一段保留时间后从 肾脏中去除， 或者可检测肾脏相应的功能 ( 特定酶存在或不存在 )。其他例子有肽序列 CPEN ↓ FFWGGGG 或 PENFF， 其可以被基质金属蛋白酶 -13 解离。可解离的间隔物的一个简 单的实施方案是羧酸酯的形成， 其可以被酯酶方便的解离。
     或者， 所述间隔物可含有酸不稳定结构， 例如腙、 亚胺、 腙酸、 缩醛或缩酮 ( 例如参 见 Haag-R， Kratz-F， Angewandte Chemie 1218 页 (2006))。
     根据本发明， 氨基酸是携带至少一个氨基和至少一个羧基的化合物。实例有天然 的蛋白来源或非蛋白来源的氨基酸， 其在有机体内产生或通过合成制备。
     肽是通过连接两个或更多个氨基酸形成的化合物。 这里的单个氨基酸以限定的顺 序连接， 形成链， 通常是非支链的。肽中和较大蛋白中的氨基酸通过酰胺键相互连接。
     根据本发明， 固相是有机、 无机或有机 / 无机复合材料， 其在固相合成中能用作树 脂或支持物。此外， 模具表面， 例如微量滴定板， 或微粒材料， 例如有机或无机纳米颗粒、 金 属颗粒等也被认为是根据本发明的固相。
     根据本发明， 根据德国药品法的活性化合物或活性化合物分子是在药物制备 中用作药用活性成分或在应用于药物制备中变成为药用活性成分的物质 ( 德国药品法 §4(19))。活性化合物通常在有机体内产生特定的效果。根据本发明的活性化合物通常 是药用活性分子或药物， 例如免疫抑制剂， 例如硫唑嘌呤、 麦考酚酸吗乙酯、 环孢素、 他克 莫司、 西罗莫司、 芬戈莫德或雷公藤内酯， 细胞抑制剂， 例如博莱霉素、 更生霉素、 丝裂霉素、 柔红霉素、 多柔比星、 表柔比星、 伊达比星、 米托蒽醌、 去氧氟尿苷、 顺铂、 卡铂、 奥沙利铂、 沙 铂、 喜树碱、 托泊替康、 伊立替康、 安吖啶、 依托泊苷、 替尼泊苷、 环磷酰胺、 曲磷胺、 美法仑、 苯丁酸氮芥、 雌莫司汀、 白消安、 苯丁酸氮芥、 氮芥、 曲奥舒凡、 卡莫司汀、 洛莫司汀、 尼莫司 汀、 甲基苄肼、 链佐星、 达卡巴嗪、 异环磷酰胺、 替莫唑胺、 噻替哌、 长春瑞滨、 长春新碱、 长春 碱、 长春地辛、 紫杉醇、 多西紫杉醇、 甲氨蝶呤、 培美曲塞、 雷替曲塞、 氟尿嘧啶、 卡培他滨、 胞 嘧啶阿拉伯糖苷、 吉西他滨、 硫鸟嘌呤、 喷司他丁、 巯嘌呤、 氟达拉滨、 克拉屈滨、 羟基脲、 米 托坦、 阿扎胞苷、 阿糖胞苷、 奈拉滨、 硼替佐米、 阿那格雷， 尤其是蛋白激酶抑制剂， 例如伊马 替尼、 厄洛替尼、 舒尼替尼、 索拉非尼、 达沙替尼、 拉帕替尼或尼洛替尼， 免疫治疗剂， 例如西 妥昔单抗、 阿仑珠单抗和贝伐单抗， 消炎药， 例如萘普生、 布洛芬、 吲哚美辛、 泼尼松龙、 泼尼 松、 氢化可的松或布地奈德， 抗生素， 尤其是青霉素类， 例如苄基青霉素、 甲氧西林或阿莫西 林， 头孢菌素类， 例如 cefuroxim、 头孢噻肟、 头孢羟氨苄或头孢克肟， β- 内酰胺酶抑制剂， 例如克拉维酸、 舒巴克坦或三唑巴坦， 碳青霉烯类， 例如亚胺培南或美罗培南， 单菌胺类， 例 如氨曲南， 四环素类， 例如四环素、 金霉素、 土霉素、 多西环素、 米诺环素或替吉环素， 大环内 酯类抗生素， 例如红霉素 A， 糖肽类抗生素， 例如万古霉素， 烯二炔类， 例如卡齐霉素， 病毒抑 制剂， 例如阿昔洛韦、 伐昔洛韦、 更昔洛韦、 缬更昔洛韦、 喷昔洛韦、 泛昔洛韦、 溴夫定、 西多 福韦、 磷甲酸、 碘苷或曲金刚胺， 抗高血压药物， 特别是血管紧张素转换酶抑制剂， 例如贝那 普利、 卡托普利、 西拉普利、 依那普利、 福辛普利、 赖诺普利、 培哚普利、 喹那普利、 雷米普利、 群多普利或佐芬普利， 沙坦类， 如氯沙坦、 缬沙坦 (balsartan)、 厄贝沙坦、 坎地沙坦、 依普沙 坦、 奥美沙坦或替米沙坦， 肾素抑制剂， 例如， 阿利吉仑， β- 受体阻滞剂， 例如普萘洛尔、 吲 哚洛尔、 索他洛尔、 波吲洛尔、 阿替洛尔、 比索洛尔、 塞利洛尔、 艾司洛尔、 美托洛尔、 奈必洛 尔、 氧烯洛尔、 卡维地洛或拉贝洛尔， 排尿酸药， 例如丙磺舒或苯溴马隆， 或利尿剂， 如乙酰唑胺、 呋塞米、 托拉塞米、 布美他尼、 吡咯他尼、 阿佐塞米、 依他尼酸、 etozoline、 氢氯噻嗪、 苄噻嗪、 氯噻嗪、 氯噻酮、 吲达帕胺、 美夫西特、 美托拉宗、 氯帕胺、 希帕胺、 氢氟噻嗪、 甲氯噻 嗪、 泊利噻嗪、 阿米洛利、 氨苯蝶啶、 螺内酯、 坎利酮、 依普利酮或螺内酯。
     其他抗肿瘤剂， 例如对增殖细胞有效的试剂也是根据本发明的类似活性化合物。 抗肿瘤剂的例子包括细胞因子， 例如白介素 -2(IL-2)、 肿瘤坏死因子等， 凝集素炎症反应增 强物 ( 选择素类 )， 例如 L- 选择素、 E- 选择素、 P- 选择素等以及类似分子。
     根据本发明， 一种或多种相同或不同的活性化合物分子可结合本发明的缀合物。
     同样， 特别是在大分子的情况下， 例如相对大的活性化合物分子， 例如蛋白质， 两 个或多个， 优选 2、 3、 4、 5、 6、 7、 8、 9 或 10 个本发明的缀合物可能反过来与一个活性化合物 分子结合， 以使得肾脏特异性积聚活性化合物。根据本发明的缀合物和大分子之间通常也 发生共价结合。根据本发明， 大分子不仅包括大的分子， 例如蛋白质， 还包括任何形式的颗 粒 ( 例如纳米颗粒 )、 脂质体或其他系统， 通过这些系统活性化合物可以转运或可以与之结 合。
     除了活性化合物分子或活性分子外， 其他官能团， 例如用于诊断或成像方法的官 能团也可与本发明的缀合物结合。
     同样， 含氟侧链可通过任选的间隔物作为官能团纳入。因此肾脏内的相应分子的 19 积聚可以在 F 核共振成像的帮助下描述。具有统一的共振频率的高对称排列的氟原子在 这里特别有利。为了提高 19F 的信号， 可使用通常用于核自旋断层扫描的造影剂， 例如钆布 醇 如果根据本发明的缀合物包括络合剂， 在位于本发明缀合物上的络合剂帮助下整 合入本领域技术人员已知的钆或锰或其他强的顺磁性金属离子是尤其有利的。 本文中适当 的络合剂例如有 DOTA 和 DTPA.
     此外， 不属于携带羧基的化合物的络合剂也可被缀合， 其同样任选通过间隔物。 实 例有羟基喹啉、 硫脲、 胍、 二硫代氨基甲酸盐、 异羟肟酸、 酰胺肟、 氨基磷酸、 ( 环 ) 聚氨基、 巯 基、 1， 3- 二羰基和冠醚与在某些情况下具有特定活性的金属离子。
     细胞特异性靶向的官能团， 例如抗体、 抗体片段或适体也可以与根据本发明的缀 合物结合。荧光染料或白细胞介素如 IL-2， 也可以被结合。
     根 据 本 发 明， “肽 键 连 接”表 示 两 个 单 体 单 元 间 存 在 -NH-CO- 键， 正如肽类 或 蛋 白 质 中 两 个 氨 基 酸 单 体 单 元 之 间 存 在 的 那 样。 这 表 示 两 个 单 体 单 元 以 此 方 式 连 接， 一 个 单 体 的 -NH 基 团 与 另 一 个 单 体 的 -C ＝ O 基 团 连 接。 因 此 产 生 以 下 结 构 ：
     M-NH-CO-M-NH-CO-M-NH-CO-M， 其中 M 是单体的未参与结合的部分。
     本发明的缀合物由至少两个共价结合的部分组成——携带羧基的化合物和寡聚 物。 在一个优选的实施方案中， 所述缀合物包含寡聚物、 一个或多个携带羧基的化合物和一 个或多个活性化合物分子。 在一个尤其优选的实施方案中， 根据本发明的缀合物包含多个， 例如 2、 3、 4、 5、 6、 7、 8、 9 或 10 个相同或不同的携带羧基的化合物和多个， 例如 2、 3、 4、 5、 6、 7、 8、 9 或 10 个相同或不同的活性化合物分子。
     已发现如果携带羧基的化合物与 10-80％的单体单元共价结合的话， 根据本发明 的缀合物尤其特异性地在肾脏积聚。
     根据本发明， 络合剂是能络合金属离子， 即与金属离子形成金属螯合复合物的任何分子结构。络合剂通常也称为螯合剂。适用于本发明的络合剂实例有 EDTA、 NOTA、 TETA、 亚氨二乙酸、 DOTA 或 DTPA。根据本发明， 尤其优选能结合可在 SPECT、 PET、 CT 或 MRT 测量 中检测到的金属离子的络合剂。优选的络合剂是 DOTA 或 DTPA 或其衍生物。根据本发明， 络合剂可以是已结合金属离子的分子或可以结合金属离子、 但在现阶段未结合的分子。 2+
     本发明中适于结合络合剂的金属离子有， 例如 Fe 、 Fe3+、 Cu2+、 Cr3+、 Gd3+、 Eu3+、 Dy3+、 La3+、 Yb3+ 和 / 或 Mn2+ 或放射性核素的离子， 例如 γ- 发射体、 质子发射体、 俄歇电子发射 51 67 68 111 99m 140 175 153 166 88 90 体、 α 发射体和荧光发射体， 例如 Cr、 Ga、 Ga、 In、 Tc、 La、 Yb、 Sm、 Ho、 Y、 Y、 149 177 47 142 159 212 72 72 97 109 105 101 119 128 197 211 Pm、 Lu、 Sc、 Pr、 Gd、 Bi、 As、 Se、 Ru、 Pd、 Rh、 mRh、 Sb、 Ba、 Hg、 At、 169 203 212 64 67 188 186 198 Eu、 Pb、 Pb、 Cu、 Cu、 Re、 Re、 Au 和 / 或 199Ag。
     适当的金属离子及其各自的用途的例子有 ： 111
     · In 用于 SPECT 68
     · Ga 用于 PET 90
     · Y 用于治疗
     ·Gd， Eu， Mn 用于 MRT
     ·钽、 钨或其他高原子序数元素用于计算机断层扫描 根据本发明， 术语寡聚物被用于由寡聚物构成的缀合物的一部分， 所述寡聚物由 肽键连接的单体单元组成。寡聚物通常由 5-1000 个单体单元组成， 优选 8-100， 尤其优选 10-50 个单体单元。 在一个特别优选的实施方案中， 所述寡聚物由具有 8-100 个单体单元的 ε- 聚赖氨酸组成， 尤其优选 10-50 个单体单元。
     然而， 在其他实施方案中， 高达 50％的 ε- 赖氨酸单体单元可被其他单体单元替 换， 和 / 或高达 50％的 ε- 赖氨酸单体单元可通过引入其他官能团衍生化或修饰。 类似的， 如果由肽键连接的单体单元组成的寡聚物包含至少 10 个连续的由至少 70％ ( 基于单体单 元数目 )、 优选至少 80％的 ε- 赖氨酸单元组成的单体单元， 则寡聚物可包含多个并非是 ε- 赖氨酸单体单元的连续的单体单元。例如， 如果存在其中没有 ε- 赖氨酸单体单元的 10-20 个单体单元的链 ( 例如包括氨基酸 )， 随后例如 10 个单体单元中的 8 个是 ε- 赖氨 酸单体单元， 2 个由其他氨基酸组成， 位于所述寡聚物的一端。
     根据本发明， 术语单体单元被用于与至少一个寡聚物的其他部分经肽键连接的寡 聚物任何部分。这里末端单体单元通常仅与一个其他单体单元经肽键连接。寡聚物中间的 单体单元与两个其他单体单元经肽键连接。 与三个单体单元经肽键连接的单体单元位于分 枝点上。当单体单元位于寡聚物中间时， 单体单元通常一方面提供肽键的 -NH 部分， 另一方 面提供 -CO 部分。
     根据本发明， ε- 赖氨酸单体单元是 ε- 赖氨酸单元、 鸟氨酸单元、 2， 3- 二氨基丙 酸单元或 2， 4- 二氨基丁酸单元。ε- 赖氨酸单体单元优选由 ε- 赖氨酸单元组成。术语单 元在这里各自表示其是位于经肽键连接的寡聚物中的单元或单体， 而不是游离氨基酸。
     ε- 赖氨酸单元具有以下化学结构 ：
     根据本发明， 寡聚物中的 ε- 赖氨酸单体单元可以是 D 或 L 型。
     通常， 根据本发明的寡聚物中的其他单体单元可包括除 ε- 赖氨酸单体单元外的 天然或合成氨基酸， 例如尤其是丙氨酸、 β- 丙氨酸、 甘氨酸、 谷氨酸、 天冬氨酸或精氨酸。
     其他典型的单体单元是具有间隔物功能的单体单元， 如下式所示 ：
     -NH-SP-COI
     其中 SP 可以是 C1-C20 亚烷基、 亚链烯基或亚炔基， 其中一个或多个非相邻的亚 甲基可被 -O-、 -S-、 -S(O)-、 -SO2-、 -SO2O-、 -C(O)-、 -C(O)O-、 -CH2-、 -CHR’ -、 -CR’ -CR’ 2-、 + ＝ CH-、 -CH-CR’ -、 -CH ＝ CH-、 -CR’ ＝ CR’ -、 -C ≡ C-、 -N R’ -P(O)R’ O-、 -C(O) 2-、 NR’ -、 -SO2NR’ -、 -OP(O)R’ O-、 -P(O)(NR’ -、 -PR’ - 替换， 其中 R’ 2)NR’ 2 ＝ N- 或 -P(O)R’ ＝ C1- 至 C6- 烷基、 C3- 至 C7- 环烷基、 未取代或取代的苯基。
     SP 优选代表线性的 C3 至 C10- 烷基链、 具有一个或多个亚烷基的线性的 C3-C10 链、 具有 2-10 个乙二醇单元的乙二醇链或寡肽链。
     其他典型的单体单元是那些含有用于连接间隔物、 活性化合物、 络合剂、 肽类、 染 料、 增溶剂、 保护基团、 固相或类似成分的官能团的单元， 或者诸如活性化合物、 络合剂、 肽 类、 增溶剂、 保护基团、 固相或染料的成分已经与之直接或通过间隔物结合的单元。该类型 的单体单元优选具有至少一个下述官能团 ： -NH2、 -SH、 -OH、 -Hal( 例如 -Cl、 -Br、 -I)、 -炔 基、 -NCS、 -NCO、 -SO2Cl、 - 叠氮化物、 - 碳酸酯、 - 醛、 - 环氧化物、 -COOH、 -COOR， 其中 R 在此 优选为卤素或优选为活化剂， 即， 好的离去基团， 例如 N- 羟基琥珀酰亚胺、 五氟苯基或对硝 基苯基， 或与活性化合物、 络合剂、 肽类、 染料或类似成分通过该类型的官能团连接。
     此外， 根据本发明的寡聚物可包含衍生化的 ε- 赖氨酸单体单元。它们是其中其 他官能团 (F1/F2) 相应结合 NH 基团和 / 或氨基的单体单元。这里 F1 和 F2 可以各自独立 的是乙酰基或是活性化合物、 络合剂、 肽类、 染料、 增溶剂、 保护基团、 固相或类似的直接或 通过间隔物结合的成分。相应的使用基团 F1 和 / 或 F2 而衍生的 ε- 赖氨酸单元如式 II 所示。
     本领域技术人员显而易见， 上述结构式描述的是位于寡聚物链中间的单体单元， 而末端单体单元根据其位于 C 或 N 末端的不同， 将携带 COOH 或 COOR 基团代替 CO， 或携带 NF1H、 NF1R、 NHR 或 NR2 代替 -NH- 或 -NF1-， 其中 R 通常是 H、 线性或支链的 C1-C6 烷基、 NH2、 用于结合活性化合物、 络合剂、 肽类、 染料、 增溶剂、 保护基团、 固相或类似成分的间隔物， 或 直接或通过间隔物结合的活性化合物、 络合剂、 肽类、 染料、 增溶剂、 保护基团、 固相或类似
     成分。 因此， 根据本发明， ε- 聚赖氨酸衍生物是寡聚物， 其并非完全由 ε- 赖氨酸单元 构成， 而是还存在其他 ε- 赖氨酸单体单元， 例如鸟氨酸单元， 和 / 或根据本发明的说明， 一 些单体单元由除 ε- 赖氨酸、 鸟氨酸、 2， 3- 二氨基丙酸或 2， 4- 二氨基丁酸以外的氨基酸和 / 或式 I 的化合物构成。
     本发明基于下列令人惊讶的效果， 即 ε- 聚赖氨酸和 ε- 聚赖氨酸衍生物与携带 羧基的化合物的缀合物在肾脏中特异性积聚， 例如在注射入血流或皮下注射后。 因此， 根据 本发明的缀合物适用于肾脏的治疗方法、 用于表征肾脏和靶向于肾脏的成像方法中。
     根据本发明的化合物优选从 ε- 聚赖氨酸通过缀合相应的携带羧基的化合物以 及优选一种或多种活性化合物分子或其他官能团进行制备 ( 任选在进行相应的活化后 )。
     ε- 聚 赖 氨 酸 是 氨 基 酸 L- 赖 氨 酸 的 均 聚 物。ε- 聚 赖 氨 酸 是 由 小 白 链 霉 菌 (Streptomyces albulus) 通过需氧过程生产的。该天然生产的 ε- 聚赖氨酸包括大约 30 个 L- 赖氨酸单元。ε- 聚赖氨酸在日本已批准作为食品的抗菌防腐剂。与 α- 聚赖氨酸相 反， ε- 聚赖氨酸不能被蛋白酶酶解。
     根据本发明可使用任何类型的 ε- 聚赖氨酸， 例如， 天然产生的、 基因工程或合成 生产的 ε- 聚赖氨酸。ε- 聚赖氨酸的化学合成按照常规肽合成的方法使用相应保护的 L 赖氨酸进行， 使得肽结合在侧链的 ε- 氨基上进行。
     为制备本发明的化合物， 可使用具有特定侧链长度的 ε- 聚赖氨酸 ( 例如合成的 ε- 聚赖氨酸或纯化的天然 ε- 聚赖氨酸 ) 或不同链长的 ε- 聚赖氨酸的混合物， 其例如从 小白链霉菌天然获得。 根据本发明， 具有一定链长的 ε- 聚赖氨酸和不同链长的 ε- 聚赖氨 酸的混合物或者包含不同 ε- 聚赖氨酸衍生物的混合物均落于术语 ε- 聚赖氨酸和 ε- 聚 赖氨酸衍生物的范围之内。
     进一步发现， 不仅 ε- 聚赖氨酸的缀合物， 而且 ε- 聚赖氨酸衍生物的缀合物在肾 脏中具有很好的积聚。
     适用于本发明的典型的缀合物也可以用式 III 表示 ：
     A-(Lys)n-E III
     其中
     n 是介于 5-1000 的数目，
     A是
     - 一个或多个带电或不带电的末端基团， 其直接或通过间隔物或分枝状的官能团 结合， 例如氢、 -CN、 -OR’ 、 -NR’ -P(O)R’ -P(O)(OR’ )2、 -P(O)(NR’ -C(O)R’ 、 -C(O) 2、 2、 2)2、 OR’ 、 -C(O)OH、 -C(O)NR’ -SO2NR’ -C(O)Hal、 SO2OH、 -SO2Hal、 -NO2、 -Hal 或 2、 2、
     - 一个或多个直接或通过间隔物或分枝状的官能团结合的基团， 例如携带羧基的 化合物、 活性化合物分子、 络合剂、 染料、 一种或多种相同或不同的氨基酸、 肽类、 蛋白质、 增 溶剂、 保护基团或固相。
     E是
     - 一个或多个带电或不带电的末端基团， 其直接或通过间隔物或分枝状的官能团 结合， 例如氢、 -CN、 -OR’ 、 -NH2、 NHR’ 、 -NR’ -P(O)R’ -P(O)(OR’ )2、 -P(O)(NR’ -C(O) 2、 2、 2)2、 R’ 、 -C(O)OR’ 、 -C(O)OH、 -C(O)NR’ -SO2NR’ -C(O)Hal、 SO2OH、 -SO2Hal、 -NO2、 -Hal 或者 2、 2、
     - 一个或多个直接或通过间隔物或分枝状的官能团结合的基团， 例如携带羧基的 化合物、 活性化合物分子、 络合剂、 染料、 一种或多种相同或不同的氨基酸、 肽类、 蛋白质、 增 溶剂、 保护基团或固相，
     Lys 各自独立地是
     - 相应于已给出的定义的 ε- 赖氨酸单体单元
     - 符合式 I 或 II 的单体单元
     - 符合式 IV 的基团
     (NH-M-CO) IV
     其中 M 可以各自独立的表示 ：
     -、 -O-、 -S-、 -S(O)-、 -SO2-、 -SO2O-、 -C(O)-、 -C(O)O-、 -CH2-、 -CHR’ -、 -CR’ -CR’ 2-、 + ＝ CH-、 -CH-CR’ -、 -CH ＝ CH-、 -CR’ ＝ CR’ -、 -C ≡ C-、 -N R’ -P(O)R’ O-、 -C(O) 2-、 NR’ -、 -SO2NR’ -、 -OP(O)R’ O-、 -P(O)(NR’ -、 -PR’ -或 2)NR’ 2 ＝ N- 或 -P(O)R’
     - 具有 1-20 个碳原子的直链或支链的烷基，
     - 具有 2-20 个碳原子和一个或多个双键的直链或支链的链烯基，
     - 具有 2-20 个碳原子和一个或多个叁键的直链或支链的炔基，
     - 饱和的、 部分或完全不饱和的具有 3-7 个碳原子的环烷基， 其可以被具有 1-6 个 碳原子的烷基取代，
     其中一个或多个非相邻的亚甲基可以被 -O- 或 -S- 替换， 并且相邻的亚甲基可以 被链烯基或炔基替换，
     其中一个或多个亚甲基可以各自独立地被下列基团替换 ： -O-、 -S-、 -S(O)-、 -SO2、 -SO2O-、 -C(O)-、 -C(O)O-、 -CH2-、 -CHR’ -、 -CR’ -CR’ ＝ CH-、 -CH-CR’ -、 -CH ＝ CH-、 -CR’ 2-、 + ＝ CR’ -、 -C ≡ C-、 -N R’ -P(O)R’ O-、 -C(O)NR’ -、 -SO2NR’ -、 -OP(O)R’ O-、 -P(O)(NR’ 2-、 2) NR’ -、 -PR’ 2 ＝ N- 或 -P(O)R’
     并且 M 中存在的一个或多个亚甲基可以各自独立地被 R” 单或双取代， 其中
     R’ 是线性或支链的 C1- 至 C8- 烷基、 C3- 至 C7- 环烷基、 未被取代或被取代的苯基， 以及
     R” 是线性或支链的 C1- 至 C8- 烷基、 C3- 至 C7- 环烷基、 未被取代或被取代的苯基，
     或 -CN、 -OR’ 、 -NH2、 NHR’ 、 -NR’ -P(O)R’ -P(O)(OR’ )2、 -P(O)(NR’ -C(O) 2、 2、 2)2、 R’ 、 -C(O)OR’ 、 -C(O)OH、 -C(O)NR’ -SO2NR’ -C(O)Hal、 SO2OH、 -SO2Hal、 -NO2、 -Hal， 以及 2、 2、
     Hal ＝ -F、 -Cl、 -Br 或 -I，
     其中携带羧基的化合物、 活性化合物、 络合剂、 肽类、 增溶剂、 保护基团、 固相、 染料 或类似成分可以各自独立地直接或通过间隔物与所有单体单元 Lys 的适于缀合的官能团 结合 ( 例如 NH、 NH2、 COOH、 OH、 -SH、 -Hal( 例如 -Cl、 -Br、 -I)、 - 炔、 - 叠氮化物、 - 醛 )， 条 件是根据本发明的化合物含有至少一种携带羧基的化合物， 并且 50％以上单体单元 ( 基于 单体单元数目 ) 是 ε- 赖氨酸单体单元， 或至少 70％ ( 基于单体单元数目 ) 的至少 10 个连 续单体单元是 ε- 赖氨酸单体单元。
     在根据本发明的化合物的一个优选的实施方案中， A是
     -C(O)OR’ 、 -C(O)OH、 -C(O)NR’ 或者 2 或 -C(O)Hal，
     一种或多种直接或通过间隔物或分枝状的官能团结合的成分， 例如携带羧基的化合物、 活性化合物、 络合剂、 肽类、 增溶剂、 保护基团、 固相或染料。
     A 尤其优选 -OH、 -OCH3、 -OCH2CH3
     或者一种或多种直接或通过间隔物或分枝状的官能团结合的活性化合物分子。
     在一个优选的实施方案中， E是
     -H、 -CH3、 -CH2CH3 或
     或者
     一种或多种直接或通过间隔物或分枝状的官能团结合的成分， 例如携带羧基的化 合物、 活性化合物、 络合剂、 肽类、 增溶剂、 保护基团、 固相或染料。
     E 尤其优选是
     一种或多种直接或通过间隔物或分枝状的官能团结合的活性化合物分子。
     如果根据本发明的化合物含有一个或多个含有 NH2 或 COOH 基团的 Lys， 其他单体 单元可通过它们经肽键结合， 形成单分枝或多分枝的化合物。根据本发明的化合物优选是 非分枝的。
     n 优选是 8-100 的数字， 尤其优选 10-50。
     根据本发明的缀合物优选包含不仅一个， 而是多个携带羧基的化合物。它们可直 接结合或通过间隔物结合到寡聚物的羧基和 / 或氨基末端和 / 或适于缀合的单体单元的官 能团 ( 例如 NH、 -NH2、 -COOH、 -OH、 -SH、 -Hal( 例如 -Cl、 -Br、 -I)、 - 炔、 - 叠氮化物、 -醛) 上。
     在一个优选的实施方案中， 携带羧基的化合物的结合通过单体单元的氨基进行， 例如 ε- 赖氨酸的游离氨基。
     根据本发明的缀合物应当优选含有每 10 个单体单元至少一个携带羧基的化合 物， 尤其优选每 10 个单体单元含有 3-6 个携带羧基的化合物。然而， 同样一个携带羧基的 化合物可以结合超过 9 个单体单元或全部 10 个单体单元。每 10 个单体单元对应的携带羧 基的化合物的最佳数目依赖于携带羧基的化合物的类型， 以及单体单元的类型。上述提到 的每个单体单元对应的携带羧基的化合物的优选数目尤其可用于完全由 ε- 赖氨酸单体 单元建立的寡聚物。携带羧基的化合物在根据本发明的缀合物中的分布可以是随机的， 表 示例如第一单体单元含有 -NH2， 随后是具有携带羧基的化合物的单体单元， 随后是另一个 含有 -NH2 的单体单元， 随后两次具有携带羧基的化合物的单体单元， 再两次含有 -NH2 的单 体单元， 等等。
     同样， 络合剂在根据本发明的化合物中的分布可以是这样的顺序， 例如每个第二 单体单元具有与之结合的携带羧基的化合物。排序可以这样进行， 本发明缀合物一端的所 有单体单元具有已缀合的携带羧基的化合物， 而其余的单体含有游离的 NH2 官能团。
     携带羧基的化合物优选在本发明的缀合物中随机分布。
     本发明的缀合物能够尤其通过肽合成领域的技术人员已知的各种方法制备。
     1. 从 ε- 聚赖氨酸开始合成
     在此方面， 均一或不同链长的合成或天然 ε- 聚赖氨酸通常与相应的携带羧基的 化合物在溶液中反应。为此， 例如首先活化携带羧基的化合物。这可以通过例如通过将一 个或多个其羧基转化为活性酯或酰氯进行活化。随后与 ε- 聚赖氨酸反应， 其中缀合优选 在游离氨基上发生。 或者， 例如携带羧基的化合物的一个或多个羧基可使用偶联剂活化， 例如二环己基碳二亚胺或 HATU， 随后与 ε- 聚赖氨酸反应， 其中缀合优选在游离氨基上发生。 该类反应的反应条件是本领域技术人员已知的。合适的溶剂例如有水、 乙腈、 DMSO、 DMF、 二 烷、 THF、 甲醇或两种或多种所述溶剂的混合物。 2. 固相合成
     特别的， 如果该缀合物包含一种或多种单体单元， 所述单体单元并非由 ε- 赖氨 酸组成或由衍生化的 ε- 赖氨酸单体单元组成， 使用固相合成制备本发明的缀合物可能 是有利的。该固相合成以相应于常规肽合成的方式进行 ( 例如 Fmoc 肽合成或 Boc 肽合 成 )。 这类固相合成是本领域技术人员已知的。 用于肽合成的适当的教科书有 Solid Phase Peptide Synthesis ： 289(Methods in Enzymology)， Sidney P.Colowick( 作者 )， Gregg B.Fields( 出版商 )， Melvin I.Simon( 出版商 )Academic Press Inc(1997 年 11 月 ) 或 Fmoc Solid Phase Peptide Synthesis ： A Practical Approach， W.Chan( 作者 )， W.C.Chan( 出 版商 )， Peter D.White( 出版商 )″ Oxford Univ Pr(2000 年 3 月 2 日 )。其各自选择单体 形成相应于本发明的寡聚物或缀合物。依赖于单体单元的类型， 合成可直接使用衍生的单 体单元， 或最初在意图衍生化的位点保护的单体单元。 当寡聚物合成完成后， 携带羧基的化 合物、 活性化合物等的最终衍生化可随后在固相上或从固相解离后在溶液中进行。
     在此情况下， 携带羧基的化合物的优选和已完成的寡聚物结合， 即当寡聚物固相 合成完成后依然在固相上结合， 或解离后在溶液中结合。
     如果携带羧基的化合物或活性化合物或类似成分 ( 该过程在下文以络合剂为例 描述 ) 需要结合到例如寡聚物的 N 末端， 寡聚物通常用氨基末端保护基团， 例如 Fmoc 产生。 如果络合剂能够经受用于将寡聚物从合成树脂上解离下来以及去保护侧链的条件， Fmoc 可 从整个树脂结合的多肽的 N 末端解离下来， 使得络合剂结合游离的 N 末端氨基。在此情况 下， 络合剂通常由用于产生能有效与寡聚物氨基形成酰胺或氨基甲酸酯键活性酯或活性碳 酸酯基团的领域的公知方法活化。当然也可以使用不同的连接化学。
     此处为帮助最小化副反应， 可使用常规保护基团阻断胍基和脒基， 例如苄氧羰基 (CBZ)、 二 -t-BOC、 PMC、 Pbf、 N-NO2 等。
     偶联反应通过已知的偶联方法在溶剂中进行， 例如 N， N- 二甲基甲酰胺 (DMF)、 N- 甲基吡咯烷酮、 二氯甲烷和 / 或水。示范性的偶联剂包括 O- 苯并三唑基氧基四甲基脲
     六氟磷酸盐 (HATU)、 二环己基碳二亚胺、 溴 - 三 ( 吡咯烷子基 ) 溴化(PyBroP) 等。其他试剂诸如 N， N- 二甲基氨基吡啶 (DMAP)、 4- 吡咯烷子基吡啶、 N- 羟基琥珀酰亚胺或 N- 羟 基苯并三唑也可以存在。
     相应的， 携带羧基的化合物、 活性化合物、 络合剂或类似成分的结合也可在非末端 ε- 赖氨酸单体单元的氨基上发生。
     如果分子含有络合剂， 金属离子可通过已知的方法络合。
     本发明还涉及根据本发明的缀合物在制备药物组合物或药剂， 尤其是治疗性组合 物， 和 / 或增强成像的组合物 ( 例如造影剂 ) 和 / 或核医学成像中放射标记的示踪剂中的 用途。
     本发明还涉及根据本发明的缀合物 ( 其中一种或多种活性化合物优选与之共价 结合 )， 和 / 或其可药用盐和立体异构体 ( 包括其所有比例的混合物 )， 以及任选的赋形剂 和 / 或佐剂，- 作为药剂
     - 用作药剂
     - 作为药剂中的活性化合物或活性成分
     - 作为诊断试剂
     - 用作诊断试剂
     - 用于肾脏靶向
     - 以及尤其作为治疗肾脏疾病的药剂。
     治疗性组合物通常至少包含活性化合物 ( 此时本发明的缀合物与活性化合物优 选共价结合 ) 以及一种或多种允许应用所述治疗性组合物的适当的溶剂和 / 或赋形剂。
     诊断组合物或诊断试剂用作诊断方法中的增强成像或成像的组合物。 诊断试剂通 常至少包含信号源， 即成像和 / 或增强成像成分 ( 此处即本发明的缀合物， 其中在此情况下 缀合物中的至少一种携带羧基的化合物优选是络合剂 ) 以及一种或多种允许应用该诊断 组合物的适当溶剂和 / 或赋形剂。
     在诊断应用中， 本发明的缀合物优选用作增强成像对比介质中的信号源， 使得后 者能通过核医学和 / 或放射性方法检测， 例如 SPECT、 PET、 超声， 和 / 或还可以通过核磁共 振断层扫描、 计算机断层扫描术和光学成像方法 ( 近红外成像 ) 检测。增强成像对比介质 的检测方法和应用是本领域技术人员已知的。 适当应用的例子有癌症、 神经性问题的诊断， 检查对治疗的响应， 检查肾脏的损伤程度 ( 例如在自身免疫疾病情况下 )， 以及监测基因治 疗， 识别细胞变化。 本发明进一步涉及药剂或药物组合物， 其包含至少一种根据本发明的缀合物和 / 或其可药用的盐和立体异构体 ( 包括其所有比例的混合物 )， 以及任选的赋形剂和 / 或佐 剂。
     药物组合物或药剂可进行调节， 用于通过任何需要的合适方法进行施用， 例如通 过口服 ( 包括含服或舌下 )、 直肠、 经鼻、 局部 ( 包括含服、 舌下或经皮 )、 阴道或肠胃外 ( 包 括皮下、 肌内、 静脉内或真皮内 ) 方法。所述制剂可以使用药物领域所有已知的方法制备， 例如将活性成分和赋形剂或佐剂混合。
     用于口服给药的药物制剂可作为分离的单元施用， 例如胶囊或片剂 ； 粉末或颗粒 ； 水性或非水性液体中的溶液或混悬液 ； 可食用泡沫或泡沫食物 ； 或水包油乳液或油包水乳 液。
     因此， 例如在以片剂或胶囊形式口服施用时， 活性成分可以与口服无毒的可药用 惰性赋形剂结合， 例如乙醇、 甘油、 水等。 通过将化合物粉碎至适当的细微尺寸制备粉末， 将 其与以类似的方式粉碎的可药用赋形剂混合， 例如可食用的碳水化合物， 例如淀粉或甘露 醇。矫味剂、 防腐剂、 分散剂和染料也可以存在。
     通过上述的方法制备粉末混合物， 填充至成形的明胶外壳中制备胶囊。助流剂和 润滑剂， 例如高度分散的硅酸、 滑石、 硬脂酸镁、 硬脂酸钙或固态聚乙二醇均可在填充前加 入到粉末混合物中。崩解剂或增溶剂， 例如琼脂 - 琼脂、 碳酸钙或碳酸钠也可加入以改善胶 囊服用后药物的利用度。
     此外， 如果需要或必要， 还可以在混合物中加入适当的粘合剂、 润滑剂和崩解剂以 及染料。适当的粘合剂包括淀粉、 明胶、 天然糖类， 例如葡萄糖或 β- 乳糖、 从玉蜀黍制备的
     甜味剂、 天然和合成的橡胶， 例如阿拉伯胶、 黄蓍胶或海藻酸钠、 羧甲基纤维素、 聚乙二醇、 蜡类等等。用于这些剂型中的润滑剂包括油酸钠、 硬脂酸钠、 硬脂酸镁、 苯甲酸钠、 醋酸钠、 氯化钠等等。崩解剂包括但不限于淀粉、 甲基纤维素、 琼脂、 皂粘土、 黄原胶等等。片剂通过 例如下列方式制备 ： 制备粉末混合物， 将混合物制粒或干压缩， 加入润滑剂和崩解剂， 将整 个混合物压成片剂。通过与如前所述的稀释剂或基质， 任选粘合剂 ( 例如羧甲基纤维素、 海 藻酸盐、 明胶或聚乙烯吡咯烷酮 )、 溶出延缓剂 ( 例如石蜡 )、 吸收加速剂 ( 例如季铵盐 ) 和 / 或吸附剂 ( 例如皂粘土、 白陶土或磷酸二钙 ) 混合以适当方式粉碎的化合物制备粉末混合 物。所述粉末混合物可通过用粘合剂 ( 例如糖浆、 淀粉糊、 阿拉伯胶水 ) 或纤维素溶液或聚 合物材料湿润， 然后通过筛子压制进行制粒。或者， 粉末混合物可放入制片机， 获得不均匀 形状的团块， 随后粉碎形成颗粒。这些颗粒可通过加入硬脂酸、 硬脂酸盐、 滑石或矿物油进 一步润滑以防止粘附在片剂铸型上。润滑的混合物随后压制成片剂。根据本发明的化合物 也可与自由流动的惰性赋形剂混合， 无需制粒或干压缩步骤直接压制成片剂。可以存在透 明或不透明的保护层， 其由虫胶密封层、 糖或聚合物层以及蜡光涂层组成。 这些包衣可加入 染料以区分不同的剂量单位。
     口服液体， 例如溶液、 糖浆和酏剂可以剂量单位的形式制备， 使得给定的量包含预 定量的化合物。糖浆可通过将化合物溶于适当风味的水溶液中制备， 而酏剂可使用无毒醇 载体制备。混悬液可通过将化合物分散在无毒载体中配制。增溶剂和乳化剂 ( 例如乙氧基 化的异硬脂醇和聚氧乙烯山梨醇醚 )、 防腐剂、 风味添加剂 ( 例如薄荷油或天然甜味剂或糖 精或其他人工甜味剂 ) 等等也可被加入。
     如果需要， 用于口服施用的剂量单位制剂可包裹在微胶囊中。该制剂还可以以这 样的方式制备， 使得释放延长或延迟， 例如通过将微粒物质包衣或包埋在聚合物、 蜡等之 中。
     根据本发明的缀合物也可以以脂质体递送系统的形式施用， 例如小单室脂质体、 大单室脂质体和多室脂质体。 脂质体可从多种磷脂形成， 例如胆固醇、 硬脂酰胺或磷脂酰胆 碱类。
     根据本发明的缀合物也可使用与之偶联的单克隆抗体作为载体递送。 缀合物也可 与作为靶向药物载体的可溶性聚合物偶联。这些聚合物可包括聚乙烯吡咯烷酮、 吡喃共聚 物、 聚羟丙基甲基丙烯酰氨基苯酚、 聚羟乙基天冬酰胺基苯酚或被棕榈酰基所取代的聚氧 化乙烯聚赖氨酸。化合物还可与生物可降解的聚合物类偶联， 其适合于获得药物的可控释 放， 例如聚乳酸、 聚 -ε- 己内酯、 聚羟基丁酸、 聚原酸酯类、 缩醛树脂、 聚二羟基吡喃、 聚腈 基丙烯酸酯和交联的或两亲的水凝胶嵌段共聚物。
     适合透皮给药的药物制剂可作为独立的硬膏剂施用， 用于和受者表皮延长的密 切接触。因此， 例如活性成分可通过离子电渗疗法从硬膏剂进行递送， 如 Pharmaceutical Research， 3(6)， 318(1986) 中的一般性术语所述。
     用于局部施用的药物化合物可制成软膏、 乳膏、 混悬液、 洗剂、 粉末、 溶液、 糊剂、 凝 胶、 喷雾剂、 气溶胶或油类。
     用于直肠施用的药物制剂可以栓剂或灌肠剂的形式施用。
     用于经鼻施用的药物制剂 ( 其中载体物质是包含粗粉的固体， 颗粒尺寸为， 例如 范围 20-500 微米 ) 可以以嗅剂的方式施用， 即通过鼻道从近鼻处含有粉末的容器中快速吸入。适当的作为鼻喷雾或鼻滴剂施用的制剂以液体作为载体物质， 在水中或油中包含活性 成分。
     用于通过吸入施用的药物制剂包括细微颗粒粉剂或雾剂， 其可通过各种类型的使 用气溶胶的加压分散器、 喷雾器或吸入器产生。
     用于胃肠外施用的药物制剂包括水性和非水性无菌注射溶液， 其包含抗氧化剂、 缓冲液、 抑菌剂和溶质， 以此使制剂与受者血液保持等渗 ； 以及水性和非水性无菌混悬液， 其包含混悬介质和增稠剂。 制剂可以在单剂或多剂容器中施用， 例如密封的安瓿和玻璃瓶， 在冻干状态下存储， 需要在即将使用前加入无菌载体液体， 例如注射用水。 根据配方制备的 注射溶液和混悬液可从无菌粉末、 颗粒和片剂制备。
     根据本发明的缀合物优选通过胃肠外施用。
     无需多言， 除上述特别提到的组分外， 所述制剂还可根据特定的剂型包括其他本 领域中常用的试剂 ； 因此， 例如适于口服的制剂可包括矫味剂。
     根据本发明的缀合物的治疗有效量依赖于多方面的因素， 包括偶联的活性化合物 类型、 患者年龄和体重、 需要治疗的具体病症及其严重程度、 制剂的性质和施用的方法。
     本发明还涉及用于制备药物组合物、 尤其是增强成像或治疗组合物的试剂盒， 其 至少包含根据本发明的缀合物。如果该缀合物含有络合剂， 其优选仍未与任何具有增强成 像或治疗作用的金属离子络合。 根据本发明的缀合物在试剂盒中可以是溶解在溶剂中的形 式 ( 例如缓冲水溶液 ) 或优选是冻干物的形式。
     由于可被本发明的缀合物的络合剂络合的金属离子在很多应用中具有放射性， 包 含缀合物的药物组合物不能按需要过早制备。 此外， 由于其放射性， 制备过程中必需遵循某 些关于职业安全性的操作。 为此， 优选提供包括根据本发明的缀合物的试剂盒， 其中络合剂 尚未与最终应用所需要的金属离子络合。
     已发现， 根据本发明的缀合物在应用后短时间内在肾脏中特异性地， 即排他性或 实际上排他性地积聚。当根据本发明的缀合物进行优选的静脉内施用时， 仅 5 分钟后就观 察到在肾脏的积聚。1 小时后， 30％以上， 优选 50％以上， 尤其优选 70％以上， 更优选 80％ 以上的注射剂量聚集于肾脏 (％数据基于放射活性的测定 )。
     在关于根据本发明的放射标记的缀合物的器官分布研究中 ( 例如 PET 测量或非侵 袭性成像 )， 根据本发明的缀合物在应用后 1 小时通常具有相对于身体其他部分 ( 血液、 心 脏、 肺、 脾、 肝、 肌肉、 脑 ) 至少 2 倍、 优选至少 5 倍、 尤其优选至少 10 倍的肾脏富集。这说明 直接与放射标记化合物的量直接相关的信号强度在肾脏中至少是从血液、 心脏、 肺、 脾、 肝、 肌肉和脑部得到的信号总和的 2 倍。
     根据本发明的缀合物因此非常适合用于诊断应用， 例如肾闪烁照相术、 肾 PET 和 肾 MRT， 肾脏总体的功能性试验， 治疗和诊断肾癌以及肾癌转移灶、 肾 CT 和 / 或肾超声 ( 如 果需要的话 )。
     该治疗应用尤其用于肾脏器官的药物靶向。具体而言， 根据本发明的缀合物可作 为治疗肾脏疾病或药物作用位点在肾脏的疾病的药物。一种或多种活性化合物， 例如抗生 素、 炎症抑制剂、 ACE 抑制剂、 利尿剂、 免疫抑制剂或化疗剂优选结合本发明的缀合物， 例如 通过可解离的间隔物序列。
     根据本发明的缀合物也可用于阻断肾脏毒性物质的再吸收。根据本发明， 靶向于肾脏表示所用物质在肾脏中相对于身体其余部分的吸收增 加。 在本发明的缀合物靶向于肾脏的过程中， 通过施用本发明的缀合物， 优选在肾脏中具有 相对于身体其他部分 ( 血液、 心脏、 肺、 脾、 肝、 肌肉、 脑 ) 至少 2 倍、 优选至少 5 倍、 尤其优选 至少 10 倍的富集。这些数值通过放射性标记的根据本发明的缀合物的器官分布研究测定 ( 例如 PET 测量或非侵袭性成像 )。肾脏的富集通常在 30 分钟到 8 小时后发生， 取决于应 用的类型。
     无需多言， 本领域技术人员能够在最宽的范围内应用上述说明。优选的实施方案 和实施例因此仅仅应当认为是描述性的公开， 而不是以任何方式加以限制。
     所有上下文中提到的申请、 专利和出版物的完整内容， 尤其是 2009 年 7 月 20 日提 交的对应申请 EP 09009393.1-20 整体引入本文作为参考。 实施例 1. 原料合成
     实施例 1(ε-L- 聚赖氨酸 -DOTA)
     DOTA 2， 6- 二 氟 苯 基 酯 ： 从 DOTA 和 2， 6- 二 氟 苯 酚 与 DCC 获 得 (Mier 等 人， Bioconjugate Chem.2005， 16， 237)
     ε-L- 聚赖氨酸， 平均摩尔质量约 4000( 主要由 29-34 个赖氨酸单元组成 )， 是购 自 Chisso 公司 ( 日本 ) 的 25％水溶液并冻干。 将 ε- 聚赖氨酸 (30mg) 溶于水中 (200μl)， 加入 DOTA 2， 6- 二氟苯基酯 (100mg) 的甲醇溶液 (1ml)， 加入 100μlN， N- 二异丙基乙胺， 将混合物在室温下搅拌 2 天。 随后再加入 DOTA 2， 6- 二氟苯基酯 (100mg)， 将混合物在室温 下搅拌过夜。混合物随后用水稀释， 通过制备 HPLC 纯化。纯化的组分一起冻干。获得无色 固体状的 DOTA-ε- 聚赖氨酸 (98mg)。通过加载 Gd 并通过 MS 测定每分子 ε- 聚赖氨酸的 DOTA 数目， 为每分子 ε- 聚赖氨酸约 10DOTA 单元 ； 即约 30％的 ε- 聚赖氨酸氨基已反应。
     图 2 显示了实施例 1 中获得的化合物的图解说明， 其中 DOTA 修饰显然在分子中随 机分布， 而非图 2 中所简单描述的那样。
     实施例 2(ε-L- 聚赖氨酸 -DTPA)
     将 75mgε-L- 聚赖氨酸和 310mg DTPA 二氟苯基酯四 - 叔丁基酯溶于 4ml 甲醇中， 在室温下搅拌 20 小时。蒸发反应溶液， 向残余物中加入 4mlTFA+100μl 水， 保持 20 小时。 产物使用乙醚沉淀。HPLC 纯化并冻干获得 150mg 无色固体。
     实施例 3( 加载 111In)
     将 1.5mgε-L- 聚赖氨酸 -DOTA 溶于 500μl 乙醇、 100μlDMSO 和 500μl0.4M 醋酸 钠缓冲液中， pH5。将 30μl 该溶液用 30μl 缓冲液稀释， 加入 11InCl3(20MBq)， 将混合物在 70℃加热 8 分钟， 放射性 -HPLC 显示完全络合。
     将 1.2mgε-L- 聚赖氨酸 -DTPA 溶于 400μl0.4M 的醋酸钠缓冲液中， pH 5。向 111 80μl 该溶液中加入 20MBq InCl3， 将混合物在 70℃加热 10 分钟， 放射性 -HPLC 显示完全 络合。
     实施例 4( 加载 68Ga)
     将 50μl 实施例 3 的 ε-L- 聚赖氨酸 -DOTA 溶液加入 100μl50MBq 的 68GaCl3(pH3) 的溶液， 将混合物在 95℃加热 10 分钟， HPLC 显示完全络合。
     实施例 5( 加载 Gd)
     将 10mgε-L- 聚赖氨酸 -DOTA 和 50mg GdCl3 六水合物在 60℃在 pH5 的 600μl0.4M 醋酸钠缓冲液中加热 30 分钟。HPLC 纯化和冻干获得 10mg 无色固体。
     实施例 6( 使用 19F 修饰 EPL-DOTA)
     将 50mgε-L- 聚赖氨酸 -DOTA 溶于 3ml 甲醇中， 加入 200μl 三乙胺和 200μl 三 氟醋酸乙酯， 将混合物在室温下搅拌 1 小时。使用包含水和乙腈的梯度洗脱进行 RP-HPLC 纯化， 冻干获得 35mg 无色固体。
     实施例 7(ε- 聚赖氨酸的依那普利衍生物 )
     依那普利 ： 将马来酸依那普利 (Bosche Scientific) 加到含有 Dowex50WX8 的柱 上， 用水洗涤直到中性。 随后用 2％吡啶的水溶液洗脱依那普利， 蒸发溶剂， 残余物用乙腈蒸 发多次。获得无色油状的依那普利， 直接继续使用。
     依那普利叔丁基酯 ： 从 依 那 普 利 和 N， N ′ - 二 环 己 基 -O- 叔 丁 基 异 脲 合 成 (Chadran， Ravi US 2006241017)。
     依那普利拉叔丁基酯 ： 从依那普利叔丁基酯使用 NaOH 进行合成 (Iwasaki 等人， Chem.Pharm.Bull.37(2)280(1989)
     N， N′ - 二异丙基 -O- 苄基异脲 ： 从苯甲醇和 N， N′ - 二环己基碳二亚胺进行合成 (Mathias， Synthesis 1979， 561.)
     6- 羟基己酸苄酯 ： 将 N， N′ - 二异丙基 -O- 苄基异脲 (2.34g ； 10mmol) 在 THF 中的 溶液 (8ml) 加入到 6- 羟基己酸 (ABCR) 中 (1.32g ； 10mmol)， 在室温下搅拌混合物 2 天。过 滤固体物质， 蒸发滤液。残余物在硅胶上用乙酸乙酯∶己烷 1 ∶ 2-1 ∶ 1 洗脱， 产率 90％。
     己酸苄酯 6-O-N， N ′ - 二异丙基异脲 ： 将 N， N ′ - 二异丙基碳二亚胺 (1.14g， 9mmol) 加入到 6- 羟基己酸苄酯 (2.0g ； 9mmol) 中， 加入 CuCl(30mg) 和 THF(6ml)， 将混合物 在室温下搅拌过夜。 混合物随后用 THF 稀释， 在玻璃漏斗中用中性氧化铝过滤， 用 THF 淋洗。 蒸发滤液， 残余物用乙醚溶解， 过滤固体物质， 蒸发滤液。产物不需进一步纯化即可使用。
     依那普利衍生物 1( 对应于图 4) ： 将依那普利叔丁基酯 (2.87g 7.09mmol) 在 THF 中的溶液 (20ml) 加入己酸苄酯， 加入 6-O-N， N′ - 二异丙基异脲 (2.47g， 7.09mmol)， 加入 20mg DMAP， 加热回流混合物 7 小时， 随后在 60℃搅拌过夜。 反应溶液用冰冷却， 过滤固体物 质。蒸发滤液， 残余物在硅胶上用乙酸乙酯∶己烷 1 ∶ 2-2 ∶ 1 洗脱。纯化的组分一起蒸 发， 产率 85％。 13
     C 和 1H-NMR 证实了所述结构。
     依 那 普 利 衍 生 物 2( 对 应 于 图 4) ： 将 依 那 普 利 衍 生 物 1(400mg) 溶 于 甲 醇 中 (50ml)， 加入 10％ Pd/C(70mg)， 混合物使用氢在大气压下氢化。40 分钟后， HPLC 显示完全 13 1 反应。过滤催化剂， 蒸发溶剂。产物不经进一步纯化即可使用。 C 和 H-NMR 证实了所述结 构。
     依那普利衍生物 3( 对应于图 4) ： 将依那普利衍生物 2(183mg ； 0.35mmol) 溶于乙 腈中 (2ml)， 加入 N， N， N′， N′ - 四甲基 -O-(N- 琥珀酰亚胺基 ) 脲 四氟硼酸盐 (TSTU) (106mg ； 0.35mmol) 在乙腈中的溶液 (2ml)， 加入 N， N- 二异丙基乙胺 (63μl ； 0.35mmol)， 在 室温下搅拌混合物。HPLC 显示 5 分钟后反应完全。产物通过制备 HPLC 纯化。冻干后， 获得 无色半固体状化合物。MS( 质谱 ) 显示与预期一致的实测质量。依 那 普 利 衍 生 物 4( 对 应 于 图 4) ： 将 依 那 普 利 衍 生 物 3(8mg) 在 室 温 下 溶 于 TFA(200μl) 和三异丙基硅烷 (5μl) 的混合物中。HPLC 显示 1 小时后反应完全。加入乙 腈 (1ml)， 随后蒸发混合物。将残余物溶于 1ml 的乙腈∶水 (1 ∶ 1) 中， 冻干。MS 显示质量 与预期一致。
     ε- 聚赖氨酸 - 依那普利衍生物 ：
     溶液 A ： 8mg 依那普利衍生物 4 在 100μl 乙腈中的溶液
     溶液 B ： 100mgε- 聚赖氨酸在 650μl 水和 350μl 乙腈中的溶液
     将 5μlN， N- 二异丙基乙胺加入 100μl 溶液 B 中并混合。随后加入 25μl 溶液 A， 尽快混合。数分钟后， HPLC 显示未反应的 ε- 聚赖氨酸峰和新的主峰， 但不再有依那普利 衍生物 4 的峰。新形成的产物通过制备 HPLC 分离， MS 鉴定为需要的单依那普利 -ε- 聚赖 氨酸衍生物。
     DOTA-ε- 聚赖氨酸 - 依那普利衍生物 ： 将过量的 DOTA 2， 6- 二氟苯基酯的甲醇溶 液加入到 ε- 聚赖氨酸 - 依那普利衍生物的水溶液中， 加入 N， N- 二异丙基乙胺。通过制备 HPLC 纯化获得需要的化合物。
     实施例 7 ： ε- 聚赖氨酸的雷帕霉素衍生物
     雷 帕 霉 素 42- 半 琥 珀 酸 酯 ： 从 雷 帕 霉 素 (LC-Laboratories) 琥 珀 酸 酐 和 南 极 假 丝 酵 母 (Candida antarictiaca)(Sigma) 的 脂 肪 酶 丙 烯 酸 树 脂 制 备 (Gu 等 人， Org. Lett.2005， 7， 3945-3948)。
     雷 帕 霉 素 42- 半 琥 珀 酰 基 -NHS 酯 ： 将 雷 帕 霉 素 42- 半 琥 珀 酸 酯 (180mg ； 0.177mmol) 溶于乙腈 (1.5ml)， 加入 N， N， N′， N′ - 四甲基 -O-(N- 琥珀酰亚胺基 ) 四氟 硼酸脲 (TSTU)(56mg ； 0.186mmol) 的乙腈溶液 (0.5ml)， 加入 N， N- 二异丙基乙胺 (36μl ； 0.20mmol)， 室温下搅拌混合物。30 分钟后 HPLC 显示完全反应。产物通过制备 HPLC 纯化。 冻干后， 获得无色固体化合物产物 (125mg)。MS 显示实测质量与预期一致。
     ε- 聚赖氨酸 - 雷帕霉素衍生物 ：
     将 ε- 聚赖氨酸 (3ml 25％水溶液 ； Chisso) 用水稀释 (30ml)， 使用 TFA 调节 pH 至 约 3 并冻干。
     溶液 A ： 30mg 雷帕霉素 42- 半琥珀酰基 -NHS 酯在 500μl 乙腈中的溶液
     溶液 B ： 500mgε- 聚赖氨酸 ( 酸性， 见上文 ) 溶于 5ml 水∶乙腈 (2 ∶ 1)， 通过添 加三乙胺调节至 pH7-7.5。
     将溶液 A 搅拌加入溶液 B。形成浑浊的混合物。加入乙腈 (1ml) 使溶液澄清。约 15 分钟后 HPLC 显示雷帕霉素 42 半琥珀酰基 -NHS 酯完全反应， 除未反应的 ε- 聚赖氨酸外 形成新的产物。新形成的产物通过制备 HPLC 分离， MS 鉴定为所需的单雷帕霉素 -ε- 聚赖 氨酸衍生物。
     DOTA-ε- 聚赖氨酸 - 雷帕霉素衍生物 ： 将 DOTA 2， 6- 二氟苯基酯 (20mg ； 40μmol) 在乙腈中的溶液 (200μl) 加入到 ε- 聚赖氨酸 - 雷帕霉素衍生物 (10mg ； 约 2μmol) 在 水∶乙腈 2 ∶ 1 的溶液中 (500μl)， 通过加入三乙胺将反应溶液调节至 pH 7-7.5， 室温下 反应过夜。通过制备 HPLC 纯化后冻干获得所需的无色固体化合物。通过 MS 确定每分子 DOTA 的数目。比例介于 15-18 个 DOTA 单元每分子。
     实施例 8 ： ε- 聚赖氨酸的索拉非尼衍生物4- 氯 (2- 吡啶基 ))N-2- 羟乙基甲酰胺 (S-2) ： 将 4- 氯吡啶 -2- 甲酸甲酯盐酸盐 (S-1)(2.08g ； 10mmol)(Bankston 等人， Organic Process Research&Development 2002， 6， 777-781) 加入甲醇 (5ml)， 在冰中冷却。在 10 分钟内滴加乙醇胺 (3ml ； 50mmol) 在 THF 中的溶液 (50ml)， 混合物随后在 0°继续搅拌 3h， 在室温下搅拌过夜。蒸发后， 残余物用乙 酸乙酯溶解， 用 5％ NaHCO3 洗涤， 干燥有机溶液并蒸发。获得的产物 S-2(1.84g 91％ ) 为 13 高纯度的淡黄色固体 (HPLC)。 C NMR(DMSO-d6) ： 642.15， 59.98， 122.30， 126.82， 145.01， 150.43， 152.09， 163.20p.p.m。
     (4-(4- 氨 基 苯 氧 基 )(2- 吡 啶 基 ))-N-2- 羟 乙 基 甲 酰 胺 (S-3) ： 将叔丁醇钾 (3.17g ； 28.24mmol) 在氩气中分批加入到 4- 氨基苯酚 (2.96g ； 27.1mmol) 在 DMF 中的溶液 中 (45ml)， 混合物随后在室温下搅拌 1.5 小时。加入 S-2(5.43g ； 27mmol) 在 DMF 中的溶液 (10ml)， 随后加入 K2CO3(2.0g)。反应在 70°油浴中加热 6 小时， 随后冷却， 加入乙酸乙酯 (400ml) 和饱和 NaCl(400ml)。再次用乙酸乙酯萃取水相， 合并的有机相用 4x100ml 饱和的 NaCl 溶液洗涤、 干燥并蒸发。黑色残余物首先在硅胶上通过乙酸乙酯 / 己烷 (3 ∶ 1)- 乙 酸乙酯 / 甲醇 (10 ∶ 1) 纯化。合并蒸发含有产物的组分， 随后在氧化铝上用乙酸乙酯 / 己 烷 (3 ∶ 1)- 乙酸乙酯 / 甲醇 (10 ∶ 1) 洗脱。产物为高纯度的淡黄色固体 (HPLC)(3.20g ； 43％ )。MS ： M+Na ＝ 296.100 ； C14H15N3NaO3 计算值＝ 296.1011。 N-(4- 氯 -3-( 三氟甲基 ) 苯基 )-((4-(2-(N- 羟乙基氨甲酰基 )-(4- 吡啶基氧 基 )) 苯基 ) 氨基 ) 甲酰胺 (S-4) ： 将 S-3(1.50g ； 5.49mmol) 在二氯甲烷中的溶液 (20ml) 在冰中冷却， 加入 4- 氯 -3- 三氟甲基苯基异氰酸酯 (1.26g ； 5.70mmol) 在二氯甲烷中的溶 液 (20ml)。1 小时后， 过滤沉淀的固体， 用二氯甲烷淋洗并干燥。获得白色固体状的产物 (S-4)(2.34g ； 4.73mmol ； 86％ )。MS ： M+H ＝ 495.1037 C22H19ClF3N4O4 计算值 ： 495.1047。
     索拉非尼衍生物 S-5 ： 将 S-4(2.30g ； 4.65mmol) 溶于吡啶 (15ml) 中， 加入琥珀 酸 酐 (581mg ； 5.81mmol) 在 吡 啶 中 的 溶 液 (5ml)。 加 入 N， N- 二 甲 基 氨 基 吡 啶 (284mg ； 2.33mmol)， 混合物在室温下搅拌过夜。反应混合物添加到含有约 20ml 吡啶 -Dowex 在吡 啶∶甲醇∶水 (8 ∶ 1 ∶ 1) 中的溶液的柱上， 用相同的混合物洗脱。蒸发洗脱物， 残余物用 甲苯多次蒸发， 最后用乙腈蒸发。获得白色泡沫状产物 (S-5)(2.65g ； 4.45mmol ； 95％ )MS ： M+H ＝ 595.1115 ； C26H23ClF3N4O7 计算值 ： 595.1207。
     索拉非尼衍生物 S-6 ： 将 S-5(180mg ； 0.30mmol) 溶于乙腈 (3ml)， 加入 N， N， N′，
     N′ - 四甲基 -O-(N- 琥珀酰亚胺基 ) 脲四氟硼酸盐 (TSTU)(99mg ； 0.32mmol) 在乙腈中的溶液 (3ml)。加入 N， N- 二异丙基乙胺 (67μl ； 0.37mmol)。HPLC 显示 10 分钟后完全反 应。加入 0.1％ TFA 的水溶液 (2ml)， 混合物通过制备 HPLC 纯化。获得 “灰白色” 固体状的 692.1371。 S-6(163mg ； 0.24mmol ； 78％ ).MS ： M+H ＝ 692.1368 ； C30H25ClF3N5O9 计算值 ：
     ε- 聚赖氨酸 - 索拉非尼衍生物 ：
     将 ε- 聚赖氨酸 (3ml 25％水溶液 ； Chisso) 用水稀释 (30ml)， 使用 TFA 调节至 pH 约 3， 冻干。
     溶液 A ： 17mg 索拉非尼衍生物 S-6 在 500μl 乙腈中的溶液。
     溶液 B ： 500mgε- 聚赖氨酸 ( 酸性， 见上 ) 溶于 5ml 水∶乙腈 (2 ∶ 1)， 通过加入 三乙胺调节至 pH7-7.5。
     将溶液 A 搅拌加入溶液 B。形成浑浊的 rongy。加入乙腈 (1ml) 使溶液澄清。约15 分钟后 HPLC 显示索拉非尼衍生物 S-6 完全反应， 除未反应的 ε- 聚赖氨酸外形成新的产 物。新形成的产物 (71mg) 通过制备 HPLC 分离， MS 鉴定为所需的单索拉非尼 -ε- 聚赖氨 酸衍生物。
     DOTA-ε- 聚 赖 氨 酸 - 索 拉 非 尼 衍 生 物 ： 将 DOTA 2， 6- 二 氟 苯 基 酯 (197mg ； 360μmol) 在乙腈中的溶液 (1.5ml) 加入到 ε- 聚赖氨酸 - 索拉非尼衍生物 (71mg ； 约 15μmol) 在水∶乙腈 2 ∶ 1 的溶液中 (1.5ml)， 通过加入三乙胺将反应溶液调节至 pH 7-7.5， 室温下反应过夜。通过制备 HPLC 纯化， 冻干后获得所需的无色固体化合物 (90mg)。 通过 MS 确定每分子的 DOTA 数目为 16-20。
     2. 用途实施例
     1. 器官分布研究
     为确定药代动力学， 根据合成实施例 2/3 用放射性核素 111In 标记 ε- 聚赖氨 酸 -DOTA， 将 NMRI 小鼠分组， 每组 3 只， 通过尾静脉注射。用量为每只动物约 5μgε- 聚赖 氨酸 -DOTA， 剂量为每只动物约 1MBq。
     随后将动物切开， 在 γ 计数器中检测分离器官 ( 血液、 心脏、 肺、 脾、 肝、 肾、 肌肉、 脑 ) 中的放射性。相应器官中的放射性量直接代表了摄取的 ε- 聚赖氨酸 -DOTA 量。动物 在不同的时间处死， 整个试验的全部操作按照动物试验科学性的伦理学原则进行。
     令人惊讶的， 在测定中观察到在注射含 111In 的 ε- 聚赖氨酸 -DOTA 仅 10 分钟后， 在试验动物的肾脏中积聚了超过 150％的注射剂量 /g 肾脏组织。少量通过尿排泄。
     不同器官中的积聚的图解表示如图 2 所示。Y 轴代表了特定器官中的特异性积聚 ( 用注射剂量 /g 组织的百分比表示 )。P1 到 P3 代表不同程度装载的缀合物的结果 ： P1 ： 约 10％的赖氨酸单体携带 DOTA ； P2 ： 约 30％的赖氨酸单体携带 DOTA ； P3 ： 约 50％的赖氨酸单 体携带 DOTA。
     2.PET 测量
     在 PET 测量中， 根据合成实施例 4 使用 68- 镓进行标记。在小动物 PET 扫描仪 (Siemens) 中动态研究肾脏积聚。发现化合物 (ε-L- 聚赖氨酸 -DOTA， 装载有 68Ga) 达到极 好的器官与背景的比值， 并在肾脏中实际上排他性地积聚。这里通常的数值为在肾脏中相 对于身体其余部分 10 倍积聚。
     3. 比较试验 99m
     Tc-MAG3 和 99mTc-DMSA 的摄取与 (ε-L- 聚赖氨酸 -DOTA， 装载了 111In) 的摄取在 大鼠和小鼠模型中通过平面闪烁照相法进行了比较。相对于本发明的物质， 已知的两种示 踪剂显示的肾脏 - 背景比值较差。
     3. 各种携带羧基的化合物的缀合
     为研究不同的携带羧基的化合物对肾脏积聚的影响， 将 ε- 聚赖氨酸与 DOTA 单元 缀合以帮助放射性核素在动物试验中的标记。除了一个 DOTA 单元外， 还缀合了多种其他 携带羧基的化合物或无羧基的化合物。这些缀合物的器官分布研究显示与 DO-3AM(1， 4， 7， 10- 四氮杂环十二烷 -N， -N′， -N″， - 三酰胺， N” ’ - 单乙酸， 大环类化合物 ) 的缀合物 ( 其 缀合后不含羧基 ) 在肾脏中的积聚未超过使用 DOTA 基团已获得的积聚， 而柠檬酸的缀合物 具有很好的积聚， 琥珀酸的缀合物在肾脏中积聚也较好。
     合成每分子仅含一个 DOTA 单元的 ε- 聚赖氨酸 (Ref.1) ： 将 ε- 聚赖氨酸 (780mg)溶解在水∶甲醇 1 ∶ 1 中， 加入 DOTA 2， 6- 二氟苯基酯 (103mg) 在甲醇中的溶液， 加入二 异丙基乙胺 (100μl)， 将混合物在室温下搅拌过夜。产物通过 HPLC 纯化并冻干。MS 显示 ε- 聚赖氨酸和 ε- 聚赖氨酸 -1xDOTA 混合物， 其比例为约 2 ∶ 1。该化合物 Ref.1 被用于 制备所有下述衍生物。
     Ref.1 的 DO-3AM- 醋酸衍生物 ： 将 DO-3AM- 醋酸 (42mg) 和 TSTU(31mg) 溶于 DMF 中 (2ml)， 加入二异丙基乙胺 (18μl)。1 分钟后， 将该溶液加入 Ref.1(16mg) 的水∶二 烷 1 ∶ 1 溶液 (400μl) 中， 室温下反应过夜。用水稀释后， 产物通过 HPLC 纯化并冻干。
     Ref.1 的柠檬酸衍生物 ： 从柠檬酸 (2mmol) 和二环己基碳二亚胺 (1mmol) 的 THF 溶液 (5ml) 制备柠檬酸酐。30 分钟后， 过滤形成的二环己基脲， 用 THF 淋洗。蒸发滤液， 直 接使用。将柠檬酸酐 (80mg) 的吡啶溶液 (200μl) 加入 Ref.1(38mg) 和二甲基氨基吡啶 (5mg) 在吡啶∶水 1 ∶ 1 的溶液 (200μl) 中， 室温下搅拌混合物过夜。用水稀释后， 产物用 HPLC 纯化并冻干。每分子 ε- 聚赖氨酸 -1xDOTA 的柠檬酸单元的数目通过 MS 测定为 4-8。 Ref.1 的琥珀酸衍生物 ： 将琥珀酸酐 (100mg) 在吡啶∶二 烷 1 ∶ 1 中的溶液 (2000μl) 加入 Ref.1(38mg) 和二甲基氨基吡啶 (5mg) 在吡啶∶水 1 ∶ 1 的溶液 (1000μl) 中， 室温 下搅拌混合物过夜。用水稀释后， 产物用 HPLC 纯化并冻干。