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1、10申请公布号CN102470149A43申请公布日20120523CN102470149ACN102470149A21申请号201080034252622申请日2010081761/234,68120090818USA61K35/1220060171申请人生命细胞公司地址美国新泽西州72发明人本杰明奇巴罗74专利代理机构北京安信方达知识产权代理有限公司11262代理人申基成郑霞54发明名称用于处理组织的方法57摘要提供了用于处理组织的方法。在一些实施方案中，所述方法包括通过向组织样品施加高静压而将组织样品去细胞化的方法。在一些实施方案中，所述方法包括通过向组织样品施加高静压而融化组织样品和/。
2、或减少样品中的生物负荷的方法。30优先权数据85PCT申请进入国家阶段日2012020186PCT申请的申请数据PCT/US2010/0457232010081787PCT申请的公布数据WO2011/022369EN2011022451INTCL权利要求书4页说明书9页附图4页19中华人民共和国国家知识产权局12发明专利申请权利要求书4页说明书9页附图4页1/4页21一种用于将组织样品去细胞化的方法，所述方法包括提供在液体中的包含哺乳动物组织的组织样品；和向所述液体施加至少200MPA的压力，持续足以破坏软组织中基本上所有天然组织细胞的时间，其中破坏基本上所有细胞包括破裂所述细胞的细胞膜，从而。
3、在盐水溶液中洗涤所述组织样品允许去除至少95的所述天然组织细胞。2如权利要求1所述的方法，其中向所述液体施加的压力是至少约500MPA。3如权利要求1所述的方法，其中向所述液体施加的压力是至少300MPA，持续至少30分钟。4如权利要求1所述的方法，其中向所述液体施加的压力是至少400MPA，持续至少10分钟。5如权利要求1所述的方法，其中向所述液体施加的压力是至少400MPA，持续至少30分钟。6如权利要求1所述的方法，其中所述液体包括盐的水溶液。7如权利要求6所述的方法，其中所述液体包括磷酸盐缓冲盐水。8如权利要求1所述的方法，所述方法还包括对所述组织进行灭菌过程。9如权利要求8所述的方法。
4、，其中所述灭菌过程包括辐照过程。10如权利要求8所述的方法，其中所述灭菌过程包括电子束辐照过程。11如权利要求8所述的方法，其中所述灭菌过程包括超临界二氧化碳灭菌过程。12如权利要求8所述的方法，其中所述灭菌过程包括过乙酸处理过程。13如权利要求1所述的方法，其中所述哺乳动物组织包括软组织。14如权利要求13所述的方法，其中所述哺乳动物组织包括皮肤。15如权利要求13所述的方法，其中所述哺乳动物软组织包括猪真皮。16如权利要求14所述的方法，所述方法还包括在施加所述压力之前从皮肤去除表皮层。17如权利要求1所述的方法，其中所述哺乳动物组织包括腱或韧带中的至少一种。18如权利要求1所述的方法，其。
5、中所述哺乳动物组织包括小肠粘膜下层。19如权利要求1所述的方法，所述方法还包括洗涤所述哺乳动物软组织以去除被破坏的细胞；和对所述组织样品进行至少一种另外的去细胞化过程。20一种用于融化组织样品的方法，所述方法包括提供在液体中的至少部分地冷冻的包含哺乳动物组织的组织样品；和向所述液体施加足以融化所述冷冻的组织样品的压力。21如权利要求20所述的方法，其中融化所述冷冻的组织包括导致所述组织样品中大于50的固态水经历相转变成为液态。22如权利要求20所述的方法，其中融化所述冷冻的组织包括导致所述组织样品中基本上所有的固态水经历相转变成为液态。23如权利要求20所述的方法，其中进行融化所述组织而不使所。
6、述组织样品的温度提高多于10。24如权利要求20所述的方法，其中进行融化所述组织而不提高所述组织样品的温度权利要求书CN102470149A2/4页3到大于30。25如权利要求21所述的方法，其中进行融化所述组织而不使所述组织样品的温度提高多于10。26如权利要求21所述的方法，其中进行融化所述组织而不提高所述组织样品的温度到大于30。27如权利要求22所述的方法，其中进行融化所述组织而不使所述组织样品的温度提高多于10。28如权利要求22所述的方法，其中进行融化所述组织而不提高所述组织样品的温度到大于30。29如权利要求2328任一项所述的方法，其中融化所述组织在少于30分钟中进行。30如权。
7、利要求2328任一项所述的方法，其中融化所述组织在少于60分钟中进行。31如权利要求20所述的方法，其中向所述液体施加的压力是至少500MPA。32如权利要求20所述的方法，其中所述液体包括盐的水溶液。33如权利要求32所述的方法，其中所述液体包括磷酸盐缓冲盐水。34如权利要求20所述的方法，所述方法还包括对所述组织进行灭菌过程。35如权利要求34所述的方法，其中所述灭菌过程包括辐照过程。36如权利要求34所述的方法，其中所述灭菌过程包括电子束辐照过程。37如权利要求34所述的方法，其中所述灭菌过程包括超临界二氧化碳灭菌过程。38如权利要求34所述的方法，其中所述灭菌过程包括过乙酸处理过程。3。
8、9如权利要求20所述的方法，其中所述组织样品包括软组织。40如权利要求36所述的方法，其中所述软组织包括真皮。41如权利要求37所述的方法，其中所述软组织包括猪真皮。42如权利要求39所述的方法，其中所述哺乳动物组织包括腱或韧带中的至少一种。43如权利要求39所述的方法，其中所述哺乳动物组织包括小肠粘膜下层。44一种用于将组织样品去细胞化的方法，所述方法包括提供在含液体的容器中的包含哺乳动物组织的组织样品；和向所述液体施加压力，持续足以破坏软组织中基本上所有细胞的时间，其中破坏基本上所有细胞包括破裂所述细胞的细胞膜，从而在盐水溶液中洗涤所述组织样品允许去除至少95的天然组织细胞，且其中所述压力。
9、以使得所述组织样品的温度不超过30的速率施加。45如权利要求44所述的方法，其中向所述液体施加的压力是至少500MPA。46如权利要求44所述的方法，其中向所述液体施加的压力是至少300MPA，持续至少30分钟。47如权利要求44所述的方法，其中向所述液体施加的压力是至少400MPA，持续至少10分钟。48如权利要求44所述的方法，其中向所述液体施加的压力是至少400MPA，持续至少40分钟。49如权利要求44所述的方法，其中所述液体包括盐的水溶液。50如权利要求49所述的方法，其中所述液体包括磷酸盐缓冲盐水。权利要求书CN102470149A3/4页451如权利要求44所述的方法，所述方法还。
10、包括对所述组织进行灭菌过程。52如权利要求51所述的方法，其中所述灭菌过程包括辐照过程。53如权利要求51所述的方法，其中所述灭菌过程包括电子束辐照过程。54如权利要求51所述的方法，其中所述灭菌过程包括超临界二氧化碳灭菌过程。55如权利要求51所述的方法，其中所述灭菌过程包括过乙酸处理过程。56如权利要求44所述的方法，其中所述哺乳动物组织包括皮肤。57如权利要求56所述的方法，其中所述哺乳动物组织包括猪真皮。58如权利要求57所述的方法，所述方法还包括在施加所述压力之前从皮肤去除表皮层。59一种用于减少组织样品中的生物负荷的方法，所述方法包括提供在含液体的容器中的包含哺乳动物软组织的组织样。
11、品；和向所述液体施加压力，持续足以导致所述软组织中的细菌浓度至少减少5个对数级的时间，其中在施加所述压力期间，所述组织样品的温度不超过30。60如权利要求59所述的方法，其中向所述液体施加的压力是至少500MPA。61如权利要求59所述的方法，其中向所述液体施加的压力是至少300MPA，持续至少30分钟。62如权利要求59所述的方法，其中向所述液体施加的压力是至少400MPA，持续至少10分钟。63如权利要求59所述的方法，其中向所述液体施加的压力是至少400MPA，持续至少40分钟。64如权利要求59所述的方法，其中所述液体包括盐的水溶液。65如权利要求64所述的方法，其中所述液体包括磷酸盐。
12、缓冲盐水。66如权利要求59所述的方法，所述方法还包括对所述组织进行至少一种另外的灭菌过程。67如权利要求66所述的方法，其中所述灭菌过程包括辐照过程。68如权利要求66所述的方法，其中所述灭菌过程包括电子束辐照过程。69如权利要求66所述的方法，其中所述灭菌过程包括超临界二氧化碳灭菌过程。70如权利要求66所述的方法，其中所述灭菌过程包括过乙酸处理过程。71如权利要求59所述的方法，其中所述哺乳动物软组织包括皮肤。72如权利要求71所述的方法，其中所述哺乳动物软组织包括猪真皮。73如权利要求71所述的方法，所述方法还包括在施加所述压力之前从皮肤去除表皮层。74如权利要求59所述的方法，其中所。
13、述组织样品的温度不超过25。75如权利要求59所述的方法，其中所述哺乳动物软组织是真皮。76如权利要求75所述的方法，其中所述哺乳动物软组织是无细胞真皮。77如权利要求59所述的方法，其中所述哺乳动物软组织是无细胞的。78一种用于减少组织样品中的生物负荷的方法，所述方法包括提供在含液体的容器中的包含哺乳动物软组织的组织样品；和向所述液体施加至少200MPA的压力，其中在施加所述压力期间，所述组织样品的温度权利要求书CN102470149A4/4页5不超过30。79如权利要求78所述的方法，其中向所述液体施加的压力是至少500MPA。80如权利要求78所述的方法，其中向所述液体施加的压力是至少3。
14、00MPA，持续至少30分钟。81如权利要求78所述的方法，其中向所述液体施加的压力是至少400MPA，持续至少10分钟。82如权利要求78所述的方法，其中向所述液体施加的压力是至少400MPA，持续至少40分钟。83如权利要求78所述的方法，其中所述液体包括盐的水溶液。84如权利要求83所述的方法，其中所述液体包括磷酸盐缓冲盐水。85如权利要求78所述的方法，所述方法还包括对所述组织进行至少一种另外的灭菌过程。86如权利要求85所述的方法，其中所述灭菌过程包括辐照过程。87如权利要求85所述的方法，其中所述灭菌过程包括电子束辐照过程。88如权利要求85所述的方法，其中所述灭菌过程包括超临界二。
15、氧化碳灭菌过程。89如权利要求85所述的方法，其中所述灭菌过程包括过乙酸处理过程。90如权利要求78所述的方法，其中所述哺乳动物软组织包括皮肤。91如权利要求90所述的方法，其中所述哺乳动物软组织包括猪真皮。92如权利要求90所述的方法，所述方法还包括在施加所述压力之前从皮肤去除表皮层。93如权利要求78所述的方法，其中所述组织样品的温度不超过25。94如权利要求78所述的方法，其中所述哺乳动物软组织是真皮。95如权利要求94所述的方法，其中所述哺乳动物软组织是无细胞真皮。96如权利要求78所述的方法，其中所述哺乳动物软组织是无细胞的。97如权利要求78所述的方法，其中向所述液体施加压力，持续。
16、足以导致所述哺乳动物软组织中的细菌浓度至少减少5个对数级的时间。98一种组织产品，所述组织产品是利用权利要求197任一项的方法产生的。权利要求书CN102470149A1/9页6用于处理组织的方法0001按照35USC119，本申请要求2009年8月18日提交的美国临时专利申请号61/234,681的优先权。0002人类组织和动物组织可用于产生多种用于患者应用的组织产品。通常处理组织以去除某些细胞成分和/或非细胞成分和/或以破坏组织中存在的病原体。此外，在处理或储存期间，可能冷冻和融化组织。0003发明概述0004根据某些实施方案，提供了一种用于将组织样品去细胞化的方法，包括提供在液体中的包含。
17、哺乳动物软组织的组织样品；和向液体施加至少200MPA的压力，持续足以破坏软组织中基本上所有天然组织细胞的时间，其中破坏基本上所有细胞包括破裂细胞的细胞膜，从而在盐水溶液中洗涤组织样品允许去除至少95的天然组织细胞。0005根据某些实施方案，提供了一种用于融化组织样品的方法，该方法包括提供在液体中的至少部分地冷冻的包含哺乳动物组织的组织样品；和向液体施加足以融化冷冻的组织样品的压力。0006根据某些实施方案，提供了一种用于将组织样品去细胞化的方法，该方法包括提供在含液体的容器中的包含哺乳动物组织的组织样品；和向液体施加压力，持续足以破坏软组织中基本上所有细胞的时间，其中破坏基本上所有细胞包括破。
18、裂细胞的细胞膜，从而在盐水溶液中洗涤组织样品允许去除至少95的天然组织细胞，且其中压力以使得组织样品的温度不超过30的速率施加。0007根据某些实施方案，提供了一种用于减少组织样品中的生物负荷BIOBURDEN的方法，该方法包括提供在含液体的容器中的包含哺乳动物软组织的组织样品；和向液体施加压力，持续足以导致软组织中的细菌浓度至少减少5个对数级5LOGREDUCTION的时间，其中在施加压力期间，组织样品的温度不超过30。附图说明0008图1是水的相图。0009图2A是如实验1所述的猪全皮样品的生物负荷测试结果数据。0010图2B是如实验1所述的猪真皮的生物负荷测试结果数据。0011图3是如实。
19、验2所述的猪真皮的生物负荷测试结果数据。0012图4是实验1和实验2的样品的温度相对压力的分布曲线。0013某些示例实施方案的描述0014现在将详细地参考根据本公开内容的某些示例实施方案，其某些实例阐述在附图中。尽可能地，在整个附图中将使用相同的参考编号来指示相同或相似的部分。0015在本申请中，除非另外具体指明，否则单数形式的使用包括复数形式。在本申请中，除非另外指明，否则“或”的使用表示“和/或”。而且，术语“包括INCLUDING”、以及其他形式诸如“包括INCLUDES”和“包括INCLUDED”的使用不是限制性的。本文描述的任何范围将理解为包括端点和端点之间的所有数值。说明书CN10。
20、2470149A2/9页70016本文所用的“高静压HIGHHYDROSTATICPRESSURE”理解为是指向液体中包含的物体施加的压力，该液体被加压以对该物体施加力。在某些实施方案中，高静压可包括向液体施加的大于200MPA的压力。0017本文所用的“生物负荷”是指组织样品中微生物的数量，所述微生物包括但不限于，细菌、病毒、真菌、寄生虫、衣原体、立克次氏体、支原体和原生动物。0018本文所用的“组织产品”或“组织衍生产品”是指从已被以任何方式例如但不限于，通过从组织去除细胞，从组织去除某些化学物，或将组织灭菌改变的组织产生的任何产品。本文所用的“组织样品”包括完整、未处理的组织和已被处理以。
21、产生“组织产品”或“组织衍生产品”的组织二者。0019本文所用的节标题仅是为了结构上的目的，且不应解释为限制所描述的主题。本申请中引用的所有文件或文件的部分，包括但不限于专利、专利申请、文章、书籍和论文，为了任何目的特此专门地通过引用全文并入。0020多种人类组织和动物组织可用来产生用于治疗患者的产品。例如，已经产生了用于再生、修复、强化、增强和/或治疗已由于多种疾病和/或结构损伤如，来自外伤、手术、萎缩和/或长期磨损和退化而损伤或丧失的人类组织的多种组织产品。此类产品可包括，例如，可单独使用或联合其他材料和/或化学物使用的组织基质TISSUEMATRICES和/或组织衍生蛋白或含蛋白材料如，。
22、葡萄糖胺聚糖。0021在某些实施方案中，可将这些产品完全或部分地去细胞以产生将用于患者的组织基质或细胞外组织材料。例如，可将多种组织，诸如皮肤、肠、骨、软骨、神经组织如，神经纤维或硬脑膜、腱、韧带、或其他组织完全或部分地去细胞以产生可用于患者的组织产品。在一些情形中，可使用这些去细胞的产品而不添加外源的细胞材料如，干细胞。在某些情形中，可将这些去细胞的产品植入来自自体来源或其他来源的细胞以促进治疗。0022因为组织产品通常被植入到患者身体上或身体内，在某些实施方案中，期望将这些材料灭菌，或至少将产品中可能存在的细菌或其他病原体的量减少到对于所选应用可接受的水平。在某些实施方案中，多种组织、组织。
23、衍生产品和其他可植入医疗装置通常利用诸如辐照如，辐照、电子束辐照或X射线辐照、化学物处理或加热的过程来灭菌。0023为了在多种医学应用或手术应用中使用，组织或组织产品应具有取决于预期用途的期望生物特性。例如，用于组织再生的组织产品通常应能够支持或诱导细胞向内生长和/或再生。然而，某些组织处理技术可损伤一些组织和/或去除对于某些生物功能期望的组织部分。例如，在某些实施方案中，组织去细胞化过程可包括使用多种酶、去垢剂和/或化学物，这可能损伤或去除对于某些组织的再生或生长期望的多种细胞信号分子或细胞外基质蛋白。此外，在某些实施方案中，灭菌技术诸如辐照，可通过导致组织产品的损坏BREAKDOWN和/或。
24、化学改变而改变这种产品。0024本公开内容提供处理组织样品的方法，所述组织样品保持利用这种方法产生的组织产品的某些期望生物特性。在一些实施方案中，所述方法包括用于将组织样品去细胞化的方法。在某些实施方案中，所述方法包括用于融化组织样品的方法。在一些实施方案中，所述方法包括用于减少组织样品的生物负荷的方法。0025在一些实施方案中，用于处理组织样品的方法可包括向组织施加高静压。在某些实施方案中，通过将组织样品放置在液体中或提供在液体中的组织，可向组织样品施加高说明书CN102470149A3/9页8静压。在某些实施方案中，可向液体施加压力，从而控制施加于组织样品的压力。在各种实施方案中，可控制施。
25、加于组织样品的压力、施加压力的时间、和/或压力增加和/或减少的速率，以将组织样品去细胞化，减少组织样品中的生物负荷，和/或融化组织样品。0026在各种实施方案中，施加于组织样品的压力可基于多种因素选择。在一些实施方案中，压力基于待处理的组织样品类型来选择。在一些实施方案中，选择压力以允许将组织样品去细胞化，同时保持组织样品的某些期望生物特性。在一些实施方案中，选择压力以允许组织融化而不升高组织样品温度到高于选定温度和/或允许在选定时间内融化。0027在各种实施方案中，本公开内容的方法可用来处理多种不同组织样品类型。示例的哺乳动物组织样品包括但不限于，骨、皮肤、肠、膀胱、腱、韧带、肌肉、筋膜、神。
26、经组织、肝、心、肺、肾、软骨和/或其他哺乳动物组织。在某些实施方案中，组织样品可包括哺乳动物软组织样品。例如，在某些实施方案中，组织样品可包括哺乳动物真皮。在某些实施方案中，真皮可以是与周围的表皮和/或其他组织诸如皮下脂肪分离的。在某些实施方案中，组织样品可包括小肠粘膜下层。在某些实施方案中，组织样品可包括人类来源或非人类来源。示例的适当非人类组织来源包括但不限于，猪、绵羊、山羊、兔、猴、和/或其他非人类哺乳动物。0028根据某些实施方案，多种类型的高静压施加系统可用来处理组织样品。在某些实施方案中，高静压施加系统包括钢或其他硬质材料制成的刚性器皿或容器。在某些实施方案中，将待处理的组织样品放。
27、置在带有流体如，水的器皿中。在某些实施方案中，可将组织样品包装在同样含流体的柔性容器中，并可将该柔性包装物FLEXIBLEPACKAGE放置在含流体的器皿中。在某些实施方案中，在用组织样品和流体向器皿上样之后，向器皿中的流体施加压力。在某些实施方案中，可以多种方式施加压力。例如，在某些实施方案中，可利用气动活塞压缩器皿中的流体来施加压力，或泵可迫使另外的流体进入器皿直到器皿中的压力达到期望水平。0029在某些实施方案中，将组织样品包装在含有液体的柔性容器中，并向容器施加压力。在一些实施方案中，将组织样品放置在含有液体的刚性加压容器中，并向该刚性容器中的液体施加压力。在一些实施方案中，将组织样品。
28、包装在含有液体的柔性容器中，并将该柔性容器放置在含有液体的刚性加压容器中，并向该刚性容器中的液体施加压力。在各种实施方案中，可通过利用例如活塞压缩流体，或通过向具有固定容积的容器泵入添加的流体而对流体施加压力。在某些实施方案中，当将组织样品包装在柔性容器中时，通常密封柔性容器从而仅柔性容器内的流体接触组织样品。0030多种液体可用来在施加高静压期间接触液体。例如，可使用多种含水溶液。在某些实施方案中，液体可包括盐的水溶液。在某些实施方案中，液体可包括盐水溶液，诸如磷酸盐缓冲盐水。0031在一些实施方案中，可处理组织样品以破坏组织样品的一些或基本上所有的天然组织细胞。在某些实施方案中，确定已完成。
29、的天然组织细胞的破坏可通过以下进行用不明显损伤细胞的液体如，PBS洗涤已被高静压处理的组织样品，并分析样品以确定如果有的话多少天然组织细胞保留。例如，在一些实施方案中，在高静压处理以破坏细胞后，用盐水溶液简单洗涤可去除细胞残余物，并可评价洗涤过的样品以确定是否已经去除了细胞，从而指示细胞的破坏。用于评价样品以确定细胞是否已被破坏和去除的某些适当方法是公知的，且包括例如但不限于，对冷冻或固定的组织细胞的光学显微术。在某些说明书CN102470149A4/9页9实施方案中，细胞或细胞残余物的存在可利用指示DNA存在的试剂来评价，例如，可使用DNA定量试剂盒。0032本文所用的破坏基本上所有的细胞理。
30、解为是指，已被高静压处理和在盐水溶液中洗涤的组织样品的天然组织细胞的至少95至100，包括端点和这些端点之间的所有百分比，当利用常规组织学如，光学显微术评价时不存在。0033在一些实施方案中，可用高静压处理组织样品以去除组织样品中的一些或基本上所有细胞，并可进一步用其他处理方法处理组织样品以去除剩余的细胞。例如，如上所述，在各种实施方案中，多种酶、去垢剂和/或其他化学物用来从组织去除细胞，但这种处理可能改变组织的细胞外基质。因此，为了减少用酶、去垢剂和/或其他化学物进行的处理的量，可首先用高静压处理来处理组织样品，从而去除一些或基本上所有的细胞，且可进一步用至少一种另外的去细胞化过程处理组织样。
31、品以去除另外的细胞，如果组织样品中存在任何另外的细胞的话。用于进行去细胞化的适当的试剂和方法包括但不限于，例如，LIVESEY等的美国专利号5,336,616中所述的那些。0034在一些实施方案中，可处理组织样品以产生无细胞组织基质。在一些实施方案中，无细胞组织基质可包括细胞外基质。例如，在各种实施方案中，组织基质可包括衍生自多种不同哺乳动物软组织的胶原基质。在某些实施方案中，组织基质可包括一种或多种另外的细胞外基质蛋白和/或分子，包括但不限于，多种GAG、细胞信号传导分子、或实现多种生物功能诸如细胞结合、粘附、生长、分化和/或重构所需的其他化学物。0035在一些实施方案中，用于将组织样品去细。
32、胞化的方法包括提供在液体中的包含哺乳动物软组织的组织样品，并向液体施加压力，持续足以破坏软组织中基本上所有天然组织细胞的时间。在一些实施方案中，以破坏软组织中基本上所有天然组织细胞的最小压力施加压力。在各种实施方案中，压力是至少200MPA、至少300MPA、至少400MPA或至少500MPA。在各种实施方案中，压力是300MPA至500MPA。在各种实施方案中，施加压力持续足以破坏软组织中基本上所有天然组织细胞的时间。在各种实施方案中，施加压力持续至少30分钟到至少60分钟。在某些实施方案中，向液体施加的压力是至少400MPA，持续至少10分钟。在某些实施方案中，向液体施加的压力是至少400。
33、MPA，持续至少30分钟。在某些实施方案中，向液体施加的压力是至少500MPA，持续至少30分钟。在各种实施方案中，进行去细胞化的方法而不导致组织样品的过度加热，如下所述。0036在各种实施方案中，本公开内容的方法允许向组织样品施加高静压而不导致组织样品的明显加热。在各种实施方案中，某些组织样品的加热可能损伤多种组织细胞外基质蛋白，从而削弱组织样品当用于组织修复、更换或再生时的期望生物功能。因此，本文的某些实施方案可允许组织去细胞化、组织融化、和/或减少组织的生物负荷，而不加热组织样品到可能损伤组织细胞外基质蛋白的温度或持续时间。在某些实施方案中，以使得组织样品不达到大于30的温度的速率和最大。
34、压力施加高静压。在某些实施方案中，温度不超过25。0037在某些实施方案中，在静压器皿中施加压力导致器皿内材料即，液体的绝热压缩，这导致被压缩材料的温度提高。然而，某些加压器皿允许经由器皿壁的一些热传递，因此这种系统不是真正绝热的。因此，在各种实施方案中，压力增加的量与压缩即，压力增加的速率和向器皿壁传递热或从器皿壁传递热有关。此外，在各种实施方案中，器皿内水说明书CN102470149A5/9页10的相变也可影响器皿内的温度。因此，在一些实施方案中，被高静压处理的样品的温度可通过控制在处理器皿中的压力增加的速率来控制。0038在某些实施方案中，可在施加高静压之前和/或过程中冷却组织样品、加压。
35、器皿中容纳的液体、和/或加压设备。在一些实施方案中，可将冰放入加压器皿中容纳的液体，和/或可冷却加压器皿的壁。0039在各种实施方案中，为了阻止组织损伤、损坏、和/或微生物生长，通常期望在处理、运输和/或储存期间冷冻组织样品。在各种实施方案中，在随后的处理或使用期间融化组织样品。但在某些情形中，通过加热来融化组织样品可损伤组织细胞外基质成分和/或促进微生物生长。而且，在某些实施方案中，在相对冷的条件下如，在冷藏下或刚好高于样品中水的凝固点融化组织样品可以是耗时的，尤其对于较大的组织样品。0040在某些实施方案中，用于融化组织样品的方法包括提供在液体中的至少部分地冷冻的包含哺乳动物组织的组织样品。
36、，和向液体施加足以融化冷冻的组织样品的压力。在一些实施方案中，融化发生在有限时间内和/或伴随组织样品温度仅有限的升高。0041图1提供水的固相和液相的相图。如所示的，多种冰相的融点在较高压力下降低。因此，在某些实施方案中，向含有冰的样品施加高静压可导致固态水向液体转变而不明显加热组织样品。0042在各种实施方案中，组织样品可包含部分或完全地为固态即，冰的水。在各种实施方案中，融化组织样品包括导致样品中一部分或基本上所有固态水转变为液体。在一些实施方案中，融化冷冻的组织样品包括导致组织样品中大于50的固态水经历相转变成为液态。在一些实施方案中，融化冷冻的组织包括导致组织样品中基本上所有的固态水经。
37、历相转变成为液态。在各种实施方案中，样品中50至100的冰经历相转变成为液态。0043在各种实施方案中，施加高静压处理之前和之后样品中固态冰的量可以许多方式确定。例如，在各种实施方案中，对于小样品可利用差示扫描量热法DSC确定样品中冰的存在。在各种实施方案中，对于较大样品，可通过将样品放置在已知温度的绝热液体中并向系统供应热来鉴定冰。在某些实施方案中，可在绝热系统中压缩加压样品，并且可在压缩期间测量样品温度或样品周围的流体介质的温度。预期不含冰的样品在绝热系统中以相对于加压速率的恒定速率提高其温度。在某些实施方案中，对于含有冰的样品，样品温度将在接近冰的融点的温度达到平稳PLATEAU。在一些。
38、实施方案中，如果测量样品周围流体的温度，含有冰的样品的流体温度将比不含冰的样品更缓慢地提高。样品温度的平稳和/或温度升高速率的降低将取决于存在的冰的量。0044在一些实施方案中，经历高静压处理的组织样品的温度被维持低于上限。在一些实施方案中，上限是基于样品的开始温度。例如，在一些实施方案中，进行组织融化而不使组织样品的温度提高多于10。在一些实施方案中，进行融化而不提高温度到高于30。在一些实施方案中，进行融化而不提高温度到高于25。在某些实施方案中，进行融化而不提高组织样品的温度到高于约25至30。0045在一些实施方案中，进行融化而不提高温度到高于上限，并在某一时间内进行。例如，在一些实施。
39、方案中，融化发生在30分钟内。在某些实施方案中，融化发生在60分钟内。在各种实施方案中，融化发生在约30分钟内至约60分钟内。0046在各种实施方案中，进行高静压处理以获得样品的生物负荷减少某一水平。例如，说明书CN102470149A106/9页11在各种实施方案中，高静压可以足以导致样品的细菌负荷至少减少5个对数级、减少6个对数级、减少7个对数级或减少8个对数级的压力和时间施加。在一些实施方案中，高静压可以足以减少生物负荷到特定水平的压力和时间施加。0047在各种实施方案中，组织样品的生物负荷可通过如下测量从组织样品提取微生物，并培养或定量特定类型的生物体。用于从样品提取微生物的适当方法包。
40、括用无菌液体洗涤样品，并培养用来洗涤样品的液体的部分或全部以定量样品中任何特定的一种或多种微生物的量。在多种实施方案中，洗涤流体可基于待定量的微生物类型和/或为了防止对组织的损伤来选择。在一些实施方案中，进行生物负荷减少而不提高温度到高于30。在一些实施方案中，进行生物负荷减少而不提高温度到高于25。在某些实施方案中，进行生物负荷减少而不提高组织样品的温度到高于约25至30。0048在一些实施方案中，灭菌过程可在向组织样品施加高静压之前或之后进行。例如，在一些实施方案中，施加高静压将至少部分地减少组织样品的生物负荷，并且可进行组织灭菌过程以进一步减少样品中的生物负荷。在一些实施方案中，灭菌过程。
41、可以是正好在包装组织样品之前或之后进行的最后灭菌过程。本文所用的“灭菌过程”可包括减少样品中的生物负荷的任何过程，但不需要使得样品完全无菌。0049某些示例的过程包括但不限于，辐照过程、电子束辐照过程、超临界二氧化碳灭菌过程和过乙酸处理过程。在各种实施方案中，这种过程可能损伤一些组织成分，且因此为了产生具有期望生物特性的组织，可能期望限制灭菌过程的时间或强度如，辐射剂量或PH。在某些实施方案中，向样品施加高静压以部分地减少生物负荷可因此减少用来实现期望的无菌性水平的随后灭菌过程的剂量。适当的灭菌过程包括但不限于，例如，SUN等的美国专利公布号2006/0073592A1；KEMP的美国专利号5。
42、,460,962；COOK等的美国专利公布号2008/0171092A1中描述的那些。0050实施例1组织生物负荷的减少0051使用猪皮。组织以带有完整毛发的全皮提供，或以与表皮和皮下脂肪层分离的真皮层提供。真皮层通过如下分离从真皮切下皮下脂肪和薄层12MM的真皮下部，并从真皮切下薄层0251MM的表皮和真皮上部。在分离真皮之前机械去除毛发。将两种样品类型预先冷冻，且为了增加分离的真皮组织中的生物负荷水平，将所有组织在冷藏条件下融化后一起全皮和分离的真皮储存数天。利用DENITMMAGICVAC食品包装设备FOODSAVERDEVICE单独包装每一片。将每一片密封在三个真空密封小袋中以防止猪组。
43、织暴露于加压器皿。以密封小袋中带有最少量的流体来密封样品，从而使包装物紧密地贴合样品。0052ELMHURSTRESEARCH，INCALBANY，NY制造的13升加压系统用于实验。该系统具有固定容积，并通过向器皿中泵入流体来施加压力。利用热电偶来测量温度，该热电偶从器皿的盖伸入加压腔中，以测量总流体压力BULKFLUIDPRESSURE。0053首先测试全皮和分离的真皮二者的小片运行1和运行2，然后将大的未除毛的片暴露于相同条件运行3和运行4。表1概述了这些条件。压力器皿不具有温度控制系统，所以最大温度主要依赖于开始温度和最大压力。压力增加的速率是以350PSI/秒的单速。在运行1和运行2后。
44、，通过肉眼和触摸来检查暴露于高静压的小组织片的明显降解迹象。没有观察到明显的降解迹象，所以在运行3和运行4中处理大组织片。0054说明书CN102470149A117/9页120055暴露后，将组织样品在冷藏条件110储存少于1周。提交全皮和分离的真皮的样品用于生物负荷测试。在PBS溶液中搅动样品以从样品提取细菌，将PBS溶液铺板到琼脂平板上并培养。计数细菌菌落。在暴露于高静压之前，对未处理组织的对照样品分离的真皮和全皮二者也进行相同的生物负荷测试。0056冷藏后，对一些剩余的分离的真皮组织样品也进行DSC。DSC利用1223MG样品在TA差示扫描量热仪TAINSTRUMENTS，NEWCAS。
45、TLE，DELAWARE上进行。0057生物负荷测试结果显示在图2A和2B。数据显示为以LOG10标度的每个组织样品的菌落形成单位CFU。结果显示至少对于未除毛组织减少1至3个LOG10，且对于分离的真皮组织减少4至5个LOG10。结果显示，较高压力和较长的压力保持时间与较低压力和较短时间相比更多地减少总生物负荷。0058在所测试的每种压力60KPSI和75KPSI，与分离的真皮组织相比，全皮组织存在细菌灭活减少。因此，对于真皮移植物，在高静压处理之前切割组织样品以去除非真皮组分可提供改进的生物负荷减少。0059在本研究中，对于测试的短时间段，灭活数据显示极好的结果。然而，处理的样品的DSC特。
46、性指示一些组织热损伤。例如，经受65KPSI持续5分钟或70KPSI持续10分钟的样品在DSC时具有指示高水平的变性胶原的热开始值。因此，进行实验以评定当控制处理温度时，高静压对去细胞化、融化或生物负荷减少的作用。0060实施例2处理温度的控制0061获得猪皮组织，如以上在实施例1中所述分离真皮组织。组织在使用前储存在80。然后在保持在7的对流培养箱中融化样品达36小时。将所有样品切成大约7CM7CM的方形片。利用DENITMMAGICVAC包装制备包装物以紧密地符合组织的尺寸。0062将组织样品单独放置在预先制备的包装物中。然后加入PBS几乎充满包装物平均至少50ML。在放置到包装物中之前，。
47、在使用前利用带搅动的真空强制VACUUMPULLDOWN将PBS除气数小时。当搅拌棒周围不再形成气泡时，认为除气完成。通过挤压包装物而从包装物去除尽可能多的气体，并以热封机密封包装物的开口端。0063使用冰来冷却高静压器皿。总共三次运行需要大约50磅的冰。在加压之前将冰加入器皿，在组织上方和下方都加冰。使用如实施例1所述的相同加压系统用于实施例2中所述的实验。0064表2概述了实施例2每次运行的条件。冰不是均等地使用的，因为担心较低温度时将会有器皿密封泄露。对低温下器皿完整性的信任越高，使用的冰越多。因此，每次运行的开始温度较低，因为使用较多的冰。0065说明书CN102470149A128/。
48、9页130066在施加高静压后，将组织在冷藏条件110下储存不多于24小时。为了控制在包装、处理和生物负荷测试之间的时间中PBS溶液对组织的作用，将未处理的对照样品保持在PBS中，并与处理过的样品一起测试。在高静压暴露后在无菌条件下切下样品，这可能影响生物负荷结果。细菌污染如在实验1中所述地评定。0067生物负荷测试如实施例1所述进行。生物负荷测试结果显示于图3。本研究中仅测试分离的真皮组织，且Y轴代表对数标度的CFU。生物负荷减少随着更长的保持时间和更高压力而提高。例如，运行1和运行3都以10分钟的保持时间进行，但运行3以较高压力进行，导致提高的生物负荷减少。此外，运行1和运行2都以50KP。
49、SI进行，但运行2进行较长时间，导致与运行1相比提高的生物负荷减少。0068图4是在本实验的三次运行和实施例1的四次运行期间压力相对温度的图示记录。在本实验中，样品温度不超过大约25。在实施例1中，样品温度超过35，对于较高压力甚至超过40。每条曲线顶部的水平区域是冷却平稳状态，可能是因为在高压保持步骤期间热传递至流体或从流体向器皿壁传递。高压器皿的钢壁开始时是室温，且取决于热梯度，器皿的大块钢壁提供了大块热槽SINK或热源SOURCE。实施例2也具有这些冷却平稳状态，但它们较不明显。0069还利用TA差示扫描量热仪对每个样品进行DSC测试。DSC结果显示在表3。还显示了对照，即未处理的真皮样品。相比于实施例1，实施例2中的样品未显示指示胶原变性的低的热开始值。相反，实施例2运行1至运行3的热开始值是大约5960，这与对照样品相似。因此，施加高静压同时控制样品温度有效减少样品生物负荷，而不导致明显的胶原变性。0070说明书CN102470149A139/9页14说明书CN102470149A141/4页15图1说明书附图CN102470149A152/4页16图2A图2B说明书附图CN102470149A163/4页17图3说明书附图CN102470149A174/4页18图4说明。