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1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201711002471.6 (22)申请日 2017.10.24 (71)申请人 武汉大学 地址 430072 湖北省武汉市武昌区珞珈山 武汉大学 (72)发明人 邓红兵 程谷 施晓文 杜予民 (74)专利代理机构 武汉科皓知识产权代理事务 所(特殊普通合伙) 42222 代理人 俞琳娟 (51)Int.Cl. A61L 27/38(2006.01) A61L 27/22(2006.01) A61L 27/20(2006.01) A61L 27/18(2006.01) A61L。
2、 27/50(2006.01) D04H 1/728(2012.01) D01D 5/00(2006.01) (54)发明名称 构建血管化组织工程骨膜的方法 (57)摘要 本发明提供了一种构建血管化组织工程骨 膜的方法， 其特征在于， 包括以下步骤： 步骤1.运 用静电纺丝方法制备高分子微/纳米纤维膜； 步 骤2.接种种子细胞至纳米纤维膜上， 在体外培养 并定向诱导一段时间； 步骤3.将体外定向诱导一 段时间后的种子细胞/纳米纤维膜复合体植入体 内， 经过一段时间的体内血管化后取出， 得到组 织工程骨膜。 本方法能有效减少自体组织的排斥 反应并大大增加组织工程骨膜的血管化程度， 并 且由于组织。
3、工程化骨膜提前在体内进行过血管 化， 这样， 就能缩短缺损处的血管与植入的组织 工程膜的血管的整合时间， 继而缩短骨缺损愈合 过程， 因而在创伤愈合和组织工程领域有非常广 阔的应用前景。 权利要求书1页 说明书5页 附图4页 CN 107648669 A 2018.02.02 CN 107648669 A 1.一种构建血管化组织工程骨膜的方法， 其特征在于， 包括以下步骤： 步骤1.运用静电纺丝方法制备高分子微/纳米纤维膜； 步骤2.接种种子细胞至纳米纤维膜上， 在体外培养并定向诱导一段时间； 步骤3.将体外定向诱导一段时间后的种子细胞/纳米纤维膜复合体植入体内， 经过一 段时间的体内血管化后。
4、取出， 得到组织工程骨膜。 2.根据权利要求1所述的构建血管化组织工程骨膜的方法， 其特征在于： 其中， 在步骤1中， 高分子微/纳米纤维膜的组分为： 一种或多种天然或人工合成高分子 材料。 3.根据权利要求2所述的构建血管化组织工程骨膜的方法， 其特征在于： 其中， 在步骤1中， 在高分子微/纳米纤维膜的组分为至少两种的情况下， 应至少包含一 种天然高分子材料和一种人工合成高分子材料， 并且所包含的所有高分子材料应能溶解于 同一种有机溶剂。 4.根据权利要求2所述的构建血管化组织工程骨膜的方法， 其特征在于： 其中， 在步骤1中， 高分子材料为丝素、 丝素蛋白、 胶原蛋白、 壳聚糖、 聚己内。
5、酯、 聚乳酸、 醋酸纤维素、 聚丙烯腈、 聚环氧乙烷、 聚苯乙烯、 聚苯胺、 聚乙烯吡咯烷酮中的任意一种。 5.根据权利要求1所述的构建血管化组织工程骨膜的方法， 其特征在于： 其中， 在步骤1中， 高分子微/纳米纤维膜的组分为丝素和聚已内酯。 6.根据权利要求5所述的构建血管化组织工程骨膜的方法， 其特征在于： 其中， 在步骤1中， 静电纺丝电压为1516kV， 以11.2mL/h的速度推进纺丝液， 与接收 器之间距离设定为1215cm， 纺丝温度为25， 相对湿度为4050。 7.根据权利要求1所述的构建血管化组织工程骨膜的方法， 其特征在于： 其中， 在步骤2中， 接种密度为1106/c。
6、m2， 然后将种子细胞置于5CO2， 37培养箱中 培养1周并行定向分化诱导。 8.根据权利要求5所述的构建血管化组织工程骨膜的方法， 其特征在于： 其中， 在步骤2中， 采用的种子细胞为骨髓基质干细胞、 脂肪干细胞、 牙髓干细胞、 成骨 细胞、 软骨细胞、 以及MC3T3-E1前成骨细胞中的任意一种或多种。 9.根据权利要求1所述的构建血管化组织工程骨膜的方法， 其特征在于： 其中， 在步骤3中， 体内移植方式包括皮下、 肌肉下、 以及腹腔植入中的任意一种。 10.根据权利要求1所述的构建血管化组织工程骨膜的方法， 其特征在于： 其中， 在步骤3中， 是将种子细胞/纳米纤维膜复合体植入动物皮。
7、下， 一个月后， 取出组 织工程化的纳米纤维膜。 权 利 要 求 书 1/1 页 2 CN 107648669 A 2 构建血管化组织工程骨膜的方法 技术领域 0001 本发明属于材料技术领域， 具体涉及一种构建血管化组织工程骨膜的方法。 技术背景 0002 颅颌面骨及四肢长骨易受外伤、 感染、 肿瘤及其他医源性因素造成大范围骨缺损 的发生。 传统治疗方法主要有自体骨移植、 同种异体骨移植和异体骨移植修复等， 但自体骨 来源有限、 增加额外创伤。 同种异体骨和异体骨同样来源有限、 生物活性差， 且存在免疫排 斥和传染疾病等缺陷， 限制了其临床广泛应用。 近年来， 骨组织工程的迅速发展为临床治疗。
8、 大范围骨缺损带来了希望。 0003 但是， 现有的骨组织工程支架着眼于构建三维支架修复骨缺损， 却忽略了用于修 复骨缺损的三维支架之上无血管化的骨膜覆盖。 而具备强大再生能力的骨膜中含有大量的 有助于骨修复和骨愈合的干细胞。 因此， 在构建三维支架的同时制备相应的组织工程骨膜 是成功修复骨缺损的关键所在。 0004 静电纺丝技术是一种新兴的、 可制备纳米到亚微米级纤维尺度生物支架的方法。 常规的静电纺丝装置包括喷射装置、 接收装置和高压电源。 在电场的作用下， 带电纺丝溶液 从喷丝口处喷出并最终形成纤维薄膜。 静电纺丝技术可用于制备包括有机、 无机和有机/无 机复合纳米纤维。 静电纺丝纤维的。
9、形态及分布与天然细胞外基质类似， 且孔隙率高、 比表面 积大， 在组织工程中具有良好的应用前景。 由于其具有操作简单、 成本低廉、 几乎可以在任 意基底上沉积、 适用性强以及组成和结构容易调控等优点而得到广泛的研究， 并成为最具 有应用前景的构筑功能性膜材料的制备技术之一。 近年来国内外学者们一直尝试运用静电 纺丝技术构建具备各种不同用途的纳米纤维膜。 但是运用静电纺丝技术构建组织工程骨膜 仅见较少文献报告， 而同时采用该技术构建血管化组织工程膜用于骨缺损修复还未见报 道。 本专业同行制备的静电纺丝纤维骨膜又没有经过充分的血管化处理， 植入到体内会遇 到排斥反应或供血不足造成组织工程膜不能很好。
10、的与机体融合、 发生坏死继而导致移植失 败。 0005 中国专利 “表面具有连续片层状微纳米结构的聚已内酯丝素蛋白电纺纤维膜及其 制备方法和应用” (公开号CN105421058A)公开了一种聚已内酯丝素电纺纤维膜的制备方 法。 具体步骤如下： (1)将丝素与聚己内酯混合溶于六氟异丙醇溶剂中， 在室温下充分搅拌 制成丝素/聚己内酯混和溶液； (2)运用静电纺丝方法将以上混合溶液制备成混纺纤维膜； (3)将混纺纤维膜置于真空干燥箱中真空干燥。 在氮气保护下， 与辛酸亚锡催化剂和聚己内 酯单体加热进行反应， 制备出表面具有连续片层状结构的微纳米丝素蛋白/聚己内酯纤维 膜。 该专利将丝素/聚已内酯纤。
11、维膜用于电池化工领域， 但是纤维膜的制备过程中不涉及到 交联工艺， 而未经过交联的丝素成分会被水溶解， 不利于组织工程骨膜在体内的存留。 0006 中国专利 “丝素蛋白双层仿骨膜材料的制备方法” (公开号CN105327401A)公开了 一种丝素蛋白双层仿骨膜材料的制备方法。 具体步骤如下： (1)制备外层纺丝液： 将丝素和 血管内皮生长因子混合搅拌后得到血管内皮生长因子/丝素外层纺丝液； (2)制备内层纺丝 说 明 书 1/5 页 3 CN 107648669 A 3 液： 以丝素为模板， 利用共沉淀法沉积纳米羟基磷灰石颗粒， 然后丝素/纳米颗粒加入到丝 素水溶液中搅拌得到内层纺丝液； (3。
12、)制备仿生骨膜： 静电纺丝法制备双层纳米纤维膜。 该 专利虽然也是通过静电纺丝构建丝素组织工程骨膜， 但是纯丝素膜韧性差， 受外力容易撕 裂。 而人体骨膜韧性较强， 能够抵抗较大张力。 另外， 纯丝素在体内降解时间短， 而骨缺损常 常需要三个月至半年时间才能完成修复过程。 这个期间， 纯丝素膜在体内早已降解， 不能发 挥骨膜的促骨组织形成作用。 因此， 纯丝素组织工程化骨膜并不能满足临床的需要。 0007 另外， 单纯的静电纺丝膜结构致密， 孔径一般是纳米级， 不利于微米级的血管内皮 细胞爬行进入膜的内 部 ， 这样就不能 进行有效地血管化过程。 该发明 (公开号 CN105327401A)使。
13、用的是血管内皮细胞生长因子来促进膜的血管化， 这也是一般的组织工 程常用的促支架血管化方法。 但是生长因子在体内存留时间短， 几天内即释放完毕。 而骨缺 损愈合过程一般要数月以上。 因此， 运用以上专利制备的血管化纤维膜不能满足临床需要。 发明内容 0008 本发明是为了解决上述问题而进行的， 目的在于提供一种构建血管化组织工程骨 膜的方法。 0009 本发明为了实现上述目的， 采用了以下方案： 0010 本发明提供一种构建血管化组织工程骨膜的方法， 其特征在于， 包括以下步骤： 步 骤1.运用静电纺丝方法制备高分子微/纳米纤维膜； 步骤2.接种种子细胞至纳米纤维膜上， 在体外培养并定向诱导一。
14、段时间； 步骤3.将体外定向诱导一段时间后的种子细胞/纳米纤 维膜复合体植入体内， 经过一段时间的体内血管化后取出， 得到组织工程骨膜。 0011 进一步地， 本发明提供的构建血管化组织工程骨膜的方法还可以具有以下特征： 在步骤1中， 高分子微/纳米纤维膜的组分为： 一种或多种天然或人工合成高分子材料。 0012 进一步地， 本发明提供的构建血管化组织工程骨膜的方法还可以具有以下特征： 在步骤1中， 在高分子微/纳米纤维膜的组分为至少两种的情况下， 应至少包含一种天然高 分子材料和一种人工合成高分子材料， 并且所包含的所有高分子材料应能溶解于同一种有 机溶剂。 0013 进一步地， 本发明提供。
15、的构建血管化组织工程骨膜的方法还可以具有以下特征： 在步骤1中， 高分子材料可以为丝素、 丝素蛋白、 胶原蛋白、 壳聚糖、 聚己内酯、 聚乳酸、 醋酸 纤维素、 聚丙烯腈、 聚环氧乙烷、 聚苯乙烯、 聚苯胺、 聚乙烯吡咯烷酮等。 可选用的溶剂包括 乙酸、 六氟异丙醇、 二氯甲烷、 三氯甲烷、 四氢呋喃、 三氟乙酸、 甲苯、 氯苯、 苯乙醚、 甲酸乙 酯、 乙酸乙酯、 N,N二甲基甲酰胺、 N,N-二甲基乙酰胺、 甲酸、 磷酸、 甲醇、 戊醇中的一种或多 种， 配置不同浓度(3-30)的纺丝液。 0014 进一步地， 本发明提供的构建血管化组织工程骨膜的方法还可以具有以下特征： 在步骤1中， 高。
16、分子微/纳米纤维膜的组分为丝素和聚已内酯。 0015 进一步地， 本发明提供的构建血管化组织工程骨膜的方法还可以具有以下特征： 在步骤1中， 静电纺丝电压为1516kV， 以11.2mL/h的速度推进纺丝液， 与接收器之间距 离设定为1215cm， 纺丝温度为25， 相对湿度为4050。 0016 进一步地， 本发明提供的构建血管化组织工程骨膜的方法还可以具有以下特征： 在步骤2中， 接种密度为1106/cm2， 然后将种子细胞置于5CO2， 37培养箱中培养1周并 说 明 书 2/5 页 4 CN 107648669 A 4 行定向分化诱导。 0017 进一步地， 本发明提供的构建血管化组织。
17、工程骨膜的方法还可以具有以下特征： 在步骤2中， 采用的种子细胞为骨髓基质干细胞、 脂肪干细胞、 牙髓干细胞、 成骨细胞、 软骨 细胞、 以及MC3T3-E1前成骨细胞等中的任意一种或多种。 可根据不同需要在纤维膜上接种 不同种类种子细胞， 例如， 要研究细胞的多向分化能力， 可以选择骨髓基质干细胞、 牙髓干 细胞和脂肪干细胞； 如果要研究组织工程化骨膜的成骨能力， 则可选择成骨细胞。 0018 进一步地， 本发明提供的构建血管化组织工程骨膜的方法还可以具有以下特征： 在步骤3中， 体内移植方式包括皮下、 肌肉下、 以及腹腔植入中的任意一种。 0019 进一步地， 本发明提供的构建血管化组织工。
18、程骨膜的方法还可以具有以下特征： 在步骤3中， 是将种子细胞/纳米纤维膜复合体植入动物皮下， 一个月后， 取出组织工程化的 纳米纤维膜。 0020 发明的作用与效果 0021 本发明运用自体血管化技术将静电纺丝膜植入自体皮下、 培养一段时间后再取 出， 这样得到血管化的组织工程骨膜能被机体充分血管化和自体化， 减少了自体组织的排 斥反应并大大增加了组织工程骨膜的血管化程度。 将血管化的组织工程骨膜覆盖至缺损处 来修复骨缺损， 由于组织工程化骨膜提前在体内进行过血管化， 这样， 就能缩短缺损处的血 管与植入的组织工程膜的血管的整合时间， 继而缩短骨缺损愈合过程。 由于方法简单、 并且 效果显著，。
19、 因此本方法所制备的血管化微/纳米纤维膜在创伤愈合和组织工程领域有非常 广阔的应用前景。 附图说明 0022 图1为本发明实施例一中将壳聚糖/醋酸纤维素纳米纤维膜植入小鼠背部皮下一 月后取出得到的壳聚糖/醋酸纤维素组织工程化骨膜的大体观察图； 0023 图2为本发明实施例二中醋酸/纤维素微/纳米纤维膜(CS/CA)与单纯的壳聚糖纳 米纤维膜(CS)的拉力对比图； 0024 图3为本发明实施例三中制备的丝素与聚已内酯比例为4:1的复合纳米纤维膜的 扫描电镜图； 0025 图4为本发明实施例三中丝素/聚已内酯纳米纤维膜(SF/PCL)与纯丝素膜(SF)的 拉力对比图； 0026 图5为本发明实施例。
20、三中的SF/PCL纳米纤维膜亲水性与纯PCL膜的对比图， 其中， (a)是SF/PCL纳米纤维膜在3s时候的接触角； (b)是纯PCL纳米纤维膜在3s时候的接触角； 0027 图6为本发明实施例三中的MC3T3-E1前成骨细胞在SF/PCL纳米纤维膜上的粘附及 生长情况的表面扫描电镜图； 0028 图7(a)为本发明实施例三中的有血管化组织工程骨膜覆盖的大鼠胫骨骨折愈合 过程图， 图7(b)为无人工骨膜覆盖的大鼠胫骨骨折愈合过程图； 0029 图8(a)为本发明实施例三中有血管化组织工程骨膜覆盖的大鼠胫骨骨折标本的 Masson染色图； 图8(b)为无人工骨膜覆盖的大鼠胫骨骨折标本Masson。
21、染色图。 具体实施方式 说 明 书 3/5 页 5 CN 107648669 A 5 0030 以下结合附图对本发明涉及的构建血管化组织工程骨膜的方法的具体实施方案 进行详细地说明。 0031 0032 步骤1.制备壳聚糖/醋酸纤维素纤维膜： 0033 将壳聚糖与醋酸纤维素(质量比2:1)溶解于二甲基乙酰胺和丙酮的混合溶剂中得 到8的复合纺丝液。 然后采用静电纺丝技术制备壳聚糖/醋酸纤维素复合纤维膜， 随后将 所得的壳聚糖/醋酸纤维素复合纤维膜在真空干燥箱中真空干燥24h， 使溶剂充分挥发； 静 电纺丝电压为16kV， 以1.2mL/h的速度推进纺丝液， 与接收器之间距离设定为12cm， 纺丝。
22、温 度为25， 相对湿度为40； 0034 100酒精浸泡30分钟， 95酒精浸泡5分钟， 90酒精浸泡5分钟， 85酒精浸泡5 分钟， 80酒精浸泡5分钟， 70酒精浸泡5分钟， 60酒精浸泡5分钟， 50酒精浸泡5分钟， 双蒸水浸泡10分钟； 0035 将纤维膜真空干燥， 紫外线照射消毒24h。 0036 步骤2.接种种子细胞及体外定向诱导： 0037 按照1106/cm2的密度在纤维膜上接种骨髓基质干细胞并置于5CO2， 37培养 箱中培养1周并行成骨诱导(含有10胎牛血清、 10mmol/L的 -甘油磷酸钠、 50 g/ L的抗坏 血酸、 10nmol/L的地塞米松的高糖DMEM培养基。
23、)， 得到种子细胞/纳米纤维膜复合体； 0038 步骤3.植入体内血管化： 0039 如图1所示， 将种子细胞/纳米纤维膜复合体植入小鼠背部皮下， 一月后， 取出组织 工程化的纳米纤维膜， 可见纳米纤维膜在动物体内没有引起明显的验证反应， 证明其生物 相容性良好。 0040 0041 步骤1.制备醋酸/纤维素微/纳米纤维膜： 0042 将醋酸纤维素溶解于丙酮和二甲基乙酰胺(质量比2:1)的混合溶液中， 得到 16wt的醋酸/纤维素混合溶液。 接着运用静电纺丝法制备醋酸/纤维素微/纳米纤维膜。 参 数设置： 温度为25， 相对湿度为50， 电压为16kV， 接收距离为15cm， 溶液流速为1mL。
24、/h； 0043 在60下真空干燥所制备的醋酸纤维素微/纳米纤维复合膜充分挥发残留溶剂； 将干燥后的微/纳米纤维膜置于0.05mol/L氢氧化钠溶液中水解7d， 室温晾干后紫外线照射 消毒24h； 如图2所示， 拉力测试显示醋酸/纤维素微/纳米纤维膜的拉力大于单纯的壳聚糖 纳米纤维膜； 证明运用本方法制备的纳米纤维膜机械性能良好。 0044 步骤2.接种种子细胞及体外定向诱导： 0045 按照1106/cm2的密度在纤维膜上接种MC3T3-E1前成骨细胞并置于5CO2， 37 培养箱中培养1周并行成骨诱导(含有10胎牛血清、 10mmol/L的 -甘油磷酸钠、 50 g/ L的 抗坏血酸、 1。
25、0nmol/L的地塞米松的高糖DMEM培养基)， 得到种子细胞/纳米纤维膜复合体； 0046 步骤3.植入体内血管化： 0047 将种子细胞/纳米纤维膜复合体植入动物皮下， 一月后， 取出组织工程化的纳米纤 维膜， 可见纤维膜在动物体内没有引起明显的验证反应， 证明其生物相容性良好。 0048 0049 步骤1.制备丝素/聚己内酯复合纳米纤维膜： 说 明 书 4/5 页 6 CN 107648669 A 6 0050 分别取一定量的丝素和聚己内酯溶解到六氟异丙醇中， 配制成质量分数为3的、 丝素与聚己内酯4:1的混合溶液； 接着用静电纺丝技术制备丝素/聚己内酯复合纳米纤维 膜， 参数设置： 温。
26、度为25， 相对湿度为40， 电压15kV， 接收距离为12cm， 溶液流速为1mL/ h； 0051 100酒精浸泡30分钟， 95酒精浸泡5分钟， 90酒精浸泡5分钟， 85酒精浸泡5 分钟， 80酒精浸泡5分钟， 70酒精浸泡5分钟， 60酒精浸泡5分钟， 50酒精浸泡5分钟， 双蒸水浸泡10分钟； 0052 将所得的丝素/聚己内酯复合纳米纤维膜在60下真空干燥， 紫外线照射消毒 24h； 如图3所示， 扫描电镜结果显示制备的丝素/聚己内酯复合纳米纤维膜具有均匀的纤维 直径和一定的孔隙率； 如图4所示， 拉力测试显示丝素/聚已内酯纳米纤维膜的拉力远大于 纯丝素膜， 证明运用本方法制备的纳。
27、米纤维膜的生物相容性以及机械性能良好； 如图5所 示， 亲水性结果显示丝素/聚己内酯纳米纤维膜在3s时候的亲水性明显优于纯聚己内酯膜。 0053 步骤2.接种种子细胞及体外定向诱导： 0054 按照1106/cm2的密度在纤维膜上接种骨髓基质干细胞并置于5CO2， 37培养 箱中培养1周并行成骨诱导(含有10胎牛血清、 10mmol/L的 -甘油磷酸钠、 50 g/ L的抗坏 血酸、 10nmol/L的地塞米松的高糖DMEM培养基)， 如图6所示， 扫描电镜显示细胞在丝素/聚 己内酯复合纳米纤维膜上生长良好。 0055 步骤3.植入体内血管化： 0056 将纤维膜植入动物皮下， 一月后， 取出。
28、组织工程化的纳米纤维膜， 可见纤维膜在动 物体内没有引起明显的验证反应， 证明其生物相容性良好。 0057 如图7和8所示， 用所得的SF/PCL纳米纤维膜覆盖到骨折断端处4周， 可见有SF/PCL 纳米纤维膜覆盖的骨折断端愈合良好， 无软骨骨痂的存在， 无纤维膜覆盖的骨折呈错位愈 合状态， 并且骨折断端处有较多的软骨骨痂。 证明血管化组织工程骨膜能够有效减少骨痂 的形成、 继而促进骨折愈合， 防止错位愈合。 0058 以上实施例仅仅是对本发明技术方案所做的举例说明。 本发明所涉及的构建血管 化组织工程骨膜的方法并不仅仅限定于在以上实施例中所描述的内容， 而是以权利要求所 限定的范围为准。 本发明所属领域技术人员在该实施例的基础上所做的任何修改或补充或 等效替换， 都在本发明的权利要求所要求保护的范围内。 说 明 书 5/5 页 7 CN 107648669 A 7 图1 图2 说 明 书 附 图 1/4 页 8 CN 107648669 A 8 图3 图4 说 明 书 附 图 2/4 页 9 CN 107648669 A 9 图5 图6 说 明 书 附 图 3/4 页 10 CN 107648669 A 10 图7 图8 说 明 书 附 图 4/4 页 11 CN 107648669 A 11 。