一种组合物凝胶与应用.pdf

本发明涉及一种组合物凝胶与应用，属于再生医学和生物医药领域。该组合物凝胶主要由生物可降解材料凝胶和干细胞组成。本发明的组合物凝胶具有降解周期持久、稳定性好、干细胞原料来源广泛的优点。

1.一种组合物凝胶，主要由生物可降解材料凝胶和干细胞组成，其特征在于，干细胞被生物可降解材料凝胶包裹，该组合物凝胶颗粒的直径在50-800μm。 2.根据权利要求1所述组合物凝胶，其特征在于，该组合物凝胶保存温度范围是2-25℃。 3.根据权利要求1所述组合物凝胶，其特征在于，所述的干细胞包括脐带间充质干细胞、脂肪干细胞、神经干细胞、真皮成纤维干细胞其中一种或多种。 4.根据权利要求3所述组合物凝胶，其特征在于，所述的干细胞的浓度为1.0×10个/ml～1.0×10个/ml。 5.根据权利要求4所述组合物凝胶，其特征在于，所述的干细胞来自自体、异体或异种。 6.根据权利要求1所述组合物凝胶，其特征在于，所述的生物可降解材料凝胶由下列生物可降解材料中的一种或多种构成：聚羧甲基纤维素、海藻酸盐、羟丙基甲基纤维素、羧甲基纤维素、乙基羟乙基纤维素、羟烷基纤维素、烷基纤维素、聚乳酸、微晶纤维素、聚乳酸-羟基乙酸、糊精、羟乙基淀粉、羟乙基壳聚糖、壳聚糖、透明质酸、胶原蛋白、明胶，以及透明质酸、胶原蛋白、明胶的衍生物。 7.根据权利要求6所述组合物凝胶，其特征在于，所述的生物可降解材料的浓度范围是5-150mg/ml。 8.如权利要求1-7任一项所述的组合物凝胶在美容、整形、抗衰、软骨修复、关节腔润滑、关节炎、溃疡、烧伤以及重大疑难疾病制剂中的应用。

技术领域

本发明涉及一种组合物凝胶与应用，特别涉及一种含干细胞和生物可降解材料凝胶的组合物凝胶及应用，属于再生医学和生物医药领域。

背景技术

间充质干细胞(MSC,mesenchymal stem cells)来源于发育早期的中胚层和外胚层的一类多能干细胞，能分化为细胞之间的间质组织而得名，具有多向分化潜能、造血支持和促进干细胞植入、免疫调控和自我复制等特点而日益受到人们的关注。间充质干细胞广泛分布于骨髓、骨膜、松骨质、脂肪、滑膜、骨骼肌、胎肝、乳牙、脐带、脐带血中，在体内或体外特定的诱导条件下，可分化为脂肪、骨、软骨、肌肉、肌腱、韧带、神经、肝、心肌、内皮等多种组织细胞，连续传代培养和冷冻保存后仍具有多向分化潜能，可作为理想的种子细胞用于衰老和病变引起的组织器官损伤修复。

在再生医学方面，利用间充质干细胞分化成为自身的组织，永久的存在，可起到长期塑形作用；能激活机体处于休眠状态下的各种干细胞群，以替代更新原有的因衰老或病理性等因素所造成组织细胞的衰退和老化，达到组织器官功能的恢复，增强组织器官的活性和原有的抗耐受力，改善因衰老等因素所造成的细胞与细胞间、细胞与细胞外基质间的信息传递，增强和加快各组织细胞的新老更替等作用，可以起到抗衰老、美容、除皱的作用。有关干细胞被用于整形美容方面已经有一些研究。中国专利CN200610152104.X公开了一种由细胞成分与透明质酸组成的注射用人体软组织填充剂及其制备方法，但是该填充剂中2.0-30毫克/毫升含量很少，很容易短时间内透明质酸被降解掉，而注射期初阶段面临细胞分泌一定量胶原太少起不到填充而产生填充失败的风险。中国专CN2014107181008公开了脂肪干细胞和透明质酸组成的医用组合物。作为塑形填充的组合物在体内体积应该保持稳定，才能起到塑形美容的效果，体积增大说明塑形失败或者注射存在很大的失败风险。

在一些疑难疾病治疗方面，干细胞被注入人体内，通过多功能活化细胞自我靶向性功能准确到达相应的受损器官和组织，以达到修复、替代衰老、病变的细胞，重建功能正常细胞和组织的目的，从而使疾病得到根本上的治疗。已有的研究发现报道，干细胞可以治疗一些重大疑难疾病，如癌症、糖尿病、白血病、肝肾功能衰竭、神经系统疾病，以及软骨损伤、关节炎的修复、关节腔的润滑等等。目前干细胞移植是直接移植干细胞，往往在体外获得足够数量和形态的干细胞后，一天甚至数小时之内必须植入到患者手中，否则干细胞会过度分化而老化，因此干细胞保存运输以及保存期限受到很大制约，无法产业化。

开发一种克服目前干细胞应用存在的问题的组合物凝胶十分必要。

发明内容

本发明提供一种组合物凝胶主要包括生物可降解材料凝胶和干细胞组成，干细胞被生物可降解材料凝胶包裹。

生物可降解材料凝胶在干细胞外围形成一层保护屏障，保护了干细胞生存微环境。

生物可降解材料凝胶包括自由凝胶和交联凝胶。自由凝胶是指将生物可降解材料溶解于生理盐水、注射用水或中性生理性等渗磷酸缓冲液中形成的凝胶，不含交联剂。交联凝胶是指在一定的条件下用交联剂交联之后，用生理盐水、注射用水或中性生理性等渗磷酸缓冲液洗脱至pH为中性的凝胶。中性生理性等渗磷酸缓冲液是指由Na2HPO4、NaH2PO4和NaCl组成或Na2HPO4、KH2PO4和NaCl组成构成的pH值为6.5-7.5、渗透压为280-320mOsmol/L溶液。交联度是指生物可降解材料单体结合一个交联剂分子的百分比，用生物可降解材料单体与交联剂的摩尔比计算。

组合物凝胶被植入体内后在填充区域体积维持一个平衡的状态，由干细胞的分化增殖弥补透明质酸被降解的空间，即组合物凝胶本身发生变化但在填充区域内组合物凝胶的体积大小保持恒定不变，随着高生物可降解材料逐渐被降解，而干细胞逐渐增殖分化形成新的组织，过程始终处于一个相对平衡或接近的状态，最终的结果是组合物凝胶中生物可降解材料被完全降解，被干细胞的增殖分化来形成新的组织所代替，从而起到永久性的塑形和填充作用，这样塑形和填充才能起到永久的美容。

本发明通过研究发现，通过组合物凝胶的颗粒大小、干细胞数量可以控制组合物凝胶的整体性能。

在维持组合物凝胶降解平衡的主要因素是组合物凝胶粒径大小。组合物凝胶在体内的降解与其粒径大小直接相关。但是，粒径的大小与注射时的推进力相关，而推进力大小会影响组合物凝胶注射时使用者的舒适度或者体验感：粒径越大，降解周期越长，推挤力越大，舒适度越差；粒径越小，降解周期越短，推挤力越小，舒适度越好。因此，需要在组合物凝胶粒径与降解性能之间寻求一个平衡，根据不同的用途，本发明组合物凝胶粒径范围是25-1200μm，也可以是30-1000μm或者35-800μm，还可以是40-700μm或者50-600μm，推荐范围是80-500μm或者100-400μm，优选120-350μm或者150-300μm，最佳粒径范围是160-250μm或者180-200μm。

影响组合物凝胶降解还与其生物可降解材料的分子量大小相关，一般通过交联来增大生物可降解材料的分子量，交联度是衍生物降解快慢的重要指标。交联度越大，说明交联越充分、降解周期越长；交联度越小，交联越少、降解周期越短。本发明一般选择大分子量的生物可降解材料，或者交联的生物可降解材料。本发明组合物凝胶的交联度范围是1％-25％，也可以是2％-20％或者3％-15％，也可以是5％-12％或者6％-10％，推荐7％-9％。

本发明组合物凝胶可以主要由生物可降解材料形成的自由凝胶和干细胞组成，也可以由生物可降解材料形成的交联凝胶和干细胞组成，还可以由生物可降解材料溶液、交联凝胶和干细胞组合而成。本发明中，交联凝胶与生物可降解材料溶液比例范围是1:49-49:1(W/W)，可以是1:24-24:1(W/W)或者1:9-9:1(W/W)，还可以是1:8-8:1(W/W)或者1:7-7:1(W/W)，推荐的范围是1:5-5:1(W/W)1:4-4:1(W/W)，优选的范围是1:3-3:1(W/W)或者3:7-7:3(W/W)，最优范围1:2-2:1(W/W)或者1:1-1:1.5(W/W)，其他是合适的比例符合本发明思想也属于本发明的发明范围。

在本发明中，组合物凝胶的生物可降解材料是由下列材料中的一种或多种组合构成：聚羧甲基纤维素、海藻酸盐、羟丙基甲基纤维素、羧甲基纤维素、乙基羟乙基纤维素、羟烷基纤维素、烷基纤维素、聚乳酸、微晶纤维素、聚乳酸-羟基乙酸、糊精、羟乙基淀粉、羟乙基壳聚糖、壳聚糖、透明质酸、胶原蛋白、明胶，以及透明质酸、胶原蛋白、明胶的衍生物，优选海藻酸盐、透明质酸钠及其衍生物、壳聚糖、胶原蛋白及其衍生物、羟乙基壳聚糖。本发明中，透明质酸平均分子量的范围是0.2-4.0MDa，也可以是0.4-3.0MDa或者0.5-2.0MDa，推荐可以是0.6-1.5MDa或者0.7-1.2MDa，优选0.8-1.1MDa或者0.9-1.0MDa。

在本发明中，组合物凝胶中的生物可降解材料的含量范围是5-150mg/ml，也可以是10-120mg/ml或者15-100mg/ml，还可以是20-80mg/ml或者25-70mg/ml，推荐30-60mg/ml或者35-55mg/ml，优选40-50mg/ml。

本发明中，组合物凝胶的干细胞包括脐带间充质干细胞、脂肪干细胞、神经干细胞、真皮成纤维干细胞其中一种或多种。由于脐带间充质干细胞原料供应比较充沛，优选脐带间充质干细胞，可以自制提取获得也可以是市场购得，具体本发明对此不作限定。干细胞有自我分化与增值的能力，因此，本发明的组合物凝胶的干细胞浓度为1.0×103个/ml～2.0×108个/ml，浓度也可以是2.0×103个/ml～1.0×108个/ml或者1.0×104个/ml～2.0×107个/ml，推荐的浓度是2.0×104个/ml～1.0×107个/ml或者1.0×105个/ml～2.0×106个/ml，优选的浓度是2.0×105个/ml～1.0×106个/ml。本发明发现为了维持一个持久的组合物凝胶，生物可降解材料与干细胞的配比有一个原则，即组合物凝胶粒径小，干细胞的浓度越高；生物可降解材料浓度越高，干细胞的浓度越低；组合物凝胶粒径大、生物可降解材料的浓度；生物可降解材料的交联度越高，干细胞的浓度越低。

本发明对于干细胞的来源可以来自自体、异体或异种，优选自体和异体来源的干细胞。含有干细胞的组织是从具有资质的医疗结构获得，选取肝炎、梅毒、艾滋病等传染病检测阴性且相关并发症，同时经得产妇知情同意并签署知情同意书。干细胞种子是从具有资质的机构或单位获得。

为了给干细胞提供一定的生产营养物质，本发明的组合物凝胶中，除了主要的干细胞、生物可降解凝胶之外，还可以天然生长因子、盐类、糖类、蛋白成分、核酸类、维生素、抗生素等成分，比如碱性成纤维细胞生长因子bFGF、表皮生长因子EGF、软骨素、L-谷氨酰胺、肝素钙、VC、VB、VE、胰岛素、庆大霉素，只要按此思路添加的成分以供干细胞生长增殖，都属于本发明的范畴。

本发明组合物凝胶的保存温度范围可以是2-30℃，也可以是4-25℃或者6-23℃，推荐温度范围是8-20℃，优选15-18℃。

本发明提供主要包括生物可降解材料和干细胞的组合物凝胶可以应用于美容、整形、抗衰、软骨修复、关节腔润滑、关节炎、溃疡、烧伤，以及癌症、糖尿病、白血病、肝肾功能衰竭、神经系统疾病(如帕金森、老年痴呆)等重大疑难疾病制剂中。

本发明的组合物凝胶具有降解周期持久、稳定性好、干细胞原料来源广泛的优点。

附图说明

附图1.组合物凝胶整体示意图，图中的1是组合物凝胶示意图，2是干细胞示意图，3是生物可降解材料凝胶。

实施例

实施例一、脐带间充质干细胞的制备

将新鲜脐带用生理盐水清洗脐带中血管中的血污；

将脐带组织剪碎成肉糜状后转移至50ml离心管中，每管30ml；

每管加入0.25％I胶原酶，重复混匀后，在37℃恒温震荡器内消化20min；

每管加入同体积的0.25％胰酶继续消化20min,直至肉眼看不见大的组织块时即可；

每管加入30ml含FBS的α-MEM中止消化，除去未消化的组织，加入3倍的PBS培养基，3000rpm/min离心3min弃去上清，收集细胞；

加入等体积的含FBS的α-MEM重悬细胞，并对细胞计数,计数后按3×105个接种至培养瓶中，37℃，5％CO2培养箱内培养；

多数细胞贴壁后，每3天半量更换培养液,弃去未贴壁细胞；

倒置相差显微镜下观察，细胞融合达到80％后，用0.25％的胰酶消化，按1:5的比例传代，继续扩增培养。

实施例二、脂肪干细胞的制备

无菌条件下将脂肪组织分装置50ml离心管中，每管30ml；

每管加入等体积的0.2％Ⅰ型胶原酶，充分混匀，转入恒温振荡器37℃处消化30min；

每管加入30ml的含FBS的α-MEM终止消化后，加入2倍体积PBS培养基，1500rpm/min离心5min，弃上清后加入PBS反复冲洗后，在DMEM培养液中重悬细胞；

接种至25mm培养皿中，置于37℃、体积分数为5％CO2培养箱中培养；

48h后首次半量换液，细胞生长至75％-90％融合时传代，每3天更换培养液；

弃去培养基，加入PBS溶液5ml，轻摇后弃去PBS溶液，重复一次；每平皿加入2mL 0.2％胰酶，把平皿移入培养箱37℃消化2min；

倒置显微镜下观察细胞，若胞质回缩，细胞之间不再连接成片，表明此时细胞消化适度，往平皿中加入2ml/瓶的含有血清的培养液以中止消化；

细胞悬液移入离心管，1500rpm/min离心5min，弃去上清液，加入2ml培养液，用滴管轻轻吹打细胞制成细胞悬液，对细胞计数，按1.0×106个/瓶，计算所需要培养瓶数量，向瓶中加入10ml新鲜培养基，将混匀的细胞悬液均分至每个细胞培养瓶中；

将培养瓶轻摇3次使细胞均匀分散，37℃、体积分数为5％CO2培养箱中培养。

备注：有关神经干细胞、真皮成纤维干细胞的制备方法，在此不作一一实例，关于干细胞的制备可以参考《干细胞实验指南》(裴雪涛.干细胞试验指南.北京:科学出版社,2006)、《人干细胞培养》(弗雷谢尼,章静波.人干细胞培养.北京:科学出版社,2009)。

实施例三、组合物凝胶性能

在本实验中，对比了本发明的不同组合物凝胶性能，生物可降解材料凝胶的溶剂是生理盐水，具体数据见表1。

表1.

从实验数据中可以看出，本发明的组合物凝胶，生物可降解材料浓度越大，组合物凝胶含干细胞越多。

实施例四、组合物凝胶性能

在本实验中，对比了本发明的不同组合物凝胶性能，生物可降解材料凝胶的溶剂为中性生理性等渗磷酸缓冲，具体数据见表2。

表2.

从实验数据中可以看出，本发明的组合物凝胶，生物可降解材料的交联度越小，组合物凝胶含干细胞越多。

实施例五、组合物凝胶性能

在本实验中，对比了由交联透明质酸与透明质酸溶液不同比例构成的组合物凝胶性能，生物可降解材料凝胶的溶剂为注射用水，具体数据见表3。

表3.

本实验的数据显示，生物可降解材料凝胶的交联度高且浓度越大的组合物凝胶，含干细胞越少；生物可降解材料凝胶的交联度越低且浓度越小的组合物凝胶，含干细胞越多。

实施例六、组合物凝胶降解性能和推挤力性能对比

在本实验中，对比了前面实施例中部分组合物凝胶和瑞蓝2号、乔登雅4号降解性能、推挤力，具体见表4。

降解性能：将1g的样品装入1ml离心管，离心甩平管内液面，然后向各管内加入25μl透明质酸酶溶液和25μl纤维素酶，使酶的作用总浓度是50IU/ml。以不加酶、其他操作保持一致的样品为对照品。37℃恒温48小时。反应后将各管倒立，将液态样品用纸吸收，测定残留在管底部的样品重量。将各试样的试验品以及对照品的样品重量测定结果以理论残留样品百分率(％)的计算。

推挤力：是通过一次性注射器带针头、在推挤速度12.5mm/min条件下测定的，测试是在23℃环境下进行；其中3-1、3-4、4-3、3-7、3-9、5-3、4-6、5-4、3-11等样品通过27G注射器针头，3-13、5-7、4-9、3-15、4-10、4-12等样品通过21G注射器针头，3-17、5-15、4-14、4-15、5-19、5-20等样品通过16G注射器针头。

表4.

编号 粒径(μm) 推挤力(N) 百分比(％) 3-1 25 9.5 73 3-4 40 10.1 74 4-3 80 12.4 78 3-7 100 11.3 76 3-9 150 11.4 77 5-3 180 12.8 78 4-6 200 12.8 82 5-4 200 14.5 80 3-11 200 13.7 80 3-13 300 10.5 83 5-7 300 12.8 84 4-9 350 10.7 86 3-15 400 11.2 86 4-10 400 12.4 88 4-12 500 15.7 89 3-17 600 11.2 87 5-15 600 11.5 87 4-14 700 12.7 89 4-15 800 13.2 91 5-19 1000 16.9 91 5-20 1200 19.3 90 瑞蓝2号 - 10.7 63 乔登雅4号 - 11.2 72

本实验的数据显示，粒径大、交联度高的组合物凝胶降解周期越长；粒径越大、交联度越高的组合物凝胶的推挤力越大。实验数据显示，本发明组合物凝胶的降解性能优秀。

实施例六、组合物凝胶的稳定性

在本实验中，对比了实施例五中组合物凝胶体积变化和干细胞变化。

体积变化和干细胞形态变化：将5g的样品装入15ml螺盖的离心管，1500rpm/min离心2min，记下体积V1；向各管内加入100μl含10％FBS的α-MEM培养液，37℃恒温15天，1500rpm/min离心2min，记下体积V2；同时对比培养前后干细胞的形态。

试验结果显示，本实验中所有组合物凝胶试验品的V2与V1一致或者V2略微小于V1，通过细胞观察培养前后干细胞形态，发现干细胞形态前后一致。试验结果说明本发明组合物凝胶稳定性性能优越。