相关申请交叉参考
[0001]本申请要求2006年8月2日提交的美国专利申请第 60/821,190号的优先权权益。该申请还与美国专利第5,874,500、 6,063,061、6,066,325、6,166,130和6,458,889号相关。这些提交文件 的内容各自通过引用结合到本文中。
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产生的发明权力的声明
[0002]不适用
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[0003]不适用
发明背景
[0004]在1992年11月10日颁布给Rhee等的美国专利第 5,162,430号中，有关于通过使胶原蛋白与合成亲水性聚合物例如聚乙 二醇的各种衍生物共价连接制备的胶原蛋白-合成聚合物缀合物的论 述。在1994年6月28日颁布给Rhee等的美国专利第5,324,775号中， 有关于与合成的非免疫原性亲水性聚乙二醇聚合物共价连接的各种 嵌入天然生物相容性聚合物(例如多糖)的论述。在1994年7月12日 颁布给Rhee等的美国专利第5,328,955号中，有关于各种活化形式的 聚乙二醇和可用于产生具有一定范围物理和化学性质的胶原蛋白-合 成聚合物缀合物的各种键的论述。
[0005]在1995年3月14日提交的顺序号08/403,358中，有关于 用疏水性交联剂或亲水性和疏水性交联剂的混合物制备的交联生物 材料组合物的论述。疏水性交联剂可包括任何含有或可通过化学衍生 化含有两个或多个琥珀酰亚胺基的疏水性聚合物。
[0006]在1996年12月3日颁布给Yeung等的美国专利第 5,580,923号中，有关于可用于防止手术粘连的组合物的论述，该组合 物含基体材料和防粘粘合剂，其中基体材料优选含胶原蛋白，优选该 粘合剂含至少一个组织活性官能团和至少一个基体活性官能团。
[0007]在1997年3月25日颁布给Rhee等的美国专利第 5,614,587号中，有关于生物粘附性组合物的论述，该组合物含用多官 能活化的合成亲水性聚合物交联的胶原蛋白，和用此类组合物完成第 一表面和第二表面之间粘合的方法，其中第一和第二表面中的至少一 个可为原生(native)组织表面。
[0008]在日本专利公布号07090241中有关于用于透镜材料短时 粘合以支持和使该材料安装在机械装置的组合物的论述，该组合物含 有平均分子量为1000-5000的聚乙二醇和平均分子量为 30,000-200,000的聚N-乙烯基吡咯烷酮的混合物。
[0009]West和Hubbell在Biomaterials(1995)16：1153-1156中论 述了用光聚合的聚乙二醇-乳酸共聚物二丙烯酸酯水凝胶和物理交联 聚乙二醇-聚丙二醇共聚物水凝胶泊洛沙姆防止术后粘连。
[0010]在美国专利第5,672,336和5,196,185号中有关于创伤敷料 的论述，该敷料含有0.5-2.0μm粒度的微粒纤维胶原。该组合物主要 包含水相，但不能形成本发明中所述水凝胶。在美国专利第5,698,213 号中有关于可用作吸收性外科手术装置和递药溶媒的交联脂族聚酯 水凝胶的论述。在美国专利第5,674,275号中有关于丙烯酸酯或异丁 烯酸酯基水凝胶粘合剂的论述。在美国专利第5,306,501号中有关于 可用作递药溶媒的聚氧化烯基热致可逆的水凝胶的论述。
[0011]在美国专利第4,925,677和5,041,292号中有关于含与多糖 或粘多糖交联的蛋白组分的可用作递药溶媒的水凝胶的论述。
[0012]在美国专利第5,384,333号和Jeong等(1997)″Nature，″ 388：860-862中有关于可生物降解的注射给药聚合物的论述。在美国专 利第4,925,677号中有关于用于控释递药的可生物降解水凝胶的论述。 在美国专利第4,347,234和4,291,013号中有关于基于可再吸收胶原蛋 白的递药系统的论述。在美国专利第5,300,494和4,946,870号中有关 于用于递药的氨基多糖基生物相容性膜的论述。在美国专利第 5,648,506号中有关于释放紫杉醇的水溶性载体的论述。
[0013]已有聚合物用作治疗药物的载体，实现局部释放和缓释 (Langer，et al.，Rev.Macro.Chem.Phys.，C23(1)，61，1983；Controlled Drug Delivery，Vol.I和II，Bruck，S.D.，(ed.)，CRC Press，Boca Raton， Fla.，1983；Leong et al.，Adv.Drug Delivery Review，1：199，1987)。这些 治疗药物释放系统类似于输注，提供增强疗效和减少全身毒性的潜 力。
[0014]提出的用于控释药物释放的其它类合成聚合物包括聚酯 (Pitt，et al.，Controlled Release of Bioactive Materials，R.Baker，Ed.， Academic Press，New York，1980)；聚酰胺(Sidman，et al.，Journal of Membrane Science，7：227，1979)；聚氨酯(Maser，et al.，Journal of Polymer Science，Polymer Symposium，66：259，1979)；聚原酸酯(Heller， et al.，Polymer Engineering Scient，21：727，1981)；和聚酸酐(Leong，et al.， Biomaterials，7：364，1986)。
[0015]在美国专利第5,428,024；5,352,715；和5,204,382号中有 关于通过机械破坏发生物理性质变化的含胶原蛋白的组合物的论述。 这些专利主要涉及纤维和不溶性胶原。在美国专利第4,803,075号中 有关于注射胶原蛋白组合物的论述。在美国专利第5,516,532号中有 关于骨/软骨注射组合物的论述。在WO 96/39159中有关于含5μm-850 μm粒度干燥粒子的胶原蛋白基释放基质的论述，其中干燥粒子可悬 浮于水并具有特定表面电荷密度。在美国专利第5,196,185号中有关 于粒度为1μm-50μm的胶原蛋白制剂的描述，该制剂可用作形成创 伤敷料的气溶胶喷雾剂。论述胶原蛋白组合物的其它专利包括美国专 利第5,672,336和5,356,614号。在WO 96/06883中有关于可交联并可 通过注射器注射的聚合物非易蚀性水凝胶的论述。
[0016]转让给本发明受让人的以下待审申请含相关主题内容： 1997年7月31日提交的美国专利申请顺序号08/903,674；1997年6 月18日提交的美国专利申请顺序号60/050,437；1996年8月27日提 交的美国专利申请顺序号08/704,852；1996年6月19日提交的美国 专利申请顺序号08/673,710；1996年2月20日提交的美国专利申请 顺序号60/011,898；1996年11月7日提交的美国专利申请顺序号 60/006,321；1996年11月7日提交的美国专利申请顺序号60/006,322； 1996年11月7日提交的美国专利申请顺序号60/006,324；和1995年 6月7日提交的美国专利申请顺序号08/481,712。这些申请各自通过 引用全文结合到本文中。以上文献和其中引用的刊物各自通过引用结 合到本文中。有多种适用于生物粘合剂的材料，用于组织增加、预防 外科手术粘连、在合成植入物表面涂层、用作递药基质、眼科应用等。 另外，在许多情况下，这些材料的凝结时间可能小于最佳时间，但对 于外科手术和其它医疗应用，通常优选快速起效材料。在其它情况下， 目前可得到的材料可显示某些外科手术应用不期望的溶胀性质。因 此，需要快速起效材料，作为例如止血和/或伤口密封用的组织密封剂 使用。还需要提供显示最小溶胀性质的材料。
发明概述
[0017]本发明提供在体内环境中实现止血或其它流体抑制的组 合物。本发明组合物含第一种和第二种交联性组分和至少一种水凝胶 形成组分，此类组合物适合涂覆在脊椎动物上以促使流体抑制。组合 物包括快速起效材料，用作例如用于止血和/或伤口密封应用的组织密 封剂。此类组合物显示最小熔胀性质。
[0018]在第一个方面，本发明实施方案提供包含以下组分的组合 物：第一种交联性组分、在能够反应的条件下与第一种交联性组分交 联的第二种交联性组分，和水凝胶形成组分。第一种交联性组分与第 二种交联性组分交联，形成具有空隙的多孔基质，而水凝胶形成组分 能够水合形成水凝胶，以填充至少一些空隙。在某些方面，水凝胶形 成组分的pH可影响形成密封剂基质屏障的反应时间。例如，在某些 实施方案中，提供含pH 6.75的水凝胶形成组分的组合物，该组合物 的反应时间比含pH 9.5的水凝胶形成组分的组合物慢。
[0019]第一种交联性组分可包含多个亲核性基团，而第二种交联 性组分可包含多个亲电基团。在某些方面，第一种交联性组分包含具 有m个亲核基团的多-亲核性聚环氧烷，第二种交联性组分包含具有n 个亲电基团的多-亲电性聚环氧烷，其中m和n各自大于或等于2，且 其中m+n大于或等于5。在某些方面，n为2，m大于或等于3。可将 多-亲核性聚环氧烷四官能活化。在某些方面，m为2，n大于或等于 3。可将多-亲电性聚环氧烷四官能活化。在某些情况下，多-亲核性聚 环氧烷和多-亲电性聚环氧烷均四官能活化。多-亲核性聚环氧烷可包 含2个或多个亲核基团例如NH2、-SH、-H、-PH2和/或-CO-NH-NH2。 在某些情况下，多-亲核性聚环氧烷包含2个或多个伯氨基。在某些情 况下，多-亲核性聚环氧烷包含2个或多个硫醇基。多-亲核性聚环氧 烷可以为聚乙二醇或其衍生物。在某些情况下，聚乙二醇包含2个或 多个亲核基团，它们可包括伯氨基和/或硫醇基。多-亲电性聚环氧烷 可包含2个或多个亲电基团例如-CO2N(COCH2)2、-CO2H、-CHO、 -CHOCH2、-N＝C＝O、-SO2CH＝CH2、-N(COCH)2和/或-S-S-(C5H4N)。 多-亲电性聚环氧烷可包含2个或多个琥珀酰亚胺基。多-亲电性聚环 氧烷可包含2个或多个马来酰亚胺基。在某些情况下，多-亲电性聚环 氧烷可为聚乙二醇或其衍生物。
[0020]在某些方面，组合物包含多糖或蛋白。多糖可为葡糖胺多 糖，例如透明质酸、甲壳质、硫酸软骨素A、硫酸软骨素B、硫酸软 骨素C、硫酸角蛋白、硫酸角质、肝素或其衍生物。蛋白可以为胶原 蛋白或其衍生物。多-亲核性聚环氧烷或多-亲电性聚环氧烷，或多-亲 核性聚环氧烷和多-亲电性聚环氧烷均可含连接基团。在某些情况下， 可通过下式给出多-亲核性聚环氧烷：聚合物-Q1-Xm。可通过下式给出 多-亲电性聚环氧烷：聚合物-Q2-Yn。X可为亲电基团，Y可为亲核基 团，m和n各自可为2-4，m+n可为≤5，Q1和Q2各自可为连接基团 例如-O-(CH2)n′-、-S-、-(CH2)n′-、-NH-(CH2)n′-、-O2C-NH-(CH2)n′-、 -O2C-(CH2)n′-、-O2C-CR1H和/或-O-R2-CO-NH。在某些情况下，n′可为 1-10，R1可为-H、-CH3或-C2H5，R2可为-CH2-或-CO-NH-CH2CH2-， Q1和Q2可相同或不同，或可不存在。在某些方面，Y可为 -CO2N(COCH2)2或-CO2N(COCH2)2。在某些情况下，多-亲核性聚环氧 烷或多-亲电性聚环氧烷，或多-亲核性聚环氧烷和多-亲电性聚环氧烷 都还包含可生物降解基团。可生物降解基团可为丙交酯、乙交酯、ε- 己内酯、聚(α-羟基酸)、聚(氨基酸)或聚(酐)。在某些方面，水凝胶形 成组分能够水化，形成包括明胶的生物相容性水凝胶片段，且当释放 至湿组织靶部位时吸收水。水凝胶可包含完全水化时大小为约0.01 mm-约5mm和约400％-约5000％的平衡溶胀的亚单位。在某些情况 下，水凝胶体内降解时间小于1年。在某些情况下，水凝胶至少部分 被含水介质水化并含活性剂，该活性剂可包括凝血药例如凝血酶。
[0021]在另一方面，本发明实施方案提供将活性剂释放至患者的 方法。该方法可包括给予患者靶部位一定量的本文中所述组合物。在 某些方面，实施方案包括将密封剂释放到患者的方法。该方法可包括 给予出血靶部位足以抑制出血的量的本文中所述组合物。在某些方 面，实施方案包括将凝血酶释放到患者的方法。该方法可包括给予出 血靶部位足以抑制出血的量的本文中所述组合物。
[0022]在还另一方面，本发明实施方案包括含多-亲核性聚环氧 烷、多-亲电性聚环氧烷和水凝胶形成组分的组合物。多-亲核性聚环 氧烷还可包含至少一个伯氨基和至少一个硫醇基。在能够反应的条件 下，多-亲核性聚环氧烷和多-亲电性聚环氧烷能够基本上立即交联。 实施方案包括组合物，其中多-亲核性聚环氧烷包含两个或多个硫醇 基，多-亲电性聚环氧烷包含两个或多个亲电基团例如琥珀酰亚胺基和 /或马来酰亚胺基。实施方案还包括组合物，其中多-亲核性聚环氧烷 包含两个或多个亲核基团例如伯氨基和/或硫醇基。多-亲电性聚环氧 烷可包含两个或多个琥珀酰亚胺基。在某些情况下，实施方案包括含 以下组分的组合物：具有两个或多个硫醇基的第一种聚乙二醇、具有 两个或多个琥珀酰亚胺基或马来酰亚胺基的第二种聚乙二醇，和水凝 胶形成组分。硫醇基和琥珀酰亚胺基或马来酰亚胺基的总数可至少为 5，在能够反应的条件下，第一种聚乙二醇和第二种聚乙二醇可能够 基本上立即交联。在某些情况下，第一种聚乙二醇含4个硫醇基，第 二种聚乙二醇含4个琥珀酰亚胺基。在某些情况下，组合物含蛋白质 或多糖。多糖可以是葡糖胺多糖，例如透明质酸、甲壳质、硫酸软骨 素A、硫酸软骨素B、硫酸软骨素C、硫酸角蛋白、硫酸角质、肝素 或其衍生物。蛋白质可以是胶原蛋白或其衍生物。
[0023]在另一个方面，本发明实施方案包括将组织道密封的方 法。该方法可包括用组合物至少部分填充组织道，该组合物含第一种 交联性组分、在能够反应的条件下与第一种交联性组分交联的第二种 交联性组分，和水凝胶形成组分。第一种和第二种交联性组分可交联 形成具有空隙的多孔性基质，而水凝胶形成组分可能够水化形成水凝 胶，填充至少一些空隙。在某些情况下，水凝胶含完全水化时大小约 0.05mm-约5mm和平衡溶胀为约400％-约1300％的亚单位，它们在 组织道中约1-约120天后降解。在某些情况下，第一种交联性组分含 多个亲核基团，第二种聚合物含多个亲电基团。
[0024]在还另一个方面，本发明实施方案包括在患者身体中靶部 位抑制出血的方法。该方法可包括将足以抑制出血的量的组合物释放 至靶部位，其中该组合物含第一种交联性组分、在能够反应的条件下 与第一种交联性组分交联的第二种交联性组分，和水凝胶形成组分。 第一种和第二种交联性组分可交联形成具有空隙的多孔基质，而水凝 胶形成组分能够水化形成水凝胶，填充至少一些空隙。当完全水化时， 水凝胶可含大小约0.05mm-约5mm的亚单位，其平衡溶胀为约400％ -约1300％，它们在组织道中约1-约120天后降解。第一种交联性组 分可包含多个亲核基团，第二种交联性组分可包含多个亲电基团。在 另一方面，本发明实施方案包括将生物活性物质释放至患者身体中靶 部位的方法。该方法可包括将组合物和生物活性物质联合释放至靶部 位，其中组合物含第一种交联性组分、在能够反应的条件下与第一种 交联性组分交联的第二种交联性组分，和水凝胶形成组分。第一种和 第二种交联性组分可交联形成具有空隙的多孔性基质，而水凝胶形成 组分能够水化形成水凝胶，填充至少一些空隙。当完全水化时，水凝 胶可含大小约0.05mm-约5mm的亚单位，平衡溶胀约400％-约 1300％，它们可在组织道中约1-约120天后降解。在某些情况下，第 一种交联性组分包含多个亲核基团，第二种交联性组分包含多个亲电 基团。生物活性物质可以是止血剂，例如凝血酶。
[0025]在另一方面，本发明实施方案包括将可溶胀组合物释放至 组织中的靶部位的方法。该方法可包括将组合物涂覆在靶部位上，其 中该组合物含第一种交联性组分、在能够反应的条件下与第一种交联 性组分交联的第二种交联性组分，和水凝胶形成组分。第一种和第二 种交联性组分可交联形成具有空隙的多孔基质，而水凝胶形成组分能 水化形成水凝胶，填充至少一些空隙。当完全水化时，水凝胶可含大 小约0.05mm-约5mm的亚单位，其平衡溶胀约400％-约1300％，它 们在组织道中约1-约120天后降解。当涂覆到其中其溶胀至平衡溶胀 值的靶部位后，组合物可在小于其平衡溶胀下水化。在某些方面，第 一种交联性组分含多个亲核基团，第二种交联性组分含多个亲电基 团。在某些方面，靶部位可在以下组织中：肌肉、皮肤、上皮组织、 平滑肌、骨骼肌或心肌、结缔或支持组织、神经组织、眼和其它感觉 器官组织、血管和心组织、肠胃器官和组织、胸膜和其它肺组织、肾、 内分泌腺、雄性和雌性生殖器官、脂肪组织、肝、胰腺、淋巴腺、软 骨、骨、口腔组织和粘膜组织，以及脾和其它腹部器官。在某些方面， 靶部位包括所选择的组织中空隙区域，例如组织皮层(divot)、组织道、 脊柱内空间或体腔。在某些情况下，水凝胶在平衡溶胀时的水化度为 水化50％-95％。在某些情况下，水凝胶含增塑剂例如聚乙二醇、山 梨醇或甘油。以水凝胶组分的组合物计，增塑剂可以0.1％-30％重量 存在。在某些情况下，水凝胶含交联蛋白水凝胶。该蛋白可包括明胶、 可溶性胶原蛋白、白蛋白、血红蛋白、纤维蛋白原(fibrogen)、纤维蛋 白、酪蛋白、纤连蛋白、弹性蛋白、角蛋白、层粘连蛋白及其衍生物 和组合。在某些情况下，水凝胶含交联多糖。多糖可含葡糖胺多糖、 淀粉衍生物、纤维素衍生物、半纤维素衍生物、木聚糖、琼脂糖、藻 酸酯(盐)，和壳聚糖及其组合。在某些情况下，水凝胶含交联非生物 聚合物。该交联非生物聚合物可含聚丙烯酸酯、聚异丁烯酸酯、聚丙 烯酰胺、聚乙烯树脂、聚丙交酯-乙交酯、聚己内酯、聚氧乙烯及其组 合。在某些情况下，水凝胶含至少两种成分，它们选自交联蛋白、交 联多糖和交联非生物聚合物。水凝胶可包括水凝胶聚合物和水凝胶交 联剂。水凝胶聚合物和水凝胶交联剂可在产生水凝胶聚合物分子交联 的条件下反应。在某些情况下，水凝胶含分子交联水凝胶聚合物，在 产生水凝胶聚合物分子交联的条件下通过辐照水凝胶制备该聚合物。 在某些情况，水凝胶包含分子交联水凝胶，通过在产生水凝胶聚合物 分子交联的条件下使单不饱和与多不饱和水凝胶单体反应制备该分 子交联水凝胶。
[0026]在再另一方面，本发明实施方案包括形成三维合成聚合物 基质的方法。该方法包括提供含m个亲核基团的第一种交联性组分和 含n个亲电基团的第二种交联性组分。使亲电基团与亲核基团反应， 在基团之间形成共价键，m和n各自大于或等于2，m+n大于或等于 5。该方法还包括使第一种交联性组分与第二种交联性组分组合，将 水凝胶形成组分加入到第一种交联性组分和第二种交联性组分，让第 一种交联性组分和第二种交联性组分互相交联，形成三维基质。该方 法也可包括使第一组织表面和第二表面与第一种交联性组分、第二种 交联性组分和水凝胶形成组分接触。在某些情况下，第二表面是原生 (native)组织表面。在某些情况下，第二表面是非原生组织表面，例如 合成植入物。合成植入物可以为供体角膜、人造血管、心脏瓣膜、人 造器官、粘合性假体、可移植微透镜(implantable lenticule)、血管移植 物、支架或支架/移植物组合。在某些情况下，将粉末形式的第一种交 联性组分、第二种交联性组分和水凝胶形成组分各自涂覆在第一组织 表面。在某些情况下，将第一种交联性组分、第二种交联性组分和水 凝胶形成组分各自以单一合并混合的粉末制剂的粉末涂覆在第一组 织表面。混合粉末制剂可含蛋白和/或多糖。第一组织表面可在硬组织 或软组织之上或之中。第一组织表面可包括手术部位周围或近邻。该 方法还可包括封闭手术部位。在某些情况下，混合粉末制剂含胶原蛋 白。在某些情况下，混合粉末制剂含生物活性剂。在某些方面，本发 明实施方案包括混合粉末组合物，该组合物含粉末形式的具有多个亲 核基团的第一种交联性组分、粉末形式的具有多个亲电基团的第二种 交联性组分，和粉末形式的水凝胶形成组分。在能够反应的条件下， 第一种和第二种交联性组分能够基本上立即交联。
[0027]在相关方面，加入到第二种交联性组分的第一种交联性组 分提供组合的交联性组分组合物。以组合的交联性组分组合物计，第 一种交联性组分可以约0.5％-约20％重量的浓度存在。在某些情况下， 以组合的交联性组分组合物计，第二种交联性组分可以约0.5％-约 20％重量的浓度存在。第一种交联性组分与第二种交联性组分的重量 比可为约45％-约55％。相关的，第一种交联性组分与第二种交联性 组分的重量比可为约50％。在某些情况下，第一种和第二种交联性组 分和水凝胶形成组分的重量比可为约28％-约42％w/w。相关的，第 一种和第二种交联性组分与水凝胶形成组分之间的重量比可为约 20％-约30％w/w。在某些方面，以组合的交联性组分组合物计，第一 种交联性组分可以约0.5％-约20％重量的浓度存在。相关的，以组合 的交联性组分组合物计，第二种交联性组分可以约0.5％-约20％重量 的浓度存在。第一种交联性组分与第二种交联性组分的重量比可为约 45％-约55％。类似的，第一种交联性组分与第二种交联性组分的重量 比可为约50％。
[0028]在另一方面，本发明实施方案提供密封剂基质组合物试剂 盒。试剂盒可包含例如容器和置于该容器内的混合粉末组合物。组合 物可包含具有多个亲核基团的第一种交联性组分和具有多个亲电基 团的第二种交联性组分。第一种交联性组分、第二种交联性组分或二 者均可以为粉末形式。试剂盒也可含粉末形式的水凝胶形成组分。在 能够反应的条件下，第一种和第二种交联性组分能够基本上立即交 联。在某些情况下，容器含注射器管和注射器柱塞。试剂盒也可含关 于将混合粉末组合物涂覆在患者出血靶部位的书面说明书。在某些情 况下，混合粉末含活性剂。活性剂可包括凝血酶。在另一方面，试剂 盒可含胶原海绵或其它合适的支持物，和固定在该海棉或支持物的表 面的混合粉末组合物。该组合物可含具有多个亲核基团的第一种交联 性组分和具有多个亲电基团的第二种交联性组分。第一种交联性组 分、第二种交联性组分或二者均可为粉末形式。试剂盒也可含粉末形 式的水凝胶形成组分。在能够反应的条件下，第一种和第二种交联性 组分能够基本上立即交联。
[0029]为更全面理解本发明性质和优点，应结合附图参考详述部 分。
[0030]本发明包括但不限于：
[0031]含以下组分的组合物：
第一种交联性组分；
在能够反应的条件下与第一种交联性组分交联的第二种交联性 组分；和
水凝胶形成组分；
其中第一种和第二种交联性组分交联形成具有空隙的多孔基质， 和其中水凝胶形成组分能够水化形成水凝胶，填充至少一些空隙。
[0032]第31段的组合物，其中第一种交联性组分含多个亲核基 团，第二种交联性组分含多个亲电基团。
[0033]第31段的组合物，其中第一种交联性组分含具有m个亲 核基团的多-亲核性聚环氧烷，第二种交联性组分含具有n个亲电基团 的多-亲电性聚环氧烷，其中m和n各自大于或等于2，和其中m+n 大于或等于5。
[0034]第33段的组合物，其中n为2，和其中m大于或等于3。
[0035]第34段的组合物，其中多-亲核性聚环氧烷被四官能活化。
[0036]第33段的组合物，其中m为2，和其中n大于或等于3。
[0037]第36段的组合物，其中多-亲电性聚环氧烷被四官能活化。
[0038]第33段的组合物，其中多-亲核性聚环氧烷和多-亲电性 聚环氧烷均被四官能活化。
[0039]第33段的组合物，其中多-亲核性聚环氧烷还含选自以下 的2个或多个亲核基团：NH2、-SH、-H、-PH2和-CO-NH-NH2。
[0040]第33段的组合物，其中多-亲核性聚环氧烷还含2个或多 个伯氨基。
[0041]第33段的组合物，其中多-亲核性聚环氧烷还含2个或多 个硫醇基。
[0042]第33段的组合物，其中多-亲核性聚环氧烷为聚乙二醇或 其衍生物。
[0043]第42段的组合物，其中聚乙二醇还含2个或多个亲核基 团，该亲核基团选自伯氨基和硫醇基。
[0044]第33段的组合物，其中多-亲电性聚环氧烷还含选自以下 的2个或多个亲电基团：CO2N(COCH2)2、-CO2H、-CHO、-CHOCH2、 -N＝C＝O、-SO2CH＝CH2、N(COCH)2和-S-S-(C5H4N)。
[0045]第33段的组合物，其中多-亲电性聚环氧烷还含2个或多 个琥珀酰亚胺基。
[0046]第33段的组合物，其中多-亲电性聚环氧烷还含2个或多 个马来酰亚胺基。
[0047]第33段的组合物，其中多-亲电性聚环氧烷是聚乙二醇或 其衍生物。
[0048]第33段的组合物，该组合物还包含多糖或蛋白。
[0049]第33段的组合物，该组合物还包含多糖，其中多糖为葡 糖胺多糖。
[0050]第49段的组合物，其中葡糖胺多糖选自透明质酸、甲壳 质、硫酸软骨素A、硫酸软骨素B、硫酸软骨素C、硫酸角蛋白、硫 酸角质、肝素及其衍生物。
[0051]第33段的组合物，该组合物还包含蛋白，其中蛋白为胶 原蛋白或其衍生物。
[0052]第33段的组合物，其中多-亲核性聚环氧烷或多-亲电性 聚环氧烷，或多-亲核性聚环氧烷和多-亲电性聚环氧烷两者还含连接 基团。
[0053]第33段的组合物，其中通过下式给出多-亲核性聚环氧烷：
聚合物-Q1-Xm
且其中通过下式给出多-亲电性聚环氧烷：
聚合物-Q2-Yn
其中X为亲电基团，Y为亲核基团；
其中m和n各自为2-4；
其中m+n≤5；
其中Q1和Q2各自为连接基团，该连接基团选自-O-(CH2)n′-、-S-、 -(CH2)n′-、NH-(CH2)n′-、-O2C-NH-(CH2)n′-、-O2C-(CH2)n′-、-O2C-CR1H 和-O-R2-CO-NH；
其中n′＝1-10；
其中R1＝-H、-CH3或-C2H5；
其中R2＝-CH2-或-CO-NH-CH2CH2-；和
其中Q1和Q2可相同或不同，或可不存在。
[0054]第53段的组合物，其中通过下式给出Y：
-CO2N(COCH2)2。
[0055]第53段的组合物，其中通过下式给出Y：
-N(COCH)2。
[0056]第33段的组合物，其中多-亲核性聚环氧烷或多-亲电性 聚环氧烷，或多-亲核性聚环氧烷和多-亲电性聚环氧烷两者还含可生 物降解基团。
[0057]第56段的组合物，其中可生物降解基团选自丙交酯、乙 交酯、ε-己内酯、聚(α-羟基酸)、聚(氨基酸)和聚(酐)。
[0058]第31段的组合物，其中水凝胶形成组分能够水化，形成 包括明胶的生物相容性水凝胶片段，当释放至湿组织靶部位时将吸收 水，其中该水凝胶含当完全水化时大小约0.01mm-约5mm的亚单位， 其平衡溶胀为约400％-约5000％。
[0059]第58段的组合物，其中水凝胶在体内的降解时间小于1 年。
[0060]第58和59段中任一段的组合物，其中至少部分水凝胶被 含活性剂的含水介质水化。
[0061]第60段的组合物，其中活性剂是凝血药。
[0062]第61段的组合物，其中凝血药是凝血酶。
[0063]将活性剂释放至患者的方法，该方法包括给予患者靶部位 一定量的第60段的组合物。
[0064]将密封剂释放至患者的方法，该方法包括给予出血靶部位 足以抑制出血的量的第31段的组合物。
[0065]将凝血酶释放至患者的方法，该方法包括给予出血靶部位 足以抑制出血的量的第62段的组合物。
[0066]含多-亲核性聚环氧烷、多-亲电性聚环氧烷和水凝胶形成 组分的组合物，其中多-亲核性聚环氧烷还含至少一个伯氨基和至少一 个硫醇基，且其中在能够反应的条件下，多-亲核性聚环氧烷和多-亲 电性聚环氧烷能够基本上立即交联。
[0067]含多-亲核性聚环氧烷、多-亲电性聚环氧烷和水凝胶形成 组分的组合物，其中多-亲核性聚环氧烷还含2个或多个硫醇基，多- 亲电性聚环氧烷还含2个或多个亲电基团，该亲电基团选自琥珀酰亚 胺基和马来酰亚胺基，且其中在能够反应的条件下，多-亲核性聚环氧 烷和多-亲电性聚环氧烷能够基本上立即交联。
[0068]一种组合物，该组合物含多-亲核性聚环氧烷、多-亲电性 聚环氧烷和水凝胶形成组分，其中多-亲核性聚环氧烷还含2个或多个 亲核基团，该亲核基团选自伯氨基和硫醇基，且多-亲电性聚环氧烷还 含2个或多个琥珀酰亚胺基，其中在能够反应的条件下，多-亲核性聚 环氧烷和多-亲电性聚环氧烷能够基本上立即交联。
[0069]一种组合物，该组合物含具有2个或多个硫醇基的第一种 聚乙二醇、具有2个或多个琥珀酰亚胺基或马来酰亚胺基的第二种聚 乙二醇，和水凝胶形成组分，其中硫醇基和琥珀酰亚胺基或马来酰亚 胺基的总数为至少5，且其中在能够反应的条件下，第一种聚乙二醇 和第二种聚乙二醇能够基本上立即交联。
[0070]第69段的组合物，其中第一种聚乙二醇还含4个硫醇基， 第二种聚乙二醇还含4个琥珀酰亚胺基。
[0071]第69段的组合物，该组合物还含蛋白或多糖。
[0072]第69段的组合物，该组合物还含多糖，其中多糖为葡糖 胺多糖。
[0073]第72段的组合物，其中葡糖胺多糖选自透明质酸、甲壳 质、硫酸软骨素A、硫酸软骨素B、硫酸软骨素C、硫酸角蛋白、硫 酸角质、肝素及其衍生物。
[0074]第69段的组合物，该组合物还含蛋白，其中蛋白为胶原 蛋白或其衍生物。
[0075]将组织道密封的方法，该方法包括用组合物至少部分填充 组织道，该组合物含：
第一种交联性组分；
在能够反应的条件下与第一种交联性组分交联的第二种交联性 组分；和
水凝胶形成组分；
其中第一种和第二种交联性组分交联形成具有空隙的多孔基质， 水凝胶形成组分能够水化形成水凝胶，填充至少一些空隙，水凝胶含 完全水化时具有大小约0.05mm-约5mm的亚单位，和平衡溶胀约 400％-约1300％，此类水凝胶在组织道中约1-约120天后降解。
[0076]第75段的方法，其中第一种交联性组分含多个亲核基团， 第二种聚合物含多个亲电基团。
[0077]抑制患者身体中靶部位出血的方法，该方法包括将足以抑 制出血的量的组合物释放至靶部位，该组合物含：
第一种交联性组分；
在能够反应的条件下与第一种交联性组分交联的第二种交联性 组分；和
水凝胶形成组分；
其中第一种和第二种交联性组分交联形成具有空隙的多孔性基 质，水凝胶形成组分能够水化形成水凝胶，填充至少一些空隙，水凝 胶含完全水化时具有大小约0.05mm-约5mm的亚单位，和平衡溶胀 约400％-约1300％，此类水凝胶在组织道中约1-约120天后降解。
[0078]第77段的方法，其中第一种交联性组分含多个亲核基团， 第二种交联性组分含多个亲电基团。
[0079]将生物活性物质释放至患者身体中靶部位的方法，该方法 包括将组合物和生物活性物质联合释放至靶部位，该组合物含：
第一种交联性组分；
在能够反应的条件下与第一种交联性组分交联的第二种交联性 组分；和
水凝胶形成组分；
其中第一种和第二种交联性组分交联形成具有空隙的多孔性基 质，水凝胶形成组分能够水化形成水凝胶，填充至少一些空隙，水凝 胶含完全水化时具有大小约0.05mm-约5mm的亚单位，和平衡溶胀 约400％-约1300％，此类水凝胶在组织道中约1-约120天后降解。
[0080]第79段的方法，其中第一种交联性组分含多个亲核基团， 第二种交联性组分含多个亲电基团。
[0081]第79段的方法，其中生物活性物质为止血药。
[0082]第79段的方法，其中生物活性物质为凝血酶。
[0083]将可溶胀组合物释放至组织中靶部位的方法，所述方法包 括将组合物涂覆到靶部位，该组合物含：
第一种交联性组分；
在能够反应的条件下与第一种交联性组分交联的第二种交联性 组分；和
水凝胶形成组分；
其中第一种和第二种交联性组分交联形成具有空隙的多孔性基 质，水凝胶形成组分能够水化形成水凝胶，填充至少一些空隙，水凝 胶含完全水化时具有大小约0.05mm-约5mm的亚单位，和平衡溶胀 约400％-约1300％，此类水凝胶在组织道中约1-约120天后降解， 当涂覆在其中其膨胀至平衡溶胀值的靶部位后，组合物在小于其平衡 溶胀时水化。
[0084]第83段的方法，其中第一种交联性组分含多个亲核基团， 第二种交联性组分含多个亲电基团。
[0085]第83段的方法，其中靶部位位于选自以下的组织中：肌 肉、皮肤、上皮组织、结缔或支持组织、神经组织、眼和其它感觉器 官组织、血管和心组织、肠胃器官和组织、胸膜和其它肺组织、肾、 内分泌腺、雄性和雌性生殖器官、脂肪组织、肝、胰腺、淋巴腺、软 骨、骨、口腔组织和粘膜组织，以及脾和其它腹部器官。
[0086]第85段的方法，其中靶部位是所选择的组织中的空隙区 域。
[0087]第86段的方法，其中空隙区域选自组织皮层、组织道、 脊柱内空间和体腔。
[0088]第83段的方法，其中平衡溶胀时水凝胶的水化度为水化 50％-95％。
[0089]第83段的方法，其中水凝胶含增塑剂。
[0090]第89段的方法，其中增塑剂选自聚乙二醇、山梨醇和甘 油。
[0091]第89段的方法，其中以水凝胶组分的组合物计，增塑剂 以0.1％-30％重量存在。
[0092]第75-91段中任一段的方法，其中水凝胶含交联蛋白水凝 胶。
[0093]第92段的方法，其中蛋白选自明胶、可溶性胶原蛋白、 白蛋白、血红蛋白、纤维蛋白原、纤维蛋白、酪蛋白、纤连蛋白、弹 性蛋白、角蛋白、层粘连蛋白及其衍生物和组合。
[0094]第75-91段中任一段的方法，其中水凝胶含交联多糖。
[0095]第94段的方法，其中多糖选自葡糖胺多糖、淀粉衍生物、 纤维素衍生物、半纤维素衍生物、木聚糖、琼脂糖、藻酸酯(盐)，和 壳聚糖及其组合。
[0096]第75-91段中任一段的方法，其中水凝胶含交联非生物聚 合物。
[0097]第96段的方法，其中交联非生物聚合物选自聚丙烯酸酯、 聚异丁烯酸酯、聚丙烯酰胺、聚乙烯树脂、聚丙交酯-乙交酯、聚己内 酯、聚氧乙烯及其组合。
[0098]第75-91段中任一段的方法，其中水凝胶含至少两种组分， 这些组分选自交联蛋白、交联多糖和交联非生物聚合物。
[0099]第75-91段中任一段的方法，其中水凝胶含水凝胶聚合物 和水凝胶交联剂，其中使水凝胶聚合物和水凝胶交联剂在产生水凝胶 聚合物分子交联的条件下反应。
[0100]第75-91段中任一段的方法，其中水凝胶含分子交联水凝 胶聚合物，通过在产生水凝胶聚合物分子交联的条件下辐照水凝胶制 备该分子交联水凝胶聚合物。
[0101]第75-91段中任一段的方法，其中水凝胶含分子交联水凝 胶，通过在产生水凝胶聚合物分子交联的条件下使单不饱和与多不饱 和水凝胶单体反应制备该分子交联水凝胶。
[0102]形成三维合成聚合物基质的方法，该方法包括以下步骤：
提供含m个亲核基团的第一种交联性组分和含n个亲电基团的第 二种交联性组分，其中亲电基团与亲核基团反应，在它们之间形成共 价键，其中m和n各自大于或等于2，且其中m+n大于或等于5；
将第一种交联性组分与第二种交联性组分组合；
将水凝胶形成组分加入到第一种交联性组分和第二种交联性组 分中；
让第一种交联性组分和第二种交联性组分相互交联，形成三维基 质。
[0103]第102段的方法，该方法还包括使第一组织表面和第二表 面与第一种交联性组分、第二种交联性组分和水凝胶形成组分接触。
[0104]第103段的方法，其中第二表面是原生组织表面。
[0105]第103段的方法，其中第二表面是非原生组织表面。
[0106]第105段的方法，其中非原生组织表面是合成植入物。
[0107]第106段的方法，其中合成植入物选自供体角膜、人造血 管、心脏瓣膜、人造器官、粘合性假体、可移植微透镜、血管移植物、 支架和支架/移植物组合。
[0108]第102段的方法，其中将第一种交联性组分、第二种交联 性组分和水凝胶形成组分各自以粉末形式涂覆在第一组织表面。
[0109]第102段的方法，其中将第一种交联性组分、第二种交联 性组分和水凝胶形成组分各自以单一合并混合的粉末制剂的粉末涂 覆在第一组织表面。
[0110]第109段的方法，其中混合粉末制剂还含蛋白或多糖。
[0111]第102段的方法，其中第一组织表面在硬组织或软组织上 或其中。
[0112]第102段的方法，其中第一组织表面包含、围绕或与手术 部位相邻，且其中该方法还包括将手术部位封闭的步骤。
[0113]第102段的方法，其中混合粉末制剂还含胶原蛋白。
[0114]第102段的方法，其中混合粉末制剂还含生物活性剂。
[0115]含以下组分的混合粉末组合物：
含多个亲核基团的第一种交联性组分，第一种交联性组分为粉末 形式；
含多个亲电基团的第二种交联性组分，第二种交联性组分为粉末 形式；和
粉末形式的水凝胶形成组分；
其中在能够反应的条件下，第一种和第二种交联性组分能够基本 上立即交联。
[0116]第115段的混合粉末组合物，其中加入第二种交联性组分 中的第一种交联性组分提供组合的交联性组分组合物，且以组合的交 联性组分组合物计，第一种交联性组分以约0.5％-约20％重量的浓度 存在。
[0117]第115段的混合粉末组合物，其中加入第二种交联性组分 中的第一种交联性组分提供组合的交联性组分组合物，且以组合的交 联性组分组合物计，第二种交联性组分以约0.5％-约20％重量的浓度 存在。
[0118]第115段的混合粉末组合物，其中第一种交联性组分与第 二种交联性组分的重量比为约45％-约55％。
[0119]第115段的混合粉末组合物，其中第一种交联性组分与第 二种交联性组分的重量比为约50％。
[0120]第115段的混合粉末组合物，其中第一种和第二种交联性 组分和水凝胶形成组分之间的重量比为约28％-约42％w/w。
[0121]第115段的混合粉末组合物，其中第一种和第二种交联性 组分和水凝胶形成组分之间的重量比为约20％-约30％w/w。
[0122]第121段的混合粉末组合物，其中加入第二种交联性组分 中的第一种交联性组分提供组合的交联性组分组合物，且以组合的交 联性组分组合物计，第一种交联性组分以约0.5％-约20％重量的浓度 存在。
[0123]第121段的混合粉末组合物，其中加入第二种交联性组分 中的第一种交联性组分提供组合的交联性组分组合物，且以组合的交 联性组分组合物计，第二种交联性组分以约0.5％-约20％重量的浓度 存在。
[0124]第121段的混合粉末组合物，其中第一种交联性组分与第 二种交联性组分的重量比为约45％-约55％。
[0125]第121段的混合粉末组合物，其中第一种交联性组分与第 二种交联性组分的重量比为约50％。
[0126]一种试剂盒，该试剂盒含：
容器；和
置于该容器中的混合粉末组合物，该组合物含：
含多个亲核基团的第一种交联性组分，第一种交联性组分为粉末 形式；
含多个亲电基团的第二种交联性组分，第二种交联性组分为粉末 形式；和
粉末形式的水凝胶形成组分；
其中在能够反应的条件下，第一种和第二种交联性组分能够基本 上立即交联。
[0127]第126段的试剂盒，其中容器中含有注射器管和注射器柱 塞。
[0128]第126段的试剂盒，该试剂盒还含有有关将混合粉末组合 物涂覆在患者出血靶部位的书面说明书。
[0129]第126段的试剂盒，其中混合粉末还含有活性剂。
[0130]第129段的试剂盒，其中活性剂包括凝血酶。
[0131]一种试剂盒，该试剂盒含有：
胶原海绵；和
固定在该海绵表面的混合粉末组合物，该混合粉末组合物含：
含多个亲核基团的第一种交联性组分，第一种交联性组分为粉末 形式；
含多个亲电基团的第二种交联性组分，第二种交联性组分为粉末 形式；和
粉末形式的水凝胶形成组分；
其中在能够反应的条件下，第一种和第二种交联性组分能够基本 上立即交联。
[0132]一种用于制备药物的组合物，该组合物含：
第一种交联性组分；
在能够反应的条件下与第一种交联性组分交联的第二种交联性 组分；和
水凝胶形成组分；
其中第一种和第二种交联性组分交联，形成具有空隙的多孔基 质，且其中水凝胶形成组分能够水化形成水凝胶，填充至少一些空隙。
[0133]第132段的组合物，其中第一种交联性组分含有多个亲核 基团，第二种交联性组分含有多个亲电基团。
[0134]第133段的组合物，其中第一种交联性组分含有具有m 个亲核基团的多-亲核性聚环氧烷，第二种交联性组分含有具有n个亲 电基团的多-亲电性聚环氧烷，其中m和n各自大于或等于2，且其中 m+n大于或等于5。
[0135]第134段的组合物，其中n为2，且其中m大于或等于3。
[0136]第135段的组合物，其中多-亲核性聚环氧烷被四官能活 化。
[0137]第134段的组合物，其中m为2，且其中n大于或等于3。
[0138]第137段的组合物，其中多-亲电性聚环氧烷被四官能活 化。
[0139]第134段的组合物，其中多-亲核性聚环氧烷和多-亲电性 聚环氧烷均被四官能活化。
[0140]第134段的组合物，其中多-亲核性聚环氧烷还含有2个 或多个亲核基团，这些亲核基团选自NH2、-SH、-H、-PH2和 -CO-NH-NH2。
[0141]第134段的组合物，其中多-亲核性聚环氧烷还含有2个 或多个伯氨基。
[0142]一种组合物，该组合物含：
含原生胶原纤维的胶原海绵；和
固定在海绵表面的混合粉末组合物，该混合粉末组合物含：
含多个亲核基团的第一种交联性组分，第一种交联性组分为粉末 形式并占混合粉末约10％；
含多个亲电基团的第二种交联性组分，第二种交联性组分为粉末 形式并占混合粉末约10％；和
粉末形式的水凝胶形成组分，其占混合粉末约80％；
其中在能够反应的条件下，第一种和第二种交联性组分能够基本 上立即交联，形成具有空隙的多孔基质，水凝胶形成组分能够水化形 成水凝胶，填充至少一些空隙。
附图简述
[0143]图1阐明本发明某些实施方案的第一种交联性组分。
[0144]图2阐明本发明某些实施方案的第二种交联性组分。
[0145]图3显示由本发明某些实施方案的亲水性聚合物形成交 联的基质组合物。
[0146]图4显示由本发明某些实施方案的疏水性聚合物形成交 联的基质组合物。
[0147]图5阐明本发明某些实施方案的水凝胶形成组分亚单位。
[0148]图6阐明交联的聚合物凝胶片段的溶胀百分率与固体百 分率之间的相关性，该聚合物凝胶片段在本发明某些实施方案的密封 剂组合物中可用作水凝胶形成组分。
[0149]图7A-E阐明根据本发明的实施方案，施用密封剂基质组 合物来处理脾动脉穿刺。
[0150]图8A-E阐明根据本发明的实施方案，施用密封剂基质组 合物来处理肝切除。
[0151]图9阐明根据本发明实施方案的密封剂基质组合物的处 理和包装。
[0152]图10阐明根据本发明实施方案的密封剂基质组合物的处 理和包装。
[0153]图11阐明根据本发明的实施方案，PEG浓度对凝胶强度 的影响。
[0154]图12阐明根据本发明的实施方案，PEG浓度对溶胀率的 影响。
[0155]图13阐明根据本发明的实施方案，PEG浓度对溶胀率的 影响。
[0156]图14阐明根据本发明的实施方案，PEG浓度对溶胀率的 影响。
发明详述
[0157]按照某些实施方案，本发明提供干燥密封剂基质组合物， 该组合物通过密封组织裂口或缺损在体内环境中实现止血或其它流 体抑制。本发明某些实施方案的组合物包括适合涂覆在脊椎动物组织 以促进流体抑制的干燥组合物，该组合物含第一种和第二种交联性组 分和至少一种水凝胶形成组分。本发明组合物中的第一种和第二种组 分在体内环境下反应形成交联基质，而水凝胶形成组分快速吸收到达 组织裂口的生物液，并强化得到的由第一种和第二种组分交联形成的 物理性密封剂基质屏障。本申请中所述“密封剂基质组合物”可指涂覆 在体内组织部位前的本发明组合物，“密封剂基质屏障”可指本发明组 合物与生物液接触后产生的基质屏障，和第一种和第二种组分交联形 成含水凝胶的多孔交联基质。可制备多种形式的密封剂基质组合物， 包括粉末、饼状物、垫状物等。饼状物实施方案包括通过加热或烘干 形成聚集体的密封剂基质组合物粉末样品。垫状物实施方案包括置于 海绵例如胶原海绵或其它支持物的密封剂基质组合物粉末样品，然后 将该海绵或支持物烘干，形成熔合到海绵或支持物的固化粉末。
[0158]尽管本发明可用于含有非血液生物液(例如淋巴或脊髓 液)，但由本发明某些实施方案中的组合物形成的密封剂基质也可称为 “止血基质”，因为这是本文中所述主要用途。
[0159]除提供快速止血和具有与周围组织高粘着力的屏障外，本 发明某些实施方案的密封剂基质比已公开的用于止血材料有几个优 点。首先，可在组织裂口的相当潮湿环境(例如动脉出血的快速渗出或 喷射，例如内器官的摩擦或剧烈创伤)下，使用本发明某些实施方案的 密封剂基质。相比之下，目前已上市的许多用于止血的组合物需要相 对干燥的部位，方可适当的粘着组合物和维持止血。例如，在某些情 况下，可将某些PEG混合物置于快速出血部位，但有可能它们可被洗 去。同样，在某些情况下，某些明胶组合物可在快速出血部位水化， 但可能难以使它们保留在该部位。有利的是，发现含第一种交联性组 分、第二种交联性组分和水凝胶形成组分的制剂可提供甚至在能够反 应的条件下保持固定不动的材料，该材料与大量出血形成机械稳定的 凝块样物质，使血液停止流出。其次，本发明某些实施方案的密封剂 基质通过物理性密封组织裂口起作用，而不依赖脊椎动物的任何内源 性凝血能力。因此，密封剂基质可用于它们的血液中具有低纤维蛋白 原浓度的脊椎动物，或甚至可用于不含纤维蛋白原的血液替代品。例 如，当第一种和第二种交联性组分与水凝胶形成组分组合并涂覆在出 血表面时，交联性组分和水凝胶形成组分可发生协同相互作用。按照 某些实施方案，在水凝胶形成组分的存在下，第一种和第二种交联性 组分可在出血靶部位反应并交联，形成相对刚性结构。相关的，水凝 胶形成组分可填充在该相对刚性结构中，介导物理性密封的形成。
[0160]按照本发明某些实施方案，可在第一种和第二种交联性组 分不交联的条件下(即缺乏水分、适当pH、温度等)，通过使第一种交 联性组分与第二种交联性组分和水凝胶形成组分混合，制备密封剂基 质组合物。与生物液接触后，或在其它能够反应的条件下，交联性第 一种和第二种组分交联形成具有空隙的多孔基质，而水凝胶形成组分 水化形成水凝胶，填充至少一些空隙。任选，交联性组分还可与水凝 胶-形成组分和/或周围组织交联。
I.密封剂基质交联性组分
[0161]通常，第一种交联性组分含两个或多个亲核基团，第二种 交联性组分含能够与第一种交联性组分上的亲核基团共价结合的两 个或多个亲电基团。第一种和第二种组分可交联形成多孔基质。在美 国专利号5,874,500；6,166,130；6,312,725；，6,328,229；和6,458,889 中有关于示例性第一种和第二种组分和多孔基质的描述，它们的内容 通过引用结合到本文中。
[0162]通常选择非免疫原性的第一种和第二种组分，因此，在开 始治疗前可不需“皮试”。另外，可选择这些组分和水凝胶形成组分阻 止通过基体金属蛋白酶(例如胶原酶)进行酶切割，提供比现有胶原蛋 白组合物更长体内持续期。或者，可选择在伤口愈合期间可消除或再 吸收的第一种和第二种组分和水凝胶形成组分，以避免在体内的密封 剂基质的周围形成纤维组织。
[0163]在一个实施方案中，第一种组分可以是含多个亲核基团 (以下由″X ″代表)的合成聚合物，该聚合物可与含多个亲电基团(以下 由″Y″代表)的第二种组分合成聚合物反应，得到如下共价结合聚合物 网络：
聚合物-Xm+聚合物-Yn→聚合物-Z-聚合物
其中m≥2，n≥2，且m+n≥5；
X＝-NH2、-SH、-OH、-PH2、-CO-NH-NH2等，且可相同或不同；
Y＝-CO2N(COCH2)2、-CO2H、-CHO、-CHOCH2、-N＝C＝O、 SO2CH＝CH2、-N(COCH)2)、-S-S-(C5H4N)等，且可相同或不同；和
Z＝由亲核基团(X)和亲电基团(Y)结合形成的官能团
[0164]如上所述，X和Y可相同或不同，即第一种组分可具有 两个不同亲核基团和/或第二种组分可具有两个不同亲电基团。图1说 明示例性第一种组分聚合物或第一种交联性组分。图2说明示例性第 二种组分聚合物或第二种交联性组分。
[0165]第一种和第二种组分聚合物的骨架可为环氧烷，尤其是环 氧乙烷、环氧丙烷及其混合物。可由下式代表双官能环氧烷的实例：
X-聚合物-X Y-聚合物-Y
其中X和Y定义同上，术语“聚合物”代表-(CH2CH2O)n-或 -(CH(CH3)CH2O)n-或-(CH2CH2O)n-(CH(CH3)CH2O)n-。
[0166]官能团X或Y通常通过连接基团(以下由″Q″代表)与聚合 物骨架偶联，已知或可能存在多种此类连接基团。尽管本发明组分具 有两个或多个官能团，但为简化缘故，以下实例显示仅一个官能团和 得到的交联。有多种方法制备各种官能化聚合物，以下列出它们中的 一些：
聚合物-Q1-X+聚合物-Q2-Y→聚合物-Q1-Z-Q2-聚合物
其中
在各情况下，n＝1-10；
R1＝H、CH3、C2H5，...CpH2p+1；
R2＝CH2、CO-NH-CH2CH2；
Q1和Q2可相同或不同。
[0167]例如，当Q2＝OCH2CH2(在该情况下Q1不存在)；Y＝ -CO2N(COCH2)2；和X＝-NH2、-SH或-OH，得到的反应物和Z基团 如下所示：
聚合物-NH2+聚合物-OCH2CH2CO2-N(COCH2)2→ -NH-OCH2CH2CO-聚合物(酰胺)
聚合物-SH+聚合物-OCH2CH2CO2-N(COCH2)2→ -S-OCH2CH2CO-聚合物(硫代酸酯)
聚合物-OH+聚合物-OCH2CH2CO2-N(COCH2)2→ -O-OCH2CH2CO-聚合物(酯)
[0168]可在聚合物和连接基团之间插入由以下″D″代表的另一个 基团，使交联聚合物组合物体内降解增加，例如用于递药应用：
聚合物-D-Q-X+聚合物-D-Q-Y→聚合物-D-Q-Z-Q-D-聚合物-
[0169]某些可用的可生物降解基团″D″包括丙交酯、乙交酯、ε- 己内酯、聚(α-羟基酸)、聚(氨基酸)、聚(酐)，和各种二或三肽。
A.具有聚合物骨架的第一种和第二种组分
[0170]如上所述，为制备本发明组合物，提供含两个或多个亲核 基团例如伯氨基或硫醇基的第一种组分聚合物，和含能够与第一种组 分聚合物上的亲核基团共价结合的两个或多个亲电基团的第二种组 分聚合物是有用的。第一种和第二种组分聚合物可为合成物。
[0171]与第一种和第二种组分聚合物使用有关的术语“聚合物” 尤其是指聚烷基类；二-、三-、寡-和聚氨基酸；和三-、寡-或多糖。
[0172]与第一种和第二种组分聚合物使用有关的术语“合成聚合 物”包括非天然和通过化学合成制备的聚合物。因此，可不包括天然蛋 白例如胶原蛋白和天然多糖例如透明质酸。包括合成胶原蛋白和合成 透明质酸及其衍生物。含亲核或亲电基团的合成聚合物包括“多官能活 化的合成聚合物”。术语“多官能活化的”(或简称“活化”)可指具有或通 过化学修饰后具有两个或多个亲核或亲电基团的合成聚合物，这些基 团能够相互反应(即亲核基团与亲电基团反应)形成共价键。多官能活 化的合成聚合物的类型包括双官能活化、四官能活化的和星形支化聚 合物。
[0173]可用于本发明的多官能活化的合成聚合物通常含至少2 个或至少3个官能团，以便与含多个亲核基团的合成聚合物(即“多-亲 核性聚合物”)形成3维交联网络。换言之，它们通常是至少二官能、 三官能或四官能活化的。如果第一种合成聚合物是双官能活化合成聚 合物，则第二种合成聚合物通常含3个或多个官能团，以得到3维交 联网络。第一种和第二种组分聚合物均可含至少3个官能团。
B.第一种组分聚合物
[0174]含多个亲核基团的第一种组分聚合物又指本文中统称的 “多-亲核性聚合物”。为用于本发明，多亲核性聚合物通常含至少2个 或至少3个亲核基团。如果使用仅含两个亲核基团的合成聚合物，则 通常使用含3个或多个亲电基团的合成聚合物，以得到3维交联网络。
[0175]用于本发明组合物和方法的多-亲核性聚合物包括合成聚 合物，该聚合物含或通过修饰后含多个亲核基团例如伯氨基和硫醇 基。此类多亲核性聚合物可包括：(i)合成含两个或多个伯氨基或硫醇 基的合成多肽；和(ii)经修饰含两个或多个伯氨基或硫醇基的聚乙二 醇。一般而言，硫醇基与亲电基团反应速度倾向于比伯氨基与亲电基 团反应慢。
[0176]多-亲核性多肽可以是合成多肽，合成该多肽以加入含伯 氨基的氨基酸(例如赖氨酸)和/或含硫醇基的氨基酸(例如半胱氨酸)。 例如，第一种组分聚合物可以是二聚赖氨酸、三聚赖氨酸、四聚赖氨 酸、五聚赖氨酸，或二聚半胱氨酸、三聚半胱氨酸、四聚半胱氨酸、 五聚半胱氨酸，或含两个或多个赖氨酸或半胱氨酸和其它氨基酸(例如 甘氨酸、丙氨酸)，优选含非疏水性氨基酸的低聚肽或多肽。通常使用 合成制备的赖氨酸赖氨酸的聚合物-聚(赖氨酸)(145MW)。制备了在任 何位置具有6-约4,000个伯氨基，相应分子量约870-约580,000的聚 (赖氨酸)。可从Peninsula Laboratories，Inc.(Belmont，Calif.)购得各种分 子量的聚(赖氨酸)。
[0177]可按照例如在Poly(ethylene Glycol)Chemistry： Biotechnical and Biomedical Applications，第22章J.Milton Harris，ed.， Plenum Press，N.Y.(1992)中提出的方法，将聚乙二醇化学修饰以使含 多个伯氨基或硫醇基。修饰的含两个或多个伯氨基的聚乙二醇在本文 中称为“多氨基PEGs”。修饰的含两个或多个硫醇基的聚乙二醇在本文 中称为“多硫醇基PEGs”。本文中使用的术语“聚乙二醇”包括修饰和衍 生化的聚乙二醇。
[0178]可从Shearwater Polymers(Huntsville，Ala.)和Texaco Chemical Company(Houston，Tex.)购得名为″Jeffamine″的各种形式的 多氨基PEG。可用于本发明的多氨基PEGs包括Texaco′s Jeffamine二 胺(″D″系列)和三胺(″T″系列)，它们的每个分子分别含2和3个伯氨基。
[0179]聚胺例如乙二胺(H2N-CH2CH2-NH2)、1，4-丁二胺 (H2N-(CH2)4-NH2)、1，5-戊二胺(尸胺)(H2N-(CH2)5-NH2)、1，6-己二胺 (H2N-(CH2)6-NH2)、双(2-羟乙基)胺(HN-(CH2CH2OH)2)、双(2)氨基乙 基)胺(HN-(CH2CH2NH2)2)和三(2-氨基乙基)胺(N-(CH2CH2NH2)3)也可 用作含多个亲核基团的第一种组分合成聚合物。
C.第二种组分聚合物
[0180]含多个亲电基团的第二种组分聚合物在本文中又称为“多 -亲电性聚合物”。为用于本发明，多-亲电性聚合物通常含至少2个或 至少3个亲电基团，以便与多-亲核性聚合物形成3维交联网络。
[0181]用于本发明组合物的多-亲电性聚合物可以是含两个或多 个琥珀酰亚胺基的聚合物，该琥珀酰亚胺基能够与其它分子上的亲核 基团形成共价键。琥珀酰亚胺基与含伯氨基(-NH2)的物质例如多氨基 PEG、聚(赖氨酸)或胶原蛋白极易反应。琥珀酰亚胺基有些不易与含 硫醇基(-SH)的物质例如多硫醇PEG或含多个半胱氨酸残基的合成多 肽反应。
[0182]本文中使用的术语“含两个或多个琥珀酰亚胺基”将包括 市售含两个或多个琥珀酰亚胺基的聚合物和通过化学衍生化后含两 个或多个琥珀酰亚胺基的那些聚合物。本文中使用的术语“琥珀酰亚胺 基”将包括磺基琥珀酰亚胺基和“上位”琥珀酰亚胺基的其它此类变化 形式。磺基琥珀酰亚胺基上的亚硫酸钠部分的存在用于增加聚合物的 溶解性。
D.用作第一种或第二种组分骨架的亲水性聚合物
[0183]按照本发明某些实施方案，亲水性聚合物和尤其是各种聚 乙二醇可用于第一种和第二种组分聚合物骨架。本文中使用的术语 ″PEG″包括具有重复结构(OCH2CH2)n的聚合物。
[0184]PEG的四官能活化的形式的结构如图3所示，它是通过使 四官能活化的PEG与多氨基PEG反应得到的普通反应产物。如该图 所示，琥珀酰亚胺基是由-N(COCH2)2代表的5元环结构。在图3中， 符号ΛΛΛ代表开放键。
[0185]实施方案包括使本文中称为SG-PEG的四官能活化的 PEG琥珀酰亚胺基戊二酸酯与多氨基PEG反应，从而得到反应产物。 PEG的另一种活化形式称为PEG琥珀酰亚胺基丙酸酯(SE-PEG)。实 施方案包括四官能活化的SE-PEG和通过使其与多氨基PEG反应得到 的产物。在某些实施方案中，在PEG的任一一端上有3个重复CH2基团。进一步的实施方案包括含不易水解的“醚”键的缀合物。该缀合 物与图3中所示其中提供酯键的缀合物截然不同。酯键在生理环境下 水解。本发明实施方案考虑聚乙二醇的其它官能活化形式，如通过使 四官能活化的PEGs与多氨基PEG反应形成的缀合物。在某些实施方 案中，缀合物含醚和酰胺键两者。这些键在生理环境下稳定。
[0186]PEG的另一种官能活化形式称为PEG琥珀酰亚胺基琥珀 酰胺(succinimidyl succinamide)(SSA-PEG)。实施方案包括该化合物的 四官能活化的形式和通过使其与多氨基PEG反应得到的反应产物。这 些化合物和相关化合物也可用于本发明实施方案中的组合物。实施方 案还包括含“酰胺”键的缀合物，如同前述醚键，“酰胺”键不易水解， 因此比酯键更稳定。在称为PEG琥珀酰亚胺基碳酸酯(SC-PEG)的化 合物实施方案中，提供还另一种活化形式的PEG。实施方案包括四官 能活化的SC-PEG和通过使其与多氨基PEG反应形成的缀合物。
[0187]如上所述，用于本发明实施方案的活化聚乙二醇衍生物可 含作为活性基团的琥珀酰亚胺基。但是，不同活化基团可连接在沿 PEG分子长度的部位。例如可将PEG衍生化，形成官能活化的PEG 丙醛(propion aldehyde)(A-PEG)。实施方案包括四官能活化形式和由 A-PEG与多氨基PEG反应形成的缀合物。键可称为-(CH2)m-NH-键， 其中m＝1-10。
[0188]再另一种形式的活化聚乙二醇是官能活化PEG缩水甘油 醚(E-PEG)。实施方案包括四官能活化的化合物和由该化合物与多氨 基PEG反应形成的缀合物。聚乙二醇的另一种活化衍生物是官能活化 PEG-异氰酸酯(I-PEG)。实施方案包括由这种化合物与多氨基PEG反 应形成的缀合物。聚乙二醇的另一种活化衍生物是官能活化PEG-乙 烯砜(V-PEG)。实施方案包括由这种化合物与多氨基PEG反应形成的 缀合物。
[0189]用于本发明组合物和其它实施方案的多官能活化聚乙二 醇可包括含琥珀酰亚胺基的聚乙二醇例如SG-PEG和SE-PEG，它们 可以是三官能或四官能活化的形式。现可从Shearwater Polymers， Huntsville，Ala.和Union Carbide，Soutb Charleston，W.Va.购得上述多 种活化形式的聚乙二醇。
E.将第一种和第二种组分聚合物衍生化以含官能团
[0190]可将某些聚合物例如多元酸衍生化，使其含2个或多个官 能团例如琥珀酰亚胺基。用于本发明的多元酸包括但不限于三羟甲基 丙烷-基三羧酸、二(三羟甲基丙烷)-基四羧酸、庚二酸、辛二酸(辛二 酸)和十六碳二酸(它普酸)。可从DuPont Chemical Company购得多种 此类多酸。
[0191]按照通用方法，可通过在N，N′-二环己基碳二亚胺(DCC) 的存在下与适当摩尔量的N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)反应，将多元酸化 学衍生化，使其含2个或多个琥珀酰亚胺基。
[0192]可用美国专利申请顺序号08/403,358中所述各种方法，将 多元醇例如三羟甲基丙烷和二(三羟甲基丙烷)转化为羧酸，然后在 DCC的存在下通过与NHS反应进一步衍生化，分别得到三官能和四 官能活化的聚合物。通过加入琥珀酰亚胺基将多元酸例如庚二酸 (HOOC-(CH2)2-COOH)、辛二酸(HOOC-(CH2)2-COOH)和十六碳二酸 (HOOC-(CH2)14-COOH)衍生化，得到二官能活化聚合物。
[0193]可将多胺例如乙二胺(H2N-CH2CH2-NH2)、1，4-丁二胺 (H2N-(CH2)4-NH2)、1，5-戊二胺(尸胺)(H2N-(CH2)5-NH2)、1，6-己二胺 (H2N-(CH2)6-NH2)、二(2-羟乙基)胺(HN-(CH2CH2OH)2)、二(2)胺基乙 基)胺(HN-(CH2CH2NH2)2)和三(2-胺基乙基)胺(N-(CH2CH2NH2)3)化学 衍生化为多元酸，然后可按美国专利申请顺序号08/403,358所述，在 DCC的存在下通过与适当摩尔量的N-羟基琥珀酰亚胺反应，将其衍 生化，以使含2个或多个琥珀酰亚胺基。可从DuPont Chemical Company购得多种此类多胺。
[0194]在某些实施方案中，以总交联性组分组合物计，第一种交 联性组分(例如多氨基PEG)以约0.5-约20％重量的浓度存在，以总交 联性组分组合物计，第二种交联性组分以约0.5-约20％重量的浓度存 在。例如，具有总重1克(1000毫克)的最终交联性组分组合物可含约 5-约200毫克第一种交联性组分(例如多氨基PEG)和约5-约200毫克 第二种交联性组分。
[0195]在某些实施方案中，第一种交联性组分与第二种交联性组 分的重量比为约20％-约80％。在有关实施方案中，该比例为约45％- 约55％。在某些情况下，该比例为约50％。按照凝胶强度试验确定重 量比。第一种交联性组分和第二种交联性组分的分子量可相同。
II.用于密封剂基质组合物的水凝胶形成组分
[0196]用于本发明的水凝胶形成组分可包括美国专利号 4,640,834；5,209,776；5,292,362；5,714,370；6,063,061；和6,066,325 中所述可再吸收的生物相容性分子交联凝胶和水凝胶，这些专利通过 引用结合到本文中。可从Baxter Healthcare Corporation以商品名 FLOSEAL购得通过这些专利所述技术制备的材料，这些材料和凝血 酶溶液混合在一起置于试剂盒用作止血药物。或者，任何可水化的交 联聚合物可用作本发明中的水凝胶形成组分。例如，可使用藻酸盐 (酯)、琼脂糖、明胶(例如SURGIFOAMTM粉末)或其它合成碳水化合物 或蛋白基能水化的交联聚合物。有用的水凝胶形成组分的主要特性是 流体的生物相容性、快速吸收和滞留。因此，尽管聚丙烯酰胺可用作 本发明中的水凝胶形成组分，但较少优选它，因为它在许多内部应用 中生物相容性差。通常，用作水凝胶形成组分的能水化的交联聚合物 具有粒度约70-约300微米和pH约6.8-约9.5。水凝胶形成组分可为 第一种和第二种交联性组分提供机械稳定性，尤其当对密封剂基质施 加力、压力或稀释时。
[0197]在某些实施方案中，第一种和第二种交联性组分和水凝胶 形成组分之间的重量比例为约28％-约42％w/w。在某些情况下，组 合物可含占组合物总质量约5％-约75％浓度的混合的第一种和第二 种交联性组分，和占组合物总质量约95％-约25％浓度的水凝胶形成 组分。相关的，组合物可含占组合物总质量约5％-约40％浓度的混合 的第一种和第二种交联性组分，和占组合物总质量约95％-约60％浓 度的水凝胶形成组分。类似的，组合物可含占组合物总质量约10％- 约30％浓度的混合的第一种和第二种交联性组分，和占组合物总质量 约90％-约70％浓度的水凝胶形成组分。例如，组合物可含约20％混 合的第一种和第二种交联性组分和约80％水凝胶形成组分。在某些实 施方案中，混合的第一种和第二种交联性组分组合物可具有固定的重 量比50∶50％，混合的第一种和第二种交联性组分组合物与水凝胶形成 组分的w/w比例可为约20％-约30％。可基于凝胶强度/粘着试验选择 混合的第一种和第二种交联性组分组合物与水凝胶形成组分的w/w 比例。水凝胶形成组分可用作吸收剂，以为第一种与第二种交联性组 分聚合提供半干燥表面。本发明实施方案包括干燥密封剂基质组合物 试剂盒，该试剂盒含这些比例量的交联性组分和水凝胶形成组分。
[0198]按照某些实施方案，术语“生物相容性”是指符合由国际标 准化组织(NAMSA，Northwood，Ohio)公布的标准#ISO 10993-1标准的 材料。按照某些实施方案，术语“可再吸收”是指当直接置于患者体内 的靶部位(且不受移植装置例如乳腺移植物保护)在小于1年通常1- 120天期间降解或溶解的组合物。已知测量再吸收和降解的方法。按 照某些实施方案，术语“分子交联”是指含聚合物分子(即单条链)的材 料，这些聚合物分子通过由元素、基团或化合物组成的桥连接，其中 聚合物分子的骨架原子通过一级化学键连接。如同以下更详细的描述 那样，可通过多种方式实现交联。
[0199]按照某些实施方案，术语“水凝胶”包括含单相含水胶体的 组合物，其中以下更详细定义的生物或非生物性聚合物吸收水或水性 缓冲液。水凝胶可含多个子网络，其中各子网络是分子交联水凝胶， 该水凝胶的大小取决于水化度，且在上述范围内。通常，这些水凝胶 几乎不含或不含游离水，即不能通过简单过滤将水凝胶中的水除去。
[0200]“溶胀百分率”可定义为湿重减去干重除以干重并乘以 100，其中通过例如过滤将材料表面的湿润剂尽可能完全除去后测量 湿重，且其中在暴露于升高的温度下在足以将湿润剂蒸发的时间内例 如在120℃下2小时后测量干重。
[0201]“平衡溶胀”可定义为当可水化的交联聚合物材料浸泡在湿 润剂中保持足以使水含量变恒定的时间通常18-24小时后达到平衡的 溶胀百分率。
[0202]“靶部位”通常是预定的将密封剂基质组合物释放的位置， 通常为组织裂口或缺损。通常，靶部位为目标组织位置，但在某些情 况中例如当材料原位溶胀覆盖目标位置时，可给予或将密封剂基质组 合物分配至目标位置附近的位置。
[0203]可由生物和非生物聚合物形成可用作至少某些本发明实 施方案中的水凝胶形成组分的可水化交联聚合物。合适的生物聚合物 含蛋白例如明胶、可溶性胶原蛋白、白蛋白、血红蛋白、酪蛋白、纤 维蛋白原、纤维蛋白、纤连蛋白、弹性蛋白、角蛋白、层粘连蛋白及 其衍生物和组合。可溶性非纤维胶原同样合适。示例性明胶制剂列举 如下。其它合适的生物聚合物包括多糖例如葡糖胺多糖(例如透明质酸 和硫酸软骨素)、淀粉衍生物、木聚糖、纤维素衍生物、半纤维素衍生 物、琼脂糖、藻酸盐(酯)、壳聚糖及其衍生物和组合。可通过以下两 种机理中任一选择可降解的合适的非生物聚合物：即(1)聚合物骨架断 裂，或(2)导致水溶性的侧链降解。示例性非生物聚合物包括合成物， 例如聚丙烯酸酯、聚异丁烯酸酯、聚丙烯酰胺、聚乙烯树脂、聚丙交 酯-乙交酯、聚己内酯、聚氧乙烯及其衍生物和组合。
[0204]可按适合形成含水水凝胶的任何方式，使作为水凝胶形成 组分使用的可水化交联聚合物分子交联。例如，可用双或多官能交联 剂将这些聚合物分子交联，交联剂与两个或多个聚合物分子链共价连 接。示例性双功能交联剂包括醛、环氧化物、琥珀酰亚胺、碳二亚胺 类、马来酰亚胺、叠氮化物、碳酸酯、异氰酸酯、二乙烯砜、醇、胺、 亚氨酸酯(imidates)、酸酐、卤化物、硅烷、重氮基乙酸酯、氮丙啶等。 或者，可通过使用氧化剂和其它试剂例如高碘酸盐完成交联，氧化剂 可将聚合物上的侧链或部分活化，使它们可与其它侧链或部分反应形 成交联键。另一种交联方法包括将聚合物暴露于辐射例如γ辐射，使侧 链聚合物活化，让交联反应进行。脱氢热交联方法也合适。可通过将 明胶在升高的温度通常120℃下保持至少8小时，使明胶脱氢热交联。 根据平衡溶胀百分率下降情况，证明可通过升高控制温度、延长控制 时间或二者的组合，增加交联程度。减压操作可加速交联反应。以下 论述优选的使明胶分子交联的方法。
[0205]水凝胶可包含增塑剂，以增加水凝胶的展性、弹性和降解 速度。增塑剂可以是醇，例如聚乙二醇、山梨醇或甘油。通常，增塑 剂应为分子量约200-1000D或约400D的聚乙二醇。存在于水凝胶 的增塑剂可占聚合物组合物重量约0.1％-约30％，优选1％-5％(重量)。 在具有高固体含量通常大于组合物重量10％(不含增塑剂)的水凝胶 中，使用增塑剂可尤其有利。
[0206]制备分子交联明胶的示例性方法如下。取明胶，放入水性 缓冲液，形成非交联凝胶，通常，凝胶的固体含量为约1％-约70％(重 量)，或约3％-约10％(重量)。通常通过暴露于戊二醛(例如0.01％- 0.05％w/w，在0℃-15℃下，在水性缓冲液中过夜)、高碘酸钠(例如 0.05M，在0℃-8℃下保持48小时)或1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基) 碳二亚胺(″EDC″)(例如0.5％-1.5％w/w，在室温下过夜)，或通过暴露 于约0.3-3兆拉德γ或电子束辐射，使明胶交联。或者，可将明胶粒 子悬浮于醇例如甲醇或乙醇中，使固体含量约1％-约70％(重量)，或 约3％-约10％(重量)，然后通过暴露于交联剂，通常戊二醛(例如0.01％ -0.1％w/w，在室温下过夜)交联。在醛的情况下，通常将pH保持在约 6-约11，或约7-约10。当与戊二醛交联时，通过席夫碱形成交联， 通过随后还原例如通过用硼氢化钠处理，稳定形成的交联物。交联后， 可用水洗涤得到的颗粒，任选用醇冲洗，干燥，再悬浮于具有需要的 缓冲剂和pH的含水介质至得到需要的水化度。然后可将得到的水凝 胶装入下文中更详述的本发明涂药器中。或者，也可按下文中更详述 方法，在交联之前或之后，通过机械方式破坏水凝胶。
[0207]制备平衡溶胀百分率约400％-约1300％，或约600％-约 950％的分子交联明胶组合物的示例性方法如下。取明胶，放入含交联 剂溶液(通常戊二醛，通常在0.01％-0.1％w/w浓度下)的水性缓冲液 (通常在pH约6-约17下，或在pH约7-约10下)中，形成凝胶，该 凝胶固体含量通常为1％-70％(重量)，通常3％-10％(重量)。随着交 联发生，将该凝胶充分搅拌，然后在0-15℃下保持过夜。然后用去离 子水冲洗3次，用醇(优选甲醇、乙醇或异丙醇)冲洗2次，在室温下 干燥。可任选用硼氢化钠处理凝胶，进一步稳定交联。在某些情况下， 水凝胶形成组分可含具有例如大量甘氨酸残基(例如每隔第3个残基 排列的3个中有1个)、脯氨酸残基和4-羟基脯氨酸残基的明胶。示例 性明胶亚单位如图5所示。明胶实施方案包括具有以下氨基酸组成的 分子：甘氨酸21％、脯氨酸12％、羟脯氨酸12％、谷氨酸10％、丙氨 酸9％、精氨酸8％、天冬氨酸6％、赖氨酸4％、丝氨酸4％、亮氨酸 3％、缬氨酸2％、苯丙氨酸2％、苏氨酸2％、异亮氨酸1％、羟赖氨 酸1％、蛋氨酸和组氨酸＜1％和酪氨酸＜0.5％。图6说明可用作密封剂 组合物的水凝胶形成组分的交联聚合物凝胶片段实施方案的溶胀百 分率与固体百分率之间的相关性。
[0208]在用作水凝胶形成组分之前，优选按分批法，使分子交联 水凝胶机械性断裂。该机械性断裂步骤的主要目的是得到水凝胶的多 个亚单位，这些亚单位的尺寸可强化填充和填塞它们被释放的空间的 能力。如果不发生机械性断裂，分子交联水凝胶将难以与所处理的不 规则形成的靶空间相匹配和填充。通过使水凝胶断裂为较小尺寸的亚 单位，可非常有效地填充此类空间，同时保留交联水凝胶的机械完整 性和持久性。
[0209]可在其机械性断裂之前或之后，进行水凝胶的聚合物链的 分子交联。只要水凝胶组合物断裂为大小为上述0.01mm-5.0mm范 围之内的亚单位，就可按间歇操作例如搅拌使水凝胶机械性断裂。其 它分批机械性断裂法包括通过匀化器或搅拌器泵吸或通过泵，它们将 水凝胶压缩、拉伸或剪切至大于水凝胶的断裂屈服应力的水平。在某 些情况下，聚合物组合物的挤出造成水凝胶从基本上连续网络即跨越 原始水凝胶团的尺寸的网络，转变为具有上述范围的尺寸的子网络或 亚单位的集合。
[0210]在目前优选的实施方案中，可先制备(例如通过喷雾干燥) 可水化的交联聚合物和/或在交联前使其机械性断裂，通常在水化前形 成水凝胶。可作为微粉固体或粉末状干燥固体提供可水化的交联聚合 物，可通过进一步粉碎使它们碎裂，得到具有需要的通常恰好控制在 小范围内粒度的粒子。也可进行其它粒度选择和改进步骤例如筛分、 旋风分类方法等。对于下文中所述示例性明胶材料，优选干燥粒子尺 寸的范围为约0.01mm-约1.5mm，更优选约0.05mm-约1.0mm。示 例性粒度分布应为大于约95％(重量)粒子的粒度为约0.05mm-约0.7 mm。粉碎聚合物原料的方法包括匀化、研磨、凝聚、碾磨、喷射研 磨等。也可通过喷雾干燥形成聚合物原料粉末。可通过常规技术例如 筛分、聚集、再研磨等进一步控制和提纯粒度分布。
[0211]然后可将干燥固体粉末悬浮于本文中其它地方所述水性 缓冲液，并交联。在其它情况下，可将可水化的交联聚合物悬浮于水 性缓冲液，交联，然后干燥。然后可使该交联干燥聚合物断裂，然后 将断裂物质再悬浮于水性缓冲液中。在所有情况下，得到的物质含具 有离散子网络的交联水凝胶，这些子网络具有上述尺寸。
[0212]机械性断裂后，可用作水凝胶形成组分的可水化的交联聚 合物通常可被再吸收，即在首次涂覆后小于1年，通常1-120天，优 选1-90天，更优选2-30天后，它们将在患者身体上生物降解。已知 测量再吸收所需要的时间长度的技术。
III.一组密封剂基质组合物实施方案的制备和用途：多孔基质和 可水化交联聚合物的组合
[0213]本发明组合物含与第二种交联性组分组合的第一种交联 性组分，它们能够交联形成具有空隙的多孔基质，其与可水化的交联 聚合物组合，该交联聚合物能够水化形成水凝胶，以填充至少一些空 隙。可认识到，本发明组合物可用于各种生物医疗应用，包括有关改 变以下的上述各应用：(1)第一种和第二种组分(即多孔基质)；和(2)可 水化交联聚合物。例如，此类组合物可通过形成血液的快速物理屏障 起机械性密封剂作用，终止或抑制出血。因此，本发明某些实施方案 可提供无直接“止血”作用(例如对凝血级联的生物化学作用；涉及凝血 起动因子)结果。
[0214]水凝胶形成组分可用作吸收剂(例如用于血液和其它流体 和组织)。通过吸收血液，水凝胶形成组分可确保在治疗部位上保持较 高浓度的第一种和第二种交联性组分，并可确保为第一种和第二种交 联性组分相互交联和与周围组织交联提供半干燥表面。在某些实施方 案中，第一种和第二种组分可在水凝胶形成组分吸收血液的同时交 联。该吸收和交联可在数秒种内发生，得到的密封剂基质屏障可在30 分钟-1小时达到完全强度。
[0215]通常，尽管例如在水凝胶形成组分中可能存在极少量水 分，但密封剂基质组合物是“干燥”的。在某些情况下，可在涂覆前， 将可水化交联聚合物部分预水化，尽管这种方法可能必须在比生理pH 更高的pH下，或在防止涂覆到靶部位前第一种和第二种组分交联的 其它条件下进行。通常，密封剂基质组合物为粉末或熔化饼状形式。
[0216]用于制备密封剂基质组合物的第一种和第二种组分的浓 度可因多种因素而异，这些因素包括所使用的具体交联性组分的类型 和分子量，和需要的最终用途。在某些实施方案中，第一种和第二种 组分与水凝胶形成组分的重量比为10-50％w/w、15-45％w/w、 20-42％w/w、30-40％w/w和28-约42％w/w。在某些实施方案中， 第一种和第二种聚合物的粒度可为约50-约90微米。在某些实施方案 中，可水化交联聚合物的粒度可为约250-约400微米。
[0217]在某些实施方案中，可按干燥微粒或粉末形式提供第一种 和第二种组分。可将该形式的第一种和第二种组分混合在一起，可再 与也为干燥微粒或粉末形式的水凝胶形成组分混合。可通过任何机械 混合方式例如研磨叶片混合得到这些组分的混合物。然后可将得到的 密封剂基质组合物的干燥粉末装入各种容器例如纸盒、信封、广口瓶 等。可在无菌条件进行混合和填充，或包装后通过例如γ辐射将密封剂 基质组合物灭菌。然后本发明的干燥粉末实施方案准备使用。第一种 和第二种交联性聚合物在生理环境(例如血液pH)可反应而交联，所以 可将组合物中的3组分密封剂基质组合物直接涂覆在干燥的需要部 位，将组织缺损密封，条件是存在足够水化体液。因此，可将密封剂 基质组合物粉末只是洒在组织缺损靶部位之上和倒入其中，保持在适 当位置(例如用纱布垫或外科手术手套)至密封剂基质屏障形成。这在 其中需要可用于各种大小的组织缺损的一次性产品的创伤情况下(例 如在急诊科或战场)尤其有效和方便。
[0218]在其它实施方案中，可将第一种和第二种组分和水凝胶形 成组分固定在支持物或衬垫物上，形成“密封剂基质垫”。在这些实施 方案中，提供支持物例如胶原海绵，然后将密封剂基质组合物固定在 支持物上使用。因为密封剂基质组合物易与组织、有机材料和合成材 料结合，这些实施方案可能是最好的，因为可用易于操作的支持物涂 覆密封剂基质组合物。鉴于建立有效密封剂基质屏障需要相对少量的 密封剂基质组合物的事实，可将相对薄层的密封剂基质组合物固定在 支持物上。例如，在下列实施例中，固定在表面上仅约0.5-1.0g密 封剂基质组合物形成具有极佳止血性质的3cm×3cm的垫。如外科技 术人员认识到的那样，在其中可预计组织缺损的大小和当与粉末相比 需要改善的操作特性的情况下，需要这些实施方案。如同干燥粉末实 施方案，在密封剂基质组合物的密封剂基质垫实施方案中，可将密封 剂基质垫直接涂覆在组织缺损处，无需通过将垫的密封剂基质组合物 侧面压在组织缺损处直至交联性组分发生交联的进一步准备。
[0219]本发明密封剂基质垫实施方案中的支持物可以是任何生 物相容性材料。尽管在本文中详细阐述了胶原蛋白支持物，但可使用 用作支持物的其它材料。例如，可使用生物相容性的其它蛋白或多糖 支持材料。这些支持材料在体内按与密封剂基质屏障大致相同的速度 降解，或可按与密封剂基质屏障不同的速度降解。在外科领域中熟知 胶原海绵及其制备方法、胶原蛋白的制备和操作详述如下。同样，可 使用由纤维蛋白制备的海绵。也可使用基于碳水化合物的材料例如纤 维素(外用)或壳聚糖。此外，还可使用可生物相容和可生物降解的合 成聚合物。外科领域技术人员会认识到，非海绵形式可用于本发明密 封剂基质垫实施方案中的支持物。例如，可使用胶原蛋白或其它材料 的片或膜。另外，支持物还可采用任何可用形状例如圆锥形、半球形、 棒状、楔形等，以便提供与组织缺损形状大约更相近的垫。例如，用 圆锥形胶原海绵作为支持物的密封剂基质垫可用于治疗枪伤。
[0220]通常，此类支持物起结构或机械组分的作用。支持物可具 有某种程度的多孔性，让血液或其它液体渗入支持物，增加与组合物 的接触。此类结构可具有约1.3X-约1.5X的溶胀因子，因此可理想的 用于外科应用。例如，海绵支持的组合物可用于神经外科，以密封硬 膜，其中过度溶胀可对脑产生有害压力。一般而言，支持物应足够柔 软以适应典型的组织缺损，还应在外科环境中具有良好操作性质。
[0221]可通过多种方法将密封剂基质组合物固定在支持物上。在 下述某些实施方案中，适度热量足以将含4-臂PEG第一种和第二种 组分和交联明胶水凝胶形成组分的密封剂基质组合物粉末固定。在这 些实施方案中，将密封剂基质组合物粉末放在胶原海绵上，然后加热 至60-70℃，保持约1-2分钟。干燥粉末基质在该热量下略微熔化，使 其固定在胶原海绵的表面。或者，可用粘合剂或药剂领域中已知的其 它赋形剂将密封剂基质组合物固定至支持物。一般而言，用于将密封 剂基质组合物固定到支持物的技术须取决于密封剂基质组合物中的 第一种和第二种组分和水凝胶形成组分。用于使密封剂基质组合物固 定在支持物上的方法不应明显降低第一种和第二种组分暴露于生理 环境交联的能力，或水凝胶形成组分吸收生物流体的能力。
[0222]在其它实施方案中，可使密封剂基质组合物形成无支持物 的片或膜。对于密封剂基质垫实施方案来讲，可用将密封剂基质组合 物固定到支持物的上述方法，完成密封剂基质组合物的这种形成。
IV.将其它组分加入密封剂基质组合物
[0223]在本发明的其它实施方案中，可将除第一种和第二种交联 性组分和水凝胶形成组分以外的其它组分加入本发明密封剂基质组 合物。一般而言，可将这些其它组分与第一种和第二种和干燥形式的 水凝胶形成组分混合。其它组分可增加具有特殊用途的本发明密封剂 基质组合物的进一步机械强度或改善的性能。例如，因为它不透明且 粘性比非纤维胶原弱，所以有时不优选纤维胶原用于生物粘合组合 物。但按美国专利第5,614,587号所述，纤维胶原或非纤维胶原和纤 维胶原的混合物可优选用于预定在体内长期持续有效的粘合组合物。 可按类似于上述用于胶原蛋白的方式，将各种脱乙酰化和/或脱硫酸酯 化的葡糖胺多糖衍生物掺入组合物。
[0224]可将天然蛋白例如胶原蛋白和各种天然多糖的衍生物例 如葡糖胺多糖掺入本发明第一种和第二种组分在生理环境下反应交 联形成的密封剂基质屏障。当这些其它组分还含与合成聚合物上的官 能团反应的官能团时，在第一种和第二种组分在靶部位交联期间，它 们的存在导致形成交联合成聚合物-天然聚合物基质。尤其是，当天然 聚合物(蛋白或多糖)也含亲核基团例如伯氨基时，第二种交联性组分 上的亲电基团将与这些组分上的伯氨基和第一种交联性组分上的亲 核基团反应，致使这些其它组分变为密封剂基质屏障上一部分。
[0225]一般而言，通常通过脱乙酰化、脱硫酸酯化或二者将葡糖 胺多糖化学衍生化，以使含可与第二种交联性组分上的亲电基团反应 的伯氨基。可按任一前述方法或二者衍生化的葡糖胺多糖包括以下： 透明质酸、硫酸软骨素A、硫酸软骨素B(硫酸皮肤素)、硫酸软骨素 C、甲壳质(可衍生化为壳聚糖)、硫酸角蛋白、硫酸角质和肝素。通过 脱乙酰化和/或脱硫酸酯化使葡糖胺多糖衍生化和使得到的葡糖胺多 糖衍生物与合成亲水性聚合物共价结合在普通转让许可的美国专利 第5,510,418号中有更详细的论述，其内容通过引用结合到本文中。
[0226]同样，第二种交联性组分上的亲电基团可与某些天然蛋白 的赖氨酸残基上的伯氨基或半胱氨酸残基上的硫醇基反应。富集赖氨 酸的蛋白例如胶原蛋白及其衍生物尤其具有与合成聚合物上的亲电 基团反应的活性。本文中使用的术语“胶原蛋白”将包括任何来源的任 何类型胶原蛋白，包括但不限于从组织中提取或重组制备的胶原蛋 白、胶原蛋白类似物、胶原蛋白衍生物、修饰的胶原蛋白和变性胶原 蛋白例如明胶。在1992年11月10日颁布给Rhee等的普通转让的美 国专利第5,162,430号中有使胶原蛋白与合成亲水性聚合物共价结合 的论述。
[0227]一般而言，任何来源的胶原蛋白可用于本发明组合物，例 如可从人或其它哺乳动物源例如牛或猪真皮和人胎盘提取和纯化胶 原蛋白，或可通过重组或其它方法制备。由牛皮制备纯的基本上非抗 原性胶原蛋白溶液的方法在本领域中熟知。在1995年6月27日颁布 给Palefsky等的美国专利第5,428,022号中公开了从人胎盘提取和纯化 胶原蛋白的方法。美国专利第5,667,839号中公开了用包括转基因母 牛在内的转基因动物奶制备重组人胶原蛋白的方法。本文中使用的术 语“胶原蛋白”或“胶原蛋白材料”是指所有形式的胶原蛋白，包括经处 理或修饰的那些胶原蛋白。
[0228]尽管通常优选I型，但任何类型的胶原蛋白均可用于本发 明组合物，这些胶原蛋白包括但不限于I、II、III、IV型或其任何组 合。可使用含非端肽或端肽的胶原蛋白；但当使用源自异种的胶原蛋 白例如牛胶原蛋白时，通常优选非端肽胶原蛋白，因为其免疫原性比 含端肽的胶原蛋白少。
[0229]尚未通过方法例如加热、辐射或化学交联剂预先交联的胶 原蛋白可用于本发明组合物，也可使用预先交联的胶原蛋白。Collagen Corporation(Palo Alto，Calif.)出售胶原蛋白浓度为35mg/ml和65 mg/ml的非交联非端肽纤维胶原，它们的商标名分别为I胶 原蛋白和Zyderm II胶原蛋白。Collagen Corporation出售胶原蛋白浓 度为35mg/ml的戊二醛交联非端肽纤维胶原，其商标名为胶 原蛋白。用于本发明的胶原蛋白通常为冻干粉末形式。
[0230]由于其粘稠度，非纤维胶原通常用于预定用作生物粘合剂 的本发明组合物。术语“非纤维胶原”包括在pH 7下基本上为非纤维形 式的任何修饰或未修饰的胶原蛋白材料，其通过胶原蛋白的水性悬浮 液的光学澄清度显示。
[0231]已为非纤维形式的胶原蛋白可用于本发明组合物。本文中 使用的术语“非纤维胶原”将包括原生形式的非纤维的胶原蛋白类型和 经化学修饰后在或接近中性pH下为非纤维的胶原蛋白。原生形式的 非纤维(或微纤维)的胶原蛋白类型包括IV、VI和VII型。
[0232]在中性pH下为非纤维形式的化学修饰的胶原蛋白包括琥 珀酰化胶原蛋白和甲基化胶原蛋白，可按照1979年8月14日颁布给 Miyata等的美国专利第4,164,559号中所述制备这两种胶原蛋白，该 专利通过引用全文结合到本文中。按照美国专利第5,614,587号中公 开所述，由于其固有粘性，甲基化胶原蛋白通常用于生物粘合剂组合 物。
[0233]用于本发明密封剂基质组合物的胶原蛋白初始可为纤维 形式，然后可通过加入一种或多种纤维分解剂使其变为非纤维。纤维 分解剂通常以足以使胶原蛋白变为上述pH 7下基本上为非纤维的量 存在。用于本发明的纤维分解剂包括但不限于各种生物相容性醇、氨 基酸、无机盐和碳水化合物，尤其优选生物相容性醇。优选的生物相 容性醇包括甘油和丙二醇。在某些情况下，非生物相容性醇例如乙醇、 甲醇和异丙醇可能不适合用于本发明第一种和第二种聚合物，因为它 们对接受它们的患者身体有潜在有害作用。氨基酸的实例包括精氨 酸。无机盐的实例包括氯化钠和氯化钾。尽管碳水化合物例如包括蔗 糖在内的各种糖可用于本发明实践，但与其它类型的纤维分解剂一 样，它们不优选，因为它们可能在体内具有细胞毒作用。
[0234]为用于组织粘着，除密封外，可能还需要将蛋白例如白蛋 白、纤维蛋白或纤维蛋白原加入密封剂基质组合物，以促使细胞附着。 另外，引入水胶体例如羧甲基纤维素也可促使组织粘着和/或溶胀性。
[0235]本发明密封剂基质组合物也可含一种或多种其它生物活 性剂或化合物。在一个实施方案中，可将生物活性剂例如紫杉醇衍生 物加入密封剂基质组合物，以防止在组织缺损部位粘合。在其它实施 方案中，可将生物活性剂例如抗生素或抗微生物剂加入密封剂基质， 用于例如其中病原生物体可进入组织缺损部位或伤口的外伤引起的 伤口情况(例如刀或子弹伤口)。在其它实施方案中，可将组合物中的 生物活性剂例如生长因子释放至局部组织部位，以促使组织愈合和再 生。在另外的实施方案中，可加入凝血剂例如凝血酶，以通过激活凝 血级联进一步改善密封和组织再生。示例性生物活性组分包括但不限 于蛋白、碳水化合物、核酸、无机及有机生物活性分子例如酶、抗生 素、抗肿瘤药、抑菌剂、抗粘着形成药(例如紫杉醇衍生物)、杀菌剂、 抗病毒药、止血药、局麻药、消炎药、激素、抗血管发生剂、抗体、 神经递质、精神作用药物、对生殖器官起作用的药物和寡核苷酸，例 如反义寡核苷酸。本文中使用的术语“生物活性剂”或“活性剂”包括在 体内起生物作用的有机或无机分子。活性剂的实例包括但不限于酶、 受体拮抗剂或激动剂、激素、生长因子、自身骨髓、抗生素、抗粘着 形成剂、抗微生物剂、其它药物和抗体。术语“活性剂”也将包括以上 定义的两种或多种活性剂的组合或混合物。
[0236]以组合物计，此类生物活性组分通常以相对低的浓度，通 常低于10％(重量)，通常低于5％(重量)，通常低于1％(重量)的浓度 存在。可将两种或多种此类活性剂组合在单一组合物中和/或可用两种 或多种组合物释放不同活性组分，其中所述组分可在递药部位相互作 用。示例性止血药包括凝血酶、纤维蛋白原和凝血因子。可按浓度例 如约50-约10,000单位凝血酶/ml水凝胶，或约100-约1000单位凝血 酶/ml水凝胶，加入止血药如凝血酶。
[0237]也可制备含各种显影剂例如碘或硫酸钡或氟的交联的第 一种和第二种聚合物组合物，以帮助给予后分别通过X-射线或 19F-MRI使组合物显影。
[0238]用于本发明组合物的优选的活性剂包括生长因子，例如转 化生长因子(TGFs)、成纤维细胞生长因子(FGFs)、血小板衍生的生长 因子(PDGFs)、表皮生长因子(EGFs)、结缔组织活化肽(CTAPs)、成骨 因子和此类生长因子的生物活性类似物、片段和衍生物。尤其优选转 化生长因子(TGF)超基因家族成员，它们是多官能调节蛋白。TGF超 基因家族成员包括β转化生长因子(例如TGF-β1、TGF-β2、TGF-β3)； 骨形成蛋白(例如BMP-1、BMP-2、BMP-3、BMP-4、BMP-5、BMP-6、 BMP-7、BMP-8、BMP-9)；肝素-结合生长因子(例如成纤维细胞生长 因子(FGF)、表皮生长因子(EGF)、血小板衍生的生长因子(PDGF)、胰 岛素样生长因子(IGF))；抑制素(例如抑制素A、抑制素B)；生长分化 因子(例如GDF-1)；和活化素(例如活化素A、活化素B、活化素AB)。
[0239]可从原生或天然来源例如哺乳动物细胞分离生长因子，或 可例如通过重组DNA技术或各种化学方法合成制备生长因子。另外， 还可使用这些因子的类似物、片段或衍生物，条件是它们显示出原生 分子的至少一些生物活性。例如，可通过位点特异性诱变或其它基因 工程技术改变基因表达制备类似物。
[0240]可通过混合将生物活性剂掺入密封剂基质组合物。在一个 实施方案中，可将活性剂与干燥或冻干形式的密封剂基质组合物粉末 混合。在另一个实施方案中，可将该混合物固定在固体支持物例如上 述用于密封剂基质组合物的胶原蛋白上。在其它实施方案中，可通过 使这些活性剂与第一种或第二种组分合成聚合物上的官能团结合，使 活性剂掺入上述密封剂基质组合物。在1992年11月10日颁布给Rhee 等的普通转让的美国专利第5,162,430号中，有关于用官能活化聚乙 二醇使生物活性剂例如生长因子共价结合的方法论述。优选此类组合 物含可易生物降解的键，例如因酶降解导致活性剂释放到靶组织，在 该部位它可发挥需要的其疗效。
[0241]将含亲核基团的生物活性剂加入交联聚合物组合物的简 单方法涉及在给药前将活性剂与第一种组分、第二种组分和水凝胶形 成组分以干燥状态混合。当将密封剂基质组合物涂覆在组织缺损并与 生物体液接触后，生物活性剂将与第二种组分反应，与第一种和第二 种组分的多孔交联基质交联，同时水凝胶形成组分吸收生物体液。该 方法使活性剂与密封剂基质屏障的交联性组分聚合物基质部分共价 结合，得到高效缓释组合物。
[0242]除其它因素外，所用的活性剂的种类和量将取决于所治疗 的具体部位和病症以及所选择的活性剂的生物活性和药代动力学。
V.密封剂基质组合物作为生物粘合剂的用途
[0243]本发明密封剂基质组合物通常具有粘性，因此与组织牢固 结合，因为第二种交联性组分的亲电基团与组织的靶部位中的胶原蛋 白的亲核基团反应。本发明某些多孔基质组合物可具有非同寻常的高 粘性。因此，除用作屏障基质止血外，本发明密封剂基质组合物还可 用作在生理环境下与湿或潮湿组织结合的生物粘合剂。本文中使用的 术语“生物粘合剂”、“生物粘合剂”和“外科手术粘合剂”可互换使用， 它们包括能够使两个原生组织表面短暂或长久连接，或使原生组织表 面与非原生组织表面或合成植入物的表面短暂或长久连接的生物相 容性组合物。
[0244]按照使第一表面与第二表面连接的通用方法，将密封剂基 质组合物(例如干燥粉末或片状形式)涂覆在第一表面。然后使第一表 面与第二表面接触，优选立即使两个表面粘合。第一和第二表面中的 至少一个表面优选为原生组织表面。当机械性稳定水凝胶形成组分用 于组合物时，例如用于实施例的交联明胶时，与仅含第一种和第二种 交联性组分的组合物相反，得到的多孔基质显示增加的机械强度。因 此，两个组织表面之间的粘合强度也增加，因为组织之间的多孔基质 层在生理机械压力下不太可能在内部分离。
[0245]可通过手工或用其他适当方法将两表面并在一起，同时让 交联反应进行至完成。交联通常在涂覆密封剂基质组合物后5-60分钟 内完成。但是，完成交联发生需要的时间取决于多种因素，包括第一 种和第二种交联性组分的类型和分子量，最尤其是两种组分在靶部位 中的有效浓度(即浓度越高，导致越快的交联时间)。
[0246]优选第一和第二表面中的至少一个表面是原生组织表面。 本文中使用的术语“原生组织”包括为所治疗具体患者的身体本身的生 物组织。本文中使用的术语“原生组织”包括从患者身体的一部分抬高 的(elevated)或除去的用于移植到同一患者身体的另一部分的生物组 织(例如骨自身移植物、皮片自身移植物等)。例如，在烧伤患者的情 况中，可用本发明某些实施方案的组合物将患者身体的一部分的皮肤 片粘合到身体的另一部分。
[0247]其它表面可以是原生组织表面、非原生组织表面或合成植 入物的表面。本文中使用的术语“非原生组织”包括从供体患者(该患者 可与受体患者为同一种族或不同种族)的身体切除的用于移植到受体 患者的身体的生物组织(例如组织和器官移植物)。例如，可用本发明 交联聚合物组合物将患者的异种移植心脏瓣膜固定在患者的心脏中 并将心脏瓣膜周围密封，防止渗漏。
[0248]本文中使用的术语“合成植入物”包括预定移植到患者身 体中的任何生物相容性物质，这些生物相容性物质不包括在以上关于 原生组织和非原生组织的定义中。合成植入物包括例如人造血管、心 脏瓣膜、人工器官、骨假肢、可移植微透镜、血管移植物、支架，和 支架/移植物组合等。
VI.密封剂基质组合物阻止粘连的用途
[0249]本发明密封剂组合物的另一个用途是将组织涂布，以阻止 外科手术或内组织或器官损伤后形成粘连。按照将组织涂布以阻止外 科手术后形成粘连的通用方法，将第一种和第二种合成聚合物与可水 化交联聚合物混合或预混合，然后在第一种合成聚合物上的亲核基团 与第二种合成聚合物上的亲电基团发生显著交联之前，将反应混合物 的薄层涂覆在组织上，这些组织包含、围绕和/或与手术部位相邻。可 通过挤压、喷撒、涂抹、用于组合物粉末的喷雾(同上述)；通过将密 封剂基质组合物的薄膜或片置于组织上或通过任何其它常规方法，将 反应混合物涂覆在组织部位。
[0250]将反应混合物涂覆在手术部位后，在手术切口闭合前，让 交联原位继续进行。一旦交联达到平衡，与被涂布组织接触的组织不 会与被涂布组织粘连。此时，可用常规方法(缝合等)将手术部位闭合。
[0251]一般而言，优选在相对短时间(即在第一种合成聚合物和 第二种合成聚合物混合后5-15分钟)内完成完全交联的组合物可用于 防止外科手术粘连，以使手术结束后手术部位较快闭合。另外，优选 具有较高机械强度的可水化交联聚合物用于组合物，例如实施例中使 用的交联明胶，以增加涂层的机械稳定性。
[0252]在以下实施例中，描述了第一种交联性组分与第二种交联 性组分和水凝胶形成组分形成密封剂基质组合物的制备和表征，提出 它们以便为本领域普通技术人员提供关于如何制备优选的缀合物、组 合物和装置实施方案的完全公开和描述，而无意限定发明人认为他们 的发明范围。己努力确保所用数量(例如量、温度、分子量等)的准确 性，但应说明可能存在某些实验误差和偏差。除另有说明外，份为重 量份，分子量为重均分子量，温度为摄氏度，压力为常压或接近常压。
VII.实施例
实施例1：用于密封剂基质的第一种和第二种组分组合物：交联 多氨基PEG组合物的制备
[0253]制备各种二氨基PEGs的以下储备液：将10克Jeffamine ED-2001(得自Texaco Chemical Company，Houston，Tex.)溶于9ml水。 将10克Jeffamine ED-4000(也得自Texaco Chemical Company)溶于9 ml水。将0.1克二氨基PEG(3400MW，得自Shearwater Polymers， Huntsville，Ala.)溶于300μl水。将以上制备的3种二氨基PEG溶液各 自与三官能活化的SC-PEG含水溶液(TSC-PEG，5000MW，也得自 Shearwater Polymers)混合，见下表1所示。
表1
[0254]用注射器-注射器混合方法将二氨基PEG和TSC-PEG的 溶液混合。将各材料从注射器中推出，在37℃下放置1小时。各材料 形成凝胶。一般而言，凝胶随水含量增加变更软；含最少量含水溶剂 (水或PBS)的凝胶最坚硬。
实施例2：用于密封剂基质的第一种和第二种组分组合物：交联 聚(赖氨酸)组合物的制备
[0255]将溶于0.1ml磷酸盐缓冲液(0.2M，pH＝6.6)的10毫克聚 L-赖氨酸氢溴酸盐(8,000MW，得自Peninsula Laboratories，Belmont， Calif.)与10mg四官能活化的SE-PEG(10,000MW，得自Shearwater Polymers，Huntsville，Ala.)的0.1ml PBS溶液混合。该组合物几乎立即 形成软凝胶。
实施例3：用于密封剂基质的第一种和第二种组分组合物：pH 对四氨基PEG/四SE-PEG制剂的凝胶形成的影响
[0256]在培养皿中制备含pH 6、7和8的各浓度的四氨基PEG 和四SE-PEG的凝胶。将四氨基PEG和四SE-PEG混合后，将各皿反 复倾斜；将制剂停止流动点定为胶凝时间。在室温下，pH对各种四 氨基PEG/四SE-PEG制剂胶凝时间的影响见下表2所示。
表2
[0257]凝胶形成需要的时间随pH增加并随四氨基PEG和四 SE-PEG浓度增加而减少。
实施例4：水凝胶形成组分材料以及交联和溶胀百分率测量方法 的评价
[0258]让明胶粒子在含交联剂(例如0.005-0.5％(重量)戊二醛) 的含水缓冲液(例如0.2M磷酸钠，pH 9.2)中溶胀。将反应混合物冷藏 过夜，然后用去离子水洗涤3次、用乙醇洗涤2次，将其在环境温度 下干燥。在环境温度下，以低固体浓度(2-3％)将干燥交联明胶再悬浮 于含水缓冲液，保持一定时间。缓冲液的浓度基本上大于平衡溶胀需 要的浓度，存在两相(水凝胶相和缓冲液)。然后通过在0.8μm标称截 流滤膜(Millipore，Bedford，Mass.)上施加真空，将含湿水凝胶的悬浮液 过滤。将外来缓冲液除去后，记录截留的湿水凝胶和湿滤膜的总重。 然后将水凝胶和膜在约120℃下干燥至少2小时，记录干燥水凝胶残 留物和干燥滤膜的总重。也进行不含水凝胶残留物的湿滤膜和不含水 凝胶的干燥滤膜样品的几次测量，用这些测量值推导出湿水凝胶和干 燥水凝胶的净重。然后按以下公式计算“溶胀百分率”：
溶胀百分率＝100×[(水凝胶的湿重-水凝胶的干重)/水凝胶的干 重]
[0259]对于给出的明胶样品，至少按一式三份测量溶胀，然后将 测量值平均。将在测量湿重前样品再悬浮于缓冲液18-24小时的溶胀 百分率值定义为“平衡溶胀”。
[0260]得到的交联明胶材料显示平衡溶胀值范围为400％- 1300％。平衡溶胀的程度取决于交联的方法和程度。
实施例5：用于密封剂基质的水凝胶形成组分：由用EDC交联 的明胶组成的可水化交联聚合产物片段
[0261]在70℃下，将明胶(Atlantic Gelatin，General Foods Corp.， Woburn，Mass.)溶于蒸馏水，固体含量为1-10％(w/w)(更优选8％)。 然后加入0.2％-3.5％(或0.2％-0.3％)1-乙基-3-(3二甲基氨基丙基)碳 二亚胺(EDC)(Sigma，St.Louis，Mo.)。将形成的水凝胶产物在室温下搅 拌1小时。用Freezone 12冻干系统(Labconco，Mo.)将水凝胶干燥，再 用Waring搅拌机型号31BC91(VWR，Willard，Ohio)研细。然后将干燥 聚合物组合物加入注射器，用缓冲液平衡。测得的平衡溶胀至少为 1000％。结果见表3所示。
表3
实施例6：用于密封剂基质的水凝胶形成组分：可水化交联聚合 产物片段，该聚合产物片段由用EDC交联的明胶和聚(L)谷氨酸组成
[0262]在70℃下，将明胶(Atlantic Gelatin，General Foods Corp.， Woburn，Mass.)溶于蒸馏水，固体含量为1-10％(w/w)(更优选6-8％)。 然后加入0-10％(w/w)(更优选2-5％)聚(L)谷氨酸(PLGA)(Sigma，St. Louis，Mo.)和0.2-3.5％(或0.2-0.4％)1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳 二亚胺(EDC)(Sigma)。将形成的水凝胶产物在室温下搅拌1小时。将 水凝胶在过量盐水中溶胀一定时间(例如20小时)。然后通过在滤膜 (Millipore，Bedford，Mass.)上施加真空将水凝胶过滤。测得的平衡溶胀 至少为1500％。结果见表4所示。
表4
实施例7：用于密封剂基质的水凝胶形成组分：可水化交联聚合 水凝胶片段的制备
[0263]在2℃-30℃(优选22℃-30℃)下，将牛真皮(Spears Co.PA) 在氢氧化钠(Spectrum Chemical Co.，CA)水溶液(0.1M-1.5M，或0.4- 1.2M)中搅拌1-18小时(或1-4小时)。然后将该真皮浆用无机酸例如 盐酸、磷酸或硫酸(Spectrum Chemical Co.，CA.)中和，然后通过滤网过 滤将中和的液相与不溶性真皮分离。然后将真皮用无热原水和醇例如 异丙醇(Spectrum Chemical Co.，CA.)洗涤。洗涤3-12次后，将真皮悬 浮于无热原水，然后可将真皮、水浆加热至50℃-90℃，优选60℃- 80℃，以使真皮热胶凝。在胶凝期间，将真皮、水浆的pH调控至pH 3-pH 11，或pH 7-pH 9。也可通过搅拌和/或匀化使浆状物中不溶性 真皮破裂。该破裂可发生在热胶凝周期之前或之后。使热胶凝进行1-6 小时。胶凝后，通过过滤使浆状物澄清。通过在15℃-40℃，优选20℃ -35℃下通风干燥，将明胶浆脱水。然后通过研磨使干燥明胶碎裂， 其中干燥表示水分含量小于20％(重量)。
[0264]将干燥明胶加入pH 7-10的含0.0025％-0.075％(重量)戊 二醛(Amresco Inc，OH.)的冷(5℃-15℃)含水溶液。该溶液中明胶浓度 为1％-10％(重量)。让戊二醛与明胶颗粒交联1-18小时，然后通过 过滤或沉降使明胶与水相分离。然后将明胶粒子加入含0.00833％ -0.0667％(重量)硼氢化纳(Spectrum Chemical Co.，CA.)含水溶液，明胶 浓度又为1％-10％(重量)，pH为7-12，或7-9。1-6小时后，通过 过滤或沉降使交联明胶与水相分离。然后可将明胶再悬浮于无热原 水，明胶浓度为1％-10％(重量)，然后通过过滤或沉降与水相分离， 将残余交联剂和还原剂除去。最后在滤网或筛上收集交联明胶，最后 将明胶用无热原水洗涤。然后将湿交联明胶置于干燥室，在15℃-40℃ 下干燥。从干燥室中取出干燥交联明胶(即水分含量小于20％(重量) 的交联明胶)，然后用机械研磨机研磨，得到典型粒度分布为0.020mm -2.000mm的粉末。
实施例8：速效干燥止血密封剂粉末
[0265]通过使第一种交联性组分、第二种交联性组分和水凝胶形 成组分混合，制备速效干燥止血密封剂粉末。第一种交联聚合物 (PEG-A)是PEG-琥珀酰亚胺基粉末，第二种交联聚合物(PEG-B)是 PEG-硫醇粉末，水凝胶形成组分是交联明胶粉末。
实施例9：速效干燥密封剂垫
[0266]通过使第一种交联性组分、第二种交联性组分和水凝胶形 成组分混合，制备速效干燥密封剂垫。将得到的组合物、密封剂基质 组合物粉末置于冻干胶原海绵上，加热至60-70℃保持约1-2分钟。干 燥粉末基质在该加热下略微熔化，将其固定在胶原海绵的表面，从而 形成密封剂基质垫。或者，可用粘合剂或药剂领域中已知的其它赋形 剂将密封剂基质组合物固定到支持物上。一般而言，用于使密封剂基 质组合物固定到支持物的技术可取决于密封剂基质组合物的第一种 和第二种组分和水凝胶形成组分。本发明密封剂基质垫实施方案提供 便利形式，可通过该形式处理密封剂基质组合物，然后通过海绵或其 它合适的支持方式将密封剂基质组合物释放至手术部位。
实施例10：密封剂粉末治疗脾动脉穿刺
[0267]图7A-E说明根据本发明实施方案，用密封剂基质组合物 治疗脾动脉穿刺。将猪肝素化至约3倍基线。如图7A所示，通过手 术用18g针700引起猪脾动脉穿刺。穿刺后，动脉710出现大出血705。 如图7B和7C所示，通过注射器730将约700mg密封剂粉末基质组 合物720涂覆在穿刺部位，用带手套的手指740轻压或放置在该部位 上保持2分钟。发现密封剂粉末形成充分止血的凝固物750。涂覆后 5分钟，用如图7D所示冲洗装置760冲洗该部位，将过量粉末组合 物洗去。当用镊子夹住凝固物时，它似乎与组织牢固粘合且具有良好 完整性。如图7E所示，在涂覆44分钟后，通过用钳子770剥离将凝 固物750除去，重新出现出血715。
实施例11：治疗肝切除的密封剂粉末
[0268]图8A-E说明根据本发明实施方案，用密封剂基质组合物 治疗肝切除。将猪肝素化至约3倍基线。如图8A所示，用剪刀810 将该猪的肝中叶805的尖端800或边缘切除。切除后，该部位出现大 出血815。如图8B所示，将约6ml(2g)密封剂基质组合物820涂覆 在该部位，用注射器825的尖端保持在适当位置2分钟。如图8C所 示，可用带手套的手指将粉末压在或维持在缺损上。密封剂粉末形成 凝固物835，观察到该凝固物完全止住出血。涂覆8分钟后，按图8D 所示用冲洗装置840冲洗该部位。当用镊子夹住凝固物时，它似乎与 组织紧密粘合且具有良好完整性。在涂覆28分钟后，通过用钳子845 剥离将凝固物835除去，重新出现出血850。
实施例12：治疗脾损害的密封剂粉末
[0269]用6mm活体解剖组织穿刺针，通过手术在猪体上形成脾 损害，用剪刀除去组织芯。将猪肝素化至约2.5倍基线。组织穿刺后， 脾出现大出血。将约700mg(2ml)密封剂基质组合物粉末用12ml注 射器的边缘涂覆在穿刺部位。不用压力保持材料在适当的位置。观察 到密封剂粉末形成完全止血的凝固物。涂覆4分钟后，冲洗该部位。 当用镊子夹住凝固物时，它似乎与组织紧密粘合且具有良好完整性。 在涂覆25分钟后，通过剥离将凝固物除去，重新出现出血。
实施例13：机械应激试验
[0270]通过使0.60-0.65g密封剂基质组合粉末与1ml猪血浆在 塑料模具中反应，制备密封剂基质屏障。将混合物在室温下固化约30 分钟。将3×1×0.3cn凝胶块的两端用氰基丙烯酸酯胶带粘住，形成用 于断开的咬合空间(1×1cm)。用预安装的夹具将胶带各端夹住。用 Chatillon TCD2000试验装置对矩形凝胶进行标准应激试验至凝胶形 状破裂，测定拉伸强度。持续加压至凝胶破裂以测量最大力(N)和最大 负荷时的挠度(mm)。凝胶的有效表面积为1×0.3cm，凝胶的原始有效 长度为1cm。密封剂凝胶的拉伸强度为约15.3N/cm2。对含第一种交 联性组分和第二种交联性组分但不含水凝胶形成组分的凝胶组合物 进行同样试验，测得的拉伸强度为约5.1N/cm2。
实施例14：剥离强度试验
[0271]在某些实施方案中，混合的粉末含第一种和第二种交联性 组分和水凝胶形成组分，当该粉末溶于生理液例如血液或其它体液 时，粉末自动聚合。该材料可通过共价键牢固地与组织或其它涂覆部 位粘合。可用机械夹将密封剂基质从组织例如皮肤分离，检验组织粘 合的机械强度。在该实施例中，在密封剂基质屏障形成后，进行多次 如下拉伸试验。通过将3种不同浓度(10％、20％和30％交联性组分) 的交联性组分和交联明胶混合，制备含第一种交联性组分(季戊四醇聚 (乙二醇)醚四琥珀酰亚胺基戊二酸酯)和第二种交联性组分(季戊四醇 聚(乙二醇)醚四硫醇)和交联明胶(FloSealTM)的3组分粉末系列。在 3×1×0.3cm塑料模具中，将约0.40g-约0.45g 3组分粉末加到置于鸡 皮样品顶部上的约0.6ml猪血浆，在室温下固化约60分钟。形成密 封剂基质屏障，该屏障与皮肤牢固粘合。将形成的密封剂基质屏障粘 贴在夹在Chatillon TCD200试验装置上的板上。当将皮肤与密封剂基 质屏障分离时，测量最大峰力(N)。观察到，粘合强度增加与PEG混 合物(第一种和第二种交联性组分)浓度的增加几乎线性相关。结果见 表4A所示。
实施例15：用于熔合垫中海绵衬垫的纤维胶原的制备
[0272]如下制备第一种纤维胶原样品。将40g NaOH在25℃下溶 于450ccH2O。将约50g牛真皮切片加入NaOH溶液。将该真皮溶液 搅拌80分钟。将NAOH溶液轻轻倒出，将真皮用H2O洗涤。用2M HCl 将真皮溶解，使pH至2.3-2.4。继续搅拌18小时。在18℃下，用1M NaOH滴定1250ml浓胶原蛋白溶液(CIS)至pH 7.25。10小时内形成 胶原纤维，过滤。使240ml在pH 7.4下沉淀，然后在8℃下使其与 33μl 25％戊二醛(GA)溶液交联23小时。通过规定循环(recipe cycle)， 用Virtis冷冻干燥机将纤维胶原冻干。
[0273]如下制备第二种纤维胶原样品。用240g粘性溶液(例如 CIS)使纤维胶原交联。通过加入60cc H2O将溶液稀释。通过加入约 1.8cc 2M NaOH使pH升至9.2。将溶液温度调至8℃，加入33μl 25％ GA。将溶液搅拌23小时，得到约54g沉淀纤维。用Virtis冷冻干燥 机，通过规定循环将纤维胶原冻干。
实施例16：使水凝胶形成组分去缓冲化
[0274]在某些实施方案中，可能需要将水凝胶形成组分例如 FloSealTM中的磷酸盐除去，以使环境液体能易于影响水凝胶形成组分 的pH。涂覆后，水凝胶形成组分原位交联可帮助密封剂基质化合物 与组织粘着。在某些情况下，在某些pH值下粘着可更有效。例如， 某些明胶基材料可在pH小于6或7下更容易粘着。按1∶50比例，将 FloSealTM用H2O洗涤，用0.01M HCl或0.01M NaOH将浆状物的pH 调节或酸化至pH 2-7。将湿明胶饼过滤，在通风干燥箱中，将滤饼在 32℃下干燥12-20小时，用研钵和槌轻度研磨。将干燥明胶粉末加入 混合PEG溶液，以便原位交联。将浆状物搅拌30秒，然后立即涂在 用pH 7.4的25mM磷酸盐缓冲液全饱和的称量纸表面上。记录聚合 时间，结果见表5所示。
表5
实施例17：PEG饼状物的制备
[0275]在一个实施方案中，通过振摇将0.8g PEG-琥珀酰亚胺粉 末和0.8g PEG-硫醇粉末充分混合，然后加入充满N2的100ml圆底烧 瓶。将混合粉末在40℃-50℃油浴中熔化，并且用手工缓缓搅拌30分 钟，然后冷却。用刮刀将固体膜从烧瓶中取出。在另一个实施方案中， 将PEG-琥珀酰亚胺和PEG-硫醇的混合粉末溶于胶原蛋白(例如0.3％) 或明胶(例如2％)的酸性溶液，冻干。认为纤维胶原或明胶可帮助基质 分散并对PEG饼的处理有改善作用。
[0276]在对比组合物中，将1.2g胶原纤维溶于100cc pH 2HCl， 在35℃水浴中加热1-2小时，用pH 2HCl稀释，得到0.3％CIS产物。 将0.2g PEG-琥珀酰亚胺和0.2g PEG-硫醇溶于2cc 0.3％CIS。将得到 的混合物倒入盘中，通过22小时循环冻干，得到PEG饼。在还另一 个实施方案中，在35℃水浴中，将2g明胶溶于100cc pH 2HCl。将 4g双组分PEG粉末混合物溶于2cc明胶溶液，冻干，得到PEG饼。
[0277]在相关实施方案中，通过将pH 2.0的PEG-SG、PEG-SH 和胶原蛋白的混合溶液冻干制备PEG饼。在肝素化的猪模型中的擦伤 肝囊管上进行动物研究。将2滴0.2M磷酸盐缓冲液(pH 9.0)加到正在 缓慢出血的肝脏表面。将一块饼置于该部位不施加压力。在第5和10 分钟时，测试各PEG饼对该部位的粘合力。发现在制备期间，PEG-SG 的活性不降低，PEG饼通过共价键与擦伤肝组织粘合。试验样品的组 合物和体内性能归纳在表6中。
实施例18：粉碎的PEG饼材料
[0278]将400mg预混CoSealTM、1g FloSealTM(例如pH 7.1-9.5； 粒径70-400μm)和2-3cc H2O混合为糊状物，通过22小时循环下冷 冻，形成饼状物。如图9所示，然后将饼状物900打碎为910，粉碎， 粉碎为粉末形式920，然后放入注射器930(例如5cc或10cc注射器)。 用刀片除去注射器管尖端940，将混合物粉末920涂覆在损伤部位 950，原位观察密封剂活性。在实施例10-12中描述了示例性结果。在 另一个实施方案中，由表7中所述3组分浆状物制备饼状物。
[0279]某些实施方案的示例性制剂的试验结果显示表8所示以 下特性。
实施例19：密封剂基质组合物熔合垫的制备
[0280]用熔化的CoSealTM预混物制备PEG垫。通过使不同pH 值的FloSealTM粉末与预混CoSealTM(例如粉末形式的两种PEG组分) 按各种重量比例混合，制备3组分粉末。用冻干胶原海绵作备用支持 垫，将熔化的3组分混合物固定在其上。在一个实施方案中，如图10 所示，将0.5-1g密封剂基质组合物1000置于海绵1010的3×3cm2部 分上部。将海绵和密封剂基质放入烘箱，在60-70℃下烘1-2分钟， 然后放入干燥器中冷却，隔绝或尽量少与空气接触。观察到密封剂基 质粉末形成粗膜并与海绵粘连，形成熔合垫1020。在相关实施方案中， 制备了几个海绵，各自的尺寸为3×3×0.3cm3。在某些海绵上涂布第一 种和第二种交联性组分和水凝胶形成组分的3组分混合物。在某些海 绵上仅涂布第一种和第二种交联性组分的双组分混合物。在肝损害部 位上原位测试了所有熔合垫。结果见表9所示。
[0281]在相关实施方案中，制备了几种组合物粉末。某些组合物 含第一种和第二种交联性组分和水凝胶形成组分的3组分混合物。某 些组合物仅含第一种和第二种交联性组分的双组分混合物。在肝损害 部位上原位测试了所有组合物。结果见表10所示。
实施例20：γ-辐射对体内性能的影响
[0282]制备密封剂基质组合物粉末和固定在海绵上的密封剂基 质组合物，将其中的一些用γ射线辐照，以测定γ射线对体内性能的 影响。如表11所示，未观察到任何影响。
实施例21：pH对体内性能的影响
[0283]进行体内研究，以评价水凝胶形成组分的pH值、手工涂 覆方法对原位交联的影响。用第一种密封剂组合物中的pH 6.75的 FlosealTM和第二种密封剂组合物中的pH 9.5的FloSealTM作对比。在某 些情况下，用手工将密封剂基质组合物维系在损害上，在其它情况下， 将密封剂基质组合物涂覆或放置在损害上，不用外力维系。含pH 6.75 FlosealTM的组合物的反应时间似乎比含pH 9.5的FlosealTM组合物慢约 10-30秒。示例性研究结果见表12。因此认为水凝胶形成组分的pH 可在交联反应的早期起作用。水凝胶形成组分的pH可影响在潮湿环 境(例如其中已发生出血)中凝胶形成速度。在某些情况下，如果交联 发生不够块，可将密封剂组合物从损害部位除去。
实施例22：SURGIFOAMTM作为水凝胶形成组分的用途
[0284]按1∶1∶2、1∶1∶4和1∶1∶8(重量)比例，将COH 102(季戊四 醇四-[1-(1′-氧代-5′-琥珀酰戊酸酯(pentate))-2-聚(氧乙烯)二醇]醚)粉 末、COH206(季戊四醇四-[巯基乙基-聚(氧乙烯)二醇]醚)粉末和 SURGIFOAMTM可吸收明胶粉末(Ethicon，Somerville，NJ)的混合物共 混，然后填充至改进的5mL注射器。得到的混合物为基本上干燥的 自由流动的粉末。将2克各组合物涂覆在在猪肝脏上手术形成的损害 (约1cm×1cm×0.3cm深)，并且轻度压紧。对于各组合物，1分钟 后撤去压紧。使各组合物中的COH 102和COH206在损害的潮湿环 境中互相反应，形成掺入SURGIFOAMTM粉末并物理性密封损害部位 的交联水凝胶。未观察到用该组合物治疗的任何部位出血。涂覆5分 钟后，用盐水溶液冲洗处理的损害，未出现再出血。2小时后检查处 理部位，也未发现出血。
实施例23：含凝血剂的密封剂基质组合物的体内性能
[0285]制备含4∶1重量比的FloSealTM和CoSealTM(预混)的密封剂 基质组合物粉末。在某些实施方案中，该比例提供有效达到需要的化 学聚合水平和使组合物与组织粘合的交联度。将凝血酶粉末加入各浓 度的密封剂基质组合物粉末中。在动物研究试验中测试得到的混合 物，该动物研究试验涉及测量肝脏正方形中的出血计分和将得到的混 合物与不合凝血酶的密封剂基质组合物的止血效率作对比。
[0286]试验材料包括0.1g季戊四醇四[巯基乙基-聚(氧乙烯)]醚、 0.1g季戊四醇四[1-1′-氧代-5′-琥珀酰亚胺基戊酸酯)-2-聚(氧乙烯)二醇] 醚、0.8g交联明胶粒子(FloSealTM)和各种浓度(5k、2.5k、1.25k和0.625 kμ/g)凝血酶。在混合试验中，将得到的混合物的4组分用转筒式混合 机混合。在重新组成试验中，将4ml凝血酶溶液(1250μ/ml)与0.8g FloSeal混合，然后冻干22小时。然后用转筒式混合机将干燥混合物 与CoSealTM粉末混合。不受任何特定理论的限制，认为重新组成凝血 酶制剂含渗入FloSealTM基质的凝血酶分子，以使凝血酶可保留在密封 剂基质屏障以提高止血效率。在垫实验中，通过将得到的4组分混合 物(密封剂基质组合物+凝血酶)固定在明胶海绵(Gelfoam)海绵上部，将 混合物熔化，冷却，固化，制备垫。将烘箱温度设为约60℃-约65℃， 保持约1分钟。
[0287]在体内试验中，将动物肝素化使凝血时间激活，达到基线 的3-5倍以上。检验制剂对通过手术制备的猪肝方块(1cm×1cm×0.2 cm)的出血范围的作用。5分钟计时后，立即冲洗损害，将过量粉末除 去。在1、5、10和30分钟时，给处理的损害区域评分。与血液接触 后，材料发生聚合，然后与损害牢固粘合。密封剂基质屏障机械性密 封出血区域，通过与组织结合起机械性密封剂的作用。在体内试验中， 将凝血酶在约60℃下加热5分钟，发现完全有活性。在制备的明胶海 绵垫中，发现凝血酶活性丧失。
[0288]表13中提供急性体内作用评价结果。损害出血的评分为 ″0″代表未出血，″4″代表严重出血。根据此处观察到的出血评分，测 试的所有样品均未显示出血。将凝血酶加入密封剂基质组合物后，未 发现显著优点。凝血酶的使用未在初级止血中显示任何益处，尽管它 可能加强次级止血/凝血形成和伤口愈合。
实施例24：PEG浓度对凝胶强度的影响
[0289]根据本发明的一个实施方案，PEG浓度对凝胶强度的影响 如表14和图11所示。凝胶形成后，进行拉伸试验。通过使3组分粉 末(例如含第一种和第二种交联性组分和水凝胶形成组分的密封剂基 质组合物)在塑料模具(3×1×0.3cm)中反应，制备凝胶。将猪血浆(1ml， Baxter动物编号S-264)加入密封剂基质组合物粉末(0.60-0.65g)，起 动凝胶形成，然后在室温下固化约30分钟。用氰基丙烯酸酯胶使透 明胶纸与凝胶两端粘合，制成用于拉扯开的啮合空间(1×1cm)。通过 拉伸试验，测量将凝胶拉伸至断裂时的最大力(N)和在最大负荷下的挠 度(cm)。1×0.3cm为有效表面积。凝胶的原始有效长度为1.0cm。通 过Chatillon TCD200试验装置将标准应力施加在矩形凝胶上至其破裂 是拉伸强度的决定因素。试验结果表明较高浓度的聚合物可增加密封 剂基质组合物凝胶的强度。
实施例25：PEG浓度对溶胀率的影响
[0290]根据本发明的一个实施方案，PEG浓度对溶胀率的影响如 图12、13和14所示。进行溶胀研究，以表征密封剂基质组合物凝胶。 当与水性环境接触时，亲水性聚合物溶胀，形成水凝胶。一旦凝胶形 成，水分子便自由扩散到由溶胀的FloSealTM粒子形成的相当疏松的网 络。再加入水后，COH102-COH206接点断裂，单独的聚合物分子溶 于水。通过将4种不同浓度(5％、10％、20％和30％w/w)聚合物CoSealTM和FloSealTM混合并使它们与等量猪血浆(1.7ml/g粉末)反应，制备密 封剂基质组合物凝胶。在室温下，将凝胶固化30分钟，然后使其在 盐水中溶胀。每隔一定时间，吸出缓冲液，测定剩余凝胶的重量。监 测凝胶的重量变化。由以下方程计算溶胀率Q：
Q＝W*/W
其中W*是湿重，W是初始重量。溶胀率随聚合物浓度增加而增 加。不受任何特定理论的限制，溶胀率的表观下降可解释为当凝胶缓 慢侵蚀时凝胶物质的损失。将实验的终点作为在凝胶崩解为几个小块 或变得太粘糊和松弱以致无法将游离的缓冲剂从凝胶中轻轻倒出时 的时间计分。水继续向芯渗透，最后凝胶转化为PEG和明胶粒子的粘 性溶液。所有材料崩解需约2-3周(图14)。似乎CoSealTM在密封剂基 质组合物粉末中的百分率对密封剂基质组合物凝胶的稳定性有重要 影响。密封剂基质组合物凝胶的溶出速度因聚合物的交联度而异。结 果显示较高浓度的CoSealTM可造成较强凝胶稳定性，也可造成更大溶 胀。预计这种凝胶的体外相对持续性与体内情况相似。
[0291]以上实施例提供本发明组合物可以是有效密封剂的充分 说明。这些组合物可原位与生理液或血液聚合，因此可非常牢固地密 封组织或与其粘着。
[0292]尽管为了理解清楚的目的，通过阐述和实施例详细的描述 了前述发明，但在权利要求的范围内可进行一定变化和改进将是显而 易见的。本文中描述的所有专利、刊物、文章、书籍和其它参考资料 均通过引用结合到本文中。
[0293]实施例26：评价一些制剂在动物模型中的止血性质
[0294]制剂编号334-77
[0295]将1g PEG-A粉末(季戊四醇四[巯基乙基-聚氧乙烯]醚， MW 10,000)、1g PEG-B粉末(季戊四醇四[1-1′-氧代-5′-琥珀酰亚胺基戊 酸酯-2-聚氧乙烯二醇]醚，MW 10,000)和8g FloSealTM放入混合瓶(50 ml容积)，将瓶安装在Inversina转筒式混合机上，混合。将3组分混 合物共混10分钟至完全混合。在6支注射器(5ml容积)中填充约1.5g 该混合物。
[0296]制剂编号334-77-1
[0297]将1.5g制剂编号334-77样品固定在一片明胶海绵(3×4 cm2，压缩的明胶海绵，Upjohn制备，NDC 0009-0353-01)上。将上部有 样品的明胶海绵放入真空箱中，在60-65℃下烘1分钟至样品开始熔 化。然后将材料冷却，固化。将在明胶海绵上得到的两块饼状物放入 插入干燥剂的小袋，密封。
[0298]制剂编号334-77-4
[0299]将制剂编号334-77样品放在一块胶原海绵上并烘烤。通 过戊二醛溶液(5k ppm)使胶原纤维轻度交联和通过用VirTis Genesis 冷冻干燥机将胶原蛋白溶液(1.0％)冻干，制备海绵。将胶原蛋白垫(3× 4cm2)小心分成具有1.5g制剂编号334-77样品的层，然后放入真空干 燥箱中，在60-65℃下加热1分钟至样品开始熔化。然后让该材料冷 却，固化。将得到的各胶原蛋白垫放入插入干燥剂的小袋，密封。
[0300]方法：
[0301]外科手术方法：
[0302]在肝部分切除前，将动物(NZW兔，雌性，体重约3kg)麻醉， 使其静脉内接受4.000IU/kg剂量的肝素化30分钟。
[0303]肝脏切除模型：
[0304]通过中央剖腹手术，使肝脏左叶暴露并夹紧。将部分左侧 肝叶切除。通过涂覆试验药物控制渗出。将涂覆和固定时间标准化， 使不超过300秒。当预计完成基本止血时间5分钟后，撤除止血钳。
[0305]肝擦伤模型：
[0306]通过中央剖腹手术，使肝脏左叶暴露。在肝叶表面上磨出 直径2cm，深度2mm的浅环形损害。用带砂轮附件的打孔机(钻孔研 磨机PROXXON FBS 230/E；粗砂粒度P40，转速5.000/分钟)完成该 磨损。用这些制剂中的一种治疗得到的小血管或毛细管出血或因此产 生的渗出。
[0307]15分钟观察期后，将左肝叶重新放回腹腔的原始位置。如 果达到止血，将腹部闭合，切除网膜(Synthofil2/0)。按2水平方式， 用作为断纹缝合线的Synthofil2/0将肌肉和皮肤切口分别缝合。
[0308]24小时后，通过过量戊巴比妥钠(约320mg i.v./动物)将动 物麻醉处死。无痛处死后，进行尸体解剖。目视检查腹部是否存在由 重新出血产生的血液和/或血液凝块。如果存在，用预称量的手术抹布 吸收血液和/或血液凝块，测定重量。如果未达到止血，通过过量戊巴 比妥钠(约320mg i.v./动物)将动物处死，只评价初始终点。
[0309]结果：
[0310]本研究的目的是评价制剂#334-77、#334-77-1和#334-77-4 止血性质)。使用两种极端止血模型：(1)高肝素化的兔肝脏切除和(2) 肝表面模型。
[0311]将制剂#334-77粉末涂覆在出血伤口上后，发现将制剂压 在伤口表面有助于止血。难以用干燥外科乳胶手套施加该压力，因为 粉末与手套的粘性比与伤口的更强。但较易用湿手套施加压力。当与 血液的水分接触后，制剂形成密封膜。涂覆后，在多种情况下，可达 到止血效果，甚至在该实施例中使用的极端模型中。如果首次涂覆后 未达到完全止血且在形成层下有血液渗出，通过简单涂覆更多制剂 #334-77难以完全止血。将制剂涂覆范围限制在仅需要止血的地方可 能比较困难，因为如不引起足够重视，制剂粉末可堕入腹腔并粘着在 腹腔上。因此，适当涂覆制剂#334-77是有帮助的。
[0312]相反，可容易将制剂#344-77-4涂覆在大面积组织上使其 成为恒定厚度层，并允许施加足够压力以达到止血。涂覆后，具有原 生胶原蛋白垫背衬的制剂#344-77-4保持与肝叶粘着，起止血剂和胶的 作用，使垫粘合在伤口和肝囊管上。这种可生物降解的背衬可提高粉 末组合物的止血效率。可生物降解的背衬还可赋予制剂柔韧性，在涂 覆期间，让制剂在切除面的边缘上收缩。用该制剂治疗两只动物，一 只为表面模型，另一只为切除模型。在两种模型中均达到快速止血。 仅治疗的表面模型动物存活，术后24h未出血。24h后，羊毛状胶原 蛋白仍在涂覆部位。治疗的切除模型动物整夜出血至死亡且羊毛状物 脱落。两种实验的区别是，在第一种动物模型中，将干燥状态的羊毛 状胶原蛋白压在伤口上，在第二种动物模型中，用湿纱布抹布施加压 力。结果见表15所示。
动物 实验 表15 1 1a 肝切除模型：(#334-77-1) 左肝叶。不夹肝叶涂覆。在涂覆期间，明胶海绵垫脆和硬，在 干燥状态下不能在切除边缘周围收缩。用湿纱布抹布(0.9％ NaCl)在切除周围的切除表面和完整的肝囊管上压2分钟。 粉末与伤口表面牢固粘合，但不与明胶海绵背衬粘合。用0.9％ NaCl冲洗未粘合的粉末。除切除边缘上的一点出现渗血外， 其余部位出血停止。 1b 表面模型：(#334-77-1) 左中肝叶。不夹肝叶涂覆。用湿纱布抹布(0.9％NaCl)将制剂 #334-77-1在伤口表面压2分钟。撤去明胶海绵背衬。制剂与 伤口粘合。出血停止。 2 2a 肝切除模型：(#334-77) 左侧肝叶。将制剂#334-77涂覆在出血表面，用干乳胶手套压 位。粉末与手套的粘性比与伤口表面的更强。用手套除去制剂 层。 2b 肝切除模型：(#334-77) 与2a中相同的左侧肝叶。用湿手套涂覆#334-77，并在伤口表 面压10秒钟。无任何粉末与手套粘合。伤口表面上形成层。 发现粉末下有渗血。 2c 肝切除模型：(#334-77)
左中肝叶，夹住涂覆。将制剂#334-77涂覆在出血表面，用金 属箔压在该表面。5分钟后撤去钳子。在切除边缘略有渗血。 试图通过涂覆更多制剂止血。未能完全阻止出血。将粉末层除 去。该层形成密封膜，但与伤口表面仅有很少的粘着。 2d 肝切除模型：(#WR334-77) 与2c中相同的肝叶，但制备新的切口以促使出血。夹住肝叶 后涂覆。用解剖刀将制剂在伤口压2分钟。未能阻止出血。 3 3a 表面模型：#WR334-77+马胶原蛋白垫 将#344-77粉末铺在马胶原蛋白垫的薄层上。用注射针在胶原 蛋白垫上从具有制剂层的一侧打孔。将一部分制剂压入孔中。 该制剂层比在制剂变型中的薄。干燥、不夹住肝叶涂覆羊毛状 物。用手套将羊毛状物压2分钟。未发现出血。将垫去除。发 现与肝囊管粘合良好，但与伤口表面较少粘合。 3b 表面模型：制剂-胶原蛋白-垫(#334-77-4) 与3a相同的伤口。施加干燥状态的垫，在伤口表面压2分钟。 该垫比具有明胶海绵背衬的羊毛状物更具柔韧性(弯曲性)。这 有利于易于涂覆。该制剂未从胶原蛋白垫上脱落。整个制剂- 胶原蛋白垫与伤口和肝囊管粘合。未发现出血)。用0.9％NaCl 将胶原蛋白垫湿润，将兔关闭。该动物存活了24h，然后处死。 在尸体解剖检查中，羊毛状物在原位置上，且24h内未出现 出血。