组织工程拟生态毛发毛囊移植物
前言
男性型秃发为常见的疾病状态，其常常通过毛发移植手术治疗。在 此过程中，切下来自于不在秃发区域内的头皮区域的毛发毛囊并将其重 新植入秃发区域内以产生满头毛发的假象。此过程中无新的毛发产生。 它的成功受可收获的及重新植入秃发区域的毛发毛囊的数目的限制。此 外，由于不是所有的移出毛发毛囊均可成功被移植，此技术，虽然是很 普遍，但具有显著的缺点。
众所周知，在毛发毛囊内亚结构中发现的细胞特异类型具有诱导形 成完整的、正常功能的毛发毛囊的能力。这些细胞被称为毛囊干细胞或 者称为毛囊祖细胞。考虑到有效的毛发恢复治疗的巨大市场，为了毛发 增殖进行了许多尝试以探索这些细胞的毛囊诱导能力。尽管表面上科学 可行，但在现有技术所公开的所有方案都被证实不能满足对于秃头提供 临床上及美容上可接受的新的治疗的目的。例如，将来源于大鼠胡须 (whisker)的培养的真皮乳头细胞植入大鼠耳皮下，引起从植入位点生长 出胡须。参见R.F. Oliver和C.A.B.Jahoda，1990年4月24日的美国 专利4,919,664，“Stimulation of hair growth(毛发生长刺激)”，此处引入这 些教导作为参考。在未公布的Andrew Messenger博士对5名人类志愿 者的临床研究中，毛发毛囊真皮乳头细胞从志愿者的头皮活组织中切下 培养。细胞增殖并覆盖培养瓶表面，通过从瓶表面刮除移去细胞，并植 入在从中获得细胞的每个受试者的前臂下面的皮肤的浅切口中。在细胞 植入位点未观察到新的毛发生长。6个月后活组织检查所有的位点并且 组织学发现为正常，无头皮毛发毛囊形成的迹象。
最近，T.H.Barrows在2002年2月28日公开的国际公开WO 02/15952，“Scaffolds for Tissue Engineered Hair(用于组织工程毛发的支 架)”描述了在以生物可吸收的材料制成的多孔”支架”上植入同型培养 细胞的方法，本文引入该公开的教导。在这案例的后续临床研究产生了 来自于培养细胞植入的在人类受试者皮肤中诱导新毛发毛囊和毛发生 长的首个有文件记载的实例(见T.H.Barrows，S.A.Cochran，E.I.Griffin， 和A.R.Solomon，″Tissue Engineered Human Hair：Preliminary Clinical Results(组织工程人类毛发：初步临床结果)″，TE2002：International Workshop on Tissue Engineering(组织工程国际研讨会)，St.Gallen， Switzerland，24-27，2002，2月，此处引入该文献的教导作为参考)。无固 体支架结构存在下注入细胞未表现出毛囊新生的迹象。但是，与支架结 合的16个细胞移植中仅1个引起美容上有用的毛干的生长。尽管在大 量细胞加支架的植入位点中，组织学上被注意到毛囊新生的不明确迹 象，但是那里也有对部分降解的支架碎片残留物的持续的炎症反应。此 异体反应类型被推定可产生毛发毛囊形成的有害环境(见K.S.Stenn， 2002年4月17提交的美国专利申请10/123,984，"Compositions and methods for inducing new hair follicle formation and hair growth in a desired orientation(朝所需方向诱导新毛发毛囊形成和毛发生长的组合 物和方法)"，在此引入该申请的教导)。
因此，仍需要可靠的及可重现的方法用于培养毛囊祖细胞并且植入 培养细胞到皮肤中以产生新的、美容上有活力的毛发毛囊。
发明概述
简言之，本发明一方面是构造成模仿天然毛发毛囊结构的并设 计用于经皮植入的改进支架。该植入物的一些部分可作为特异类型 细胞接种的支持结构，其它部分与表皮接触或突出穿过表皮作为表 皮向下生长的位点。这种向下生长对产生与被植入细胞联系的漏斗 是有益的，继而对于控制新形成毛干的出口角度有帮助。
另一方面，本发明为特异的组合物的用途，及生产生物相容性 与需要的生物可吸收的速率相结合的支架的制造方法。这些支架类 型的性能特征在成功的毛囊诱导植入物的构成中是非常重要的，便 于或加强毛囊新生过程。
又一方面，本发明为培养的细胞的特异组合，其提供可靠的及 可重现的毛囊新生的起始。单独植入培养的真皮乳头(也称为毛囊乳 头)细胞得到不可预知的及非重复性的结果。已发现角质化细胞，从 新生皮肤(如婴儿包皮组织)获得的适当的角质化细胞，也必须与真皮 乳头细胞联合植入。其它的细胞类型可任选与真皮乳头/角质化细胞 组合联合以提高毛囊新生的成功率。任选其它的细胞可选自已知存 在于人胚胎、胎或婴儿头皮皮肤、婴儿包皮、脐带血液、成人的骨 髓、肌肉、脂肪组织和皮肤中的干细胞群。
本发明又一方面为令人惊讶的发现，即软骨素-6-硫酸酯可作为 对毛囊新生过程提供有益效果或能加强毛囊新生过程的物质。
另一方面，本发明为制造拟生态毛发毛囊移植物的方法，以及 对其用细胞接种并将其植入需要有新毛干生长的皮肤的方法。
本发明一方面还是毛发增殖的方法，其中从收获的毛囊处的细 胞在培养中增殖，与培养的角质化细胞或其它异源细胞联合等分为 大量生物可吸收的支架。产生的细胞接种的拟生态植入物的植入比 现有技术的方法所可能达到的程度提供了较高程度的毛发恢复。因 而，本发明的方法减少、抑制或治愈了脱发，特别包括但不限于男 性或女性型秃发和其它脱发状态。
附图简述
图1为本发明的中空细丝的横截面代表性的示意图，显示了生 物可吸收的聚合物固体外部细丝(1)，相同或不同的生物可吸收的聚 合物的多孔内部细丝(2)及中间的管腔(3)。
图2为图1的中空细丝的横截面代表性的示意图，显示细胞 (4)(如角质化细胞)，其通过芯吸细胞混悬液进入所述细丝的管腔被接 种到细丝的多孔内层，及细胞团(5)(如培养的真皮乳头细胞或毛发毛 囊断片)，通过机械力使其进入所述细丝的开口端被接种到细丝的管 腔。
图3为图2的细丝植入皮肤后不久的横截面代表性的示意图， 近侧端(6)在真皮(7)中，远侧端(8)被朝下生长的表皮所包围。
图4为由多孔的d，l-丙交酯和乙交酯(PLGA)共聚物制成的本发 明的中空细丝的扫描电子显微照片(SEM)。
图5为通过切开小管显露的图4的中空细丝的多孔内表面的 SEM。
图6为光学显微照片，表示具有图1所示构成的细丝(10)，其中 外部细丝(1)由固体PLGA制成，多孔内部细丝由交联透明质酸 (HAX)制成。图6还表示了由不含HAX的PLGA制成的细丝(11)。 两种细丝均被放置于以食用色素染料染为红色的水(12)滴上。仅有 PLGA的纤维(11)浮于水(12)的顶部，并且没有芯吸任何水进入该纤 维的管腔，相反，含有HAX的PLGA纤维(10)迅速芯吸所述水进入 管腔，使该纤维变为红色。
图7(A)为小鼠鬣(胡须)毛囊(13)和具有足够的内部直径尺寸容纳 切下的毛囊的PLGA中空细丝(14)的照片。
图7(B)为在图7(A)的PLGA中空细丝管腔中插入了毛囊(13)的 照片。
图8为小鼠胡须(15)的照片，观察到植入含有PLGA中空细丝的 鬣毛囊后30天，相对于再生长的剃过的鼠毛(16)，小鼠胡须生长于 小鼠背部。
图9为在植入来自新生小鼠皮肤的含有PLGA中空细丝(19)的细 胞混合物后30天，生长于小鼠皮肤下的毛囊球(17)和毛干(18)的显微 照片。
图10为并列的两张相同放大倍数的切自裸鼠的皮肤下对比显微 照片，此裸鼠13天前被注射取自于新生黑小鼠表皮与真皮的细胞。 插图A显示对照注射位，插图B显示含有同样数目细胞的注射位置， 除细胞之外注射液还含有5％(w/v)的软骨素-6-硫酸酯，与对照相比产 生较大且较多数量的新生毛发毛囊。
图11也为并列的两张相同放大倍数切自裸鼠的皮肤下的对比显 微照片，此裸鼠13天前被注射取自于新生黑小鼠表皮与真皮的细胞。 插图A显示与图10相同的对照注射位，插图C显示在同一只小鼠上 含有同样数目细胞的注射位置，除细胞之外注射液还含有20％(w/v) 的PluronicTM F-127表面活性剂(氧化乙烯和氧化丙烯的共聚物)，产 生大于对照的新生毛发毛囊。
图12为本发明的中空细丝的横截面代表性的示意图，其中管腔 (20)轻微地逐渐变细至附着在多孔的填料(22)的闭合端(21)。
图13为本发明的中空细丝的横截面代表性的示意图，显示盛有 细胞(24)和液体(25)的细移液管吸头(23)被插入到逐渐变细的管腔 (20)。
图14为本发明的中空细丝的横截面代表性的示意图，显示液体 (25)和细胞(24)的混悬液经从移液管吸头(23)放出，该细胞积聚于管 腔闭合端(21)并且液体(25)被多孔填料(22)充分吸收。
图15为实施例10的中空细丝支架和10微升的移液管吸头(26) 的照片，此移液管吸头与在实施本发明的实施方案的方法中用作心 轴的移液管吸头相同。鞘(27)由PLGA制成，包含在球端(29)的纤维 块(28)由交联明胶/软骨素-6-硫酸酯细丝制成。通过将移液管吸头插 入到支架鞘中将活性碳颗粒与水的浆注射入该支架，活性碳颗粒(30) 集于纤维支架的近侧部分。
定义
本发明所用列于下面的术语具有下列意义：
“组织工程”定义为产生细胞联合、生物相容性支架的领域，此生 物相容性支架通常为生物可吸收支架，具有代替、修复或增加人体 组织和器官的效用。
“毛囊新生”定义为在先前不存在毛囊或者在以前存在的毛囊之 外和毛囊之间的皮肤区域新的毛发毛囊形成的现象。
“生物可吸收的”定义为材料的特性，使材料在机体内降解为无毒 的副产物，从机体排出或在机体中代谢。
“支架”定义为无细胞毒性的结构，可包含活细胞及将它们维持在 特定的结构中。
“细丝”定义为长度远大于其直径的圆筒状结构。
“纤维”定义为具有物理完整性的细丝。
“PLGA”定义为丙交酯与乙交酯的共聚物。
“VEGF”定义为血管内皮生长因子。
“EDC”定义为N-(3-二甲氨基丙基)-N′-乙基碳化二亚胺盐酸盐。
“TFE”定义为2，2，2-三氟乙醇。
“HAX”定义为交联的透明质酸。
“心轴”定义为圆筒状的、逐渐变细的或圆锥形物体，用于维持应 用于其外表面的材料的形状并且在产生中空细丝的过程中从所述应 用材料移除。
发明详述
在本发明的实施方案中，拟生态毛发毛囊移植物支架组件为包 含一种或多种生物可吸收的聚合物的中空细丝，此生物可吸收的聚 合物限定出通常从支架的一端延伸至另一端的内部管腔。根据需要 的用途中空细丝的内壁或外壁可为光滑的或多孔的。例如，具有相 对光滑表面的中空细丝可用于将一种类型的细胞(如人包皮角质化细 胞)保持在管腔表面，并将另一类型的细胞(如培养的成人毛发毛囊乳 头细胞，适于细胞聚积团的形式)安置于管腔中与环绕的表面附着细 胞接触。中空细丝借助高度多孔、亲水的内部能够用于芯吸一种或 多种类型的细胞混悬液进入细丝，而细丝本身可能相对疏水，因而 不能芯吸水溶液。
多孔的亲水内部比中空细丝外部具有较快的生物吸收 (bioabsorption)或液化速率，便于在细丝管腔中重新组织接种的细胞， 而且使细胞继续被更缓慢的生物可吸收的细丝壁包含。另外，支架 聚合物从管腔内部到支架外部可具有可变的或梯度生物吸收 (bioabsorptive)速率。因而，内部，即指管腔，它的生物吸收或生物 可吸收速率高于外部或外部放置的聚合物生物吸收速率。
生物可吸收的、生物相容性材料适于中空细丝的制造和用作填 充中空细丝内部，可选自通常用于临床实践和生物医学研究的任何 广泛的多种生物相容性的、合成的、天然的和半合成的材料。中空 细丝可包含包括以下的聚合物：聚(乳酸)、聚(乙二醇酸)、聚(环丙烷 碳酸酯)、聚(二甲基环丙烷碳酸酯)、聚(氨基酸)、酪氨酸衍生的聚(碳 酸酯)、聚(碳酸酯)、聚(己内酯)、聚(对-二噁烷酮)、聚(酯)、聚(酯- 酰胺)、聚(酸酐)、聚(原酸酯)、胶原、明胶、血清白蛋白、蛋白质、 多糖、粘多糖、碳水化合物、葡萄糖胺聚糖、聚(乙二醇)、聚(丙二 醇)、聚(丙烯酸酯)、聚(异丁烯酸酯)、聚(乙烯醇)和所述聚合物的共 聚物、掺合物及混合物，还有包含阻断与另外的非降解聚合物共聚 的生物可吸收的键的低聚物，此低聚物通过所述的生物可吸收的键 的降解或水解作用被释放从而被代谢或排出。本发明生物可吸收的 材料利用生长因子、细胞附着结合位点部分、细胞信号分子的表面 修饰、移植物聚合、共聚或掺合可有利于提高细胞附着和/或提高细 胞的功能、聚积、或毛囊新生过程的起始。
适于用作中空细丝或用作填充中空细丝的材料的天然发生的聚 合物(或生物多聚物或生物材料)包括胶原、明胶、纤维素衍生物、淀 粉、糊精、壳聚糖、脂蛋白、重组形式的人胶原和明胶、纤维蛋白 原、纤维蛋白、纤维结合素、层粘连蛋白、白蛋白，其它血清蛋白、 多糖、粘多糖和在人机体产生的其它生物多聚物。适宜的生物多聚 物可以天然形式或以被修饰的形式被使用，诸如与毒理学上可接受 的交联试剂交联，例如为了降低溶解性。填充材料可以包括纤维、 凝胶和多孔结构的多种物理形式被利用。例如，细胞可与纤维蛋白 原溶液联合，它们暴露于凝血酶时可被转变为生物可吸收的凝胶。
另一方法包括被称为PluronicTM F-127的乙烯氧化物和丙烯氧化 物共聚物的使用，它由BASF Corp.，Mount Olive，NJ的商业化提供。 此表面活性剂与活细胞相容，并且当从较低温度升至体温时其高于 临界浓度形成凝胶。因而，中空细丝能够，例如，首先被PluronicTMF-127的乙醇溶液处理，接着蒸发乙醇在管腔表面得到亲水涂层。含 有细胞混悬液的PluronicTM F-127冷溶液可被芯吸或注射入细丝管腔 并放置于温暖的环境中使PluronicTM F-127胶化并且防止细胞从细丝 中移出。其它生物相容性胶成形材料包括具有末端基团的共价反应 形成胶网的胶原、明胶、血清白蛋白、MatrigelTM基底膜基质(BD Biosciences，San Jose，CA)及各种聚乙二醇分子。
预见到本发明的结构的其它用途。例如，在加入或不加入其它 成分下，简单地将大量中空细丝束在一起，可能获得具有连续的孔 贯通它的三维物体的终产品。这样的结构可用于在组织工程软骨领 域中。因为软骨基本上是无血管的，用于组织工程软骨的支架适于 具有容易接受营养的内部。此外，这样的支架的接种便于经过孔直 接通过所述装置流动。另外，通过沿生物机械负荷的轴定向孔，接 种的软骨细胞将被刺激适当反应并组织起来进入天然关节软骨的柱 状结构。
透明质酸被认为是对于组织工程应用有用的生物材料，并且适 用于以上提及的用于组织工程软骨的支架。通过利用冷凝剂自我交 联透明质酸获得适宜的材料，适宜的EDC，如K.Tomihata and Y. Ikada“Crosslinking of hyaluronic acid with water-soluble carbodiimide(利用水溶性碳化二亚胺的透明质酸交联)J.Biomed. Mater.Res.，37，243-251(1997)所描述，此处引入其教导作为参考。 可选择地，透明质酸可通过多种其它方法交联，包括Y.Luo，K.R. Kirker，and G.D.Prestwich在“Modification of Natural Polymers： Hyaluronic Acid(天然聚合物修饰：透明质酸)”Chapter 45 in Methods of Tissue Engineering(在《组织工程方法》的第45章)，A.Atala and R.P. Lanza，eds.，Academic Press，2002，pp.539-553所描述的方法，此处引 入其教导作为参考。
可选择地，可通过酯化作用转换透明质酸成用于本发明的不溶 性材料，如美国专利4,851,521，″Esters of Hyaluronic Acid(透明质酸 的酯)"，由Francesco delta Valle和Aurelio Romeo(July 25，1989)所 描述的，此处引入其教导作为参考。此类型的适合材料为透明质酸 的苄基酯。因为依靠酯键的水解作用，数天之内合成产物在体内转 变回可溶性透明质酸，所以转酯基作用为交联适宜的方法，同时也 可使用其它的交联试剂及添加的交联成形分子。胺末端的交联分子 也是适宜的，其包括但不限于脂肪族二氨、诸如赖氨酸烷基酯的二 氨基酸酯和胺末端基聚(乙二醇)。
也可采用许多透明质酸的化学交联方法来促进生物活性分子共 价附着于透明质酸结构以加强所产生支架的性能。例如，包含氨基 酸Arg-Gly-Asp(RGD)的细胞附着区域序列的肽可用于加强细胞对交 联的透明质酸支架的附着。
在使用透明质酸制造用于组织工程毛发毛囊的支架中，可期望 将生长因子和血管发生因子附着于支架，这样的方法可将这些因子 在支架降解期间释放，用于促进血管生长到新形成的毛囊或是其它 有益的目的。除小分子共价附着于支架之外，诸如蛋白质、糖蛋白 的较高分子量的分子和诸如胶原、层粘连蛋白、纤维结合素等等的 其它生物聚合物，可被物理地或静电地结合到结构上以提供更大的 物理完整性、细胞附着能力或生物活性。其它包括硫酸软骨素、肝 素、硫酸皮肤素、多能聚糖的葡萄糖胺聚糖等等在本发明中可替代 透明质酸被有利利用。
制造用于组织工程毛发毛囊的支架的适宜的材料为软骨素-6-硫 酸酯。在实施例6中示例性说明了软骨素-6-硫酸酯对于毛囊新生过 程的令人惊奇的有益效果。适宜的组合为软骨素-6-硫酸酯和明胶的 混合物，它们利用EDC交联，并如实施例9示例描述的使用癸二酸 颗粒作为多孔试剂赋予多微孔性，或通过如实施例10所示例描述的 转变为纤维团。
毛发毛囊的形成需要表皮细胞(即角质化细胞)与真皮细胞(即真 皮成纤维细胞或真皮/毛囊乳头细胞)间的相互作用。用于治疗烧伤患 者的用于制造组织工程活皮肤等同物的真皮和表皮细胞真皮和表皮 细胞，它们目前通常是从人婴儿包皮组织中取得，因为它容易获得。 这些皮肤等同物，尽管具有巨大的临床价值，但是缺少毛发毛囊。 因而，角质化细胞或来自于那些来源的角质化细胞通常被认为在需 要诱导新毛发毛囊的形成的组织工程植入物构造中不具有任何特别 的价值。这在Cooley和Vogel(WO99/01034)的公开“preferably the epidermal cells are from the same patient being treated...(优选表皮细胞 来自于接受治疗的相同患者...)”中有陈述，此处引入其教导。
令人惊奇的是，在这里发现来自成人头皮的角质化细胞并不特 别可靠，事实上，来自于婴儿包皮的角质化细胞在它们与真皮乳头 细胞联合诱导毛囊新生的能力上更有效。但是这一发现的原因未知 (并且不希望被任何特别的理论束缚)，表皮干细胞为表皮角质化细胞 的非常少的亚群，我们相信它们在起始毛囊新生中是需要的，并且 婴儿表皮与成人表皮相比是这些细胞的更丰富的来源。因而，来自 婴儿的其它干细胞来源也可是有用的。例如，由脐带取得的血液可 为有用的干细胞的来源，还有取自胚胎的或已建立的胚胎干细胞系， 或取自已建立的器官捐赠程序中的婴儿头皮皮肤。
本发明的表皮/真皮细胞构造的真皮组分可从取自接受毛发恢复 治疗的受试者的切下的毛囊获得。但是，另一可能为从适宜为婴儿 的捐赠器官的头皮获得细胞。欲接种到支架里的细胞可从毛囊断片 培养物获得，其中毛囊断片选自包含真皮乳头、真皮鞘、基质以及 内根鞘和外根鞘的断片。可选择地，细胞可简单地培养自细胞混合 物，该细胞混合物由完整的头皮真皮制备或者由传统毛发恢复手术 过程中供体位点组织的毛囊单位切除后保留的真皮和毛囊组织残余 物(scrap)制备，其中供体也是所述细胞的受体。
表皮细胞不论起源均适于容纳于中空细丝管腔内，附着于或毗 连于管腔内壁或另外容纳于其中的多孔结构中。从接受拟生态移植 物的人的有头皮的毛发活组织检测获得的并且培养增殖的毛囊祖细 胞，适于首先容纳于细丝管腔的近侧室，此近侧室对应毛囊球。因 而，所述移植物为齐备的，其中真皮和表皮组件彼此间有着恰当的 关系的存在着，避免了植入细胞与完整的表皮或向移植的植入物下 面生长的表皮细胞的相互作用的需要。这继而提供了可靠的及可重 现性的新毛发毛囊的形成。
可选择地，真皮和表皮细胞可联合作为混合物，与任选的附加 干细胞一起，并且在植入前被接种到支架中。在此情况下细胞就原 位联系和改组。对于此细胞传递的方法适宜的支架构造如图12至14 所示。在此实施方案中，该支架被制造为一端闭合的形成多孔的、 作为吸收液体的贮器的海绵样的结构的中空细丝。因而，在中空细 丝的管腔中注射细胞和液体的混悬液，液体被芯吸入贮器末端引起 细胞集聚到细丝闭合末端的浓缩区域。然后将该含有细胞的支架以 与在传统毛发恢复手术过程中植入毛囊移植物相同的方式立即植入 皮肤刺伤处。此实施方案的制造支架的方法如实施例9中示例性的 描述，并且包括以下步骤：
1.提供逐渐变细的心轴，其与移液管吸头或其它适宜的液体转 移工具的远侧部分具有相同维数。
2.提供两端开口，能容纳步骤1的心轴的模型腔，心轴作为该腔 的插入物，此腔长于心轴，此超出的长度产生的空隙体积约等于心 轴自身体积。
3.提供生物可吸收的材料A和孔生试剂颗粒C的混合物，A溶 解于溶剂B中，C可溶于溶剂D但不溶于溶剂B。
4.用步骤3的混合物填充步骤2的腔并插入步骤1的心轴。
5.移除溶剂B，从模型腔中取出模制部分。
6.将步骤5的模制部分放置于溶剂D中以除去孔生试剂颗粒。
7.将步骤6的模制部分放置于溶于溶剂F的交联剂E中。
8.以新的溶剂F或其它适宜的溶剂冲洗产生的支架并使其干燥。
9.任选地以水-可溶性物质G的水溶液再水化步骤8的支架并使 水分蒸发产生保护涂层。
10.制备溶于溶剂I中的生物可吸收的材料H的溶液。
11.以步骤10的溶液包被步骤9的支架并使溶剂I蒸发。
12.通过在水中浸泡支架移去材料G的保护涂层，以新的水冲洗， 并使水蒸发。
在包括以上步骤的适宜的方法中，A为软骨素-6-硫酸酯和明胶 的混合物，B为水，C为小于63微米的癸二酸颗粒，D为丙酮，E 为EDC，F为体积比为9∶1的丙酮∶水混合物。
上述方法的变体所产生的实施例10示例性描述的实施方案包括 以下步骤：
1.提供逐渐变细的心轴，其与移液管吸头或其它适宜的液体转移 工具的远侧部分具有相同维数，除了所述心轴的顶部轻微延伸至形 成尖头之外。
2.以水溶性聚合物A包被步骤1的心轴
3.将可渗透的、生物可吸收的滤过物质B附着于步骤1的心轴顶 部，这样适于在液体中从细胞混悬液中分离细胞，所述滤过物质基 本上被溶于溶剂D中的可移去的保护涂层C包裹。
4.以溶于溶剂F中的膜形成的生物可吸收的聚合物E包被整个心 轴和所述滤过物质B
5.移去步骤4的溶剂F生成覆盖于心轴和步骤3的被附着的顶部 的生物可吸收的聚合物膜的连续层。
6.通过在心轴附着点远侧移去一小片覆盖于滤过材料所述膜， 在步骤5的膜中生成一个开孔。
7.通过在水中浸泡步骤6的产物基本移去聚合物A。
8.通过浸泡于溶剂D中基本移去保护涂层材料C。
9.从产物中移去心轴，继续进行完全移去材料A和C所必要的 步骤7和8。
在以上方法的适宜的实施方案中，A为表面活性剂，例如PluronicTMF-127，B为含有软骨素-6-硫酸酯和交联明胶的纤维团，C为焦化的蔗 糖，D为水，E为PLGA，F为二氯甲烷。
制造本发明的两端开口的长中空细丝支架的适宜的方法涉及作 为心轴的尼龙单纤丝的使用，继而通过溶解移除尼龙单纤丝，在其 上沉积有多种成分。在此方法中也可考虑使用可被移除且不损坏生 物材料包埋料的由其它材料制成的纤维。可选择地，中空细丝熔化 挤出已证明是可用于产生本发明的中空细丝的技术。
在本发明的方法中，首先用颗粒包被细的尼龙纤维，以确保粘 稠的溶液形式的生物可吸收材料的应用能够粘附该纤维。使用尼龙 溶液或其它诸如聚苯乙烯的聚合物溶液，将这些颗粒涂敷于、粘附 于或结合于该尼龙纤维。所述尼龙(或其它聚合物)颗粒牢固地粘附于 所述细的尼龙纤维并且协助后续的以例如透明质酸溶液的粘稠的水 溶液对该纤维的包被，但该溶液不粘于该尼龙表面。用作颗粒的适 宜的物质为癸二酸，它基本不溶于水(透明质酸的溶剂)和TFE(尼龙 的溶剂)，但是在丙酮(透明质酸和尼龙的非溶剂)中自由溶解。所述 颗粒凭借该颗粒的移除在产生的中空细丝上形成多孔管腔表面。成 熟、交联或另外使包被的生物可吸收的材料不溶于水之后，用适当 的溶剂移去尼龙和附着于该尼龙的颗粒。如果需要，可再应用不同 生物可吸收材料的附加包被。在此方法的这一阶段，所述尼龙和附 着该尼龙的颗粒被移除，有广泛选择的溶剂可用于涂敷此第二种材 料。适宜的第二种材料为丙交酯和乙交酯的共聚物(下文中称之为 PLGA)，因此在此方法中提供具有HAX内部和PLGA外部的中空细 丝。
从以上，此方法详细的步骤如下：
1.提供水溶性材料W。
2.提供溶于溶剂A的材料X的纤维。
3.提供溶于溶剂B的生物可吸收的材料Y。
4.提供溶于溶剂C的颗粒P。
5.提供溶于溶剂D的生物可吸收的材料Z。
6.提供溶于溶剂N的聚合物M。
7.制备溶于溶剂N中的聚合物M溶液。
8.以步骤7的溶液包被步骤2的纤维。
9.将步骤4的颗粒P包被步骤8的被包被的纤维并使溶剂N 蒸发，因此将所述颗粒结合于所述纤维上。
10.制备溶于溶剂B的材料Y溶液。
11.将步骤10的溶液包被到以步骤9的颗粒包围的纤维上并 使溶剂B蒸发。
12.若材料Y为水溶性的，则通过交联使材料Y不溶于水。
13.通过用溶剂N溶解和冲洗从步骤12的包被的纤维中移除 聚合物M。
14.通过用溶剂C溶解和冲洗从步骤13的包被的纤维中移除 颗粒P。
15.通过用溶剂A溶解和冲洗从步骤14的包被的纤维中移除 纤维X。
16.制备溶于水中的材料W的溶液。
17.如果需要，涂敷步骤16的溶液保护涂层于步骤15的细 丝并使水蒸发。
18.制备溶于溶剂D的生物可吸收材料Z的溶液。
19.以步骤18的溶液包被步骤17的纤维并使溶剂D蒸发。
20.通过在水中浸泡细丝移除材料W的保护涂层，以新的水 冲洗，并使细丝干燥。
21.切断细丝成适宜的长度并且灭菌。
22.通过使在适宜的液体中适宜体积的细胞混悬液被芯吸入 所述细丝管腔，以所述适宜的细胞接种细丝。
23.通过插入所述细丝的一端任选地以额外的细胞构造装载 所述细丝。
24.在需要毛干生长的皮肤中做切口并将步骤22或23的细 丝植入切口，含有细胞构造的一端包埋于皮肤中，并且远侧 端在皮肤上经皮延伸。
在包括以上步骤的适宜的方法中，W为焦化蔗糖，X为尼龙，A 为TFE，Y为透明质酸(钠盐)，B为水，P为癸二酸(颗粒大小为10-500 微米，优选50-200微米)，Z为PLGA，D和N为二氯甲烷，M为聚 苯乙烯，并且C为丙酮。如果需要PLGA具有多孔性，D可特定为 丙三醇和TFE的溶液。通过蒸发TFE，PLGA和丙三醇相分离为二 连续乳液。通过溶于水中移除丙三醇赋予残留的PLGA包被多微孔 结构。
为制造用于软骨组织工程应用的支架，步骤11的的大量的纤维， 加入或不加入其它成分，可采用步骤10的其它的包被溶液作为粘和 剂束在一起。在溶解心轴纤维之前，所述束可被切成盘，据此，在 溶解纤维并完成处理步骤之后可构造所需要的产品。
实施例
实施例1 PLGA不损害毛囊存活和毛发生长
从CCA Purac Biochem bv，Gorinchem，荷兰(PurasorbPLGA， 在氯仿中的固有粘度为1.06dl/g)获得d，1-丙交酯和乙交酯(52∶48)的 共聚物(PLGA)，并溶解于二氯甲烷中(10％w/v)。蔗糖被熔化并加热 直至焦化，并使其冷却至能从熔化物中拉出所需尺寸的细丝的温度 为止。细丝被冷却直至凝固，然后立即放置在覆盖有氯化钠粉末的 表面以防止它们变粘。通过将PLGA溶液包被于粉化的、以盐覆盖 的焦化糖的细丝制备中空细丝。蒸发二氯甲烷，通过将包被的细丝 放置于水中溶解并除去糖和盐。在IACUC许可下在Mercer大学 (Atlanta，GA)从安乐死的C57B16小鼠(Charles River)上切下鬣(胡须) 毛囊。将被切下的胡须重新植入于同系基因型小鼠剃过的背部皮肤 上的斜切口。然后重复操作如下：将切下的毛囊先插入并将其整洁 地安置于空PLGA细丝腔中，这样该毛囊就完全被聚合物包围(图7)。 30天后将被植入小鼠安乐死并且切下皮肤，平展于矩形纸板上，在 福尔马林中固定并通过石蜡包埋、切片、H&E染色的常规方法处理 用以通过光学显微镜检查分析。
30天后，发现8个中7个对照毛囊植入物生长出鬣毛干。3个 中2个PLGA/毛囊植入物也被发现生长出毛干(图8)。在PLGA中有 或没有鞘的再生的、移植的毛囊组织学未表现出任何异常。
实施例2多微孔PLGA中空细丝的制备
在TFE(Aldrich Chemical Co.，Milwaukee，WI)中制备丙三醇 (glycerine U.S.P.)和PLGA(ResomerTM RG504，Boehringer Ingelheim， Germany)溶液，丙三醇与PLGA的比率为80∶20(w/w)。将此溶液包 被焦化蔗糖细丝(如以上在实施例1中所描述制备)数层，涂层间时间 足够涂层干燥。蒸发丙三醇和PLGA的溶剂TFE，引起溶质浓度增 加直至丙三醇不再残留混合。丙三醇从PLGA/TFE的相分离导致形 成二连续乳液。然后将包被的细丝放置于水中，这样引起糖及丙三 醇还有任何残余的TFE迅速溶解并从当前的多微孔PLGA中浸出。 用水漂洗合成的多孔中空细丝并使其在干燥器中完全干燥。该干燥 的PLGA中空细丝多孔结构如图4和图5的SEM照片所示。
实施例3亲水PLGA中空细丝的制备
在无水乙醇中温和加热制备约5％(w/v)的PluronicTM F-127表面 活性剂(Sigma Chemical Co.，St.Louis，MO)溶液，它是乙烯氧化物和 丙烯氧化物的共聚物。如实施例1所描述制备PLGA中空细丝。使 澄清无色的PluronicTM F-127溶液被芯吸入PLGA细丝中的一根，并 使乙醇完全蒸发。放置一滴红色食用色素染料于玻璃板上。将一根 15mm长的PluronicTM F-127处理的PLGA中空细丝及一根15mm长 的未处理的具有相同直径的对照细丝与染料接触，使每根细丝的一 端接触到该液体表面。PluronicTM F-127处理的PLGA中空细丝迅速 芯吸水染料溶液通过它的整个长度，相反，未处理的细丝仅缓慢芯 吸染料到它长度的4mm。
实施例4 PLGA包被的HAX细丝的制备
将癸二酸(Aldrich Chemical Co.，MilWaukee，WI)用研钵和研棒磨 碎并筛滤获得尺寸为＞63和＜212微米的颗粒。用溶于TFE的尼龙溶 液(10％w/v)包被一米长的细的单纤丝尼龙纤维(0.003-英寸直径， Shakespeare Monofilament Division，Columbia，SC)，并立即牵引所述 纤维通过含有所述溶液的移液管，然后通过放置于移液管吸头出口 的一堆癸二酸颗粒从而使癸二酸颗粒包围纤维。纤维悬吊于一端并 且使其悬挂于垂直位置。通过将180mg透明质酸钠粉末(1.4百万分 子量，Lifecore Biomedical，Chaska，MN)与10ml水混合并且使其水化， 并室温过夜溶解制成透明质酸钠盐溶液。将溶液混和均匀，然后手 动将胶液珠沿该纤维向下流动将其包被于该纤维上。使透明质酸盐 溶液的薄涂层干燥，然后涂敷两层附加的涂层，并使涂涂层间的时 间足够涂层干燥。然后将该纤维切为约4cm长，并且放置于含有溶 于丙酮的0.2％(w/v)的N，N′-异丙基乙基氨基碳化二亚胺(Sigma Chemical Co.，St.Louis，MO)的小瓶中，其中丙酮含有10％(v/v)的水。 室温3小时后，倒出溶液并替换为纯丙酮。再倒出丙酮并通过蒸发 除去残留的丙酮。然后在小瓶中装满TFE(Aldrich Chemical Co.， Milwaukee，WI)并使其维持室温过夜。倒出TFE并替换为新的TFE， 数小时后倒出并替换为丙酮。再倒出丙酮通过蒸发除去残留的丙酮， 生产HAX细丝。
于明火上在试管中搅拌加热蔗糖直至蔗糖熔化且焦化为止。倒 出黑褐色的熔化物并使其凝固。将其溶解于水中(约20％w/v)制备糖 浆。将干燥的HAX细丝放置于该糖浆中，HAX细丝迅速吸收液体 并且直径显著变大。从糖浆中移去细丝并使其部分干燥。然后用氯 化钠粉末(＜63微米)包被细丝并放置于干燥器中干燥过夜。将坚硬的、 脆的、琥珀色的细丝浸入溶于二氯甲烷(Aldrich Chemical Co.， Milwaukee，WI)的10％(w/v)的PLGA(PurasorbPDLG，在氯仿中固 有粘度为1.06dl/g，CCA Purac Biochem bv，Gorinchem，荷兰)溶液中 并使溶剂蒸发。然后将包被的细丝浸泡于水中直至糖和盐溶解，以 琥珀色消失为据。然后将细丝返回干燥器并使其完全干燥。通过实 施例1的方法制备不含HAX的PLGA对照中空细丝。这些细丝芯吸 液体的能力通过将其一端浸入一滴含有红色食用着色染料的水中测 试。红色的水迅速进入含有HAX的细丝管腔并完全充满，由此使细 丝成为红色。但是，不含有HAX的细丝不能芯吸水并且具有水排斥 性，漂浮于水面上。
实施例5包含在PLGA中空细丝支架中的来自小鼠细胞的体内毛发 毛囊新生及毛干生长
如以外所述(S.M Prouty，L. Lawrence，et al.(1996). ″Fibroblast-dependent induction of a murine skin lesion with similarity to human common blue nevus.(以人普通蓝痣类似物损伤的鼠皮肤的 成纤维细胞依赖的诱导作用)"Am J Pathol 148(6)：1871-85)，此处引 入其教导，从新生小鼠中分离表皮和真皮细胞。与发表的程序有两 点不同，即，为便于从新生小鼠皮肤的真皮上分离表皮，使用C57/B16 小鼠(Charles River Laboratories)及使用分散酶(Gibco)而不是胰酶。一 旦真皮和表皮细胞群都单独分离出来，将它们再组合使真皮细胞与 也被称为表皮芽的表皮的比率为100∶1。以900rpm旋转此细胞组 合物5分钟。生成的片状沉淀物重悬于PBS以获得至少10百万总细 胞/毫升的细胞浓度，通过简单地将所述纤维浸没于细胞混悬液将细 胞混悬液迅速加载于按实施例1所讨论的方法制备的所述PLGA中 空细丝。然后用19-号皮下注射针通过穿刺皮肤，再退出针直至一半 的开放斜面暴露为止，插入中空细丝植入物于该开口中，然后完全 退出针同时将细丝推至皮下，这样将这些细胞接种的细丝植入裸 (Nu/Nu)鼠背部皮肤下面。植入后3周，小鼠被尸体解剖并切下皮肤。 在细丝植入位点的皮肤的皮下观察到伴随着PLGA支架材料的毛囊 样结构和毛干。如图9所示，在这张显微照片上可观察到良好成形 的毛囊球和长毛干。该支架材料不易看见，因为它是无色的且部分 被降解了。
实施例6软骨素-6-硫酸酯在细胞混悬液中作为附加物的用途
利用实施例5中描述的方法以评估在注射给裸鼠之前添加至细 胞混悬液中的一些可溶性材料。将准确的相同数量的每种细胞类型 注射到对照和测试材料的注射位点，这些位置位于同一只小鼠。如 图10所示，注射细胞后13天，在相同放大倍数下，在有起始5％浓 度的软骨素-6-硫酸酯(Sigma Chemical Co.，St.Louis，MO)存在下，在 皮下间隔形成的毛囊明显大一些。
实施例7 PluronicTM F-127在细胞混悬液中作为附加物的用途
以20％PluronicTM F-127表面活性剂(Sigma Chemical Co.，St. Louis，MO)替换软骨素-6-硫酸酯重复进行实施例6的实验。如图11 所示，注射细胞后13天，在相同放大倍数下，在皮下间隔形成的毛 囊比无PluronicTM F-127表面活性剂存在的注射液的对照注射位点的 毛囊明显大一些。
实施例8交联明胶中空细丝的制备
将猪皮明胶(300 bloom，Sigma Chemical Co.，St.Louis，MO)溶于 温水中形成5％(w/v)的溶液。此溶液应用于实施例4所描述的以癸 二酸包裹的细尼龙细丝。涂敷数层包被，使应用涂层间的时间足够 涂层干燥。然后该纤维被切为约4cm长，并且放置于含有溶于丙酮 的0.2％(w/v)的EDC(Sigma Chemical Co.，St.Louis，MO)的小瓶中， 其中丙酮含有10％(v/v)的水。室温3小时后，倒出溶液并替换为纯 丙酮。再倒出丙酮并通过蒸发除去残留的丙酮。然后在小瓶中装满 TFE(Aldrich Chemical Co.，Milwaukee，WI)并使其维持室温过夜。倒 出TFE并替换为新的TFE，数小时后倒出并替换为丙酮。再倒出丙 酮通过蒸发除去残留的丙酮，生产不溶于水的明胶中空细丝。
实施例9交联软骨素-6-硫酸酯/明胶的制备
将癸二酸(Aldrich Chemical Co.，Milwaukee，WI)用研钵和研棒磨 碎为能通过63微米的筛的颗粒。将一次性10微升移液管吸头 (Eppendorf epTIPSTM，Brinkman Instruments，Westbury，NY)切为三等 分段。弃掉近侧部段，用癸二酸粉末填充中间段。将软骨素-6-硫酸 酯(80mg)和猪皮明胶(80mg)溶于2.0ml温水中。将装有不锈钢管的 注射器安装到癸二酸填充的移液管吸头部分的较大的开口，将此溶 液加载到此注射器中。溶液被注射到填充的癸二酸中，使得当液体 在填充料中移动时从粉末中挤出空气。然后将从移液管吸头切下的 远侧段插入到填充段中。擦掉从开口端中挤出的多余的糊。
经干燥器过夜贮存使装配的段完全干燥。然后将它们放置于溶 于9∶1(v/v)的丙酮∶水的0.2％(w/v)的EDC溶液中。约1小时后， 轻轻将两段移液管吸头分开，推出模制产品并且放回EDC溶液中放 置另外的3小时，然后将该交联支架浸泡于纯丙酮中1小时再使其 干燥。
实施例10 PLGA移液管吸头鞘支架及交联的明胶/软骨素-6-细丝
将软骨素-6-硫酸酯及猪皮明胶(各100mg)溶于2.0ml温的去离子 水中，并通过26-号针缓慢注入装满丙酮的硅橡胶管，丙酮从升高的 贮器流进烧杯中。收集合成的细的白色的细丝并放置于溶于9∶1的 丙酮∶水的0.2％(W/v)的EDC溶液中4小时。然后用纯丙酮漂洗细 丝并使其干燥。给细丝添加溶于水的30％(w/v)的焦化蔗糖并且使细 丝浸泡于其中直至细丝完全饱和。将一小束饱和的纤维团放置于 1.0mm内径的TeflonTM管中并使其在干燥器中完全干燥。褐色的糖包 裹的圆柱细丝被从管中挤出放置到30-号针的顶部，此针通过 Eppendorf移液管吸头(10 microliter epTIPSTM，Brinkman Instruments， Inc.，USA)的末端伸出。将具有附着的糖包裹的细丝的移液管吸头悬 吊点朝下浸入溶于二氯甲烷的30％(w/v)的PluronicTM F-127溶液中， 并使其干燥，然后再浸入溶于二氯甲烷的15％(w/v)PLGA溶液中， 并使其干燥。用剪子剪断被干燥的PLGA的远侧端并将整个移液管 吸头放置于水中。数分钟后，由于水合的PluronicTM F-127表面活性 剂涂层，PLGA薄膜容易地从移液管吸头滑落。将产生的支架进一步 浸泡直至焦化糖的褐色消失为止。
为了测试包含在PLGA鞘中的含纤维材料作为滤过介质的功能 并因此作为收集和植入毛发毛囊诱导细胞的方式的能力，将在水中 的活性碳颗粒(100-400 mesh，Norit CAl Activated Charcoal，Sigma Chemical Co.，St.Louis，MO)浆牵引到10微升移液管吸头，将吸头插 入到所述PLGA支架鞘中，从移液管中推出所述的浆并通过支架末 端出来。如图15所示，在纤维性材料的近端活性碳颗粒清晰可见， 随着水的经过它们在近端集聚。
实施例11用于组织工程软骨的捆束中空细丝HAX支架
将透明质酸钠(MW 1.4×106 Daltons，产品编号：80081，LifeCore Biomedical，Inc.，Chaska，MN 55318)溶解在去离子水中，放置于透析 袋中并对1克/100ml去离子水的阳离子交换纤维素(Dowex AG 50W-X4，purchased from BIO-RAD Laboratories，Inc.，Hercules，CA)透 析，并于4℃用磁力棒搅拌2天。从透析袋中移去溶液并冻干以获得 松散的白色固体，将此固体重溶于去离子水以获得含有3.4％(w/v)的 透明质酸的粘稠溶液。
将尼龙单纤丝线(直径0.003英寸，SN-38 WonderThreadTM， Shakespeare Monofilament Division，哥伦比亚，SC)排成3米长的一 列，并以在溶于二氯甲烷的约5％(w/v)聚苯乙烯(碎的一次性培养皿 碎片)溶液中的癸二酸粉末(＜63微米)浆包被，采用以下方式包被：通 过将纤维穿过球部截掉的一次性移液管(cat.no.231，Samco Scientific Corp.，San Fernando，CA)，穿过球部孔将所述的浆注射入移液管，然 后沿该纤维的长度向下移动移液管(先流过球部)，这样移液管吸头作 为量孔用于使所述的浆均匀沉积。二氯甲烷蒸发后，包被的纤维为 不透明的白色并且比未包被的纤维具有显著的粗糙感。然后将以上 透明质酸溶液以相同方式涂敷于包被纤维。涂敷5层包被，每层透 明质酸涂层之间约有1小时干燥时间。然后小心卷起纤维并放置于 有盖的皿，此皿具有溶于丙酮的0.2％(w/v)EDC溶液，该丙酮含 10％(v/v)的去离子水，并浸没于此溶液中使其过夜浸泡。然后在纯丙 酮中漂洗并再次捆扎纤维，这次约将约10根纤维一起捆束为一个连 续的绳。手动以透明质酸溶液包被所述绳，即指用一只手的拇指和 食指及中指拿住少量粘稠溶液，所述绳放置于三指接合形成的缺口 处并朝着绳的长度移动手。进行数层包被并且每层之间使其有足够 干燥的时间。然后卷起包被的绳并放置于上述的含有EDC溶液的有 盖皿中，使其浸泡过夜。然后用纯丙酮漂洗并使其干燥。
将该绳切为4cm长并且每段用大量的透明质酸溶液包被。将包 被的段束在一起并用0.009英寸直径的尼龙单纤丝(Shakespeare)围 绕着束捆扎成单独的环。将每环扎紧并打结，将多余的透明质酸溶 液从束中挤出，然后将束一端悬挂干燥。多余的溶液从末端滴下， 并且一天后所述束成为硬的、轻的混合物。然后用刀片将其切为3mm 直径的盘，并将该盘放置于新一批的以上提及的EDC溶液过夜，以 使透明质酸交联及溶去癸二酸，并再在二氯甲烷中过夜以完成溶去 聚苯乙烯。然后将其放置于TFE中溶去尼龙。一小时后替换新的TFE 并使该盘在新的TFE中浸泡过夜。然后以新的TFE漂洗该盘，再用 丙酮漂洗并使其干燥。将干燥的盘放置于50％戊二醛水溶液(Acros no. 41096-5000，购于Fisher Scientific Co.，Fairlawn，NJ)中，并于室温使 其浸泡72小时，如M.Hu，E.E.Sabelman，S.Lai，E.K.Timek，F.Zhang， V.R.Hentz，and W.C.Lineaweaver在"Polypeptide resurfacing method improves fibroblast′s adhesion to hyaluronan strands(多肽再涂 层方法提高层纤维细胞对透明质烷细丝的附着)″，Journal of Biomedical Materials Research(生物医学材料研究杂志)，vol.47，79-84 页(1999)中所推荐，此处引入其教导。这种处理将EDC交联的HAX 转变为更适于组织工程软骨应用的较缓慢降解的材料。将所述盘从 戊二醛中移出后，更换数次去离子水漂洗，然后使其在水中浸泡过 夜。再次漂洗盘并在用于细胞接种和生物反应器研究之前放置于作 为消毒剂的70％(v/v)异丙醇/水溶液中。