技术领域
本发明涉及动物源性植入性医疗器械技术领域，具体涉及一种硬脑膜生物修补片及 其制备方法。
背景技术
硬脑膜是一厚而坚韧的双层膜。外层是颅骨内面的骨膜,仅疏松地附于颅盖，特别 是在枕部与颞部附着更疏松，称为骨膜层；内层较外层厚而坚韧，与硬脊膜在枕骨大孔 处续连，称为脑膜层。硬脑膜的主要作用是保护脑组织。外伤、肿瘤和神经外科手术等 均会造成硬脑膜缺损，硬脑膜重建是神经外科手术的基本操作步骤，其重建的完整与否 与患者的术后恢复关系密切，也是预防脑脊液漏和颅内感染的重要措施；传统的硬脑膜 重建材料主要取自自体组织，材料来源有限，并加重患者的痛苦，近年来人工硬脑膜修 补材料已被广泛接受。
根据材料学的化学成分和生物学特性，硬脑膜修补材料目前主要有不吸收材料、 可吸收材料、生物材料几大类。目前临床上使用的硬脑膜修补材料以高分子材料为主， 植入后不可吸收和降解，会永久存留体内，作为异物，置入后会引起局部组织炎症以及 感染。现代医用植入材料的发展方向是可降解、具有主动诱导组织再生的生物材料。
基于组织工程学原理的以动物组织为原料的细胞外基质(extracellular matrix，ECM) 材料是主要发展方向。ECM是由多种大分子物质如胶原、非胶原糖蛋白、氨基聚糖、 蛋白聚糖、弹性蛋白等成分，按一定比例和结构建成的复杂的有机的三维整体，为各种 细胞的生存及活动提供适宜的场所和微环境，能够调节各种细胞的生长、形状、代谢、 迁移、增殖和分化，进而调控组织和器官功能。组织缺损的一个严重后果是“土壤”— ECM的丧失，这也是机体自身无法实现组织修复和再生的原因。天然的ECM可以作为 组织再生的“土壤”，是理想的组织修复材料。去除动物组织的细胞成分可以去除大部 分的免疫原性，并保留ECM成分，可以开发出理想的硬脑膜生物修补材料。目前已经 用于临床的生物活性材料包括同种异体真皮、猪小肠粘膜下层、猪真皮、胚胎牛真皮等 ECM材料。其中脱细胞小肠粘膜下层(small intestinal submucosa,SIS)基质材料是目前 学术界公认的最理想的组织修复材料。美国Cook Biotech Incorporated的以猪小肠粘膜 下层为原料的硬脑膜生物修补片(商品名：Biodesign Surgisis)在欧美国家已占据10～30％ 的生物硬脑膜片市场，并于2010年底进入我国市场。
Biodesign Surgisis产品具有天然特有的ECM结构和组成，能够主动诱导组织再生， 免疫原性低，组织相容性好，可降解等优势。但随着临床应用的增加，Biodesign Surgisis 产品的问题也显现出来。临床研究显示：Biodesign Surgisis产品在临床应用中出现了不 同程度的浆液肿、感染、慢性炎症反应、组织愈合不良等并发症，其中浆液肿发生率最 高。并发症可能导致疾病的复发，甚至需要二次手术去除。另外，产品的抗感染能力以 及不同批次的产品的稳定性和统一性较差。
一方面，动物源DNA残留是Biodesign Surgisis产品的主要缺点。Biodesign Surgisis 的生产工艺并没有考虑到清除DNA残留的环节，其产品标准也未规定DNA残留控制 的内容(参考标准：YZB/USA 0944-2010)。研究已经证实，浆液肿是由Th2炎性细胞 因子反应引起的，而该反应就是由动物源DNA的慢性免疫反应所导致。另一方面， Biodesign Surgisis产品采用普通杂交系猪作为动物源，杂交系动物遗传背景的个体差异 导致了不同批次产品的不稳定性和不统一性。再一方面，Biodesign Surgisis产品采用的 真空压制冻干成型工艺使SIS基质材料的空间结构压缩，破坏了天然的ECM三维结构， 影响产品的抗感染能力和促进组织再生能力。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种硬脑膜生物修补片，该硬脑膜生物修补片以 近交系动物作为动物来源，遗传特征纯净、稳定、统一，在根本上保证了不同批次产品 的稳定性和统一性，动物源DNA残留少并完整保留了天然ECM的三维结构，免疫源 性低，抗感染能力强。
一种硬脑膜生物修补片，它采用近交系动物的小肠粘膜下层组织为原料，去除细胞 成分和DNA成分，完整保留细胞外基质成分和结构，并具有微孔结构。
所述近交系动物优选为近交系猪，进一步优选为中国近交系五指山小型猪。
所述去除细胞成分和DNA成分后DNA残留量为105～130pg/g。
所述微孔结构的孔径为150～250um，孔隙率为85～90％。
所述硬脑膜生物修补片由4～12层单层构成，形状为长方形或正方形，长度为 7～20cm，宽度为6～20cm，所述硬脑膜生物修补片上具有贯穿性小孔，所述贯穿性小孔 的孔径为0.5～2mm，孔间隔为0.5～1cm。
所述贯穿性小孔为通过激光微孔技术打孔而成。
本发明所要解决的另一技术问题是提供上述硬脑膜生物修补片的制备方法，该制备 方法改进和优化了制备工艺，增加了DNA清除环节，将机械振荡与超声波振荡有效结 合，将冷冻干燥技术和激光微孔技术有效结合，从而有效清除了动物源DNA，完整保 留了天然ECM的结构和成分，使本发明硬脑膜生物修补片与已有类似产品相比，DNA 残留量低，免疫原性低、抗感染能力高。
上述硬脑膜生物修补片的制备方法，包括以下操作步骤：
(1)动物源的确定和小肠组织的前置处理与初洗
选择近交系动物作为动物来源，动物品种的确定采用专利ZL200510008994.2所规 定的方法，取新鲜屠宰动物的小肠组织清洗洁净，分离出小肠粘膜下层，使用注射用水 冲洗3遍。
专利ZL200510008994.2所规定的方法如其权利要求书中所述，具体如下：
以待测猪的基因组DNA为模板，利用序列2所示的正向引物和序列3所示的反向 引物组成的一对引物进行PCR扩增，检测扩增产物中是否有一条88bp的条带，选取扩 增产物中有该88bp的条带的猪为动物来源。引物序列如下：
正向引物：5’TCTGGAGCTAGCATAAGTGCC 3’(序列2)，
反向引物：5’GTGCAAGTACACATGCAGGG 3’(序列3)。
(2)病毒灭活
采用过氧乙酸-乙醇溶液法灭活病毒，该步骤在清洗槽可振荡的恒温超声波清洗器中 进行，其中过氧乙酸的体积百分含量为0.05～0.2％(优选为0.1％)，灭活时间为1～2h(优 选为1h)，温度范围为4～40℃，然后在磷酸盐缓冲液中清洗2～5次，每次15min，检测清 洗后的磷酸盐缓冲液的pH值，当pH达到6.5-7.5后,以流动的注射用水清洗材料，检测 电导率达到1.5um/s以下时终止。
(3)脱细胞
该步骤在清洗槽可振荡的恒温超声波清洗器中进行，首先将材料置入清洗槽中，然 后在清洗槽中注入氢氧化钠溶液，开启清洗器，清洗时间为5～30min(优选为20min)， 氢氧化钠溶液浓度为5～100mmol/L(优选为5～20mmol/L，进一步优选为10mmol/L)，然 后关闭清洗器，将氢氧化钠溶液倾出，注入磷酸盐缓冲液进行清洗，开启清洗器，清洗 时间为5～20min(优选为15min)，磷酸盐缓冲液重复清洗2～5次，检测清洗后的磷酸盐 缓冲液的pH值，当pH达到6.5-7.5后,以流动的注射用水清洗材料，检测电导率达到 1.5um/s以下时终止。
(4)DNA清除处理
该步骤在清洗槽可振荡的恒温超声波清洗器中进行，将氯化钠溶液注入清洗槽中， 开启清洗器，清洗时间为5～30min(优选为20min)，氯化钠溶液浓度为0.015mol/l或2mol/L (优选为0.015mol/L)、PH值不超过7.8，然后以流动的注射用水清洗材料，检测电导 率达到1.5um/s以下时终止。
(5)成型
该步骤包括制具固定、冷冻干燥和激光微孔打孔3步，将材料4～12层叠加，固定 于制具(优选为不锈钢制具)上，然后用注射用水清洗洁净，将已固定于制具的材料放 于冷冻干燥机中，按照预先设计的冻干流程进行冷冻干燥：预冻至-25～-50℃(优选为 -25℃)，保温0.5～4小时(优选为2h)，升温15℃，保温4～12小时(优选为8h)，升温 15℃，保温0.5～4小时(优选为2h)，升温至25℃，保温4小时，冻干完成后，使用激 光微孔打孔机打孔(即贯穿性小孔)，孔径范围为0.5～2mm，孔间隔为0.5～1cm。所述 的激光微孔打孔是指利用激光技术将材料打出微米级的小孔，使用激光微孔打孔机打孔 是为了使单层间形成贯穿的孔隙，以利于组织修复，并增加单层间的粘附力。
(6)包装灭菌
在无菌的状态下进行包装，一层采用特卫强纸、另一层采用聚乙烯塑料，包装完成 后采用环氧乙烷进行灭菌。
所述步骤(1)中近交系动物优选为近交系猪，进一步优选为中国近交系五指山小 型猪。所述的中国近交系五指山小型猪是指ZL02149030.9所提供的动物品种，利用同 窝的一公一母五指山猪为系祖，采用“仔配母”、“全同胞交配”，培育出的近交系猪种 群。
作为优选，所述步骤(2)、(3)、(4)中清洗槽振荡频率为100～300rpm，进一步优 选为200rpm。
作为优选，所述步骤(2)、(3)、(4)中超声波频率为20～80KHZ，进一步优选为 45KHZ。
本发明中所述磷酸盐缓冲液的配制方法为称7.9g NaCl、0.2g KCl、0.24g KH2PO4、 1.8g K2HPO4，溶于800ml蒸馏水中，用HCl调节溶液的pH值至7.4，然后加蒸馏水定 容至1L。
本发明中注射用水的使用标准依照国家药典中规定。
本发明中所述的清洗槽可振荡的超声波清洗机是将传统超声波清洗机的清洗槽与 机械震荡器相结合，使清洗槽能够在超声波清洗的同时发生机械震荡，实现了机械振荡 与超声波清洗同时联合发挥作用。
与现有技术相比，本发明具有以下显著优点和有益效果：
本发明选用近交系动物作为动物来源，更进一步优选为中国近交系五指山小型猪 后，使该品种的近交系数高达0.991，基因高度纯合，具有遗传特征纯净、稳定、统一 的优势，在根本上保证了不同批次产品的稳定性和统一性，使个体之间的遗传背景差异 很小，从而决定了免疫原性的基因与人类具有很高的同源性。以该品种为动物来源开发 的小肠粘膜下层ECM材料产品的统一性、稳定性和低免疫源性高于以杂交系猪为原料 的产品。
本发明制备方法改进和优化了制备工艺，增加了DNA清除环节，确定了产品DNA 残留的标准。本发明病毒灭活采用低浓度过氧乙酸-乙醇溶液结合机械振荡和超声波清 洗，脱细胞采用低浓度氢氧化钠溶液结合机械振荡和超声波清洗，DNA清除采用氯化 钠溶液结合机械振荡和超声波清洗，每步骤完成后均采用磷酸盐缓冲液和注射用水清 洗。制备方法中的病毒灭活、脱细胞和DNA清除等步骤均同时结合机械振荡与超声波 清洗，制备方法将机械振荡与超声波振荡有效结合，提高了病毒灭活、脱细胞和DNA 清除工艺的效率，DNA残留量显著降低，大大降低了工艺耗时，简化了工艺流程，整 个制备过程仅使用过氧乙酸-乙醇、氢氧化钠和氯化钠3种溶液，并且浓度均远远低于 现有的制备技术，使制备的材料完全去除了免疫原性，完整保留了天然ECM的结构和 生长因子等有效成分，无有毒有害物质残留；并且，在成型工艺中创新性地将冷冻干燥 技术和激光微孔技术有效结合，保留天然ECM三维结构，孔隙不压缩，产品的抗感染 能力高。
附图说明
图1所示的是本发明实施例2中的试样剪裁示意图；
图2所示的是本发明实施例2中的光学显微镜图；
图3所示的是本发明实施例2中的电镜超微结构图。
具体实施方式
以下结合实施例对本发明作进一步具体描述，但不局限于此。
实施例1：8层硬脑膜生物修补片的制备
制备方法如下：
(1)动物源的确定和小肠组织的前置处理与初洗
选择中国近交系五指山小型猪作为动物来源，动物品种的确定采用专利 ZL200510008994.2所规定的方法，取新鲜屠宰的中国近交系五指山小型猪的小肠组织清 洗洁净，分离出小肠粘膜下层，使用注射用水冲洗3遍。
(2)病毒灭活
采用过氧乙酸-乙醇溶液法灭活病毒，该步骤在清洗槽可振荡的恒温超声波清洗器 中进行，其中过氧乙酸的体积百分含量为0.05～0.2％(优选为0.1％)，灭活时间为1～2h (优选为1h)，温度范围为4～40℃，然后在磷酸盐缓冲液中清洗2～5次，每次15min， 检测清洗后的磷酸盐缓冲液的pH值，当pH达到6.5-7.5后,以流动的注射用水清洗材料， 检测电导率达到1.5um/s以下时终止。清洗槽振荡频率为100～300rpm(优选为200rpm)， 超声波频率为20～80KHZ(优选为45KHZ)。
(3)脱细胞
该步骤在清洗槽可振荡的恒温超声波清洗器中进行，首先将材料置入清洗槽中，然 后在清洗槽中注入氢氧化钠溶液，开启清洗器，清洗时间为5～30min(优选为20min)， 氢氧化钠溶液浓度为5～100mmol/L(优选为5～20mmol/L，进一步优选为10mmol/L)， 然后关闭清洗器，将氢氧化钠溶液倾出，注入磷酸盐缓冲液进行清洗，开启清洗器，清 洗时间为5～20min(优选为15min)，磷酸盐缓冲液重复清洗2～5次，检测清洗后的磷酸 盐缓冲液的pH值，当pH达到6.5-7.5后,以流动的注射用水清洗材料，检测电导率达到 1.5um/s以下时终止。清洗槽振荡频率为100～300rpm(优选为200rpm)，超声波频率为 20～80KHZ(优选为45KHZ)。
(4)DNA清除处理
该步骤在清洗槽可振荡的恒温超声波清洗器中进行，将氯化钠溶液注入清洗槽中， 开启清洗器，清洗时间为5～30min(优选为20min)，氯化钠溶液浓度为0.015mol/l或 2mol/L(优选为0.015mol/L)、PH值不超过7.8，然后以流动的注射用水清洗材料，检 测电导率达到1.5um/s以下时终止。清洗槽振荡频率为100～300rpm(优选为200rpm)， 超声波频率为20～80KHZ(优选为45KHZ)。
(5)成型
该步骤包括制具固定、冷冻干燥和激光微孔打孔3步，将材料8层叠加，固定于不 锈钢制具上，然后用注射用水清洗洁净，将已固定于制具的材料放于冷冻干燥机中，按 照预先设计的冻干流程进行冷冻干燥：预冻至-25～-50℃(优选为-25℃)，保温0.5～4小 时(优选为2h)，升温15℃，保温4～12小时(优选为8h)，升温15℃，保温0.5～4小 时(优选为2h)，升温至25℃，保温4小时，冻干完成后，使用激光微孔打孔机打孔， 孔径范围为0.5～2mm，孔间隔为0.5～1cm。所述的激光微孔打孔是指利用激光技术将材 料打出微米级的小孔，使用激光微孔打孔机打孔是为了使材料表面形成孔隙，以利于组 织修复。
(6)包装灭菌
在无菌的状态下进行包装，一层采用特卫强纸、另一层采用聚乙烯塑料，包装完成 后采用环氧乙烷进行灭菌。
实施例2：实施例1所制备的材料的理化性质、组织学、生长因子和生物学性能检 测
1.对制备的8层材料进行物理性能检测，检测项目包括孔隙率测定、缝合保持力、抗 张强度、爆破强度。
1)孔隙率测定：采用压汞法测定材料的孔隙率，并与并与Biodesign Surgisis产品 进行对比。结果：实施例1提供的样品的孔隙率为87.8±2.51，Biodesign Surgisis产品孔 隙率为78.3±6.38。
2)缝合保持力检测：方法：用2-0的外科缝线或相同直径的不锈钢丝缝合在修补片 一端边缘内2毫米处，将缝线或不锈钢丝与修补片的另一端固定在拉力仪上，以 20mm/min的速度进行拉伸，直到缝合点被撕裂，记录下缝合点被撕裂时的拉力。按上 述方法对3批样品进行检测。结果：缝合抗拉强度大于或等于5±0.5N。
3)抗张强度检测方法：方法：使用拉伸(压缩)试验机，按照图1所示，将修补片 裁剪成试样，裁剪后在相对湿度为40％-60％，温度为22℃±2℃的条件下放置2h后立即 进行试验。将试样两端固定在拉伸试验机的夹头上,以100mm/min的速度依次向外拉伸 直到试样断裂，纵向试样和横向试样分别进行试验。以N为单位记录下试样断裂时的力。 按上述方法对3批样品进行检测。结果：纵向：15N，横向：8N。
4)爆破强度检测：方法：使用拉伸(压缩)试验机，将材料裁剪成23×23mm的 正方形试样备用，在相对湿度为40％-60％，温度为24℃±2℃的条件下放置2h后立即进 行试验。用环形夹具将试样固定在拉伸仪的工作台上，使球形探头以750mm/min的速度 穿过试样，记录下探头穿破试样的力。按上述方法对3批样品进行检测。结果：爆破强 度大于120N。
2.化学性能检测，检测项目包括病毒、酸碱度、内毒素和DNA残留量。
1)检验液制备:检验液制备:取样品的厚度均匀部分，切成1cm2的碎片，用水洗净 后晾干，然后加入玻璃容器中，按样品内外总表面积(cm2)与水(mL)的比为5：1的 比例加水，加盖后置于压力蒸汽灭菌器中，在121℃±1℃加热30min，加热结束后将样 品与液体分离，冷至室温作为检验液。取同体积水置于玻璃容器中，同法制备空白对照 液。
2)病毒检测：方法：选择伪狂犬病毒为指示病毒，采用实时定量PCR法检测病毒 DNA拷贝数，检测3批样品。结果：病毒DNA拷贝数0。
3)酸碱度检测：按GB/T14233.1中5.4.1(《医用输液、输血、注射器具检验方法第 1部分：化学分析方法》)中规定的方法试验，结果：检验液与空白对照液的PH值之差 不超过1.5。
4)内毒素：按6cm2样品加1ml浸提介质的比例，37±1℃，72±2hr制备试验液， 浸提介质：生理盐水。按GB/T 14233.2-2005(《医用输液、输血、注射器具检验方法 第2部分:生物学试验方法》)规定的方法进行，检测3批样品。结果：内毒素含量小于 5EU/g。
5)DNA残留量检测：依据生物制剂残留DNA检测方法(《中国药典》2010，附 录IX－B外源性DNA残留量测定法)，采用荧光染色法检测实施例1所提供的样品的 DNA残留量，并与Biodesign Surgisis产品进行对比。结果：实施例1所提供的样品的 DNA残留量为120±15pg/g，Biodesign Surgisis产品的DNA残留量为250±45pg/g。
3.组织学检测
1)光学显微镜观察：方法：石蜡包膜后的材料行苏木精—伊红染色，倒置相差显 微镜观察。结果：无细胞和细胞碎片残留，胶原显微连续无断裂，如图2所示。
2)超微结构观察。结果：材料呈多孔结构，纤维无断裂，孔径均匀，平均孔径大 小为200um,孔隙率大于85％，如图3所示。
4.生长因子检测：
按6cm2样品加1ml浸提介质的比例，37±1℃，72±2hr制备试验液，浸提介质：生 理盐水。采用ELLISA法检测浸提液中碱性生长因子(bFGF)和血管内皮生长因子 (VEGF)含量。结果：bFGF含量为121.8±2.683ng/L，VEGF含量为93.8±3.033ng/L。
5.生物学性能检测，检测项目包括细胞毒性、迟发型超敏反应、皮内反应。
1)细胞毒性:方法：按6cm2样品加1ml浸提介质的比例，37±1℃，24±2hr制备试 验液，浸提介质:含血清的MEM培养基。取试验液按照GB/T16886.5-2003(《医疗器械 生物学评价第十部分：刺激与迟发型超敏反应试验》)中规定的试验方法进行试验。结 果：细胞毒性反应小于或等于1级。
2)迟发型超敏反应:方法：按6cm2样品加1ml浸提介质的比例，37±1℃，72±2hr 制备试验液，浸提介质为生理盐水和棉籽油。按照CB/T 16886.10-2005(《医疗器械生 物学评价第10部分：刺激与迟发型超敏反应试验》)试验方法规定进行试验。结果：无 迟发型超敏反应。
3)皮内反应:按6cm2样品加1ml浸提介质的比例，37±1℃，72±2hr制备试验液， 浸提介质为生理盐水和棉籽油。按照CB/T 16886.10-2005(《医疗器械生物学评价第10 部分：刺激与迟发型超敏反应试验》)试验方法规定进行试验。结果：试验样品与溶剂 对照平均记分之差小于1.0。
本发明的上述实施例是对本发明的说明而不能用于限制本发明，与本发明的权利要 求书相当的含义和范围内的任何改变，都应认为是包括在权利要求书的范围内。
序列表：
序列2：
5’TCTGGAGCTAGCATAAGTGCC 3’
序列3：
5’GTGCAAGTACACATGCAGGG 3’