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靶定补体蛋白 C3B 的抗体的组合物和方法
    发明背景
     年龄相关性黄斑变性 (AMD) 是进行性疾病， 并且是美国年龄 65 岁及以上老年人视 觉丧失和失明的主要原因。AMD 主要影响黄斑 ； 其为负责阅读或开车所需的高视敏度的视 网膜的一部分。大多数 AMD 患者遭受该疾病的早期阶段， 所述疾病的特征在于存在称为玻 璃疣的细胞外视网膜沉积物。 玻璃疣是细胞碎片的细胞外视网膜沉积物、 炎症介质、 和细胞 外基质组分。AMD 的晚期阶段表现为干涩或湿润形式， 两者均与视觉丧失相关。干涩 AMD， 也称为地图样萎缩， 在检眼镜检查中呈现为界线清楚的区域， 其对应于视网膜色素上皮细 胞 (RPE) 丧失的局部区域。湿润 AMD 与脉络膜的新血管形成相关， 引起 Bruch’ s 膜完整性 受损和视网膜中脉管生长， 其中它们经常出血。 这种渗漏引起对视网膜细胞的永久性损伤， 它们相继死亡的， 并在中央视觉区产生盲点。
     人先天性系统由补体途径组成。补体途径作用于防御化脓性细菌感染， 桥接先天 性和适应性免疫 ； 并去除免疫复合体的产物和炎性损伤。补体是在血浆和细胞表面参与级 联反应的多于 30 种蛋白质的系统。补体系统及其补体组分参与多种免疫过程。例如， 补体 C5b-9 复合体， 也称为末端复合体或膜攻击复合体 (MAC)， 通过诱导膜通透性损伤而在细胞 死亡中起重要作用。
     近期工作已经证明， 补体组分 C3 和 C5 是 AMD 患者中玻璃疣的主要成分。 Mulling， R.F. 等 (2000)FASEB J 14， 835-46。已经推测它们以及膜攻击复合体 (MAC)C5b-9 和其它 急性期反应蛋白在玻璃疣上 RPF 细胞中的存在参与了可激发补体激活和 MAC 形成的过程。 Johnson， L 等 (2001)Exp Eye Res 73， 887-896。因此， 越来越多的证据表明， 补体组分不仅 仅是先天性免疫的介体。
     已经建议营养干预用于抑制干涩 AMD 发展成湿润 AMD。目前， 仅 FDA 批准的湿 润 AMD 的 治 疗 包 括 光 动 力 学 疗 法 (PDT)、 抗 VEGF 适 体， 如 pegaptanib， 和 抗 VEGF 抗 体 ranibizumab。这些药物或治疗通常向已患有重大视觉丧失的患者施用。
     仍然需要开发 AMD 的有效治疗， 来替换或补充目前的治疗。尤其是， 需要可以提供 早期检测、 预防或恢复视觉丧失的治疗。
     发明概述
     本发明涉及分离的抗体或其抗原结合片段， 其特异性结合人或猕猴补体 C3b 蛋 白， 其中所述抗体以低于或等于 100pM 的 KD 结合人 C3b， 并以低于或等于 200pM 的 KD 结合 猕猴 C3b。例如， 此处描述的抗体或抗原结合片段可以低于或等于 90pM、 低于或等于 80pM、 低于或等于 70pM、 低于或等于 60pM、 低于或等于 50pM、 低于或等于 40pM、 低于或等于 30pM， 并优选高达低于或等于 20、 19、 18、 17、 16、 15、 14、 13、 12 或 11pM 的 KD 结合人 C3b。优选的 是， 抗体或其抗原结合片段以低于或等于 10pM 的 Kd 结合人 C3b。例如， 抗体或其抗原结合 片段可以低于或等于 9pM、 低于或等于 8pM、 低于或等于 7pM、 低于或等于 6pM、 低于或等于 5pM、 低于或等于 4pM、 低于或等于 3pM、 低于或等于 2pM， 或高达低于或等于 1pM 的 KD 结合 C3b。此处描述的抗体或抗原结合片段可以低于或等于 250pM、 低于或等于 240pM、 低于或等 于 230pM、 低于或等于 220pM、 低于或等于 210pM、 低于或等于 200pM、 低于或等于 190pM、 低于
     或等于 180pM、 低于或等于 170pM、 低于或等于 160pM、 低于或等于 150pM、 低于或等于 140pM、 低于或等于 130pM、 低于或等于 120pM、 低于或等于 110pM、 低于或等于 100pM、 低于或等于 90pM、 低于或等于 80pM、 低于或等于 70pM、 低于或等于 60pM、 低于或等于 50pM、 低于或等于 40、 39、 38、 37、 36、 35、 34、 33、 32 或 31pM、 低于或等于 30pM、 低于或等于 20、 19、 18、 17、 16、 15、 14、 13、 12 或 11pM 并优选高达低于或等于 10、 9、 8、 7、 6、 5、 4、 3、 2 或 1pM 的 KD 结合猕猴 C3b。
     优选通过溶液平衡滴定 (SET) 测定此处描述的抗体的结合亲和力。SET 的方法为 本领域所知并在下文中进行了进一步的详细描述。
     本发明的抗体可用于抑制补体旁路。例如， 此处描述的抗体或其片段如体外溶血 测定所测定以低于或等于 70nM、 优选低于或等于 65nM、 优选低于或等于 50nM、 优选低于或 等于 40nM、 30nM 或 20nM， 并更优选低于或等于 10nM 的 IC50 抑制补体旁路。 此处描述的抗体 或其片段如体外溶血测定所测定以低于或等于 100nM、 优选低于或等于 90nM、 优选低于或 等于 80nM、 优选低于或等于 75nM， 并更优选低于或等于 70nM 的 IC50 抑制猕猴中的补体旁 路。 此处描述的抗体或其片段如体外 C3b 沉积所测定以低于或等于 30nM、 低于或等于 25nM、 低于或等于 20nM， 并优选低于或等于 10nM 的 IC50 抑制补体旁路。此处描述的抗体或其片 段可如体外 C3b 沉积所测定以低于或等于 70nM、 低于或等于 50nM、 低于或等于 40nM， 并优选 低于或等于 30nM 的 IC50 抑制猕猴中的补体旁路。
     此处描述的抗体或其片段如补体膜攻击复合体的沉积所测定以低于或等于 5nM， 优选低于或等于 4nM、 3nM、 2nM， 并更优选低于或等于 1nM 的 IC50 抑制补体旁路。此处描述 的抗体或其片段如补体膜攻击复合体的沉积所测定以低于或等于 20nM， 优选低于或等于 19nM、 18nM、 17nM、 16nM、 15nM、 14nM 或 13nM， 并更优选低于或等于 10nM 的 IC50 抑制猕猴中 的补体旁路。
     此处描述的抗体或其片段如通过产生 C3a 和 C5a 测定以低于或等于 100nM， 优选低 于或等于 90nM、 80nM、 70nM、 60nM、 50nM、 40nM、 30nM 或 20nM， 并更优选低于或等于 10nM 抑制 补体旁路。
     本发明描述的抗体或其抗原结合片段优选具有如表 12 中所示的 Fab 的结合特征。
     本发明还包括分离的抗体或其抗原结合片段， 其特异性结合人或猕猴的补体 C3b 蛋白， 并与表 1 中描述的抗体交叉竞争。
     此处描述的抗体或其抗原结合片段可以是单克隆抗体、 人或人源化抗体、 嵌合抗 体、 单链抗体、 Fab 片段、 Fv 片段、 F(ab’ )2 片段、 或 ScFv 片段、 和 / 或 IgG 同种型。
     本发明的抗体可包括这样的构架， 其中氨基酸已经替换成来自各人 VH 或 VL 种系 序列的抗体构架。
     一方面， 本发明的抗体以比所述抗体结合 C3 的亲和力高至少 1000 倍的亲和力结 合 C3b。
     本发明包括具有表 1 中抗体 9556 的重链和轻链序列的抗体或其抗原结合片段。 本 发明包括具有表 1 中抗体 9611 的重链和轻链序列的抗体或其抗原结合片段。本发明包括 具有表 1 中抗体 9612 的重链和轻链序列的抗体或其抗原结合片段。本发明还包括具有表 1 中抗体 9609 的重链和轻链序列的抗体或其抗原结合片段。本发明包括具有表 1 中抗体 9610 的重链和轻链序列的抗体或其抗原结合片段。本发明还包括具有表 1 中抗体 9674 的 重链和轻链序列的抗体或其抗原结合片段。本发明又进一步包括具有表 1 中抗体 9675 的重链和轻链序列的抗体或其抗原结合片段。本发明包括具有表 1 中抗体 9124 的重链和轻 链序列的抗体或其抗原结合片段。本发明还包括具有表 1 中抗体 9397 的重链和轻链序列 的抗体或其抗原结合片段。本发明还包括具有表 1 中抗体 9398 的重链和轻链序列的抗体 或其抗原结合片段。本发明还包括具有表 1 中抗体 9136 的重链和轻链序列的抗体或其抗 原结合片段。本发明还包括具有表 1 中抗体 9141 的重链和轻链序列的抗体或其抗原结合 片段。本发明又进一步包括具有表 1 中抗体 9373 的重链和轻链序列的抗体或其抗原结合 片段。本发明还包括具有表 1 中抗体 9423 的重链和轻链序列的抗体或其抗原结合片段。
     本发明包括具有表 1 中抗体 9556 的重链和轻链可变域序列的抗体或其抗原结合 片段。本发明包括具有表 1 中抗体 9611 的重链和轻链可变域序列的抗体或其抗原结合片 段。本发明包括具有表 1 中抗体 9612 的重链和轻链可变域序列的抗体或其抗原结合片段。 本发明还包括具有表 1 中抗体 9609 的重链和轻链可变域序列的抗体或其抗原结合片段。 本 发明包括具有表 1 中抗体 9610 的重链和轻链可变域序列的抗体或其抗原结合片段。本发 明还包括具有表 1 中抗体 9674 的重链和轻链可变域序列的抗体或其抗原结合片段。本发 明又进一步包括具有表 1 中 9675 抗体的重链和轻链可变域序列的抗体或其抗原结合片段。 本发明包括具有表 1 中 9124 抗体的重链和轻链可变域序列的抗体或其抗原结合片段。本 发明还包括具有表 1 中 9397 抗体的重链和轻链可变域序列的抗体或其抗原结合片段。本 发明还包括具有表 1 中 9398 抗体的重链和轻链可变域序列的抗体或其抗原结合片段。本 发明还包括具有表 1 中 9136 抗体的重链和轻链可变域序列的抗体或其抗原结合片段。本 发明还包括具有表 1 中 9141 抗体的重链和轻链可变域序列的抗体或其抗原结合片段。本 发明又进一步包括具有表 1 中 9373 抗体的重链和轻链可变域序列的抗体或其抗原结合片 段。本发明还包括具有表 1 中 9423 抗体的重链和轻链可变域序列的抗体或其抗原结合片 段。
     本发明还涉及分离的抗体或其抗原结合片段， 其包括选自 SEQ IDNOs ： 1、 15、 29、 43、 57、 71、 85、 99、 113、 127、 141、 155、 169 和 183 的重链 CDR1 ； 选自 SEQ ID NOs ： 2、 16、 30、 44、 58、 72、 86、 100、 114、 128、 142、 156、 170 和 184 的重链 CDR2 ； 和选自 SEQ ID NOs ： 3、 17、 31、 45、 59、 73、 87、 101、 115、 129、 143、 157、 171 和 185 的重链 CDR3， 其中所述分离的抗体或其抗原结 合片段结合补体蛋白 C3b。在其它方面， 分离的抗体或其抗原结合片段还包括选自 SEQ ID NOs ： 4、 18、 32、 46、 60、 74、 88、 102、 116、 130、 144、 158、 172 和 186 的 轻 链 CDR1 ； 选 自 SEQ ID NOs ： 5、 19、 33、 47、 61、 75、 89、 103、 117、 131、 145、 159、 173 和 187 的轻链 CDR2 ； 和选自 SEQ ID NOs ： 6、 20、 34、 48、 62、 76、 90、 104、 118、 132、 146、 160、 174 和 188 的轻链 CDR3。
     本发明还涉及分离的抗体或其抗原结合片段， 其包括选自 SEQ IDNOs ： 4、 18、 32、 46、 60、 74、 88、 102、 116、 130、 144、 158、 172 和 186 的轻链 CDR1 ； 选自 SEQ ID NOs 5、 19、 33、 47、 61、 75、 89、 103、 117、 131、 145、 159、 173 和 187 的轻链 CDR2 ； 和选自 SEQ ID NOs 6、 20、 34、 48、 62、 76、 90、 104、 118、 132、 146、 160、 174 和 188 的轻链 CDR3， 其中所述分离的抗体或其抗 原结合片段结合补体蛋白 C3b。
     本发明还涉及分离的抗体或其抗原结合片段， 其包括选自 SEQ IDNOs ： 7、 21、 35、 49、 63、 77、 91、 105、 119、 133、 147、 161、 175 和 189 的重链可变域序列， 还包括选自 SEQ ID NOs ： 8、 22、 36、 50、 64、 78、 92、 106、 120、 134、 148、 162、 176 和 190 的轻链可变域序列， 其中所 述分离的抗体或其抗原结合片段结合补体蛋白 C3b。本发明还涉及分离的抗体或其抗原结合片段， 其包括选自 SEQ IDNOs ： 8、 22、 36、 50、 64、 78、 92、 106、 120、 134、 148、 162、 176 和 190 的轻链可变域序列， 其中所述分离的抗体 或其抗原结合片段结合补体蛋白 C3b。
     本发明还涉及分离的抗体或其抗原结合片段， 其包括与选自 SEQ IDNOs ： 7、 21、 35、 49、 63、 77、 91、 105、 119、 133、 147、 161、 175 和 189 的序列具有至少 95％序列同一性的重链可 变域， 其中所述抗体结合 C3b。一方面， 分离的抗体或其抗原结合片段还包括与选自 SEQ ID NOs 8、 22、 36、 50、 64、 78、 92、 106、 120、 134、 148、 162、 176 和 190 的序列具有至少 95％序列同 一性的轻链可变域。
     本发明还涉及分离的抗体或其抗原结合片段， 其包括与选自 SEQ IDNOs 8、 22、 36、 50、 64、 78、 92、 106、 120、 134、 148、 162、 176 和 190 的序列具有至少 95％序列同一性的轻链可 变域， 其中所述抗体结合 C3b。
     本发明还进一步涉及分离的抗体或其抗原结合片段， 其包括与选自 SEQ ID NOs 9、 23、 37、 51、 65、 79、 93、 107、 121、 135、 149、 163、 177 和 191 的序列具有至少 95％序列同一性 的重链， 其中所述抗体结合 C3b。一方面， 分离的抗体或其抗原结合片段还包括与选自 SEQ ID NOs10、 24、 38、 52、 66、 80、 94、 108、 122、 136、 150、 164、 178 和 192 的序列具有至少 95％序 列同一性的轻链。 本发明进一步涉及分离的抗体或其抗原结合片段， 其包括与选自 SEQID NOs 10、 24、 38、 52、 66、 80、 94、 108、 122、 136、 150、 164、 178 和 192 的序列具有至少 95％序列同一性的 轻链， 其中所述抗体结合 C3b。
     本发明还包括药物组合物， 其包含此处描述的抗体组合物以及药学上可接受的载 体。 尤其是， 本发明包括药物组合物， 其包含表 1 的抗体或其抗原结合片段， 例如抗体 9556、 9611、 9612、 9609、 9610、 9674、 9675、 9124、 9397、 9398、 9136、 9141、 9373 或 9423。本发明还包 括药物组合物， 其包含表 1 的两种或多种抗体或其抗原结合片段的组合。
     本发明还包括分离的核酸， 其包含编码这样的多肽的序列， 所述多肽包括与选自 SEQ ID NOs ： 7、 21、 35、 49、 63、 77、 91、 105、 119、 133、 147、 161、 175 和 189 的 序 列 具 有 至 少 95％序列同一性的重链可变域。
     本发明还涉及分离的核酸， 其包含编码这样的多肽的序列， 所述多肽包括与选自 SEQ ID NOs 8、 22、 36、 50、 64、 78、 92、 106、 120、 134、 148、 162、 176 和 190 的 序 列 具 有 至 少 95％序列同一性的轻链可变域。
     一方面， 本发明还包括这样的载体， 其包括一种或多种此处描述的核酸分子。
     本发明还包括分离的宿主细胞， 其包括编码上文描述的抗体重链的重组 DNA 序 列， 和编码所述抗体轻链的第二个重组 DNA 序列， 其中所述 DNA 序列有效连接启动子， 并能 够在宿主细胞中表达。期望抗体可以是人单克隆抗体。还期望宿主细胞是非人哺乳动物细 胞。
     本发明还涉及治疗年龄相关性黄斑变性的方法， 其中所述方法包括向需要治疗的 受试者施用有效量的包含此处描述的抗体或其片段的组合物的步骤。期望受试者是人。
     本发明还提供在受试者中抑制补体旁路的方法， 其中所述方法包括向需要抑制的 受试者施用有效量的包含此处描述的抗体或其抗原结合片段的组合物的步骤。一方面， 受 试者是人。
     本发明还提供抑制 C3b 结合因子 B、 P 或 H 的方法， 其包括使 C3b 与此处描述的抗 C3b 抗体或其片段接触。
     本发明还提供抑制 C3 转变酶、 C4 转变酶和 C3b-C3b 二聚体形成的方法， 其包括使 C3b 与抗 C3b 抗体或其片段接触。
     本发明还包括分离的抗体或其抗原结合片段， 其包含与选自 SEQ IDNOs ： 1、 2、 3、 4、 5、 6、 15、 16、 17、 18、 19、 20、 29、 30、 31、 32、 33、 34、 43、 44、 45、 46、 47、 48、 57、 58、 59、 60、 61、 62、 71、 72、 73、 74、 75、 76、 85、 86、 87、 88、 89 和 90 的序列具有至少 80％、 85％、 90％， 以及高达至 少 95 ％的序列同一性的至少一个互补性决定区 (CDR) 序列， 其中所述抗体结合补体蛋白 C3b。
     本发明还包括分离的抗体或其抗原结合片段， 其包含选自 SEQ IDNOs ： 1、 2、 3、 15、 16、 17、 29、 30、 31、 43、 44、 45、 57、 58、 59、 71、 72、 73、 85、 86 和 87 的至少一个重链 CDR 序列， 其 中所述抗体结合 C3b。
     本发明还包括分离的抗体或其抗原结合片段， 其包含选自 SEQ IDNOs ： 4、 5、 6、 18、 19、 20、 32、 33、 34、 46、 47、 48、 60、 61、 62、 74、 75、 76、 88、 89 和 90 的至少一个轻链 CDR 序列， 其 中所述抗体结合 C3b。 本发明还包括分离的抗原结合多肽， 其包含选自 SEQ ID NOs ： 1、 15、 29、 43、 57、 71 和 85 的重链 CDR1 ； 选自 SEQ ID NOs ： 2、 16、 30、 44、 58、 72 和 86 的重链 CDR2 ； 和选自 SEQ ID NOs ： 3、 17、 31、 45、 59、 73 和 87 的重链 CDR3， 其中所述抗原结合多肽结合补体蛋白 C3b。
     本发明还包括抗原结合多肽， 其包含选自 SEQ ID NOs ： 4、 18、 32、 46、 60、 74 和 88 的 轻链 CDR1 ； 选自 SEQ ID NOs 5、 19、 33、 47、 61、 75 和 89 的轻链 CDR2 ； 和选自 SEQ ID NOs 6、 20、 34、 48、 62、 76 和 90 的轻链 CDR3， 其中所述抗原结合多肽结合补体蛋白 C3b。
     除了包括上文指出的重链 CDR 序列的抗原结合多肽外， 抗原结合多肽还包括选自 SEQ ID NOs ： 4、 18、 32、 46、 60、 74 和 88 的轻链 CDR1 ； 选自 SEQ ID NOs 5、 19、 33、 47、 61、 75 和 89 的轻链 CDR2 ； 和选自 SEQID NOs 6、 20、 34、 48、 62、 76 和 90 的轻链 CDR3。
     此处描述的抗体结合多肽以低于或等于 100pM， 优选低于或等于 10pM， 优选低于 或等于 2pM 的 KD 结合 C3b。此外， 优选地， 抗原结合多肽结合人和猕猴 C3b。
     本发明还包括调节 C3b 的方法， 其包括向需要调节的受试者施用有效量的抗体、 其抗原结合片段或此处描述的抗原结合多肽。
     任何上述抗体或其抗原结合片段可以是单克隆抗体或其抗原结合片段。
     定义
     除非另有定义， 此处所用的所有技术和科技术语具有本发明所属领域中普通技术 人员通常理解的相同意思。
     如此处所用的术语 “抗体” 包括完整抗体及其任何抗原结合片段 ( 即 “抗原结合部 分” ) 或单链。天然存在的 “抗体” 是包含通过二硫键相互连接的至少两条重 (H) 链和两条 轻 (L) 链的糖蛋白。每一重链包含重链可变区 ( 此处缩写为 VH) 和重链恒定区。所述重链 恒定区包含三个结构域， CH1、 CH2 和 CH3。每一轻链包含轻链可变区 ( 缩写为 VL) 和轻链恒 定区。所述轻链恒定区包含一个结构域 CL。VH 和 VL 区可进一步细分成高变区， 称为互补 决定区 (CDR)， 它们散布着称为构架区 (FR) 的更保守的区域。每一 VH 和 VL 由以下面顺序 从氨基末端到羧基末端排列的三个 CDR 和四个 FR 组成 ： FR1、 CDR1、 FR2、 CDR2、 FR3、 CDR3、
     FR4。重链和轻链的可变区含有与抗原相互作用的结合域。抗体的恒定区可介导免疫球蛋 白与宿主组织或因子， 包括免疫系统的多种细胞 ( 例如效应细胞 ) 和经典补体系统的第一 个组分 (Clq) 的结合。
     如此处所用， 术语抗体的 “抗原结合部分” 指完整抗体的一个或更多片段， 其保留 与给定抗原 ( 例如 C3b) 特异性结合的能力。可通过完整抗体的片段进行抗体的抗原结合 功能。术语抗体的 “抗原结合部分” 中包括的结合片段的实例包括 Fab 片段， 其为 VL、 VH、 CL 和 CH1 结构域组成的单价片段 ； F(ab)2 片段， 其为包含在铰链区通过二硫键连接的两个 Fab 片段的二价片段 ； 由 VH 和 CH1 结构域组成的 Fd 片段 ； 由抗体单条臂的 VL 和 VH 结构域 组成的 Fv 片段 ； 单结构域抗体 (dAb) 片段 (Ward 等， 1989Nature 341 ： 544-546)， 其由 VH 结 构域或 VL 结构域组成 ； 和分离的互补决定区 (CDR)。
     此外， 尽管 Fv 片段的两个结构域 VL 和 VH 由单独的基因编码， 但可使用重组方法， 通过人工肽接头将它们连接， 所述人工肽接头使得它们能够制备成单条蛋白质链， 其中 VL 和 VH 区域配对形成单价分子 ( 称为单链 Fv(scFv) ； 参阅例如 Bird 等， 1988 Science 242 ： 423-426 ； 和 Huston 等， 1988Proc.Natl.Acad.Sci.85 ： 5879-5883)。 此类单链抗体包括抗体 的一个或更多 “抗原结合部分” 。使用本领域技术人员已知的常规技术获得这些抗体片段， 并筛选所述片段， 以与完整抗体相同的方式使用所述片段。
     抗 原 结 合 部 分 也 可 掺 入 到 单 结 构 域 抗 体、 巨 型 抗 体 (maxibodies)、 微型抗体 (minibodies)、 胞内抗体、 双抗体、 三抗体、 四抗体、 v-NAR 和 bis-scFv( 参阅例如 Hollinger 和 Hudson， 2005， Nature Biotechnology， 23， 9， 1126-1136)。抗体的抗原结合部分可移植 到基于多肽如 III 型纤连蛋白 (Fn3) 的支架中 ( 参阅美国专利号 6,703,199， 其描述了纤连 蛋白多肽单抗体体 )。
     抗原结合部分可掺入到包含一对串联 Fv 区段 (VH-CH1-VH-CH1) 的单链分子中， 所述串联 Fv 区段与互补轻链多肽一起形成一对抗原结合区 (Zapata 等， 1995 Protein Eng.8(10) ： 1057-1062 ； 和美国专利号 5,641,870)。
     如此处所用， 术语 “亲和力” 指抗体与抗原在单个抗原位点上相互作用的强度。在 每一抗原位点中， 抗体 “臂” 的可变区与抗原在许多位点上通过弱的非共价力相互作用 ； 相 互作用越多， 亲和力越强。
     如此处所用， 术语 “亲合力” 指抗体 - 抗原复合物的总稳定性或强度的信息化量 度。其受三个主要因素控制 ： 抗体表位亲和力 ； 抗原与抗体两者的效价 ； 和相互作用部分的 结构排列。最终这些因素决定了抗体的特异性， 即特定抗原结合精确抗原表位的可能性。
     术语 “氨基酸” 指天然发生的和合成的氨基酸， 以及与天然发生的氨基酸以相似方 式起作用的氨基酸类似物和氨基酸模拟物。 天然发生的氨基酸是由遗传密码编码的那些氨 基酸， 以及稍后被例如羟脯氨酸、 γ- 羧基谷氨酸和 O- 磷酸丝氨酸修饰的那些氨基酸。 氨基 酸类似物指这样的化合物， 其与天然发生的氨基酸具有相同的基本化学结构， 即与氢结合 的 α 碳、 羧基、 氨基和 R 基团， 例如高丝氨酸、 正亮氨酸、 甲硫氨酸亚砜、 甲硫氨酸甲锍。此 类类似物具有修饰的 R 基团 ( 例如， 正亮氨酸 ) 或修饰的肽骨架， 但保留了与天然发生的氨 基酸相同的基本化学结构。 氨基酸模拟物指具有与氨基酸的一般化学结构不同结构的化合 物， 但它以与天然发生的氨基酸类似的方式起作用。
     如此处所用， 术语 “结合特异性” 指各抗体结合位点与仅一个抗原决定簇相互作用的能力。抗体的结合部位位于分子的 Fab 部分， 并从重链和轻链的高变区构建。抗体的结 合亲和力是单个抗原决定簇与抗体上单个结合部位之间反应的强度。 其为抗原决定簇与抗 体结合部位之间起作用的吸引力和排斥力的总和。
     两 个 实 体 之 间 的 特 异 性 结 合 表 示 平 衡 常 数 (KA) 为 至 少 1x107M-1、 108M-1、 109M-1、 1010M-1、 1011M-1、 1012M-1、 1013M-1 的结合。短语与抗体 ( 例如， C3b 结合抗体 ) 的 “特异性 ( 或选择性 ) 结合” 指决定近亲抗原 ( 例如人 C3b 或猕猴 C3b) 在蛋白质和其它 生物产品的异质群体中的存在的结合反应。除了上文指出的平衡常数 (KA)， 本发明的 C3b 结合抗体通常还具有约 1x10-2s-1、 1x10-3s-1、 1x10-4s-1、 1x10-5s-1 或更低的解离速率 常数 (Kd)， 并且以比其结合非特异性抗原 ( 例如 C3) 的亲和力至少 10 倍， 优选 100 倍， 或高 达 1000 倍或更高的亲和力结合 C3b。 。短语 “识别抗原的抗体” 和 “对抗原特异的抗体” 此 处可与 “特异性结合抗原的抗体” 互换使用。
     如此处所用， “neo- 表位” 或 “neo- 抗原” 可互换使用， 并且是蛋白水解切割 C3 后 C3b 上存在的蛋白质的抗原部分。这些 neo- 表位在未切割的 C3 上不容易接近。
     术语 “与黄斑变性相关的状况或病症” 指任何多种这样的状况， 其中例如因黄斑细 胞生长降低引起视网膜黄斑变性或无功能， 增加了黄斑细胞 ( 例如 RPE 细胞 ) 的死亡或重 排、 正常生物学功能的丧失， 或这些事件的组合。黄斑变性导致细胞组织结构的完整性和 / 或正常黄斑的胞外基质的缺失和 / 或黄斑细胞的功能缺失。黄斑变性相关病症的实例包括 AMD、 北卡罗来纳黄斑营养不良、 Sorsby′ s 眼底营养不良、 隐性黄斑营养不良、 模式营养不 良、 卵黄状黄斑变性、 显性玻璃疣， 和 malattia leventinese( 辐射玻璃疣 )。 该术语还包括 黄斑异常和 / 或变性之前或之后发生的黄斑外改变。因此， 术语 “黄斑变性相关病症” 还广 泛地包括改变或损坏黄斑完整性或功能的任何状况 ( 例如， RPE 或 Bruch′ s 膜的损伤 )。 例如， 该术语包括视网膜脱落、 脉络膜视网膜变性、 视网膜变性、 光感受器退化、 RPE 变性、 粘 多糖病、 视杆 - 视椎营养不良、 视椎 - 视杆营养不良和视椎变性。
     术语 “补体组分” 、 “补体蛋白” 或 “补体组分蛋白” 指参与激活补体系统的分子。经 典途径组分包括， 例如 C1q、 C1r、 C1s、 C4、 C2、 C3、 C5、 C6、 C7、 C8、 C9 和 C5b-9 复合体 ( 膜攻 击复合体 ： MAC)。旁路途径组分包括， 例如因子 B、 因子 D、 备解素、 H 和 I。
     术语 “调节” 或 “调节” 在此处互换使用， 指活性或生物学过程 ( 例如， 补体过程 ) 的上调 ( 即， 激活或刺激 ( 例如， 通过激动或加强 )) 和下调 ( 即， 抑制或阻遏 ( 例如， 通过 拮抗、 降低或抑制 ))。 “调节” 旨在描述过程的上调或下调。可通过刺激物的拮抗剂抑制通 过该刺激物上调的过程。相反地， 可通过修饰剂的激动剂抑制通过该修饰剂下调的过程。
     术语 “补体途径相关分子” 、 “补体途径分子” 和 “补体途径相关蛋白” 可互换使用， 并指在补体激活和响应激活的补体系统介导的或激活的补体系统触发的下游细胞活性中 起作用的多种分子。它们包括补体途径的起始物 ( 即， 直接或间接触发补体系统激活的分 子 )、 在补体激活过程中产生的或起作用的分子 ( 例如， 补体蛋白 / 酶， 如 C3、 C5、 C5b-9、 因 子 B、 因子 D、 MASP-1 和 MASP-2)、 补体受体或抑制剂 ( 例如， 簇蛋白、 玻连蛋白、 CR1 或 CD59)， 和激活的补体系统调节或触发的分子 ( 例如， 膜攻击复合体抑制因子、 MACIF ； 参阅例如， ugita 等， J Biochem， 106 ： 589-92， 1989)。因此， 除了此处指出的补体蛋白， 补体途径相关 分子还包括， 例如 C3/C5 转变酶调节子 (RCA)， 如补体受体类型 1( 也称为 CR1 或 CD35)、 补 体受体类型 2( 也称为 CR2 或 CD21)、 膜辅因子蛋白 (MCP 或 CD46)， 和 C4bBP ； MAC 调节子， 如玻连蛋白、 簇蛋白 ( 也称为 “SP40， 40” )、 CRP、 CD59， 和同源限制因子 (HRF) ； 免疫球蛋白链， 如 Igκ、 Igλ 或 Igγ ； C1 抑制剂 ； 和其它蛋白质， 如 CR3、 CR4(CD11b/18) 和 DAF(CD 55)。
     术语 “补体途径调节的细胞活性” 包括因以下引起的细胞损伤 ： C5b-9 攻击复合 体、 血管通透性改变、 平滑肌细胞的收缩和迁移、 T 细胞增殖、 免疫粘着、 树突状细胞、 单核细 胞、 粒细胞和血小板的聚集、 嗜中性粒细胞 (PMN) 和巨噬细胞的吞噬、 迁移和激活。
     此外， 补体途径的激活导致补体途径中副产物产生的促炎症反应的增加。与补体 途径激活相关的病症包括肾炎、 哮喘、 再灌注损伤、 血液透析、 类风湿性关节炎、 全身性红 斑狼疮、 牛皮癣、 多发性硬化症、 移植、 阿尔茨海默氏病、 aHUS、 MPGN II 或任何其它补体介 导的疾病。与黄斑变性相关的病症包括 AMD、 北卡罗来纳黄斑营养不良、 Sorsby′ s 眼底 营养不良、 隐性黄斑营养不良、 模式营养不良、 卵黄状黄斑变性、 显性玻璃疣， 和 malattia leventinese( 辐射玻璃疣 )、 黄斑异常和 / 或变性之前或之后发生的黄斑外改变、 视网膜脱 落、 脉络膜视网膜变性、 视网膜变性、 光感受器退化、 RPE 变性、 粘多糖病、 视杆 - 视椎营养不 良、 视椎 - 视杆营养不良和视椎变性粘多糖病。
     如此处所用， 术语 “受试者” 包括任何人或非人动物。
     术语 “非人动物” 包括所有的非人脊椎动物， 例如哺乳动物和非哺乳动物， 如非人 灵长类、 啮齿类、 兔、 绵羊、 狗、 猫、 马、 奶牛、 鸟、 两栖动物、 爬行动物等。 术语 “嵌合抗体” 是这样的抗体分子， 其中 (a) 恒定区或其部分被改变、 替换或交 换， 使得抗原结合位点 ( 可变区 ) 连接不同种类或改变种类的恒定区、 效应功能和 / 或物 种， 或赋予嵌合抗体新性质的完全不同的分子， 例如酶、 毒素、 激素、 生长因子、 药物等 ； 或 (b) 可变区或其部分被具有不同或改变抗原特异性的可变区改变、 替换或交换。例如， 可通 过来自人免疫球蛋白的恒定区替换小鼠恒定区来修饰小鼠抗体。由于用人恒定区进行替 换， 嵌合抗体在识别抗原中可保留其特异性， 同时与最初的小鼠抗体相比， 在人中具有降低 的抗原性。
     术语 “补体 C3b 蛋白” 或 “C3b” 互换使用， 并指不同物种中的 C3b 蛋白。例如， 人 C3b 具有 SEQ ID NO ： 197(A 链 ) 和 198(B 链 ) 中阐明的序列。 可从 Complement Technology Inc.(Tyler， TX) 获得人 C3b。如下文实施例部分阐明产生猕猴 C3b。
     术语 “保守修饰的变体” 应用到氨基酸和核酸序列。对于特定核酸序列， 保守修饰 的变体指编码相同或基本相同氨基酸序列的那些核酸， 或者其中所述核酸不编码氨基酸序 列， 则指基本相同的序列。 因为遗传密码的简并性， 大量功能相同的核酸编码任何给定的蛋 白质。例如， 密码子 GCA、 GCC、 GCG 和 GCU 均编码氨基酸丙氨酸。因此， 在每一位置上 ( 其中 密码子确定丙氨酸 )， 可将所述密码子改变成任何所述相应的密码子， 而不改变所编码的多 肽。此类核酸变异是 “沉默变异” ， 其为保守修饰变异的一种。此处编码多肽的每一核酸序 列也描述了所述核酸的每一种可能的沉默变异。 本领域技术人员将认识到可修饰核酸中的 每一密码子 ( 除了 AUG， 其通常是甲硫氨酸的唯一密码子， 和 TGG， 其通常是色氨酸的唯一密 码子 )， 以产生功能上相同的分子。因此， 在每一所述序列中暗含了编码多肽的核酸的每一 沉默变异。
     对于多肽序列， “保守修饰的变体” 包括对多肽序列的各替换、 缺失或添加， 其导致 对氨基酸用化学上类似的氨基酸进行替换。 提供功能上类似的氨基酸的保守替换表为本领 域所熟知。此类保守修饰变体除了并且不排斥本发明的多态性变体、 种间同源物和等位基
     因。 以下 8 组含有彼此为保守替换的氨基酸 ： 1) 丙氨酸 (A)、 甘氨酸 (G) ； 2) 天冬氨酸 (D)， 谷 氨酸 (E) ； 3) 天冬酰胺 (N)， 谷氨酰胺 (Q) ； 4) 精氨酸 (R)， 赖氨酸 (K) ； 5) 异亮氨酸 (I)， 亮氨 酸 (L)， 甲硫氨酸 (M)， 缬氨酸 (V) ； 6) 苯丙氨酸 (F)， 酪氨酸 (Y)， 色氨酸 (W) ； 7) 丝氨酸 (S)， 苏氨酸 (T) ； 和 8) 半胱氨酸 (C)、 甲硫氨酸 (M)( 参阅例如， Creighton， Proteins(1984))。 在一些实施方案中， 术语 “保守序列修饰” 用于指不显著影响或改变含有氨基酸序列的抗体 的结合特征的氨基酸修饰。
     术语 “交叉 - 阻断” 、 “交叉 - 阻断的” 在此处可互换使用， 表示抗体或其它结合剂 在标准的竞争性结合测定中干扰其它抗体或结合剂与 C3 结合的能力。
     可使用标准竞争结合测定法来测定抗体或其它结合剂能够干扰另一抗体或结合 分子与 C3 结合的能力或程度， 并因此是否可以被称为本发明的交叉阻断。一种合适的测定 法包括使用 Biacore 技术 ( 例如通过使用 BIAcore3000 仪器 (Biacore， Uppsala， Sweden))， 其可以使用表面等离振子共振技术测量相互作用的程度。 用于测量交叉阻断的另一测定法 使用基于 ELISA 的方法。
     术语 “表位” 表示能够特异性结合抗体的蛋白质决定簇。 表位一般由分子的化学活 性表面基团， 如氨基酸或糖侧链组成， 并一般具有特定的三维结构特征， 以及比电荷特征。 构象和非构象表位可以区分开， 因为在变性溶剂的存在下失去与前者的结合， 而不失去与 后者的结合。 如此处所用， 术语 IgG 抗体或其片段 ( 例如， Fab 片段 ) 的 “高亲和力” 指对靶抗原 具有 10-8M 或更低、 10-9M 或更低、 10-10M、 或 10-11M 或更低、 或 10-12M 或更低、 或 10-13M 或更低的 KD 的抗体。然而， “高亲和力” 结合对于其它抗体同种型可以发生变化。例如， 对 于 IgM 同种型的 “高亲和力” 结合指具有 10-7M 或更低， 或 10-8M 或更低的 KD 的抗体。一方 面， 此处描述的抗 C3b 抗体或其抗原结合片段具有低于或等于 1nM， 优选低于或等于 200pM， 更优选低于或等于 100pM， 并甚至更优选低于或等于 10pM 的 KD。
     如此处所用， 术语 “人抗体” 旨在包括具有可变区的抗体， 在所述可变区中构架和 CDR 区均来自人来源的序列。 此外， 如果抗体含有恒定区， 所述恒定区也来自此类人序列， 例 如人种系序列， 或突变形式的人种系序列。本发明的人抗体可包括不由人序列编码的氨基 酸残基 ( 例如， 通过体外随机或位点特异性诱变或通过体内体细胞突变引入的突变 )。
     术语 “人单克隆抗体” 指具有可变区的显示单一结合特异性的抗体， 在所述可变区 中构架和 CDR 区均来自人序列。在一个实施方案中， 所述人单克隆抗体由杂交瘤产生， 所述 杂交瘤包括从转基因非人动物， 例如转基因小鼠中获得的 B 细胞， 所述转基因非人动物具 有融合到无限增殖细胞中的包含人重链转基因和轻链转基因的基因组。
     “人源化” 抗体是保留非人抗体的反应性， 而在人中具有更低免疫原性的抗体。 例如这可通过保留非人 CDR 区并用它们的人类对应物替换抗体剩余部分 ( 即， 恒定区以 及可变区的构架部分 ) 来实现。参阅例如， Morrison 等， Proc.Natl.Acad.Sci.USA， 81 ： 6851-6855， 1984 ； Morrison 和 Oi， Adv.Immunol.， 44 ： 65-92， 1988 ； Verhoeyen 等， Science， 239 ： 1534-1536， 1988 ； Padlan， Molec.Immun.， 28 ： 489-498， 1991 ； 和 Padlan， Molec. Immun.， 31 ： 169-217， 1994。人工程化技术的其它实例包括， 但不限于在 US5,766,886 中公 开的 Xoma 技术。
     在两条或更多核酸或多肽序列的上下文中， 术语 “相同的” 或百分比 “同一性” 指
     相同的两条或更多序列或子序列。 当使用以下的序列比较算法或通过手工比对和视觉检查 测定， 比较并比对在比较窗内或指定区域内用于最大对应时， 如果两条序列具有特定百分 比 ( 即， 在特定区域上或当不指定时， 在全长序列上 60％同一性， 任选地 65％、 70％、 75％、 80％、 85％、 90％、 95％或 99％同一性 ) 的相同氨基酸残基或核苷酸， 那么两条序列 “基本相 同” 。任选地， 同一性存在于长度至少约 50 个核苷酸 ( 或 10 个氨基酸 ) 的区域， 或更优选 地在长度至少 100 到 500 或 1000 或更多核苷酸 ( 或 20、 50、 200 或更多氨基酸 ) 的区域。
     对于序列比较， 通常一条序列作为参考序列， 测试序列与其进行比较。 当使用序列 比较算法时， 将测试和参考序列输入计算机， 如果需要， 指定子序列坐标， 并指定序列算法 程序参数。可使用默认程序参数， 或可指定可选参数。所述序列比较算法然后基于程序参 数计算测试序列相对于参考序列的百分比序列同一性。
     如此处所用， “比较窗口”包括参考选自 20 到 600、 一般约 50 到约 200， 更一般 约 100 到约 150 的任何一定数量相邻位置的区段， 其中可在两条序列进行最佳比对后将 序列与相同数量相邻位置的参考序列进行比较。用于比较的序列比对方法为本领域所熟 知。例如通过 Smith 和 Waterman(1970)Adv.Appl.Math.2 ： 482c 的局部同源性算法， 通过 Needleman 和 Wunsch， J.Mol.Biol.48 ： 443， 1970 的同源性比对算法， 通过搜索 Pearson 和 Lipman， Proc.Nat’ l.Acad.Sci.USA 85 ： 2444， 1988 的相似性方法， 通过这些算法的计算机 化实现 (Wisconsin Genetics Software Package， Genetics Computer Group， 575 Science Dr.， Madison， WI 中的 GAP、 BESTFIT、 FASTA 和 TFASTA)， 或通过手工比对和视觉检查 ( 参 阅， 例如 Brent 等， Current Protocols in Molecular Biology， John Wiley&Sons， Inc. (Ringbou 编辑， 2003)) 进行序列最佳比对用于比较。
     适合于测定百分比序列同一性和序列相似性的算法的两个实例是 BLAST 和 BLAST 2.0 算法， 其分别描述于 Altschul 等， Nuc.Acids Res.25 ： 3389-3402， 1977 ； 和 Altschul 等， J.Mol.Biol.215 ： 403-410， 1990 中。用于进行 BLAST 分析的软件通过 National Center for BiotechnologyInformation 公开获得。该算法包括首先通过鉴定查询序列中长度为 W 的短字来鉴定高得分序列对 (HSPs)， 当在数据库序列中用相同长度的字比对时， 所述短字 匹配或满足某一正值阈值得分 T。T 称为邻近字得分阈值 (Altschul 等， 上文 )。这些初始 邻近字命中作为起始搜索的种子， 以发现含有它们的更长 HSPs。 只要可增加累积比对得分， 则沿每一序列的两个方向延伸字命中。对于核苷酸序列， 使用参数 M( 对一对匹配残基的奖 赏得分 ； 总＞ 0) 和 N( 对错配残基的罚分 ； 总＜ 0) 计算累积得分。对于氨基酸序列， 使用 得分矩阵来计算累积得分。当 ： 所述累积比对得分从其最高达到值跌落 X 量 ； 因一个或更 多负得分残基比对累积， 所述累积比对得分到达零或以下 ； 或到达任何一条序列的末端时， 停止字命中在每一方向上的延伸。BLAST 算法参数 W、 T 和 X 决定了比对的灵敏度和速度。 BLASTN 程序 ( 对于核苷酸序列 ) 使用默认字长 (W)11、 期望值 (E)10、 M ＝ 5、 N ＝ -4 和两 条链的比较。对于氨基酸序列， BLASTP 程序使用默认字长 3， 和期望值 (E)10 和 BLOSUM62 得分矩阵 ( 参阅 Henikoff 和 Henikoff， Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89 ： 10915， 1989) 比对 (B)50、 期望值 (E)10、 M ＝ 5、 N ＝ -4 和两条链的比较。
     BLAST 算法也进行两条序列之间相似性的统计学分析 ( 参阅例如， Karlin 和 Altschul， Proc.Natl.Acad.Sci.U SA 90 ： 5873-5787， 1993)。BLAST 算法提供的一种相似 性测量是最小总和概率 (P(N))， 其提供两条核苷酸或氨基酸序列之间偶然发生匹配的概率的指示。例如， 如果测试核酸与参考核酸的比较中最小总和概率低于约 0.2， 更优选低于约 0.01， 并最优选低于约 0.001， 那么认为核酸与参考序列相似。
     也可使用已经整合到 ALIGN 算法 ( 版本 2.0) 的 E.Meyers 和 W.Miller(Comput. Appl.Biosci.， 4： 11-17， 1988) 的算法， 使用 PAM120 加权残基表， 空位长度罚分 12 和空位 罚分 4 测定两条氨基酸序列之间的百分比同一性。 此外， 可使用已经整合到 GCG 软件包 ( 可 在 www.gcg.com 上获得 ) 中的 GAP 程序的 Needleman 和 Wunsch(J.Mol， Biol.48 ： 444-453， 1970) 算法， 使用 Blossom 62 矩阵或 PAM250 矩阵， 以及空位加权 16、 14、 12、 10、 8、 6或4和 长度加权 1、 2、 3、 4、 5 或 6 来测定两条氨基酸序列之间的百分比同一性。
     除了上文指出的序列同一性的百分比， 两条核酸序列或多肽基本相同的另一指示 是第一条核酸编码的多肽与针对第二条核酸编码的多肽产生的抗体免疫交叉反应， 如下文 描述。因此， 多肽通常与第二条多肽基本相同， 例如， 其中两条肽仅因保守替换而不同。两 条核酸序列基本相同的另一指示是两个分子或其互补序列在严格条件下彼此杂交， 如下文 描述。两条核酸序列基本相同的又一指示是可使用相同的引物来扩增所述序列。
     术语 “分离的抗体” 指抗体， 其基本不含具有不同抗原特异性的其它抗体 ( 例如， 特异性结合 C3b 的分离的抗体基本不含特异性结合除 C3b 外的抗原的抗体 )。 然而， 特异性 结合 C3b 的分离的抗体可对其它抗原具有交叉反应性。此外， 分离的抗体可基本不含其它 细胞物质和 / 或化学品。
     术语 “同种型” 指重链恒定区基因提供的抗体种类 ( 例如， IgM、 IgE、 IgG 如 IgG1 或 IgG4)。 同种型也包括这些种类中一种的修饰形式， 其中已经进行修饰以改变 Fc 功能， 例 如来增强或减弱效应功能或与 Fc 受体的结合。
     如此处所用， 术语 “Kassoc” 或 “Ka” 旨在指特定抗体 - 抗原相互作用的结合速率， 而如此处所用， 术语 “Kdis” 或 “Kd” 旨在指特定抗体 - 抗原相互作用的解离速率。如此处 所用， 术语 “KD” 旨在指解离常数， 其获得于 Kd 与 Ka 的比值 ( 即 Kd/Ka) 并表达为摩尔浓度 (M)。可使用本领域熟知的方法测定抗体的 KD 值。用于测定抗体 KD 的方法是通过使用表 面等离振子共振， 或使用生物传感器系统如 系统。
     如此处所用， 术语 “单克隆抗体” 或 “单克隆抗体组合物” 指单个分子组合物的抗 体分子的制剂。单克隆抗体组合物对特定表位显示单一结合特异性和亲和力。
     术语 “核酸” 此处与术语 “多核苷酸” 可互换使用， 并指单链或双链形式的脱氧核 糖核苷酸或核糖核苷酸及其聚合物。 所述术语包括含有已知核苷酸类似物或修饰的骨架残 基或键的核酸， 其为合成的、 天然发生的和非天然发生的， 其与参考核酸具有相似的结合性 质， 并且其以与参考核苷酸相似的方式进行代谢。 此类类似物的实例包括， 但不限于硫代磷 酸酯、 氨基磷酸酯、 甲基膦酸酯、 手性 - 甲基膦酸酯、 2-O- 甲基核糖核苷酸、 肽核酸 (PNA)。
     除非另有指出， 特定核酸序列也暗中包括其保守修饰的变体 ( 例如简并密码子替 换 ) 和互补序列， 以及明确指出的序列。尤其是， 如下文详细描述， 可通过产生这样的序列 完成简并密码子替换， 其中用混和碱基和 / 或脱氧肌苷残基替换一个或更多所选 ( 或全部 ) 密码子的第三个位置 (Batzer 等， Nucleic Acid Res.19 ： 5081， 1991 ； Ohtsuka 等， J.Biol. Chem.260 ： 2605-2608， 1985 ； 和 Rossolini 等， Mol.Cell.Probes 8 ： 91-98， 1994)。
     术语 “有效连接” 指两个和更多多核苷酸 ( 例如 DNA) 区段的功能关系。通常， 其 指转录调节序列与转录序列之间的功能关系。例如， 如果启动子或增强子序列刺激或调节编码序列在适当宿主细胞或其它表达系统中的转录， 那么该启动子或增强子序列有效连接 编码序列。一般地， 有效连接转录序列的启动子转录调节序列与转录序列在物理空间上邻 近， 即它们是顺式作用。然而， 一些转录调节序列， 如增强子不需要与编码序列 ( 增强子增 强其转录 ) 在物理空间上邻近或位于其附近。
     如此处所用， 术语 “优化的” 表示已经使用生产细胞或生物， 一般是真核细胞， 例如 毕赤酵母细胞、 中国仓鼠卵巢细胞 (CHO) 或人细胞中优选的密码子改变核苷酸序列， 以编 码氨基酸序列。将优化的核苷酸序列改造以完全或最大可能地保留起始核苷酸序列 ( 其也 称为 “亲本” 序列 ) 最初编码的氨基酸序列。已经改造了此处的优化序列以具有哺乳动物 细胞中优选的密码子。 然而， 此处也考虑其它真核细胞或原核细胞中这些序列的优化表达。 优化的核苷酸序列编码的氨基酸序列也称为优化的。
     术语 “多肽” 和 “蛋白质” 此处互换使用来指氨基酸残基的聚合物。所述术语应用 到氨基酸聚合物， 其中一个或更多氨基酸残基是相应天然发生氨基酸的人工化学模拟物， 还应用到天然发生的氨基酸聚合物和非天然发生的氨基酸聚合物。除非另有指出， 特定的 多肽序列也暗中包括其保守修饰的变体。
     如此处所用， 术语 “重组人抗体” 包括通过重组方法制备、 表达、 产生或分离的所有 人抗体， 如从对人免疫球蛋白基因转基因或转染色体的动物 ( 例如小鼠 ) 或从中制备的杂 交瘤中分离的抗体、 从经转化以表达人抗体的宿主细胞， 例如从转染瘤中分离的抗体、 从重 组、 组合人抗体库文中分离的抗体， 和通过任何其它手段制备、 表达、 产生或分离的抗体， 所 述手段包括将全部或部分人免疫球蛋白基因、 序列剪切成其它 DNA 序列。此类重组人抗体 具有可变区， 其中构架和 CDR 区均来自人种系免疫球蛋白序列。然而在某些实施方案中， 此 类重组人抗体可进行体外诱变 ( 或者， 当使用人 Ig 序列转基因的动物时， 进行体内体细胞 诱变 )， 因此重组抗体的 VH 和 VL 区的氨基酸序列是当来自并与人种系 VH 和 VL 序列相关时 可能在体内人抗体种系所有组成成分中不天然存在的序列。
     术语 “重组宿主细胞” ( 或简单地 “宿主细胞” ) 指已经向其中引入重组表达载体 的细胞。应理解此类术语不仅旨在指特定受试者细胞， 还指此细胞的后代。因为某些修饰 可能因突变或环境影响而在后代中出现， 所以该后代实际上可能与亲本细胞不相同， 但仍 然包括在此处所用术语 “宿主细胞” 的范围内。
     术语 “受试者” 包括人和非人动物。非人动物包括所有的脊椎动物， 例如哺乳动物 和非哺乳动物， 如非人灵长类、 羊、 狗、 奶牛、 鸡、 两栖动物和爬行动物。 除了指出时， 术语 “患 者” 或 “受试者” 此处可互换使用。
     术语 “治疗” 包括施用组合物或抗体， 以防止或延迟症状、 并发症或疾病 ( 例如 AMD) 的生物化学指征的开始， 缓解症状或阻止或抑制疾病、 状况或病症的进一步发展。 治疗 可以是预防性的 ( 以防止或延迟疾病开始， 或防止其临床或亚临床症状的表现 ) 或在疾病 表现后治疗性抑制或缓解症状。
     术语 “载体” 旨在指能够转运已经连接另一多核苷酸的多核苷酸分子。一种类型 的载体是 “质粒” ， 其指已经连接额外 DNA 片段的环形双链 DNA 环。另一类型的载体是病毒 载体， 如腺伴随病毒载体 (AAV 或 AAV2)， 其中额外的 DNA 区段可连接到病毒基因组内。某 些载体能够在其中引入载体的宿主细胞中进行自主复制 ( 例如， 具有细菌复制起点的细菌 载体和游离型哺乳动物载体 )。其它载体 ( 例如非游离型哺乳动物载体 ) 可在引入宿主细胞后整合到宿主细胞的基因组中， 并由此与所述宿主基因组一起复制。 此外， 某些载体能够 指导它们有效连接的基因的表达。此类载体此处称为 “重组表达载体” ( 或简单地， “表达 载体” )。一般而言， 在重组 DNA 技术中有用的表达载体经常是质粒的形式。在本说明书中， “质粒” 和 “载体” 可互换使用， 因为质粒是载体的最常用形式。然而， 本发明旨在包括此类 其它形式的表达载体， 如病毒载体 ( 例如， 复制缺陷型逆转录病毒、 腺病毒和腺伴随病毒 )， 其起等同的功能。
     如此处所用， 术语 “C3b 活性” 表示 C3b 产生下游的补体旁路的活性， 包括但不限于 例如 C3 转变酶的活性， C5 转变酶的活性。可使用此处描述的测定， 如但不限于溶血测定， 测定 C3a 和 C5a 产生的测定、 C3b 沉积测定， 和膜攻击复合体 (MAC) 沉积测定来测定 C3b 活 性。如此处所用， “C3b 活性的改变” 或 “C3b 活性的调节” 指通过一种或多种此处描述的测 定法测定 C3b 活性， 其中 C3b 活性相对于相关对照增加或降低至少 10％。 例如， 当存在抗体 或片段的情况下 C3b 活性相对于缺少抗体或片段情况下 C3b 的活性降低或增加至少 10％ 时， 可以说本发明的抗体或抗原结合片段调节 C3b 活性。
     如此处所用， 术语 “cyno” 或 “猕猴” 指猕猴 (Macaca fascicularis)。
     附图简述 图 1 显示， C3b 抗体以相对于 C3 高至少 1000 倍的选择性结合 C3b。
     图 2 显示了在 10％人或猕猴血清中抗 C3b 抗体抑制溶血的能力的实例。
     图 3 显示了 C3b 抗体抑制 C3b 产生为 C3 分解产物的能力的实例。
     图 4 显示了证明 C3b 抗体抑制 MAC 沉积的能力的示例性数据。
     图 5 显示， C3b 抗体通过抑制产生 C3a 和 C5a 阻断旁路途径驱动的补体激活。
     图 6A 显示了 SDS-PAGE 凝胶， 其显示了 tick-over 转变酶活性的抑制。图 6B 显示 了 6A 凝胶中对 C3b 产生的抑制的定量。图 6C 显示了抗 C3b 抗体抑制预形成的 C3 转变酶 活性。
     图 7 显示抗体 C3b 抗体体外抑制 C5 转化酶活性。
     图 8A 显示了通过 C3b 抗体抑制因子 B 结合 C3b。图 8B 显示了通过 C3b 抗体抑制 因子 P 结合 C3b。图 8C 显示了通过 C3b 抗体抑制因子 H 结合 C3b。图 8D 显示了通过 C3b 抗体抑制 C3b-C3b 二聚体形成。
     图 9 显示了针对 C3d 的抗体交叉反应性测定的结果。
     图 10 显示了针对 C5 的抗体交叉反应性测定的结果。
     图 11 显示了测定 C3b 抗体是否结合 i C3b 或 C3c 的结合测定的结果。
     图 12 显示了物种交叉反应性研究的结果。图 12A 显示了大鼠交叉反应性。图 12B 显示了兔交叉反应性。图 12C 显示了猪交叉反应性。图 12D 显示了小鼠交叉反应性。图 12E 显示了豚鼠交叉反应性。图 12F 显示了狗交叉反应性。
     发明详述
     本发明部分基于这样抗体分子的发现， 所述抗体分子特异性结合人和猕猴 C3b。 本 发明涉及全长 IgG 形式的抗体 ( 参阅例如， 抗体 9556、 9611、 9612、 9609、 9610、 9674 和 9675) 以及其抗原结合片段， 如 Fab 片段 ( 例如， 参阅抗体 9124、 9397、 9398、 9136、 9141、 9373 和 9423)。
     因此， 本发明提供特异性结合补体 C3b 蛋白 ( 例如， 人 C3b， 猕猴 C3b) 的抗体、 药物
     组合物、 生产方法和使用此类抗体和组合物的方法。
     C3b 抗体
     本发明提供特异性结合 C3b( 例如， 人 C3b， 猕猴 C3b) 的抗体。 在一些实施方案中， 本发明提供特异性结合人和猕猴 C3b 的抗体。本发明的抗体包括， 但不限于如实施例中所 述分离的人单克隆抗体。
     本发明提供特异性结合 C3b 蛋白质 ( 例如， 人和 / 或猕猴 C3b) 的抗体， 所述抗体包 含具有 SEQ ID NO ： 7、 21、 35、 49、 63、 77、 91、 105、 119、 133、 147、 161、 175 和 189 的氨基酸序列 的 VH 结构域。本发明还提供特异性结合 C3b 蛋白质 ( 例如， 人和 / 或猕猴 C3b) 的抗体， 所 述抗体包含具有下文表 1 中列出的任何一个 VH CDRs 的氨基酸序列的 VH CDR。具体而言， 本发明提供特异性结合 C3b 蛋白质 ( 例如， 人和 / 或猕猴 C3b) 的抗体， 所述抗体包含 ( 或 者， 组成为 ) 具有下文表 1 中列出的任何一个 VH CDRs 的氨基酸序列的一个、 两个、 三个、 四 个、 五个或更多 VH CDRs。
     本发明提供特异性结合 C3b 蛋白质 ( 例如， 人和 / 或猕猴 C3b) 的抗体， 所述抗体包 含具有 SEQ ID NO ： 8、 22、 36、 50、 64、 78、 92、 106、 120、 134、 148、 162、 176 和 190 的氨基酸序列 的 VL 结构域。本发明还提供特异性结合 C3b 蛋白质 ( 例如， 人和 / 或猕猴 C3b) 的抗体， 所 述抗体包含具有下文表 1 中列出的任何一个 VL CDRs 的氨基酸序列的 VL CDR。具体而言， 本发明提供特异性结合 C3b 蛋白质 ( 例如， 人和 / 或猕猴 C3b) 的抗体， 所述抗体包含 ( 或 者， 组成为 ) 具有下文表 1 中列出的任何一个 VL CDRs 的氨基酸序列的一个、 两个、 三个或 更多 VL CDRs。
     本发明的其它抗体包括已经突变的氨基酸， 其在 CDR 区中仍然与表 1 所述序列中 描述的 CDR 区具有至少百分之 60、 70、 80、 85、 90 或 95 的同一性。在一些实施方案中， 其包 括突变氨基酸序列， 其中当与表 1 所述序列中描述的 CDR 区比较时 CDR 区中不超过 1、 2、 3、 4 或 5 个氨基酸已经发生突变。
     本发明还提供编码特异性结合 C3b 蛋白质 ( 例如， 人和 / 或猕猴 C3b) 的抗体的 VH、 VL、 全长重链和全长轻链的核酸序列。可优化此类核酸序列用于在哺乳动物细胞中表 达 ( 例如， 表 1 显示了抗体 9556、 9611、 9612、 9609、 9610、 9674 和 9675， 以及 Fab 片段 9124、 9397、 9398、 9136、 9141、 9373 和 9423 的重链和轻链的优化核酸序列 )。
     表 1. 本发明 C3b 抗体、 Fabs 与 C3b 蛋白质的实例
     表1
     本发明的其它抗体包括其中氨基酸或编码氨基酸的核酸已经发生突变， 但与表 1 中描述的序列仍然具有至少百分之 60、 65、 70、 75、 80、 85、 90 或 95 的同一性的那些抗体。在 一些实施方案中， 其包括突变氨基酸序列， 其中当与表 1 所述序列中描述的序列中的可变 区比较时在可变区内不超过 1、 2、 3、 4 或 5 个氨基酸已经发生突变， 但却保留基本相同的治 疗活性。
     因为这些抗体中每一抗体均可结合 C3b， 所以可以 “混和并匹配” VH、 VL、 全长轻链 和全长重链序列 ( 氨基酸序列和编码所述氨基酸序列的核苷酸序列 )， 以产生本发明的其 它 C3b 结合抗体。可使用本领域已知的结合测定法 ( 例如， ELISA， 和实施例部分中描述的 其它测定法 ) 测试此类 “混和并匹配的” C3b 结合抗体。当这些链进行混合和匹配时， 应该 用结构相似的 VH 序列替换来自特定 VH/VL 配对的 VH 序列。 同样， 应该用结构相似的全长重 链序列替换来自特定全长重链 / 全长轻链配对的全长重链序列。同样， 应该用结构相似的 VL 序列替换来自特定 VH/VL 配对的 VL 序列。同样应该用结构相似的全长轻链序列替换来 自特定全长重链 / 全长轻链配对的全长轻链序列。因此， 一方面， 本发明提供分离的单克隆 抗体或其抗原结合区， 其具有 ： 包含选自 SEQ ID NO ： 7、 21、 35、 49、 63、 77、 91、 105、 119、 133、 147、 161、 175 和 189 的氨基酸序列的重链可变域 ； 和包含选自 SEQ ID NO ： 8、 22、 36、 50、 64、 78、 92、 106、 120、 134、 148、 162、 176 和 190 的氨基酸序列的轻链可变域 ； 其中所述抗体特异 性结合 C3b( 例如， 人和 / 或猕猴 C3b)。
     另一方面， 本发明提供 (i) 分离的单克隆抗体， 其具有 ： 包含选自 SEQID NOs ： 9、 23、 37、 51、 65、 79、 93、 107、 121、 135、 149、 163、 177 和 191 的氨基酸序列的全长重链， 已经优 化所述氨基酸序列用于在哺乳动物细胞中表达 ； 和包含选自 SEQ ID NOs ： 10、 24、 38、 52、 66、 80、 94、 108、 122、 136、 150、 164、 178 和 192 的氨基酸序列的全长轻链， 已经优化所述氨基酸
     序列用于在哺乳动物细胞中表达 ； 或 (ii) 包含其抗原结合部分的功能蛋白质。
     另一方面， 本发明提供 C3b 结合抗体， 其包含如表 1 中所述的重链和轻链 CDR1s、 CDR2s 和 CDR3s， 或其组合。 所述抗体的 VH CDR1s 的氨基酸序列示于 SEQ ID NOs ： 1、 15、 29、 43、 57、 71、 85、 99、 113、 127、 141、 155、 169 和 183 中。所述抗体的 VH CDR2s 的氨基酸序列示 于 SEQID NOs ： 2、 16、 30、 44、 58、 72、 86、 100、 114、 128、 142、 156、 170 和 184 中。 所述抗体的 VH CDR3s 的氨基酸序列示于 SEQ ID NOs ： 3、 17、 31、 45、 59、 73、 87、 101、 115、 129、 143、 157、 171 和 185 中。所述抗体的 VL CDR1s 的氨基酸序列示于 SEQ ID NOs ： 4、 18、 32、 46、 60、 74、 88、 102、 116、 130、 144、 158、 172 和 186 中。 所述抗体的 VL CDR2s 的氨基酸序列示于 SEQ ID NOs ： 5、 19、 33、 47、 61、 75、 89、 103、 117、 131、 145、 159、 173 和 187 中。 所述抗体的 VL CDR3s 的氨基 酸序列示于 SEQ ID NOs ： 6、 20、 34、 48、 62、 76、 90、 104、 118、 132、 146、 160、 174 和 188 中。 使用 Kabat 系统描绘 CDR 区 (Kabat， E.A.， 等， 1991Sequences of Proteins of Immunological Interest， 第五版， U.S.Departmentof Health and Human Services， NIH 公开号 91-3242)。
     如果这些抗体中的每一抗体均可结合 C3b 并且主要通过 CDR1、 2 和 3 区提供抗原 结合特异性， VH CDR1、 2 和 3 序列和 VL CDR1、 2 和 3 序列就可进行 “混和并匹配” ( 即， 可 将来自不同抗体的 CDRs 进行混和并匹配， 尽管每一抗体优选含有 VH CDR1、 2 和 3 以及 VL CDR1、 2 和 3， 以产生本发明的其它 C3b 结合分子 )。 可使用本领域已知的结合测定法和实施 例中描述的那些方法 ( 例如 ELISA) 来测试此类 “混和并匹配的” C3b 结合抗体。当 VH CDR 序列进行混和并匹配时， 应该用结构相似的 CDR 序列替换来自特定 VH 序列的 CDR1、 CDR2 和 / 或 CDR3。同样， 当 VL CDR 序列进行混和并匹配时， 应该用结构相似的 CDR 序列替换来自 特定 VL 序列的 CDR1、 CDR2 和 / 或 CDR3 序列。对本领域普通技术人员显而易见的是可用来 自此处对本发明单克隆抗体所示的 CDR 序列的结构相似的序列替换一个或更多 VH 和 / 或 VL CDR 区来产生新的 VH 和 VL 序列。 在一个实施方案中， 除了上述的， 此处描述的抗体的抗 原结合片段可包含 VHCDR1、 2 和 3， 或 VL CDR 1、 2 和 3， 其中所述片段作为单个可变域结合 C3b。
     因此， 本发明提供分离的单克隆抗体或其抗原结合区， 其包含 ： 包含选自 SEQ ID NOs ： 1、 15、 29、 43、 57、 71、 85、 99、 113、 127、 141、 155、 169 和 183 的氨基酸序列的重链可变区 CDR1 ； 包含选自 SEQ ID NOs ： 2、 16、 30、 44、 58、 72、 86、 100、 114、 128、 142、 156、 170 和 184 的氨 基酸序列的重链可变区 CDR2 ； 包含选自 SEQ ID NOs ： 3、 17、 31、 45、 59、 73、 87、 101、 115、 129、 143、 157、 171 和 185 的氨基酸序列的重链可变区 CDR3 ； 包含选自 SEQ ID NOs ： 4、 18、 32、 46、 60、 74、 88、 102、 116、 130、 144、 158、 172 和 186 的氨基酸序列的轻链可变区 CDR1 ； 包含选自 SEQ ID NOs ： 5、 19、 33、 47、 61、 75、 89、 103、 117、 131、 145、 159、 173 和 187 的氨基酸序列的轻 链可变区 CDR2 ； 包含选自 SEQ ID NOs ： 6、 20、 34、 48、 62、 76、 90、 104、 118、 132、 146、 160、 174 和 188 的氨基酸序列的轻链可变区 CDR3 ； 其中所述抗体特异性结合 C3b。
     本发明包括具有表 1 中抗体 9556 的重链和轻链序列的抗体或其抗原结合片段。 本 发明包括具有表 1 中抗体 9611 的重链和轻链序列的抗体或其抗原结合片段。本发明包括 具有表 1 中抗体 9612 的重链和轻链序列的抗体或其抗原结合片段。本发明还包括具有表 1 中抗体 9609 的重链和轻链序列的抗体或其抗原结合片段。本发明包括具有表 1 中抗体 9610 的重链和轻链序列的抗体或其抗原结合片段。本发明还包括具有表 1 中抗体 9674 的 重链和轻链序列的抗体或其抗原结合片段。本发明又进一步包括具有表 1 中 9675 抗体的重链和轻链序列的抗体或其抗原结合片段。本发明包括具有表 1 中 9124 抗体的重链和轻 链序列的抗体或其抗原结合片段。本发明还包括具有表 1 中 9397 抗体的重链和轻链序列 的抗体或其抗原结合片段。本发明还包括具有表 1 中 9398 抗体的重链和轻链序列的抗体 或其抗原结合片段。本发明还包括具有表 1 中 9136 抗体的重链和轻链序列的抗体或其抗 原结合片段。本发明还包括具有表 1 中 9141 抗体的重链和轻链序列的抗体或其抗原结合 片段。本发明又进一步包括具有表 1 中 9373 抗体的重链和轻链序列的抗体或其抗原结合 片段。本发明还包括具有表 1 中 9423 抗体的重链和轻链序列的抗体或其抗原结合片段。
     在特定实施方案中， 特异性结合 C3b 的抗体包含 SEQ ID NO ： 1 的重链可变区 CDR1 ； SEQ ID NO ： 2 的重链可变区 CDR2 ； SEQ ID NO ： 3 的重链可变区 CDR3 ； SEQ ID NO ： 4 的轻链 可变区 CDR1 ； SEQ ID NO ： 5 的轻链可变区 CDR2 ； 和 SEQ ID NO ： 6 的轻链可变区 CDR3。在另 一特定实施方案中， 特异性结合 C3b 的抗体包含 SEQ ID NO ： 15 的重链可变区 CDR1 ； SEQ ID NO ： 16 的重链可变区 CDR2 ； SEQ ID NO ： 17 的重链可变区 CDR3 ； SEQ ID NO ： 18 的轻链可变 区 CDR1 ； SEQ ID NO ： 19 的轻链可变区 CDR2 ； 和 SEQ ID NO ： 20 的轻链可变区 CDR3。
     在另一特定实施方案中， 特异性结合 C3b 的抗体包含 SEQ ID NO ： 29 的重链可变区 CDR1 ； SEQ ID NO ： 30 的重链可变区 CDR2 ； SEQ ID NO ： 31 的重链可变区 CDR3 ； SEQ ID NO ： 32 的轻链可变区 CDR1 ； SEQ ID NO ： 33 的轻链可变区 CDR2 ； 和 SEQ ID NO ： 34 的轻链可变区 CDR3。在另一特定实施方案中， 特异性结合 C3b 的抗体包含 SEQ ID NO ： 43 的重链可变区 CDR1 ； SEQ ID NO ： 44 的重链可变区 CDR2 ； SEQ ID NO ： 45 的重链可变区 CDR3 ； SEQ ID NO ： 46 的轻链可变区 CDR1 ； SEQ ID NO ： 47 的轻链可变区 CDR2 ； 和 SEQ ID NO ： 48 的轻链可变区 CDR3。
     在另一特定实施方案中， 特异性结合 C3b 的抗体包含 SEQ ID NO ： 57 的重链可变区 CDR1 ； SEQ ID NO ： 58 的重链可变区 CDR2 ； SEQ ID NO ： 59 的重链可变区 CDR3 ； SEQ ID NO ： 60 的轻链可变区 CDR1 ； SEQ ID NO ： 61 的轻链可变区 CDR2 ； 和 SEQ ID NO ： 62 的轻链可变区 CDR3。在另一特定实施方案中， 特异性结合 C3b 的抗体包含 SEQ ID NO ： 71 的重链可变区 CDR1 ； SEQ ID NO ： 72 的重链可变区 CDR2 ； SEQ ID NO ： 73 的重链可变区 CDR3 ； SEQ ID NO ： 74 的轻链可变区 CDR1 ； SEQ ID NO ： 75 的轻链可变区 CDR2 ； 和 SEQ ID NO ： 76 的轻链可变区 CDR3。
     在另一特定实施方案中， 特异性结合 C3b 的抗体包含 SEQ ID NO ： 85 的重链可变区 CDR1 ； SEQ ID NO ： 86 的重链可变区 CDR2 ； SEQ ID NO ： 87 的重链可变区 CDR3 ； SEQ ID NO ： 88 的轻链可变区 CDR1 ； SEQ ID NO ： 89 的轻链可变区 CDR2 ； 和 SEQ ID NO ： 90 的轻链可变区 CDR3。
     在某些实施方案中， 特异性结合 C3b 的抗体是表 1 中描述的抗体。 在优选实施方案 中， 结合 C3b 的抗体是 9556。在其它优选实施方案中， 结合 C3b 的抗体是 9610。在其它优 选实施方案中， 结合 C3b 的抗体是 9674。在其它优选实施方案中， 结合 C3b 的抗体是 9675。 在又一其它优选实施方案中， 结合 C3b 的抗体是 9609。
     如此处所用， 人抗体包含重链或轻链可变区或全长重链或轻链， 其 “产自” 或 “来 自” 特定种系序列， 如果抗体的可变区或全长链获自使用人种系免疫球蛋白基因的系统的 话。 此类系统包括用目的抗原免疫携带人免疫球蛋白基因的转基因小鼠或利用目的抗原筛 选在噬菌体上展示的人免疫球蛋白基因文库。 例如可通过比较人抗体的氨基酸序列与人种系免疫球蛋白的氨基酸序列并选择与人抗体的序列在序列上最相近 ( 即， 最高％同一性 ) 的人种系免疫球蛋白序列来鉴定 “产自” 或 “来自” 人种系免疫球蛋白序列的人抗体。 “产 自” 或 “来自” 特定人种系免疫球蛋白序列的人抗体可含有与种系序列相比例如因天然发 生的体细胞突变或刻意引入定点突变的氨基酸差异。然而， 在 VH 或 VL 构架区， 所选人抗体 在氨基酸序列上通常与人种系免疫球蛋白基因编码的氨基酸序列具有至少 90％的同一性， 并含有氨基酸残基， 当与其它物种的种系免疫球蛋白氨基酸序列 ( 例如， 鼠类种系序列 ) 比 较时， 其将人抗体鉴定为人的。 在某些情况下， 人抗体在氨基酸序列上与种系免疫球蛋白基 因编码的氨基酸序列具有至少 60％、 70％、 80％、 90％或至少 95％， 或甚至至少 96％、 97％、 98％或 99％的同一性。通常， 重组人抗体与人种系免疫球蛋白基因编码的氨基酸序列在 VH 或 VL 构架区具有不超过 10 个氨基酸的差异。在某些情况下， 人抗体与种系免疫球蛋白基 因编码的氨基酸序列具有不超过 5 个， 或甚至不超过 4、 3、 2 或 1 个氨基酸的差异。人种系 免疫球蛋白基因的实例包括， 但不限于下文描述的可变域种系片段以及 DP47 和 DPK9。
     同源抗体
     在另一实施方案中， 本发明提供包含与表 1 所述序列同源的氨基酸序列的抗体或 其抗原结合片段， 并且所述抗体结合 C3b 蛋白质 ( 例如， 人和 / 或猕猴 C3b)， 并保留表 1 所 述那些抗体的期望功能性质。
     例如， 本发明提供包含重链可变域和轻链可变域的分离的单克隆抗体 ( 或其功能 抗原结合片段 )， 其中所述重链可变域包含与选自 SEQ ID NO ： 7、 21、 35、 49、 63、 77、 91、 105、 119、 133、 147、 161、 175 和 189 的氨基酸序列具有至少 80％、 至少 90％或至少 95％同一性的 氨基酸序列 ； 所述轻链可变域包含与选自 SEQ ID NO ： 8、 22、 36、 50、 64、 78、 92、 106、 120、 134、 148、 162、 176 和 190 的氨基酸序列具有至少 80％、 至少 90％或至少 95％同一性的氨基酸 序列 ； 所述抗体特异性结合 C3b( 例如， 人和 / 或猕猴 C3b)， 并且所述抗体在溶血测定中可 以抑制红细胞溶解。在特定实例中， 此类抗体在 10％人或猕猴血清的溶血测定中具有低于 50nM 的 IC50 值。
     在其它实施方案中， VH 和 / 或 VL 氨基酸序列可以与表 1 中阐明的序列具有 50％、 60％、 70％、 80％、 90％、 95％、 96％、 97％、 98％或 99％的同一性。在其它实施方案中， VH 和 / 或 VL 氨基酸序列可以相同， 只是在不超过 1、 2、 3、 4 或 5 个氨基酸位置上具有氨基酸替换。 可通过诱变 ( 例如定点或 PCR 介导诱变 ) 分别编码 SEQ ID NO ： 7、 21、 35、 49、 63、 77、 91、 105、 119、 133、 147、 161、 175、 189、 8、 22、 36、 50、 64、 78、 92、 106、 120、 134、 148、 162、 176 和 190 的核 酸分子来获得这样的抗体， 所述抗体具有与表 1 所述的那些抗体的 VH 和 VL 区具有高 ( 即， 80％或更高 ) 同一性的 VH 和 VL 区， 然后使用此处所述的功能测定法测试所编码的经改变 的抗体保留的功能。
     在其它实施方案中， 全长重链和 / 或全长轻链氨基酸序列与表 1 中阐明的序列具 有 50％、 60％、 70％、 80％、 90％、 95％、 96％、 97％、 98％或 99％的同一性。可通过诱变 ( 例 如定点或 PCR 介导的诱变 ) 分别编码此类多肽的核酸分子来获得这样的抗体， 其具有分别 与 SEQ ID NOs ： 9、 23、 37、 51、 65、 79、 93、 107、 121、 135、 149、 163、 177 和 191 任何一个的全长 重链和 SEQ ID NOs ： 10、 24、 38、 52、 66、 80、 94、 108、 122、 136、 150、 164、 178 和 192 任何一个的 全长轻链具有高 ( 即， 80％或更高 ) 同一性的全长重链和全长轻链， 然后使用此处所述的功 能测定法测试编码的经改变抗体保留的功能。在其它实施方案中， 全长重链和 / 或全长轻链核苷酸序列与上文阐明的序列具有 60％、 70％、 80％、 90％、 95％、 96％、 97％、 98％或 99％的同一性。
     在其它实施方案中， 重链和 / 或轻链核苷酸序列的可变区与上文阐明的序列具有 60％、 70％、 80％、 90％、 95％、 96％、 97％、 98％或 99％的同一性。
     如此处所用， 两条序列之间的百分比同一性是所述序列共有的相同位置数量的函 数 ( 即， ％同一性等于相同位置的数量 / 位置总数 x100)， 其中考虑空位数量和每一空位长 度， 需要引入所述空位用于两条序列的最佳比对。 如下文非限制性实施例所述， 可使用数学 算法完成两条序列之间序列的比较和百分比同一性的确定。
     此外或备选地， 本发明的蛋白质序列可进一步用作 “查询序列” 以针对公共数据库 进行搜索， 例如来鉴定相关序列。 例如， 可使用 Altschul 等， 1990 J.Mol.Biol.215 ： 403-10 的 BLAST 程序 ( 版本 2.0) 进行此类搜索。
     具有保守修饰的抗体
     在某些实施方案中， 本发明的抗体具有包含 CDR1、 CDR2 和 CDR3 序列的重链可变 区和包含 CDR1、 CDR2 和 CDR3 序列的轻链可变区， 其中一个或更多这些 CDR 序列具有基于 此处所述抗体的特定氨基酸序列或其保守修饰， 并且其中所述抗体保留本发明 C3b 结合抗 体的期望功能性质。因此， 本发明提供分离的单克隆抗体， 或其功能抗原结合片段， 其由包 含 CDR1、 CDR2 和 CDR3 序列的重链可变区和包含 CDR1、 CDR2 和 CDR3 序列的轻链可变区组 成， 其中 ： 所述重链可变区 CDR1 氨基酸序列选自 SEQID NOs ： 1、 15、 29、 43、 57、 71、 85、 99、 113、 127、 141、 155、 169 和 183， 及其保守修饰 ； 所述重链可变区 CDR2 氨基酸序列选自 SEQ ID NOs ： 2、 16、 30、 44、 58、 72、 86、 100、 114、 128、 142、 156、 170 和 184， 及其保守修饰 ； 所述重链可 变区 CDR3 氨基酸序列选自 SEQ ID NOs ： 3、 17、 31、 45、 59、 73、 87、 101、 115、 129、 143、 157、 171 和 185， 及其保守修饰 ； 所述轻链可变区 CDR1 氨基酸序列选自 SEQ ID NOs ： 4、 18、 32、 46、 60、 74、 88、 102、 116、 130、 144、 158、 172 和 186， 及其保守修饰 ； 所述轻链可变区 CDR2 氨基酸 序列选自 SEQ ID NOs ： 5、 19、 33、 47、 61、 75、 89、 103、 117、 131、 145、 159、 173 和 187， 及其保守 修饰 ； 所述轻链可变区 CDR3 氨基酸序列选自 SEQ ID NOs ： 6、 20、 34、 48、 62、 76、 90、 104、 118、 132、 146、 160、 174 和 188， 及其保守修饰 ； 所述抗体或其抗原结合片段特异性结合 C3b， 并在 如此处所述溶血测定中抑制红细胞溶解。
     在其它实施方案中， 优化用于在哺乳动物细胞中表达的本发明的抗体具有全长重 链序列和全长轻链序列， 其中一个或更多这些序列具有基于此处所述抗体的特定氨基酸序 列或其保守修饰， 并且其中所述抗体保留本发明 C3b 结合抗体的期望功能性质。因此， 本发 明提供优化用于在哺乳动物细胞中表达的分离的单克隆抗体， 其由全长重链和全长轻链组 成， 其中 ： 所述全长重链具有选自 SEQ ID NOs ： 9、 23、 37、 51、 65、 79、 93、 107、 121、 135、 149、 163、 177 和 191 的氨基酸序列， 及其保守修饰 ； 并且所述全长轻链具有选自 SEQ ID NOs ： 10、 24、 38、 52、 66、 80、 94、 108、 122、 136、 150、 164、 178 和 192 的氨基酸序列， 及其保守修饰 ； 所述 抗体特异性结合 C3b( 例如， 人和 / 或猕猴 C3b) ； 并且所述抗体在如此处所述的溶血测定中 抑制红细胞溶解。在特定实施方案中， 当使用用 100pM 人 C5 重构的人 C5 耗尽的血清时， 此 类抗体在 10％人或猕猴血清的溶血测定中具有低于 50nM 的 IC50 值。
     结合相同表位的抗体
     本发明提供与表 1 所述 C3b 结合抗体结合相同表位的抗体。 因此可基于它们在 C3b结合测定中与本发明其它抗体交叉竞争 ( 例如以统计学上显著的方式竞争性抑制结合 ) 的 能力鉴定额外的抗体。测试抗体抑制本发明抗体与 C3b 蛋白质 ( 例如， 人和 / 或猕猴 C3b) 结合的能力显示所述测试抗体可与该抗体竞争结合 C3b ； 根据非限制性理论， 该抗体和与 其竞争的抗体结合 C3b 上相同或相关 ( 例如， 结构上相似或空间上接近 ) 的表位。在某一 实施方案中， 与本发明抗体结合 C3b 上相同表位的抗体是人单克隆抗体。可如此处所述制 备并分离这种人单克隆抗体。 如此处所用， 当竞争抗体浓度高于竞争抗体的 106xKD， 竞争抗 体抑制本发明抗体结合 C3b 高于 50％时， 抗体 “竞争” 结合。
     改造和修饰的抗体
     还可使用具有一个或更多此处所示 VH 和 / 或 VL 序列的抗体作为起始材料制备本 发明的抗体， 以改造修饰的抗体， 所述修饰的抗体可以具有从起始抗体改变的性质。 可通过 修饰一个或两个可变区 ( 即， VH 和 / 或 VL)， 例如一个或更多 CDR 区和 / 或一个或更多构架 区内的一个或更多残基来改造抗体。此外或备选地， 可通过在恒定区内修饰残基来改造抗 体， 例如来改变所述抗体的效应功能。
     可以进行的一种类型的可变区改造是 CDR 移植。抗体主要通过定位在六个重链和 轻链互补决定区 (CDRs) 中的氨基酸残基与靶抗原相互作用。为此， CDRs 内的氨基酸序列 在各抗体之间比 CDRs 外的序列更多样化。因为 CDR 序列负责多数抗体 - 抗原相互作用， 所以通过构建表达载体来表达模拟特定天然发生抗体的性质的重组抗体是可能的， 所述表 达载体包括移植到具有不同性质的不同抗体的构架序列上的来自特定天然发生抗体的 CDR 序列 ( 参阅例如， Riechmann， L. 等， 1998 Nature 332 ： 323-327 ； Jones， P. 等， 1986 Nature 321 ： 522-525 ； Queen， C. 等， 1989Proc.Natl.Acad.， U.S.A.86 ： 10029-10033 ； Winter 的 美 国 专 利 号 5,225,539， 和 Queen 等 的 美 国 专 利 号 5,530,101 ； 5,585,089 ； 5,693,762 和 6,180,370)。
     因此， 本发明的另一实施方案涉及分离的单克隆抗体， 或其抗原结合片段， 其包含 重链可变区， 所述重链可变区分别包含具有选自 SEQ ID NOs ： 1、 15、 29、 43、 57、 71、 85、 99、 113、 127、 141、 155、 169 和 183 的氨基酸序列的 CDR1 序列 ； 具有选自 SEQ ID NOs ： 2、 16、 30、 44、 58、 72、 86、 100、 114、 128、 142、 156、 170 和 184 的氨基酸序列的 CDR2 序列 ； 具有选自 SEQ ID NOs ： 3、 17、 31、 45、 59、 73、 87、 101、 115、 129、 143、 157、 171 和 185 的氨基酸序列的 CDR3 序 列； 和轻链可变区， 所述轻链可变区分别包含具有选自 SEQ ID NOs ： SEQ ID NOs ： 4、 18、 32、 46、 60、 74、 88、 102、 116、 130、 144、 158、 172 和 186 的氨基酸序列的 CDR1 序列 ； 具有选自 SEQ ID NOs ： SEQ ID NOs ： 5、 19、 33、 47、 61、 75、 89、 103、 117、 131、 145、 159、 173 和 187 的氨基酸序 列的 CDR2 序列 ； 具有选自 SEQ ID NOs ： 6、 20、 34、 48、 62、 76、 90、 104、 118、 132、 146、 160、 174 和 188 的氨基酸序列的 CDR3 序列。因此， 此类抗体含有单克隆抗体的 VH 和 VL CDR， 但仍然 含有来自这些抗体的不同构架序列。
     可从公共 DNA 数据库或包括种系抗体基因序列的出版的参考文献中获得此类 构架序列。例如， 人重链和轻链可变区基因的种系 DNA 序列可见于 “VBase” 人种系序列 数 据 库 ( 可 在 互 联 网 www.mrc-cpe.cam.ac.uk/vbase 上 获 得 )， 以 及 Kabat， E.A.， 等， 1991 Sequences ofProteins of Immunological Interest，第 五 版， U.S.Department of Healthand Human Services， NIH 公开号 91-3242 ； Tomlinson， I.M.， 等， 1992 J.fol. Biol.227 ： 776-798 ； 和 Cox， J.P.L. 等， 1994 Eur.J Immunol.24 ： 827-836 ； 各自内容此处明确引入作为参考。
     用于本发明抗体的构架序列的实例是与本发明所选抗体使用的构架序列， 例如本 发明单克隆抗体使用的共有序列和 / 或构架序列在结构上相似的那些构架序列。VH CDR1、 2 和 3 序列， 以及 VL CDR1、 2 和 3 序列可移植到与见于构架序列来源的种系免疫球蛋白基 因中的序列具有相同序列的构架区上， 或者所述 CDR 序列可移植到与种系序列相比含有一 个或更多突变的构架区上。例如， 已经发现有利的是在某些情况下在构架区内突变残基以 维持或增强抗体的抗原结合力 ( 参阅例如， Queen 等的美国专利号 5,530,101 ； 5,585,089 ； 5,693,762 和 6,180,370)。可用作其上构建此处所述抗体和抗原结合片段的支架的构架包 括， 但不限于 VH1A、 VH1B、 VH3、 Vk1、 Vl2 和 Vk2。额外的构架为本领域所知， 并可见于例如万 维网 vbase.mrc-cpe.cam.ac.uk/index.php ？ &MMN_position ＝ 1:1 上的 vBase 数据库。
     另一类型的可变区修饰是在 VH 和 / 或 VL CDR1、 CDR2 和 / 或 CDR3 区内突变氨基 酸残基， 由此改善目的抗体的一种或更多结合性质 ( 例如， 亲和力 )， 称为 “亲和力成熟” 。 可 进行定点诱变或 PCR 介导的诱变引入突变， 并在如此处所述以及实施例中提供的体外或体 内测定中评估对抗体结合或其它目的功能性质的影响。可引入保守修饰 ( 如上文讨论 )。 所述突变可以是氨基酸替换、 添加或缺失。此外， 通常改变 CDR 区内不超过 1、 2、 3、 4或5个 残基。
     因此， 在另一实施方案中， 本发明提供分离的 C3b 结合单克隆抗体， 或其抗原结合 片段， 其由重链可变区组成， 所述重链可变区具有 ： 由选自 SEQ ID NOs ： 1、 15、 29、 43、 57、 71、 85、 99、 113、 127、 141、 155、 169 和 183 的氨基酸序列， 或与 SEQ ID NOs ： 1、 15、 29、 43、 57、 71、 85、 99、 113、 127、 141、 155、 169 和 183 相比具有 1、 2、 3、 4 或 5 个氨基酸替换、 缺失或添加的 氨基酸序列组成的 VH CDR1 区 ； 具有选自 SEQ IDNOs ： 2、 16、 30、 44、 58、 72、 86、 100、 114、 128、 142、 156、 170 和 184 的氨基酸序列， 或与 SEQ ID NOs ： 2、 16、 30、 44、 58、 72、 86、 100、 114、 128、 142、 156、 170 和 184 相比具有 1、 2、 3、 4 或 5 个氨基酸替换、 缺失或添加的氨基酸序列的 VH CDR2 区 ； 具有选自 SEQ ID NOs ： 3、 17、 31、 45、 59、 73、 87、 101、 115、 129、 143、 157、 171 和 185 的氨基酸序列， 或与 SEQ ID NOs ： 3、 17、 31、 45、 59、 73、 87、 101、 115、 129、 143、 157、 171 和 185 相比具有 1、 2、 3、 4 或 5 个氨基酸替换、 缺失或添加的氨基酸序列的 VH CDR3 区 ； 具有选自 SEQ ID NOs ： 4、 18、 32、 46、 60、 74、 88、 102、 116、 130、 144、 158、 172 和 186 的氨基酸序列， 或与 SEQID NOs ： 4、 18、 32、 46、 60、 74、 88、 102、 116、 130、 144、 158、 172 和 186 相比具有 1、 2、 3、 4或 5 个氨基酸替换、 缺失或添加的氨基酸序列的 VL CDR1 区 ； 具有选自 SEQ ID NOs ： 5、 19、 33、 47、 61、 75、 89、 103、 117、 131、 145、 159、 173 和 187 的氨基酸序列， 或与 SEQ ID NOs ： 5、 19、 33、 47、 61、 75、 89、 103、 117、 131、 145、 159、 173 和 187 相比具有 1、 2、 3、 4 或 5 个氨基酸替换、 缺失 或添加的氨基酸序列的 VL CDR2 区 ； 和具有选自 SEQ ID NOs ： 6、 20、 34、 48、 62、 76、 90、 104、 118、 132、 146、 160、 174 和 188 的氨基酸序列， 或与 SEQ ID NOs ： 6、 20、 34、 48、 62、 76、 90、 104、 118、 132、 146、 160、 174 和 188 相比具有 1、 2、 3、 4 或 5 个氨基酸替换、 缺失或添加的氨基酸序 列的 VL CDR3 区。
     抗原结合域移植到备选构架或支架中
     可使用多种抗体 / 免疫球蛋白构架或支架， 只要所得多肽包括至少一个特异性结 合 C3b 的抗原结合区。此类构架或支架包括人免疫球蛋白或其片段的 5 个主要个体基因 型， 并包括其它动物物种， 优选具有人源化方面的动物物种的免疫球蛋白。单重链抗体， 如在骆驼中鉴定的那些单重链抗体在该方面十分重要。 本领域技术人员不断发现并开发新的 构架、 支架和片段。
     一方面， 本发明涉及使用其上可移植本发明 CDRs 的非免疫球蛋白支架产生基 于非免疫球蛋白的抗体。可以使用已知或未知非免疫球蛋白构架和支架， 只要它们包 含对靶 C3b 蛋白质 ( 例如， 人和 / 或猕猴 C3b) 特异的结合区。已知的非免疫球蛋白构 架 或 支 架 包 括， 但 不 限 于 纤 连 蛋 白 (Compound Therapeutics， Inc.， Waltham， MA)、 锚 蛋 白 (MolecularPartners AG， Zurich， Switzerland)、 结 构 域 抗 体 (Domantis， Ltd.， Cambridge， MA， and Ablynx nv， Zwijnaarde， Belgium)、脂 笼 蛋 白 (PierisProteolab AG， Freising， Germany)、 小 模 块 免 疫 药 物 (TrubionPharmaceuticals Inc.， Seattle， WA)、 maxybodies(Avidia， Inc.， MountainView， CA)、 A 蛋 白 (Affibody AG， Sweden) 和 affilin(γ- 晶体蛋白或泛素 )(Scil Proteins GmbH， Halle， Germany)。
     纤连蛋白支架基于纤连蛋白类型 III 结构域 ( 例如， 纤连蛋白类型 III 的第十个 模块 (10Fn3 结构域 ))。纤连蛋白类型 III 结构域具有在两个 β 折叠之间分布的 7 个或 8 个 β 链， 所述两个 β 折叠自身彼此包装形成蛋白质的核心， 并进一步含有将 β 链彼此连 接且暴露在溶剂中的环 ( 与 CDRs 类似 )。在 β 折叠夹层每一边缘具有至少三个这样的环， 其中所述边缘是与 β 链方向垂直的蛋白质边界 ( 参阅 US 6,818,418)。 这些基于纤连蛋白 的支架不是免疫球蛋白， 尽管总体折叠与最小功能抗体片段、 在骆驼和骆马 IgG 中包含完 整抗原识别单位的重链可变区十分相近。因为该结构， 非免疫球蛋白抗体模拟与自然界中 相似的抗原结合性质以及与抗体的那些亲和力相似的亲和力。 这些支架可用于体外环随机 化和改组策略， 其与体内抗体的亲和力成熟过程相似。这些基于纤连蛋白的分子可用作支 架， 其中使用标准克隆技术用本发明的 CDRs 替换所述分子的环区。
     锚蛋白技术基于使用具有锚蛋白来源的重复模块的蛋白质作为携带可变区的支 架， 所述可变区可用于结合不同靶标。所述锚蛋白重复模块是由两个反向平行的 α 螺旋和 β 转角组成的 33 个氨基酸的多肽。通过使用核糖体展示对可变区的结合进行最大优化。
     Avimers 来自含有如 LRP-1 蛋白质的天然 A 结构域。这些结构域天然地用于蛋白 质 - 蛋白质相互作用， 并且在人中超过 250 个蛋白质在结构上基于 A 结构域。Avimers 由通 过氨基酸接头连接的大量不同的 “A 结构域” 单体 (2-10) 组成。可使用例如美国专利申请 公开号 20040175756 ； 20050053973 ； 20050048512 和 20060008844 中描述的方法产生可以 结合靶抗原的 Avimers。
     Affibody 亲和配体是由基于 A 蛋白一个 IgG 结合域的支架的三螺旋束组成的小的 简单蛋白质。A 蛋白是来自细菌金黄色葡萄球菌 (Staphylococcus aureus) 的表面蛋白。 该支架结构域由 58 个氨基酸组成， 其中 13 个随机化以产生具有大量配体变体的 affibody 文库 ( 参阅例如， US5,831,012)。Affibody 分子模拟抗体， 它们与 150kDa 的抗体分子量相 比具有 6kDa 的分子量。尽管其具有小的尺寸， 但 affibody 分子的结合位点与抗体的结合 位点类似。
     Anticalins 是 Pieris ProteoLab AG 公司开发的产品。 它们衍生自脂笼蛋白， 其为 一大类小且坚固的蛋白质， 一般参与生理运输或储藏化学敏感的或不溶解的化合物。若干 天然脂笼蛋白在人组织或体液中产生。蛋白质结构表明为免疫球蛋白， 在刚性构架上面具 有高变环。然而， 与抗体或它们的重组片段相比， 脂笼蛋白由具有 160 到 180 个氨基酸残基的单条多肽链组成， 仅比单个免疫球蛋白结构域稍大。构成结合口袋的四环组显示明显的 结构可塑性并耐受多种侧链。因此结合位点在专有方法中可重塑， 以识别具有高亲和力和 特异性的不同形状的规定靶分子。 脂笼蛋白家族的一个蛋白质——Pieris Brassicae 的后 胆色素结合蛋白 (BBP) 已经用于通过诱变处理四环组来开发 anticalins。 描述 anticalins 的专利申请的一个实例在 PCT 公开号 WO 199916873 中。
     Affilin 分子是设计用来针对蛋白质和小分子具有特异亲和力的小的非免疫球蛋 白蛋白质。可从两个文库中非常快速地选择新的 affilin 分子， 每一所述文库基于来自不 同人的支架蛋白。 Affilin 分子与免疫球蛋白蛋白质不显示任何结构同源性。 目前， 使用两 个 affilin 支架， 其中一个是 γ 晶体蛋白——人结构晶状体蛋白质， 另一个是 “泛素” 超家 族蛋白质。两个人支架均非常小， 显示高的温度稳定性， 并对 pH 改变和变性剂几乎是有抵 抗力的。该高稳定性主要是因为蛋白质扩展的 β 折叠结构。γ 晶体蛋白来源的蛋白质的 实例描述于 WO200104144 中， 并且 “泛素样” 蛋白质的实例描述于 WO2004106368 中。
     蛋白质表位模拟 (PEM) 是模拟蛋白质 β 发夹二级结构的中等大小、 环形的、 肽样 分子 (MW 1-2kDa)， 所述主要二级结构参与蛋白质 - 蛋白质相互作用。
     人抗体或人源化抗体
     本发明提供特异性结合 C3b 蛋白质 ( 例如， 人和 / 或猕猴 C3b) 的完全人抗体。与 嵌合或人源化抗体相比， 当对人受试者施用时， 本发明的人 C3b 结合抗体具有进一步降低 的抗原性。
     可使用本领域已知的方法产生人 C3b 结合抗体。例如， 人类工程技术用于将非人 抗体转变成改造的人抗体。美国专利公开号 20050008625 描述了用抗体中人可变区替换非 人抗体可变区的体内方法， 同时维持相同或提供比非人抗体的结合性质更好的结合性质。 所述方法依赖于完全人抗体对非人参考抗体可变区的表位引导的替换。 所得人抗体一般在 结构上与参考非人抗体不相关， 但与所述参考抗体结合相同抗原上的相同表位。 简言之， 在 响应测试抗体结合抗原的报告系统存在下， 通过在细胞中 “竞争者” 与参考抗体 (“测试抗 体” ) 多种杂合物的文库之间建立竞争结合有限量的抗原， 使得可以进行连续表位引导的互 补性替换方法。所述竞争者可以是参考抗体或其衍生物， 如单链 Fv 片段。所述竞争者也可 以是天然的或人造的抗原配体， 其与参考抗体结合相同的表位。所述竞争者唯一需要的是 其可以与参考抗体结合相同的表位， 并且其与参考抗体竞争结合抗原。测试抗体具有来自 非人参考抗体的一个共同的抗原结合 V 区， 和从不同来源如人抗体的所有组成成分库中随 机选择的其它 V 区。来自参考抗体的共同 V 区用作引导者， 将所述测试抗体置于抗原上的 相同表位上， 并且在同一方向， 从而选择是偏向于对参考抗体具有最高抗原结合保真度。
     许多类型的报告系统可用于检测测试抗体与抗原之间期望的相互作用。例如， 互 补报告子片段可分别连接抗原和测试抗体， 使得仅当测试抗体结合抗原时发生片段互补的 报告子激活。当测试抗体和抗原报告片段融合物与竞争者共表达时， 报告子激活变得依赖 于所述测试抗体与竞争者竞争的能力， 其与该测试抗体对抗原的亲和力成比例。可使用的 其它报告系统包括如美国专利申请系列号 10/208,730( 公开号 20030198971) 中公布的自 抑制的报告子再激活系统 (RAIR) 的再激活子， 或在美国专利申请系列 10/076,845( 公开号 20030157579) 中公开的竞争激活系统。
     利用连续表位引导的互补替换系统， 进行选择以鉴定表达单个测试抗体与竞争者、 抗原和报告子组分的细胞。 在这些细胞中， 每一测试抗体一对一地与竞争者竞争结合有 限量的抗原。报告子的活性与结合测试抗体的抗原的量成比例， 其又与测试抗体对抗原的 亲和力和测试抗体的稳定性成比例。当表达为测试抗体时， 开始在其相对于参考抗体的活 性基础上选择测试抗体。第一轮选择的结果是一组 “杂合” 抗体， 其中每一抗体包含来自参 考抗体的相同非人 V 区和来自文库的人 V 区， 并且每一抗体与参考抗体结合抗原上的相同 表位。在第一轮中选择的一个或更多杂合抗体对抗原的亲和力与参考抗体相当或更高。
     在第二个 V 区替换步骤中， 使用在第一步骤中选择的人 V 区作为选择同族人 V 区 的多样文库替换剩余非人参考抗体 V 区的指导。第一轮中选择的杂合抗体也可用作第二轮 选择的竞争者。 第二轮选择的结果是一组完全人抗体， 其在结构上不同于参考抗体， 但与参 考抗体竞争结合相同的抗原。一些所选人抗体与参考抗体结合相同抗原上的相同表位。在 这些所选人抗体中， 一个或更多抗体以与参考抗体相当或比其高的亲和力结合相同表位。
     使用上文描述的一种小鼠或嵌合 C3b 结合抗体作为参考抗体， 可容易地使用该方 法来产生以相同结合特异性及相同或更高结合亲和力结合人 C3b 的人抗体。此外， 也可从 通常生产人抗体的公司， 例如 KaloBios， Inc.(Mountain View， CA) 通过商业途径获得此类 人 C3b 结合抗体。
     骆驼 (camelid) 抗体
     从骆驼和单峰骆驼 (Camelus bactrianus 和 Calelus dromaderius) 家族的成员， 包括新世界成员如骆马物种 (Lama paccos、 Lama glama 和 Lamavicugna) 中获得的抗体蛋 白质已经在大小、 结构复杂性和对人受试者的抗原性方面进行了表征。自然界中发现的来 自该哺乳动物家族的某些 IgG 抗体缺少轻链， 并因此在结构上不同于来自其它动物的抗体 的两条重链和两条轻链的典型四链四级结构。参阅 PCT/EP93/02214(1994 年 3 月 3 日公开 的 WO 94/04678)。
     可通过遗传改造获得鉴定为 VHH 的小的单个可变结构域的骆驼抗体的区域， 以产 生对靶标具有高亲和力的小蛋白质， 得到低分子量的抗体来源蛋白质， 称为 “骆驼纳米抗 体” 。参阅 1998 年 6 月 2 日提交的美国专利号 5,759,808 ； 还参阅 Stijlemans， B. 等， 2004J Biol Chem 279 ： 1256-1261 ； Dumoulin， M. 等， 2003 Nature 424 ： 783-788 ； Pleschberger， M. 等 2003Bioconjugate Chem 14 ： 440-448 ； Cortez-Retamozo， V. 等 2002 Int JCancer 89 ： 456-62 ； 和 Lauwereys， M. 等 1998 EMBO J 17 ： 3512-3520。 例 如 从 Ablynx， Ghent， Belgium 通过商业途径获得骆驼抗体和抗体片段的改造库。 如同非人来源的其它抗体一样， 可重组改变骆驼抗体的氨基酸序列， 来获得与人序列更像的序列， 即纳米抗体可以进行 “人 源化” 。因此， 骆驼抗体对人的天然低抗原性可进一步降低。
     骆驼纳米抗体的分子量是人 IgG 分子的大概十分之一， 并且所述蛋白质物理直径 仅几纳米。 小尺寸的一种结果是骆驼纳米抗体能够结合更大抗体蛋白质在功能上看不见的 抗原位点， 即骆驼纳米抗体可用作使用经典免疫技术检测不到的抗原的试剂， 并可能用作 治疗剂。因此， 小尺寸的另一结果是骆驼纳米抗体因此可抑制靶蛋白质的沟或窄缝中特异 位点的结合， 并因而可具有这样的能力， 其比典型抗体更像典型的低分子量药物的功能。
     低分子量和紧密尺寸还导致骆驼纳米抗体极其热稳定， 对极端 pH 和蛋白酶解消 化稳定， 并且抗原性弱。 另一结果是骆驼纳米抗体容易从循环系统转移到组织， 甚至穿过血 脑屏障， 可治疗影响神经组织的病症。纳米抗体可进一步利于药物运输穿过血脑屏障。参阅 2004 年 8 月 19 日公开的美国专利申请 20040161738。这些特征与对人的低抗原性结合 表明巨大的治疗潜能。另外， 这些分子可在原核细胞， 如大肠杆菌 (E.coli) 中完全表达， 并 用噬菌体表达为融合蛋白， 且是有功能的。
     因此， 本发明的特征是对 C3b 具有高亲和力的骆驼抗体或纳米抗体。在此处的某 些实施方案中， 所述骆驼抗体或纳米抗体在骆驼动物中天然产生， 即， 使用此处为其它抗体 描述的技术， 用 C3b 或其肽片段免疫骆驼来产生。或者， 改造， 即如此处实施例中所述使用 C3b 作为靶标的淘选方法， 通过例如从展示适当诱导的骆驼纳米抗体蛋白质的噬菌体文库 中选择产生 C3b 结合的骆驼纳米抗体。可通过遗传改造进一步定制改造的纳米抗体， 以在 受体受试者中具有从 45 分钟到两周的半衰期。在特定实施方案中， 如 PCT/EP93/02214 所 述， 通过将本发明人抗体的重链或轻链的 CDRs 序列移植到纳米抗体或单结构域抗体构架 序列中来获得骆驼抗体或纳米抗体。
     双特异性分子和多价抗体
     另一方面， 本发明描述了包含本发明 C3b 结合抗体或其片段的双特异性或多特异 性分子。本发明的抗体或其抗原结合片段可衍生或连接另一功能分子， 例如另一肽或蛋白 质 ( 例如， 另一抗体或受体的配体 )， 来产生结合至少两种不同结合位点或靶分子的双特异 性分子。本发明的抗体可实际上衍生或连接超过一种其它功能分子， 以产生结合多于两种 不同结合位点和 / 或靶分子的多特异性分子 ； 此处所用的术语 “双特异性分子” 也旨在包括 此类多特异性分子。为了产生本发明的双特异性分子， 本发明的抗体可在功能上连接 ( 例 如， 通过化学偶联、 遗传融合、 非共价结合或其它 ) 一个或更多其它结合分子， 如另一抗体、 抗体片段、 肽或结合模拟物， 以便产生双特异性分子。
     因此， 本发明包括双特异性分子， 其包含对 C3b 的至少第一种结合特异性， 和对第 二个靶表位的第二种结合特异性。例如， 所述第二个靶表位是 C3b 的不同于第一个靶表位 的另一表位。
     此外， 对于其中双特异性分子是多特异性的发明， 除了第一个和第二个靶表位之 外， 所述分子可以还包括第三种结合特异性。
     在一个实施方案中， 本发明的双特异性分子包含作为结合特异性的至少一种抗 体， 或其抗体片段， 包括例如， Fab、 Fab′、 F(ab′ )2、 Fv 或单链 Fv。所述抗体还可以是轻链 或重链二聚体， 或其任何最小片段， 如 Ladner 等美国专利号 4,946,778 中描述的 Fv 或单链 构建体。
     双抗体是二价的双特异性分子， 其中 VH 和 VL 结构域在单条多肽链上表达， 通 过太短以至于不能在同一条链上两个结构域之间配对的接头连接。所述 VH 和 VL 结构 域与另一条链的互补结构域配对， 由此产生两个抗原结合位点 ( 参阅例如， Holliger 等， 1993Proc.Natl.Acad.Sci.USA90 ： 6444-6448 ； Poljak 等， 1994 Structure 2 ： 1121-1123)。 可 通 过 在 同 一 细 胞 中 表 达 具 有 结 构 VHA-VLB 和 VHB-VLA(VH-VL 构 型 )， 或 VLA-VHB 和 VLB-VHA(VL-VH 构型 ) 的两条多肽链来产生双抗体。大多数的双抗体在细菌中以可溶形 式表达。通过连接两条双抗体形成多肽链与大约 15 个氨基酸残基的接头产生单链双抗体 (scDb)( 参 阅 Holliger 和 Winter， 1997 CancerImmunol.Immunother.， 45(3-4) ： 128-30 ； Wu 等， 1996 Immunotechnology， 2(1) ： 21-36)。scDb 在细菌中以可溶的活性单体形式表达 ( 参 阅 Holliger 和 Winter， 1997 Cancer Immunol.Immunother.， 45(34) ： 128-30 ； Wu 等，1996Immunotechnology， 2(1) ： 21-36 ； Pluckthun 和 Pack， 1997Immunotechnology， 3(2) ： 83-105 ； Ridgway 等， 1996 Protein Eng.， 9(7) ： 617-21)。双抗体可融合到 Fc 上， 以产生 “二 - 双抗体” ( 参阅 Lu 等， 2004J.Biol.Chem.， 279(4) ： 2856-65)。
     可用于本发明的双特异性分子中的其它抗体是鼠类、 嵌合和人源化单克隆抗体。
     可使用本领域已知的方法， 通过缀合成分结合特异性来制备本发明的双特异性分 子。例如， 可单独产生双特异性分子的每一结合特异性， 然后相互缀合。当结合特异性是 蛋白质或肽时， 多种偶联或交联剂可用于共价缀合。交联剂的实例包括 A 蛋白、 碳二亚胺、 N- 琥珀酰亚胺基 -S- 乙酰 - 硫代乙酸酯 (SATA)、 5， 5′ - 二硫代双 (2- 硝基苯甲酸 )(DTNB)、 邻 - 亚苯基二马来酰亚胺 (oPDM)、 N- 琥珀酰亚胺基 -3-(2- 吡啶基二硫代 ) 丙酸酯 (SPDP) 和磺基琥珀酰亚胺基 4-(N- 马来酰亚胺基甲基 ) 环己烷 -l- 羧酸酯 ( 磺基 -SMCC)( 参阅例 如， Karpovsky 等， 1984 J.Exp.Med.160 ： 1686 ； Liu， MA 等， 1985 Proc.Natl.Acad.Sci.USA 82 ： 8648)。其它方法包括在 Paulus， 1985Behring Ins.Mitt.No.78， 118-132 ； Brennan 等， 1985 Science 229 ： 81-83 和 Glennie 等， 1987 J.Immunol.139 ： 2367-2375 中描述的那些。 缀合剂是 SATA 和磺基 -SMCC， 两者均可从 Pierce Chemical Co.(Rockford， IL) 获得。
     当结合特异性是抗体时， 它们可通过两条重链的 C 末端铰链区的巯基成键而缀 合。在特定实施方案中， 在缀合之前修饰铰链区以含有奇数个巯基残基， 例如 1 个。
     或者， 两种结合特异性可在相同载体中编码， 并在相同宿主细胞中表达并装配。 其 中双特异性分子是 mAb x mAb、 mAb x Fab、 Fab x F(ab′ )2 或配体 x Fab 融合蛋白质时， 该 方法是特别有用的。本发明的双特异性分子可以单链分子， 其包含一个单链抗体和结合决 定簇， 或包含两个结合决定簇的单链双特异性分子。双特异性分子可包含至少两个单链分 子。 例如在美国专利号 5,260,203 ； 美国专利号 5,455,030 ； 美国专利号 4,881,175 ； 美国专 利号 5,132,405 ； 美国专利号 5,091,513 ； 美国专利号 5,476,786 ； 美国专利号 5,013,653 ； 美国专利号 5,258,498 ； 和美国专利号 5,482,858 中描述了用于制备双特异性分子的方法。
     例如， 通过酶联免疫吸附测定 (ELISA)、 放射免疫测定 (REA)、 FACS 分析、 生物测定 ( 例如生长抑制 )、 或 Western 印迹测定来验证双特异性分子与其特异性靶标的结合。这些 测定法中的每一种一般通过使用对目的复合体特异的标记试剂 ( 例如抗体 ) 检测特别重要 的蛋白质 - 抗体复合物的存在。
     另一方面， 本发明提供多价化合物， 其包含结合 C3b 的本发明抗体的至少两个相 同或不同的抗原结合部分。 所述抗原结合部分可通过蛋白质融合或共价或非共价键而连接 在一起。或者， 已经为双特异性分子描述了连接方法。例如通过交联本发明的抗体与结合 本发明抗体的恒定区， 例如 Fc 或铰链区获得四价化合物。
     例 如 在 Borean 专 利 EP 1 012 280B1 中 描 述 了 三 聚 化 结 构 域。 例 如 在 PCT/ EP97/05897 中描述了五聚化模块。
     具有延长半衰期的抗体
     本发明提供特异性结合 C3b 蛋白质的在体内具有延长半衰期的抗体。
     许多因素可影响蛋白质在体内的半衰期。例如， 肾过滤、 肝中的新陈代谢、 蛋白酶 解酶 ( 蛋白酶 ) 的降解和免疫原性应答 ( 例如， 抗体的蛋白质中和及巨噬细胞和树突状 细胞的吸收 )。多种策略可用于延长本发明抗体的半衰期。例如， 通过化学连接聚乙二醇 (PEG)、 reCODE PEG、 抗体支架、 聚唾液酸 (PSA)、 羟乙基淀粉 (HES)、 白蛋白结合配体、 和糖类保护层 ； 通过遗传融合到结合血清蛋白质的蛋白质， 如白蛋白、 IgG、 FcRn， 和转移 ； 通过偶 联 ( 遗传上或化学上 ) 到其它结合部分， 所述结合部分结合血清蛋白质， 如纳米抗体、 Fabs、 DARPins、 avimers、 affibodies 和 anticalins ； 通过遗传融合 rPEG、 白蛋白、 白蛋白的结构 域、 白蛋白结合蛋白质和 Fc ； 或通过掺入到 nancarriers 中， 减缓释放制剂和医疗设备。
     为了延长抗体在体内的血清循环， 可使用或不使用多功能接头通过 PEG 位点特异 性缀合到抗体 N 或 C 末端或通过赖氨酸残基上存在的 ε 氨基将惰性聚合分子如高分子量 PEG 附着到抗体或其片段上。为了聚乙二醇化抗体， 抗体或其片段通常与聚乙二醇 (PEG)， 如 PEG 的活性酯或醛衍生物在其中一个或更多 PEG 基团变得附着到抗体或其片段的条件下 进行反应。可利用活性 PEG 分子 ( 或类似活性水溶性聚合物 ) 通过酰化反应或烷化反应进 行聚乙二醇化。如此处所用， 术语 “聚乙二醇” 旨在包括任何的 PEG 形式， 其已经用于衍生 其它蛋白质， 如单 (C1-C10) 烷氧基或芳氧基 - 聚乙二醇或聚乙二醇 - 马来酰亚胺。在某些 实施方案中， 待聚乙二醇化的抗体是无糖基化抗体。使用导致生物活性损失最小的线性或 分支聚合物衍生化。可通过 SDS-PAGE 和质谱密切监测缀合的程度， 来保证 PEG 分子与抗体 的正确缀合。可通过大小排排阻或通过离子交换层析从抗体 -PEG 缀合物中分离未反应的 PEG。可使用本领域技术人员熟知的方法， 例如通过此处描述的免疫测定法测试 PEG 衍生抗 体的结合活性以及体内功效。聚乙二醇化蛋白质的方法为本领域所知， 并可应用到本发明 的抗体中。参阅例如， Nishimura 等的 EP 0 154 316 和 Ishikawa 等的 EP 0 401 384。
     其它修改的聚乙二醇化技术包括重建化学正交指导的改造技术 (ReCODE PEG)， 其 将化学上特定的侧链通过包括 tRNA 合成酶和 tRNA 的重建系统掺入到生物合成蛋白质中。 该技术能够在大肠杆菌、 酵母和哺乳动物细胞中将多于 30 个新氨基酸掺入到生物合成蛋 白质中。所述 tRNA 将非天然氨基酸掺入到琥珀密码子定位的任何位置， 使琥珀密码子从终 止密码子转化成信令化学上特定的氨基酸掺入的一个密码子。
     重组聚乙二醇化技术 (rPEG) 也可用于血清半衰期延长。该技术包括将 300-600 个氨基酸未组织的蛋白质尾巴融合到现有的药物蛋白质上。 因为该未组织蛋白质链的表观 分子量比其实际分子量大约 15 倍， 所以极大延长了该蛋白质的血清半衰期。与需要化学缀 合和再纯化的常规聚乙二醇化相反， 该制备方法极其简化并且产品是同质的。
     多唾液酸化是另一种技术， 其使用天然聚合物聚唾液酸 (PSA) 来延长活性生命并 提高治疗肽和蛋白质的稳定性。PSA 是唾液酸的聚合物 ( 糖 )。当用于蛋白质和治疗肽药 物递送时， 聚唾液酸在缀合上提供保护性微环境。这增加了治疗蛋白质在循环中的活性生 命并防止其被免疫系统识别。 PSA 聚合物天然见于人体中。 其被某些细菌采用， 所述细菌进 化了超过数百万年， 用所述 PSA 聚合物包被自身的壁。通过分子拟态， 这些天然多唾液酸化 细菌然后能够挫败身体的防御系统。 PSA 是自然界的最终偷窃技术， 可容易地自此类细菌大 量产生并具有预定的物理特点。甚至当与蛋白质偶联时， 细菌 PSA 也是完全非免疫原性的， 因为它与人体中的 PSA 在化学上相同。
     另一技术包括使用连接抗体的羟乙基淀粉 (“HES” ) 衍生物。HES 是来自蜡状玉 米淀粉的修饰的天然聚合物， 并可通过身体的酶进行新陈代谢。一般施用 HES 溶液来替换 不足的血液体积并改善血液的流变学性质。 抗体的羟乙基化使得能够通过提高分子的稳定 性， 以及降低肾清除率来延长循环半衰期， 产生提高的生物学活性。通过改变不同的参数， 如 HES 的分子量， 可定制广泛的 HES 抗体缀合物。也可通过向 IgG 恒定结构域或其 FcRn 结合片段 ( 优选 Fc 或铰链 Fc 结构域片 段 ) 中引入一个或更多氨基酸修饰 ( 即， 替换、 插入或缺失 ) 产生在体内具有增加的半衰 期的抗体。参阅例如， 国际公开号 WO 98/23289 ； 国际公开号 WO 97/34631 ； 和美国专利号 6,277,375。
     另外， 抗体可缀合到白蛋白 ( 例如， 人血清白蛋白 ； HSA) 上， 以使抗体或抗体片段 在体内更稳定或在体内具有更长的半衰期。技术为本领域所熟知， 参阅例如国际公开号 WO 93/15199、 WO 93/15200 和 WO 01/77137 ； 和欧洲专利号 EP 413,622。此外， 在上文描述的 双特异性抗体的背景中， 可设计抗体的特异性， 以便抗体的一个结合域结合 C3b， 而抗体的 第二个结合域结合血清白蛋白， 优选 HSA。
     提高半衰期的策略特别用于纳米抗体、 基于纤连蛋白的结合子， 和期望提高体内 半衰期的其它抗体或蛋白质。
     抗体缀合物
     本发明提供特异性结合 C3b 蛋白质的抗体或其片段， 其重组融合或化学缀合 ( 包 括共价和非共价缀合 ) 到异源蛋白质或多肽 ( 或其片段， 优选至少 10、 至少 20、 至少 30、 至少 40、 至少 50、 至少 60、 至少 70、 至少 80、 至少 90 或至少 100 个氨基酸的多肽 )， 以产 生融合蛋白质。具体而言， 本发明提供包含此处所述抗体的抗原结合片段 ( 例如， Fab 片 段、 Fd 片段、 Fv 片段、 F(ab)2 片段、 VH 结构域、 VH CDR、 VL 结构域或 VL CDR) 和异源蛋白 质、 多肽或肽的融合蛋白质。用于融合或缀合蛋白质、 多肽或肽到抗体或抗体片段上的方 法为本领域所知。参阅例如美国专利号 5,336,603、 5,622,929、 5,359,046、 5,349,053、 5,447,851 和 5,112,946 ； 欧洲专利号 EP 307,434 和 EP 367,166 ； 国际公开号 WO 96/04388 和 WO91/06570 ； Ashkenazi 等， 1991， Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88 ： 10535-10539 ； Zheng 等， 1995， J.Immunol.154 ： 5590-5600 ； 和 Vil 等， 1992， Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89 ： 11337-11341。
     可通过基因改组、 基序改组、 外显子改组和 / 或密码子改组 ( 共同称为 “DNA 改 组” ) 的技术产生额外的融合蛋白质。可使用 DNA 改组来改变本发明抗体或其片段的 活性 ( 例如， 具有更高亲和力和更低解离速率的抗体或其片段 )。一般参阅美国专利 号 5,605,793、 5,811,238、 5,830,721、 5,834,252 和 5,837,458 ； Patten 等， 1997， Curr. Opinion Biotechnol.8 ： 724-33 ； Harayama， 1998， Trends Biotechnol.16(2) ： 76-82 ； Hansson 等， 1999， J.Mol.Biol.287 ： 265-76 ； 以及 Lorenzo 和 Blasco， 1998， Biotechniques 24(2) ： 308-313( 这些专利和出版物每一文件以其整体引入作为参考 )。 可在重组之前通过 易错 PCR、 随机核苷酸插入或其它方法进行随机诱变来改变抗体或其片段， 或编码的抗体或 其片段。编码特异性结合 C3b 蛋白质的抗体或其片段的多核苷酸可与一种或更多异源分子 的一个或更多组分、 基序、 断片、 部分、 结构域、 片段等重组。
     此外， 抗体或其片段可融合到标记序列上， 如肽， 以利于纯化。在优选的实施 方案中， 标记氨基酸序列是六组氨酸肽， 如 pQE 载体 (QIAGEN， Inc.， 9259 Eton Avenue， Chatsworth， CA， 91311) 中提供的标签， 其中许多可以通过商业途径获得。如 Gentz 等， 1989， Proc.Natl.Acad.Sci.USA86 ： 821-824 中所述， 六组氨酸提供融合蛋白质的便利纯 化。可用于纯化的其它肽标签包括， 但不限于血凝素 ( “HA” ) 标签， 其对应于来自流行性感 冒血凝素蛋白质的表位 (Wilson 等， 1984， Cell 37 ： 767) 和 “flag” 标签。在其它实施方案中， 本发明的抗体或其片段缀合诊断或检测试剂。此类抗体可用 于监测或预后疾病或病症的开始、 发展、 进行和 / 或严重性， 作为临床试验程序的一部分， 如测定特定治疗的功效。可通过将抗体与可检测物质偶联完成此类诊断和检测， 所述可检 测物质包括但不限于多种酶， 如但不限于， 辣根过氧化物酶、 碱性磷酸酶、 β- 半乳糖苷酶、 或乙酰胆碱酯酶 ； 辅基， 如但不限于链霉抗生物素蛋白生物素和抗生物素蛋白 / 生物素 ； 荧 光物质， 如但不限于伞形酮、 荧光素、 异硫氰酸荧光素、 罗丹明、 二氯三嗪基胺荧光素、 丹磺 酰氯或藻红蛋白 ； 发光物质， 如但不限于鲁米诺 ； 生物发光物质， 如但不限于荧光素酶、 荧 光素和水母发光蛋白 ； 放射性物质， 如但不限于碘 (131I、 125I、 123I 和 121I)、 碳 (14C)、 硫 (35S)、 氚 (3H)、 铟 (115In、 113In、 112In 和 111In)、 锝 (99Tc)、 铊 (201Ti)、 镓 (68Ga、 67Ga)、 钯 (103Pd)、钼 (99Mo)、氙 (133Xe)、氟 (18F)、 153Sm、 177Lu、 159Gd、 149Pm、 140La、 175Yb、 166Ho、 90Y、 47Sc、 186Re、 188Re、 142Pr、 105Rh、 97Ru、 68Ge、 57Co、 65Zn、 85Sr、 32P、 153Gd、 169Yb、 51Cr、 54Mn、 75Se、 113Sn 和 117Tin ； 和使用多种正电子发射断层术的正电子发射金 属， 和非放射性顺磁金属离子。
     本发明还包括缀合治疗部分的抗体或其片段的用途。 抗体或其片段可缀合到治疗 部分， 如细胞毒素， 例如细胞生长抑制剂或细胞自杀剂， 治疗剂或放射性金属离子， 例如 α 粒子发射体。细胞毒素或细胞毒性剂包括对细胞有害的任何试剂。
     另外， 抗体或其片段可缀合到修饰给定生物反应的治疗部分或药物部分。治疗部 分或药物部分不解释为限制为典型的化学治疗剂。例如， 药物部分可以是具有想要的生物 学活性的蛋白质、 肽或多肽。此类蛋白质可包括例如， 毒素如相思豆毒蛋白、 蓖麻毒蛋白 A、 假单胞菌外毒素、 霍乱毒素或白喉毒素 ； 蛋白质如肿瘤坏死因子、 α 干扰素、 β 干扰素、 神 经生长因子、 血小板衍生生长因子、 组织纤溶酶原激活物、 细胞凋亡剂、 抗血管生成剂 ； 或生 物反应修饰因子， 例如淋巴因子。
     此外， 抗体可缀合到治疗部分， 如放射性金属离子， 如 α 粒子发射体， 如用于将放 射性金属离子 ( 包括但不限于 131In、 131LU、 131Y、 131Ho、 131Sm) 缀合到多肽上的 213Bi 或大环螯合剂。在某些实施方案中， 所述大环螯合剂是 1， 4， 7， 10- 四氮杂环十二烷 -N， N’ ， N” ， N’ ” - 四乙酸 (DOTA)， 其可通过接头分子附着到抗体上。此类接头分子为本领域所 熟知， 并描述于 Denardo 等， 1998， Clin Cancer Res.4(10) ： 2483-90 ； Peterson 等， 1999， Bioconjug.Chem.10(4) ： 553-7 ； 和 Zimmerman 等， 1999， Nucl.Med.Biol.26(8) ： 943-50， 每 一参考文献以其整体引入作为参考。
     用 于 将 治 疗 部 分 缀 合 到 抗 体 上 的 技 术 是 众 所 周 知 的， 参 阅 例 如 Arnon 等， “Monoclonal Antibodies For Immunotargeting Of Drugs In CancerTherapy” ， Monoclonal Antibodies And Cancer Therapy， Reisfeld 等 ( 编辑 )， 第 243-56 页 (Alan R.Liss， Inc.1985) ； Hellstrom 等， “Antibodies For DrugDelivery” ， Controlled Drug Delivery( 第 2 版 Robinson 等 ( 编 辑 )，第 623-53 页 (Marcel Dekker， Inc.1987) ； Thorpe， “Antibody Carriers Of CytotoxicAgents In Cancer Therapy ： A Review” ， Monoclonal Antibodies 84 ： Biological And Clinical Applications ， Pinchera 等 ( 编 辑 )， 第 475-506 页 (1985) ； “Analysis， Results， And Future Prospective Of The TherapeuticUse Of Radiolabeled Antibody In Cancer Therapy” ， MonoclonalAntibodies For Cancer Detection And Therapy， Baldwin 等 ( 编 辑 )， 第303-16 页 (Academic Press 1985)， 和 Thorpe 等， 1982， Immunol.Rev.62 ： 119-58。
     抗体也可附着到固相支持体上， 所述固相支持体特别用于靶抗原的免疫测定或纯 化。 此类固相支持体包括， 但不限于玻璃、 纤维素、 聚丙烯酰胺、 尼龙、 聚苯乙烯、 聚氯乙烯或 聚丙烯。
     产生本发明抗体的方法
     编码抗体的核酸
     本发明提供基本纯化的核酸分子， 其编码包含上文描述的 C3b 结合抗体链的区段 或结构域的多肽。 本发明的一些核酸包含编码示于 SEQ ID NO ： 7、 21、 35、 49、 63、 77、 91、 105、 119、 133、 147、 161、 175 和 189 的重链可变区的核苷酸序列， 和 / 或编码示于 SEQ ID NO ： 8、 22、 36、 50、 64、 78、 92、 106、 120、 134、 148、 162、 176 的轻链可变区的核苷酸序列。在特定实施 方案中， 核酸分子是在表 1 中鉴定的那些核酸分子。 本发明的一些其它核酸分子包含与表 1 中鉴定的那些核酸分子的核苷酸序列基本相同 ( 例如至少 65、 80％、 95％或 99％ ) 的核苷 酸序列。当从适当表达载体进行表达时， 这些多核苷酸编码的多肽能够显示 C3b 抗原结合 能力。
     本发明还提供的是编码来自上文阐明的 C3b 结合抗体的重链和轻链的至少一个 CDR 区以及一般地所有三个 CDR 区的多核苷酸。一些其它多核苷酸编码上文阐明的 C3b 结 合抗体的重链和 / 或轻链的所有或基本上所有可变区序列。因为密码子的简并性， 多种核 酸序列编码每一种免疫球蛋白氨基酸序列。
     本发明的核酸分子可编码抗体的可变区和恒定区。 一些本发明的核酸序列包含编 码成熟重链序列的核苷酸， 所述成熟重链序列与在 SEQ IDNOs ： 9、 23、 37、 51、 65、 79、 93、 107、 121、 135、 149、 163、 177 和 191 中阐明的成熟重链序列基本相同 ( 例如， 至少 80 ％、 90 ％或 99％ )。一些其它核酸序列包含编码成熟轻链序列的核苷酸， 所述成熟轻链序列与在 SEQID NOs ： 10、 24、 38、 52、 66、 80、 94、 108、 122、 136、 150、 164、 178 和 192 中阐明的成熟轻链序列基 本相同 ( 例如， 至少 80％、 90％或 99％ )。
     可通过从头固相 DNA 合成或通过 PCR 诱变编码 C3b 结合抗体或其结合片段的现有 序列 ( 例如下文实施例中描述的序列 ) 来产生多核苷酸序列。可通过本领域已知的方法， 如 Narang 等， 1979， Meth.Enzymol.68 ∶ 90 的磷酸三酯法 ； Brown 等， Meth.Enzymol.68 ： 109， 1979 的磷酸二酯法 ； Beaucage 等， Tetra.Lett.， 22 ： 1859， 1981 的二乙基亚磷酰胺法 ； 和美国专利号 4,458,066 的固相支持物法完成核酸的直接化学合成。如 PCR Technology ： Principles and Applications for DNA Amplification， H.A.Erlich( 编辑 )， Freeman Press， NY， NY， 1992 ； PCR Protocols ： A Guide to Methods andApplications， Innis 等 ( 编 辑 )， Academic Press， San Diego， CA， 1990 ； Mattila 等， Nucleic Acids Res.19 ： 967， 1991 ； 和 Eckert 等， PCR Methodsand Applications 1 ： 17， 1991 中描述的进行通过 PCR 向多核苷 酸序列中引入突变。
     本发明还提供用于产生上文所述 C3b 结合抗体的表达载体和宿主细胞。可使用 多种表达载体来表达编码 C3b 结合抗体链或结合片段的多核苷酸。基于病毒的表达载体 和非病毒表达载体均可用于在哺乳动物宿主细胞中产生抗体。非病毒载体和系统包括质 粒、 游离型载体， 通常具有用于表达蛋白质或 RNA 的表达盒， 和人工染色体 ( 参阅例如， Harrington 等， NatGenet 15 ： 345， 1997)。例如， 用于在哺乳动物 ( 例如人 ) 细胞中表达C3b 结合多核苷酸和多肽的非病毒载体包括 pThioHis A、 B&C、 pcDNA3.1/His、 pEBVHis A、 B&C(Invitrogen， San Diego， CA)、 MPSV 载体， 和本领域中已知用于表达其它蛋白质的许多 其它载体。 有用的病毒载体包括基于逆转录病毒、 腺病毒、 腺伴随病毒、 疱疹病毒的载体、 基 于 SV40、 乳头瘤病毒、 HBP EB 病毒、 痘苗病毒载体和 Semliki Forest 病毒 (SFV) 的载体。 参 阅， Brent 等， 上文 ； Smith， Annu.Rev.Microbiol.49 ： 807， 1995 ； 和 Rosenfeld 等， Cell 68 ： 143， 1992。
     表达载体的选择依赖于其中待表达所述载体的预期宿主细胞。通常， 所述表达载 体含有有效连接编码 C3b 结合抗体链或片段的多核苷酸的启动子和其它调节序列 ( 例如， 增强子 )。 在一些实施方案中， 使用诱导型启动子来防止插入序列的表达 ( 除了在诱导条件 下之外 )。诱导型启动子包括， 例如阿拉伯糖、 lacZ、 金属硫蛋白启动子或热激启动子。可 在非诱导条件下扩大转化生物的培养， 而不偏向编码序列的群体， 宿主细胞能更好地耐受 所述编码序列的表达产物。除了启动子， 也需要或想要其它调节元件用于 C3b 结合抗体链 或片段的有效表达。这些元件通常包括 ATG 起始密码子和邻近核糖体结合位点或其它序 列。此外， 可通过包括适合于使用中的细胞系统的增强子来增强表达的效率 ( 参阅例如， Scharf 等， Results Probl.Cell Differ.20 ： 125， 1994 ； 和 Bittner 等， Meth.Enzymol.， 153 ： 516， 1987)。例如， SV40 增强子或 CMV 增强子可用于提高哺乳动物宿主细胞中的表达。
     表达载体也可提供分泌信号序列位置， 以与插入的 C3b 结合抗体序列编码的多肽 形成融合蛋白质。更经常地， 所述插入的 C3b 结合抗体序列在包括在载体中之前连接信号 序列。待用于接受编码 C3b 结合的抗体轻链和重链可变结构域的序列的载体有时候也编码 恒定区或其部分。此类载体允许可变区表达为与恒定区的融合蛋白质， 由此导致完整抗体 或其片段的产生。通常， 此类恒定区是人的恒定区。
     用于携带并表达 C3b 结合抗体链的宿主细胞可以是原核细胞或真核细胞。大肠杆 菌是用于克隆并表达本发明多核苷酸的一种原核宿主。 适于使用的其它微生物宿主包括芽 孢杆菌， 如枯草杆菌 (Bacillus subtilis)， 和其它肠杆菌科 (enterobacteriaceae)， 如沙 门氏菌属 (Salmonella)、 沙雷氏菌属 (Serratia) 和多种假单胞菌属 (Pseudomonas) 物种。 在这些原核宿主中， 也可以制备表达载体， 其通常含有与所述宿主细胞相容的表达控制序 列 ( 例如， 复制起点 )。此外， 存在任何数量的多种众所周知的启动子， 如乳糖启动子系统、 色氨酸 (trp) 启动子系统、 β- 内酰胺酶启动子系统， 或来自 λ 噬菌体的启动子系统。所 述启动子通常任选地与操纵子序列控制表达， 并具有核糖体结合位点序列等， 用于起始并 完成转录和翻译。其它微生物， 如酵母也可用于表达本发明的 C3b 结合多肽。也可使用昆 虫细胞与杆状病毒载体组合。
     在一些优选的实施方案中， 哺乳动物宿主细胞用于表达并产生本发明的 C3b 结合 多肽。例如， 它们可以是表达内源免疫球蛋白基因的杂交瘤细胞系 ( 例如， 实施例中描述 的 1D6.C9 骨髓瘤杂交瘤克隆 ) 或携带外源表达载体的哺乳动物细胞系 ( 例如， 下文示例的 SP2/0 骨髓瘤细胞 )。这些包括任何正常致死或正常或非正常永生动物或人细胞。例如， 已 经开发了能够分泌完整免疫球蛋白的大量合适宿主细胞系， 包括 CHO 细胞系、 多种 Cos 细胞 系、 HeLa 细胞、 骨髓瘤细胞系、 转化的 B 细胞和杂交瘤。一般在例如 Winnacker， FROM GENES TO CLONES， VCH Publishers， N.Y.， N.Y.， 1987 中讨论了哺乳动物组织细胞培养物表达多 肽的用途。 用于哺乳动物宿主细胞的表达载体可包括表达控制序列， 如复制起点、 启动子和增强子 ( 参阅例如， Queen 等， Immunol.Rev.89 ： 49-68， 1986)、 和必要的加工信息位点， 如 核糖体结合位点、 RNA 剪接位点、 多腺苷酸化位点和转录终止子序列。这些表达载体一般含 有来自哺乳动物基因或来自哺乳动物病毒的启动子。合适的启动子可以是组成型的、 细胞 类型特异的、 阶段特异的、 和 / 或可调整的或可调节的。有用的启动子包括， 但不限于金属 硫蛋白启动子、 组成型腺病毒主要晚期启动子、 地塞米松诱导型 MMTV 启动子、 SV40 启动子、 MRP polIII 启动子、 组成型 MPSV 启动子、 四环素诱导型 CMV 启动子 ( 如人立即早期 CMV 启 动子 )、 组成型 CMV 启动子和本领域已知的启动子 - 增强子组合。
     用于引入含有目的多核苷酸序列的表达载体的方法根据细胞宿主的类型变化。 例 如， 氯化钙转染通常用于原核细胞， 而磷酸钙处理或电穿孔可用于其它细胞宿主。( 一般参 阅 Sambrook， 等， 上文 )。其它方法包括， 例如电穿孔、 磷酸钙处理、 脂质体介导的转化、 注射 和显微注射、 生物射弹方法、 病毒体、 免疫脂质体、 聚阳离子 ： 核酸缀合物、 裸 DNA、 人工病毒 体、 与疱疹病毒结构蛋白 VP22 的融合物 (Elliot 和 O′ Hare， Cell 88 ： 223， 1997)、 DNA 的 试剂增强的吸收和离体转导。对于重组蛋白质的长期、 高产量生产， 通常想要稳定表达。例 如， 可使用含有病毒复制起点或内源表达元件和选择标记基因的本发明的表达载体制备稳 定表达 C3b 结合抗体链或结合片段的细胞系。引入载体后， 可以允许细胞在富集培养基中 生长 1-2 天后转换到选择性培养基。选择标记的目的是赋予选择抗性， 并且其存在允许成 功表达所引入序列的细胞在选择性培养基中生长。 使用对细胞类型合适的组织培养技术增 殖具有抗性的稳定转染的细胞。
     本发明单克隆抗体的产生
     可 通 过 多 种 技 术， 包 括 常 规 单 克 隆 抗 体 方 法， 例 如 Kohler 和 Milstein， 1975 Nature 256 ： 495 的标准体细胞杂交技术来产生单克隆抗体 (mAbs)。可使用产生单克隆抗 体的许多技术， 例如， 病毒转化或 B 淋巴细胞的致癌性转化。
     用于制备杂交瘤的动物系统是鼠类系统。小鼠中杂交瘤的产生是良好建立的程 序。分离免疫的脾细胞用于融合的免疫方案和技术为本领域所知。融合配偶体 ( 例如鼠类 骨髓瘤细胞 ) 和融合步骤也是已知的。
     可在如上文描述制备的鼠类单克隆抗体的序列基础上制备本发明的嵌合或人源 化抗体。 可使用标准分子生物学技术从目的鼠类杂交瘤中获得编码重链和轻链免疫球蛋白 的 DNA， 并进行改造以含有非鼠类 ( 例如， 人 ) 免疫球蛋白序列。 例如， 为了产生嵌合抗体， 可 使用本领域已知的方法将鼠类可变区连接到人恒定区 ( 参阅例如， Cabilly 等的美国专利 号 4,816,567)。为了产生人源化抗体， 可使用本领域已知的方法将鼠类 CDR 区插入人构架 中。 参阅例如， Winter 的美国专利号 5225539， 和 Queen 等的美国专利号 5530101 ； 5585089 ； 5693762 和 6180370。
     在某一实施方案中， 本发明抗体是人单克隆抗体。可使用携带人免疫系统的部分 而非小鼠系统的转基因或转染色体小鼠产生针对 C3b 的此类人单克隆抗体。这些转基因和 转染色体小鼠包括此处分别称为 HuMAb 小鼠和 KM 小鼠的小鼠， 并在此处统称为 “人 Ig 小 鼠” 。
     HuMAb 小鼠 (Medarex， Inc.) 含有编码未重排人重链 (μ 和 γ) 和 K 轻链免 疫球蛋白序列的人免疫球蛋白基因小基因座 (miniloci)， 以及失活内源 μ 和 K 链基因 座的靶向突变 ( 参阅例如， Lonberg， 等， 1994Nature368(6474) ： 856-859)。因此， 小鼠显示降低表达的小鼠 IgM 或 K， 并且响应免疫时， 引入的人重链和轻链转基因经历类别转 换和体细胞突变， 产生高亲和力人 IgGK 单克隆抗体 (Lonberg， N. 等， 1994 上文 ； 综述见 于 Lonberg， N.， 1994 Handbook of Experimental Pharmacology 113 ： 49-101 ； Lonberg， N. 和 Huszar， D.， 1995 Intern.Rev.Immunol.13 ： 65-93， 以及 Harding， F. 和 Lonberg， N.， 1995 Ann.N.Y.Acad.Sci.764 ： 536-546)。HuMAb 小鼠的制备和用途以及该小鼠携带的基因 组修饰进一步描述于 Taylor， L. 等， 1992Nucleic Acids Research 20 ： 6287-6295 ； Chen， J. 等， 1993 InternationalImmunology 5 ： 647-656 ； Tuaillon 等， 1993Proc.Natl.Acad. Sci.USA94 ： 3720-3724 ； Choi 等， 1993Nature Genetics 4 ： 117-123 ； Chen， J. 等， 1993EMBO J.12 ： 821-830 ； Tuaillon 等， 1994 J.Immunol.152 ： 2912-2920 ； Taylor ， L. 等， 1994 International Immunology 579-591 ； 和 Fishwild， D. 等， 1996 Nature Biotechnology 14 ： 845-851， 所有参考文献的内容以其整体明确引入作为参考。进一步参阅均为 Lonberg 和 Kay 的 美 国 专 利 号 5,545,806 ； 5,569,825 ； 5,625,126 ； 5,633,425 ； 5,789,650 ； 5,877,397 ； 5,661,016 ； 5,814,318 ； 5,874,299 和 5,770,429 Surani 等 的 美 国 专 利 号 5,545,807 ； 均为 Lonberg 和 Kay 的 PCT 公开号 WO 92103918、 WO 93/12227、 WO 94/25585、 WO97113852、 WO 98/24884 和 WO 99/45962 ； 和 Korman 等的 PCT 公开号 WO 01/14424。
     在另一实施方案中， 可使用在转基因和转染色体上携带人免疫球蛋白序列的小 鼠， 如携带人重链转基因和人轻链转染色体的小鼠产生本发明的人抗体。在 Ishida 等的 PCT 公开 WO 02/43478 中详细描述了此处称为 “KM 小鼠” 的这种小鼠。
     进一步， 表达人免疫球蛋白基因的备选转基因动物系统可在本领域中获得， 并可 用于产生本发明的 C3b 结合抗体。例如， 可使用称为 Xenomouse(Abgenix， Inc.) 的备选 转基因系统。在例如 Kucherlapati 等的美国专利号 5,939,598 ； 6,075,181 ； 6,114,598 ； 6,150,584 和 6,162,963 中描述了此类小鼠。
     此外， 表达人免疫球蛋白基因的备选转染色体动物系统可在本领域中获得， 并可 用于产生本发明的 C3b 结合抗体。例如， 可使用称为 “TC 小鼠” 的携带人重链转染色体和人 轻链转染色体的小鼠 ； 在 Tomizuka 等， 2000Proc.Natl.Acad.Sci.USA 97 ： 722-727 中描述 了这种小鼠。另外， 携带人重链和轻链转染色体的奶牛已经描述于本领域中 (Kuroiwa 等， 2002 NatureBiotechnology 20 ： 889-894)， 并可用于产生本发明的 C3b 结合抗体。
     也可使用噬菌体展示方法制备本发明的人单克隆抗体， 用于筛选人免疫球蛋白基 因文库。在本领域中建立或在下文实施例中描述了用于分离人抗体的此类噬菌体展示方 法。 参阅例如 ： Ladner 等的美国专利号 5,223,409 ； 5,403,484 ； 和 5,571,698 ； Dower 等的美 国专利号 5,427,908 和 5,580,717 ； McCafferty 等的美国专利号 5,969,108 和 6,172,197 ； 和 Griffiths 等的美国专利号 5,885,793 ； 6,521,404 ； 6,544,731 ； 6,555,313 ； 6,582,915 和 6,593,081。
     也可使用 SCID 小鼠制备本发明的人单克隆抗体， 在所述 SCID 小鼠中已经重建了 人免疫细胞， 使得在免疫后产生人抗体应答。例如在 Wilson 等的美国专利号 5,476,996 和 5,698,767 中描述了此类小鼠。
     构架或 Fc 改造
     本发明的改造抗体包括其中 VH 和 / 或 VL 内构架残基已经进行了修饰， 例如以改 善抗体性质的那些抗体。通常进行这些构架修饰以降低抗体的免疫原性。例如， 一种方法是将一个或更多构架残基 “回复突变” 成相应的种系序列。更特别地， 已经经历体细胞突变 的抗体含有不同于抗体来源种系序列的构架残基。 可通过比较抗体构架序列与抗体来源的 种系序列来鉴定此类残基。为了将构架区序列恢复成它们的种系构型， 例如通过定点诱变 可以将体细胞突变 “回复突变” 到种系序列中。此类 “回复突变的” 抗体也旨在包括在本发 明内。
     另一类型的构架修饰包括突变构架区， 或甚至一个或更多 CDR 区内的一个或更多 残基， 来去除 T 细胞表位， 由此降低抗体的潜在免疫原性。该方法也称为 “去免疫化” ， 并进 一步详细描述于 Carr 等的美国专利公开号 20030153043 中。
     除了在构架或 CDR 区内进行修饰外或作为备选， 可改造本发明的抗体以包括 Fc 区 内的修饰， 通常用来改变抗体的一种或更多功能性质， 如血清半衰期、 补体结合、 Fc 受体结 合， 和 / 或抗原依赖性细胞毒性。 另外， 可化学修饰 ( 例如， 一个或更多化学部分可附着到抗 体上 ) 或修饰本发明的抗体以改变其糖基化， 再次用于改变抗体的一种或更多功能性质。 在下文中进一步详细描述了这些实施方案中每一个实施方案。Fc 区中残基的编号是 Kabat 的 EU 指数的编号。
     在一个实施方案中， 修饰 CH1 的铰链区， 使得改变， 例如增加或减少铰链区中半胱 氨酸残基的数量。在 Bodmer 等的美国专利号 5,677,425 中进一步描述了该方法。改变 CH1 的铰链区中半胱氨酸残基的数量， 例如用来便于轻链和重链装配， 或提高或降低抗体的稳 定性。
     在另一实施方案中， 突变抗体的 Fc 铰链区， 以降低抗体的生物半衰期。更特别地， 向 Fc 铰链片段的 CH2-CH3 结构域界面区引入一个或更多氨基酸突变， 使得抗体相对于天然 的 Fc 铰链结构域 SpA 结合具有受损的葡萄球菌蛋白 A(SpA) 结合。在 Ward 等的美国专利 号 6,165,745 中进一步描述了该方法。
     在另一实施方案中， 修饰抗体以增加其生物半衰期。多种方法是可能的。例如， 可 引入一个或更多以下突变 ： T252L、 T254S、 T256F， 如 Ward 的美国专利号 6,277,375 中所述。 或者， 为了增加生物学半衰期， 可在 CH1 或 CL 区内改变抗体， 以含有取自 IgG 的 Fc 区的 CH2 结构域的两个环的挽救受体结合表位， 如 Presta 等的美国专利号 5,869,046 和 6,121,022 所述。
     在其它实施方案中， 通过用不同氨基酸残基替换至少一个氨基酸残基来改变 Fc 区域， 以改变抗体的效应功能。例如， 可用不同氨基酸残基替换一个或更多氨基酸， 使得所 述抗体对效应配体具有改变的亲和力， 但保留亲本抗体的抗原结合能力。对其亲和力改变 的效应配体可以是例如， Fc 受体或补体的 C1 组分。在 Winter 等的美国专利号 5,624,821 和 5,648,260 中进一步详细描述了该方法。
     在另一实施方案中， 可用不同氨基酸残基替换选自氨基酸残基的一个或更多氨 基酸， 使得抗体具有改变的 C1q 结合 / 或降低的或消除的补体依赖性细胞毒性 (CDC)。在 Idusogie 等的美国专利号 6,194,551 中进一步详细描述了该方法。
     在另一实施方案中， 改变一个或更多氨基酸残基， 由此改变抗体固定补体的能力。 在 Bodmer 等的 PCT 公开 WO 94/29351 中进一步详细描述了该方法。
     在再一实施方案中， 修饰 Fc 区以提高抗体介导抗体依赖性细胞毒性 (ADCC) 的 能力和 / 或通过修饰一个或更多氨基酸来增加抗体对 Fcγ 受体的亲和力。在 Presta 的PCT 公开 WO 00/42072 中进一步详细了描述该方法。此外， 已经在人 IgG1 上对 FcγRl、 FcγRII、 FcγRIII 和 FcRn 的结合位点进行作图， 并且已经描述了具有提高结合的变体 ( 参 阅 Shields， R.L. 等， 2001 J.Biol.Chen.276 ： 6591-6604)。
     在再一实施方案中， 修饰抗体的糖基化。例如， 可制备无糖基化抗体 ( 即， 所述抗 体缺少糖基化 )。可改变糖基化， 例如用来增加抗体对 “抗原” 的亲和力。可通过例如改变 抗体序列中一个或更多糖基化位点来完成此类糖类修饰。例如， 可进行一个或更多氨基酸 替换， 由此去除该位点上的糖基化， 所述氨基酸替换导致一个或更多可变区构架糖基化位 点的去除。这种无糖基化可增加抗体对抗原的亲和力。在 Co 等的美国专利号 5,714,350 和 6,350,861 中进一步详细了描述该方法。
     此外或备选地， 可以制备具有改变类型糖基化的抗体， 如具有减少量的岩藻糖残 基的低岩藻糖化抗体或具有增加的二等分 GlcNac 结构的抗体。已经显示此类改变的糖基 化模式提高抗体的 ADCC 能力。例如通过在具有改变的糖基化机器的宿主细胞中表达抗体 来完成此类糖类修饰。已经在本领域中描述了具有改变糖基化机器的细胞， 并且其可用作 宿主细胞， 在其中表达本发明重组抗体， 由此产生具有改变的糖基化的抗体。例如， Hang 等 的 EP 1,176,195 描述了具有功能破坏的 FUT8 基因的细胞系， 该基因编码岩藻糖转移酶， 使 得在这种细胞系中表达的抗体显示低岩藻糖化。Presta 的 PCT 公开 WO 03/035835 描述了 变体 CHO 细胞系 Lecl3 细胞， 其将岩藻糖附着到 Asn(297)- 连接的糖类上的能力降低， 也 导致在该宿主细胞中表达的抗体的低岩藻糖化 ( 也参阅 Shields， R.L. 等， 2002 J.Biol. Chem.277 ： 26733-26740)。 Umana 等的 PCT 公开 WO 99/54342 描述了经改造以表达糖蛋白修 饰糖基转移酶 ( 例如， β(1， 4)-N 乙酰葡糖氨基转移酶 III(GnTIII))， 使得在改造的细胞系 中表达的抗体显示增加的二等分 GlcNac 结构， 其导致抗体的 ADCC 活性提高 ( 也参阅 Umana 等， 1999 Nat.Biotech.17 ： 176-180)。
     改造改变的抗体的方法
     如上讨论， 此处显示的具有 VH 和 VL 序列或全长重链和轻链序列的 C3b 结合抗体 可用于通过修饰全长重链和 / 或轻链序列、 VH 和 / 或 VL 序列、 或附着到其上的恒定区产生 新的 C3b 结合抗体。因此， 在本发明的另一方面， 本发明 C3b 结合抗体的结构特征用于产生 结构上相关的 C3b 结合抗体， 其保留了本发明抗体的至少一种功能性质， 如结合人 C3b， 以 及抑制 C3b 的一种或更多功能性质 ( 例如， 在溶血测定中抑制红细胞溶解 )。
     例如， 本发明抗体的一个或更多 CDR 区或其突变可与已知的构架区和 / 或其它 CDRs 重组组合以产生本发明额外的重组改造的 C3b 结合抗体， 如上讨论。其它类型的修饰 包括在先前部分中描述的那些。用于改造方法的起始材料是此处提供的一个或更多 VH 和 / 或 VL 序列， 或其一个或更多 CDR 区。为了产生改造的抗体， 不必实际制备 ( 即， 表达为蛋 白质 ) 具有此处提供的一个或更多 VH 和 / 或 VL 序列， 或其一个或更多 CDR 区的抗体。而 是， 序列中包含的信息用作起始材料， 来产生来自初始序列的 “第二代” 序列， 然后制备所述 “第二代” 序列并将其表达为蛋白质。
     因此， 在另一实施方案中， 本发明提供用于制备 C3b 结合抗体 ； 改变重链可变区抗 体序列和 / 或轻链可变区抗体序列内的至少一个氨基酸残基来产生至少一个改变的抗体 序列 ； 并将所述改变的抗体序列表达为蛋白质的方法， 所述 C3b 结合抗体由以下组成 ： 具有 选自 SEQ ID NOs ： 1、 15、 29、 43、 57、 71、 85、 99、 113、 127、 141、 155、 169 和 183 的 CDR1 序列、 选自 SEQ ID NOs ： 2、 16、 30、 44、 58、 72、 86、 100、 114、 128、 142、 156、 170 和 184 序列， 和 / 或选自 SEQ ID NOs ： 3、 17、 31、 45、 59、 73、 87、 101、 115、 129、 143、 157、 171 和 185 的 CDR3 序列的重链 可变区抗体序列 ； 和具有选自 SEQ ID NOs ： 4、 18、 32、 46、 60、 74、 88、 102、 116、 130、 144、 158、 172 和 186 的 CDR1 序列、 选自 SEQ ID NOs ： SEQ ID NOs ： 5、 19、 33、 47、 61、 75、 89、 103、 117、 131、 145、 159、 173 和 187 的 CDR2 序列， 和 / 或选自 SEQ ID NOs ： 6、 20、 34、 48、 62、 76、 90、 104、 118、 132、 146、 160、 174 和 188 的 CDR3 序列的轻链可变区抗体序列。
     因此， 在另一实施方案中， 本发明提供用于制备经过优化以在哺乳动物细胞中表 达的 C3b 结合抗体 ； 改变全长重链抗体序列和 / 或全长轻链抗体序列内的至少一个氨基酸 残基来产生至少一个改变的抗体序列 ； 并将所述改变的抗体序列表达为蛋白质的方法， 所 述 C3b 结合抗体由以下组成 ： 具有选自 SEQ ID NOs ： 9、 23、 37、 51、 65、 79、 93、 107、 121、 135、 149、 163、 177 和 191 的序列的全长重链抗体序列 ； 和具有选自 SEQ ID NOs ： 10、 24、 38、 52、 66、 80、 94、 108、 122、 136、 150、 164、 178 和 192 的序列的全长轻链抗体序列。
     也 可 通 过 筛 选 抗 体 文 库 制 备 改 变 的 抗 体 序 列， 所述抗体文库具有如 US20050255552 中描述的固定的 CDR3 序列或最小基本结合决定簇以及 CDR1 和 CDR2 序列上 的多样性。可根据适合于从抗体文库中筛选抗体的任何筛选技术， 如噬菌体展示技术进行 筛选。
     标准分子生物学技术可用于制备和表达改变的抗体序列。 所述改变的抗体序列编 码的抗体是保留此处所述 C3b 结合抗体的一种、 一些或所有功能性质的抗体， 所述功能性 质包括， 但不限于与人和 / 或猕猴 C3b 的特异性结合 ； 和所述抗体在溶血测定中抑制红细胞 溶解。
     可使用本领域中可得的标准测定法， 如在实施例中阐明的那些测定法 ( 例如， ELISA) 评估经改变的抗体的功能性质。
     在本发明改造抗体的方法的某些实施方案中， 可沿全部或部分 C3b 结合抗体编码 序列随机或选择性引入突变， 并且可如此处描述的筛选所得的经修饰 C3b 结合抗体的结合 活性和 / 或其它功能性质。已经在本领域中描述了突变方法。例如， Short 的 PCT 公开 WO 02/092780 描述了使用饱和诱变、 合成连接装配或其组合用于产生并筛选抗体突变的方法。 或者， Lazar 等的 PCT 公开 WO 03/074679 描述了使用计算筛选方法来优化抗体理化性质的 方法。
     本发明抗体的表征
     可通过多种功能测定表征本发明的抗体。例如， 它们可通过它们在溶血测定中抑 制红细胞溶解的能力、 与 C3b 蛋白质 ( 例如， 人和 / 或猕猴 C3b) 的亲和力、 它们抑制 C3a 或 C5a 产生的能力、 它们抑制 C3b 沉积的能力、 表位装箱 (binning)、 它们对蛋白酶解的抗性、 及阻断补体级联的能力， 例如它们抑制 MAC 形成的能力来表征。
     多种方法可用于测定补体途径分子的存在和补体系统的激活 ( 参阅例如， 美国专 利号 6,087,120 ； 和 Newell 等， J Lab Clin Med， 100 ： 437-44， 1982)。例如， 可通过 (i) 测 定红细胞的补体介导的溶解 ( 溶血 ) 的抑制 ； (ii) 测定抑制 C3 或 C5 切割的能力 ； 和 (iii) 旁路途径介导的溶血的抑制来监测补体活性。
     两种最常用的技术是溶血测定 ( 参阅例如 Baatrup 等， Ann Rheum Dis， 51 ： 892-7， 1992) 和免疫学测定 ( 参阅例如 Auda 等， Rheumatol Int， 10 ： 185-9， 1990)。所述溶血技术测量经典或旁路途径中完整序列的功能能力。 免疫学技术测量特定补体组分或裂解产物的 蛋白质浓度。在本发明方法中可用于检测补体激活或测定补体组分活性的其它测定法包 括， 例如 T 细胞增殖测定 (Chain 等， J Immunol Methods， 99 ： 221-8， 1987) 和迟发型超敏反 应 (DTH) 测定 (Forstrom 等， 1983， Nature 303 ： 627-629 ； Halliday 等， 1982， Assessment of Immune Status by the Leukocyte Adherence Inhibition Test， Academic， New York 第 1-26 页 ； Koppi 等， 1982， Cell.Immunol.66 ： 394-406 ； 和美国专利号 5,843,449)。
     在溶血技术中， 所有的补体组分必须存在且具有功能。因此， 溶血技术可筛选功 能完整性和补体系统的不足 ( 参阅例如 Dijk 等， J ImmunolMethods 36 ： 29-39， 1980 ； Minh 等， Clin Lab Haematol.5 ： 23-341983 ； 和 Tanaka 等， J Immunol 86 ： 161-170， 1986)。为了 测定经典途径的功能能力， 用溶血素包被的羊红细胞 ( 针对绵羊红细胞的兔 IgG) 或用兔抗 鸡抗体致敏的鸡红细胞用作靶细胞 ( 致敏细胞 )。 这些 Ag-Ab 复合体激活了经典途径， 并当 所述组分有功能且以足够浓度存在时导致靶细胞的溶解。为了确定旁路途径的功能能力， 兔红细胞用作靶细胞 ( 参阅例如美国专利号 6,087,120)。
     为了测试抗体抑制 MAC( 膜攻击复合体 ) 形成的能力， 可进行 MAC 沉积测定。简言 之， 酵母多糖可用于激活旁路途径， 并且 IgM 可用于激活经典途径。用人血清预温育 Fabs， 并将其加到用酵母多糖或 IgM 包被的平板中。 可计算每一样品的 MAC 沉积相对于基线 (EDTA 处理的人血清 ) 和阳性对照 ( 人血清 ) 的百分比抑制。
     为了测试本发明抗体在替代途径中抑制补体蛋白 C3 的能力， 测定在酵母多糖上 沉积的 C3 分解产物 C3b 的产生。在下文实施例中详细描述了用于测定 C3b 沉积的特定方 法。
     可 通 过 例 如 使 用 特 异 性 抗 C5a 抗 体， 如 从 US Biologics 获 得 的 小 鼠 抗 人 C5a-des-Arg 抗体的 ELISA 测定法抗体抑制测定 C5 分解产物 C5a 的产生的能力。
     可通过直接标记目的抗体检测抗体结合 C3b 的能力， 或不标记抗体并使用本领域 中已知的多种夹层测定法间接检测结合。
     在一些实施方案中， 本发明的 C3b 结合抗体阻断或竞争参考 C3b 结合抗体与 C3b 多肽的结合。这些可以是上文描述的完全人 C3b 结合抗体。它们也可以是其它小鼠、 嵌合 或人源化 C3b 结合抗体， 其与参考抗体结合相同的表位。阻断或竞争参考抗体结合的能力 表明测试中的 C3b 结合抗体结合参考抗体定义的相同或相似表位， 或与参考 C3b 结合抗体 结合的表位足够接近的表位。此类抗体尤其可能具有为参考抗体鉴定到的有利性质。可通 过例如竞争结合测定法来确定阻断参考抗体或与其竞争的能力。利用竞争结合测定法， 检 测测试中的抗体抑制参考抗体特异结合共同抗原， 如 C3b 多肽的能力。如果过量的测试抗 体基本抑制参考抗体的结合， 那么测试抗体与参考抗体竞争对抗原的特异性结合。基本抑 制表示测试抗体降低参考抗体的特异结合通常至少 10％、 25％、 50％、 75％或 90％。
     有许多已知的竞争结合测定法， 其可用于评估 C3b 结合抗体与参考 C3b 结合抗体 竞争结合 C3b 蛋白质。这些测定法包括， 例如固相直接或间接放射免疫测定 (RIA)、 固相 直接或间接酶免疫测定 (EIA)、 夹层竞争测定 ( 参阅 Stahli 等， Methods in Enzymology 9： 242-253， 1983) ； 固 相 直 接 生 物 素 - 亲 和 素 EIA( 参 阅 Kirkland 等， J.Immunol.137 ： 3614-3619， 1986) ； 固相直接标记测定、 固相直接标记夹层测定 ( 参阅 Harlow&Lane， 上文 ) ； 使 用 I-125 标 记 的 固 相 直 接 标 记 RIA( 参 阅 Morel 等， Molec.Immunol.25 ： 7-15， 1988) ；固相直接生物素 - 亲和素 EIA(Cheung 等， Virology 176 ： 546-552， 1990) ； 和直接标记的 RIA(Moldenhauer 等， Scand.J.Immunol.32 ： 77-82， 1990)。通常， 这种测定包括使用结合到 固体表面或细胞的纯化抗原， 所述固体表面或细胞携带未标记的测试 C3b 结合抗体和标记 的参考抗体中任何一种。 通过测定在测试抗体存在下结合到固体表面或细胞上的标记的量 来测定竞争抑制。所述测试抗体一般过量存在。通过竞争测定鉴定的抗体 ( 竞争抗体 ) 包 括与参考抗体结合相同表位的抗体和结合邻近表位的抗体， 所述临近表位与参考抗体结合 的表位足够接近以发生位阻。
     为了测定所选的 C3b 结合单克隆抗体是否结合唯一的表位， 可使用市售试剂 ( 例 如， 来自 Pierce， Rockford， IL 的试剂 ) 将每一抗体生物素化。 可使用 C3b 多肽包被的 ELISA 平板， 使用未标记单克隆抗体和生物素化单克隆抗体进行竞争研究。可利用链霉抗生物素 蛋白 - 亲和素 - 碱性磷酸酶探针检测生物素化的 MAb 结合。为了测定纯化的 C3b 结合抗体 的同种型， 可进行同种型 ELISA。例如， 可用 1μg/ml 抗人 IgG 在 4℃下过夜包被微量滴定 板的孔。用 1％ BSA 封闭后， 平板与 1μg/ml 或更少的单克隆 C3b 结合抗体或纯化的同种型 对照在室温下反应 1 到 2 小时。所述孔然后与人 IgGl 或人 IgM 特异性碱性磷酸酶缀合的 探针反应。然后将平板显影， 并对其进行分析， 以便测定纯化抗体的同种型。
     为了证明单克隆 C3b 结合抗体与表达 C3b 多肽的肝细胞的结合， 可使用流式细胞 术。简言之， 表达 C3b 的细胞系 ( 在标准生长条件下生长 ) 可与含 0.1％ BSA 和 10％胎牛 血清的 PBS 中多种浓度的 C3b 结合抗体混和， 并在 37℃下温育 1 小时。洗涤后， 细胞与萤光 素标记的抗人 IgG 抗体在与一级抗体染色相同的条件下反应。可通过 FACScan 仪器使用光 和侧向散射性质门控单个细胞来分析样品。 ( 除了或者替代 ) 流式细胞术测定外， 还可使用 利用荧光显微术的备选测定法。 可如上所述将细胞染色， 并通过荧光显微术检测所述细胞。 该方法允许显示单个细胞， 但根据抗原的密度具有降低的灵敏度。
     可通过蛋白质印迹进一步测试本发明的 C3b 结合抗体与 C3b 多肽或抗原片段的反 应性。 简言之， 可制备纯化的 C3b 多肽或融合蛋白质， 或来自表达 C3b 的细胞的细胞提取物， 并进行十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳。电泳后， 将分离的抗原转移到硝基纤维素膜 上， 用 10％胎牛血清封闭， 并用待测试的单克隆抗体探测。 可使用抗人 IgG 碱性磷酸酶检测 人 IgG 结合， 并用 BCIP/NBT 底物片剂 (Sigma Chem.Co.， St.Louis， MO) 显色。
     在下文实施例部分也描述了功能测定的实例。
     预防和治疗用途
     本发明提供了通过向需要治疗的受试者施用有效量的本发明抗体治疗与提高的 补体活性相关的疾病或病症的方法。在特定实施方案中， 本发明提供了通过向需要治疗的 受试者施用有效量的本发明抗体治疗年龄相关性黄斑变性 (AMD) 的方法。
     尤其可使用本发明的抗体来预防干性 AMD 向湿性 AMD 的发展、 减慢和 / 或防止地 图样萎缩的发展、 治疗或预防黄斑水肿、 和改善因干性 AMD 发展引起的视力丧失。其也可以 与抗 VEGF 治疗组合使用来治疗湿性 AMD 患者。
     在一些实施方案中， 本发明提供通过向需要治疗的受试者施用有效量的本发明抗 体治疗补体相关疾病或病症的方法。 已知补体相关疾病或病症的实例包括 ： 神经障碍、 多发 性硬化、 中风、 吉 - 巴综合征、 外伤性脑损伤、 帕金森病、 不恰当或不想要补体激活的疾病、 血液透析并发症、 超急性同种异体移植物排斥、 异种移植物排斥、 IL-2 治疗过程中白细胞介素 2 诱导的毒性、 炎性疾病、 自身免疫病炎症、 克隆病、 成人呼吸道窘迫综合征、 包括烧伤或 冻伤的热伤、 局部缺血后再灌注状况、 心肌梗塞、 气囊血管成形术、 心肺转流术或肾脏转流 术中的泵后综合征、 血液透析、 肾缺血、 表面重建后肠系膜动脉再灌注、 传染病或脓毒、 免疫 复合物病症和自身免疫性疾病、 类风湿性关节炎、 系统性红斑狼疮 (SLE)、 SLE 肾炎、 增殖性 肾炎、 溶血性贫血、 和重症肌无力。 此外， 其它已知补体相关疾病是肺部疾病和病症， 如呼吸 困难、 咯血、 ARDS、 哮喘、 慢性阻塞性肺疾病 (COPD)、 肺气肿、 肺栓塞和梗塞、 肺炎、 致纤维化 粉尘疾病、 惰性粉尘和矿物质 ( 例如， 硅、 煤炭粉末、 铍和石棉 )、 肺纤维化、 有机粉尘疾病、 化学损伤 ( 因刺激性气体和化学物质， 例如氯、 光气、 二氧化硫、 硫化氢、 二氧化氮、 铵和盐 酸 )、 烟雾损伤、 热损伤 ( 例如， 烧伤、 冻伤 )、 哮喘、 变态反应、 支气管收缩、 超敏感性肺炎、 寄 生虫病、 肺出血肾炎综合征、 肺血管炎和免疫复合物相关的炎症。
     在特定实施方案中， 本发明提供通过向需要治疗的受试者施用有效量的本发明抗 体治疗补体相关疾病或病症的方法， 其中所述疾病或病症是哮喘、 关节炎 ( 例如， 类风湿性 关节炎 )、 自身免疫性心脏病、 多发性硬化、 炎性肠病、 缺血 - 再灌注损伤、 巴 - 西综合征、 血 液透析、 系统性红斑狼疮、 红斑狼疮、 牛皮癣、 多发性硬化、 移植、 中枢神经系统疾病如阿尔 茨海默氏病和其它神经变性状况、 aHUS、 肾小球肾炎、 大疱性类天疱疮或 MPGNII。
     在特定实施方案中， 本发明提供通过向需要治疗的受试者施用有效量的包含本发 明抗体的组合物来治疗肾小球肾炎的方法。 肾小球肾炎的症状包括， 但不限于蛋白尿 ； 降低 的肾小球滤过率 (GFR) ； 血清电解质改变， 包括氮质血症 ( 尿毒症、 过度血尿氮 -BUN) 和盐 滞留， 致使水滞留， 导致高血压和水肿 ； 血尿和异常尿沉淀， 包括红细胞管型 ； 低白蛋白血 症； 高脂血症 ； 和脂肪尿。在特定实施方案中， 本发明提供通过向需要治疗的受试者施用有 效量的包含本发明抗体的组合物来治疗阵发性夜间血红蛋白尿 (PNH) 的方法。
     在特定实施方案中， 本发明提供通过向需要治疗的受试者施用有效量的包含本发 明抗体的组合物来减少与体外循环相关的免疫和止血系统功能异常的方法。 本发明的抗体 可用于任何方法中， 所述方法涉及使患者血管中血液循环穿过导管， 并回流到患者血管中， 所述导管具有网眼表面， 所述网眼表面包含能够引起补体激活、 血小板激活、 白细胞激活或 血小板 - 白细胞粘着至少一种的材料。此类方法包括， 但不限于所有形式的 ECC， 以及涉及 向患者血液循环中引入人工或外源器官、 组织或血管的方法。
     也可利用治疗与黄斑变性相关状况的已知方法， 如在美国专利号 6,218,368 中描 述的抗生素治疗向待用本发明治疗剂治疗的受试者施用其它治疗剂。在其它治疗中， 免疫 抑制剂如环孢菌素是能够抑制免疫应答的治疗剂。这些治疗剂包括细胞毒性药物、 皮质类 固醇、 非类固醇抗炎药物 (NSAIDs)、 特异的 T 淋巴细胞免疫抑制剂， 和抗体或其片段 ( 参阅 Physicians′ Desk Reference， 第 53 版， Medical Economics Company Inc.， Montvale， N.J.(1999))。通常以一周、 一个月、 三个月、 六个月或一年的间隔继续免疫抑制治疗。在一 些患者中， 在患者余生中施用治疗。
     当本发明的治疗剂与另一治疗剂一起施用时， 可以任何顺序连续施用或同时施用 两种治疗剂。在一些方面， 本发明的抗体向也接受第二种治疗剂 ( 例如维替泊芬 ) 治疗的 受试者施用。另一方面， 结合分子与外科治疗结合施用。
     与 C3b 结合抗体组合治疗的合适治疗剂包括本领域中已知的治疗剂， 其能够调节 补体组分的活性 ( 参阅例如， 美国专利号 5,808,109)。已经报道其它治疗剂降低补体介导的活性。此类治疗剂包括 ： 氨基酸 (Takada， Y. 等 Immunology 1978， 34， 509) ； 膦酸酯 (Becker， L.Biochem.Biophy.Acta 1967， 147， 289)、 聚阴离子物质 (Conrow， R.B. 等 J.Med. Chem.1980， 23， 242) ； 磺酰氟 (Hansch， C. ； Yoshimoto， M.J.Med.Chem.1974， 17， 1160， 和其 中引用的参考文献 ) ； 多核苷酸 (DeClercq， P.F. 等 Biochem.Biophys.Res.Commun.1975， 67， 255) ；海 松 酸 (Glovsky， M.M. 等 J.Immunol.1969， 102， 1) ；卟 吩 (Lapidus， M. 和 Tomasco， J.Immunopharmacol.1981， 3， 137) ； 一些抗炎药 (Burge， J.J. 等 J.Immunol.1978， 120， 1625) ； 酚 类 (Muller-Eberhard， H.J.1978， Molecular Basis of Biological DegradativeProcesses， Berlin， R.D. 等， 编辑 Academic Press， New York， 第 65 页 ) ； 和苄 脒类 (Vogt， W. 等 Immunology 1979， 36， 138)。这些治疗剂中的一些治疗剂通过一般性抑 制蛋白酶和酯酶起作用。其它治疗剂对补体途径中任何特定中间步骤并不是特异的， 但是 却抑制补体激活的一个以上的步骤。后面化合物的实例包括苄脒类， 其阻断 C1、 C4 和 C3b 的利用 ( 参阅例如 Vogt 等 Immunol.1979， 36， 138)。
     可抑制补体组分活性的本领域已知的额外治疗剂包括来自葡萄穗霉属 (Stachybotrys) 的真菌代谢物 K-76(Corey 等， J.Amer.Chem.Soc.104 ： 5551， 1982)。 已经显 示 K-76 和 K-76COOH 主要在 C3b 步抑制补体 (Hong 等， J.Immunol.122 ： 2418， 1979 ； Miyazaki 等， Microbiol.Immunol.24 ： 1091， 1980)， 并防止从正常人补体中产生趋化因子 (Bumpers 等， Lab.Clinc.Med.102 ： 421， 1983)。在高浓度的 K-76 或 K-76COOH 中， 显示了对 C2、 C3、 C6、 C7 和 C9 与其各自先前媒介物的反应的一定抑制。也已经报道了 K-76 或 K-76COOH 抑 制补体的 C3b 激活系统 (Hong 等， J.Immunol.127 ： 104-108， 1981)。用于实践本发明方法 的其它合适治疗剂包括灰黄霉素 (griseofulvin)(Weinberg， Principles of Medicinal Chemistry， 第 2 版， Foye， W.O.， 编辑， Lea&Febiger， Philadelphia， Pa.， 第 813 页， 1981)、 isopannarin(Djura 等， Aust.J.Chem.36 ： 1057， 1983) 和 Siphonodictyoncoralli-phagum 的代谢物 (Sullivan 等， Tetrahedron 37 ： 979， 1981)。
     组合治疗方案可以是累加的， 或其可以产生协同结果 ( 例如， 补体途径活性的减 少超出组合使用两种治疗剂的预期 )。 在一些实施方案中， 本发明提供使用本发明的 C3b 结 合抗体和抗血管发生剂， 如抗 VEGF 治疗剂来预防和 / 或治疗 AMD 或如上所述另一补体相关 疾病的组合治疗。
     诊断用途
     一方面， 本发明包括用于在生物学样品 ( 例如， 血液、 血清、 细胞、 组织 ) 的背景中 或遭受疾病或病症、 或处于发生与 AMD 相关病症的风险的个体中测定 C3b 蛋白质和 / 或核 酸表达以及 C3b 蛋白质功能的诊断测定法。
     诊断测定法， 如竞争性测定法依赖于标记的类似物 (“示踪物” ) 与测试样品分析 物竞争共同结合配偶体上有限数量的结合位点的能力。 结合配偶体一般在竞争前或竞争后 不溶解， 然后结合到结合配偶体上的示踪物和分析物与未结合的示踪物和分析物分离。通 过倾析 ( 其中结合配偶体预先不溶解 ) 或通过离心 ( 其中竞争反应后结合配偶体沉淀 ) 完 成该分离。 如通过标记物质的量测定， 测试样品分析物的量与结合的示踪物的量成反比。 制 备已知量的分析物的剂量反应曲线， 并与测试结果进行比较， 以定量测定测试样品中存在 的分析物的量。当酶用作检测标记时， 这些测定称为 ELISA 系统。在该形式的测定中， 抗体 与 C3b 结合抗体之间的竞争性结合导致结合的 C3b 蛋白质， 优选本发明的 C3b 表位成为血清样品中抗体的量度， 最特别的是中和血清样品中的抗体。
     测定的显著优势是直接对中和抗体 ( 即， 干扰与 C3b 蛋白质， 尤其是表位结合的那 些抗体 ) 进行测定。这种测定， 特别是 ELISA 测试形式在临床环境和常规血液筛查中具有 相当多的应用。
     免疫学技术使用针对多种补体组分 ( 例如 C3、 C4、 C5) 的不同表位的多克隆或单 克隆抗体来检测例如， 补体组分的裂解产物 ( 参阅例如， Hugli 等， Immunoassays Clinical Laboratory Techniques 443-460， 1980 ； Gorski 等， JImmunol Meth 47 ： 61-73， 1981 ； Linder 等， J Immunol Meth 47 ： 49-59， 1981 ；和 Burger 等， J Immunol 141 ： 553-558， 1988)。然后可测定抗体与所述裂解产物和已知浓度的标记裂解产物的竞争结合。可获得 多种测定， 如放射免疫测定、 ELISA′ s 和放射扩散测定来检测补体裂解产物。
     免疫学技术提供高灵敏度来检测补体激活， 因为它们允许测定来自患有或不患有 黄斑变性相关病症的测试受试者和对照受试者的血液中裂解产物的形成。因此， 在本发明 的一些实施方案中， 通过测试受试者的血浆中补体组分的可溶性裂解产物的定量来测定 异常补体激活以获得对眼病症相关病症的诊断。如在 Chenoweth 等， N Engl J Med 304 ： 497-502， 1981 ； 和 Bhakdi 等， Biochim Biophys Acta 737 ： 343-372， 1983 中描述进行测定。 优选地， 仅测定体内形成的补体激活。这可通过在含有补体系统的抑制剂的培养基中收集 来自受试者的生物学样品 ( 例如血清 )， 随后在所述样品中测定补体激活 ( 例如裂解产物的 定量 ) 来完成。
     在患有眼疾病或病症相关病症的患者的临床诊断或监测中， 补体蛋白质的检测与 来自正常受试者的相应生物学样品中的水平的比较表明患者患有与黄斑变性相关的病症。
     在 US2006/0067935 中描述了体内诊断或成像。简言之， 这些方法一般包括向患者 施用或引入诊断有效量的 C3b 结合分子， 其有效附着到通过非创性方法可检测的标记或标 签上。允许抗体 - 标记缀合物足够时间定位并结合眼睛内的补体蛋白质。然后将所述患者 暴露在检测设备下来鉴定可检测标记， 因此在患者眼睛中形成 C3b 结合分子的定位图像。 通过检测抗体 - 标记是否结合眼睛的组分来检测 C3b 结合抗体或其抗原结合片段的存在。 与未患有 AMD 疾病的正常个体相比， 所选补体蛋白质或蛋白质组合增加水平的检测表明与 黄斑变性相关的病症的倾向性和 / 或发作。也优选本发明的这些方面用于眼睛成像方法以 及组合的血管发生诊断和治疗方法。
     本发明还涉及预测医学领域， 其中诊断测定、 预后测定、 药物基因组学和监测临床 试验用于预后 ( 预测 ) 目的， 由此预防性治疗个体。
     本发明还提供用于测定个体是否具有发生与补体途径活性失调相关病症的风险 的预后 ( 或预测 ) 测定法。例如， 可测定生物学样品中 C3b 基因中的突变。此类测定法可 用于预后或预测目的， 由此在病症发作之前预防性治疗个体， 所述病症的特征在于 C3b 蛋 白质、 核酸表达或活性或与其相关。
     本发明的另一方面提供用于在个体中测定 C3b 核酸表达或 C3b 蛋白质活性的方 法， 由此为该个体选择适当的治疗剂或预防剂 ( 此处称为 “药物基因组学” )。药物基因组学 允许基于个体的基因型来选择治疗剂 ( 例如， 药物 ) 用于个体的治疗性或预防性治疗 ( 例 如， 检查个体的基因型以测定所述个体对特定治疗剂应答的能力 )。
     本发明的另一方面涉及在临床试验中监测治疗剂 ( 例如， 药物 ) 对 C3b 蛋白质的表达或活性的影响。
     药物组合物
     本发明提供包含与药学上可接受的载体一起配制的 C3b 结合抗体 ( 完整的或结合 片段 ) 的药物组合物。所述组合物可额外地含有适合于治疗或预防补体相关疾病 ( 例如 AMD) 的一种或更多其它治疗剂。药学上可接受的载体增强或稳定组合物， 或者可用于利于 组合物的制备。 药学上可接受的载体包括， 生理上相容的溶剂、 分散介质、 包衣、 抗细菌和抗 真菌剂、 等渗剂和吸收延迟剂等。
     可通过本领域已知的多种方法施用本发明的药物组合物。施用的途径和 / 或方式 根据想要的结果而变化。优选静脉、 肌内、 腹膜内、 或皮下施用、 或在靶位点附近施用。在特 定实施方案中， 配制本发明的抗体， 使得它们可经玻璃体内向眼睛施用。 药学上可接受的载 体应适合于静脉内、 肌内、 皮下、 肠胃外、 脊柱或表皮施用 ( 例如通过注射或输注 )。根据施 用途径， 可以材料包衣活性化合物， 即抗体， 双特异和多特异分子， 以保护所述化合物免于 酸和可能失活所述化合物的其它自然条件的作用。
     组合物应该是无菌且是流体的。 可使用包衣， 如卵磷脂， 在分散情况下维持需要的 颗粒大小并使用表面活性剂来维持适当的流动性。在许多情况下， 优选在组合物中包括等 渗剂， 例如， 糖、 多元醇如甘露醇或山梨醇、 和氯化钠。 可通过在组合物中引入延迟吸收的物 质 ( 例如单硬脂酸铝或明胶 ) 产生可注射组合物的长期吸收。
     可根据本领域所熟知的且常规实践的方法制备本发明的药物组合物。参阅例如， Remington ： The Science and Practice of Pharmacy， MackPublishing Co.， 第 20 版， 2000 ； 和 Sustained and Controlled Release DrugDelivery Systems， J.R.Robinson， 编 辑， Marcel Dekker， Inc.， New York， 1978。优选在 GMP 条件下制备药物组合物。通常， 在 本发明的药物组合物中使用治疗有效剂量或有效剂量的 C3b 结合抗体。通过本领域技术人 员已知的常规方法将 C3b 结合抗体配制成药学上可接受的剂量形式。调整剂量方案来提供 最想要的应答 ( 例如， 治疗应答 )。 例如， 可施用快速灌注， 可随时间施用若干分份剂量或根 据治疗情形的紧急性指示按比例减少或增加剂量。 以剂量单位形式配制肠胃外组合物尤其 利于容易施用和剂量的均一性。 此处所用的剂量单位形式指适合作为待治疗的受试者的单 一剂量的物理分离单位 ； 每一单位含有预定量的活性化合物， 其经计算以产生与需要的药 学载体相关的想要的治疗效果。
     可改变本发明药物组合物中活性成份的实际剂量水平， 以获得活性成份的量， 其 对特定患者、 组合物和施用方式有效实现想要的治疗应答， 而对所述患者无毒。 所选剂量水 平依赖于多种药物代谢动力学因素， 包括所用本发明具体组合物或其酯、 盐或酰胺的活性、 施用途径、 施用时间、 所用特定化合物的排泄速率、 治疗的持续时间、 与所用特定组合物组 合使用的其它药物、 化合物和 / 或物质、 年龄、 性别、 体重、 状况、 一般健康和待治疗患者的 先前医疗史等因素。
     医师或兽医可以比需要达到想要的治疗效果更低的水平开始施用药物组合物中 所用本发明抗体的剂量， 并逐渐增加剂量， 直至达到想要的效果。一般地， 用于治疗此处描 述的变应性炎性病症的本发明组合物的有效剂量根据许多不同因素而变化， 所述因素包括 施用手段、 靶位点、 患者的生理状态、 患者是人还是动物、 施用的其它药剂、 以及治疗是预防 性的还是治疗性的。 需要滴定治疗剂量以使安全性和效力达到最佳。 对于抗体的全身施用，剂量范围在约 0.0001 到 100mg/kg 宿主体重， 并更一般在 0.01 到 15mg/kg 宿主体重之间。 示例性治疗方案使得每两周一次或每月一次或每 3 到 6 个月一次进行全身施用。对于抗体 的玻璃体内施用， 剂量范围在约 0.0001 到约 10mg 之间。示例性治疗方案使得每两周一次 或每月一次或每 3 到 6 个月一次进行全身施用。
     一般在多种情况下施用抗体。单次剂量的间隔可以是每周一次、 每月一次或每年 一次。如通过测定患者中 C3b 结合抗体的血液水平指示， 间隔也可以是不规则的。在全身 施用的一些方法中， 调整剂量以达到 1-1000μg/ml 的血浆抗体浓度， 在一些方法中达到 25-500μg/ml。或者， 抗体可作为持续释放制剂施用， 在所述情况下需要更不频繁的施用。 剂量和频率根据抗体在患者体内的半衰期而变化。一般地， 人源化抗体比嵌合抗体和非人 抗体显示更长的半衰期。施用的剂量和频率可根据治疗是预防性的还是治疗性的而变化。 在预防性应用中， 在长时间段内以相对不频繁的间隔施用相对低的剂量。一些患者在其余 生继续接受治疗。 在治疗性应用中， 有时候需要在相对短间隔内相对高的剂量， 直至疾病的 发展减慢或终止， 并优选直至所述患者显示疾病症状部分或彻底改善。 此后， 可对患者施用 预防性方案。 实施例 提供以下实施例来进一步阐明本发明， 但不限制其范围。本发明的其它变型对本 领域的普通技术人员而言是显而易见的并包括在所附权利要求中。
     实施例 1 ： 抗原的产生和质量控制
     生物素化 C3b 的产生
     使用来自的 Pierce 标记试剂， 以 20 倍摩尔过量的生物素化试剂生物化纯化的 C3b。在室温下进行生物素化， 并使用 0.5ml Zeba Spin 脱盐柱分离未缀合的生物素。使用 EZ-Link NHS-LC-LC- 生物素标记 C3b 的赖氨酸残基， 并使用 EZ-Link Maleimide-PEG2- 生 物素标记半胱氨酸残基。使用 HABA 测定和 LC-MS/MS 定量生物素化的程度。通过 LC-MS/MS 验证参与 C3 上硫酯键形成的单个半胱氨酸的生物素化。
     结合琼脂糖珠子的 C3b 的产生
     使 用 来 自 Amersham Biosciences(17-0851-01) 的 PD-10 脱 盐 柱 将 纯 化 的 C3b(Quidel A413， lot 903726) 缓冲液交换成偶联缓冲液 (50mM Tris， 5mM EDTA-Na， pH 8.5)。SulfoLink 偶联凝胶 (Pierce 20401) 和所有其它试剂均平衡至室温。以 4 凝胶床 体积的偶联缓冲液平衡 SulfoLink 偶联凝胶， 并离心， 去除上清液。然后将缓冲液交换的 C3b 蛋白溶液加入到离心平衡的 SulfoLink 偶联凝胶 (SulfoLink Coupling Gel) 中。混 合物在室温下摇动 15 分钟， 然后在不混合的情况下保持静止 30 分钟。然后用 3 凝胶床体 积的偶联缓冲液洗涤缀合的 C3b 偶联凝胶。然后， 向 C3b 偶联凝胶中加入 1 凝胶床体积的 Quenching Reagent( 偶联缓冲液中 50mM L- 半胱氨酸 -HCL(44889))， 并在室温下保持摇动 15 分钟。15 分钟后， 缀合的 C3b 偶联凝胶在室温下不混合的情况下保持 30 分钟。用至少 6 凝胶床体积的洗涤溶液 (1M NaCl) 洗涤缀合的 C3b 偶联凝胶， 然后用 2 凝胶床体积的除气 StorageBuffer( 含有 0.05％叠氮化纳的磷酸盐缓冲盐水 ) 进行洗涤。最后的步骤是向凝 胶床体积中加入 1 凝胶床体积的 Storage Buffer 至估计 1mg/ml 的蛋白质。
     C3b-SulfoLink 偶联凝胶蛋白浓度测定
     以下量的 C3b 在还原条件下 4-12％变性蛋白质凝胶上运行 ： 2μg、 1.5μg、 1μg、 0.75μg、 0.5μg 和 0.25μg。在这些泳道后， 还将 2μl、 4μl 和 8μl 的 50 ％珠子悬浮液 (C3b 偶联凝胶 ) 在还原性条件下上样。 由于 α 链与珠子共价连接， 它在蛋白质凝胶上将不 会出现， 因此通过比较 β 链来测定蛋白质浓度。估计 1μl 的偶联凝胶有约 1μg 的 C3b， 因 此可获得大于 90％的偶联效率。
     计算在 SulfoLink 偶联凝胶上活性 C3b 百分比
     用在 4 种不同浓度 (0.122μM、 0.244μM、 0.367μM 和 0.489μM) 的因子 B、 固定 浓度的可溶性 C3b( 所有 4 种浓度均为 0.294μM) 和固定浓度的因子 D( 所有 4 种浓度均为 0.47μM) 设置四种对照。从这些对照反应中省略因子 P。反应在 37℃下温育 15 分钟。此 时将所有对照样品立即加入到 4X 的样品缓冲液中并放于 95℃ 10 分钟， 以稍后在 4-12％ Bis-Tris 蛋白质凝胶上电泳。 C3b 偶联的珠子浓度为每 1mg 柱床体积约 1mg C3b。 以下 7 个 反应由 0.294μM 固定浓度的偶联 C3b 的珠子、 2.68μM 固定浓度的因子 P 和 0.95μM 固定浓 度的因子 D 组成。因子 B 的浓度如下 ： 0.367μM、 0.489μM、 0.978μM、 1.467μM、 1.955μM、 2.933μM 和 3.910μM。对于这 7 个反应， 除因子 D 外均在 37℃下温育 30 分钟。经 30 分钟 温育后， 加入 0.95uM 的因子 D 并将反应温育 2 分钟。此时将所有样品立即加入到 4X 样品 缓冲液中并在还原性条件下在 4-12％ Bis-Tris 凝胶上电泳。 当分析数据时， 在所有泳道中 比较 Bb 条带。
     珠子 -C3b 稳定性
     在 C3b-SulfoLink 偶联凝胶缀合后， 将珠子离心并在 100％甘油 ( 使甘油终浓度为 50％ ) 中轻轻重悬浮。随后将珠子置于 -80℃进行几次冻融 ( 检测了高达 3 次 )。随后在冰 上解冻珠子并转移至 15ml 锥形管中。加入 5 柱体积的 1XPBS 来重悬浮珠子。将其在 850g 离心 5 分钟。完成用 10 柱体积的 1XPBS 进行的两次额外洗涤。最终步骤是用 1XPBS 重悬 浮珠子获得终浓度 50％的浆料溶液。每次冻融检测 Bb 产生 ： 与 3μM 因子 B、 0.5μM 因子 D、 1μM 的 C3b 珠子和 5mM 的 MgCl 温育 1 小时并寻找完全的 Bb 产生。除此之外， 在 -80℃ 储存几周后经 Bb 产生检测冰冻的珠子。
     Cyno C3 的纯化和 Cyno C3b 的产生
     Cyno 血浆购自 Alphagenesis(Yemassee， SC)。用 PBS、 10mM EDTA 和 2 份完全的混 和抑制剂片剂 (Roche) 将 50ml 血浆稀释到 200ml。缓慢将 40％的 PEG6000 加入到溶液中 至终浓度为 4％， 并在 4 度轻轻搅拌额外 30 分钟。通过在 17,500rpm 下离心 20 分钟去除沉 淀。再次将 PEG6000 加入到上清液中至终浓度为 12.5％并在 4 度搅拌 30 分钟。17,500rpm 下离心 20 分钟后去除上清液。在 50ml 1XPBS、 10mM EDTA 缓冲液中再次溶解沉淀， 并将含 C3 的溶液通过 15ml 的蛋白质 G(GE) 柱子两次以去除 CynoIgG。用 4L 20mM Tris pH 8.0、 10mM EDTA 对来自蛋白质 G 柱子的流出液透析过夜。同时， 用 0.5M NaOH 将 20ml MonoQ 柱 (GE) 清洗， 并随后用水和大量体积的 20mM Tris pH8.0 和 10mM EDTA 清洗直至柱基线清楚 且平衡。随后将透析的溶液装载至 ATKA 100(GE) 的 MonoQ 柱中， 流速为 0.8ml/ 分钟。装 载后， 用 10 柱体积的 20mM Tris pH 8.0 和 10mM EDTA 洗涤柱子或直至基线达到稳定。用 20 柱体积的从 0 至 500mM 的 NaCl 线性梯度将所述蛋白质从柱子上洗脱下来并以 4ml/ 管收 集级分。在非还原和还原性条件下经 SDS-PAGE 凝胶鉴定级分中的 C3 蛋白峰。进一步经蛋 白质印迹和 MS 肽谱分析验证 C3。随后将纯度为 85％的 C3 级分混合并用 PBS 缓冲液通过2660sephacryl 300 凝胶过滤柱 (GE) 进一步纯化。同样经 SDS-PAGE 和 MS 分析证实 C3 峰 级分。混合纯的级分并用 millipore 浓缩器浓缩至约 1mg/ml， 等份分装并保存在 -80 度冰 箱用于后续使用。
     在 PBS 缓冲液中将 Cyno C3 稀释至 500ug/ml。通过在 PBS 缓冲液中加入 0.4μM fB(Comptech)、 0.05μM fD(CompTech) 和 5mM MgCl2 将 C3 完全转化为 C3b， 并在室温温育 30 分钟。随后通过 2660sephacryl 300 凝胶过滤柱将所述 C3b 进一步纯化。混合含 C3b 的 峰组分， 其由 millipore 浓缩器浓缩。在 C3 转化酶测定中检测 cyno C3b 的活性。所述蛋 白质显示出与人 C3b(CompTech) 相当的 Bb 产生活性。
     通过补体因子和商品化抗体结合进行 C3b 试剂的质量控制
     酶联免疫吸附测定 (ELISA) 结合 ( 表位保守性 )
     在 ELISA 中比较生物素化的 C3b 分子和非生物素化的 C3b， 来评估由市售抗体识别 的 C3b 表位的保守性。
     用包被缓冲液 ( 碳酸氢盐 pH 9.5-9.8) 中 2μg/ml 的 100μl/ 孔市售抗 C3 或抗 C3b 抗体包被 Maxisorp 板， 并将其在 4℃温育过夜。用 PBST 洗涤 3 次后， 用 300μl/ 孔稀 释剂 (Synblock， AbD Serotec) 在室温下封闭所述板 2 小时。抽出封闭溶液后， 在稀释剂 中稀释的 100μl C3b(+/- 生物素 ) 样品在室温下温育 1 小时。加入在稀释剂 ( 多聚 HRP 稀释剂 ) 中 1 ∶ 5000 稀释的 100μl/ 孔 Strep-HRP( 聚 HRP 链霉抗生物素蛋白 ) 或 HRP 缀 合的抗 C3Ab 30 分钟。用 PBST 洗涤 4 次后， 加入 100μl/ 孔 TMB 底物 (Ultra TMB 底物溶 液 )5-10 分钟。 通过 50μl/ 孔的终止液 (2N H2SO4) 来终止反应。 读取吸光度 (A450-A570) 并使用 SoftMax Pro 分析数据。
     通过补体因子和商业化 Abs 的结合
     检测琼脂糖珠子上固定的 C3b 其结合商业化抗体和补体因子蛋白的能力。
     向各管中加入 4μl 的 C3b 珠子浆料 ( 对应于～ 1μg 的 C3b)。将珠子重悬浮于 100μl 稀释剂中。然后利用稀释剂 +Ab 或补体因子蛋白使管中的总体积达到 200μl。在 室温下摇动管 1 小时， 然后用稀释剂洗涤 1 次。向小柱中应用珠子浆料， 并再洗涤 2 次。快 速甩出剩余的液体 (1,200G， 1 分钟 )。塞紧柱子， 然后加入稀释剂中 500μl 的二级抗体或 抗补体因子 Ab(1 ∶ 5000)。在室温下温育 1 小时， 然后用稀释剂洗涤 4 次。[ 对于补体因 子， 利用二级 Ab 重复上述步骤 ]。快速甩出剩余的液体 (1,200G， 1 分钟 )。填充柱子， 然 后加入 100μl 的 TMB 底物。将液体快速甩入 (1,200G， 1 分钟 ) 新鲜管中。转移溶液到 96 孔板中。用 50μl/ 孔终止溶液 (2N H2SO4) 终止反应。读取吸光度 (A450-A570)， 并使用 SoftMax Pro 分析数据。
     实施例 2 ： 从 HuCAL 文库中产生 C3b 特异性抗体
     使用市售噬菌体展示文库 Morphosys HuCAL 文库作为抗体变体蛋白 质来源， 通过选择具有高结合亲和力的克隆产生抗 C3b 抗体。HuCAL 文库是 Fab 文库 (Knappik 等， 2000)， 其中所有六个 CDR 均因适当突变而变得多样化， 并且其使用 CysDisplay TM 技术将 Fab 连接到噬菌体表面 ( 例如见 WO01/05950)。
     HuCAL 噬菌体 - 抗体提供为 12 个单独的子库 ： VH1κ、 VH1λ、 VH2κ、 VH2λ、 VH3κ、 VH3λ、 VH4κ、 VH4λ、 VH5κ、 VH5λ、 VH6κ、 VH6λ。根据特定实验需要， 可以 任何组合混合 12 个子库。对于结合 C3b 的抗体的选择， 应用三种不同的淘选策略 ：a) 利用生物素化的人 C3b 的溶液淘选， 其中通过链霉抗生物素蛋白磁珠捕获噬菌 体 - 抗原复合体，
     b) 基于珠子的淘选， 其中 C3b 结合到琼脂糖珠子上， 和
     c) 差异肽淘选， 其中偶联到载体蛋白的肽上的选择循环与全长 C3b( 结合琼脂糖 珠子的生物素化 ) 上的选择循环交替进行。
     噬菌粒复苏、 噬菌体扩增和纯化
     在 含 有 34μg/ml 氯 霉 素 和 1 ％ 葡 萄 糖 的 2xYT 培 养 基 (2xYT-CG) 中 扩 增 HuCAL 文库。在用 OD600nm 为 0.5 的 VCSM13 辅助噬菌体感染后 (37℃下不摇动， 30 分钟 ； 37℃下 250rpm 摇动 30 分钟 )， 将细胞离心 (4120g ； 5 分钟 ； 4℃ )， 在 2xYT/34μg/ ml 氯霉素 /50μg/ml 卡那霉素 /0.25mM IPTG 中重悬浮， 并在 22℃下培养过夜。从上清液 中 PEG 沉淀噬菌体， 将其在 PBS/20％甘油中重悬浮并储存在 -80℃。 如下进行两个淘选循环 之间的噬菌体扩增 ： 用洗脱的噬菌体感染对数中期大肠杆菌 TG1 细胞并接种到补充有 1％ 葡萄糖和 34μg/ml 氯霉素的 LB 琼脂 (LB-CG 平板 ) 上。在 30℃下过夜温育后， 从琼脂平板 上刮去所述 TG1 菌落， 并将其用于接种 2xYT-CG， 直至达到 0.5 的 OD600nm。如上所述加入 VCSM13 辅助噬菌体用于感染。
     溶液淘选
     用于该淘选策略中的抗原是生物素化的 C3b。存在生物素化 C3b 的两种不同生物 素化的变体。 在一种变体中， 生物素通过附着到 C3b 上半胱氨酸残基的马来酰亚胺 -PEG- 接 头连接 C3b。该变体在下文中称为 C3b- 半胱氨酸 - 生物素。在另一变体中， 生物素通过附 着到 C3b 上的 3 个不同赖氨酸残基的磺基 -NHS-LCLC- 接头连接 C3b。该变体在下文中称为 C3b- 赖氨酸 - 生物素。在选择循环中交替进行两种不同变体上的选择， 以不选择结合接头 分子的噬菌体。
     用 PBS 洗 涤 链 霉 抗 生 物 素 蛋 白 磁 珠 (Dynabeads M-280 ； Dynal) 一 次， 并用 Chemiblocker 在室温下封闭 2 小时。还在旋转器上利用 Chemiblocker 在室温下封闭 PBS 洗脱的噬菌体 1-2 小时。封闭的噬菌体针对封闭的链霉抗生物素蛋白磁珠预吸附两次 30 分钟。将噬菌体上清液转移到新封闭的 2ml 反应管中， 加入人生物素化的 C3b， 并将混合物 在室温下旋转器上温育 1-2 小时。向各淘选库中加入 100μl 封闭的链霉抗生物素蛋白磁 珠， 并在旋转器上温育 20 分钟。用颗粒分离器 (Dynal MPC-E) 收集珠子大概 2.5 分钟， 并 小心地去除溶液。
     然后使用旋转器在 PBST 中洗涤珠子 7 次， 随后用 PBS 再洗涤 3 次。向各管中加 入 10mM Tris/HCl pH 8 中的 200μl 20mM DTT 从 Dynabeads 上洗脱噬菌体， 并温育 10 分 钟。通过磁性颗粒分离器去除 Dynabeads， 并向生长至 OD600nm 为 0.6-0.8 的 14ml 大肠杆 菌 TG-1 培养物中加入上清液。为了噬菌体感染， 在 37℃下 50ml 塑料管中不摇动情况下温 育所述培养物 45 分钟。4120xg 离心 5 分钟后， 细菌沉淀物各自在 800μl 2xYT 培养基中重 悬浮， 接种到 3xYT-CG 琼脂平板上， 并在 37℃下温育过夜。从所述平板上刮去菌落， 如上所 述复苏噬菌体并进行扩增。以与第一轮选择相同的方式进行第二轮和第三轮选择。
     为了选择 C3b 特异性噬菌体， 在多个子库中应用利用 C3 蛋白质的几种不同封闭方 法。一般地， 当用 Chemiblocker 封闭噬菌体时， 加入纯化的 C3 或含有 C3 的血清， 并在旋转 器上温育 1-2 小时。因此， 当与 C3b 接触时， 可能的 C3b/C3 交叉反应性噬菌体应该已结合到抗原上并应仅选择 C3b 特异性噬菌体。对于淘选 1812.1， 以 10 倍摩尔过量加入纯化的 C3( 仅在第一轮过程中 )。对淘选 1889 的子库 1-6 不应用封闭。对于子库 7-12， 在所有三 轮选择中应用使用人血清的多种封闭条件。对于子库 7 和 8， 加入未稀释的人血清， 产生超 过 C3b 大约 70 倍摩尔过量的 C3。因为我们担心血清因子可能降解 C3b， 所以加入蛋白酶抑 制剂 (Pefabloc SC， Roche， 终浓度 4mM)。对于子库 9-12， 加入稀释的人血清， 产生超过 C3b 大约 2 倍摩尔过量的 C3。子库 9 和 10 含有蛋白质抑制剂， 对于库 11 和 12 不加入抑制剂。
     基于珠子的淘选
     用于基于珠子淘选的抗原是偶联 sulfolink 琼脂糖珠子的 C3b。通过 MorphoSys 利用半胱氨酸 ( 来自 SulfoLink Immobilization Trial Kit) 处理琼脂糖珠子 (SulfoLink Coupling Gel) 产生用于将噬菌体预吸附到封闭的柱子上的珠子， 所述半胱氨酸封闭珠子 上所有可能的结合位点。
     在旋转器上室温下， 用 Chemiblocker 封闭 PBS 稀释的噬菌体 1-2 小时。封闭的噬 菌体预吸附封闭的琼脂糖珠子两次， 30 分钟。将噬菌体上清液转移到新的封闭的 2ml 反应 管中， 加入偶联人 C3b 的琼脂糖珠子， 并在旋转器上室温下温育混合物 1-2 小时。通过在台 式离心机中离心 (1000g， 1 分钟 ) 收集琼脂糖珠子， 并去除上清液。通过在 1ml 洗涤缓冲液 中温和重悬浮、 在洗涤缓冲液中温育并通过离心收集来反复洗涤沉淀物。
     通过向各管中加入 10mM Tris/HCl pH 8 中的 200μl 20mM DTT， 并温育 10 分钟从 琼脂糖珠子上洗脱噬菌体。通过离心沉淀珠子， 并向生长至 OD600nm 为 0.6-0.8 的 14ml 大 肠杆菌 TG-1 培养物中加入上清液。为了噬菌体感染， 在 37℃下 50ml 塑料管中不摇动情况 下温育所述培养物 45 分钟。4120xg 下离心 5 分钟后， 细菌沉淀物各自在 800μl 2xYT 培养 基中重悬浮， 接种到 3xYT-CG 琼脂平板上， 并在 37℃下温育过夜。从平板上刮去菌落， 如此 处所述复苏噬菌体并进行扩增。以与第一轮选择相同的方式进行第二和第三轮选择。
     琼脂糖珠子的沉淀物难以看得见， 并且容易溶解在上清液中。因此， 决定使用至 少 25μl 珠子， 以能够看得见沉淀物。这导致相对高的抗原浓度， 其对于第一轮对于所有子 库是不同的， 因为使用了不同的体积。第一轮子库中 C3b 的浓度大约如下 ： 子库 1820.1 中 为 189nM、 子库 1820.2 中为 128nM、 子库 1820.3 中为 257nM、 子库 1820.4 中为 98nM、 子库 1820.5 和 1820.6 中为 66nM。在第二轮选择中， C3b 浓度是， 子库 1820.1-3 中为 112nM， 子 库 1820.4-6 中为 57nM。在第三轮选择中， C3b 的浓度在所有子库中为 57nM。
     通过加入纯化的 C3 至大约 475nM 的终浓度将利用 C3 的封闭应用到子库 1820.4-6 的第一轮选择中。
     差异肽淘选
     用于差异肽淘选的抗原是代表 C3b 上不同表位的肽。这些肽在蛋白质结构分析中 已经鉴定为 C3b 特异的， 所述分析比较 C3b 相比于 C3 上表面暴露的残基。通过上文描述的 MorphoSys 进行与两种不同载体蛋白 BSA 和转铁蛋白的偶联。在选择循环中必须交替两种 不同的载体蛋白， 以不选择结合载体蛋白的噬菌体。此外， 在肽上的选择循环与在全长 C3b 上的选择循环交替进行， 以保证所选的噬菌体结合到正确折叠的全长 C3b 上。
     肽淘选中的实际淘选步骤是使用肽偶联载体蛋白作为结合 Maxisorp 平板的抗原 的固相淘选。用 PBS 中浓度为 50μg/ml 的偶联肽的 300μl 载体蛋白包被 Maxisorp 平板 (F96 Nunc-Immunoplate) 一定数量的孔 ( 取决于预封闭噬菌体的体积 )。密封平板并在4℃温育过夜。
     用 400μl PBS 洗 涤 包 被 的 孔 两 次， 并 在 微 量 滴 定 板 摇 床 上 室 温 下 用 350μl PBS/5％奶粉封闭 2 小时。在旋转器上室温下用 PBST/5％奶粉和终浓度为 0.5％ (v/v) 的 未偶联载体蛋白封闭噬菌体 2 小时。在封闭程序后用 400μl PBS 洗涤包被的孔两次。向 各包被孔中加入 300μl 预封闭的噬菌体， 并在摇床上室温下温育 2 小时。通过加入七次 400μl PBST 进行洗涤， 然后用 PBS 洗涤七次 ( 细节见表 8 和 10)。
     以每孔 10mM Tris/HCl pH8 中的 300μl 20mM DTT 从平板上洗脱噬菌体 10 分钟。 向在 37℃下 2YT 培养基中生长至 OD600 为 0.6-0.8 的 14ml 大肠杆菌 TG-1 中加入 DTT 噬菌 体洗脱液， 并为了噬菌体感染， 在 37℃下 50ml 塑料管中不摇动情况下温育 45 分钟。 4120xg 离心 5 分钟后， 细菌沉淀物各自在 600μl 2xYT 培养基中重悬浮， 接种到 3xYT-CG 琼脂平板 上， 并在 37℃下温育过夜。从所述平板上刮去菌落， 如此处所述复苏噬菌体并进行扩增。
     对于淘选 1849， 第一轮和第三轮选择是如上所述进行的肽淘选。第二轮是如此处 所述在结合琼脂糖珠子的 C3b 上的选择， 稍微做了以下修改 ： 已经使用奶粉而非半胱氨酸 封闭了用于噬菌体预吸附的琼脂糖珠子上的结合位点， 还如上所述在 PBST/5％奶粉中预封 闭所述噬菌体。对于淘选 1883， 第一轮和第三轮选择是使用如此处所述进行的生物素化 C3b 的溶液淘选。第二轮是如上所述的肽淘选 ( 该部分 )。
     淘选结果
     三轮淘选后选择的克隆已经亚克隆到表达载体中， 然后筛选与用于选择中的 C3b 或肽的结合。认为显示高于背景水平至少 2 倍的结合信号的克隆为初级命中。
     第一轮溶液淘选 1812 的输出是筛选在 Neutravidin 平板上与生物素化的 C3b 的 结合， 产生 531 个初级命中。以 C3b 筛选鉴定的 78 个克隆平行进行在生物素化的 C3 上的 筛选， 其在 C3b 上比在 C3 上显示更强的信号。78 个克隆的序列分析揭示了 27 条独特序列， 其中 19 条是结合并纯化的。仅小比例的这些克隆在捕获 ELISA 中显示与 cyno C3b 的交叉 反应性。鉴定 cyno 交叉反应性 C3bneo 抗体为本发明抗体的期望性状， 并特异选择 C3bneo 结合子的 cyno 交叉反应性。从 Cyno 猴血浆中纯化 Cyno C3b 蛋白， 并且在筛选过程中纯的 cyno C3b 作为抗原与人 C3b 一起使用。猕猴是极好的非人灵长类安全 / 毒性物种。期望 C3bneo 抗体与 cyno 的潜力和亲和力在人的 5-10 倍以内。选择该标准， 以实现对 cyno 中 C3b 浓度的显著抑制， 因此允许评估显著抑制 C3b 浓度引起的可能毒性。在筛选期， 因为没 有或有弱 cyno 交叉反应性， 必须丢弃许多克隆。为了鉴定更多的 cyno 交叉反应性克隆， 进 行淘选 1812 的再筛选。为了再筛选， 选择 178 个克隆， 其已经在 Neutravidin 平板上显示 了与 C3b 的显著结合 ( 高于背景至少 5 倍 ) 并且之前并未测序过。178 个克隆中的 38 个显 示与 cyno C3b 的结合， 并进一步进行 C3 反筛 (counter screen)。38 个克隆中的 10 个进 行反筛， 产生纯化的 1 个新的独特克隆。
     使用巯基平板的 ELISA 用于筛选基于珠子的淘选 1820。79 个初级命中， 49 个在 C3b 上比在 C3 上显示更强的信号。将这些测序， 产生 13 条独特序列， 其中 7 条是结合且纯 化的。
     筛选来自不同肽淘选 1849 的微表达 Fabs 与用于各选择的肽的结合。偶联肽的载 体蛋白用作 ELISA 中的直接包被抗原。 鉴定了 2944 中的 566 个初级命中， 但仅 22 个初级命 中显示高于背景至少 5 倍的信号。这 22 个克隆和 32 个额外克隆 ( 其显示接近背景 5 倍的信号 ) 进一步进行筛选， 以检查与全长 C3b 的结合。54 个克隆中没有一个显示与全长 C3b 的结合。
     与先前的差异肽淘选相反， 在差异肽淘选 1883 中进行全长 C3b 上的两轮选择和肽 上的仅一轮选择。淘选 1883 的结果是在捕获 ELISA 中筛选与 C3b 的结合。4416 个克隆的 筛选产生了 497 个初级命中。已经显示高于背景至少 5 倍信号的 275 个初级命中进一步进 行反筛。将经过反筛的 183 个克隆测序， 产生 9 个独特克隆。7 个独特克隆是结合且纯化 的。
     第二轮溶液筛选 1889 的结果是在捕获 ELISA 中筛选与 C3b 的结合， 产生 4416 个初 级命中的 2878 个。大多数初级命中 (2469/2878) 显示高于背景至少 5 倍的结合信号。决 定挑选 396 个代表性克隆进行反筛， 其来自不同淘选子库并具有不同的信号强度。 396 个克 隆中的 158 个通过反筛， 并进行测序， 产生 14 条独特序列和最终 11 个纯化的 Fabs。为了 不丢失任何感兴趣的克隆， 检测对 C3b 具有高于背景至少 5 倍结合信号的剩余克隆与 cyno C3b 的结合， 所述剩余克隆 (2073/2469) 未曾进行反筛选。筛选所得的 129 个 cyno 交叉反 应性克隆对 C3b 相比于 C3 的特异性。25 个克隆显示优于 C3 结合的 C3b 选择性， 最后产生 4 条新的独特序列。4 个克隆中的 3 个是结合且纯化的。
     表位装箱 (Epitope bining)
     根据制造商说明， 使用试剂盒 (ECL Protein biotinylation Module， GE) 生物素 化纯化的 Fabs。通过使其流过 Zeba Desalt Spin Column(Pierce) 从未结合的生物素上 清洗生物素化的 Fab。检测与生物素化的 Fab 的人 C3b 的结合活性， 在捕获 ELISA( 此处所 述 ) 中直接与其未生物素化的前体 (progenitor) 比较。仅挑选其结合活性未受生物素化 影响的 Fabs 继续研究。
     通过竞争 ELISA 进行表位装箱。所用的捕获抗体是指向 C3b 蛋白质兔多克隆抗人 C3d Ab， Abcam 的抗体， 其是 C3b 的亚结构域。用在 PBS 中稀释到 2μg/ml 的捕获抗体填充 Maxisorp 平板的孔。密封平板并在 4℃下温育过夜。
     第二天， 通过加入 PBST/5％奶粉封闭平板上剩余的结合位点。平板在室温下温育 1 小时， 然后用 PBST 洗涤 2 次。以在 PBST/5％奶粉中稀释的终浓度为 2.5μg/ml 加入 C3b。 平板在室温下温育 1 小时， 然后用 PBST 洗涤 2 次。
     同时， 均在 PBS 中稀释的终浓度 2.5μg/ml 的 C3b、 生物素化的 Fab 和未生物素化 的 Fab( 高于生物素化的 Fab 100 倍摩尔过量 ) 加入到孔中。平板在室温下温育 1 小时， 然 后用 PBST 洗涤 2 次。
     为了检测生物素化的 Fabs， 加入 AP 缀合的链霉抗生素蛋白 (Zymed)， 平板在室温 下温育 1 小时， 然后用 TBST 洗涤 5 次。根据制造商的说明书使用荧光底物 AttoPhos。在 Tecan GENios Pro 平板读出器上测量荧光。
     通过如上所述的竞争 ELISA 进行表位装箱。向人 C3b 中加入生物素化的 Fab 和未 生物素化的 Fab(100 倍过量 ) 的混合物。检测生物素标记。阴性对照 Fab MOR03207 获得 的信号设置为 100％值。与 100％信号相比评定抑制。
     鉴定了 6 个表位组 ( 在下文表中进行了概述 )。组 B 和 C， 以及组 D 和 E 共有部分 重叠的表位。
     表2： 表位组的概述
     实施例 3. 亲和力成熟和优化
     产生亲和力成熟文库
     为了增加所选抗体片段的亲和力和生物活性， 使用三核苷酸定向诱变通过盒诱变 平行地优化 L-CDR3 和 H-CDR2 区 ( 等， 1994)， 而构架区保持不变。在克隆用于
     亲和力成熟之前， 所有亲本 Fab 片段从相应的表达载体 (108x9_MH) 经过 XbaI/CN 102459334 A说明书23_LHC 产生105/123 页EcoRI 转移到 CysDisplayTM 载体 个 BssHII 位点从 HuCAL 展示载体25_LHC 中。通过去除干扰文库克隆的一 25_LHC， 用于 H-CDR2 优化。
     为了优化亲本 Fabs 的 L-CDR3， 通过 BpiI/SphI 去除轻链 (405bp) 的 L-CDR3、 构架 4 和恒定区， 并用多样化 L-CDR3 与构架 4 和所述恒定域的所有组成成分替换。大约 1.5μg 的 Fab 载体片段与 3 到 5 倍摩尔过量的携带多样化 L-CDR3s 的插入片段连接。在第二个文 库组中， 使 H-CDR2(XhoI/BssHII) 多样化， 而连接构架区保持不变。为了监测克隆效率， 在 将多样化 H-CDR2 盒克隆之前用模拟物替换亲本 H-CDR2。
     在 4ml 大肠杆菌 TOP10F 细胞 (Invitrogen， Carlsbad， CA， USA) 中将文库的连接 混合物电穿孔， 产生 108 到 109 个独立克隆。该文库大小保证覆盖理论多样性。如此处所 述进行文库的扩增。对于质量控制， 随机挑取单个克隆并进行测序。
     制备噬菌体用于亲和力成熟淘选
     在 含 有 34μg/ml 氯 霉 素 和 1 ％ 葡 萄 糖 (2xYT-CG) 的 2xYT 培 养 基 中 扩 增 成熟文库。用 OD600nm 为 0.5 的 VCSM13 辅助噬菌体感染后 ( 在 37℃， 不摇动 30 分钟 ； 在 37℃， 250rpm 摇动 30 分钟 )， 收集细胞 (4120xg ； 5 分钟 ； 4℃ )， 在 2xYT/34μg/ ml 氯霉素 /50μg/ml 卡那霉素 /0.25mMIPTG 中重悬浮并在 22℃下培养过夜。从上清液中 PEG 沉淀噬菌体两次， 在 PBS 中重悬浮并如下所述用于成熟淘选。
     (a) 成熟淘选
     用于成熟中的选择方法是如上文所述的溶液淘选。 为了增加淘选的严格性并选择 提高的解离速率， 降低抗原浓度并应用延长的洗涤条件 ( 高达 24 小时 )。在 4℃下进行过 夜洗涤步骤， 所有其他洗涤步骤在室温下进行。
     选择亲和力成熟的候选物
     已经在多种测定中表征了来自初次淘选的 Fabs。 根据以下标准将它们分级并分组 成可能的成熟候选物 ：
     ●结合 C3b 相比于结合 C3 的选择性
     ●溶血测定中的潜力
     ● C3b 和 MAC 沉积测定中的潜力
     ●作用方式
     ●表位箱
     ●亲和力
     8 个一级抗体进行成熟， 其因此在下文中称为 “亲本” 抗体。
     亲本抗体 MOR08035、 8598 和 8599 属于初次淘选后发现的最大一组 Fabs。它们是 表位箱 D 的成员， 在功能测定中展示活性， 并抑制 C3 和 C5 转化酶。这些抗体强烈抑制因子 B 与 C3b 的结合， 抑制因子 H 结合的程度较低。
     亲本抗体 MOR08552 展示相同的特征， 只是其具有稍微不同的表位 ( 箱 C)。
     MOR08672 和 MOR08675 均属于表位箱 D。它们非常好地抑制因子 H 的结合， 但仅显 示对其它因子结合的弱抑制。它们可能通过与上文抗体不同的机制起作用。同样， 缺少其 它因子的竞争可以导致以较低亲和力实现相同潜力。这种论点尤其用于 MOR08675， 其显示 适当的潜力， 尽管与 C3b 的亲和力实际上是低的。MOR08555 是表位组 C 的成员， 其与 MOR08305 组具有相似的特征， 但不抑制 C5 转化酶。 MOR08653 属于表位箱 B， 其与箱 C 部分重叠。其在功能测定中的存在导致对所检 测的所有机制的抑制 ： 因子 P、 因子 B 和因子 H 的结合、 C3b 二聚体形成的抑制以及 C3 和 C5 转化酶的抑制。
     分别构建来自各亲本的成熟文库， 以能够在淘选库的组成中维持灵活性。在稍晚 时间点上编辑库。对于各亲本抗体， 根据抗体发挥的主要抑制机制定义靶 KD 值。在 2 个库 的各库中编辑 MOR08598 和 MOR08653， 还有 MOR08555 和 MOR08599。在每各库中， 抗体展示 对抗原的相似亲和力， 很好地表达， 具有相同的靶 KD， 并且不共有重叠表位。
     用于亲和力成熟的文库
     通过 LCDR3 和 HCDR2 盒的平行交换进行亲和力成熟。通过三核苷酸定向盒诱变
     优化 CDR 序列。将来自表达载体 25 中。
     x9_Fab_MH 的 Fab 片段克隆到噬菌粒载体通过标准克隆方法产生 16 个不同的亲和力成熟文库 ( 对于各亲本抗体， 一个 LCDR3 和一个 HCDR3 文库 ) 并将多样化的克隆转化到电感受态大肠杆菌 TOP10F ′细胞 (Invitrogen) 中。文库大小合适， 在 5x108-4x109 范围内。对随机挑取的克隆测序显示 100％的多样性。在挑取的克隆中没有发现亲本结合子。最后， 分别制备了所有 16 个文库 的噬菌体。
     用于亲和力成熟的淘选策略
     在选择过程中分别保存 HCDR2 和 LCDR3 文库。8 个亲本中的 4 个处理为前导 ； 其 余 4 个亲本在 2 个库中各自排列。从所产生的亲和力成熟文库中复苏的约 1012 个噬菌体 进行成熟淘选。
     使用生物素化的抗原进行使用各噬菌体库的溶液淘选， 在人和 cynoC3b 之间交 替。为了增加淘选严格性并选择提高的解离速率， 降低抗原浓度并应用延长的洗涤条件 ( 高达 24 小时 )。在上文中概述了淘选和洗涤条件。成熟淘选后， 将富集的噬菌粒库亚克 隆到
     x9_MH 表达载体中。亲和力筛选和成熟淘选结果
     从所有淘选中筛选了共 2464 个克隆作为在人 C3b 上具有提高亲和力的细菌裂解 物。通过溶液平衡滴定 (SET) 评估初步的亲和力。认为估计与其亲本克隆相比亲和力提高 的克隆是初级命中。 从各淘选子库中获得初级命中， 并对所有初级命中测序， 8305-LCDR3 文库除外， 其 中对 65 个初级命中最好的 17 个测序。在 261 个初级命中中鉴定了共 173 条独特序列。可 鉴定来自所有亲本 Fabs( 除了 MOR08598) 的衍生物。从亲本 MOR08552 和 MOR08599 中没有 鉴定到 HCDR2 成熟的衍生物。
     选择亲和力优化的 Fabs 用于蛋白质纯化
     将独特的初级命中挑取到微孔培养板中， 并用于微量表达 Fab。Fab 裂解物用于第 二轮筛选中， 在捕获 ELISA 中检测与人 C3b、 cyno C3b 的结合、 在捕获 ELISA 中检查与对抗 靶标 C3d 和 C5 的交叉反应性， 并进行反筛。通过筛选的克隆继续用于研究。目的是从各亲 本中大规模表达并纯化大约 12 种衍生物。在多于 12 种衍生物通过第二轮筛选的情况下，
     用于蛋白质纯化的选择基于序列变异性。以下段落详细描述了各淘选子库的选择方法。
     已经从亲本 MOR08305 中鉴定了在 HCDR2 中成熟的 23 个独特克隆， 和在 LCDR3 中成 熟的 11 个克隆。 21/23HCDR2 成熟的克隆通过了反筛， 并且 18/21 与人 C3b 很好地结合。 但仅 1/18 克隆与 cyno C3b 显示很好的结合。选择该克隆 (MOR09124) 用于大规模纯化。根据序 列变异性选择额外的 5 个克隆用于大规模纯化。纯化对 MOR09122 不起作用。3/11LCDR3 成 熟的克隆不经过反筛， 但 2/3 包括在大规模纯化中 (MOR09130 和 9131)， 因为它们在人 C3b 上的高结合信号暗示了低亲和力， 其反过来可导致在血清上的残余结合。纯化对 MOR09132 不起作用。
     已经从亲本 8552 中鉴定了 16 个 LCDR3 成熟的衍生物。根据上文描述的相似标准 选择 7/16 的衍生物用于大规模纯化。但对于它们全部， 纯化均失败了。因此， 所有剩余 9 种衍生物进行大规模纯化。纯化仅对 2/9(MOR09308 和 9313) 起作用。
     已经从亲本 MOR08555 中鉴定到了在 HCDR2 中成熟的 1 个独特克隆， 和在 LCDR3 中 成熟的 3 个独特克隆。因为总共仅有 4 种衍生物， 决定全部纯化它们， 不管它们在第二轮筛 选中的行为。
     已经从亲本 MOR08599 中鉴定到了在 LCDR3 中成熟的 25 个独特克隆。它们中的大 多数在第二轮筛选过程中进行的所有测试中表现良好。 用于大规模纯化的克隆的选择基于 序列变异性。
     已经从亲本 MOR08653 中鉴定到了在 HCDR2 中成熟的 25 个独特克隆， 和在 LCDR3 中 成熟的 10 个独特克隆。各亚组中仅 1 个在反筛中表现良好。这些克隆 (MOR09198 和 9202) 继续用于研究。其它克隆的选择基于序列变异性。
     已经从亲本 MOR08672 中鉴定到了在 HCDR2 中成熟的 5 个独特克隆， 和在 LCDR3 中 成熟的 29 个独特克隆。仅 1/5HCDR2 成熟的克隆通过反筛， 并继续用于研究 (MOR09139)。 选择了 2 个额外的 HCDR2 成熟的克隆。纯化仅对 MOR09137 起作用。大多数 LCDR3 成熟的 克隆在第二轮筛选中表现良好。这些克隆的选择基于序列变异性。
     已经从亲本 MOR08675 中鉴定到了在 HCDR2 中成熟的 7 个独特克隆， 和在 LCDR3 中 成熟的 17 个独特克隆。1/7HCDR2 成熟的克隆显示仅与人和 cyno C3b 的弱结合， 并且被排 除在外。在剩余的 6 个克隆中， 仅 3 个不含有潜在的糖基化位点， 并进行大规模纯化。在选 择中包括含有潜在的糖基化位点的 2 个额外克隆。大多数 LCDR3 成熟的克隆在第二轮筛选 中表现良好。这些克隆的选择基于序列变异性。
     选择亲和力优化的 Fabs 继续研究
     考虑了先前部分中给出的所有可用数据， 包括未显示的与亲和力优化的 Fabs 的 表征相关的数据 ( 例如， 结合亲和力、 溶血的抑制、 C3b 沉积的抑制 ) 后， 选择最佳 Fabs 继续 研究。选择由 22 个成熟的 Fabs 组成， 其来自 4 种不同的亲本抗体。表 5 概述了所选 Fabs 的关键特征。
     表5： 被选择用于继续研究的 22 个成熟的 Fabs 的关键特征
     优化的 Fabs 的 IgG 转化以及在 IgG 水平上的杂交克隆
     将所有 8 个亲本 Fabs、 几个成熟的 Fabs 和具有期望谱的几个成熟修复 ( 去除潜在 糖基化位点的 )Fabs 亚克隆到人 IgG 形式中。
     通过用轻链和重链构建体的组合转染细胞完成 IgG 水平上的杂交克隆。因为 MOR09124 是鉴定到的唯一 HCDR2 成熟的克隆， 所以杂交克隆仅对各家族 (MOR08305 衍生 物 ) 是可能的， 其中 MOR09121 的重链与其它成熟家族成员的轻链组合。为杂交克隆给出了 新的 MOR 号， 其概述于表 8 中。
     表8： 杂交克隆抗体的 MOR 号。
     MOR0 9395 9396 9397 9398 9399 9400
     类型 杂交克隆 杂交克隆 杂交克隆 杂交克隆 杂交克隆 杂交克隆 MOR0 的重链 9124 9124 9124 9124 9124 9124 MOR0 的轻链 9128 9129 9130 9131 9255 9256在上述亲和力成熟的 Fabs、 修复的 Fabs( 去除糖基化位点的 )， 和杂交克隆的 Fabs 中， 根据此处描述的方法测定 Fabs 9124、 9397、 9398、 9136、 9141、 9373 和 9423 的结合特征。表 9 概述了这些 Fabs 的结合亲和力、 功能潜能和补体因子结合的抑制。
     在下文详细描述了用于测定在表 8 中概述的 Fabs 的结合亲和力和功能性质的方法。如从表 8 中的数据可以看出， 本发明的 Fab 片段能够以低于或等于 100pM， 在许多情况 下以低于或等于 10pM 的亲和力结合人和猕猴 C3b。此外， Fab 片段以低于或等于 100nM， 在 大多数情况下低于或等于 50nM 的 IC50 显示对人和猕猴 C3b 的功能潜能。
     实施例 4IgG 形式的 C3b 结合子的产生和表征
     IgGs 的种系化
     通过 Geneart(Geneart AG， Regensburg， Germany) 将编码轻链和重链的免疫球蛋 白可变区的 pM2 表达载体中的区域种系化并进行优化， 以匹配种系化序列， 避免不适合在 哺乳动物细胞中表达的密码子， 并避免隐藏的剪接位点。 将所有重链的 N 末端 QVQ 变成 EVQ， 因为末端 Q 可能形成 pyroglutamine。选择来自各亲本家族的抗体， 用于种系化 / 优化。简 言之， 如下在 IgG 形式中种系化并表达抗体。
     转化成 IgG
     为了表达全长免疫球蛋白， 将 Fab 重链 (VH) 和轻链 (VL) 的可变结构域片段从 Fab 表达载体亚克隆到 IgG1 表达载体中。限制酶 MfeI 和 BlpI 用于将 VH 结构域片段亚克隆到 2_h_IgG1AA 中， 其中 234 和 235 位上的亮氨酸突变成丙氨酸来消除 FcRγ 结 合并减弱效应功能。经 EcoRV 和 BsiWI 位点将 VL 结构域片段亚克隆至 Igκ 中， 而使用 EcoRV 和 HpaI 完成亚克隆到
     2_h_2_h_Igλ2 中。人 IgG 的瞬时表达和纯化
     用 1 ∶ 1 的比例的 IgG 重链和轻链表达载体 DNA 转染真核 HKB11 和 HEK293 细胞。 在转染后 3 天或 7 天收集细胞培养物上清液， 并进行标准的 A 蛋白亲和层析 (MabSelect SURE， GE Healthcare)。除非另有说明， 缓冲液交换成 1x Dulbcecco ′ s PBS(pH 7.2， Invitrogen) 并无菌过滤样品 (0.2μm)。 在 SDS-PAGE 中或通过使用 Agilent BioAnalyzer 分析变性的还原和非还原条件下的 IgG 的纯度， 并通过 HP-SEC 分析天然状态中 IgG 的纯 度。
     为种系化的抗体给出了新的 MOR 号， 如表 10 中所示。
     表 10 ： 种系化的抗体的 MOR 号。
     种系化抗体的 MOR0 9555 9556 9609 9610 9611 9612 祖先抗体的 MOR0 9140 9124 9136 9141 9397 9398114CN 102459334 A 9613 9674 9675
     说明书9314 9373 9423111/123 页当然， 进一步表征了种系化抗体 9556、 9611、 9612、 9609、 9610、 9674 和 9675。
     亲和力测定
     C3bneo 抗体通过结合 C3b 分子上的新表位阻断补体激活。C3b 上的新表位也是血 浆中其它丰富补体蛋白的结合位点， 例如因子 H、 因子 B 和因子 P， 其通过旁路途径调节补体 激活。C3bneo 抗体因此应该具有高的亲和力， 以与这些丰富补体蛋白竞争， 来通过阻断这 些补体蛋白结合 C3b 而有效阻断补体激活。高亲和力为实现低治疗剂量所需。例如， 血浆 中因子 H 的浓度在 3μM 左右， 因子 H 与 C3b 的结合亲和力 (Kd) 是～ 30nM ； 因子 H 浓度比 其 Kd 高 100 倍。当 C3bneo 抗体与因子 H 竞争结合 C3b 时， 其需要 10pM Kd C3bneo 抗体的 1nM 浓度 ( 高于其 Kd100 倍抗体浓度 ) 来抑制因子 H 结合 C3b 的 50％。等于或低于 10pM Kd C3bneo 抗体因此会以适当的治疗抗体剂量实现旁路途径补体激活的有效阻断。因此， 选择的本发明的抗体分子具有低于或等于 65pM， 优选低于或等于 10pM 范围的高结合亲和 力。例如， 选择本发明的抗体分子以对 C3b 具有 9、 8、 7、 6、 5、 4、 3 或 2pM 或更低的结合亲和 力 ( 即， 低于 2pM 的更高亲和力 )。
     如下通过 Biacore 和溶液平衡滴定 (SET) 测定种系化的 IgG 抗体结合 C3b 的亲和 力。
     Biacore 测定
     使用 CM5 传感器芯片 (GE Healthcare， BR-1005-30) 在 25℃下以 BIAcore T100(GE Healthcare) 完 成 Biacore 动 力 学 实 验。 运 行 缓 冲 液 是 HBS-EP(+)(GE Healthcare， BR-1001-88)。简言之， 进行以下步骤以测定结合亲和力。
     ●制备抗 C3d IgG 固定化的传感器芯片 ： 根据供应商的说明书 (GEHealthcare， BR-1000-50)， 通过使用氨基偶联方法， 以 10ul/ 分钟的流速在 CM5 芯片上将兔抗 C3d 多 克隆抗体 (Abcam， ab-15981)( 在乙酸盐 pH5.0 偶联缓冲液中 50ug/ml(GE Healthcare， BR-1003-51)) 偶联到两个不同的流动池 (Fc1 和 2) 上 600 秒。最终固定化的水平将＞ 7000RU。
     ●在第二个流动池上捕获 C3b ： 在第二个流动池上以 10ul/ 分钟注射运行缓冲液 中的 1ug/ml 的 C3b， 以对 Fab 而言达到～ 70RU 的捕获水平， 或对 IgG 动力学分析而言达到～ 20RU 的水平。
     ●在两个流动池上注射不同浓度的抗 C3b Fab 或 IgG ： 在两个流动池 (Fc1 和 2) 上 以 60ul/ 分钟注射抗 C3b 溶液 ( 在运行缓冲液中 0.3125nM ～ 10nM ； 1 ∶ 2 系列稀释 )240 秒。
     ●解离 ： 在两个流动池上以 60ul/ 分钟注射 HBS-EP(+) 运行缓冲液， 以监测 C3b 与 抗 C3b Fab/IgG 之间的解离。对于 5nM 和 2.5M Fab/IgG 浓度， 解离时间设置为 2400 秒， 而 对于包括另一 5nM Fab/IgG 浓度的所有其它浓度设置为 300 秒。
     ●再生 ： 在两个流动池上以甘氨酸 -HCl pH1.6( 从甘氨酸 -HCl pH1.5 和甘氨酸pH2.0， GE Healthcare 制备 )+0.05％ P20 表面活性剂 (GEHealthcare， BR-1000-54)， 60ul/ 分钟的流速在各循环结束时进行再生 40 秒， 两次。
     ●动力学分析 ： 以 BIAevaluation 1.1 软件通过应用 1 ∶ 1 结合模型获得动力学 速率常数， 其中局部拟合 Rmax 值。
     在下文表 11 中显示了 Biacore 结合动力学测定的结果。如所示， 此处所述的抗体 对人 C3b 显示高亲和力结合， KD 值通常低于或等于 10pM， 并在许多情况下低于或等于 5pM。 这些抗体对 cyno C3b 也显示非常高的亲和力 ( 低于 200pM 的结合亲和力 )。
     表 11
     SET 测定
     对于通过溶液平衡滴定 (SET) 对 KD 的测定， 使用抗体蛋白质的单体级分 ( 至少 90％的单体含量， 通过分析 SEC 分析 ； Superdex75(AmershamPharmacia) 用于 Fab 或 Tosoh G3000SWXL(Tosoh Bioscience) 用于 IgG)。
     基本如参考文献中所述进行溶液中的亲和力测定 (Friguet 等 305-19)。 为了提高 SET 方法的灵敏度和准确度， 从经典 ELISA 转换成基于 ECL 的技术 (Haenel 等， 2005)。 TM
     根据制造商的说明书利用 MSD Sulfo-TAG NHS-Ester(Meso ScaleDiscovery， Gaithersburg， MD， USA) 标记 1mg/ml 山羊抗人 (Fab)2 片段特异性抗体 (Dianova)。
     在聚丙烯微量滴定板中进行实验并以含有 0.5％ BSA 和 0.02％ Tween20 的 PBS pH 7.4 作为测定缓冲液。以比预期 KD 高至少 10 倍的浓度开始， 以 2n 系列稀释未标记的人 C3b 或 cyno C3b。没有抗原的孔用于测定 Bmax 值 ； 具有测定缓冲液的孔用作测定背景。加入 例如 10pM Fab(60μL 终体积中的终浓度 ) 后， 在室温下过夜温育混合物。所应用的 Fab 浓 度与预期 KD 相似或低于预期 KD。
     用 PBS 中 0.05μg/ml 人 C3b(30μL/ 孔 ) 过夜包被标准 MSD 平板， 并用 PBS 中的 3％ BSA 封闭 1 小时。用测定缓冲液洗涤平板后， 将平衡的样品转移到那些平板中 ( 每孔 30μL) 并温育 20 分钟。洗涤后， 向 MSD 平板中加入 30μL/ 孔最终稀释 1 ∶ 1500 的 MSD 磺
     基 - 标签标记的检测抗体 ( 山羊抗人 (Fab)2)， 并在室温下 Eppendorf 摇床上 (700rpm) 温 育 30 分钟。
     洗涤平板并加入含表面活性剂的 30μL/ 孔 MSD Read 缓冲液 T 后， 使用 Sector 成 像仪 6000(Meso Scale Discovery， Gaithersburg， MD， USA) 检测电化学发光信号。
     用 XLfit(IDBS) 软件， 应用定制的拟合模型评估数据。对于 Fab 分子的 KD 测定， 使用以下拟合模型 ( 根据 Haenel 等， 2005， 根据 Abraham 等改进 ) ：
     [Fab]t ： 应用的总 Fab 浓度
     X： 应用的总可溶性抗原浓度 ( 结合位点 )
     Bmax ： 没有抗原的 Fab 的最大信号
     KD ： 亲和力
     原则上， 应用相同的方案来测定 IgG 分子的 KD 值， 除以下不同 ： 向稀释系列的抗原 中加入完整 IgG 分子， 而不是 Fab 分子， 并且在室温下平衡过夜。随后， 如上所述处理样品。
     对于数据评估， 即 IgG 分子的 KD 测定， 使用 IgG 的以下拟合模型 ( 根据 Piehler 等， 1997 改进 ) ：
     [IgG] ： 应用的总 IgG 浓度
     x： 应用的总可溶性抗原浓度 ( 结合位点 )
     Bmax ： 没有抗原的 IgG 的最大信号
     KD ： 亲和力
     尽管没有特定地显示， SET 数据验证了此处所述的抗体是人 C3b 的高亲和力结合 子， 其结合亲和力在低于或等于 10pM， 在许多情况下低于或等于 5pM 的范围内。同样地， 此 处描述的抗体以高亲和力结合猕猴 C3b， 通常以低于或等于 200pM 的 KD 结合猕猴 C3b。
     C3b 抗体显示对 C3 的显著结合选择性
     检查 C3b 抗体， 以测定它们对 C3b 的结合相对于 C3b 前体 C3 是否是选择性的。简 言之， 通过进行以下步骤测定对 C3b 的结合选择性。用碳酸盐缓冲液中 2μg/ml 的抗 C3d 兔单克隆抗体 (abcam 17453) 以 100μl/ 孔包被 Maxisorp 平板 Nunc(442404)。密封平 板并在 4 ℃下温育过夜。抽干平板并用 PBS/0.5 ％ Tween 20 洗涤 3 次。用稀释剂 (PBS， 4％ BSA Fraction V(Fisher ICN16006980)， 0.1％ Tween 20(Sigma P1379)， 0.1％ Triton X-100(Sigma P234729)) 封闭平板， 并在室温下温育 2 小时或在 4℃下温育过夜。然后用 PBS/0.5％ Tween 20 洗涤平板一次。 在稀释剂中以 1μg/ml 稀释纯化的 C3b( 补体技术 A114 lot 21) 和 C3( 补体技术 A113c)， 并在每孔中接种 100μl。在室温下温育 1 小时。然后用 PBS/0.5％ Tween 20 洗涤 3 次。以 100nM 稀释 Fabs， 随后在稀释剂中稀释 ( 或更高浓度 )， 并在每孔中接种 100μl。在室温下温育 1 小时。用 PBS/0.5％ Tween 20 洗涤平板 3 次。在
     稀释剂中加入 100μl/ 孔的 1 ∶ 400 的抗组氨酸 HRP 单克隆检测抗体， 并在室温下温育 1 小时。然后用 PBS/0.5％ Tween 20 洗涤 4 次。加入 100μl 的 TMB 底物 (Pierce 34028)， 并在室温下温育高达 5 分钟。向各孔中加入 50μl 的终止溶液 (2N 硫酸 )， 并在 450nm 处读 取平板， 并在 570nm 处校正塑料读数。
     如图 1 所示， C3b 抗体对 C3 结合具有选择性。抗体实现了相对于 C3 结合高 1000 倍的 C3b 结合选择性。尽管图 1 显示了对抗体 9556 的结合选择性的实例， 1000 倍的结合选 择性是此处公开的七种 IgG C3b 抗体具有的性质。
     C3b 抗体抑制备选补体途径
     为了证明抗 C3b 抗体抑制备选补体途径， 进行以下测定。
     溶血测定
     溶血测定是基本的功能测定， 其检测补体激活并已经用于评估抗人 C3b mAbs 和 Fab 分 子 阻 断 红 细 胞 (RBCs) 通 过 补 体 途 径 溶 解 的 能 力 (Evanset al.(1995).In vitro and in vivo inhibition of complement activity by asingle-chain Fv fragment recognizing human C5.Mol Immunol 32， 1183-1195 ； Thomas et al.(1996). Inhibition of complement activity byhumanized anti-C5 antibody and single-chain Fv.Mol Immunol 33， 1389-1401 ； Rinder et al.(1995).Blockade of C5a and C5b-9 generationinhibits leukocyte and platelet activation during extracorporeal circulation.J Clin Invest 96， 1564-1572)。简言之， 对于经典途径测定， 敏化的红细胞 用作通过血清中存在的补体蛋白质进行溶解的靶标。该测定对于高亲和力抗人 C3b mAbs 的表征和筛选是重要的。
     从 Rinder 等， (1995) 和 Thomas 等， (1996) 改进该方法。
     试剂 ：
     兔红细胞 (Rb RBCs)-Lampire， Cat#7246408
     人血清 -Novartis Blood Research Program ； 或 Cyno 血清 -AlphaGenesis
     明胶佛罗那缓冲液 (GVB)-Boston BioProducts， Cat#IBB-300
     EGTA-Boston BioProducts， Cat#BM-151
     MgCl2
     U 型底 96- 孔板 -Corning， Cat#3795
     平底 96 孔板 -Corning， Cat#3370
     NP-40-Sigma， Cat#74385
     方案 ：
     1. 洗涤 Rb RBCs 并在 GVB/EGTA/Mg++ 中调整至 8.33e7 细胞 /ml
     2. 向 96 孔圆底平板的孔中加入在 GVB 中稀释的 50μl Ab ； Ab 的浓度应该是期望 终浓度的 2 倍。
     3. 加入在含有 EGTA 和 Mg++ 的 GVB 中稀释的 50μl 血清。
     a. 制备对照孔 ： 血清 +0nM Ab， 0％溶解对照 ( 仅缓冲液 )、 100％溶解对照 (0.1％ NP-40)， 和血清、 缓冲液， 和 NP-40 对照。
     b. 如果对 10％血清检测 Ab， 使用 10mM EGTA 和 5mM Mg++( 最终 ) ； 如果对 50％血 清检测 Ab， 使用 15-30mM EGTA， 5mM Mg++( 最终 )。4. 在室温下温育 30 分钟。
     5. 向样品和对照孔中加入 30μl Rb RBCs ； 向空白孔中加入 30μl 缓冲液。 在 37℃ 下温育 30 分钟。
     6. 在 2000rpm 下离心平板 5 分钟。
     7. 收集上清液， 转移至平底平板中。
     8. 读取 OD415 和 OD570。计算％溶血 ：
     图 2 显示了抗 C3b 抗体在 10％人或猕猴血清中抑制溶血的能力的实例。 此处所述 的各 C3b 抗体以低于或等于 50nM 的 IC50 抑制溶血。
     相反， 当使用敏化的红细胞进行测定时， 为了检查经典补体途径的激活， 发现此处 所述的抗 C3b 抗体不激活经典补体途径 ( 数据未显示 )。
     C3b 沉积测定
     测定在旁路途径中补体 C3 的抑制剂活性的一种方法是测定其沉积在酵母多糖上 的分解产物 C3b。根据以下步骤进行这种基于 ELISA 的测定 ： 在 4℃下 Maxisorp 384- 孔 ELISA 平板 (Nunc 464718) 中用碳酸盐缓冲液， pH 9.6(Pierce Cat#28382) 中 25μl 的 1mg/ml Zymosan A(Sigma Z4250) 包被过夜。第二天， 抽吸酵母多糖包被的平板并用每孔 100μl 的 ELISA 封闭缓冲液， Synblock(AbD Serotec BUFO34C) 在室温下封闭 2 小时。在
     各反应中， 向补充 MgCl2 和 EGTA( 最终总的反应浓度为 1mM MgCl2 和 10mMEGTA) 的 10％血 清中加入在明胶佛罗那缓冲液 (Boston BioproductsIBB320-10mM Barbital， 145mM NaCl， 0.1％明胶， 0.5mM MgCl2， 10mMEGTA) 中系列稀释的抑制剂。 阳性对照不含有抑制剂， 而阴性 对照含有 25mM EDTA。通过在室温下温育 30 分钟允许混合物达到平衡。为了去除封闭缓冲 液， 抽吸平板并用 TBS/0.05％ Tween-20 洗涤一次。 向平板中加入每孔 25μl 含有抑制剂的 10％血清或对照， 并在 37℃下温育 30 分钟 ( 先前通过时间过程测定在酵母多糖上的 C3b 沉 积的线性范围内 )。30 分钟温育后， 用 TBS/0.05％ Tween-20 洗涤平板 3 次。为了检测酵母 多糖上的 C3b 沉积， 向平板中加入在含有 2％ BSA Fraction V(Fisher Cat# ICN16006980)、 0.1％ Tween20(Sigma Cat#P1379) 和 0.1％ TritonX-100(SigmaCat#P234729) 的 PBS 中根 据制造商稀释的鸡抗人 C3-HRP 缀合的多克隆抗体 (Immunology Consultants Laboratory， Inc.Cat#CC3-80P-1)， 并在室温下温育 1 小时。然后， 用 TBS/0.05％ Tween-20 洗涤平板 3 次， 然后加入 25μl 的 Ultra TMB 底物溶液 (Pierce Cat#34028.)。当孔中的溶液变蓝时， 用 15μl 的 2N 硫酸终止反应。使用 Spectromax 在 450nm 读取平板 (OD450-570nm 读数 )， 在 570nm 处为塑料平板进行校正。使用以下公式计算在酵母多糖上 C3b 沉积的百分比 ：
     图 3 显示了 C3b 抗体抑制 C3 产生为 C3b 的分解产物的能力的实例。显示各检测 抗体以至少低于或等于 10nM 的 IC50 抑制 C3b 沉积。
     MAC 沉积测定
     测定 C3b 抗体抑制备选补体途径的功能能力的另一种测定是测定抗体抑制产生 膜攻击复合体 (MAC) 的能力， 其位于 C3b 加工的下游。简言之， 以碳酸盐缓冲液， pH 9.5 中 1mg/ml 在平板上包被 Zymosan A(Sigma) 来激活旁路途径。Fabs 或 IgGs 各自与血清 (2％ 血清， 5mM MgCl2， 10mMEDTA) 预温育， 然后加入到平板中并在室温下温育过夜。 用 TBST 洗涤 平板 3 次后， 通过与抗 C5b-9-ALP(Diatec) 温育 1 小时， 然后用 TBST 洗涤 3 次， 并与补充有 2mM MgCl2 的 4- 甲基伞形酮磷酸酯 (Fisher) 温育 30 分钟来检测 MAC。用 0.2M EDTA 终止 反应， 并在 ex ＝ 355nm， em ＝ 460nm 处读取平板。计算各样品相对于基线 (EDTA 处理的人 血清 ) 和阳性对照 ( 人血清 ) 的 MAC 沉积的抑制， 并利用 PRISM 来产生 IC50 曲线。
     图 4 显示了示例性数据， 其证明 C3b 抗体抑制 MAC 沉积的能力， 因此表明抗体抑制 补体旁路。尤其是， 抗体以低于或等于 5nM 的 IC50 抑制 MAC 沉积。
     C3a 和 C5a 产生的抑制
     可用于测定 C3b 抗体抑制补体旁路的能力的另一种测定是测量 C3a 和 C5a 的产 生， 两者是旁路途径中 C3b 下游的激活产物。
     简言之， 由申请人开发了 C5a-des-Arg ELISA 来测定溶血过程中 C5a 的产生以证 实溶血测定中抑制性的抗体也抑制 C5 切割成 C5a 和 C5b。
     用 包 被 缓 冲 液 ( 碳 酸 氢 盐 pH 9.5-9.8) 中 1μg/ml 的 100μl/ 孔 小 鼠 抗 人 C5a-des-Arg(US Biologics) 包被 Maxisorp 平板， 并将其在 4℃温育过夜。用 PBST 洗涤 3 次后， 用 300μl/ 孔稀释剂 (Synblock， AbD Serotec) 在室温下封闭所述平板 2 小时。抽 出封闭溶液后， 以稀释剂稀释的 100μl 样品或标准品在室温下温育 1 小时。如下制备标准 品： 以 20ng/ml 标准品 (rC5a-des-Arg) 开始， 制备 1 ∶ 4 连续稀释液用于 7 点曲线。在稀 释液剂中以 1 ∶ 5 稀释溶血测定的样品 ( 溶血测定上清液应该储存在 -80℃， 直至用于 C5a ELISA)。中间用 PBST 洗涤平板 3 次。
     加入稀释剂中稀释的 100μl/ 孔的 0.4μg/ml 检测抗体 ( 生物素 - 山羊抗人 c5a， R&D Systems)， 并且在室温下温育 1 小时后， 加入 HRP 稀释剂 ( 聚 -HRP 稀释剂 ) 中 1 ∶ 5000 稀释的 100μl/ 孔 Strep-HRP( 聚 -HRP 链霉抗生物素蛋白 )30 分钟。用 PBST 洗涤 4 次 后， 加入 100μl/ 孔 TMB 底物 (UltraTMB 底物溶液 )5-10 分钟。用 50μl/ 孔终止溶液 (2N H2SO4) 终止反应。读取吸光度 (A450-A570) 并使用 SoftMax Pro 分析数据。
     同样地， 由申请人开发了 C3a-des-Arg ELISA 来测定溶血过程中的 C3a 产生， 以验 证在溶血测定中抑制性的抗体也抑制 C3 切割成 C3a 和 C3b。
     用 包 被 缓 冲 液 ( 碳 酸 氢 盐 pH 9.5-9.8) 中 1μg/ml 的 100μl/ 孔 小 鼠 抗 人 C3a-des-Arg neo(US Biologics) 包被 Maxisorp 平板， 并将其在 4℃温育过夜。用 PBST 洗 涤 3 次后， 用 300μl/ 孔稀释剂 (Synblock， AbD Serotec) 在室温下封闭所述平板 2 小时。 抽出封闭溶液后， 以稀释剂稀释的 100μl 样品或标准品在室温下温育 1 小时。如下制备标 准品 ： 以 1μg/ml 标准品 (rC3a-des-Arg) 开始， 制备 1 ∶ 3 连续稀释液用于 8 点曲线。在 稀释液剂以 1 ∶ 5 稀释溶血测定的样品 ( 溶血测定上清液应该储存在 -80℃， 直至用于 C5a ELISA)。中间用 PBST 洗涤平板 3 次。
     加入稀释剂中稀释的 100μl/ 孔的 10μg/ml 检测抗体 ( 生物素 - 小鼠抗人 c3a， Chemicon 和内部生物素化的 )， 并且在室温下温育 1 小时后， 加入 HRP 稀释剂 ( 聚 -HRP 稀释剂 ) 中 1 ∶ 5000 稀释的 100μl/ 孔 Strep-HRP( 聚 -HRP 链霉抗生物素蛋白 )30 分钟。用 PBST 洗涤 4 次后， 加入 100μl/ 孔 TMB 底物 (Ultra TMB 底物溶液 )5-10 分钟。用 50μl/ 孔终止溶液 (2NH2SO4) 终止反应。 读取吸光度 (A450-A570) 并使用 SoftMax Pro 分析数据。
     如图 5 所示， C3b 抗体能够通过抑制产生 C3a 和 C5a 阻断旁路途径驱动的补体激 活。更尤其是， 此处所述的 C3b 抗体如抑制 C3a 和 C5a 产生所测定以低于或等于 50nM 的 IC50 抑制旁路途径。
     C3b 抗体抑制体外 C3 转化酶活性
     基于 C3 水空转 (Tick-over) 转化酶凝胶的测定
     在该测定中， Fabs/IgGs 与 10％的含 C3- 水的 C3 预温育， 以便当加入因子 D 和因 子 B 时， 可以测量通过 C3 水空转的转化酶活性。以以下终浓度使用蛋白质试剂 ： 天然因子 B(100nM)、 因子 D(40nM)、 C3(400nM)、 MgCl(5mM) 和 Fab/IgG 1000nM， 随后进行稀释。在 96 孔聚丙烯平板中， 加入多种稀释度的 Fabs/IgGs( 包括 PBS 对照样品 )。为此， 加入 C3 并在 室温下温育 1 小时。然后将因子 B、 因子 D 和 MgCl 的储存混合物加入到 1XPBS 中。1 小时 温育后， 将适当量的反应混合物加入到每孔 Fab/IgG-C3 中。立即取 0 时间点， 加入 4X 样品 缓冲液， 并放置在 95℃。允许转化酶反应在室温下温育 15 分钟。然后取最后的时间点， 加 入 4X 样品缓冲液， 并放置在 95℃。在还原条件下 4-12％ Bis-Tris 凝胶上为各样品运行总 体积 ( 也可在省略因子 D 的单独反应中产生 0 时间点 )。
     基于 C3b 凝胶的转化酶测定
     设计该测定， 以便 Fabs/IgGs 与 C3b 预温育。 温育后， 将其加入到 C3 反应混合物中 以检测转化酶活性。以以下终浓度使用蛋白质试剂 ： 天然 C3b(32nM)、 天然因子 B(100nM)、 因子 D(40nM)、 C3(400nM)、 MgCl(5mM) 和 Fab/IgG 1000nM， 随后进行稀释。在 96 孔聚丙烯 平板中， 加入适当体积的多种稀释度的 Fabs/IgGs( 包括 PBS 对照样品 )。为此， 每孔加入 适当量的 C3。在 37℃下温育 1 小时。然后将因子 B、 因子 D 和 MgCl 的储存混合物加入到 1XPBS 中。1 小时温育后， 向储存混合物中加入 C3， 并将适当量的反应混合物立即加入到各 孔 Fab/IgG-C3 中。立即取 0 时间点， 加入 4X 样品缓冲液， 并放置在 95℃。允许转化酶反应 在室温下温育 15 分钟。然后取最后的时间点， 加入 4X 样品缓冲液， 并放置在 95℃。在还原 条件下 4-12％ Bis-Tris 凝胶上为各样品运行总体积 ( 也可在省略因子 D 的单独反应中产 生 0 时间点 )。
     进行基于 C3 转化酶凝胶的测定
     设计该测定， 以便使用 C3b、 因子 B 突变体和因子 D 产生稳定的转化酶。 为此， 加入 Fabs/IgGs 并允许温育。 然后加入 C3， 并取样品进行分析。 C3 不能形成转化酶。 以以下终浓 度使用蛋白质试剂 ： 天然 C3b(32nM)、 天然因子 B 突变体 (16nM)、 因子 D(40nM)、 C3(400nM)、 MgCl(5mM) 和 Fab/IgG 1000nM， 随后进行稀释。在 96 孔聚丙烯平板中， 加入 c3b、 因子 B、 因 子 D 和 MgCl， 并在 37℃下温育 10 分钟。然后加入适当稀释的 fabs/IgGs(PBS 对照 ) 并在 37℃下温育 20 分钟。然后加入 C3 并在室温下温育 15 分钟。立即取 0 时间点， 加入 4X 样 品缓冲液， 并放置在 95℃。允许转化酶反应在室温下温育 15 分钟。然后取最后的时间点， 加入 4X 样品缓冲液， 并放置在 95℃。在还原条件下 4-12％ Bis-Tris 凝胶上运行各样品的 总体积 ( 也可在省略因子 D 的单独反应中产生 0 时间点 )。
     如图 6 中所示， C3b 抗体抑制旁路途径体外 C3 转化酶活性。 图 6A 显示了 SDS-PAGE凝胶， 其显示了空转转化酶活性的抑制。图 6B 显示了 6A 凝胶中对 C3b 产生的抑制的定量。 图 6C 显示了抗 C3b 抗体抑制预形成的 C3 转化酶活性。
     C3b 抗体体外抑制 C5 转化酶活性
     为了进一步表征抗 C3b 抗体抑制补体旁路的能力， 检查抗体抑制 C5 转化酶激活 的能力。简言之， 通过与纯化的 C3 和胰蛋白酶 (Sigma) 在室温下温育 10 分钟在 Zymosan A(Sigma) 上沉积 C3b。将酵母多糖离心并去除上清液， 通过加入纯化的 C3、 fB、 fD 和 NiCl2 扩增 C3b。重复扩增步骤， 直至在酵母多糖上达到想要密度的 C3b。
     Fabs/IgGs 与 Zymosan-C3b 在 室 温 下 预 温 育 45 分 钟。 加 入 纯 化 的 蛋 白 质 (Complement Tech) ： C5(100nM)、 C6(100nM)、 fB(500nM)、 fD(160nM) 和 5mM NiCl2。反应在 37℃下温育 5 中， 并通过 1 ∶ 10 稀释到冰冷的 GVB+10mM EDTA 中来终止反应。使用溶血测 定， 通过向 chRBCs(8E7/ml) 和 2％人血清中加入反应产物， 并在 37 ℃下温育 30 分钟来定 量 C5bC6 水平。在 2000rpm 下将细胞离心 5 分钟， 并在 A415/A570 处读取上清液。纯化的 C5bC6 蛋白质 (Complement Tech) 用作标准曲线。
     如图 7 所示， C3b 抗体抑制旁路途径体外 C5 转化酶活性。
     通过 C3b 抗体阻断补体因子结合 C3b
     进行以下实验， 以测定抗 C3b 抗体抑制 C3b 与补体旁路其它成员之间相互作用的 能力， 并因此证明了抗体抑制补体旁路的可能机制。简言之， 在室温下 48 小时温育期间使 用 AminoLink Reductant(Pierce) 将纯化的 C3b 和 fP 缀合到未缀合的受体或供体珠子 (PerkinElmer) 上。使用羧甲基胺半盐酸盐 (Aldrich) 淬灭珠子， 通过在 13000rpm 下离 心并用 0.1M TBST 洗涤三次进行纯化。在室温下使用 20 倍摩尔过量的 NHS 生色的生物素 (Pierce) 在 30 分钟温育期间生物素化纯化的 fB(D24G/N260D) 和 fH， 并使用 Zeba 0.5ml 脱盐柱 (Pierce) 进行纯化。
     对于 C3b-C3b 和 C3b-fP 的近似性， Fabs 或 IgGs 分别与 C3b 受体珠子 (20μg/ml) 在室温下预温育 60 分钟。然后加入 C3b- 供体珠子或 fP- 供体珠子 (20μg/ml)， 并在读数 前在室温下温育平板过夜。 对于 C3b-fB 和 C3b-fH 的近似性， 抗体与 C3b- 受体珠子 (20μg/ ml) 在室温下预温育 60 分钟。然后加入生物素化的 fB(D24G/N260D) 或 fH， 并在室温下温 育 60 分钟。然后加入 SA- 供体珠子 (20μg/ml)， 并在读数前在室温下过夜温育平板钟。在 BMGPherastar 上读取平板 (ex ＝ 680， em ＝ 520-620)。
     如图 8 所示， C3b 抗体阻断了几种补体因子与 C3b 的结合。如图中所见， 抗 C3b 抗 体利用不同的作用机制来阻断补体旁路。图 8A 显示了通过 C3b 抗体抑制因子 B 结合 C3b。 图 8B 显示了通过 C3b 抗体抑制因子 P 结合 C3b。图 8C 显示了通过 C3b 抗体抑制因子 H 结 合 C3b。图 8D 显示了通过 C3b 抗体抑制 C3b-C3b 二聚体形成。
     C3b 抗体不与人 C3d 或人 C5 交叉反应
     检测抗 C3b 抗体与人 C3d 和 C5 的交叉反应性。
     用于检测与人 C3b、 人 C3d 或 cyno C3b 的结合的 EILSAs 中的捕获抗体是针对 C3d 蛋白质兔多克隆抗人 C3d Ab， Abcam) 的抗体， 其为 C3b 的亚结构域。用在 PBS 中稀释至 2μg/ml 的捕获抗体填充 Maxisorp 平板的孔。密封平板并在 4℃下温育过夜。为了检测 Fabs 与 C5 的结合， 捕获抗体是以 5μg/ml 的终浓度使用的抗 C5 抗体 (US Biologicals)。
     第二天， 通过加入 PBST/5％奶粉封闭平板上剩余的结合位点。平板在室温下温育1 小时， 然后用 PBST 洗涤 2 次。以在 PBST/5％奶粉中稀释的 2.5μg/ml 的终浓度加入 C3b。 平板在室温下温育 1 小时， 然后用 PBST 洗涤 3 次。制备 Fabs 的系列稀释， 然后加入到封闭 的平板中。平板在室温下温育 1-2 小时， 然后用 PBST 洗涤 3 次。
     对于 Fabs 的检测， 加入抗 HIS AP- 缀合的抗体 (Invitrogen， 46-0284)， 平板在室 温下温育 1 小时， 然后用 PBST 洗涤 5 次。根据制造商的说明书使用荧光底物 AttoPhos。在 Tecan GENios Pro 平板读数器上测定荧光。
     分别在图 9 和 10 中显示了来自这些实验的 C3d 和 C5 的结果。如所示， C3b 抗体 不结合 C3d 或 C5。
     C3b 抗体等同地识别 iC3b 和 C3c
     为了测定此处所述的抗 C3b 抗体是否可以结合补体途径组分 iC3b 和 C3c， 进行 以下步骤 ： 直接向 Coat Maxisorp 平板 Nunc(442404) 以每孔 100μl 加入碳酸盐缓冲液中 的 2μg/ml iC3b( 补体技术 A115)、 C3d( 补体技术 A117) 或 C3c( 补体技术 A116)。密封 平板并在 4℃下温育过夜。抽吸平板并用 PBS/0.5％ Tween 20 洗涤 3 次。以稀释剂 (PBS， 4％ BSA Fraction V(Fisher ICN16006980)， 0.1％ Tween 20(Sigma P1379)， 0.1％ Triton X-100(Sigma P234729)) 封闭平板， 并在室温下温育 2 小时或在 4℃下温育过夜。然后用 PBS/0.5％ Tween 20 洗涤平板 1 次。以 100nM 稀释 Fabs， 随后在稀释液中稀释 ( 或如果需 要， 更高浓度 )， 并在每孔中接种 100μl。在室温下温育 1 小时。用 PBS/0.5％ Tween 20 洗涤平板 3 次。在稀释液中加入 100μl/ 孔的 1 ∶ 400 的抗组氨酸 HRP 单克隆检测抗体， 并在室温下温育 1 小时。然后用 PBS/0.5％ Tween 20 洗涤 4 次。加入 100μl 的 TMB 底物 (Pierce 34028)， 并在室温下温育高达 5 分钟。 向各孔中加入 50μl 的终止溶液 (2N 硫酸 )， 并在 450nm 处读取平板， 并在 570nm 处校正塑料平板读数。
     如图 11 中所示， C3b 抗体与 iC3b 和 C3c 交叉反应。
     物种交叉反应性
     为了测定除了人和猕猴， 此处所述的抗 C3b 抗体是否结合来自其它物种的 C3b， 如 上文所述进行溶血测定。用于各物种的血清浓度如下 ： 10％大鼠血清 ； 20％兔血清 ； 10％猪 血清 ； 20％小鼠血清 ； 10％豚鼠血清 ； 和 10％狗血清。如图 12 中所示， C3b 抗体能够与几种 物种交叉反应， 所述物种包括大鼠、 兔、 猪、 小鼠和豚鼠。
     Fab 形式的 C3bneo 结合子
     除了上文描述的全长 IgG 形式的抗 C3b 抗体， 相同的可变域用于构建 Fab 形式的 抗原结合片段。评估抗 C3b Fabs， 以根据上文描述的方法测定其结合特征。表 11 概述了亚 组 Fabs 的补体因子结合的结合亲和力、 功能潜能和抑制。
     本发明的实施方案 本发明包括， 但不限于以下实施方案 ：1. 分离的抗体或其抗原结合片段， 其特异性结合人或猕猴补体 C3b 蛋白， 其中所 述抗体以低于或等于 100pM 的 KD 结合人 C3b。
     2. 前述段落中的分离的抗体或其抗原结合片段， 其中所述抗体或其抗原结合片段 也以低于或等于 250pM 的 KD 结合猕猴 C3b。
     3. 任何前述段落中的分离的抗体或其抗原结合片段， 其中所述抗体或其抗原结合 片段以低于或等于 10pM 的 KD 结合人 C3b。
     4. 任何前述段落中的分离的抗体或其抗原结合片段， 其中所述抗体或其抗原结合 片段以低于或等于 2pM 的 KD 结合人 C3b。
     5. 任何前述段落中的分离的抗体， 其中所述抗体如通过体外溶血测定法所测定以 低于或等于 65nM 的 IC50 抑制人补体旁路。
     6. 任何前述段落中的分离的抗体， 其中所述抗体如通过体外 C3b 沉积所测定以低 于或等于 50nM 的 IC50 抑制人补体旁路。
     7. 任何前述段落中的分离的抗体， 其中所述抗体如通过补体膜攻击复合体的沉积 所测定以低于或等于 5nM 的 IC50 抑制人补体旁路。
     8. 任何前述段落中的分离的抗体， 其中所述抗体如通过产生 C3a 和 C5a 所测定以 低于或等于 100nM 的 IC50 抑制补体旁路。
     9. 任何前述段落中的分离的抗体或其抗原结合片段， 其中所述抗体或其抗原结合 片段特异性结合人或猕猴的补体 C3b 蛋白， 并与表 1 中描述的抗体交叉竞争。
     10. 任何前述段落中的分离的抗体， 其中所述抗体是单克隆抗体。
     11. 任何前述段落中的分离的抗体， 其中所述抗体是人或人源化抗体。
     12. 任何前述段落中的分离的抗体， 其中所述抗体是嵌合抗体。
     13. 任何前述段落中的分离的抗体， 其中所述抗体是单链抗体。
     14. 任何前述段落中的分离的抗体， 其中所述抗体是 Fab 片段或 ScFv 片段。
     15. 任何前述段落中的分离的抗体， 其中所述抗体是 IgG 同种型。
     16. 任何前述段落中的分离的抗体， 其中所述抗体包括这样的构架， 其中氨基酸已 经替换到来自各人 VH 或 VL 种系序列的抗体构架。
     17. 任何前述段落中的分离的抗体， 其中所述抗体以比所述抗体结合 C3 的亲和力 高至少 1000 倍的亲和力结合 C3b。
     18. 任何前述段落中的分离的抗体或其抗原结合片段， 其中所述抗体或其抗原结 合片段包含选自 SEQ ID NOs ： 1、 15、 29、 43、 57、 71、 85、 99、 113、 127、 141、 155、 169 和 183 的重 链 CDR1 ； 选自 SEQ ID NOs ： 2、 16、 30、 44、 58、 72、 86、 100、 114、 128、 142、 156、 170 和 184 的重 链 CDR2 ； 和选自 SEQ ID NOs ： 3、 17、 31、 45、 59、 73、 87、 101、 115、 129、 143、 157、 171 和 185 的 重链 CDR3， 其中所述分离的抗体或其抗原结合片段结合补体蛋白 C3b。
     19. 任何前述段落中的分离的抗体或其抗原结合片段， 其中所述抗体或其抗原结 合片段包含选自 SEQ ID NOs ： 4、 18、 32、 46、 60、 74、 88、 102、 116、 130、 144、 158、 172 和 186 的 轻链 CDR1 ； 选自 SEQ ID NOs ： 5、 19、 33、 47、 61、 75、 89、 103、 117、 131、 145、 159、 173 和 187 的 轻链 CDR2 ； 和选自 SEQ ID NOs ： 6、 20、 34、 48、 62、 76、 90、 104、 118、 132、 146、 160、 174 和 188 的轻链 CDR3， 其中所述分离的单克隆抗体或其抗原结合片段结合补体蛋白 C3b。
     20. 任何前述段落中的分离的抗体或其抗原结合片段， 其中所述单克隆抗体还包含选自 SEQ ID NOs ： 4、 18、 32、 46、 60、 74、 88、 102、 116、 130、 144、 158、 172 和 186 的轻链 CDR1 ； 选自 SEQ ID NOs ： 5、 19、 33、 47、 61、 75、 89、 103、 117、 131、 145、 159、 173 和 187 的轻链 CDR2 ； 和 选自 SEQ ID NOs ： 6、 20、 34、 48、 62、 76、 90、 104、 118、 132、 146、 160、 174 和 188 的轻链 CDR3。
     21. 任何前述段落中的分离的抗体或其抗原结合片段， 其中所述抗体或抗原结合 片段包含选自 SEQ ID NOs ： 7、 21、 35、 49、 63、 77、 91、 105、 119、 133、 147、 161、 175 和 189 的重 链可变域序列， 还包括选自 SEQ IDNOs ： 8、 22、 36、 50、 64、 78、 92、 106、 120、 134、 148、 162、 176 和 190 的轻链可变域序列， 其中所述分离的抗体或其抗原结合片段结合补体蛋白 C3b。
     22. 任何前述段落中的分离的抗体或其抗原结合片段， 其中所述抗体或其抗原结 合片段包含与选自 SEQ ID NOs ： 7、 21、 35、 49、 63、 77、 91、 105、 119、 133、 147、 161、 175 和 189 的序列具有至少 95％序列同一性的重链可变域， 其中所述抗体结合 C3b。
     23. 任何前述段落中的分离的抗体或其抗原结合片段， 其中所述抗体或其抗原结 合片段包含与选自 SEQ ID NOs 8、 22、 36、 50、 64、 78、 92、 106、 120、 134、 148、 162、 176 和 190 的序列具有至少 95％序列同一性的轻链可变域， 其中所述抗体结合 C3b。
     24. 任何前述段落中的抗体或其抗原结合片段， 其中所述抗体或其抗原结合片段 还包含与选自 SEQ ID NOs 8、 22、 36、 50、 64、 78、 92、 106、 120、 134、 148、 162、 176 和 190 的序 列具有至少 95％序列同一性的轻链可变域。
     25. 任何前述段落中的分离的抗体或其抗原结合片段， 其中所述抗体或其抗原结 合片段包含选自 SEQ ID NOs 9、 23、 37、 51、 65、 79、 93、 107、 121、 135、 149、 163、 177 和 191 的 序列具有至少 95％序列同一性的重链， 其中所述抗体结合 C3b。
     26. 任何前述段落中的分离的抗体或其抗原结合片段， 其中所述抗体或其抗原结 合片段包含与选自 SEQ ID NOs 10、 24、 38、 52、 66、 80、 94、 108、 122、 136、 150、 164、 178 和 192 的序列具有至少 95％序列同一性的轻链， 其中所述抗体结合 C3b。
     27. 任何前述段落中的分离的抗体或其抗原结合片段， 其还包含与选自 SEQ ID NOs 10、 24、 38、 52、 66、 80、 94、 108、 122、 136、 150、 164、 178 和 192 的序列具有至少 95％序列 同一性的轻链。
     28. 药物组合物， 其包含任何前述段落的抗体或其抗原结合片段和药学上可接受 的载体。
     29. 分离的核酸， 其包含编码这样的多肽的序列， 所述多肽包含与选自 SEQ ID NOs ： 7、 21、 35、 49、 63、 77、 91、 105、 119、 133、 147、 161、 175 和 189 的序列具有至少 95％序列同 一性的重链可变域。
     30. 分离的核酸， 其包含编码这样的多肽的序列， 所述多肽包含与选自 SEQ ID NOs 8、 22、 36、 50、 64、 78、 92、 106、 120、 134、 148、 162、 176 和 190 的序列具有至少 95％序列同一性 的轻链可变域。
     31. 载体， 其包括前述段落的核酸。
     32. 分离的宿主细胞， 其包含编码任何前述段落的抗体或其抗原结合片段的重链 的重组 DNA 序列， 和编码任何前述段落的抗体或其抗原结合片段的轻链的第二条重组 DNA 序列， 其中所述 DNA 序列有效连接启动子， 并能够在宿主细胞中表达。
     33. 前述段落的分离的宿主细胞， 其中所述抗体是人单克隆抗体。
     34. 先前两段中的分离的宿主细胞， 其中所述宿主细胞是非人哺乳动物细胞。35. 治疗年龄相关性黄斑变性的方法， 其包括向需要治疗的受试者施用有效量的 包含前述段落的抗体或其抗原结合片段的组合物。
     36. 前述段落的方法， 其中所述受试者是人。
     37. 在受试者中抑制补体旁路的方法， 其包括向需要抑制的受试者施用有效量的 包含前述段落的抗体或其抗原结合片段的组合物。
     38. 前述段落的方法， 其中所述受试者是人。
     年龄相关性黄斑变性 (AMD) 是进行性疾病， 并且是美国年龄 65 岁及以上老年人视 觉丧失和失明的主要原因。AMD 主要影响黄斑 ； 其为负责阅读或开车所需的高视敏度的视 网膜的一部分。大多数 AMD 患者遭受该疾病的早期阶段， 所述疾病的特征在于存在称为玻 璃疣的细胞外视网膜沉积物。 玻璃疣是细胞碎片的细胞外视网膜沉积物、 炎症介质、 和细胞 外基质组分。AMD 的晚期阶段表现为干涩或湿润形式， 两者均与视觉丧失相关。干涩 AMD， 也称为地图样萎缩， 在检眼镜检查中呈现为界线清楚的区域， 其对应于视网膜色素上皮细 胞 (RPE) 丧失的局部区域。湿润 AMD 与脉络膜的新血管形成相关， 引起 Bruch’ s 膜完整性 受损和视网膜中脉管生长， 其中它们经常出血。 这种渗漏引起对视网膜细胞的永久性损伤， 它们相继死亡的， 并在中央视觉区产生盲点。
     人先天性系统由补体途径组成。补体途径作用于防御化脓性细菌感染， 桥接先天 性和适应性免疫 ； 并去除免疫复合体的产物和炎性损伤。补体是在血浆和细胞表面参与级 联反应的多于 30 种蛋白质的系统。补体系统及其补体组分参与多种免疫过程。例如， 补体 C5b-9 复合体， 也称为末端复合体或膜攻击复合体 (MAC)， 通过诱导膜通透性损伤而在细胞 死亡中起重要作用。
    近期工作已经证明， 补体组分 C3 和 C5 是 AMD 患者中玻璃疣的主要成分。 Mulling， R.F. 等 (2000)FASEB J 14， 835-46。已经推测它们以及膜攻击复合体 (MAC)C5b-9 和其它 急性期反应蛋白在玻璃疣上 RPF 细胞中的存在参与了可激发补体激活和 MAC 形成的过程。 Johnson， L 等 (2001)Exp Eye Res 73， 887-896。因此， 越来越多的证据表明， 补体组分不仅 仅是先天性免疫的介体。
     已经建议营养干预用于抑制干涩 AMD 发展成湿润 AMD。目前， 仅 FDA 批准的湿 润 AMD 的 治 疗 包 括 光 动 力 学 疗 法 (PDT)、 抗 VEGF 适 体， 如 pegaptanib， 和 抗 VEGF 抗 体 ranibizumab。这些药物或治疗通常向已患有重大视觉丧失的患者施用。
     仍然需要开发 AMD 的有效治疗， 来替换或补充目前的治疗。尤其是， 需要可以提供 早期检测、 预防或恢复视觉丧失的治疗。
     发明概述
     本发明涉及分离的抗体或其抗原结合片段， 其特异性结合人或猕猴补体 C3b 蛋 白， 其中所述抗体以低于或等于 100pM 的 KD 结合人 C3b， 并以低于或等于 200pM 的 KD 结合 猕猴 C3b。例如， 此处描述的抗体或抗原结合片段可以低于或等于 90pM、 低于或等于 80pM、 低于或等于 70pM、 低于或等于 60pM、 低于或等于 50pM、 低于或等于 40pM、 低于或等于 30pM， 并优选高达低于或等于 20、 19、 18、 17、 16、 15、 14、 13、 12 或 11pM 的 KD 结合人 C3b。优选的 是， 抗体或其抗原结合片段以低于或等于 10pM 的 Kd 结合人 C3b。例如， 抗体或其抗原结合 片段可以低于或等于 9pM、 低于或等于 8pM、 低于或等于 7pM、 低于或等于 6pM、 低于或等于 5pM、 低于或等于 4pM、 低于或等于 3pM、 低于或等于 2pM， 或高达低于或等于 1pM 的 KD 结合 C3b。此处描述的抗体或抗原结合片段可以低于或等于 250pM、 低于或等于 240pM、 低于或等 于 230pM、 低于或等于 220pM、 低于或等于 210pM、 低于或等于 200pM、 低于或等于 190pM、 低于
     已经建议营养干预用于抑制干涩 AMD 发展成湿润 AMD。目前， 仅 FDA 批准的湿 润 AMD 的 治 疗 包 括 光 动 力 学 疗 法 (PDT)、 抗 VEGF 适 体， 如 pegaptanib， 和 抗 VEGF 抗 体 ranibizumab。这些药物或治疗通常向已患有重大视觉丧失的患者施用。
     仍然需要开发 AMD 的有效治疗， 来替换或补充目前的治疗。尤其是， 需要可以提供 早期检测、 预防或恢复视觉丧失的治疗。
     发明概述
     本发明涉及分离的抗体或其抗原结合片段， 其特异性结合人或猕猴补体 C3b 蛋 白， 其中所述抗体以低于或等于 100pM 的 KD 结合人 C3b， 并以低于或等于 200pM 的 KD 结合 猕猴 C3b。例如， 此处描述的抗体或抗原结合片段可以低于或等于 90pM、 低于或等于 80pM、 低于或等于 70pM、 低于或等于 60pM、 低于或等于 50pM、 低于或等于 40pM、 低于或等于 30pM， 并优选高达低于或等于 20、 19、 18、 17、 16、 15、 14、 13、 12 或 11pM 的 KD 结合人 C3b。优选的 是， 抗体或其抗原结合片段以低于或等于 10pM 的 Kd 结合人 C3b。例如， 抗体或其抗原结合 片段可以低于或等于 9pM、 低于或等于 8pM、 低于或等于 7pM、 低于或等于 6pM、 低于或等于 5pM、 低于或等于 4pM、 低于或等于 3pM、 低于或等于 2pM， 或高达低于或等于 1pM 的 KD 结合 C3b。此处描述的抗体或抗原结合片段可以低于或等于 250pM、 低于或等于 240pM、 低于或等 于 230pM、 低于或等于 220pM、 低于或等于 210pM、 低于或等于 200pM、 低于或等于 190pM、 低于
     或等于 180pM、 低于或等于 170pM、 低于或等于 160pM、 低于或等于 150pM、 低于或等于 140pM、 低于或等于 130pM、 低于或等于 120pM、 低于或等于 110pM、 低于或等于 100pM、 低于或等于 90pM、 低于或等于 80pM、 低于或等于 70pM、 低于或等于 60pM、 低于或等于 50pM、 低于或等于 40、 39、 38、 37、 36、 35、 34、 33、 32 或 31pM、 低于或等于 30pM、 低于或等于 20、 19、 18、 17、 16、 15、 14、 13、 12 或 11pM 并优选高达低于或等于 10、 9、 8、 7、 6、 5、 4、 3、 2 或 1pM 的 KD 结合猕猴 C3b。
     优选通过溶液平衡滴定 (SET) 测定此处描述的抗体的结合亲和力。SET 的方法为 本领域所知并在下文中进行了进一步的详细描述。
     本发明的抗体可用于抑制补体旁路。例如， 此处描述的抗体或其片段如体外溶血 测定所测定以低于或等于 70nM、 优选低于或等于 65nM、 优选低于或等于 50nM、 优选低于或 等于 40nM、 30nM 或 20nM， 并更优选低于或等于 10nM 的 IC50 抑制补体旁路。 此处描述的抗体 或其片段如体外溶血测定所测定以低于或等于 100nM、 优选低于或等于 90nM、 优选低于或 等于 80nM、 优选低于或等于 75nM， 并更优选低于或等于 70nM 的 IC50 抑制猕猴中的补体旁 路。 此处描述的抗体或其片段如体外 C3b 沉积所测定以低于或等于 30nM、 低于或等于 25nM、 低于或等于 20nM， 并优选低于或等于 10nM 的 IC50 抑制补体旁路。此处描述的抗体或其片 段可如体外 C3b 沉积所测定以低于或等于 70nM、 低于或等于 50nM、 低于或等于 40nM， 并优选 低于或等于 30nM 的 IC50 抑制猕猴中的补体旁路。
     此处描述的抗体或其片段如补体膜攻击复合体的沉积所测定以低于或等于 5nM， 优选低于或等于 4nM、 3nM、 2nM， 并更优选低于或等于 1nM 的 IC50 抑制补体旁路。此处描述 的抗体或其片段如补体膜攻击复合体的沉积所测定以低于或等于 20nM， 优选低于或等于 19nM、 18nM、 17nM、 16nM、 15nM、 14nM 或 13nM， 并更优选低于或等于 10nM 的 IC50 抑制猕猴中 的补体旁路。
     此处描述的抗体或其片段如通过产生 C3a 和 C5a 测定以低于或等于 100nM， 优选低 于或等于 90nM、 80nM、 70nM、 60nM、 50nM、 40nM、 30nM 或 20nM， 并更优选低于或等于 10nM 抑制 补体旁路。
     本发明描述的抗体或其抗原结合片段优选具有如表 12 中所示的 Fab 的结合特征。
     本发明还包括分离的抗体或其抗原结合片段， 其特异性结合人或猕猴的补体 C3b 蛋白， 并与表 1 中描述的抗体交叉竞争。
     此处描述的抗体或其抗原结合片段可以是单克隆抗体、 人或人源化抗体、 嵌合抗 体、 单链抗体、 Fab 片段、 Fv 片段、 F(ab’ )2 片段、 或 ScFv 片段、 和 / 或 IgG 同种型。
     本发明的抗体可包括这样的构架， 其中氨基酸已经替换成来自各人 VH 或 VL 种系 序列的抗体构架。
     一方面， 本发明的抗体以比所述抗体结合 C3 的亲和力高至少 1000 倍的亲和力结 合 C3b。
     本发明包括具有表 1 中抗体 9556 的重链和轻链序列的抗体或其抗原结合片段。 本 发明包括具有表 1 中抗体 9611 的重链和轻链序列的抗体或其抗原结合片段。本发明包括 具有表 1 中抗体 9612 的重链和轻链序列的抗体或其抗原结合片段。本发明还包括具有表 1 中抗体 9609 的重链和轻链序列的抗体或其抗原结合片段。本发明包括具有表 1 中抗体 9610 的重链和轻链序列的抗体或其抗原结合片段。本发明还包括具有表 1 中抗体 9674 的 重链和轻链序列的抗体或其抗原结合片段。本发明又进一步包括具有表 1 中抗体 9675 的重链和轻链序列的抗体或其抗原结合片段。本发明包括具有表 1 中抗体 9124 的重链和轻 链序列的抗体或其抗原结合片段。本发明还包括具有表 1 中抗体 9397 的重链和轻链序列 的抗体或其抗原结合片段。本发明还包括具有表 1 中抗体 9398 的重链和轻链序列的抗体 或其抗原结合片段。本发明还包括具有表 1 中抗体 9136 的重链和轻链序列的抗体或其抗 原结合片段。本发明还包括具有表 1 中抗体 9141 的重链和轻链序列的抗体或其抗原结合 片段。本发明又进一步包括具有表 1 中抗体 9373 的重链和轻链序列的抗体或其抗原结合 片段。本发明还包括具有表 1 中抗体 9423 的重链和轻链序列的抗体或其抗原结合片段。
     本发明包括具有表 1 中抗体 9556 的重链和轻链可变域序列的抗体或其抗原结合 片段。本发明包括具有表 1 中抗体 9611 的重链和轻链可变域序列的抗体或其抗原结合片 段。本发明包括具有表 1 中抗体 9612 的重链和轻链可变域序列的抗体或其抗原结合片段。 本发明还包括具有表 1 中抗体 9609 的重链和轻链可变域序列的抗体或其抗原结合片段。 本 发明包括具有表 1 中抗体 9610 的重链和轻链可变域序列的抗体或其抗原结合片段。本发 明还包括具有表 1 中抗体 9674 的重链和轻链可变域序列的抗体或其抗原结合片段。本发 明又进一步包括具有表 1 中 9675 抗体的重链和轻链可变域序列的抗体或其抗原结合片段。 本发明包括具有表 1 中 9124 抗体的重链和轻链可变域序列的抗体或其抗原结合片段。本 发明还包括具有表 1 中 9397 抗体的重链和轻链可变域序列的抗体或其抗原结合片段。本 发明还包括具有表 1 中 9398 抗体的重链和轻链可变域序列的抗体或其抗原结合片段。本 发明还包括具有表 1 中 9136 抗体的重链和轻链可变域序列的抗体或其抗原结合片段。本 发明还包括具有表 1 中 9141 抗体的重链和轻链可变域序列的抗体或其抗原结合片段。本 发明又进一步包括具有表 1 中 9373 抗体的重链和轻链可变域序列的抗体或其抗原结合片 段。本发明还包括具有表 1 中 9423 抗体的重链和轻链可变域序列的抗体或其抗原结合片 段。
     本发明还涉及分离的抗体或其抗原结合片段， 其包括选自 SEQ IDNOs ： 1、 15、 29、 43、 57、 71、 85、 99、 113、 127、 141、 155、 169 和 183 的重链 CDR1 ； 选自 SEQ ID NOs ： 2、 16、 30、 44、 58、 72、 86、 100、 114、 128、 142、 156、 170 和 184 的重链 CDR2 ； 和选自 SEQ ID NOs ： 3、 17、 31、 45、 59、 73、 87、 101、 115、 129、 143、 157、 171 和 185 的重链 CDR3， 其中所述分离的抗体或其抗原结 合片段结合补体蛋白 C3b。在其它方面， 分离的抗体或其抗原结合片段还包括选自 SEQ ID NOs ： 4、 18、 32、 46、 60、 74、 88、 102、 116、 130、 144、 158、 172 和 186 的 轻 链 CDR1 ； 选 自 SEQ ID NOs ： 5、 19、 33、 47、 61、 75、 89、 103、 117、 131、 145、 159、 173 和 187 的轻链 CDR2 ； 和选自 SEQ ID NOs ： 6、 20、 34、 48、 62、 76、 90、 104、 118、 132、 146、 160、 174 和 188 的轻链 CDR3。
     本发明还涉及分离的抗体或其抗原结合片段， 其包括选自 SEQ IDNOs ： 4、 18、 32、 46、 60、 74、 88、 102、 116、 130、 144、 158、 172 和 186 的轻链 CDR1 ； 选自 SEQ ID NOs 5、 19、 33、 47、 61、 75、 89、 103、 117、 131、 145、 159、 173 和 187 的轻链 CDR2 ； 和选自 SEQ ID NOs 6、 20、 34、 48、 62、 76、 90、 104、 118、 132、 146、 160、 174 和 188 的轻链 CDR3， 其中所述分离的抗体或其抗 原结合片段结合补体蛋白 C3b。
     本发明还涉及分离的抗体或其抗原结合片段， 其包括选自 SEQ IDNOs ： 7、 21、 35、 49、 63、 77、 91、 105、 119、 133、 147、 161、 175 和 189 的重链可变域序列， 还包括选自 SEQ ID NOs ： 8、 22、 36、 50、 64、 78、 92、 106、 120、 134、 148、 162、 176 和 190 的轻链可变域序列， 其中所 述分离的抗体或其抗原结合片段结合补体蛋白 C3b。本发明还涉及分离的抗体或其抗原结合片段， 其包括选自 SEQ IDNOs ： 8、 22、 36、 50、 64、 78、 92、 106、 120、 134、 148、 162、 176 和 190 的轻链可变域序列， 其中所述分离的抗体 或其抗原结合片段结合补体蛋白 C3b。
     本发明还涉及分离的抗体或其抗原结合片段， 其包括与选自 SEQ IDNOs ： 7、 21、 35、 49、 63、 77、 91、 105、 119、 133、 147、 161、 175 和 189 的序列具有至少 95％序列同一性的重链可 变域， 其中所述抗体结合 C3b。一方面， 分离的抗体或其抗原结合片段还包括与选自 SEQ ID NOs 8、 22、 36、 50、 64、 78、 92、 106、 120、 134、 148、 162、 176 和 190 的序列具有至少 95％序列同 一性的轻链可变域。
     本发明还涉及分离的抗体或其抗原结合片段， 其包括与选自 SEQ IDNOs 8、 22、 36、 50、 64、 78、 92、 106、 120、 134、 148、 162、 176 和 190 的序列具有至少 95％序列同一性的轻链可 变域， 其中所述抗体结合 C3b。
     本发明还进一步涉及分离的抗体或其抗原结合片段， 其包括与选自 SEQ ID NOs 9、 23、 37、 51、 65、 79、 93、 107、 121、 135、 149、 163、 177 和 191 的序列具有至少 95％序列同一性 的重链， 其中所述抗体结合 C3b。一方面， 分离的抗体或其抗原结合片段还包括与选自 SEQ ID NOs10、 24、 38、 52、 66、 80、 94、 108、 122、 136、 150、 164、 178 和 192 的序列具有至少 95％序 列同一性的轻链。 本发明进一步涉及分离的抗体或其抗原结合片段， 其包括与选自 SEQID NOs 10、 24、 38、 52、 66、 80、 94、 108、 122、 136、 150、 164、 178 和 192 的序列具有至少 95％序列同一性的 轻链， 其中所述抗体结合 C3b。
     本发明还包括药物组合物， 其包含此处描述的抗体组合物以及药学上可接受的载 体。 尤其是， 本发明包括药物组合物， 其包含表 1 的抗体或其抗原结合片段， 例如抗体 9556、 9611、 9612、 9609、 9610、 9674、 9675、 9124、 9397、 9398、 9136、 9141、 9373 或 9423。本发明还包 括药物组合物， 其包含表 1 的两种或多种抗体或其抗原结合片段的组合。
     本发明还包括分离的核酸， 其包含编码这样的多肽的序列， 所述多肽包括与选自 SEQ ID NOs ： 7、 21、 35、 49、 63、 77、 91、 105、 119、 133、 147、 161、 175 和 189 的 序 列 具 有 至 少 95％序列同一性的重链可变域。
     本发明还涉及分离的核酸， 其包含编码这样的多肽的序列， 所述多肽包括与选自 SEQ ID NOs 8、 22、 36、 50、 64、 78、 92、 106、 120、 134、 148、 162、 176 和 190 的 序 列 具 有 至 少 95％序列同一性的轻链可变域。
     一方面， 本发明还包括这样的载体， 其包括一种或多种此处描述的核酸分子。
     本发明还包括分离的宿主细胞， 其包括编码上文描述的抗体重链的重组 DNA 序 列， 和编码所述抗体轻链的第二个重组 DNA 序列， 其中所述 DNA 序列有效连接启动子， 并能 够在宿主细胞中表达。期望抗体可以是人单克隆抗体。还期望宿主细胞是非人哺乳动物细 胞。
     本发明还涉及治疗年龄相关性黄斑变性的方法， 其中所述方法包括向需要治疗的 受试者施用有效量的包含此处描述的抗体或其片段的组合物的步骤。期望受试者是人。
     本发明还提供在受试者中抑制补体旁路的方法， 其中所述方法包括向需要抑制的 受试者施用有效量的包含此处描述的抗体或其抗原结合片段的组合物的步骤。一方面， 受 试者是人。
     本发明还提供抑制 C3b 结合因子 B、 P 或 H 的方法， 其包括使 C3b 与此处描述的抗 C3b 抗体或其片段接触。
     本发明还提供抑制 C3 转变酶、 C4 转变酶和 C3b-C3b 二聚体形成的方法， 其包括使 C3b 与抗 C3b 抗体或其片段接触。
     本发明还包括分离的抗体或其抗原结合片段， 其包含与选自 SEQ IDNOs ： 1、 2、 3、 4、 5、 6、 15、 16、 17、 18、 19、 20、 29、 30、 31、 32、 33、 34、 43、 44、 45、 46、 47、 48、 57、 58、 59、 60、 61、 62、 71、 72、 73、 74、 75、 76、 85、 86、 87、 88、 89 和 90 的序列具有至少 80％、 85％、 90％， 以及高达至 少 95 ％的序列同一性的至少一个互补性决定区 (CDR) 序列， 其中所述抗体结合补体蛋白 C3b。
     本发明还包括分离的抗体或其抗原结合片段， 其包含选自 SEQ IDNOs ： 1、 2、 3、 15、 16、 17、 29、 30、 31、 43、 44、 45、 57、 58、 59、 71、 72、 73、 85、 86 和 87 的至少一个重链 CDR 序列， 其 中所述抗体结合 C3b。
     本发明还包括分离的抗体或其抗原结合片段， 其包含选自 SEQ IDNOs ： 4、 5、 6、 18、 19、 20、 32、 33、 34、 46、 47、 48、 60、 61、 62、 74、 75、 76、 88、 89 和 90 的至少一个轻链 CDR 序列， 其 中所述抗体结合 C3b。 本发明还包括分离的抗原结合多肽， 其包含选自 SEQ ID NOs ： 1、 15、 29、 43、 57、 71 和 85 的重链 CDR1 ； 选自 SEQ ID NOs ： 2、 16、 30、 44、 58、 72 和 86 的重链 CDR2 ； 和选自 SEQ ID NOs ： 3、 17、 31、 45、 59、 73 和 87 的重链 CDR3， 其中所述抗原结合多肽结合补体蛋白 C3b。
     本发明还包括抗原结合多肽， 其包含选自 SEQ ID NOs ： 4、 18、 32、 46、 60、 74 和 88 的 轻链 CDR1 ； 选自 SEQ ID NOs 5、 19、 33、 47、 61、 75 和 89 的轻链 CDR2 ； 和选自 SEQ ID NOs 6、 20、 34、 48、 62、 76 和 90 的轻链 CDR3， 其中所述抗原结合多肽结合补体蛋白 C3b。
     除了包括上文指出的重链 CDR 序列的抗原结合多肽外， 抗原结合多肽还包括选自 SEQ ID NOs ： 4、 18、 32、 46、 60、 74 和 88 的轻链 CDR1 ； 选自 SEQ ID NOs 5、 19、 33、 47、 61、 75 和 89 的轻链 CDR2 ； 和选自 SEQID NOs 6、 20、 34、 48、 62、 76 和 90 的轻链 CDR3。
     此处描述的抗体结合多肽以低于或等于 100pM， 优选低于或等于 10pM， 优选低于 或等于 2pM 的 KD 结合 C3b。此外， 优选地， 抗原结合多肽结合人和猕猴 C3b。
     本发明还包括调节 C3b 的方法， 其包括向需要调节的受试者施用有效量的抗体、 其抗原结合片段或此处描述的抗原结合多肽。
     任何上述抗体或其抗原结合片段可以是单克隆抗体或其抗原结合片段。
     定义
     除非另有定义， 此处所用的所有技术和科技术语具有本发明所属领域中普通技术 人员通常理解的相同意思。
     如此处所用的术语 “抗体” 包括完整抗体及其任何抗原结合片段 ( 即 “抗原结合部 分” ) 或单链。天然存在的 “抗体” 是包含通过二硫键相互连接的至少两条重 (H) 链和两条 轻 (L) 链的糖蛋白。每一重链包含重链可变区 ( 此处缩写为 VH) 和重链恒定区。所述重链 恒定区包含三个结构域， CH1、 CH2 和 CH3。每一轻链包含轻链可变区 ( 缩写为 VL) 和轻链恒 定区。所述轻链恒定区包含一个结构域 CL。VH 和 VL 区可进一步细分成高变区， 称为互补 决定区 (CDR)， 它们散布着称为构架区 (FR) 的更保守的区域。每一 VH 和 VL 由以下面顺序 从氨基末端到羧基末端排列的三个 CDR 和四个 FR 组成 ： FR1、 CDR1、 FR2、 CDR2、 FR3、 CDR3、
     FR4。重链和轻链的可变区含有与抗原相互作用的结合域。抗体的恒定区可介导免疫球蛋 白与宿主组织或因子， 包括免疫系统的多种细胞 ( 例如效应细胞 ) 和经典补体系统的第一 个组分 (Clq) 的结合。
     如此处所用， 术语抗体的 “抗原结合部分” 指完整抗体的一个或更多片段， 其保留 与给定抗原 ( 例如 C3b) 特异性结合的能力。可通过完整抗体的片段进行抗体的抗原结合 功能。术语抗体的 “抗原结合部分” 中包括的结合片段的实例包括 Fab 片段， 其为 VL、 VH、 CL 和 CH1 结构域组成的单价片段 ； F(ab)2 片段， 其为包含在铰链区通过二硫键连接的两个 Fab 片段的二价片段 ； 由 VH 和 CH1 结构域组成的 Fd 片段 ； 由抗体单条臂的 VL 和 VH 结构域 组成的 Fv 片段 ； 单结构域抗体 (dAb) 片段 (Ward 等， 1989Nature 341 ： 544-546)， 其由 VH 结 构域或 VL 结构域组成 ； 和分离的互补决定区 (CDR)。
     此外， 尽管 Fv 片段的两个结构域 VL 和 VH 由单独的基因编码， 但可使用重组方法， 通过人工肽接头将它们连接， 所述人工肽接头使得它们能够制备成单条蛋白质链， 其中 VL 和 VH 区域配对形成单价分子 ( 称为单链 Fv(scFv) ； 参阅例如 Bird 等， 1988 Science 242 ： 423-426 ； 和 Huston 等， 1988Proc.Natl.Acad.Sci.85 ： 5879-5883)。 此类单链抗体包括抗体 的一个或更多 “抗原结合部分” 。使用本领域技术人员已知的常规技术获得这些抗体片段， 并筛选所述片段， 以与完整抗体相同的方式使用所述片段。
     抗 原 结 合 部 分 也 可 掺 入 到 单 结 构 域 抗 体、 巨 型 抗 体 (maxibodies)、 微型抗体 (minibodies)、 胞内抗体、 双抗体、 三抗体、 四抗体、 v-NAR 和 bis-scFv( 参阅例如 Hollinger 和 Hudson， 2005， Nature Biotechnology， 23， 9， 1126-1136)。抗体的抗原结合部分可移植 到基于多肽如 III 型纤连蛋白 (Fn3) 的支架中 ( 参阅美国专利号 6,703,199， 其描述了纤连 蛋白多肽单抗体体 )。
     抗原结合部分可掺入到包含一对串联 Fv 区段 (VH-CH1-VH-CH1) 的单链分子中， 所述串联 Fv 区段与互补轻链多肽一起形成一对抗原结合区 (Zapata 等， 1995 Protein Eng.8(10) ： 1057-1062 ； 和美国专利号 5,641,870)。
     如此处所用， 术语 “亲和力” 指抗体与抗原在单个抗原位点上相互作用的强度。在 每一抗原位点中， 抗体 “臂” 的可变区与抗原在许多位点上通过弱的非共价力相互作用 ； 相 互作用越多， 亲和力越强。
     如此处所用， 术语 “亲合力” 指抗体 - 抗原复合物的总稳定性或强度的信息化量 度。其受三个主要因素控制 ： 抗体表位亲和力 ； 抗原与抗体两者的效价 ； 和相互作用部分的 结构排列。最终这些因素决定了抗体的特异性， 即特定抗原结合精确抗原表位的可能性。
     术语 “氨基酸” 指天然发生的和合成的氨基酸， 以及与天然发生的氨基酸以相似方 式起作用的氨基酸类似物和氨基酸模拟物。 天然发生的氨基酸是由遗传密码编码的那些氨 基酸， 以及稍后被例如羟脯氨酸、 γ- 羧基谷氨酸和 O- 磷酸丝氨酸修饰的那些氨基酸。 氨基 酸类似物指这样的化合物， 其与天然发生的氨基酸具有相同的基本化学结构， 即与氢结合 的 α 碳、 羧基、 氨基和 R 基团， 例如高丝氨酸、 正亮氨酸、 甲硫氨酸亚砜、 甲硫氨酸甲锍。此 类类似物具有修饰的 R 基团 ( 例如， 正亮氨酸 ) 或修饰的肽骨架， 但保留了与天然发生的氨 基酸相同的基本化学结构。 氨基酸模拟物指具有与氨基酸的一般化学结构不同结构的化合 物， 但它以与天然发生的氨基酸类似的方式起作用。
     如此处所用， 术语 “结合特异性” 指各抗体结合位点与仅一个抗原决定簇相互作用的能力。抗体的结合部位位于分子的 Fab 部分， 并从重链和轻链的高变区构建。抗体的结 合亲和力是单个抗原决定簇与抗体上单个结合部位之间反应的强度。 其为抗原决定簇与抗 体结合部位之间起作用的吸引力和排斥力的总和。
     两 个 实 体 之 间 的 特 异 性 结 合 表 示 平 衡 常 数 (KA) 为 至 少 1x107M-1、 108M-1、 109M-1、 1010M-1、 1011M-1、 1012M-1、 1013M-1 的结合。短语与抗体 ( 例如， C3b 结合抗体 ) 的 “特异性 ( 或选择性 ) 结合” 指决定近亲抗原 ( 例如人 C3b 或猕猴 C3b) 在蛋白质和其它 生物产品的异质群体中的存在的结合反应。除了上文指出的平衡常数 (KA)， 本发明的 C3b 结合抗体通常还具有约 1x10-2s-1、 1x10-3s-1、 1x10-4s-1、 1x10-5s-1 或更低的解离速率 常数 (Kd)， 并且以比其结合非特异性抗原 ( 例如 C3) 的亲和力至少 10 倍， 优选 100 倍， 或高 达 1000 倍或更高的亲和力结合 C3b。 。短语 “识别抗原的抗体” 和 “对抗原特异的抗体” 此 处可与 “特异性结合抗原的抗体” 互换使用。
     如此处所用， “neo- 表位” 或 “neo- 抗原” 可互换使用， 并且是蛋白水解切割 C3 后 C3b 上存在的蛋白质的抗原部分。这些 neo- 表位在未切割的 C3 上不容易接近。
     术语 “与黄斑变性相关的状况或病症” 指任何多种这样的状况， 其中例如因黄斑细 胞生长降低引起视网膜黄斑变性或无功能， 增加了黄斑细胞 ( 例如 RPE 细胞 ) 的死亡或重 排、 正常生物学功能的丧失， 或这些事件的组合。黄斑变性导致细胞组织结构的完整性和 / 或正常黄斑的胞外基质的缺失和 / 或黄斑细胞的功能缺失。黄斑变性相关病症的实例包括 AMD、 北卡罗来纳黄斑营养不良、 Sorsby′ s 眼底营养不良、 隐性黄斑营养不良、 模式营养不 良、 卵黄状黄斑变性、 显性玻璃疣， 和 malattia leventinese( 辐射玻璃疣 )。 该术语还包括 黄斑异常和 / 或变性之前或之后发生的黄斑外改变。因此， 术语 “黄斑变性相关病症” 还广 泛地包括改变或损坏黄斑完整性或功能的任何状况 ( 例如， RPE 或 Bruch′ s 膜的损伤 )。 例如， 该术语包括视网膜脱落、 脉络膜视网膜变性、 视网膜变性、 光感受器退化、 RPE 变性、 粘 多糖病、 视杆 - 视椎营养不良、 视椎 - 视杆营养不良和视椎变性。
     术语 “补体组分” 、 “补体蛋白” 或 “补体组分蛋白” 指参与激活补体系统的分子。经 典途径组分包括， 例如 C1q、 C1r、 C1s、 C4、 C2、 C3、 C5、 C6、 C7、 C8、 C9 和 C5b-9 复合体 ( 膜攻 击复合体 ： MAC)。旁路途径组分包括， 例如因子 B、 因子 D、 备解素、 H 和 I。
     术语 “调节” 或 “调节” 在此处互换使用， 指活性或生物学过程 ( 例如， 补体过程 ) 的上调 ( 即， 激活或刺激 ( 例如， 通过激动或加强 )) 和下调 ( 即， 抑制或阻遏 ( 例如， 通过 拮抗、 降低或抑制 ))。 “调节” 旨在描述过程的上调或下调。可通过刺激物的拮抗剂抑制通 过该刺激物上调的过程。相反地， 可通过修饰剂的激动剂抑制通过该修饰剂下调的过程。
     术语 “补体途径相关分子” 、 “补体途径分子” 和 “补体途径相关蛋白” 可互换使用， 并指在补体激活和响应激活的补体系统介导的或激活的补体系统触发的下游细胞活性中 起作用的多种分子。它们包括补体途径的起始物 ( 即， 直接或间接触发补体系统激活的分 子 )、 在补体激活过程中产生的或起作用的分子 ( 例如， 补体蛋白 / 酶， 如 C3、 C5、 C5b-9、 因 子 B、 因子 D、 MASP-1 和 MASP-2)、 补体受体或抑制剂 ( 例如， 簇蛋白、 玻连蛋白、 CR1 或 CD59)， 和激活的补体系统调节或触发的分子 ( 例如， 膜攻击复合体抑制因子、 MACIF ； 参阅例如， ugita 等， J Biochem， 106 ： 589-92， 1989)。因此， 除了此处指出的补体蛋白， 补体途径相关 分子还包括， 例如 C3/C5 转变酶调节子 (RCA)， 如补体受体类型 1( 也称为 CR1 或 CD35)、 补 体受体类型 2( 也称为 CR2 或 CD21)、 膜辅因子蛋白 (MCP 或 CD46)， 和 C4bBP ； MAC 调节子， 如玻连蛋白、 簇蛋白 ( 也称为 “SP40， 40” )、 CRP、 CD59， 和同源限制因子 (HRF) ； 免疫球蛋白链， 如 Igκ、 Igλ 或 Igγ ； C1 抑制剂 ； 和其它蛋白质， 如 CR3、 CR4(CD11b/18) 和 DAF(CD 55)。
     术语 “补体途径调节的细胞活性” 包括因以下引起的细胞损伤 ： C5b-9 攻击复合 体、 血管通透性改变、 平滑肌细胞的收缩和迁移、 T 细胞增殖、 免疫粘着、 树突状细胞、 单核细 胞、 粒细胞和血小板的聚集、 嗜中性粒细胞 (PMN) 和巨噬细胞的吞噬、 迁移和激活。
     此外， 补体途径的激活导致补体途径中副产物产生的促炎症反应的增加。与补体 途径激活相关的病症包括肾炎、 哮喘、 再灌注损伤、 血液透析、 类风湿性关节炎、 全身性红 斑狼疮、 牛皮癣、 多发性硬化症、 移植、 阿尔茨海默氏病、 aHUS、 MPGN II 或任何其它补体介 导的疾病。与黄斑变性相关的病症包括 AMD、 北卡罗来纳黄斑营养不良、 Sorsby′ s 眼底 营养不良、 隐性黄斑营养不良、 模式营养不良、 卵黄状黄斑变性、 显性玻璃疣， 和 malattia leventinese( 辐射玻璃疣 )、 黄斑异常和 / 或变性之前或之后发生的黄斑外改变、 视网膜脱 落、 脉络膜视网膜变性、 视网膜变性、 光感受器退化、 RPE 变性、 粘多糖病、 视杆 - 视椎营养不 良、 视椎 - 视杆营养不良和视椎变性粘多糖病。
     如此处所用， 术语 “受试者” 包括任何人或非人动物。
     术语 “非人动物” 包括所有的非人脊椎动物， 例如哺乳动物和非哺乳动物， 如非人 灵长类、 啮齿类、 兔、 绵羊、 狗、 猫、 马、 奶牛、 鸟、 两栖动物、 爬行动物等。 术语 “嵌合抗体” 是这样的抗体分子， 其中 (a) 恒定区或其部分被改变、 替换或交 换， 使得抗原结合位点 ( 可变区 ) 连接不同种类或改变种类的恒定区、 效应功能和 / 或物 种， 或赋予嵌合抗体新性质的完全不同的分子， 例如酶、 毒素、 激素、 生长因子、 药物等 ； 或 (b) 可变区或其部分被具有不同或改变抗原特异性的可变区改变、 替换或交换。例如， 可通 过来自人免疫球蛋白的恒定区替换小鼠恒定区来修饰小鼠抗体。由于用人恒定区进行替 换， 嵌合抗体在识别抗原中可保留其特异性， 同时与最初的小鼠抗体相比， 在人中具有降低 的抗原性。
     术语 “补体 C3b 蛋白” 或 “C3b” 互换使用， 并指不同物种中的 C3b 蛋白。例如， 人 C3b 具有 SEQ ID NO ： 197(A 链 ) 和 198(B 链 ) 中阐明的序列。 可从 Complement Technology Inc.(Tyler， TX) 获得人 C3b。如下文实施例部分阐明产生猕猴 C3b。
     术语 “保守修饰的变体” 应用到氨基酸和核酸序列。对于特定核酸序列， 保守修饰 的变体指编码相同或基本相同氨基酸序列的那些核酸， 或者其中所述核酸不编码氨基酸序 列， 则指基本相同的序列。 因为遗传密码的简并性， 大量功能相同的核酸编码任何给定的蛋 白质。例如， 密码子 GCA、 GCC、 GCG 和 GCU 均编码氨基酸丙氨酸。因此， 在每一位置上 ( 其中 密码子确定丙氨酸 )， 可将所述密码子改变成任何所述相应的密码子， 而不改变所编码的多 肽。此类核酸变异是 “沉默变异” ， 其为保守修饰变异的一种。此处编码多肽的每一核酸序 列也描述了所述核酸的每一种可能的沉默变异。 本领域技术人员将认识到可修饰核酸中的 每一密码子 ( 除了 AUG， 其通常是甲硫氨酸的唯一密码子， 和 TGG， 其通常是色氨酸的唯一密 码子 )， 以产生功能上相同的分子。因此， 在每一所述序列中暗含了编码多肽的核酸的每一 沉默变异。
     对于多肽序列， “保守修饰的变体” 包括对多肽序列的各替换、 缺失或添加， 其导致 对氨基酸用化学上类似的氨基酸进行替换。 提供功能上类似的氨基酸的保守替换表为本领 域所熟知。此类保守修饰变体除了并且不排斥本发明的多态性变体、 种间同源物和等位基
     因。 以下 8 组含有彼此为保守替换的氨基酸 ： 1) 丙氨酸 (A)、 甘氨酸 (G) ； 2) 天冬氨酸 (D)， 谷 氨酸 (E) ； 3) 天冬酰胺 (N)， 谷氨酰胺 (Q) ； 4) 精氨酸 (R)， 赖氨酸 (K) ； 5) 异亮氨酸 (I)， 亮氨 酸 (L)， 甲硫氨酸 (M)， 缬氨酸 (V) ； 6) 苯丙氨酸 (F)， 酪氨酸 (Y)， 色氨酸 (W) ； 7) 丝氨酸 (S)， 苏氨酸 (T) ； 和 8) 半胱氨酸 (C)、 甲硫氨酸 (M)( 参阅例如， Creighton， Proteins(1984))。 在一些实施方案中， 术语 “保守序列修饰” 用于指不显著影响或改变含有氨基酸序列的抗体 的结合特征的氨基酸修饰。
     术语 “交叉 - 阻断” 、 “交叉 - 阻断的” 在此处可互换使用， 表示抗体或其它结合剂 在标准的竞争性结合测定中干扰其它抗体或结合剂与 C3 结合的能力。
     可使用标准竞争结合测定法来测定抗体或其它结合剂能够干扰另一抗体或结合 分子与 C3 结合的能力或程度， 并因此是否可以被称为本发明的交叉阻断。一种合适的测定 法包括使用 Biacore 技术 ( 例如通过使用 BIAcore3000 仪器 (Biacore， Uppsala， Sweden))， 其可以使用表面等离振子共振技术测量相互作用的程度。 用于测量交叉阻断的另一测定法 使用基于 ELISA 的方法。
     术语 “表位” 表示能够特异性结合抗体的蛋白质决定簇。 表位一般由分子的化学活 性表面基团， 如氨基酸或糖侧链组成， 并一般具有特定的三维结构特征， 以及比电荷特征。 构象和非构象表位可以区分开， 因为在变性溶剂的存在下失去与前者的结合， 而不失去与 后者的结合。 如此处所用， 术语 IgG 抗体或其片段 ( 例如， Fab 片段 ) 的 “高亲和力” 指对靶抗原 具有 10-8M 或更低、 10-9M 或更低、 10-10M、 或 10-11M 或更低、 或 10-12M 或更低、 或 10-13M 或更低的 KD 的抗体。然而， “高亲和力” 结合对于其它抗体同种型可以发生变化。例如， 对 于 IgM 同种型的 “高亲和力” 结合指具有 10-7M 或更低， 或 10-8M 或更低的 KD 的抗体。一方 面， 此处描述的抗 C3b 抗体或其抗原结合片段具有低于或等于 1nM， 优选低于或等于 200pM， 更优选低于或等于 100pM， 并甚至更优选低于或等于 10pM 的 KD。
     如此处所用， 术语 “人抗体” 旨在包括具有可变区的抗体， 在所述可变区中构架和 CDR 区均来自人来源的序列。 此外， 如果抗体含有恒定区， 所述恒定区也来自此类人序列， 例 如人种系序列， 或突变形式的人种系序列。本发明的人抗体可包括不由人序列编码的氨基 酸残基 ( 例如， 通过体外随机或位点特异性诱变或通过体内体细胞突变引入的突变 )。
     术语 “人单克隆抗体” 指具有可变区的显示单一结合特异性的抗体， 在所述可变区 中构架和 CDR 区均来自人序列。在一个实施方案中， 所述人单克隆抗体由杂交瘤产生， 所述 杂交瘤包括从转基因非人动物， 例如转基因小鼠中获得的 B 细胞， 所述转基因非人动物具 有融合到无限增殖细胞中的包含人重链转基因和轻链转基因的基因组。
     “人源化” 抗体是保留非人抗体的反应性， 而在人中具有更低免疫原性的抗体。 例如这可通过保留非人 CDR 区并用它们的人类对应物替换抗体剩余部分 ( 即， 恒定区以 及可变区的构架部分 ) 来实现。参阅例如， Morrison 等， Proc.Natl.Acad.Sci.USA， 81 ： 6851-6855， 1984 ； Morrison 和 Oi， Adv.Immunol.， 44 ： 65-92， 1988 ； Verhoeyen 等， Science， 239 ： 1534-1536， 1988 ； Padlan， Molec.Immun.， 28 ： 489-498， 1991 ； 和 Padlan， Molec. Immun.， 31 ： 169-217， 1994。人工程化技术的其它实例包括， 但不限于在 US5,766,886 中公 开的 Xoma 技术。
     在两条或更多核酸或多肽序列的上下文中， 术语 “相同的” 或百分比 “同一性” 指
     相同的两条或更多序列或子序列。 当使用以下的序列比较算法或通过手工比对和视觉检查 测定， 比较并比对在比较窗内或指定区域内用于最大对应时， 如果两条序列具有特定百分 比 ( 即， 在特定区域上或当不指定时， 在全长序列上 60％同一性， 任选地 65％、 70％、 75％、 80％、 85％、 90％、 95％或 99％同一性 ) 的相同氨基酸残基或核苷酸， 那么两条序列 “基本相 同” 。任选地， 同一性存在于长度至少约 50 个核苷酸 ( 或 10 个氨基酸 ) 的区域， 或更优选 地在长度至少 100 到 500 或 1000 或更多核苷酸 ( 或 20、 50、 200 或更多氨基酸 ) 的区域。
     对于序列比较， 通常一条序列作为参考序列， 测试序列与其进行比较。 当使用序列 比较算法时， 将测试和参考序列输入计算机， 如果需要， 指定子序列坐标， 并指定序列算法 程序参数。可使用默认程序参数， 或可指定可选参数。所述序列比较算法然后基于程序参 数计算测试序列相对于参考序列的百分比序列同一性。
     如此处所用， “比较窗口”包括参考选自 20 到 600、 一般约 50 到约 200， 更一般 约 100 到约 150 的任何一定数量相邻位置的区段， 其中可在两条序列进行最佳比对后将 序列与相同数量相邻位置的参考序列进行比较。用于比较的序列比对方法为本领域所熟 知。例如通过 Smith 和 Waterman(1970)Adv.Appl.Math.2 ： 482c 的局部同源性算法， 通过 Needleman 和 Wunsch， J.Mol.Biol.48 ： 443， 1970 的同源性比对算法， 通过搜索 Pearson 和 Lipman， Proc.Nat’ l.Acad.Sci.USA 85 ： 2444， 1988 的相似性方法， 通过这些算法的计算机 化实现 (Wisconsin Genetics Software Package， Genetics Computer Group， 575 Science Dr.， Madison， WI 中的 GAP、 BESTFIT、 FASTA 和 TFASTA)， 或通过手工比对和视觉检查 ( 参 阅， 例如 Brent 等， Current Protocols in Molecular Biology， John Wiley&Sons， Inc. (Ringbou 编辑， 2003)) 进行序列最佳比对用于比较。
     适合于测定百分比序列同一性和序列相似性的算法的两个实例是 BLAST 和 BLAST 2.0 算法， 其分别描述于 Altschul 等， Nuc.Acids Res.25 ： 3389-3402， 1977 ； 和 Altschul 等， J.Mol.Biol.215 ： 403-410， 1990 中。用于进行 BLAST 分析的软件通过 National Center for BiotechnologyInformation 公开获得。该算法包括首先通过鉴定查询序列中长度为 W 的短字来鉴定高得分序列对 (HSPs)， 当在数据库序列中用相同长度的字比对时， 所述短字 匹配或满足某一正值阈值得分 T。T 称为邻近字得分阈值 (Altschul 等， 上文 )。这些初始 邻近字命中作为起始搜索的种子， 以发现含有它们的更长 HSPs。 只要可增加累积比对得分， 则沿每一序列的两个方向延伸字命中。对于核苷酸序列， 使用参数 M( 对一对匹配残基的奖 赏得分 ； 总＞ 0) 和 N( 对错配残基的罚分 ； 总＜ 0) 计算累积得分。对于氨基酸序列， 使用 得分矩阵来计算累积得分。当 ： 所述累积比对得分从其最高达到值跌落 X 量 ； 因一个或更 多负得分残基比对累积， 所述累积比对得分到达零或以下 ； 或到达任何一条序列的末端时， 停止字命中在每一方向上的延伸。BLAST 算法参数 W、 T 和 X 决定了比对的灵敏度和速度。 BLASTN 程序 ( 对于核苷酸序列 ) 使用默认字长 (W)11、 期望值 (E)10、 M ＝ 5、 N ＝ -4 和两 条链的比较。对于氨基酸序列， BLASTP 程序使用默认字长 3， 和期望值 (E)10 和 BLOSUM62 得分矩阵 ( 参阅 Henikoff 和 Henikoff， Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89 ： 10915， 1989) 比对 (B)50、 期望值 (E)10、 M ＝ 5、 N ＝ -4 和两条链的比较。
     BLAST 算法也进行两条序列之间相似性的统计学分析 ( 参阅例如， Karlin 和 Altschul， Proc.Natl.Acad.Sci.U SA 90 ： 5873-5787， 1993)。BLAST 算法提供的一种相似 性测量是最小总和概率 (P(N))， 其提供两条核苷酸或氨基酸序列之间偶然发生匹配的概率的指示。例如， 如果测试核酸与参考核酸的比较中最小总和概率低于约 0.2， 更优选低于约 0.01， 并最优选低于约 0.001， 那么认为核酸与参考序列相似。
     也可使用已经整合到 ALIGN 算法 ( 版本 2.0) 的 E.Meyers 和 W.Miller(Comput. Appl.Biosci.， 4： 11-17， 1988) 的算法， 使用 PAM120 加权残基表， 空位长度罚分 12 和空位 罚分 4 测定两条氨基酸序列之间的百分比同一性。 此外， 可使用已经整合到 GCG 软件包 ( 可 在 www.gcg.com 上获得 ) 中的 GAP 程序的 Needleman 和 Wunsch(J.Mol， Biol.48 ： 444-453， 1970) 算法， 使用 Blossom 62 矩阵或 PAM250 矩阵， 以及空位加权 16、 14、 12、 10、 8、 6或4和 长度加权 1、 2、 3、 4、 5 或 6 来测定两条氨基酸序列之间的百分比同一性。
     除了上文指出的序列同一性的百分比， 两条核酸序列或多肽基本相同的另一指示 是第一条核酸编码的多肽与针对第二条核酸编码的多肽产生的抗体免疫交叉反应， 如下文 描述。因此， 多肽通常与第二条多肽基本相同， 例如， 其中两条肽仅因保守替换而不同。两 条核酸序列基本相同的另一指示是两个分子或其互补序列在严格条件下彼此杂交， 如下文 描述。两条核酸序列基本相同的又一指示是可使用相同的引物来扩增所述序列。
     术语 “分离的抗体” 指抗体， 其基本不含具有不同抗原特异性的其它抗体 ( 例如， 特异性结合 C3b 的分离的抗体基本不含特异性结合除 C3b 外的抗原的抗体 )。 然而， 特异性 结合 C3b 的分离的抗体可对其它抗原具有交叉反应性。此外， 分离的抗体可基本不含其它 细胞物质和 / 或化学品。
     术语 “同种型” 指重链恒定区基因提供的抗体种类 ( 例如， IgM、 IgE、 IgG 如 IgG1 或 IgG4)。 同种型也包括这些种类中一种的修饰形式， 其中已经进行修饰以改变 Fc 功能， 例 如来增强或减弱效应功能或与 Fc 受体的结合。
     如此处所用， 术语 “Kassoc” 或 “Ka” 旨在指特定抗体 - 抗原相互作用的结合速率， 而如此处所用， 术语 “Kdis” 或 “Kd” 旨在指特定抗体 - 抗原相互作用的解离速率。如此处 所用， 术语 “KD” 旨在指解离常数， 其获得于 Kd 与 Ka 的比值 ( 即 Kd/Ka) 并表达为摩尔浓度 (M)。可使用本领域熟知的方法测定抗体的 KD 值。用于测定抗体 KD 的方法是通过使用表 面等离振子共振， 或使用生物传感器系统如 系统。
     如此处所用， 术语 “单克隆抗体” 或 “单克隆抗体组合物” 指单个分子组合物的抗 体分子的制剂。单克隆抗体组合物对特定表位显示单一结合特异性和亲和力。
     术语 “核酸” 此处与术语 “多核苷酸” 可互换使用， 并指单链或双链形式的脱氧核 糖核苷酸或核糖核苷酸及其聚合物。 所述术语包括含有已知核苷酸类似物或修饰的骨架残 基或键的核酸， 其为合成的、 天然发生的和非天然发生的， 其与参考核酸具有相似的结合性 质， 并且其以与参考核苷酸相似的方式进行代谢。 此类类似物的实例包括， 但不限于硫代磷 酸酯、 氨基磷酸酯、 甲基膦酸酯、 手性 - 甲基膦酸酯、 2-O- 甲基核糖核苷酸、 肽核酸 (PNA)。
     除非另有指出， 特定核酸序列也暗中包括其保守修饰的变体 ( 例如简并密码子替 换 ) 和互补序列， 以及明确指出的序列。尤其是， 如下文详细描述， 可通过产生这样的序列 完成简并密码子替换， 其中用混和碱基和 / 或脱氧肌苷残基替换一个或更多所选 ( 或全部 ) 密码子的第三个位置 (Batzer 等， Nucleic Acid Res.19 ： 5081， 1991 ； Ohtsuka 等， J.Biol. Chem.260 ： 2605-2608， 1985 ； 和 Rossolini 等， Mol.Cell.Probes 8 ： 91-98， 1994)。
     术语 “有效连接” 指两个和更多多核苷酸 ( 例如 DNA) 区段的功能关系。通常， 其 指转录调节序列与转录序列之间的功能关系。例如， 如果启动子或增强子序列刺激或调节编码序列在适当宿主细胞或其它表达系统中的转录， 那么该启动子或增强子序列有效连接 编码序列。一般地， 有效连接转录序列的启动子转录调节序列与转录序列在物理空间上邻 近， 即它们是顺式作用。然而， 一些转录调节序列， 如增强子不需要与编码序列 ( 增强子增 强其转录 ) 在物理空间上邻近或位于其附近。
     如此处所用， 术语 “优化的” 表示已经使用生产细胞或生物， 一般是真核细胞， 例如 毕赤酵母细胞、 中国仓鼠卵巢细胞 (CHO) 或人细胞中优选的密码子改变核苷酸序列， 以编 码氨基酸序列。将优化的核苷酸序列改造以完全或最大可能地保留起始核苷酸序列 ( 其也 称为 “亲本” 序列 ) 最初编码的氨基酸序列。已经改造了此处的优化序列以具有哺乳动物 细胞中优选的密码子。 然而， 此处也考虑其它真核细胞或原核细胞中这些序列的优化表达。 优化的核苷酸序列编码的氨基酸序列也称为优化的。
     术语 “多肽” 和 “蛋白质” 此处互换使用来指氨基酸残基的聚合物。所述术语应用 到氨基酸聚合物， 其中一个或更多氨基酸残基是相应天然发生氨基酸的人工化学模拟物， 还应用到天然发生的氨基酸聚合物和非天然发生的氨基酸聚合物。除非另有指出， 特定的 多肽序列也暗中包括其保守修饰的变体。
     如此处所用， 术语 “重组人抗体” 包括通过重组方法制备、 表达、 产生或分离的所有 人抗体， 如从对人免疫球蛋白基因转基因或转染色体的动物 ( 例如小鼠 ) 或从中制备的杂 交瘤中分离的抗体、 从经转化以表达人抗体的宿主细胞， 例如从转染瘤中分离的抗体、 从重 组、 组合人抗体库文中分离的抗体， 和通过任何其它手段制备、 表达、 产生或分离的抗体， 所 述手段包括将全部或部分人免疫球蛋白基因、 序列剪切成其它 DNA 序列。此类重组人抗体 具有可变区， 其中构架和 CDR 区均来自人种系免疫球蛋白序列。然而在某些实施方案中， 此 类重组人抗体可进行体外诱变 ( 或者， 当使用人 Ig 序列转基因的动物时， 进行体内体细胞 诱变 )， 因此重组抗体的 VH 和 VL 区的氨基酸序列是当来自并与人种系 VH 和 VL 序列相关时 可能在体内人抗体种系所有组成成分中不天然存在的序列。
     术语 “重组宿主细胞” ( 或简单地 “宿主细胞” ) 指已经向其中引入重组表达载体 的细胞。应理解此类术语不仅旨在指特定受试者细胞， 还指此细胞的后代。因为某些修饰 可能因突变或环境影响而在后代中出现， 所以该后代实际上可能与亲本细胞不相同， 但仍 然包括在此处所用术语 “宿主细胞” 的范围内。
     术语 “受试者” 包括人和非人动物。非人动物包括所有的脊椎动物， 例如哺乳动物 和非哺乳动物， 如非人灵长类、 羊、 狗、 奶牛、 鸡、 两栖动物和爬行动物。 除了指出时， 术语 “患 者” 或 “受试者” 此处可互换使用。
     术语 “治疗” 包括施用组合物或抗体， 以防止或延迟症状、 并发症或疾病 ( 例如 AMD) 的生物化学指征的开始， 缓解症状或阻止或抑制疾病、 状况或病症的进一步发展。 治疗 可以是预防性的 ( 以防止或延迟疾病开始， 或防止其临床或亚临床症状的表现 ) 或在疾病 表现后治疗性抑制或缓解症状。
     术语 “载体” 旨在指能够转运已经连接另一多核苷酸的多核苷酸分子。一种类型 的载体是 “质粒” ， 其指已经连接额外 DNA 片段的环形双链 DNA 环。另一类型的载体是病毒 载体， 如腺伴随病毒载体 (AAV 或 AAV2)， 其中额外的 DNA 区段可连接到病毒基因组内。某 些载体能够在其中引入载体的宿主细胞中进行自主复制 ( 例如， 具有细菌复制起点的细菌 载体和游离型哺乳动物载体 )。其它载体 ( 例如非游离型哺乳动物载体 ) 可在引入宿主细胞后整合到宿主细胞的基因组中， 并由此与所述宿主基因组一起复制。 此外， 某些载体能够 指导它们有效连接的基因的表达。此类载体此处称为 “重组表达载体” ( 或简单地， “表达 载体” )。一般而言， 在重组 DNA 技术中有用的表达载体经常是质粒的形式。在本说明书中， “质粒” 和 “载体” 可互换使用， 因为质粒是载体的最常用形式。然而， 本发明旨在包括此类 其它形式的表达载体， 如病毒载体 ( 例如， 复制缺陷型逆转录病毒、 腺病毒和腺伴随病毒 )， 其起等同的功能。
     如此处所用， 术语 “C3b 活性” 表示 C3b 产生下游的补体旁路的活性， 包括但不限于 例如 C3 转变酶的活性， C5 转变酶的活性。可使用此处描述的测定， 如但不限于溶血测定， 测定 C3a 和 C5a 产生的测定、 C3b 沉积测定， 和膜攻击复合体 (MAC) 沉积测定来测定 C3b 活 性。如此处所用， “C3b 活性的改变” 或 “C3b 活性的调节” 指通过一种或多种此处描述的测 定法测定 C3b 活性， 其中 C3b 活性相对于相关对照增加或降低至少 10％。 例如， 当存在抗体 或片段的情况下 C3b 活性相对于缺少抗体或片段情况下 C3b 的活性降低或增加至少 10％ 时， 可以说本发明的抗体或抗原结合片段调节 C3b 活性。
     如此处所用， 术语 “cyno” 或 “猕猴” 指猕猴 (Macaca fascicularis)。
     附图简述 图 1 显示， C3b 抗体以相对于 C3 高至少 1000 倍的选择性结合 C3b。
     图 2 显示了在 10％人或猕猴血清中抗 C3b 抗体抑制溶血的能力的实例。
     图 3 显示了 C3b 抗体抑制 C3b 产生为 C3 分解产物的能力的实例。
     图 4 显示了证明 C3b 抗体抑制 MAC 沉积的能力的示例性数据。
     图 5 显示， C3b 抗体通过抑制产生 C3a 和 C5a 阻断旁路途径驱动的补体激活。
     图 6A 显示了 SDS-PAGE 凝胶， 其显示了 tick-over 转变酶活性的抑制。图 6B 显示 了 6A 凝胶中对 C3b 产生的抑制的定量。图 6C 显示了抗 C3b 抗体抑制预形成的 C3 转变酶 活性。
     图 7 显示抗体 C3b 抗体体外抑制 C5 转化酶活性。
     图 8A 显示了通过 C3b 抗体抑制因子 B 结合 C3b。图 8B 显示了通过 C3b 抗体抑制 因子 P 结合 C3b。图 8C 显示了通过 C3b 抗体抑制因子 H 结合 C3b。图 8D 显示了通过 C3b 抗体抑制 C3b-C3b 二聚体形成。
     图 9 显示了针对 C3d 的抗体交叉反应性测定的结果。
     图 10 显示了针对 C5 的抗体交叉反应性测定的结果。
     图 11 显示了测定 C3b 抗体是否结合 i C3b 或 C3c 的结合测定的结果。
     图 12 显示了物种交叉反应性研究的结果。图 12A 显示了大鼠交叉反应性。图 12B 显示了兔交叉反应性。图 12C 显示了猪交叉反应性。图 12D 显示了小鼠交叉反应性。图 12E 显示了豚鼠交叉反应性。图 12F 显示了狗交叉反应性。
     发明详述
     本发明部分基于这样抗体分子的发现， 所述抗体分子特异性结合人和猕猴 C3b。 本 发明涉及全长 IgG 形式的抗体 ( 参阅例如， 抗体 9556、 9611、 9612、 9609、 9610、 9674 和 9675) 以及其抗原结合片段， 如 Fab 片段 ( 例如， 参阅抗体 9124、 9397、 9398、 9136、 9141、 9373 和 9423)。
     因此， 本发明提供特异性结合补体 C3b 蛋白 ( 例如， 人 C3b， 猕猴 C3b) 的抗体、 药物
     组合物、 生产方法和使用此类抗体和组合物的方法。
     C3b 抗体
     本发明提供特异性结合 C3b( 例如， 人 C3b， 猕猴 C3b) 的抗体。 在一些实施方案中， 本发明提供特异性结合人和猕猴 C3b 的抗体。本发明的抗体包括， 但不限于如实施例中所 述分离的人单克隆抗体。
     本发明提供特异性结合 C3b 蛋白质 ( 例如， 人和 / 或猕猴 C3b) 的抗体， 所述抗体包 含具有 SEQ ID NO ： 7、 21、 35、 49、 63、 77、 91、 105、 119、 133、 147、 161、 175 和 189 的氨基酸序列 的 VH 结构域。本发明还提供特异性结合 C3b 蛋白质 ( 例如， 人和 / 或猕猴 C3b) 的抗体， 所 述抗体包含具有下文表 1 中列出的任何一个 VH CDRs 的氨基酸序列的 VH CDR。具体而言， 本发明提供特异性结合 C3b 蛋白质 ( 例如， 人和 / 或猕猴 C3b) 的抗体， 所述抗体包含 ( 或 者， 组成为 ) 具有下文表 1 中列出的任何一个 VH CDRs 的氨基酸序列的一个、 两个、 三个、 四 个、 五个或更多 VH CDRs。
     本发明提供特异性结合 C3b 蛋白质 ( 例如， 人和 / 或猕猴 C3b) 的抗体， 所述抗体包 含具有 SEQ ID NO ： 8、 22、 36、 50、 64、 78、 92、 106、 120、 134、 148、 162、 176 和 190 的氨基酸序列 的 VL 结构域。本发明还提供特异性结合 C3b 蛋白质 ( 例如， 人和 / 或猕猴 C3b) 的抗体， 所 述抗体包含具有下文表 1 中列出的任何一个 VL CDRs 的氨基酸序列的 VL CDR。具体而言， 本发明提供特异性结合 C3b 蛋白质 ( 例如， 人和 / 或猕猴 C3b) 的抗体， 所述抗体包含 ( 或 者， 组成为 ) 具有下文表 1 中列出的任何一个 VL CDRs 的氨基酸序列的一个、 两个、 三个或 更多 VL CDRs。
     本发明的其它抗体包括已经突变的氨基酸， 其在 CDR 区中仍然与表 1 所述序列中 描述的 CDR 区具有至少百分之 60、 70、 80、 85、 90 或 95 的同一性。在一些实施方案中， 其包 括突变氨基酸序列， 其中当与表 1 所述序列中描述的 CDR 区比较时 CDR 区中不超过 1、 2、 3、 4 或 5 个氨基酸已经发生突变。
     本发明还提供编码特异性结合 C3b 蛋白质 ( 例如， 人和 / 或猕猴 C3b) 的抗体的 VH、 VL、 全长重链和全长轻链的核酸序列。可优化此类核酸序列用于在哺乳动物细胞中表 达 ( 例如， 表 1 显示了抗体 9556、 9611、 9612、 9609、 9610、 9674 和 9675， 以及 Fab 片段 9124、 9397、 9398、 9136、 9141、 9373 和 9423 的重链和轻链的优化核酸序列 )。
     表 1. 本发明 C3b 抗体、 Fabs 与 C3b 蛋白质的实例
     表1
    
    
    
    
    
    
    
    
    
    
    
    
    
    
    
    
    
    
    
    
    
    
    
    
    
    
    
    本发明的其它抗体包括其中氨基酸或编码氨基酸的核酸已经发生突变， 但与表 1 中描述的序列仍然具有至少百分之 60、 65、 70、 75、 80、 85、 90 或 95 的同一性的那些抗体。在 一些实施方案中， 其包括突变氨基酸序列， 其中当与表 1 所述序列中描述的序列中的可变 区比较时在可变区内不超过 1、 2、 3、 4 或 5 个氨基酸已经发生突变， 但却保留基本相同的治 疗活性。
     因为这些抗体中每一抗体均可结合 C3b， 所以可以 “混和并匹配” VH、 VL、 全长轻链 和全长重链序列 ( 氨基酸序列和编码所述氨基酸序列的核苷酸序列 )， 以产生本发明的其 它 C3b 结合抗体。可使用本领域已知的结合测定法 ( 例如， ELISA， 和实施例部分中描述的 其它测定法 ) 测试此类 “混和并匹配的” C3b 结合抗体。当这些链进行混合和匹配时， 应该 用结构相似的 VH 序列替换来自特定 VH/VL 配对的 VH 序列。 同样， 应该用结构相似的全长重 链序列替换来自特定全长重链 / 全长轻链配对的全长重链序列。同样， 应该用结构相似的 VL 序列替换来自特定 VH/VL 配对的 VL 序列。同样应该用结构相似的全长轻链序列替换来 自特定全长重链 / 全长轻链配对的全长轻链序列。因此， 一方面， 本发明提供分离的单克隆 抗体或其抗原结合区， 其具有 ： 包含选自 SEQ ID NO ： 7、 21、 35、 49、 63、 77、 91、 105、 119、 133、 147、 161、 175 和 189 的氨基酸序列的重链可变域 ； 和包含选自 SEQ ID NO ： 8、 22、 36、 50、 64、 78、 92、 106、 120、 134、 148、 162、 176 和 190 的氨基酸序列的轻链可变域 ； 其中所述抗体特异 性结合 C3b( 例如， 人和 / 或猕猴 C3b)。
     另一方面， 本发明提供 (i) 分离的单克隆抗体， 其具有 ： 包含选自 SEQID NOs ： 9、 23、 37、 51、 65、 79、 93、 107、 121、 135、 149、 163、 177 和 191 的氨基酸序列的全长重链， 已经优 化所述氨基酸序列用于在哺乳动物细胞中表达 ； 和包含选自 SEQ ID NOs ： 10、 24、 38、 52、 66、 80、 94、 108、 122、 136、 150、 164、 178 和 192 的氨基酸序列的全长轻链， 已经优化所述氨基酸
     序列用于在哺乳动物细胞中表达 ； 或 (ii) 包含其抗原结合部分的功能蛋白质。
     另一方面， 本发明提供 C3b 结合抗体， 其包含如表 1 中所述的重链和轻链 CDR1s、 CDR2s 和 CDR3s， 或其组合。 所述抗体的 VH CDR1s 的氨基酸序列示于 SEQ ID NOs ： 1、 15、 29、 43、 57、 71、 85、 99、 113、 127、 141、 155、 169 和 183 中。所述抗体的 VH CDR2s 的氨基酸序列示 于 SEQID NOs ： 2、 16、 30、 44、 58、 72、 86、 100、 114、 128、 142、 156、 170 和 184 中。 所述抗体的 VH CDR3s 的氨基酸序列示于 SEQ ID NOs ： 3、 17、 31、 45、 59、 73、 87、 101、 115、 129、 143、 157、 171 和 185 中。所述抗体的 VL CDR1s 的氨基酸序列示于 SEQ ID NOs ： 4、 18、 32、 46、 60、 74、 88、 102、 116、 130、 144、 158、 172 和 186 中。 所述抗体的 VL CDR2s 的氨基酸序列示于 SEQ ID NOs ： 5、 19、 33、 47、 61、 75、 89、 103、 117、 131、 145、 159、 173 和 187 中。 所述抗体的 VL CDR3s 的氨基 酸序列示于 SEQ ID NOs ： 6、 20、 34、 48、 62、 76、 90、 104、 118、 132、 146、 160、 174 和 188 中。 使用 Kabat 系统描绘 CDR 区 (Kabat， E.A.， 等， 1991Sequences of Proteins of Immunological Interest， 第五版， U.S.Departmentof Health and Human Services， NIH 公开号 91-3242)。
     如果这些抗体中的每一抗体均可结合 C3b 并且主要通过 CDR1、 2 和 3 区提供抗原 结合特异性， VH CDR1、 2 和 3 序列和 VL CDR1、 2 和 3 序列就可进行 “混和并匹配” ( 即， 可 将来自不同抗体的 CDRs 进行混和并匹配， 尽管每一抗体优选含有 VH CDR1、 2 和 3 以及 VL CDR1、 2 和 3， 以产生本发明的其它 C3b 结合分子 )。 可使用本领域已知的结合测定法和实施 例中描述的那些方法 ( 例如 ELISA) 来测试此类 “混和并匹配的” C3b 结合抗体。当 VH CDR 序列进行混和并匹配时， 应该用结构相似的 CDR 序列替换来自特定 VH 序列的 CDR1、 CDR2 和 / 或 CDR3。同样， 当 VL CDR 序列进行混和并匹配时， 应该用结构相似的 CDR 序列替换来自 特定 VL 序列的 CDR1、 CDR2 和 / 或 CDR3 序列。对本领域普通技术人员显而易见的是可用来 自此处对本发明单克隆抗体所示的 CDR 序列的结构相似的序列替换一个或更多 VH 和 / 或 VL CDR 区来产生新的 VH 和 VL 序列。 在一个实施方案中， 除了上述的， 此处描述的抗体的抗 原结合片段可包含 VHCDR1、 2 和 3， 或 VL CDR 1、 2 和 3， 其中所述片段作为单个可变域结合 C3b。
     因此， 本发明提供分离的单克隆抗体或其抗原结合区， 其包含 ： 包含选自 SEQ ID NOs ： 1、 15、 29、 43、 57、 71、 85、 99、 113、 127、 141、 155、 169 和 183 的氨基酸序列的重链可变区 CDR1 ； 包含选自 SEQ ID NOs ： 2、 16、 30、 44、 58、 72、 86、 100、 114、 128、 142、 156、 170 和 184 的氨 基酸序列的重链可变区 CDR2 ； 包含选自 SEQ ID NOs ： 3、 17、 31、 45、 59、 73、 87、 101、 115、 129、 143、 157、 171 和 185 的氨基酸序列的重链可变区 CDR3 ； 包含选自 SEQ ID NOs ： 4、 18、 32、 46、 60、 74、 88、 102、 116、 130、 144、 158、 172 和 186 的氨基酸序列的轻链可变区 CDR1 ； 包含选自 SEQ ID NOs ： 5、 19、 33、 47、 61、 75、 89、 103、 117、 131、 145、 159、 173 和 187 的氨基酸序列的轻 链可变区 CDR2 ； 包含选自 SEQ ID NOs ： 6、 20、 34、 48、 62、 76、 90、 104、 118、 132、 146、 160、 174 和 188 的氨基酸序列的轻链可变区 CDR3 ； 其中所述抗体特异性结合 C3b。
     本发明包括具有表 1 中抗体 9556 的重链和轻链序列的抗体或其抗原结合片段。 本 发明包括具有表 1 中抗体 9611 的重链和轻链序列的抗体或其抗原结合片段。本发明包括 具有表 1 中抗体 9612 的重链和轻链序列的抗体或其抗原结合片段。本发明还包括具有表 1 中抗体 9609 的重链和轻链序列的抗体或其抗原结合片段。本发明包括具有表 1 中抗体 9610 的重链和轻链序列的抗体或其抗原结合片段。本发明还包括具有表 1 中抗体 9674 的 重链和轻链序列的抗体或其抗原结合片段。本发明又进一步包括具有表 1 中 9675 抗体的重链和轻链序列的抗体或其抗原结合片段。本发明包括具有表 1 中 9124 抗体的重链和轻 链序列的抗体或其抗原结合片段。本发明还包括具有表 1 中 9397 抗体的重链和轻链序列 的抗体或其抗原结合片段。本发明还包括具有表 1 中 9398 抗体的重链和轻链序列的抗体 或其抗原结合片段。本发明还包括具有表 1 中 9136 抗体的重链和轻链序列的抗体或其抗 原结合片段。本发明还包括具有表 1 中 9141 抗体的重链和轻链序列的抗体或其抗原结合 片段。本发明又进一步包括具有表 1 中 9373 抗体的重链和轻链序列的抗体或其抗原结合 片段。本发明还包括具有表 1 中 9423 抗体的重链和轻链序列的抗体或其抗原结合片段。
     在特定实施方案中， 特异性结合 C3b 的抗体包含 SEQ ID NO ： 1 的重链可变区 CDR1 ； SEQ ID NO ： 2 的重链可变区 CDR2 ； SEQ ID NO ： 3 的重链可变区 CDR3 ； SEQ ID NO ： 4 的轻链 可变区 CDR1 ； SEQ ID NO ： 5 的轻链可变区 CDR2 ； 和 SEQ ID NO ： 6 的轻链可变区 CDR3。在另 一特定实施方案中， 特异性结合 C3b 的抗体包含 SEQ ID NO ： 15 的重链可变区 CDR1 ； SEQ ID NO ： 16 的重链可变区 CDR2 ； SEQ ID NO ： 17 的重链可变区 CDR3 ； SEQ ID NO ： 18 的轻链可变 区 CDR1 ； SEQ ID NO ： 19 的轻链可变区 CDR2 ； 和 SEQ ID NO ： 20 的轻链可变区 CDR3。
     在另一特定实施方案中， 特异性结合 C3b 的抗体包含 SEQ ID NO ： 29 的重链可变区 CDR1 ； SEQ ID NO ： 30 的重链可变区 CDR2 ； SEQ ID NO ： 31 的重链可变区 CDR3 ； SEQ ID NO ： 32 的轻链可变区 CDR1 ； SEQ ID NO ： 33 的轻链可变区 CDR2 ； 和 SEQ ID NO ： 34 的轻链可变区 CDR3。在另一特定实施方案中， 特异性结合 C3b 的抗体包含 SEQ ID NO ： 43 的重链可变区 CDR1 ； SEQ ID NO ： 44 的重链可变区 CDR2 ； SEQ ID NO ： 45 的重链可变区 CDR3 ； SEQ ID NO ： 46 的轻链可变区 CDR1 ； SEQ ID NO ： 47 的轻链可变区 CDR2 ； 和 SEQ ID NO ： 48 的轻链可变区 CDR3。
     在另一特定实施方案中， 特异性结合 C3b 的抗体包含 SEQ ID NO ： 57 的重链可变区 CDR1 ； SEQ ID NO ： 58 的重链可变区 CDR2 ； SEQ ID NO ： 59 的重链可变区 CDR3 ； SEQ ID NO ： 60 的轻链可变区 CDR1 ； SEQ ID NO ： 61 的轻链可变区 CDR2 ； 和 SEQ ID NO ： 62 的轻链可变区 CDR3。在另一特定实施方案中， 特异性结合 C3b 的抗体包含 SEQ ID NO ： 71 的重链可变区 CDR1 ； SEQ ID NO ： 72 的重链可变区 CDR2 ； SEQ ID NO ： 73 的重链可变区 CDR3 ； SEQ ID NO ： 74 的轻链可变区 CDR1 ； SEQ ID NO ： 75 的轻链可变区 CDR2 ； 和 SEQ ID NO ： 76 的轻链可变区 CDR3。
     在另一特定实施方案中， 特异性结合 C3b 的抗体包含 SEQ ID NO ： 85 的重链可变区 CDR1 ； SEQ ID NO ： 86 的重链可变区 CDR2 ； SEQ ID NO ： 87 的重链可变区 CDR3 ； SEQ ID NO ： 88 的轻链可变区 CDR1 ； SEQ ID NO ： 89 的轻链可变区 CDR2 ； 和 SEQ ID NO ： 90 的轻链可变区 CDR3。
     在某些实施方案中， 特异性结合 C3b 的抗体是表 1 中描述的抗体。 在优选实施方案 中， 结合 C3b 的抗体是 9556。在其它优选实施方案中， 结合 C3b 的抗体是 9610。在其它优 选实施方案中， 结合 C3b 的抗体是 9674。在其它优选实施方案中， 结合 C3b 的抗体是 9675。 在又一其它优选实施方案中， 结合 C3b 的抗体是 9609。
     如此处所用， 人抗体包含重链或轻链可变区或全长重链或轻链， 其 “产自” 或 “来 自” 特定种系序列， 如果抗体的可变区或全长链获自使用人种系免疫球蛋白基因的系统的 话。 此类系统包括用目的抗原免疫携带人免疫球蛋白基因的转基因小鼠或利用目的抗原筛 选在噬菌体上展示的人免疫球蛋白基因文库。 例如可通过比较人抗体的氨基酸序列与人种系免疫球蛋白的氨基酸序列并选择与人抗体的序列在序列上最相近 ( 即， 最高％同一性 ) 的人种系免疫球蛋白序列来鉴定 “产自” 或 “来自” 人种系免疫球蛋白序列的人抗体。 “产 自” 或 “来自” 特定人种系免疫球蛋白序列的人抗体可含有与种系序列相比例如因天然发 生的体细胞突变或刻意引入定点突变的氨基酸差异。然而， 在 VH 或 VL 构架区， 所选人抗体 在氨基酸序列上通常与人种系免疫球蛋白基因编码的氨基酸序列具有至少 90％的同一性， 并含有氨基酸残基， 当与其它物种的种系免疫球蛋白氨基酸序列 ( 例如， 鼠类种系序列 ) 比 较时， 其将人抗体鉴定为人的。 在某些情况下， 人抗体在氨基酸序列上与种系免疫球蛋白基 因编码的氨基酸序列具有至少 60％、 70％、 80％、 90％或至少 95％， 或甚至至少 96％、 97％、 98％或 99％的同一性。通常， 重组人抗体与人种系免疫球蛋白基因编码的氨基酸序列在 VH 或 VL 构架区具有不超过 10 个氨基酸的差异。在某些情况下， 人抗体与种系免疫球蛋白基 因编码的氨基酸序列具有不超过 5 个， 或甚至不超过 4、 3、 2 或 1 个氨基酸的差异。人种系 免疫球蛋白基因的实例包括， 但不限于下文描述的可变域种系片段以及 DP47 和 DPK9。
     同源抗体
     在另一实施方案中， 本发明提供包含与表 1 所述序列同源的氨基酸序列的抗体或 其抗原结合片段， 并且所述抗体结合 C3b 蛋白质 ( 例如， 人和 / 或猕猴 C3b)， 并保留表 1 所 述那些抗体的期望功能性质。
     例如， 本发明提供包含重链可变域和轻链可变域的分离的单克隆抗体 ( 或其功能 抗原结合片段 )， 其中所述重链可变域包含与选自 SEQ ID NO ： 7、 21、 35、 49、 63、 77、 91、 105、 119、 133、 147、 161、 175 和 189 的氨基酸序列具有至少 80％、 至少 90％或至少 95％同一性的 氨基酸序列 ； 所述轻链可变域包含与选自 SEQ ID NO ： 8、 22、 36、 50、 64、 78、 92、 106、 120、 134、 148、 162、 176 和 190 的氨基酸序列具有至少 80％、 至少 90％或至少 95％同一性的氨基酸 序列 ； 所述抗体特异性结合 C3b( 例如， 人和 / 或猕猴 C3b)， 并且所述抗体在溶血测定中可 以抑制红细胞溶解。在特定实例中， 此类抗体在 10％人或猕猴血清的溶血测定中具有低于 50nM 的 IC50 值。
     在其它实施方案中， VH 和 / 或 VL 氨基酸序列可以与表 1 中阐明的序列具有 50％、 60％、 70％、 80％、 90％、 95％、 96％、 97％、 98％或 99％的同一性。在其它实施方案中， VH 和 / 或 VL 氨基酸序列可以相同， 只是在不超过 1、 2、 3、 4 或 5 个氨基酸位置上具有氨基酸替换。 可通过诱变 ( 例如定点或 PCR 介导诱变 ) 分别编码 SEQ ID NO ： 7、 21、 35、 49、 63、 77、 91、 105、 119、 133、 147、 161、 175、 189、 8、 22、 36、 50、 64、 78、 92、 106、 120、 134、 148、 162、 176 和 190 的核 酸分子来获得这样的抗体， 所述抗体具有与表 1 所述的那些抗体的 VH 和 VL 区具有高 ( 即， 80％或更高 ) 同一性的 VH 和 VL 区， 然后使用此处所述的功能测定法测试所编码的经改变 的抗体保留的功能。
     在其它实施方案中， 全长重链和 / 或全长轻链氨基酸序列与表 1 中阐明的序列具 有 50％、 60％、 70％、 80％、 90％、 95％、 96％、 97％、 98％或 99％的同一性。可通过诱变 ( 例 如定点或 PCR 介导的诱变 ) 分别编码此类多肽的核酸分子来获得这样的抗体， 其具有分别 与 SEQ ID NOs ： 9、 23、 37、 51、 65、 79、 93、 107、 121、 135、 149、 163、 177 和 191 任何一个的全长 重链和 SEQ ID NOs ： 10、 24、 38、 52、 66、 80、 94、 108、 122、 136、 150、 164、 178 和 192 任何一个的 全长轻链具有高 ( 即， 80％或更高 ) 同一性的全长重链和全长轻链， 然后使用此处所述的功 能测定法测试编码的经改变抗体保留的功能。在其它实施方案中， 全长重链和 / 或全长轻链核苷酸序列与上文阐明的序列具有 60％、 70％、 80％、 90％、 95％、 96％、 97％、 98％或 99％的同一性。
     在其它实施方案中， 重链和 / 或轻链核苷酸序列的可变区与上文阐明的序列具有 60％、 70％、 80％、 90％、 95％、 96％、 97％、 98％或 99％的同一性。
     如此处所用， 两条序列之间的百分比同一性是所述序列共有的相同位置数量的函 数 ( 即， ％同一性等于相同位置的数量 / 位置总数 x100)， 其中考虑空位数量和每一空位长 度， 需要引入所述空位用于两条序列的最佳比对。 如下文非限制性实施例所述， 可使用数学 算法完成两条序列之间序列的比较和百分比同一性的确定。
     此外或备选地， 本发明的蛋白质序列可进一步用作 “查询序列” 以针对公共数据库 进行搜索， 例如来鉴定相关序列。 例如， 可使用 Altschul 等， 1990 J.Mol.Biol.215 ： 403-10 的 BLAST 程序 ( 版本 2.0) 进行此类搜索。
     具有保守修饰的抗体
     在某些实施方案中， 本发明的抗体具有包含 CDR1、 CDR2 和 CDR3 序列的重链可变 区和包含 CDR1、 CDR2 和 CDR3 序列的轻链可变区， 其中一个或更多这些 CDR 序列具有基于 此处所述抗体的特定氨基酸序列或其保守修饰， 并且其中所述抗体保留本发明 C3b 结合抗 体的期望功能性质。因此， 本发明提供分离的单克隆抗体， 或其功能抗原结合片段， 其由包 含 CDR1、 CDR2 和 CDR3 序列的重链可变区和包含 CDR1、 CDR2 和 CDR3 序列的轻链可变区组 成， 其中 ： 所述重链可变区 CDR1 氨基酸序列选自 SEQID NOs ： 1、 15、 29、 43、 57、 71、 85、 99、 113、 127、 141、 155、 169 和 183， 及其保守修饰 ； 所述重链可变区 CDR2 氨基酸序列选自 SEQ ID NOs ： 2、 16、 30、 44、 58、 72、 86、 100、 114、 128、 142、 156、 170 和 184， 及其保守修饰 ； 所述重链可 变区 CDR3 氨基酸序列选自 SEQ ID NOs ： 3、 17、 31、 45、 59、 73、 87、 101、 115、 129、 143、 157、 171 和 185， 及其保守修饰 ； 所述轻链可变区 CDR1 氨基酸序列选自 SEQ ID NOs ： 4、 18、 32、 46、 60、 74、 88、 102、 116、 130、 144、 158、 172 和 186， 及其保守修饰 ； 所述轻链可变区 CDR2 氨基酸 序列选自 SEQ ID NOs ： 5、 19、 33、 47、 61、 75、 89、 103、 117、 131、 145、 159、 173 和 187， 及其保守 修饰 ； 所述轻链可变区 CDR3 氨基酸序列选自 SEQ ID NOs ： 6、 20、 34、 48、 62、 76、 90、 104、 118、 132、 146、 160、 174 和 188， 及其保守修饰 ； 所述抗体或其抗原结合片段特异性结合 C3b， 并在 如此处所述溶血测定中抑制红细胞溶解。
     在其它实施方案中， 优化用于在哺乳动物细胞中表达的本发明的抗体具有全长重 链序列和全长轻链序列， 其中一个或更多这些序列具有基于此处所述抗体的特定氨基酸序 列或其保守修饰， 并且其中所述抗体保留本发明 C3b 结合抗体的期望功能性质。因此， 本发 明提供优化用于在哺乳动物细胞中表达的分离的单克隆抗体， 其由全长重链和全长轻链组 成， 其中 ： 所述全长重链具有选自 SEQ ID NOs ： 9、 23、 37、 51、 65、 79、 93、 107、 121、 135、 149、 163、 177 和 191 的氨基酸序列， 及其保守修饰 ； 并且所述全长轻链具有选自 SEQ ID NOs ： 10、 24、 38、 52、 66、 80、 94、 108、 122、 136、 150、 164、 178 和 192 的氨基酸序列， 及其保守修饰 ； 所述 抗体特异性结合 C3b( 例如， 人和 / 或猕猴 C3b) ； 并且所述抗体在如此处所述的溶血测定中 抑制红细胞溶解。在特定实施方案中， 当使用用 100pM 人 C5 重构的人 C5 耗尽的血清时， 此 类抗体在 10％人或猕猴血清的溶血测定中具有低于 50nM 的 IC50 值。
     结合相同表位的抗体
     本发明提供与表 1 所述 C3b 结合抗体结合相同表位的抗体。 因此可基于它们在 C3b结合测定中与本发明其它抗体交叉竞争 ( 例如以统计学上显著的方式竞争性抑制结合 ) 的 能力鉴定额外的抗体。测试抗体抑制本发明抗体与 C3b 蛋白质 ( 例如， 人和 / 或猕猴 C3b) 结合的能力显示所述测试抗体可与该抗体竞争结合 C3b ； 根据非限制性理论， 该抗体和与 其竞争的抗体结合 C3b 上相同或相关 ( 例如， 结构上相似或空间上接近 ) 的表位。在某一 实施方案中， 与本发明抗体结合 C3b 上相同表位的抗体是人单克隆抗体。可如此处所述制 备并分离这种人单克隆抗体。 如此处所用， 当竞争抗体浓度高于竞争抗体的 106xKD， 竞争抗 体抑制本发明抗体结合 C3b 高于 50％时， 抗体 “竞争” 结合。
     改造和修饰的抗体
     还可使用具有一个或更多此处所示 VH 和 / 或 VL 序列的抗体作为起始材料制备本 发明的抗体， 以改造修饰的抗体， 所述修饰的抗体可以具有从起始抗体改变的性质。 可通过 修饰一个或两个可变区 ( 即， VH 和 / 或 VL)， 例如一个或更多 CDR 区和 / 或一个或更多构架 区内的一个或更多残基来改造抗体。此外或备选地， 可通过在恒定区内修饰残基来改造抗 体， 例如来改变所述抗体的效应功能。
     可以进行的一种类型的可变区改造是 CDR 移植。抗体主要通过定位在六个重链和 轻链互补决定区 (CDRs) 中的氨基酸残基与靶抗原相互作用。为此， CDRs 内的氨基酸序列 在各抗体之间比 CDRs 外的序列更多样化。因为 CDR 序列负责多数抗体 - 抗原相互作用， 所以通过构建表达载体来表达模拟特定天然发生抗体的性质的重组抗体是可能的， 所述表 达载体包括移植到具有不同性质的不同抗体的构架序列上的来自特定天然发生抗体的 CDR 序列 ( 参阅例如， Riechmann， L. 等， 1998 Nature 332 ： 323-327 ； Jones， P. 等， 1986 Nature 321 ： 522-525 ； Queen， C. 等， 1989Proc.Natl.Acad.， U.S.A.86 ： 10029-10033 ； Winter 的 美 国 专 利 号 5,225,539， 和 Queen 等 的 美 国 专 利 号 5,530,101 ； 5,585,089 ； 5,693,762 和 6,180,370)。
     因此， 本发明的另一实施方案涉及分离的单克隆抗体， 或其抗原结合片段， 其包含 重链可变区， 所述重链可变区分别包含具有选自 SEQ ID NOs ： 1、 15、 29、 43、 57、 71、 85、 99、 113、 127、 141、 155、 169 和 183 的氨基酸序列的 CDR1 序列 ； 具有选自 SEQ ID NOs ： 2、 16、 30、 44、 58、 72、 86、 100、 114、 128、 142、 156、 170 和 184 的氨基酸序列的 CDR2 序列 ； 具有选自 SEQ ID NOs ： 3、 17、 31、 45、 59、 73、 87、 101、 115、 129、 143、 157、 171 和 185 的氨基酸序列的 CDR3 序 列； 和轻链可变区， 所述轻链可变区分别包含具有选自 SEQ ID NOs ： SEQ ID NOs ： 4、 18、 32、 46、 60、 74、 88、 102、 116、 130、 144、 158、 172 和 186 的氨基酸序列的 CDR1 序列 ； 具有选自 SEQ ID NOs ： SEQ ID NOs ： 5、 19、 33、 47、 61、 75、 89、 103、 117、 131、 145、 159、 173 和 187 的氨基酸序 列的 CDR2 序列 ； 具有选自 SEQ ID NOs ： 6、 20、 34、 48、 62、 76、 90、 104、 118、 132、 146、 160、 174 和 188 的氨基酸序列的 CDR3 序列。因此， 此类抗体含有单克隆抗体的 VH 和 VL CDR， 但仍然 含有来自这些抗体的不同构架序列。
     可从公共 DNA 数据库或包括种系抗体基因序列的出版的参考文献中获得此类 构架序列。例如， 人重链和轻链可变区基因的种系 DNA 序列可见于 “VBase” 人种系序列 数 据 库 ( 可 在 互 联 网 www.mrc-cpe.cam.ac.uk/vbase 上 获 得 )， 以 及 Kabat， E.A.， 等， 1991 Sequences ofProteins of Immunological Interest，第 五 版， U.S.Department of Healthand Human Services， NIH 公开号 91-3242 ； Tomlinson， I.M.， 等， 1992 J.fol. Biol.227 ： 776-798 ； 和 Cox， J.P.L. 等， 1994 Eur.J Immunol.24 ： 827-836 ； 各自内容此处明确引入作为参考。
     用于本发明抗体的构架序列的实例是与本发明所选抗体使用的构架序列， 例如本 发明单克隆抗体使用的共有序列和 / 或构架序列在结构上相似的那些构架序列。VH CDR1、 2 和 3 序列， 以及 VL CDR1、 2 和 3 序列可移植到与见于构架序列来源的种系免疫球蛋白基 因中的序列具有相同序列的构架区上， 或者所述 CDR 序列可移植到与种系序列相比含有一 个或更多突变的构架区上。例如， 已经发现有利的是在某些情况下在构架区内突变残基以 维持或增强抗体的抗原结合力 ( 参阅例如， Queen 等的美国专利号 5,530,101 ； 5,585,089 ； 5,693,762 和 6,180,370)。可用作其上构建此处所述抗体和抗原结合片段的支架的构架包 括， 但不限于 VH1A、 VH1B、 VH3、 Vk1、 Vl2 和 Vk2。额外的构架为本领域所知， 并可见于例如万 维网 vbase.mrc-cpe.cam.ac.uk/index.php ？ &MMN_position ＝ 1:1 上的 vBase 数据库。
     另一类型的可变区修饰是在 VH 和 / 或 VL CDR1、 CDR2 和 / 或 CDR3 区内突变氨基 酸残基， 由此改善目的抗体的一种或更多结合性质 ( 例如， 亲和力 )， 称为 “亲和力成熟” 。 可 进行定点诱变或 PCR 介导的诱变引入突变， 并在如此处所述以及实施例中提供的体外或体 内测定中评估对抗体结合或其它目的功能性质的影响。可引入保守修饰 ( 如上文讨论 )。 所述突变可以是氨基酸替换、 添加或缺失。此外， 通常改变 CDR 区内不超过 1、 2、 3、 4或5个 残基。
     因此， 在另一实施方案中， 本发明提供分离的 C3b 结合单克隆抗体， 或其抗原结合 片段， 其由重链可变区组成， 所述重链可变区具有 ： 由选自 SEQ ID NOs ： 1、 15、 29、 43、 57、 71、 85、 99、 113、 127、 141、 155、 169 和 183 的氨基酸序列， 或与 SEQ ID NOs ： 1、 15、 29、 43、 57、 71、 85、 99、 113、 127、 141、 155、 169 和 183 相比具有 1、 2、 3、 4 或 5 个氨基酸替换、 缺失或添加的 氨基酸序列组成的 VH CDR1 区 ； 具有选自 SEQ IDNOs ： 2、 16、 30、 44、 58、 72、 86、 100、 114、 128、 142、 156、 170 和 184 的氨基酸序列， 或与 SEQ ID NOs ： 2、 16、 30、 44、 58、 72、 86、 100、 114、 128、 142、 156、 170 和 184 相比具有 1、 2、 3、 4 或 5 个氨基酸替换、 缺失或添加的氨基酸序列的 VH CDR2 区 ； 具有选自 SEQ ID NOs ： 3、 17、 31、 45、 59、 73、 87、 101、 115、 129、 143、 157、 171 和 185 的氨基酸序列， 或与 SEQ ID NOs ： 3、 17、 31、 45、 59、 73、 87、 101、 115、 129、 143、 157、 171 和 185 相比具有 1、 2、 3、 4 或 5 个氨基酸替换、 缺失或添加的氨基酸序列的 VH CDR3 区 ； 具有选自 SEQ ID NOs ： 4、 18、 32、 46、 60、 74、 88、 102、 116、 130、 144、 158、 172 和 186 的氨基酸序列， 或与 SEQID NOs ： 4、 18、 32、 46、 60、 74、 88、 102、 116、 130、 144、 158、 172 和 186 相比具有 1、 2、 3、 4或 5 个氨基酸替换、 缺失或添加的氨基酸序列的 VL CDR1 区 ； 具有选自 SEQ ID NOs ： 5、 19、 33、 47、 61、 75、 89、 103、 117、 131、 145、 159、 173 和 187 的氨基酸序列， 或与 SEQ ID NOs ： 5、 19、 33、 47、 61、 75、 89、 103、 117、 131、 145、 159、 173 和 187 相比具有 1、 2、 3、 4 或 5 个氨基酸替换、 缺失 或添加的氨基酸序列的 VL CDR2 区 ； 和具有选自 SEQ ID NOs ： 6、 20、 34、 48、 62、 76、 90、 104、 118、 132、 146、 160、 174 和 188 的氨基酸序列， 或与 SEQ ID NOs ： 6、 20、 34、 48、 62、 76、 90、 104、 118、 132、 146、 160、 174 和 188 相比具有 1、 2、 3、 4 或 5 个氨基酸替换、 缺失或添加的氨基酸序 列的 VL CDR3 区。
     抗原结合域移植到备选构架或支架中
     可使用多种抗体 / 免疫球蛋白构架或支架， 只要所得多肽包括至少一个特异性结 合 C3b 的抗原结合区。此类构架或支架包括人免疫球蛋白或其片段的 5 个主要个体基因 型， 并包括其它动物物种， 优选具有人源化方面的动物物种的免疫球蛋白。单重链抗体， 如在骆驼中鉴定的那些单重链抗体在该方面十分重要。 本领域技术人员不断发现并开发新的 构架、 支架和片段。
     一方面， 本发明涉及使用其上可移植本发明 CDRs 的非免疫球蛋白支架产生基 于非免疫球蛋白的抗体。可以使用已知或未知非免疫球蛋白构架和支架， 只要它们包 含对靶 C3b 蛋白质 ( 例如， 人和 / 或猕猴 C3b) 特异的结合区。已知的非免疫球蛋白构 架 或 支 架 包 括， 但 不 限 于 纤 连 蛋 白 (Compound Therapeutics， Inc.， Waltham， MA)、 锚 蛋 白 (MolecularPartners AG， Zurich， Switzerland)、 结 构 域 抗 体 (Domantis， Ltd.， Cambridge， MA， and Ablynx nv， Zwijnaarde， Belgium)、脂 笼 蛋 白 (PierisProteolab AG， Freising， Germany)、 小 模 块 免 疫 药 物 (TrubionPharmaceuticals Inc.， Seattle， WA)、 maxybodies(Avidia， Inc.， MountainView， CA)、 A 蛋 白 (Affibody AG， Sweden) 和 affilin(γ- 晶体蛋白或泛素 )(Scil Proteins GmbH， Halle， Germany)。
     纤连蛋白支架基于纤连蛋白类型 III 结构域 ( 例如， 纤连蛋白类型 III 的第十个 模块 (10Fn3 结构域 ))。纤连蛋白类型 III 结构域具有在两个 β 折叠之间分布的 7 个或 8 个 β 链， 所述两个 β 折叠自身彼此包装形成蛋白质的核心， 并进一步含有将 β 链彼此连 接且暴露在溶剂中的环 ( 与 CDRs 类似 )。在 β 折叠夹层每一边缘具有至少三个这样的环， 其中所述边缘是与 β 链方向垂直的蛋白质边界 ( 参阅 US 6,818,418)。 这些基于纤连蛋白 的支架不是免疫球蛋白， 尽管总体折叠与最小功能抗体片段、 在骆驼和骆马 IgG 中包含完 整抗原识别单位的重链可变区十分相近。因为该结构， 非免疫球蛋白抗体模拟与自然界中 相似的抗原结合性质以及与抗体的那些亲和力相似的亲和力。 这些支架可用于体外环随机 化和改组策略， 其与体内抗体的亲和力成熟过程相似。这些基于纤连蛋白的分子可用作支 架， 其中使用标准克隆技术用本发明的 CDRs 替换所述分子的环区。
     锚蛋白技术基于使用具有锚蛋白来源的重复模块的蛋白质作为携带可变区的支 架， 所述可变区可用于结合不同靶标。所述锚蛋白重复模块是由两个反向平行的 α 螺旋和 β 转角组成的 33 个氨基酸的多肽。通过使用核糖体展示对可变区的结合进行最大优化。
     Avimers 来自含有如 LRP-1 蛋白质的天然 A 结构域。这些结构域天然地用于蛋白 质 - 蛋白质相互作用， 并且在人中超过 250 个蛋白质在结构上基于 A 结构域。Avimers 由通 过氨基酸接头连接的大量不同的 “A 结构域” 单体 (2-10) 组成。可使用例如美国专利申请 公开号 20040175756 ； 20050053973 ； 20050048512 和 20060008844 中描述的方法产生可以 结合靶抗原的 Avimers。
     Affibody 亲和配体是由基于 A 蛋白一个 IgG 结合域的支架的三螺旋束组成的小的 简单蛋白质。A 蛋白是来自细菌金黄色葡萄球菌 (Staphylococcus aureus) 的表面蛋白。 该支架结构域由 58 个氨基酸组成， 其中 13 个随机化以产生具有大量配体变体的 affibody 文库 ( 参阅例如， US5,831,012)。Affibody 分子模拟抗体， 它们与 150kDa 的抗体分子量相 比具有 6kDa 的分子量。尽管其具有小的尺寸， 但 affibody 分子的结合位点与抗体的结合 位点类似。
     Anticalins 是 Pieris ProteoLab AG 公司开发的产品。 它们衍生自脂笼蛋白， 其为 一大类小且坚固的蛋白质， 一般参与生理运输或储藏化学敏感的或不溶解的化合物。若干 天然脂笼蛋白在人组织或体液中产生。蛋白质结构表明为免疫球蛋白， 在刚性构架上面具 有高变环。然而， 与抗体或它们的重组片段相比， 脂笼蛋白由具有 160 到 180 个氨基酸残基的单条多肽链组成， 仅比单个免疫球蛋白结构域稍大。构成结合口袋的四环组显示明显的 结构可塑性并耐受多种侧链。因此结合位点在专有方法中可重塑， 以识别具有高亲和力和 特异性的不同形状的规定靶分子。 脂笼蛋白家族的一个蛋白质——Pieris Brassicae 的后 胆色素结合蛋白 (BBP) 已经用于通过诱变处理四环组来开发 anticalins。 描述 anticalins 的专利申请的一个实例在 PCT 公开号 WO 199916873 中。
     Affilin 分子是设计用来针对蛋白质和小分子具有特异亲和力的小的非免疫球蛋 白蛋白质。可从两个文库中非常快速地选择新的 affilin 分子， 每一所述文库基于来自不 同人的支架蛋白。 Affilin 分子与免疫球蛋白蛋白质不显示任何结构同源性。 目前， 使用两 个 affilin 支架， 其中一个是 γ 晶体蛋白——人结构晶状体蛋白质， 另一个是 “泛素” 超家 族蛋白质。两个人支架均非常小， 显示高的温度稳定性， 并对 pH 改变和变性剂几乎是有抵 抗力的。该高稳定性主要是因为蛋白质扩展的 β 折叠结构。γ 晶体蛋白来源的蛋白质的 实例描述于 WO200104144 中， 并且 “泛素样” 蛋白质的实例描述于 WO2004106368 中。
     蛋白质表位模拟 (PEM) 是模拟蛋白质 β 发夹二级结构的中等大小、 环形的、 肽样 分子 (MW 1-2kDa)， 所述主要二级结构参与蛋白质 - 蛋白质相互作用。
     人抗体或人源化抗体
     本发明提供特异性结合 C3b 蛋白质 ( 例如， 人和 / 或猕猴 C3b) 的完全人抗体。与 嵌合或人源化抗体相比， 当对人受试者施用时， 本发明的人 C3b 结合抗体具有进一步降低 的抗原性。
     可使用本领域已知的方法产生人 C3b 结合抗体。例如， 人类工程技术用于将非人 抗体转变成改造的人抗体。美国专利公开号 20050008625 描述了用抗体中人可变区替换非 人抗体可变区的体内方法， 同时维持相同或提供比非人抗体的结合性质更好的结合性质。 所述方法依赖于完全人抗体对非人参考抗体可变区的表位引导的替换。 所得人抗体一般在 结构上与参考非人抗体不相关， 但与所述参考抗体结合相同抗原上的相同表位。 简言之， 在 响应测试抗体结合抗原的报告系统存在下， 通过在细胞中 “竞争者” 与参考抗体 (“测试抗 体” ) 多种杂合物的文库之间建立竞争结合有限量的抗原， 使得可以进行连续表位引导的互 补性替换方法。所述竞争者可以是参考抗体或其衍生物， 如单链 Fv 片段。所述竞争者也可 以是天然的或人造的抗原配体， 其与参考抗体结合相同的表位。所述竞争者唯一需要的是 其可以与参考抗体结合相同的表位， 并且其与参考抗体竞争结合抗原。测试抗体具有来自 非人参考抗体的一个共同的抗原结合 V 区， 和从不同来源如人抗体的所有组成成分库中随 机选择的其它 V 区。来自参考抗体的共同 V 区用作引导者， 将所述测试抗体置于抗原上的 相同表位上， 并且在同一方向， 从而选择是偏向于对参考抗体具有最高抗原结合保真度。
     许多类型的报告系统可用于检测测试抗体与抗原之间期望的相互作用。例如， 互 补报告子片段可分别连接抗原和测试抗体， 使得仅当测试抗体结合抗原时发生片段互补的 报告子激活。当测试抗体和抗原报告片段融合物与竞争者共表达时， 报告子激活变得依赖 于所述测试抗体与竞争者竞争的能力， 其与该测试抗体对抗原的亲和力成比例。可使用的 其它报告系统包括如美国专利申请系列号 10/208,730( 公开号 20030198971) 中公布的自 抑制的报告子再激活系统 (RAIR) 的再激活子， 或在美国专利申请系列 10/076,845( 公开号 20030157579) 中公开的竞争激活系统。
     利用连续表位引导的互补替换系统， 进行选择以鉴定表达单个测试抗体与竞争者、 抗原和报告子组分的细胞。 在这些细胞中， 每一测试抗体一对一地与竞争者竞争结合有 限量的抗原。报告子的活性与结合测试抗体的抗原的量成比例， 其又与测试抗体对抗原的 亲和力和测试抗体的稳定性成比例。当表达为测试抗体时， 开始在其相对于参考抗体的活 性基础上选择测试抗体。第一轮选择的结果是一组 “杂合” 抗体， 其中每一抗体包含来自参 考抗体的相同非人 V 区和来自文库的人 V 区， 并且每一抗体与参考抗体结合抗原上的相同 表位。在第一轮中选择的一个或更多杂合抗体对抗原的亲和力与参考抗体相当或更高。
     在第二个 V 区替换步骤中， 使用在第一步骤中选择的人 V 区作为选择同族人 V 区 的多样文库替换剩余非人参考抗体 V 区的指导。第一轮中选择的杂合抗体也可用作第二轮 选择的竞争者。 第二轮选择的结果是一组完全人抗体， 其在结构上不同于参考抗体， 但与参 考抗体竞争结合相同的抗原。一些所选人抗体与参考抗体结合相同抗原上的相同表位。在 这些所选人抗体中， 一个或更多抗体以与参考抗体相当或比其高的亲和力结合相同表位。
     使用上文描述的一种小鼠或嵌合 C3b 结合抗体作为参考抗体， 可容易地使用该方 法来产生以相同结合特异性及相同或更高结合亲和力结合人 C3b 的人抗体。此外， 也可从 通常生产人抗体的公司， 例如 KaloBios， Inc.(Mountain View， CA) 通过商业途径获得此类 人 C3b 结合抗体。
     骆驼 (camelid) 抗体
     从骆驼和单峰骆驼 (Camelus bactrianus 和 Calelus dromaderius) 家族的成员， 包括新世界成员如骆马物种 (Lama paccos、 Lama glama 和 Lamavicugna) 中获得的抗体蛋 白质已经在大小、 结构复杂性和对人受试者的抗原性方面进行了表征。自然界中发现的来 自该哺乳动物家族的某些 IgG 抗体缺少轻链， 并因此在结构上不同于来自其它动物的抗体 的两条重链和两条轻链的典型四链四级结构。参阅 PCT/EP93/02214(1994 年 3 月 3 日公开 的 WO 94/04678)。
     可通过遗传改造获得鉴定为 VHH 的小的单个可变结构域的骆驼抗体的区域， 以产 生对靶标具有高亲和力的小蛋白质， 得到低分子量的抗体来源蛋白质， 称为 “骆驼纳米抗 体” 。参阅 1998 年 6 月 2 日提交的美国专利号 5,759,808 ； 还参阅 Stijlemans， B. 等， 2004J Biol Chem 279 ： 1256-1261 ； Dumoulin， M. 等， 2003 Nature 424 ： 783-788 ； Pleschberger， M. 等 2003Bioconjugate Chem 14 ： 440-448 ； Cortez-Retamozo， V. 等 2002 Int JCancer 89 ： 456-62 ； 和 Lauwereys， M. 等 1998 EMBO J 17 ： 3512-3520。 例 如 从 Ablynx， Ghent， Belgium 通过商业途径获得骆驼抗体和抗体片段的改造库。 如同非人来源的其它抗体一样， 可重组改变骆驼抗体的氨基酸序列， 来获得与人序列更像的序列， 即纳米抗体可以进行 “人 源化” 。因此， 骆驼抗体对人的天然低抗原性可进一步降低。
     骆驼纳米抗体的分子量是人 IgG 分子的大概十分之一， 并且所述蛋白质物理直径 仅几纳米。 小尺寸的一种结果是骆驼纳米抗体能够结合更大抗体蛋白质在功能上看不见的 抗原位点， 即骆驼纳米抗体可用作使用经典免疫技术检测不到的抗原的试剂， 并可能用作 治疗剂。因此， 小尺寸的另一结果是骆驼纳米抗体因此可抑制靶蛋白质的沟或窄缝中特异 位点的结合， 并因而可具有这样的能力， 其比典型抗体更像典型的低分子量药物的功能。
     低分子量和紧密尺寸还导致骆驼纳米抗体极其热稳定， 对极端 pH 和蛋白酶解消 化稳定， 并且抗原性弱。 另一结果是骆驼纳米抗体容易从循环系统转移到组织， 甚至穿过血 脑屏障， 可治疗影响神经组织的病症。纳米抗体可进一步利于药物运输穿过血脑屏障。参阅 2004 年 8 月 19 日公开的美国专利申请 20040161738。这些特征与对人的低抗原性结合 表明巨大的治疗潜能。另外， 这些分子可在原核细胞， 如大肠杆菌 (E.coli) 中完全表达， 并 用噬菌体表达为融合蛋白， 且是有功能的。
     因此， 本发明的特征是对 C3b 具有高亲和力的骆驼抗体或纳米抗体。在此处的某 些实施方案中， 所述骆驼抗体或纳米抗体在骆驼动物中天然产生， 即， 使用此处为其它抗体 描述的技术， 用 C3b 或其肽片段免疫骆驼来产生。或者， 改造， 即如此处实施例中所述使用 C3b 作为靶标的淘选方法， 通过例如从展示适当诱导的骆驼纳米抗体蛋白质的噬菌体文库 中选择产生 C3b 结合的骆驼纳米抗体。可通过遗传改造进一步定制改造的纳米抗体， 以在 受体受试者中具有从 45 分钟到两周的半衰期。在特定实施方案中， 如 PCT/EP93/02214 所 述， 通过将本发明人抗体的重链或轻链的 CDRs 序列移植到纳米抗体或单结构域抗体构架 序列中来获得骆驼抗体或纳米抗体。
     双特异性分子和多价抗体
     另一方面， 本发明描述了包含本发明 C3b 结合抗体或其片段的双特异性或多特异 性分子。本发明的抗体或其抗原结合片段可衍生或连接另一功能分子， 例如另一肽或蛋白 质 ( 例如， 另一抗体或受体的配体 )， 来产生结合至少两种不同结合位点或靶分子的双特异 性分子。本发明的抗体可实际上衍生或连接超过一种其它功能分子， 以产生结合多于两种 不同结合位点和 / 或靶分子的多特异性分子 ； 此处所用的术语 “双特异性分子” 也旨在包括 此类多特异性分子。为了产生本发明的双特异性分子， 本发明的抗体可在功能上连接 ( 例 如， 通过化学偶联、 遗传融合、 非共价结合或其它 ) 一个或更多其它结合分子， 如另一抗体、 抗体片段、 肽或结合模拟物， 以便产生双特异性分子。
     因此， 本发明包括双特异性分子， 其包含对 C3b 的至少第一种结合特异性， 和对第 二个靶表位的第二种结合特异性。例如， 所述第二个靶表位是 C3b 的不同于第一个靶表位 的另一表位。
     此外， 对于其中双特异性分子是多特异性的发明， 除了第一个和第二个靶表位之 外， 所述分子可以还包括第三种结合特异性。
     在一个实施方案中， 本发明的双特异性分子包含作为结合特异性的至少一种抗 体， 或其抗体片段， 包括例如， Fab、 Fab′、 F(ab′ )2、 Fv 或单链 Fv。所述抗体还可以是轻链 或重链二聚体， 或其任何最小片段， 如 Ladner 等美国专利号 4,946,778 中描述的 Fv 或单链 构建体。
     双抗体是二价的双特异性分子， 其中 VH 和 VL 结构域在单条多肽链上表达， 通 过太短以至于不能在同一条链上两个结构域之间配对的接头连接。所述 VH 和 VL 结构 域与另一条链的互补结构域配对， 由此产生两个抗原结合位点 ( 参阅例如， Holliger 等， 1993Proc.Natl.Acad.Sci.USA90 ： 6444-6448 ； Poljak 等， 1994 Structure 2 ： 1121-1123)。 可 通 过 在 同 一 细 胞 中 表 达 具 有 结 构 VHA-VLB 和 VHB-VLA(VH-VL 构 型 )， 或 VLA-VHB 和 VLB-VHA(VL-VH 构型 ) 的两条多肽链来产生双抗体。大多数的双抗体在细菌中以可溶形 式表达。通过连接两条双抗体形成多肽链与大约 15 个氨基酸残基的接头产生单链双抗体 (scDb)( 参 阅 Holliger 和 Winter， 1997 CancerImmunol.Immunother.， 45(3-4) ： 128-30 ； Wu 等， 1996 Immunotechnology， 2(1) ： 21-36)。scDb 在细菌中以可溶的活性单体形式表达 ( 参 阅 Holliger 和 Winter， 1997 Cancer Immunol.Immunother.， 45(34) ： 128-30 ； Wu 等，1996Immunotechnology， 2(1) ： 21-36 ； Pluckthun 和 Pack， 1997Immunotechnology， 3(2) ： 83-105 ； Ridgway 等， 1996 Protein Eng.， 9(7) ： 617-21)。双抗体可融合到 Fc 上， 以产生 “二 - 双抗体” ( 参阅 Lu 等， 2004J.Biol.Chem.， 279(4) ： 2856-65)。
     可用于本发明的双特异性分子中的其它抗体是鼠类、 嵌合和人源化单克隆抗体。
     可使用本领域已知的方法， 通过缀合成分结合特异性来制备本发明的双特异性分 子。例如， 可单独产生双特异性分子的每一结合特异性， 然后相互缀合。当结合特异性是 蛋白质或肽时， 多种偶联或交联剂可用于共价缀合。交联剂的实例包括 A 蛋白、 碳二亚胺、 N- 琥珀酰亚胺基 -S- 乙酰 - 硫代乙酸酯 (SATA)、 5， 5′ - 二硫代双 (2- 硝基苯甲酸 )(DTNB)、 邻 - 亚苯基二马来酰亚胺 (oPDM)、 N- 琥珀酰亚胺基 -3-(2- 吡啶基二硫代 ) 丙酸酯 (SPDP) 和磺基琥珀酰亚胺基 4-(N- 马来酰亚胺基甲基 ) 环己烷 -l- 羧酸酯 ( 磺基 -SMCC)( 参阅例 如， Karpovsky 等， 1984 J.Exp.Med.160 ： 1686 ； Liu， MA 等， 1985 Proc.Natl.Acad.Sci.USA 82 ： 8648)。其它方法包括在 Paulus， 1985Behring Ins.Mitt.No.78， 118-132 ； Brennan 等， 1985 Science 229 ： 81-83 和 Glennie 等， 1987 J.Immunol.139 ： 2367-2375 中描述的那些。 缀合剂是 SATA 和磺基 -SMCC， 两者均可从 Pierce Chemical Co.(Rockford， IL) 获得。
     当结合特异性是抗体时， 它们可通过两条重链的 C 末端铰链区的巯基成键而缀 合。在特定实施方案中， 在缀合之前修饰铰链区以含有奇数个巯基残基， 例如 1 个。
     或者， 两种结合特异性可在相同载体中编码， 并在相同宿主细胞中表达并装配。 其 中双特异性分子是 mAb x mAb、 mAb x Fab、 Fab x F(ab′ )2 或配体 x Fab 融合蛋白质时， 该 方法是特别有用的。本发明的双特异性分子可以单链分子， 其包含一个单链抗体和结合决 定簇， 或包含两个结合决定簇的单链双特异性分子。双特异性分子可包含至少两个单链分 子。 例如在美国专利号 5,260,203 ； 美国专利号 5,455,030 ； 美国专利号 4,881,175 ； 美国专 利号 5,132,405 ； 美国专利号 5,091,513 ； 美国专利号 5,476,786 ； 美国专利号 5,013,653 ； 美国专利号 5,258,498 ； 和美国专利号 5,482,858 中描述了用于制备双特异性分子的方法。
     例如， 通过酶联免疫吸附测定 (ELISA)、 放射免疫测定 (REA)、 FACS 分析、 生物测定 ( 例如生长抑制 )、 或 Western 印迹测定来验证双特异性分子与其特异性靶标的结合。这些 测定法中的每一种一般通过使用对目的复合体特异的标记试剂 ( 例如抗体 ) 检测特别重要 的蛋白质 - 抗体复合物的存在。
     另一方面， 本发明提供多价化合物， 其包含结合 C3b 的本发明抗体的至少两个相 同或不同的抗原结合部分。 所述抗原结合部分可通过蛋白质融合或共价或非共价键而连接 在一起。或者， 已经为双特异性分子描述了连接方法。例如通过交联本发明的抗体与结合 本发明抗体的恒定区， 例如 Fc 或铰链区获得四价化合物。
     例 如 在 Borean 专 利 EP 1 012 280B1 中 描 述 了 三 聚 化 结 构 域。 例 如 在 PCT/ EP97/05897 中描述了五聚化模块。
     具有延长半衰期的抗体
     本发明提供特异性结合 C3b 蛋白质的在体内具有延长半衰期的抗体。
     许多因素可影响蛋白质在体内的半衰期。例如， 肾过滤、 肝中的新陈代谢、 蛋白酶 解酶 ( 蛋白酶 ) 的降解和免疫原性应答 ( 例如， 抗体的蛋白质中和及巨噬细胞和树突状 细胞的吸收 )。多种策略可用于延长本发明抗体的半衰期。例如， 通过化学连接聚乙二醇 (PEG)、 reCODE PEG、 抗体支架、 聚唾液酸 (PSA)、 羟乙基淀粉 (HES)、 白蛋白结合配体、 和糖类保护层 ； 通过遗传融合到结合血清蛋白质的蛋白质， 如白蛋白、 IgG、 FcRn， 和转移 ； 通过偶 联 ( 遗传上或化学上 ) 到其它结合部分， 所述结合部分结合血清蛋白质， 如纳米抗体、 Fabs、 DARPins、 avimers、 affibodies 和 anticalins ； 通过遗传融合 rPEG、 白蛋白、 白蛋白的结构 域、 白蛋白结合蛋白质和 Fc ； 或通过掺入到 nancarriers 中， 减缓释放制剂和医疗设备。
     为了延长抗体在体内的血清循环， 可使用或不使用多功能接头通过 PEG 位点特异 性缀合到抗体 N 或 C 末端或通过赖氨酸残基上存在的 ε 氨基将惰性聚合分子如高分子量 PEG 附着到抗体或其片段上。为了聚乙二醇化抗体， 抗体或其片段通常与聚乙二醇 (PEG)， 如 PEG 的活性酯或醛衍生物在其中一个或更多 PEG 基团变得附着到抗体或其片段的条件下 进行反应。可利用活性 PEG 分子 ( 或类似活性水溶性聚合物 ) 通过酰化反应或烷化反应进 行聚乙二醇化。如此处所用， 术语 “聚乙二醇” 旨在包括任何的 PEG 形式， 其已经用于衍生 其它蛋白质， 如单 (C1-C10) 烷氧基或芳氧基 - 聚乙二醇或聚乙二醇 - 马来酰亚胺。在某些 实施方案中， 待聚乙二醇化的抗体是无糖基化抗体。使用导致生物活性损失最小的线性或 分支聚合物衍生化。可通过 SDS-PAGE 和质谱密切监测缀合的程度， 来保证 PEG 分子与抗体 的正确缀合。可通过大小排排阻或通过离子交换层析从抗体 -PEG 缀合物中分离未反应的 PEG。可使用本领域技术人员熟知的方法， 例如通过此处描述的免疫测定法测试 PEG 衍生抗 体的结合活性以及体内功效。聚乙二醇化蛋白质的方法为本领域所知， 并可应用到本发明 的抗体中。参阅例如， Nishimura 等的 EP 0 154 316 和 Ishikawa 等的 EP 0 401 384。
     其它修改的聚乙二醇化技术包括重建化学正交指导的改造技术 (ReCODE PEG)， 其 将化学上特定的侧链通过包括 tRNA 合成酶和 tRNA 的重建系统掺入到生物合成蛋白质中。 该技术能够在大肠杆菌、 酵母和哺乳动物细胞中将多于 30 个新氨基酸掺入到生物合成蛋 白质中。所述 tRNA 将非天然氨基酸掺入到琥珀密码子定位的任何位置， 使琥珀密码子从终 止密码子转化成信令化学上特定的氨基酸掺入的一个密码子。
     重组聚乙二醇化技术 (rPEG) 也可用于血清半衰期延长。该技术包括将 300-600 个氨基酸未组织的蛋白质尾巴融合到现有的药物蛋白质上。 因为该未组织蛋白质链的表观 分子量比其实际分子量大约 15 倍， 所以极大延长了该蛋白质的血清半衰期。与需要化学缀 合和再纯化的常规聚乙二醇化相反， 该制备方法极其简化并且产品是同质的。
     多唾液酸化是另一种技术， 其使用天然聚合物聚唾液酸 (PSA) 来延长活性生命并 提高治疗肽和蛋白质的稳定性。PSA 是唾液酸的聚合物 ( 糖 )。当用于蛋白质和治疗肽药 物递送时， 聚唾液酸在缀合上提供保护性微环境。这增加了治疗蛋白质在循环中的活性生 命并防止其被免疫系统识别。 PSA 聚合物天然见于人体中。 其被某些细菌采用， 所述细菌进 化了超过数百万年， 用所述 PSA 聚合物包被自身的壁。通过分子拟态， 这些天然多唾液酸化 细菌然后能够挫败身体的防御系统。 PSA 是自然界的最终偷窃技术， 可容易地自此类细菌大 量产生并具有预定的物理特点。甚至当与蛋白质偶联时， 细菌 PSA 也是完全非免疫原性的， 因为它与人体中的 PSA 在化学上相同。
     另一技术包括使用连接抗体的羟乙基淀粉 (“HES” ) 衍生物。HES 是来自蜡状玉 米淀粉的修饰的天然聚合物， 并可通过身体的酶进行新陈代谢。一般施用 HES 溶液来替换 不足的血液体积并改善血液的流变学性质。 抗体的羟乙基化使得能够通过提高分子的稳定 性， 以及降低肾清除率来延长循环半衰期， 产生提高的生物学活性。通过改变不同的参数， 如 HES 的分子量， 可定制广泛的 HES 抗体缀合物。也可通过向 IgG 恒定结构域或其 FcRn 结合片段 ( 优选 Fc 或铰链 Fc 结构域片 段 ) 中引入一个或更多氨基酸修饰 ( 即， 替换、 插入或缺失 ) 产生在体内具有增加的半衰 期的抗体。参阅例如， 国际公开号 WO 98/23289 ； 国际公开号 WO 97/34631 ； 和美国专利号 6,277,375。
     另外， 抗体可缀合到白蛋白 ( 例如， 人血清白蛋白 ； HSA) 上， 以使抗体或抗体片段 在体内更稳定或在体内具有更长的半衰期。技术为本领域所熟知， 参阅例如国际公开号 WO 93/15199、 WO 93/15200 和 WO 01/77137 ； 和欧洲专利号 EP 413,622。此外， 在上文描述的 双特异性抗体的背景中， 可设计抗体的特异性， 以便抗体的一个结合域结合 C3b， 而抗体的 第二个结合域结合血清白蛋白， 优选 HSA。
     提高半衰期的策略特别用于纳米抗体、 基于纤连蛋白的结合子， 和期望提高体内 半衰期的其它抗体或蛋白质。
     抗体缀合物
     本发明提供特异性结合 C3b 蛋白质的抗体或其片段， 其重组融合或化学缀合 ( 包 括共价和非共价缀合 ) 到异源蛋白质或多肽 ( 或其片段， 优选至少 10、 至少 20、 至少 30、 至少 40、 至少 50、 至少 60、 至少 70、 至少 80、 至少 90 或至少 100 个氨基酸的多肽 )， 以产 生融合蛋白质。具体而言， 本发明提供包含此处所述抗体的抗原结合片段 ( 例如， Fab 片 段、 Fd 片段、 Fv 片段、 F(ab)2 片段、 VH 结构域、 VH CDR、 VL 结构域或 VL CDR) 和异源蛋白 质、 多肽或肽的融合蛋白质。用于融合或缀合蛋白质、 多肽或肽到抗体或抗体片段上的方 法为本领域所知。参阅例如美国专利号 5,336,603、 5,622,929、 5,359,046、 5,349,053、 5,447,851 和 5,112,946 ； 欧洲专利号 EP 307,434 和 EP 367,166 ； 国际公开号 WO 96/04388 和 WO91/06570 ； Ashkenazi 等， 1991， Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88 ： 10535-10539 ； Zheng 等， 1995， J.Immunol.154 ： 5590-5600 ； 和 Vil 等， 1992， Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89 ： 11337-11341。
     可通过基因改组、 基序改组、 外显子改组和 / 或密码子改组 ( 共同称为 “DNA 改 组” ) 的技术产生额外的融合蛋白质。可使用 DNA 改组来改变本发明抗体或其片段的 活性 ( 例如， 具有更高亲和力和更低解离速率的抗体或其片段 )。一般参阅美国专利 号 5,605,793、 5,811,238、 5,830,721、 5,834,252 和 5,837,458 ； Patten 等， 1997， Curr. Opinion Biotechnol.8 ： 724-33 ； Harayama， 1998， Trends Biotechnol.16(2) ： 76-82 ； Hansson 等， 1999， J.Mol.Biol.287 ： 265-76 ； 以及 Lorenzo 和 Blasco， 1998， Biotechniques 24(2) ： 308-313( 这些专利和出版物每一文件以其整体引入作为参考 )。 可在重组之前通过 易错 PCR、 随机核苷酸插入或其它方法进行随机诱变来改变抗体或其片段， 或编码的抗体或 其片段。编码特异性结合 C3b 蛋白质的抗体或其片段的多核苷酸可与一种或更多异源分子 的一个或更多组分、 基序、 断片、 部分、 结构域、 片段等重组。
     此外， 抗体或其片段可融合到标记序列上， 如肽， 以利于纯化。在优选的实施 方案中， 标记氨基酸序列是六组氨酸肽， 如 pQE 载体 (QIAGEN， Inc.， 9259 Eton Avenue， Chatsworth， CA， 91311) 中提供的标签， 其中许多可以通过商业途径获得。如 Gentz 等， 1989， Proc.Natl.Acad.Sci.USA86 ： 821-824 中所述， 六组氨酸提供融合蛋白质的便利纯 化。可用于纯化的其它肽标签包括， 但不限于血凝素 ( “HA” ) 标签， 其对应于来自流行性感 冒血凝素蛋白质的表位 (Wilson 等， 1984， Cell 37 ： 767) 和 “flag” 标签。在其它实施方案中， 本发明的抗体或其片段缀合诊断或检测试剂。此类抗体可用 于监测或预后疾病或病症的开始、 发展、 进行和 / 或严重性， 作为临床试验程序的一部分， 如测定特定治疗的功效。可通过将抗体与可检测物质偶联完成此类诊断和检测， 所述可检 测物质包括但不限于多种酶， 如但不限于， 辣根过氧化物酶、 碱性磷酸酶、 β- 半乳糖苷酶、 或乙酰胆碱酯酶 ； 辅基， 如但不限于链霉抗生物素蛋白生物素和抗生物素蛋白 / 生物素 ； 荧 光物质， 如但不限于伞形酮、 荧光素、 异硫氰酸荧光素、 罗丹明、 二氯三嗪基胺荧光素、 丹磺 酰氯或藻红蛋白 ； 发光物质， 如但不限于鲁米诺 ； 生物发光物质， 如但不限于荧光素酶、 荧 光素和水母发光蛋白 ； 放射性物质， 如但不限于碘 (131I、 125I、 123I 和 121I)、 碳 (14C)、 硫 (35S)、 氚 (3H)、 铟 (115In、 113In、 112In 和 111In)、 锝 (99Tc)、 铊 (201Ti)、 镓 (68Ga、 67Ga)、 钯 (103Pd)、钼 (99Mo)、氙 (133Xe)、氟 (18F)、 153Sm、 177Lu、 159Gd、 149Pm、 140La、 175Yb、 166Ho、 90Y、 47Sc、 186Re、 188Re、 142Pr、 105Rh、 97Ru、 68Ge、 57Co、 65Zn、 85Sr、 32P、 153Gd、 169Yb、 51Cr、 54Mn、 75Se、 113Sn 和 117Tin ； 和使用多种正电子发射断层术的正电子发射金 属， 和非放射性顺磁金属离子。
     本发明还包括缀合治疗部分的抗体或其片段的用途。 抗体或其片段可缀合到治疗 部分， 如细胞毒素， 例如细胞生长抑制剂或细胞自杀剂， 治疗剂或放射性金属离子， 例如 α 粒子发射体。细胞毒素或细胞毒性剂包括对细胞有害的任何试剂。
     另外， 抗体或其片段可缀合到修饰给定生物反应的治疗部分或药物部分。治疗部 分或药物部分不解释为限制为典型的化学治疗剂。例如， 药物部分可以是具有想要的生物 学活性的蛋白质、 肽或多肽。此类蛋白质可包括例如， 毒素如相思豆毒蛋白、 蓖麻毒蛋白 A、 假单胞菌外毒素、 霍乱毒素或白喉毒素 ； 蛋白质如肿瘤坏死因子、 α 干扰素、 β 干扰素、 神 经生长因子、 血小板衍生生长因子、 组织纤溶酶原激活物、 细胞凋亡剂、 抗血管生成剂 ； 或生 物反应修饰因子， 例如淋巴因子。
     此外， 抗体可缀合到治疗部分， 如放射性金属离子， 如 α 粒子发射体， 如用于将放 射性金属离子 ( 包括但不限于 131In、 131LU、 131Y、 131Ho、 131Sm) 缀合到多肽上的 213Bi 或大环螯合剂。在某些实施方案中， 所述大环螯合剂是 1， 4， 7， 10- 四氮杂环十二烷 -N， N’ ， N” ， N’ ” - 四乙酸 (DOTA)， 其可通过接头分子附着到抗体上。此类接头分子为本领域所 熟知， 并描述于 Denardo 等， 1998， Clin Cancer Res.4(10) ： 2483-90 ； Peterson 等， 1999， Bioconjug.Chem.10(4) ： 553-7 ； 和 Zimmerman 等， 1999， Nucl.Med.Biol.26(8) ： 943-50， 每 一参考文献以其整体引入作为参考。
     用 于 将 治 疗 部 分 缀 合 到 抗 体 上 的 技 术 是 众 所 周 知 的， 参 阅 例 如 Arnon 等， “Monoclonal Antibodies For Immunotargeting Of Drugs In CancerTherapy” ， Monoclonal Antibodies And Cancer Therapy， Reisfeld 等 ( 编辑 )， 第 243-56 页 (Alan R.Liss， Inc.1985) ； Hellstrom 等， “Antibodies For DrugDelivery” ， Controlled Drug Delivery( 第 2 版 Robinson 等 ( 编 辑 )，第 623-53 页 (Marcel Dekker， Inc.1987) ； Thorpe， “Antibody Carriers Of CytotoxicAgents In Cancer Therapy ： A Review” ， Monoclonal Antibodies 84 ： Biological And Clinical Applications ， Pinchera 等 ( 编 辑 )， 第 475-506 页 (1985) ； “Analysis， Results， And Future Prospective Of The TherapeuticUse Of Radiolabeled Antibody In Cancer Therapy” ， MonoclonalAntibodies For Cancer Detection And Therapy， Baldwin 等 ( 编 辑 )， 第303-16 页 (Academic Press 1985)， 和 Thorpe 等， 1982， Immunol.Rev.62 ： 119-58。
     抗体也可附着到固相支持体上， 所述固相支持体特别用于靶抗原的免疫测定或纯 化。 此类固相支持体包括， 但不限于玻璃、 纤维素、 聚丙烯酰胺、 尼龙、 聚苯乙烯、 聚氯乙烯或 聚丙烯。
     产生本发明抗体的方法
     编码抗体的核酸
     本发明提供基本纯化的核酸分子， 其编码包含上文描述的 C3b 结合抗体链的区段 或结构域的多肽。 本发明的一些核酸包含编码示于 SEQ ID NO ： 7、 21、 35、 49、 63、 77、 91、 105、 119、 133、 147、 161、 175 和 189 的重链可变区的核苷酸序列， 和 / 或编码示于 SEQ ID NO ： 8、 22、 36、 50、 64、 78、 92、 106、 120、 134、 148、 162、 176 的轻链可变区的核苷酸序列。在特定实施 方案中， 核酸分子是在表 1 中鉴定的那些核酸分子。 本发明的一些其它核酸分子包含与表 1 中鉴定的那些核酸分子的核苷酸序列基本相同 ( 例如至少 65、 80％、 95％或 99％ ) 的核苷 酸序列。当从适当表达载体进行表达时， 这些多核苷酸编码的多肽能够显示 C3b 抗原结合 能力。
     本发明还提供的是编码来自上文阐明的 C3b 结合抗体的重链和轻链的至少一个 CDR 区以及一般地所有三个 CDR 区的多核苷酸。一些其它多核苷酸编码上文阐明的 C3b 结 合抗体的重链和 / 或轻链的所有或基本上所有可变区序列。因为密码子的简并性， 多种核 酸序列编码每一种免疫球蛋白氨基酸序列。
     本发明的核酸分子可编码抗体的可变区和恒定区。 一些本发明的核酸序列包含编 码成熟重链序列的核苷酸， 所述成熟重链序列与在 SEQ IDNOs ： 9、 23、 37、 51、 65、 79、 93、 107、 121、 135、 149、 163、 177 和 191 中阐明的成熟重链序列基本相同 ( 例如， 至少 80 ％、 90 ％或 99％ )。一些其它核酸序列包含编码成熟轻链序列的核苷酸， 所述成熟轻链序列与在 SEQID NOs ： 10、 24、 38、 52、 66、 80、 94、 108、 122、 136、 150、 164、 178 和 192 中阐明的成熟轻链序列基 本相同 ( 例如， 至少 80％、 90％或 99％ )。
     可通过从头固相 DNA 合成或通过 PCR 诱变编码 C3b 结合抗体或其结合片段的现有 序列 ( 例如下文实施例中描述的序列 ) 来产生多核苷酸序列。可通过本领域已知的方法， 如 Narang 等， 1979， Meth.Enzymol.68 ∶ 90 的磷酸三酯法 ； Brown 等， Meth.Enzymol.68 ： 109， 1979 的磷酸二酯法 ； Beaucage 等， Tetra.Lett.， 22 ： 1859， 1981 的二乙基亚磷酰胺法 ； 和美国专利号 4,458,066 的固相支持物法完成核酸的直接化学合成。如 PCR Technology ： Principles and Applications for DNA Amplification， H.A.Erlich( 编辑 )， Freeman Press， NY， NY， 1992 ； PCR Protocols ： A Guide to Methods andApplications， Innis 等 ( 编 辑 )， Academic Press， San Diego， CA， 1990 ； Mattila 等， Nucleic Acids Res.19 ： 967， 1991 ； 和 Eckert 等， PCR Methodsand Applications 1 ： 17， 1991 中描述的进行通过 PCR 向多核苷 酸序列中引入突变。
     本发明还提供用于产生上文所述 C3b 结合抗体的表达载体和宿主细胞。可使用 多种表达载体来表达编码 C3b 结合抗体链或结合片段的多核苷酸。基于病毒的表达载体 和非病毒表达载体均可用于在哺乳动物宿主细胞中产生抗体。非病毒载体和系统包括质 粒、 游离型载体， 通常具有用于表达蛋白质或 RNA 的表达盒， 和人工染色体 ( 参阅例如， Harrington 等， NatGenet 15 ： 345， 1997)。例如， 用于在哺乳动物 ( 例如人 ) 细胞中表达C3b 结合多核苷酸和多肽的非病毒载体包括 pThioHis A、 B&C、 pcDNA3.1/His、 pEBVHis A、 B&C(Invitrogen， San Diego， CA)、 MPSV 载体， 和本领域中已知用于表达其它蛋白质的许多 其它载体。 有用的病毒载体包括基于逆转录病毒、 腺病毒、 腺伴随病毒、 疱疹病毒的载体、 基 于 SV40、 乳头瘤病毒、 HBP EB 病毒、 痘苗病毒载体和 Semliki Forest 病毒 (SFV) 的载体。 参 阅， Brent 等， 上文 ； Smith， Annu.Rev.Microbiol.49 ： 807， 1995 ； 和 Rosenfeld 等， Cell 68 ： 143， 1992。
     表达载体的选择依赖于其中待表达所述载体的预期宿主细胞。通常， 所述表达载 体含有有效连接编码 C3b 结合抗体链或片段的多核苷酸的启动子和其它调节序列 ( 例如， 增强子 )。 在一些实施方案中， 使用诱导型启动子来防止插入序列的表达 ( 除了在诱导条件 下之外 )。诱导型启动子包括， 例如阿拉伯糖、 lacZ、 金属硫蛋白启动子或热激启动子。可 在非诱导条件下扩大转化生物的培养， 而不偏向编码序列的群体， 宿主细胞能更好地耐受 所述编码序列的表达产物。除了启动子， 也需要或想要其它调节元件用于 C3b 结合抗体链 或片段的有效表达。这些元件通常包括 ATG 起始密码子和邻近核糖体结合位点或其它序 列。此外， 可通过包括适合于使用中的细胞系统的增强子来增强表达的效率 ( 参阅例如， Scharf 等， Results Probl.Cell Differ.20 ： 125， 1994 ； 和 Bittner 等， Meth.Enzymol.， 153 ： 516， 1987)。例如， SV40 增强子或 CMV 增强子可用于提高哺乳动物宿主细胞中的表达。
     表达载体也可提供分泌信号序列位置， 以与插入的 C3b 结合抗体序列编码的多肽 形成融合蛋白质。更经常地， 所述插入的 C3b 结合抗体序列在包括在载体中之前连接信号 序列。待用于接受编码 C3b 结合的抗体轻链和重链可变结构域的序列的载体有时候也编码 恒定区或其部分。此类载体允许可变区表达为与恒定区的融合蛋白质， 由此导致完整抗体 或其片段的产生。通常， 此类恒定区是人的恒定区。
     用于携带并表达 C3b 结合抗体链的宿主细胞可以是原核细胞或真核细胞。大肠杆 菌是用于克隆并表达本发明多核苷酸的一种原核宿主。 适于使用的其它微生物宿主包括芽 孢杆菌， 如枯草杆菌 (Bacillus subtilis)， 和其它肠杆菌科 (enterobacteriaceae)， 如沙 门氏菌属 (Salmonella)、 沙雷氏菌属 (Serratia) 和多种假单胞菌属 (Pseudomonas) 物种。 在这些原核宿主中， 也可以制备表达载体， 其通常含有与所述宿主细胞相容的表达控制序 列 ( 例如， 复制起点 )。此外， 存在任何数量的多种众所周知的启动子， 如乳糖启动子系统、 色氨酸 (trp) 启动子系统、 β- 内酰胺酶启动子系统， 或来自 λ 噬菌体的启动子系统。所 述启动子通常任选地与操纵子序列控制表达， 并具有核糖体结合位点序列等， 用于起始并 完成转录和翻译。其它微生物， 如酵母也可用于表达本发明的 C3b 结合多肽。也可使用昆 虫细胞与杆状病毒载体组合。
     在一些优选的实施方案中， 哺乳动物宿主细胞用于表达并产生本发明的 C3b 结合 多肽。例如， 它们可以是表达内源免疫球蛋白基因的杂交瘤细胞系 ( 例如， 实施例中描述 的 1D6.C9 骨髓瘤杂交瘤克隆 ) 或携带外源表达载体的哺乳动物细胞系 ( 例如， 下文示例的 SP2/0 骨髓瘤细胞 )。这些包括任何正常致死或正常或非正常永生动物或人细胞。例如， 已 经开发了能够分泌完整免疫球蛋白的大量合适宿主细胞系， 包括 CHO 细胞系、 多种 Cos 细胞 系、 HeLa 细胞、 骨髓瘤细胞系、 转化的 B 细胞和杂交瘤。一般在例如 Winnacker， FROM GENES TO CLONES， VCH Publishers， N.Y.， N.Y.， 1987 中讨论了哺乳动物组织细胞培养物表达多 肽的用途。 用于哺乳动物宿主细胞的表达载体可包括表达控制序列， 如复制起点、 启动子和增强子 ( 参阅例如， Queen 等， Immunol.Rev.89 ： 49-68， 1986)、 和必要的加工信息位点， 如 核糖体结合位点、 RNA 剪接位点、 多腺苷酸化位点和转录终止子序列。这些表达载体一般含 有来自哺乳动物基因或来自哺乳动物病毒的启动子。合适的启动子可以是组成型的、 细胞 类型特异的、 阶段特异的、 和 / 或可调整的或可调节的。有用的启动子包括， 但不限于金属 硫蛋白启动子、 组成型腺病毒主要晚期启动子、 地塞米松诱导型 MMTV 启动子、 SV40 启动子、 MRP polIII 启动子、 组成型 MPSV 启动子、 四环素诱导型 CMV 启动子 ( 如人立即早期 CMV 启 动子 )、 组成型 CMV 启动子和本领域已知的启动子 - 增强子组合。
     用于引入含有目的多核苷酸序列的表达载体的方法根据细胞宿主的类型变化。 例 如， 氯化钙转染通常用于原核细胞， 而磷酸钙处理或电穿孔可用于其它细胞宿主。( 一般参 阅 Sambrook， 等， 上文 )。其它方法包括， 例如电穿孔、 磷酸钙处理、 脂质体介导的转化、 注射 和显微注射、 生物射弹方法、 病毒体、 免疫脂质体、 聚阳离子 ： 核酸缀合物、 裸 DNA、 人工病毒 体、 与疱疹病毒结构蛋白 VP22 的融合物 (Elliot 和 O′ Hare， Cell 88 ： 223， 1997)、 DNA 的 试剂增强的吸收和离体转导。对于重组蛋白质的长期、 高产量生产， 通常想要稳定表达。例 如， 可使用含有病毒复制起点或内源表达元件和选择标记基因的本发明的表达载体制备稳 定表达 C3b 结合抗体链或结合片段的细胞系。引入载体后， 可以允许细胞在富集培养基中 生长 1-2 天后转换到选择性培养基。选择标记的目的是赋予选择抗性， 并且其存在允许成 功表达所引入序列的细胞在选择性培养基中生长。 使用对细胞类型合适的组织培养技术增 殖具有抗性的稳定转染的细胞。
     本发明单克隆抗体的产生
     可 通 过 多 种 技 术， 包 括 常 规 单 克 隆 抗 体 方 法， 例 如 Kohler 和 Milstein， 1975 Nature 256 ： 495 的标准体细胞杂交技术来产生单克隆抗体 (mAbs)。可使用产生单克隆抗 体的许多技术， 例如， 病毒转化或 B 淋巴细胞的致癌性转化。
     用于制备杂交瘤的动物系统是鼠类系统。小鼠中杂交瘤的产生是良好建立的程 序。分离免疫的脾细胞用于融合的免疫方案和技术为本领域所知。融合配偶体 ( 例如鼠类 骨髓瘤细胞 ) 和融合步骤也是已知的。
     可在如上文描述制备的鼠类单克隆抗体的序列基础上制备本发明的嵌合或人源 化抗体。 可使用标准分子生物学技术从目的鼠类杂交瘤中获得编码重链和轻链免疫球蛋白 的 DNA， 并进行改造以含有非鼠类 ( 例如， 人 ) 免疫球蛋白序列。 例如， 为了产生嵌合抗体， 可 使用本领域已知的方法将鼠类可变区连接到人恒定区 ( 参阅例如， Cabilly 等的美国专利 号 4,816,567)。为了产生人源化抗体， 可使用本领域已知的方法将鼠类 CDR 区插入人构架 中。 参阅例如， Winter 的美国专利号 5225539， 和 Queen 等的美国专利号 5530101 ； 5585089 ； 5693762 和 6180370。
     在某一实施方案中， 本发明抗体是人单克隆抗体。可使用携带人免疫系统的部分 而非小鼠系统的转基因或转染色体小鼠产生针对 C3b 的此类人单克隆抗体。这些转基因和 转染色体小鼠包括此处分别称为 HuMAb 小鼠和 KM 小鼠的小鼠， 并在此处统称为 “人 Ig 小 鼠” 。
     HuMAb 小鼠 (Medarex， Inc.) 含有编码未重排人重链 (μ 和 γ) 和 K 轻链免 疫球蛋白序列的人免疫球蛋白基因小基因座 (miniloci)， 以及失活内源 μ 和 K 链基因 座的靶向突变 ( 参阅例如， Lonberg， 等， 1994Nature368(6474) ： 856-859)。因此， 小鼠显示降低表达的小鼠 IgM 或 K， 并且响应免疫时， 引入的人重链和轻链转基因经历类别转 换和体细胞突变， 产生高亲和力人 IgGK 单克隆抗体 (Lonberg， N. 等， 1994 上文 ； 综述见 于 Lonberg， N.， 1994 Handbook of Experimental Pharmacology 113 ： 49-101 ； Lonberg， N. 和 Huszar， D.， 1995 Intern.Rev.Immunol.13 ： 65-93， 以及 Harding， F. 和 Lonberg， N.， 1995 Ann.N.Y.Acad.Sci.764 ： 536-546)。HuMAb 小鼠的制备和用途以及该小鼠携带的基因 组修饰进一步描述于 Taylor， L. 等， 1992Nucleic Acids Research 20 ： 6287-6295 ； Chen， J. 等， 1993 InternationalImmunology 5 ： 647-656 ； Tuaillon 等， 1993Proc.Natl.Acad. Sci.USA94 ： 3720-3724 ； Choi 等， 1993Nature Genetics 4 ： 117-123 ； Chen， J. 等， 1993EMBO J.12 ： 821-830 ； Tuaillon 等， 1994 J.Immunol.152 ： 2912-2920 ； Taylor ， L. 等， 1994 International Immunology 579-591 ； 和 Fishwild， D. 等， 1996 Nature Biotechnology 14 ： 845-851， 所有参考文献的内容以其整体明确引入作为参考。进一步参阅均为 Lonberg 和 Kay 的 美 国 专 利 号 5,545,806 ； 5,569,825 ； 5,625,126 ； 5,633,425 ； 5,789,650 ； 5,877,397 ； 5,661,016 ； 5,814,318 ； 5,874,299 和 5,770,429 Surani 等 的 美 国 专 利 号 5,545,807 ； 均为 Lonberg 和 Kay 的 PCT 公开号 WO 92103918、 WO 93/12227、 WO 94/25585、 WO97113852、 WO 98/24884 和 WO 99/45962 ； 和 Korman 等的 PCT 公开号 WO 01/14424。
     在另一实施方案中， 可使用在转基因和转染色体上携带人免疫球蛋白序列的小 鼠， 如携带人重链转基因和人轻链转染色体的小鼠产生本发明的人抗体。在 Ishida 等的 PCT 公开 WO 02/43478 中详细描述了此处称为 “KM 小鼠” 的这种小鼠。
     进一步， 表达人免疫球蛋白基因的备选转基因动物系统可在本领域中获得， 并可 用于产生本发明的 C3b 结合抗体。例如， 可使用称为 Xenomouse(Abgenix， Inc.) 的备选 转基因系统。在例如 Kucherlapati 等的美国专利号 5,939,598 ； 6,075,181 ； 6,114,598 ； 6,150,584 和 6,162,963 中描述了此类小鼠。
     此外， 表达人免疫球蛋白基因的备选转染色体动物系统可在本领域中获得， 并可 用于产生本发明的 C3b 结合抗体。例如， 可使用称为 “TC 小鼠” 的携带人重链转染色体和人 轻链转染色体的小鼠 ； 在 Tomizuka 等， 2000Proc.Natl.Acad.Sci.USA 97 ： 722-727 中描述 了这种小鼠。另外， 携带人重链和轻链转染色体的奶牛已经描述于本领域中 (Kuroiwa 等， 2002 NatureBiotechnology 20 ： 889-894)， 并可用于产生本发明的 C3b 结合抗体。
     也可使用噬菌体展示方法制备本发明的人单克隆抗体， 用于筛选人免疫球蛋白基 因文库。在本领域中建立或在下文实施例中描述了用于分离人抗体的此类噬菌体展示方 法。 参阅例如 ： Ladner 等的美国专利号 5,223,409 ； 5,403,484 ； 和 5,571,698 ； Dower 等的美 国专利号 5,427,908 和 5,580,717 ； McCafferty 等的美国专利号 5,969,108 和 6,172,197 ； 和 Griffiths 等的美国专利号 5,885,793 ； 6,521,404 ； 6,544,731 ； 6,555,313 ； 6,582,915 和 6,593,081。
     也可使用 SCID 小鼠制备本发明的人单克隆抗体， 在所述 SCID 小鼠中已经重建了 人免疫细胞， 使得在免疫后产生人抗体应答。例如在 Wilson 等的美国专利号 5,476,996 和 5,698,767 中描述了此类小鼠。
     构架或 Fc 改造
     本发明的改造抗体包括其中 VH 和 / 或 VL 内构架残基已经进行了修饰， 例如以改 善抗体性质的那些抗体。通常进行这些构架修饰以降低抗体的免疫原性。例如， 一种方法是将一个或更多构架残基 “回复突变” 成相应的种系序列。更特别地， 已经经历体细胞突变 的抗体含有不同于抗体来源种系序列的构架残基。 可通过比较抗体构架序列与抗体来源的 种系序列来鉴定此类残基。为了将构架区序列恢复成它们的种系构型， 例如通过定点诱变 可以将体细胞突变 “回复突变” 到种系序列中。此类 “回复突变的” 抗体也旨在包括在本发 明内。
     另一类型的构架修饰包括突变构架区， 或甚至一个或更多 CDR 区内的一个或更多 残基， 来去除 T 细胞表位， 由此降低抗体的潜在免疫原性。该方法也称为 “去免疫化” ， 并进 一步详细描述于 Carr 等的美国专利公开号 20030153043 中。
     除了在构架或 CDR 区内进行修饰外或作为备选， 可改造本发明的抗体以包括 Fc 区 内的修饰， 通常用来改变抗体的一种或更多功能性质， 如血清半衰期、 补体结合、 Fc 受体结 合， 和 / 或抗原依赖性细胞毒性。 另外， 可化学修饰 ( 例如， 一个或更多化学部分可附着到抗 体上 ) 或修饰本发明的抗体以改变其糖基化， 再次用于改变抗体的一种或更多功能性质。 在下文中进一步详细描述了这些实施方案中每一个实施方案。Fc 区中残基的编号是 Kabat 的 EU 指数的编号。
     在一个实施方案中， 修饰 CH1 的铰链区， 使得改变， 例如增加或减少铰链区中半胱 氨酸残基的数量。在 Bodmer 等的美国专利号 5,677,425 中进一步描述了该方法。改变 CH1 的铰链区中半胱氨酸残基的数量， 例如用来便于轻链和重链装配， 或提高或降低抗体的稳 定性。
     在另一实施方案中， 突变抗体的 Fc 铰链区， 以降低抗体的生物半衰期。更特别地， 向 Fc 铰链片段的 CH2-CH3 结构域界面区引入一个或更多氨基酸突变， 使得抗体相对于天然 的 Fc 铰链结构域 SpA 结合具有受损的葡萄球菌蛋白 A(SpA) 结合。在 Ward 等的美国专利 号 6,165,745 中进一步描述了该方法。
     在另一实施方案中， 修饰抗体以增加其生物半衰期。多种方法是可能的。例如， 可 引入一个或更多以下突变 ： T252L、 T254S、 T256F， 如 Ward 的美国专利号 6,277,375 中所述。 或者， 为了增加生物学半衰期， 可在 CH1 或 CL 区内改变抗体， 以含有取自 IgG 的 Fc 区的 CH2 结构域的两个环的挽救受体结合表位， 如 Presta 等的美国专利号 5,869,046 和 6,121,022 所述。
     在其它实施方案中， 通过用不同氨基酸残基替换至少一个氨基酸残基来改变 Fc 区域， 以改变抗体的效应功能。例如， 可用不同氨基酸残基替换一个或更多氨基酸， 使得所 述抗体对效应配体具有改变的亲和力， 但保留亲本抗体的抗原结合能力。对其亲和力改变 的效应配体可以是例如， Fc 受体或补体的 C1 组分。在 Winter 等的美国专利号 5,624,821 和 5,648,260 中进一步详细描述了该方法。
     在另一实施方案中， 可用不同氨基酸残基替换选自氨基酸残基的一个或更多氨 基酸， 使得抗体具有改变的 C1q 结合 / 或降低的或消除的补体依赖性细胞毒性 (CDC)。在 Idusogie 等的美国专利号 6,194,551 中进一步详细描述了该方法。
     在另一实施方案中， 改变一个或更多氨基酸残基， 由此改变抗体固定补体的能力。 在 Bodmer 等的 PCT 公开 WO 94/29351 中进一步详细描述了该方法。
     在再一实施方案中， 修饰 Fc 区以提高抗体介导抗体依赖性细胞毒性 (ADCC) 的 能力和 / 或通过修饰一个或更多氨基酸来增加抗体对 Fcγ 受体的亲和力。在 Presta 的PCT 公开 WO 00/42072 中进一步详细了描述该方法。此外， 已经在人 IgG1 上对 FcγRl、 FcγRII、 FcγRIII 和 FcRn 的结合位点进行作图， 并且已经描述了具有提高结合的变体 ( 参 阅 Shields， R.L. 等， 2001 J.Biol.Chen.276 ： 6591-6604)。
     在再一实施方案中， 修饰抗体的糖基化。例如， 可制备无糖基化抗体 ( 即， 所述抗 体缺少糖基化 )。可改变糖基化， 例如用来增加抗体对 “抗原” 的亲和力。可通过例如改变 抗体序列中一个或更多糖基化位点来完成此类糖类修饰。例如， 可进行一个或更多氨基酸 替换， 由此去除该位点上的糖基化， 所述氨基酸替换导致一个或更多可变区构架糖基化位 点的去除。这种无糖基化可增加抗体对抗原的亲和力。在 Co 等的美国专利号 5,714,350 和 6,350,861 中进一步详细了描述该方法。
     此外或备选地， 可以制备具有改变类型糖基化的抗体， 如具有减少量的岩藻糖残 基的低岩藻糖化抗体或具有增加的二等分 GlcNac 结构的抗体。已经显示此类改变的糖基 化模式提高抗体的 ADCC 能力。例如通过在具有改变的糖基化机器的宿主细胞中表达抗体 来完成此类糖类修饰。已经在本领域中描述了具有改变糖基化机器的细胞， 并且其可用作 宿主细胞， 在其中表达本发明重组抗体， 由此产生具有改变的糖基化的抗体。例如， Hang 等 的 EP 1,176,195 描述了具有功能破坏的 FUT8 基因的细胞系， 该基因编码岩藻糖转移酶， 使 得在这种细胞系中表达的抗体显示低岩藻糖化。Presta 的 PCT 公开 WO 03/035835 描述了 变体 CHO 细胞系 Lecl3 细胞， 其将岩藻糖附着到 Asn(297)- 连接的糖类上的能力降低， 也 导致在该宿主细胞中表达的抗体的低岩藻糖化 ( 也参阅 Shields， R.L. 等， 2002 J.Biol. Chem.277 ： 26733-26740)。 Umana 等的 PCT 公开 WO 99/54342 描述了经改造以表达糖蛋白修 饰糖基转移酶 ( 例如， β(1， 4)-N 乙酰葡糖氨基转移酶 III(GnTIII))， 使得在改造的细胞系 中表达的抗体显示增加的二等分 GlcNac 结构， 其导致抗体的 ADCC 活性提高 ( 也参阅 Umana 等， 1999 Nat.Biotech.17 ： 176-180)。
     改造改变的抗体的方法
     如上讨论， 此处显示的具有 VH 和 VL 序列或全长重链和轻链序列的 C3b 结合抗体 可用于通过修饰全长重链和 / 或轻链序列、 VH 和 / 或 VL 序列、 或附着到其上的恒定区产生 新的 C3b 结合抗体。因此， 在本发明的另一方面， 本发明 C3b 结合抗体的结构特征用于产生 结构上相关的 C3b 结合抗体， 其保留了本发明抗体的至少一种功能性质， 如结合人 C3b， 以 及抑制 C3b 的一种或更多功能性质 ( 例如， 在溶血测定中抑制红细胞溶解 )。
     例如， 本发明抗体的一个或更多 CDR 区或其突变可与已知的构架区和 / 或其它 CDRs 重组组合以产生本发明额外的重组改造的 C3b 结合抗体， 如上讨论。其它类型的修饰 包括在先前部分中描述的那些。用于改造方法的起始材料是此处提供的一个或更多 VH 和 / 或 VL 序列， 或其一个或更多 CDR 区。为了产生改造的抗体， 不必实际制备 ( 即， 表达为蛋 白质 ) 具有此处提供的一个或更多 VH 和 / 或 VL 序列， 或其一个或更多 CDR 区的抗体。而 是， 序列中包含的信息用作起始材料， 来产生来自初始序列的 “第二代” 序列， 然后制备所述 “第二代” 序列并将其表达为蛋白质。
     因此， 在另一实施方案中， 本发明提供用于制备 C3b 结合抗体 ； 改变重链可变区抗 体序列和 / 或轻链可变区抗体序列内的至少一个氨基酸残基来产生至少一个改变的抗体 序列 ； 并将所述改变的抗体序列表达为蛋白质的方法， 所述 C3b 结合抗体由以下组成 ： 具有 选自 SEQ ID NOs ： 1、 15、 29、 43、 57、 71、 85、 99、 113、 127、 141、 155、 169 和 183 的 CDR1 序列、 选自 SEQ ID NOs ： 2、 16、 30、 44、 58、 72、 86、 100、 114、 128、 142、 156、 170 和 184 序列， 和 / 或选自 SEQ ID NOs ： 3、 17、 31、 45、 59、 73、 87、 101、 115、 129、 143、 157、 171 和 185 的 CDR3 序列的重链 可变区抗体序列 ； 和具有选自 SEQ ID NOs ： 4、 18、 32、 46、 60、 74、 88、 102、 116、 130、 144、 158、 172 和 186 的 CDR1 序列、 选自 SEQ ID NOs ： SEQ ID NOs ： 5、 19、 33、 47、 61、 75、 89、 103、 117、 131、 145、 159、 173 和 187 的 CDR2 序列， 和 / 或选自 SEQ ID NOs ： 6、 20、 34、 48、 62、 76、 90、 104、 118、 132、 146、 160、 174 和 188 的 CDR3 序列的轻链可变区抗体序列。
     因此， 在另一实施方案中， 本发明提供用于制备经过优化以在哺乳动物细胞中表 达的 C3b 结合抗体 ； 改变全长重链抗体序列和 / 或全长轻链抗体序列内的至少一个氨基酸 残基来产生至少一个改变的抗体序列 ； 并将所述改变的抗体序列表达为蛋白质的方法， 所 述 C3b 结合抗体由以下组成 ： 具有选自 SEQ ID NOs ： 9、 23、 37、 51、 65、 79、 93、 107、 121、 135、 149、 163、 177 和 191 的序列的全长重链抗体序列 ； 和具有选自 SEQ ID NOs ： 10、 24、 38、 52、 66、 80、 94、 108、 122、 136、 150、 164、 178 和 192 的序列的全长轻链抗体序列。
     也 可 通 过 筛 选 抗 体 文 库 制 备 改 变 的 抗 体 序 列， 所述抗体文库具有如 US20050255552 中描述的固定的 CDR3 序列或最小基本结合决定簇以及 CDR1 和 CDR2 序列上 的多样性。可根据适合于从抗体文库中筛选抗体的任何筛选技术， 如噬菌体展示技术进行 筛选。
     标准分子生物学技术可用于制备和表达改变的抗体序列。 所述改变的抗体序列编 码的抗体是保留此处所述 C3b 结合抗体的一种、 一些或所有功能性质的抗体， 所述功能性 质包括， 但不限于与人和 / 或猕猴 C3b 的特异性结合 ； 和所述抗体在溶血测定中抑制红细胞 溶解。
     可使用本领域中可得的标准测定法， 如在实施例中阐明的那些测定法 ( 例如， ELISA) 评估经改变的抗体的功能性质。
     在本发明改造抗体的方法的某些实施方案中， 可沿全部或部分 C3b 结合抗体编码 序列随机或选择性引入突变， 并且可如此处描述的筛选所得的经修饰 C3b 结合抗体的结合 活性和 / 或其它功能性质。已经在本领域中描述了突变方法。例如， Short 的 PCT 公开 WO 02/092780 描述了使用饱和诱变、 合成连接装配或其组合用于产生并筛选抗体突变的方法。 或者， Lazar 等的 PCT 公开 WO 03/074679 描述了使用计算筛选方法来优化抗体理化性质的 方法。
     本发明抗体的表征
     可通过多种功能测定表征本发明的抗体。例如， 它们可通过它们在溶血测定中抑 制红细胞溶解的能力、 与 C3b 蛋白质 ( 例如， 人和 / 或猕猴 C3b) 的亲和力、 它们抑制 C3a 或 C5a 产生的能力、 它们抑制 C3b 沉积的能力、 表位装箱 (binning)、 它们对蛋白酶解的抗性、 及阻断补体级联的能力， 例如它们抑制 MAC 形成的能力来表征。
     多种方法可用于测定补体途径分子的存在和补体系统的激活 ( 参阅例如， 美国专 利号 6,087,120 ； 和 Newell 等， J Lab Clin Med， 100 ： 437-44， 1982)。例如， 可通过 (i) 测 定红细胞的补体介导的溶解 ( 溶血 ) 的抑制 ； (ii) 测定抑制 C3 或 C5 切割的能力 ； 和 (iii) 旁路途径介导的溶血的抑制来监测补体活性。
     两种最常用的技术是溶血测定 ( 参阅例如 Baatrup 等， Ann Rheum Dis， 51 ： 892-7， 1992) 和免疫学测定 ( 参阅例如 Auda 等， Rheumatol Int， 10 ： 185-9， 1990)。所述溶血技术测量经典或旁路途径中完整序列的功能能力。 免疫学技术测量特定补体组分或裂解产物的 蛋白质浓度。在本发明方法中可用于检测补体激活或测定补体组分活性的其它测定法包 括， 例如 T 细胞增殖测定 (Chain 等， J Immunol Methods， 99 ： 221-8， 1987) 和迟发型超敏反 应 (DTH) 测定 (Forstrom 等， 1983， Nature 303 ： 627-629 ； Halliday 等， 1982， Assessment of Immune Status by the Leukocyte Adherence Inhibition Test， Academic， New York 第 1-26 页 ； Koppi 等， 1982， Cell.Immunol.66 ： 394-406 ； 和美国专利号 5,843,449)。
     在溶血技术中， 所有的补体组分必须存在且具有功能。因此， 溶血技术可筛选功 能完整性和补体系统的不足 ( 参阅例如 Dijk 等， J ImmunolMethods 36 ： 29-39， 1980 ； Minh 等， Clin Lab Haematol.5 ： 23-341983 ； 和 Tanaka 等， J Immunol 86 ： 161-170， 1986)。为了 测定经典途径的功能能力， 用溶血素包被的羊红细胞 ( 针对绵羊红细胞的兔 IgG) 或用兔抗 鸡抗体致敏的鸡红细胞用作靶细胞 ( 致敏细胞 )。 这些 Ag-Ab 复合体激活了经典途径， 并当 所述组分有功能且以足够浓度存在时导致靶细胞的溶解。为了确定旁路途径的功能能力， 兔红细胞用作靶细胞 ( 参阅例如美国专利号 6,087,120)。
     为了测试抗体抑制 MAC( 膜攻击复合体 ) 形成的能力， 可进行 MAC 沉积测定。简言 之， 酵母多糖可用于激活旁路途径， 并且 IgM 可用于激活经典途径。用人血清预温育 Fabs， 并将其加到用酵母多糖或 IgM 包被的平板中。 可计算每一样品的 MAC 沉积相对于基线 (EDTA 处理的人血清 ) 和阳性对照 ( 人血清 ) 的百分比抑制。
     为了测试本发明抗体在替代途径中抑制补体蛋白 C3 的能力， 测定在酵母多糖上 沉积的 C3 分解产物 C3b 的产生。在下文实施例中详细描述了用于测定 C3b 沉积的特定方 法。
     可 通 过 例 如 使 用 特 异 性 抗 C5a 抗 体， 如 从 US Biologics 获 得 的 小 鼠 抗 人 C5a-des-Arg 抗体的 ELISA 测定法抗体抑制测定 C5 分解产物 C5a 的产生的能力。
     可通过直接标记目的抗体检测抗体结合 C3b 的能力， 或不标记抗体并使用本领域 中已知的多种夹层测定法间接检测结合。
     在一些实施方案中， 本发明的 C3b 结合抗体阻断或竞争参考 C3b 结合抗体与 C3b 多肽的结合。这些可以是上文描述的完全人 C3b 结合抗体。它们也可以是其它小鼠、 嵌合 或人源化 C3b 结合抗体， 其与参考抗体结合相同的表位。阻断或竞争参考抗体结合的能力 表明测试中的 C3b 结合抗体结合参考抗体定义的相同或相似表位， 或与参考 C3b 结合抗体 结合的表位足够接近的表位。此类抗体尤其可能具有为参考抗体鉴定到的有利性质。可通 过例如竞争结合测定法来确定阻断参考抗体或与其竞争的能力。利用竞争结合测定法， 检 测测试中的抗体抑制参考抗体特异结合共同抗原， 如 C3b 多肽的能力。如果过量的测试抗 体基本抑制参考抗体的结合， 那么测试抗体与参考抗体竞争对抗原的特异性结合。基本抑 制表示测试抗体降低参考抗体的特异结合通常至少 10％、 25％、 50％、 75％或 90％。
     有许多已知的竞争结合测定法， 其可用于评估 C3b 结合抗体与参考 C3b 结合抗体 竞争结合 C3b 蛋白质。这些测定法包括， 例如固相直接或间接放射免疫测定 (RIA)、 固相 直接或间接酶免疫测定 (EIA)、 夹层竞争测定 ( 参阅 Stahli 等， Methods in Enzymology 9： 242-253， 1983) ； 固 相 直 接 生 物 素 - 亲 和 素 EIA( 参 阅 Kirkland 等， J.Immunol.137 ： 3614-3619， 1986) ； 固相直接标记测定、 固相直接标记夹层测定 ( 参阅 Harlow&Lane， 上文 ) ； 使 用 I-125 标 记 的 固 相 直 接 标 记 RIA( 参 阅 Morel 等， Molec.Immunol.25 ： 7-15， 1988) ；固相直接生物素 - 亲和素 EIA(Cheung 等， Virology 176 ： 546-552， 1990) ； 和直接标记的 RIA(Moldenhauer 等， Scand.J.Immunol.32 ： 77-82， 1990)。通常， 这种测定包括使用结合到 固体表面或细胞的纯化抗原， 所述固体表面或细胞携带未标记的测试 C3b 结合抗体和标记 的参考抗体中任何一种。 通过测定在测试抗体存在下结合到固体表面或细胞上的标记的量 来测定竞争抑制。所述测试抗体一般过量存在。通过竞争测定鉴定的抗体 ( 竞争抗体 ) 包 括与参考抗体结合相同表位的抗体和结合邻近表位的抗体， 所述临近表位与参考抗体结合 的表位足够接近以发生位阻。
     为了测定所选的 C3b 结合单克隆抗体是否结合唯一的表位， 可使用市售试剂 ( 例 如， 来自 Pierce， Rockford， IL 的试剂 ) 将每一抗体生物素化。 可使用 C3b 多肽包被的 ELISA 平板， 使用未标记单克隆抗体和生物素化单克隆抗体进行竞争研究。可利用链霉抗生物素 蛋白 - 亲和素 - 碱性磷酸酶探针检测生物素化的 MAb 结合。为了测定纯化的 C3b 结合抗体 的同种型， 可进行同种型 ELISA。例如， 可用 1μg/ml 抗人 IgG 在 4℃下过夜包被微量滴定 板的孔。用 1％ BSA 封闭后， 平板与 1μg/ml 或更少的单克隆 C3b 结合抗体或纯化的同种型 对照在室温下反应 1 到 2 小时。所述孔然后与人 IgGl 或人 IgM 特异性碱性磷酸酶缀合的 探针反应。然后将平板显影， 并对其进行分析， 以便测定纯化抗体的同种型。
     为了证明单克隆 C3b 结合抗体与表达 C3b 多肽的肝细胞的结合， 可使用流式细胞 术。简言之， 表达 C3b 的细胞系 ( 在标准生长条件下生长 ) 可与含 0.1％ BSA 和 10％胎牛 血清的 PBS 中多种浓度的 C3b 结合抗体混和， 并在 37℃下温育 1 小时。洗涤后， 细胞与萤光 素标记的抗人 IgG 抗体在与一级抗体染色相同的条件下反应。可通过 FACScan 仪器使用光 和侧向散射性质门控单个细胞来分析样品。 ( 除了或者替代 ) 流式细胞术测定外， 还可使用 利用荧光显微术的备选测定法。 可如上所述将细胞染色， 并通过荧光显微术检测所述细胞。 该方法允许显示单个细胞， 但根据抗原的密度具有降低的灵敏度。
     可通过蛋白质印迹进一步测试本发明的 C3b 结合抗体与 C3b 多肽或抗原片段的反 应性。 简言之， 可制备纯化的 C3b 多肽或融合蛋白质， 或来自表达 C3b 的细胞的细胞提取物， 并进行十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳。电泳后， 将分离的抗原转移到硝基纤维素膜 上， 用 10％胎牛血清封闭， 并用待测试的单克隆抗体探测。 可使用抗人 IgG 碱性磷酸酶检测 人 IgG 结合， 并用 BCIP/NBT 底物片剂 (Sigma Chem.Co.， St.Louis， MO) 显色。
     在下文实施例部分也描述了功能测定的实例。
     预防和治疗用途
     本发明提供了通过向需要治疗的受试者施用有效量的本发明抗体治疗与提高的 补体活性相关的疾病或病症的方法。在特定实施方案中， 本发明提供了通过向需要治疗的 受试者施用有效量的本发明抗体治疗年龄相关性黄斑变性 (AMD) 的方法。
     尤其可使用本发明的抗体来预防干性 AMD 向湿性 AMD 的发展、 减慢和 / 或防止地 图样萎缩的发展、 治疗或预防黄斑水肿、 和改善因干性 AMD 发展引起的视力丧失。其也可以 与抗 VEGF 治疗组合使用来治疗湿性 AMD 患者。
     在一些实施方案中， 本发明提供通过向需要治疗的受试者施用有效量的本发明抗 体治疗补体相关疾病或病症的方法。 已知补体相关疾病或病症的实例包括 ： 神经障碍、 多发 性硬化、 中风、 吉 - 巴综合征、 外伤性脑损伤、 帕金森病、 不恰当或不想要补体激活的疾病、 血液透析并发症、 超急性同种异体移植物排斥、 异种移植物排斥、 IL-2 治疗过程中白细胞介素 2 诱导的毒性、 炎性疾病、 自身免疫病炎症、 克隆病、 成人呼吸道窘迫综合征、 包括烧伤或 冻伤的热伤、 局部缺血后再灌注状况、 心肌梗塞、 气囊血管成形术、 心肺转流术或肾脏转流 术中的泵后综合征、 血液透析、 肾缺血、 表面重建后肠系膜动脉再灌注、 传染病或脓毒、 免疫 复合物病症和自身免疫性疾病、 类风湿性关节炎、 系统性红斑狼疮 (SLE)、 SLE 肾炎、 增殖性 肾炎、 溶血性贫血、 和重症肌无力。 此外， 其它已知补体相关疾病是肺部疾病和病症， 如呼吸 困难、 咯血、 ARDS、 哮喘、 慢性阻塞性肺疾病 (COPD)、 肺气肿、 肺栓塞和梗塞、 肺炎、 致纤维化 粉尘疾病、 惰性粉尘和矿物质 ( 例如， 硅、 煤炭粉末、 铍和石棉 )、 肺纤维化、 有机粉尘疾病、 化学损伤 ( 因刺激性气体和化学物质， 例如氯、 光气、 二氧化硫、 硫化氢、 二氧化氮、 铵和盐 酸 )、 烟雾损伤、 热损伤 ( 例如， 烧伤、 冻伤 )、 哮喘、 变态反应、 支气管收缩、 超敏感性肺炎、 寄 生虫病、 肺出血肾炎综合征、 肺血管炎和免疫复合物相关的炎症。
     在特定实施方案中， 本发明提供通过向需要治疗的受试者施用有效量的本发明抗 体治疗补体相关疾病或病症的方法， 其中所述疾病或病症是哮喘、 关节炎 ( 例如， 类风湿性 关节炎 )、 自身免疫性心脏病、 多发性硬化、 炎性肠病、 缺血 - 再灌注损伤、 巴 - 西综合征、 血 液透析、 系统性红斑狼疮、 红斑狼疮、 牛皮癣、 多发性硬化、 移植、 中枢神经系统疾病如阿尔 茨海默氏病和其它神经变性状况、 aHUS、 肾小球肾炎、 大疱性类天疱疮或 MPGNII。
     在特定实施方案中， 本发明提供通过向需要治疗的受试者施用有效量的包含本发 明抗体的组合物来治疗肾小球肾炎的方法。 肾小球肾炎的症状包括， 但不限于蛋白尿 ； 降低 的肾小球滤过率 (GFR) ； 血清电解质改变， 包括氮质血症 ( 尿毒症、 过度血尿氮 -BUN) 和盐 滞留， 致使水滞留， 导致高血压和水肿 ； 血尿和异常尿沉淀， 包括红细胞管型 ； 低白蛋白血 症； 高脂血症 ； 和脂肪尿。在特定实施方案中， 本发明提供通过向需要治疗的受试者施用有 效量的包含本发明抗体的组合物来治疗阵发性夜间血红蛋白尿 (PNH) 的方法。
     在特定实施方案中， 本发明提供通过向需要治疗的受试者施用有效量的包含本发 明抗体的组合物来减少与体外循环相关的免疫和止血系统功能异常的方法。 本发明的抗体 可用于任何方法中， 所述方法涉及使患者血管中血液循环穿过导管， 并回流到患者血管中， 所述导管具有网眼表面， 所述网眼表面包含能够引起补体激活、 血小板激活、 白细胞激活或 血小板 - 白细胞粘着至少一种的材料。此类方法包括， 但不限于所有形式的 ECC， 以及涉及 向患者血液循环中引入人工或外源器官、 组织或血管的方法。
     也可利用治疗与黄斑变性相关状况的已知方法， 如在美国专利号 6,218,368 中描 述的抗生素治疗向待用本发明治疗剂治疗的受试者施用其它治疗剂。在其它治疗中， 免疫 抑制剂如环孢菌素是能够抑制免疫应答的治疗剂。这些治疗剂包括细胞毒性药物、 皮质类 固醇、 非类固醇抗炎药物 (NSAIDs)、 特异的 T 淋巴细胞免疫抑制剂， 和抗体或其片段 ( 参阅 Physicians′ Desk Reference， 第 53 版， Medical Economics Company Inc.， Montvale， N.J.(1999))。通常以一周、 一个月、 三个月、 六个月或一年的间隔继续免疫抑制治疗。在一 些患者中， 在患者余生中施用治疗。
     当本发明的治疗剂与另一治疗剂一起施用时， 可以任何顺序连续施用或同时施用 两种治疗剂。在一些方面， 本发明的抗体向也接受第二种治疗剂 ( 例如维替泊芬 ) 治疗的 受试者施用。另一方面， 结合分子与外科治疗结合施用。
     与 C3b 结合抗体组合治疗的合适治疗剂包括本领域中已知的治疗剂， 其能够调节 补体组分的活性 ( 参阅例如， 美国专利号 5,808,109)。已经报道其它治疗剂降低补体介导的活性。此类治疗剂包括 ： 氨基酸 (Takada， Y. 等 Immunology 1978， 34， 509) ； 膦酸酯 (Becker， L.Biochem.Biophy.Acta 1967， 147， 289)、 聚阴离子物质 (Conrow， R.B. 等 J.Med. Chem.1980， 23， 242) ； 磺酰氟 (Hansch， C. ； Yoshimoto， M.J.Med.Chem.1974， 17， 1160， 和其 中引用的参考文献 ) ； 多核苷酸 (DeClercq， P.F. 等 Biochem.Biophys.Res.Commun.1975， 67， 255) ；海 松 酸 (Glovsky， M.M. 等 J.Immunol.1969， 102， 1) ；卟 吩 (Lapidus， M. 和 Tomasco， J.Immunopharmacol.1981， 3， 137) ； 一些抗炎药 (Burge， J.J. 等 J.Immunol.1978， 120， 1625) ； 酚 类 (Muller-Eberhard， H.J.1978， Molecular Basis of Biological DegradativeProcesses， Berlin， R.D. 等， 编辑 Academic Press， New York， 第 65 页 ) ； 和苄 脒类 (Vogt， W. 等 Immunology 1979， 36， 138)。这些治疗剂中的一些治疗剂通过一般性抑 制蛋白酶和酯酶起作用。其它治疗剂对补体途径中任何特定中间步骤并不是特异的， 但是 却抑制补体激活的一个以上的步骤。后面化合物的实例包括苄脒类， 其阻断 C1、 C4 和 C3b 的利用 ( 参阅例如 Vogt 等 Immunol.1979， 36， 138)。
     可抑制补体组分活性的本领域已知的额外治疗剂包括来自葡萄穗霉属 (Stachybotrys) 的真菌代谢物 K-76(Corey 等， J.Amer.Chem.Soc.104 ： 5551， 1982)。 已经显 示 K-76 和 K-76COOH 主要在 C3b 步抑制补体 (Hong 等， J.Immunol.122 ： 2418， 1979 ； Miyazaki 等， Microbiol.Immunol.24 ： 1091， 1980)， 并防止从正常人补体中产生趋化因子 (Bumpers 等， Lab.Clinc.Med.102 ： 421， 1983)。在高浓度的 K-76 或 K-76COOH 中， 显示了对 C2、 C3、 C6、 C7 和 C9 与其各自先前媒介物的反应的一定抑制。也已经报道了 K-76 或 K-76COOH 抑 制补体的 C3b 激活系统 (Hong 等， J.Immunol.127 ： 104-108， 1981)。用于实践本发明方法 的其它合适治疗剂包括灰黄霉素 (griseofulvin)(Weinberg， Principles of Medicinal Chemistry， 第 2 版， Foye， W.O.， 编辑， Lea&Febiger， Philadelphia， Pa.， 第 813 页， 1981)、 isopannarin(Djura 等， Aust.J.Chem.36 ： 1057， 1983) 和 Siphonodictyoncoralli-phagum 的代谢物 (Sullivan 等， Tetrahedron 37 ： 979， 1981)。
     组合治疗方案可以是累加的， 或其可以产生协同结果 ( 例如， 补体途径活性的减 少超出组合使用两种治疗剂的预期 )。 在一些实施方案中， 本发明提供使用本发明的 C3b 结 合抗体和抗血管发生剂， 如抗 VEGF 治疗剂来预防和 / 或治疗 AMD 或如上所述另一补体相关 疾病的组合治疗。
     诊断用途
     一方面， 本发明包括用于在生物学样品 ( 例如， 血液、 血清、 细胞、 组织 ) 的背景中 或遭受疾病或病症、 或处于发生与 AMD 相关病症的风险的个体中测定 C3b 蛋白质和 / 或核 酸表达以及 C3b 蛋白质功能的诊断测定法。
     诊断测定法， 如竞争性测定法依赖于标记的类似物 (“示踪物” ) 与测试样品分析 物竞争共同结合配偶体上有限数量的结合位点的能力。 结合配偶体一般在竞争前或竞争后 不溶解， 然后结合到结合配偶体上的示踪物和分析物与未结合的示踪物和分析物分离。通 过倾析 ( 其中结合配偶体预先不溶解 ) 或通过离心 ( 其中竞争反应后结合配偶体沉淀 ) 完 成该分离。 如通过标记物质的量测定， 测试样品分析物的量与结合的示踪物的量成反比。 制 备已知量的分析物的剂量反应曲线， 并与测试结果进行比较， 以定量测定测试样品中存在 的分析物的量。当酶用作检测标记时， 这些测定称为 ELISA 系统。在该形式的测定中， 抗体 与 C3b 结合抗体之间的竞争性结合导致结合的 C3b 蛋白质， 优选本发明的 C3b 表位成为血清样品中抗体的量度， 最特别的是中和血清样品中的抗体。
     测定的显著优势是直接对中和抗体 ( 即， 干扰与 C3b 蛋白质， 尤其是表位结合的那 些抗体 ) 进行测定。这种测定， 特别是 ELISA 测试形式在临床环境和常规血液筛查中具有 相当多的应用。
     免疫学技术使用针对多种补体组分 ( 例如 C3、 C4、 C5) 的不同表位的多克隆或单 克隆抗体来检测例如， 补体组分的裂解产物 ( 参阅例如， Hugli 等， Immunoassays Clinical Laboratory Techniques 443-460， 1980 ； Gorski 等， JImmunol Meth 47 ： 61-73， 1981 ； Linder 等， J Immunol Meth 47 ： 49-59， 1981 ；和 Burger 等， J Immunol 141 ： 553-558， 1988)。然后可测定抗体与所述裂解产物和已知浓度的标记裂解产物的竞争结合。可获得 多种测定， 如放射免疫测定、 ELISA′ s 和放射扩散测定来检测补体裂解产物。
     免疫学技术提供高灵敏度来检测补体激活， 因为它们允许测定来自患有或不患有 黄斑变性相关病症的测试受试者和对照受试者的血液中裂解产物的形成。因此， 在本发明 的一些实施方案中， 通过测试受试者的血浆中补体组分的可溶性裂解产物的定量来测定 异常补体激活以获得对眼病症相关病症的诊断。如在 Chenoweth 等， N Engl J Med 304 ： 497-502， 1981 ； 和 Bhakdi 等， Biochim Biophys Acta 737 ： 343-372， 1983 中描述进行测定。 优选地， 仅测定体内形成的补体激活。这可通过在含有补体系统的抑制剂的培养基中收集 来自受试者的生物学样品 ( 例如血清 )， 随后在所述样品中测定补体激活 ( 例如裂解产物的 定量 ) 来完成。
     在患有眼疾病或病症相关病症的患者的临床诊断或监测中， 补体蛋白质的检测与 来自正常受试者的相应生物学样品中的水平的比较表明患者患有与黄斑变性相关的病症。
     在 US2006/0067935 中描述了体内诊断或成像。简言之， 这些方法一般包括向患者 施用或引入诊断有效量的 C3b 结合分子， 其有效附着到通过非创性方法可检测的标记或标 签上。允许抗体 - 标记缀合物足够时间定位并结合眼睛内的补体蛋白质。然后将所述患者 暴露在检测设备下来鉴定可检测标记， 因此在患者眼睛中形成 C3b 结合分子的定位图像。 通过检测抗体 - 标记是否结合眼睛的组分来检测 C3b 结合抗体或其抗原结合片段的存在。 与未患有 AMD 疾病的正常个体相比， 所选补体蛋白质或蛋白质组合增加水平的检测表明与 黄斑变性相关的病症的倾向性和 / 或发作。也优选本发明的这些方面用于眼睛成像方法以 及组合的血管发生诊断和治疗方法。
     本发明还涉及预测医学领域， 其中诊断测定、 预后测定、 药物基因组学和监测临床 试验用于预后 ( 预测 ) 目的， 由此预防性治疗个体。
     本发明还提供用于测定个体是否具有发生与补体途径活性失调相关病症的风险 的预后 ( 或预测 ) 测定法。例如， 可测定生物学样品中 C3b 基因中的突变。此类测定法可 用于预后或预测目的， 由此在病症发作之前预防性治疗个体， 所述病症的特征在于 C3b 蛋 白质、 核酸表达或活性或与其相关。
     本发明的另一方面提供用于在个体中测定 C3b 核酸表达或 C3b 蛋白质活性的方 法， 由此为该个体选择适当的治疗剂或预防剂 ( 此处称为 “药物基因组学” )。药物基因组学 允许基于个体的基因型来选择治疗剂 ( 例如， 药物 ) 用于个体的治疗性或预防性治疗 ( 例 如， 检查个体的基因型以测定所述个体对特定治疗剂应答的能力 )。
     本发明的另一方面涉及在临床试验中监测治疗剂 ( 例如， 药物 ) 对 C3b 蛋白质的表达或活性的影响。
     药物组合物
     本发明提供包含与药学上可接受的载体一起配制的 C3b 结合抗体 ( 完整的或结合 片段 ) 的药物组合物。所述组合物可额外地含有适合于治疗或预防补体相关疾病 ( 例如 AMD) 的一种或更多其它治疗剂。药学上可接受的载体增强或稳定组合物， 或者可用于利于 组合物的制备。 药学上可接受的载体包括， 生理上相容的溶剂、 分散介质、 包衣、 抗细菌和抗 真菌剂、 等渗剂和吸收延迟剂等。
     可通过本领域已知的多种方法施用本发明的药物组合物。施用的途径和 / 或方式 根据想要的结果而变化。优选静脉、 肌内、 腹膜内、 或皮下施用、 或在靶位点附近施用。在特 定实施方案中， 配制本发明的抗体， 使得它们可经玻璃体内向眼睛施用。 药学上可接受的载 体应适合于静脉内、 肌内、 皮下、 肠胃外、 脊柱或表皮施用 ( 例如通过注射或输注 )。根据施 用途径， 可以材料包衣活性化合物， 即抗体， 双特异和多特异分子， 以保护所述化合物免于 酸和可能失活所述化合物的其它自然条件的作用。
     组合物应该是无菌且是流体的。 可使用包衣， 如卵磷脂， 在分散情况下维持需要的 颗粒大小并使用表面活性剂来维持适当的流动性。在许多情况下， 优选在组合物中包括等 渗剂， 例如， 糖、 多元醇如甘露醇或山梨醇、 和氯化钠。 可通过在组合物中引入延迟吸收的物 质 ( 例如单硬脂酸铝或明胶 ) 产生可注射组合物的长期吸收。
     可根据本领域所熟知的且常规实践的方法制备本发明的药物组合物。参阅例如， Remington ： The Science and Practice of Pharmacy， MackPublishing Co.， 第 20 版， 2000 ； 和 Sustained and Controlled Release DrugDelivery Systems， J.R.Robinson， 编 辑， Marcel Dekker， Inc.， New York， 1978。优选在 GMP 条件下制备药物组合物。通常， 在 本发明的药物组合物中使用治疗有效剂量或有效剂量的 C3b 结合抗体。通过本领域技术人 员已知的常规方法将 C3b 结合抗体配制成药学上可接受的剂量形式。调整剂量方案来提供 最想要的应答 ( 例如， 治疗应答 )。 例如， 可施用快速灌注， 可随时间施用若干分份剂量或根 据治疗情形的紧急性指示按比例减少或增加剂量。 以剂量单位形式配制肠胃外组合物尤其 利于容易施用和剂量的均一性。 此处所用的剂量单位形式指适合作为待治疗的受试者的单 一剂量的物理分离单位 ； 每一单位含有预定量的活性化合物， 其经计算以产生与需要的药 学载体相关的想要的治疗效果。
     可改变本发明药物组合物中活性成份的实际剂量水平， 以获得活性成份的量， 其 对特定患者、 组合物和施用方式有效实现想要的治疗应答， 而对所述患者无毒。 所选剂量水 平依赖于多种药物代谢动力学因素， 包括所用本发明具体组合物或其酯、 盐或酰胺的活性、 施用途径、 施用时间、 所用特定化合物的排泄速率、 治疗的持续时间、 与所用特定组合物组 合使用的其它药物、 化合物和 / 或物质、 年龄、 性别、 体重、 状况、 一般健康和待治疗患者的 先前医疗史等因素。
     医师或兽医可以比需要达到想要的治疗效果更低的水平开始施用药物组合物中 所用本发明抗体的剂量， 并逐渐增加剂量， 直至达到想要的效果。一般地， 用于治疗此处描 述的变应性炎性病症的本发明组合物的有效剂量根据许多不同因素而变化， 所述因素包括 施用手段、 靶位点、 患者的生理状态、 患者是人还是动物、 施用的其它药剂、 以及治疗是预防 性的还是治疗性的。 需要滴定治疗剂量以使安全性和效力达到最佳。 对于抗体的全身施用，剂量范围在约 0.0001 到 100mg/kg 宿主体重， 并更一般在 0.01 到 15mg/kg 宿主体重之间。 示例性治疗方案使得每两周一次或每月一次或每 3 到 6 个月一次进行全身施用。对于抗体 的玻璃体内施用， 剂量范围在约 0.0001 到约 10mg 之间。示例性治疗方案使得每两周一次 或每月一次或每 3 到 6 个月一次进行全身施用。
     一般在多种情况下施用抗体。单次剂量的间隔可以是每周一次、 每月一次或每年 一次。如通过测定患者中 C3b 结合抗体的血液水平指示， 间隔也可以是不规则的。在全身 施用的一些方法中， 调整剂量以达到 1-1000μg/ml 的血浆抗体浓度， 在一些方法中达到 25-500μg/ml。或者， 抗体可作为持续释放制剂施用， 在所述情况下需要更不频繁的施用。 剂量和频率根据抗体在患者体内的半衰期而变化。一般地， 人源化抗体比嵌合抗体和非人 抗体显示更长的半衰期。施用的剂量和频率可根据治疗是预防性的还是治疗性的而变化。 在预防性应用中， 在长时间段内以相对不频繁的间隔施用相对低的剂量。一些患者在其余 生继续接受治疗。 在治疗性应用中， 有时候需要在相对短间隔内相对高的剂量， 直至疾病的 发展减慢或终止， 并优选直至所述患者显示疾病症状部分或彻底改善。 此后， 可对患者施用 预防性方案。 实施例 提供以下实施例来进一步阐明本发明， 但不限制其范围。本发明的其它变型对本 领域的普通技术人员而言是显而易见的并包括在所附权利要求中。
     实施例 1 ： 抗原的产生和质量控制
     生物素化 C3b 的产生
     使用来自的 Pierce 标记试剂， 以 20 倍摩尔过量的生物素化试剂生物化纯化的 C3b。在室温下进行生物素化， 并使用 0.5ml Zeba Spin 脱盐柱分离未缀合的生物素。使用 EZ-Link NHS-LC-LC- 生物素标记 C3b 的赖氨酸残基， 并使用 EZ-Link Maleimide-PEG2- 生 物素标记半胱氨酸残基。使用 HABA 测定和 LC-MS/MS 定量生物素化的程度。通过 LC-MS/MS 验证参与 C3 上硫酯键形成的单个半胱氨酸的生物素化。
     结合琼脂糖珠子的 C3b 的产生
     使 用 来 自 Amersham Biosciences(17-0851-01) 的 PD-10 脱 盐 柱 将 纯 化 的 C3b(Quidel A413， lot 903726) 缓冲液交换成偶联缓冲液 (50mM Tris， 5mM EDTA-Na， pH 8.5)。SulfoLink 偶联凝胶 (Pierce 20401) 和所有其它试剂均平衡至室温。以 4 凝胶床 体积的偶联缓冲液平衡 SulfoLink 偶联凝胶， 并离心， 去除上清液。然后将缓冲液交换的 C3b 蛋白溶液加入到离心平衡的 SulfoLink 偶联凝胶 (SulfoLink Coupling Gel) 中。混 合物在室温下摇动 15 分钟， 然后在不混合的情况下保持静止 30 分钟。然后用 3 凝胶床体 积的偶联缓冲液洗涤缀合的 C3b 偶联凝胶。然后， 向 C3b 偶联凝胶中加入 1 凝胶床体积的 Quenching Reagent( 偶联缓冲液中 50mM L- 半胱氨酸 -HCL(44889))， 并在室温下保持摇动 15 分钟。15 分钟后， 缀合的 C3b 偶联凝胶在室温下不混合的情况下保持 30 分钟。用至少 6 凝胶床体积的洗涤溶液 (1M NaCl) 洗涤缀合的 C3b 偶联凝胶， 然后用 2 凝胶床体积的除气 StorageBuffer( 含有 0.05％叠氮化纳的磷酸盐缓冲盐水 ) 进行洗涤。最后的步骤是向凝 胶床体积中加入 1 凝胶床体积的 Storage Buffer 至估计 1mg/ml 的蛋白质。
     C3b-SulfoLink 偶联凝胶蛋白浓度测定
     以下量的 C3b 在还原条件下 4-12％变性蛋白质凝胶上运行 ： 2μg、 1.5μg、 1μg、 0.75μg、 0.5μg 和 0.25μg。在这些泳道后， 还将 2μl、 4μl 和 8μl 的 50 ％珠子悬浮液 (C3b 偶联凝胶 ) 在还原性条件下上样。 由于 α 链与珠子共价连接， 它在蛋白质凝胶上将不 会出现， 因此通过比较 β 链来测定蛋白质浓度。估计 1μl 的偶联凝胶有约 1μg 的 C3b， 因 此可获得大于 90％的偶联效率。
     计算在 SulfoLink 偶联凝胶上活性 C3b 百分比
     用在 4 种不同浓度 (0.122μM、 0.244μM、 0.367μM 和 0.489μM) 的因子 B、 固定 浓度的可溶性 C3b( 所有 4 种浓度均为 0.294μM) 和固定浓度的因子 D( 所有 4 种浓度均为 0.47μM) 设置四种对照。从这些对照反应中省略因子 P。反应在 37℃下温育 15 分钟。此 时将所有对照样品立即加入到 4X 的样品缓冲液中并放于 95℃ 10 分钟， 以稍后在 4-12％ Bis-Tris 蛋白质凝胶上电泳。 C3b 偶联的珠子浓度为每 1mg 柱床体积约 1mg C3b。 以下 7 个 反应由 0.294μM 固定浓度的偶联 C3b 的珠子、 2.68μM 固定浓度的因子 P 和 0.95μM 固定浓 度的因子 D 组成。因子 B 的浓度如下 ： 0.367μM、 0.489μM、 0.978μM、 1.467μM、 1.955μM、 2.933μM 和 3.910μM。对于这 7 个反应， 除因子 D 外均在 37℃下温育 30 分钟。经 30 分钟 温育后， 加入 0.95uM 的因子 D 并将反应温育 2 分钟。此时将所有样品立即加入到 4X 样品 缓冲液中并在还原性条件下在 4-12％ Bis-Tris 凝胶上电泳。 当分析数据时， 在所有泳道中 比较 Bb 条带。
     珠子 -C3b 稳定性
     在 C3b-SulfoLink 偶联凝胶缀合后， 将珠子离心并在 100％甘油 ( 使甘油终浓度为 50％ ) 中轻轻重悬浮。随后将珠子置于 -80℃进行几次冻融 ( 检测了高达 3 次 )。随后在冰 上解冻珠子并转移至 15ml 锥形管中。加入 5 柱体积的 1XPBS 来重悬浮珠子。将其在 850g 离心 5 分钟。完成用 10 柱体积的 1XPBS 进行的两次额外洗涤。最终步骤是用 1XPBS 重悬 浮珠子获得终浓度 50％的浆料溶液。每次冻融检测 Bb 产生 ： 与 3μM 因子 B、 0.5μM 因子 D、 1μM 的 C3b 珠子和 5mM 的 MgCl 温育 1 小时并寻找完全的 Bb 产生。除此之外， 在 -80℃ 储存几周后经 Bb 产生检测冰冻的珠子。
     Cyno C3 的纯化和 Cyno C3b 的产生
     Cyno 血浆购自 Alphagenesis(Yemassee， SC)。用 PBS、 10mM EDTA 和 2 份完全的混 和抑制剂片剂 (Roche) 将 50ml 血浆稀释到 200ml。缓慢将 40％的 PEG6000 加入到溶液中 至终浓度为 4％， 并在 4 度轻轻搅拌额外 30 分钟。通过在 17,500rpm 下离心 20 分钟去除沉 淀。再次将 PEG6000 加入到上清液中至终浓度为 12.5％并在 4 度搅拌 30 分钟。17,500rpm 下离心 20 分钟后去除上清液。在 50ml 1XPBS、 10mM EDTA 缓冲液中再次溶解沉淀， 并将含 C3 的溶液通过 15ml 的蛋白质 G(GE) 柱子两次以去除 CynoIgG。用 4L 20mM Tris pH 8.0、 10mM EDTA 对来自蛋白质 G 柱子的流出液透析过夜。同时， 用 0.5M NaOH 将 20ml MonoQ 柱 (GE) 清洗， 并随后用水和大量体积的 20mM Tris pH8.0 和 10mM EDTA 清洗直至柱基线清楚 且平衡。随后将透析的溶液装载至 ATKA 100(GE) 的 MonoQ 柱中， 流速为 0.8ml/ 分钟。装 载后， 用 10 柱体积的 20mM Tris pH 8.0 和 10mM EDTA 洗涤柱子或直至基线达到稳定。用 20 柱体积的从 0 至 500mM 的 NaCl 线性梯度将所述蛋白质从柱子上洗脱下来并以 4ml/ 管收 集级分。在非还原和还原性条件下经 SDS-PAGE 凝胶鉴定级分中的 C3 蛋白峰。进一步经蛋 白质印迹和 MS 肽谱分析验证 C3。随后将纯度为 85％的 C3 级分混合并用 PBS 缓冲液通过2660sephacryl 300 凝胶过滤柱 (GE) 进一步纯化。同样经 SDS-PAGE 和 MS 分析证实 C3 峰 级分。混合纯的级分并用 millipore 浓缩器浓缩至约 1mg/ml， 等份分装并保存在 -80 度冰 箱用于后续使用。
     在 PBS 缓冲液中将 Cyno C3 稀释至 500ug/ml。通过在 PBS 缓冲液中加入 0.4μM fB(Comptech)、 0.05μM fD(CompTech) 和 5mM MgCl2 将 C3 完全转化为 C3b， 并在室温温育 30 分钟。随后通过 2660sephacryl 300 凝胶过滤柱将所述 C3b 进一步纯化。混合含 C3b 的 峰组分， 其由 millipore 浓缩器浓缩。在 C3 转化酶测定中检测 cyno C3b 的活性。所述蛋 白质显示出与人 C3b(CompTech) 相当的 Bb 产生活性。
     通过补体因子和商品化抗体结合进行 C3b 试剂的质量控制
     酶联免疫吸附测定 (ELISA) 结合 ( 表位保守性 )
     在 ELISA 中比较生物素化的 C3b 分子和非生物素化的 C3b， 来评估由市售抗体识别 的 C3b 表位的保守性。
     用包被缓冲液 ( 碳酸氢盐 pH 9.5-9.8) 中 2μg/ml 的 100μl/ 孔市售抗 C3 或抗 C3b 抗体包被 Maxisorp 板， 并将其在 4℃温育过夜。用 PBST 洗涤 3 次后， 用 300μl/ 孔稀 释剂 (Synblock， AbD Serotec) 在室温下封闭所述板 2 小时。抽出封闭溶液后， 在稀释剂 中稀释的 100μl C3b(+/- 生物素 ) 样品在室温下温育 1 小时。加入在稀释剂 ( 多聚 HRP 稀释剂 ) 中 1 ∶ 5000 稀释的 100μl/ 孔 Strep-HRP( 聚 HRP 链霉抗生物素蛋白 ) 或 HRP 缀 合的抗 C3Ab 30 分钟。用 PBST 洗涤 4 次后， 加入 100μl/ 孔 TMB 底物 (Ultra TMB 底物溶 液 )5-10 分钟。 通过 50μl/ 孔的终止液 (2N H2SO4) 来终止反应。 读取吸光度 (A450-A570) 并使用 SoftMax Pro 分析数据。
     通过补体因子和商业化 Abs 的结合
     检测琼脂糖珠子上固定的 C3b 其结合商业化抗体和补体因子蛋白的能力。
     向各管中加入 4μl 的 C3b 珠子浆料 ( 对应于～ 1μg 的 C3b)。将珠子重悬浮于 100μl 稀释剂中。然后利用稀释剂 +Ab 或补体因子蛋白使管中的总体积达到 200μl。在 室温下摇动管 1 小时， 然后用稀释剂洗涤 1 次。向小柱中应用珠子浆料， 并再洗涤 2 次。快 速甩出剩余的液体 (1,200G， 1 分钟 )。塞紧柱子， 然后加入稀释剂中 500μl 的二级抗体或 抗补体因子 Ab(1 ∶ 5000)。在室温下温育 1 小时， 然后用稀释剂洗涤 4 次。[ 对于补体因 子， 利用二级 Ab 重复上述步骤 ]。快速甩出剩余的液体 (1,200G， 1 分钟 )。填充柱子， 然 后加入 100μl 的 TMB 底物。将液体快速甩入 (1,200G， 1 分钟 ) 新鲜管中。转移溶液到 96 孔板中。用 50μl/ 孔终止溶液 (2N H2SO4) 终止反应。读取吸光度 (A450-A570)， 并使用 SoftMax Pro 分析数据。
     实施例 2 ： 从 HuCAL 文库中产生 C3b 特异性抗体
     使用市售噬菌体展示文库 Morphosys HuCAL 文库作为抗体变体蛋白 质来源， 通过选择具有高结合亲和力的克隆产生抗 C3b 抗体。HuCAL 文库是 Fab 文库 (Knappik 等， 2000)， 其中所有六个 CDR 均因适当突变而变得多样化， 并且其使用 CysDisplay TM 技术将 Fab 连接到噬菌体表面 ( 例如见 WO01/05950)。
     HuCAL 噬菌体 - 抗体提供为 12 个单独的子库 ： VH1κ、 VH1λ、 VH2κ、 VH2λ、 VH3κ、 VH3λ、 VH4κ、 VH4λ、 VH5κ、 VH5λ、 VH6κ、 VH6λ。根据特定实验需要， 可以 任何组合混合 12 个子库。对于结合 C3b 的抗体的选择， 应用三种不同的淘选策略 ：a) 利用生物素化的人 C3b 的溶液淘选， 其中通过链霉抗生物素蛋白磁珠捕获噬菌 体 - 抗原复合体，
     b) 基于珠子的淘选， 其中 C3b 结合到琼脂糖珠子上， 和
     c) 差异肽淘选， 其中偶联到载体蛋白的肽上的选择循环与全长 C3b( 结合琼脂糖 珠子的生物素化 ) 上的选择循环交替进行。
     噬菌粒复苏、 噬菌体扩增和纯化
     在 含 有 34μg/ml 氯 霉 素 和 1 ％ 葡 萄 糖 的 2xYT 培 养 基 (2xYT-CG) 中 扩 增 HuCAL 文库。在用 OD600nm 为 0.5 的 VCSM13 辅助噬菌体感染后 (37℃下不摇动， 30 分钟 ； 37℃下 250rpm 摇动 30 分钟 )， 将细胞离心 (4120g ； 5 分钟 ； 4℃ )， 在 2xYT/34μg/ ml 氯霉素 /50μg/ml 卡那霉素 /0.25mM IPTG 中重悬浮， 并在 22℃下培养过夜。从上清液 中 PEG 沉淀噬菌体， 将其在 PBS/20％甘油中重悬浮并储存在 -80℃。 如下进行两个淘选循环 之间的噬菌体扩增 ： 用洗脱的噬菌体感染对数中期大肠杆菌 TG1 细胞并接种到补充有 1％ 葡萄糖和 34μg/ml 氯霉素的 LB 琼脂 (LB-CG 平板 ) 上。在 30℃下过夜温育后， 从琼脂平板 上刮去所述 TG1 菌落， 并将其用于接种 2xYT-CG， 直至达到 0.5 的 OD600nm。如上所述加入 VCSM13 辅助噬菌体用于感染。
     溶液淘选
     用于该淘选策略中的抗原是生物素化的 C3b。存在生物素化 C3b 的两种不同生物 素化的变体。 在一种变体中， 生物素通过附着到 C3b 上半胱氨酸残基的马来酰亚胺 -PEG- 接 头连接 C3b。该变体在下文中称为 C3b- 半胱氨酸 - 生物素。在另一变体中， 生物素通过附 着到 C3b 上的 3 个不同赖氨酸残基的磺基 -NHS-LCLC- 接头连接 C3b。该变体在下文中称为 C3b- 赖氨酸 - 生物素。在选择循环中交替进行两种不同变体上的选择， 以不选择结合接头 分子的噬菌体。
     用 PBS 洗 涤 链 霉 抗 生 物 素 蛋 白 磁 珠 (Dynabeads M-280 ； Dynal) 一 次， 并用 Chemiblocker 在室温下封闭 2 小时。还在旋转器上利用 Chemiblocker 在室温下封闭 PBS 洗脱的噬菌体 1-2 小时。封闭的噬菌体针对封闭的链霉抗生物素蛋白磁珠预吸附两次 30 分钟。将噬菌体上清液转移到新封闭的 2ml 反应管中， 加入人生物素化的 C3b， 并将混合物 在室温下旋转器上温育 1-2 小时。向各淘选库中加入 100μl 封闭的链霉抗生物素蛋白磁 珠， 并在旋转器上温育 20 分钟。用颗粒分离器 (Dynal MPC-E) 收集珠子大概 2.5 分钟， 并 小心地去除溶液。
     然后使用旋转器在 PBST 中洗涤珠子 7 次， 随后用 PBS 再洗涤 3 次。向各管中加 入 10mM Tris/HCl pH 8 中的 200μl 20mM DTT 从 Dynabeads 上洗脱噬菌体， 并温育 10 分 钟。通过磁性颗粒分离器去除 Dynabeads， 并向生长至 OD600nm 为 0.6-0.8 的 14ml 大肠杆 菌 TG-1 培养物中加入上清液。为了噬菌体感染， 在 37℃下 50ml 塑料管中不摇动情况下温 育所述培养物 45 分钟。4120xg 离心 5 分钟后， 细菌沉淀物各自在 800μl 2xYT 培养基中重 悬浮， 接种到 3xYT-CG 琼脂平板上， 并在 37℃下温育过夜。从所述平板上刮去菌落， 如上所 述复苏噬菌体并进行扩增。以与第一轮选择相同的方式进行第二轮和第三轮选择。
     为了选择 C3b 特异性噬菌体， 在多个子库中应用利用 C3 蛋白质的几种不同封闭方 法。一般地， 当用 Chemiblocker 封闭噬菌体时， 加入纯化的 C3 或含有 C3 的血清， 并在旋转 器上温育 1-2 小时。因此， 当与 C3b 接触时， 可能的 C3b/C3 交叉反应性噬菌体应该已结合到抗原上并应仅选择 C3b 特异性噬菌体。对于淘选 1812.1， 以 10 倍摩尔过量加入纯化的 C3( 仅在第一轮过程中 )。对淘选 1889 的子库 1-6 不应用封闭。对于子库 7-12， 在所有三 轮选择中应用使用人血清的多种封闭条件。对于子库 7 和 8， 加入未稀释的人血清， 产生超 过 C3b 大约 70 倍摩尔过量的 C3。因为我们担心血清因子可能降解 C3b， 所以加入蛋白酶抑 制剂 (Pefabloc SC， Roche， 终浓度 4mM)。对于子库 9-12， 加入稀释的人血清， 产生超过 C3b 大约 2 倍摩尔过量的 C3。子库 9 和 10 含有蛋白质抑制剂， 对于库 11 和 12 不加入抑制剂。
     基于珠子的淘选
     用于基于珠子淘选的抗原是偶联 sulfolink 琼脂糖珠子的 C3b。通过 MorphoSys 利用半胱氨酸 ( 来自 SulfoLink Immobilization Trial Kit) 处理琼脂糖珠子 (SulfoLink Coupling Gel) 产生用于将噬菌体预吸附到封闭的柱子上的珠子， 所述半胱氨酸封闭珠子 上所有可能的结合位点。
     在旋转器上室温下， 用 Chemiblocker 封闭 PBS 稀释的噬菌体 1-2 小时。封闭的噬 菌体预吸附封闭的琼脂糖珠子两次， 30 分钟。将噬菌体上清液转移到新的封闭的 2ml 反应 管中， 加入偶联人 C3b 的琼脂糖珠子， 并在旋转器上室温下温育混合物 1-2 小时。通过在台 式离心机中离心 (1000g， 1 分钟 ) 收集琼脂糖珠子， 并去除上清液。通过在 1ml 洗涤缓冲液 中温和重悬浮、 在洗涤缓冲液中温育并通过离心收集来反复洗涤沉淀物。
     通过向各管中加入 10mM Tris/HCl pH 8 中的 200μl 20mM DTT， 并温育 10 分钟从 琼脂糖珠子上洗脱噬菌体。通过离心沉淀珠子， 并向生长至 OD600nm 为 0.6-0.8 的 14ml 大 肠杆菌 TG-1 培养物中加入上清液。为了噬菌体感染， 在 37℃下 50ml 塑料管中不摇动情况 下温育所述培养物 45 分钟。4120xg 下离心 5 分钟后， 细菌沉淀物各自在 800μl 2xYT 培养 基中重悬浮， 接种到 3xYT-CG 琼脂平板上， 并在 37℃下温育过夜。从平板上刮去菌落， 如此 处所述复苏噬菌体并进行扩增。以与第一轮选择相同的方式进行第二和第三轮选择。
     琼脂糖珠子的沉淀物难以看得见， 并且容易溶解在上清液中。因此， 决定使用至 少 25μl 珠子， 以能够看得见沉淀物。这导致相对高的抗原浓度， 其对于第一轮对于所有子 库是不同的， 因为使用了不同的体积。第一轮子库中 C3b 的浓度大约如下 ： 子库 1820.1 中 为 189nM、 子库 1820.2 中为 128nM、 子库 1820.3 中为 257nM、 子库 1820.4 中为 98nM、 子库 1820.5 和 1820.6 中为 66nM。在第二轮选择中， C3b 浓度是， 子库 1820.1-3 中为 112nM， 子 库 1820.4-6 中为 57nM。在第三轮选择中， C3b 的浓度在所有子库中为 57nM。
     通过加入纯化的 C3 至大约 475nM 的终浓度将利用 C3 的封闭应用到子库 1820.4-6 的第一轮选择中。
     差异肽淘选
     用于差异肽淘选的抗原是代表 C3b 上不同表位的肽。这些肽在蛋白质结构分析中 已经鉴定为 C3b 特异的， 所述分析比较 C3b 相比于 C3 上表面暴露的残基。通过上文描述的 MorphoSys 进行与两种不同载体蛋白 BSA 和转铁蛋白的偶联。在选择循环中必须交替两种 不同的载体蛋白， 以不选择结合载体蛋白的噬菌体。此外， 在肽上的选择循环与在全长 C3b 上的选择循环交替进行， 以保证所选的噬菌体结合到正确折叠的全长 C3b 上。
     肽淘选中的实际淘选步骤是使用肽偶联载体蛋白作为结合 Maxisorp 平板的抗原 的固相淘选。用 PBS 中浓度为 50μg/ml 的偶联肽的 300μl 载体蛋白包被 Maxisorp 平板 (F96 Nunc-Immunoplate) 一定数量的孔 ( 取决于预封闭噬菌体的体积 )。密封平板并在4℃温育过夜。
     用 400μl PBS 洗 涤 包 被 的 孔 两 次， 并 在 微 量 滴 定 板 摇 床 上 室 温 下 用 350μl PBS/5％奶粉封闭 2 小时。在旋转器上室温下用 PBST/5％奶粉和终浓度为 0.5％ (v/v) 的 未偶联载体蛋白封闭噬菌体 2 小时。在封闭程序后用 400μl PBS 洗涤包被的孔两次。向 各包被孔中加入 300μl 预封闭的噬菌体， 并在摇床上室温下温育 2 小时。通过加入七次 400μl PBST 进行洗涤， 然后用 PBS 洗涤七次 ( 细节见表 8 和 10)。
     以每孔 10mM Tris/HCl pH8 中的 300μl 20mM DTT 从平板上洗脱噬菌体 10 分钟。 向在 37℃下 2YT 培养基中生长至 OD600 为 0.6-0.8 的 14ml 大肠杆菌 TG-1 中加入 DTT 噬菌 体洗脱液， 并为了噬菌体感染， 在 37℃下 50ml 塑料管中不摇动情况下温育 45 分钟。 4120xg 离心 5 分钟后， 细菌沉淀物各自在 600μl 2xYT 培养基中重悬浮， 接种到 3xYT-CG 琼脂平板 上， 并在 37℃下温育过夜。从所述平板上刮去菌落， 如此处所述复苏噬菌体并进行扩增。
     对于淘选 1849， 第一轮和第三轮选择是如上所述进行的肽淘选。第二轮是如此处 所述在结合琼脂糖珠子的 C3b 上的选择， 稍微做了以下修改 ： 已经使用奶粉而非半胱氨酸 封闭了用于噬菌体预吸附的琼脂糖珠子上的结合位点， 还如上所述在 PBST/5％奶粉中预封 闭所述噬菌体。对于淘选 1883， 第一轮和第三轮选择是使用如此处所述进行的生物素化 C3b 的溶液淘选。第二轮是如上所述的肽淘选 ( 该部分 )。
     淘选结果
     三轮淘选后选择的克隆已经亚克隆到表达载体中， 然后筛选与用于选择中的 C3b 或肽的结合。认为显示高于背景水平至少 2 倍的结合信号的克隆为初级命中。
     第一轮溶液淘选 1812 的输出是筛选在 Neutravidin 平板上与生物素化的 C3b 的 结合， 产生 531 个初级命中。以 C3b 筛选鉴定的 78 个克隆平行进行在生物素化的 C3 上的 筛选， 其在 C3b 上比在 C3 上显示更强的信号。78 个克隆的序列分析揭示了 27 条独特序列， 其中 19 条是结合并纯化的。仅小比例的这些克隆在捕获 ELISA 中显示与 cyno C3b 的交叉 反应性。鉴定 cyno 交叉反应性 C3bneo 抗体为本发明抗体的期望性状， 并特异选择 C3bneo 结合子的 cyno 交叉反应性。从 Cyno 猴血浆中纯化 Cyno C3b 蛋白， 并且在筛选过程中纯的 cyno C3b 作为抗原与人 C3b 一起使用。猕猴是极好的非人灵长类安全 / 毒性物种。期望 C3bneo 抗体与 cyno 的潜力和亲和力在人的 5-10 倍以内。选择该标准， 以实现对 cyno 中 C3b 浓度的显著抑制， 因此允许评估显著抑制 C3b 浓度引起的可能毒性。在筛选期， 因为没 有或有弱 cyno 交叉反应性， 必须丢弃许多克隆。为了鉴定更多的 cyno 交叉反应性克隆， 进 行淘选 1812 的再筛选。为了再筛选， 选择 178 个克隆， 其已经在 Neutravidin 平板上显示 了与 C3b 的显著结合 ( 高于背景至少 5 倍 ) 并且之前并未测序过。178 个克隆中的 38 个显 示与 cyno C3b 的结合， 并进一步进行 C3 反筛 (counter screen)。38 个克隆中的 10 个进 行反筛， 产生纯化的 1 个新的独特克隆。
     使用巯基平板的 ELISA 用于筛选基于珠子的淘选 1820。79 个初级命中， 49 个在 C3b 上比在 C3 上显示更强的信号。将这些测序， 产生 13 条独特序列， 其中 7 条是结合且纯 化的。
     筛选来自不同肽淘选 1849 的微表达 Fabs 与用于各选择的肽的结合。偶联肽的载 体蛋白用作 ELISA 中的直接包被抗原。 鉴定了 2944 中的 566 个初级命中， 但仅 22 个初级命 中显示高于背景至少 5 倍的信号。这 22 个克隆和 32 个额外克隆 ( 其显示接近背景 5 倍的信号 ) 进一步进行筛选， 以检查与全长 C3b 的结合。54 个克隆中没有一个显示与全长 C3b 的结合。
     与先前的差异肽淘选相反， 在差异肽淘选 1883 中进行全长 C3b 上的两轮选择和肽 上的仅一轮选择。淘选 1883 的结果是在捕获 ELISA 中筛选与 C3b 的结合。4416 个克隆的 筛选产生了 497 个初级命中。已经显示高于背景至少 5 倍信号的 275 个初级命中进一步进 行反筛。将经过反筛的 183 个克隆测序， 产生 9 个独特克隆。7 个独特克隆是结合且纯化 的。
     第二轮溶液筛选 1889 的结果是在捕获 ELISA 中筛选与 C3b 的结合， 产生 4416 个初 级命中的 2878 个。大多数初级命中 (2469/2878) 显示高于背景至少 5 倍的结合信号。决 定挑选 396 个代表性克隆进行反筛， 其来自不同淘选子库并具有不同的信号强度。 396 个克 隆中的 158 个通过反筛， 并进行测序， 产生 14 条独特序列和最终 11 个纯化的 Fabs。为了 不丢失任何感兴趣的克隆， 检测对 C3b 具有高于背景至少 5 倍结合信号的剩余克隆与 cyno C3b 的结合， 所述剩余克隆 (2073/2469) 未曾进行反筛选。筛选所得的 129 个 cyno 交叉反 应性克隆对 C3b 相比于 C3 的特异性。25 个克隆显示优于 C3 结合的 C3b 选择性， 最后产生 4 条新的独特序列。4 个克隆中的 3 个是结合且纯化的。
     表位装箱 (Epitope bining)
     根据制造商说明， 使用试剂盒 (ECL Protein biotinylation Module， GE) 生物素 化纯化的 Fabs。通过使其流过 Zeba Desalt Spin Column(Pierce) 从未结合的生物素上 清洗生物素化的 Fab。检测与生物素化的 Fab 的人 C3b 的结合活性， 在捕获 ELISA( 此处所 述 ) 中直接与其未生物素化的前体 (progenitor) 比较。仅挑选其结合活性未受生物素化 影响的 Fabs 继续研究。
     通过竞争 ELISA 进行表位装箱。所用的捕获抗体是指向 C3b 蛋白质兔多克隆抗人 C3d Ab， Abcam 的抗体， 其是 C3b 的亚结构域。用在 PBS 中稀释到 2μg/ml 的捕获抗体填充 Maxisorp 平板的孔。密封平板并在 4℃下温育过夜。
     第二天， 通过加入 PBST/5％奶粉封闭平板上剩余的结合位点。平板在室温下温育 1 小时， 然后用 PBST 洗涤 2 次。以在 PBST/5％奶粉中稀释的终浓度为 2.5μg/ml 加入 C3b。 平板在室温下温育 1 小时， 然后用 PBST 洗涤 2 次。
     同时， 均在 PBS 中稀释的终浓度 2.5μg/ml 的 C3b、 生物素化的 Fab 和未生物素化 的 Fab( 高于生物素化的 Fab 100 倍摩尔过量 ) 加入到孔中。平板在室温下温育 1 小时， 然 后用 PBST 洗涤 2 次。
     为了检测生物素化的 Fabs， 加入 AP 缀合的链霉抗生素蛋白 (Zymed)， 平板在室温 下温育 1 小时， 然后用 TBST 洗涤 5 次。根据制造商的说明书使用荧光底物 AttoPhos。在 Tecan GENios Pro 平板读出器上测量荧光。
     通过如上所述的竞争 ELISA 进行表位装箱。向人 C3b 中加入生物素化的 Fab 和未 生物素化的 Fab(100 倍过量 ) 的混合物。检测生物素标记。阴性对照 Fab MOR03207 获得 的信号设置为 100％值。与 100％信号相比评定抑制。
     鉴定了 6 个表位组 ( 在下文表中进行了概述 )。组 B 和 C， 以及组 D 和 E 共有部分 重叠的表位。
     表2： 表位组的概述
    实施例 3. 亲和力成熟和优化
     产生亲和力成熟文库
     为了增加所选抗体片段的亲和力和生物活性， 使用三核苷酸定向诱变通过盒诱变 平行地优化 L-CDR3 和 H-CDR2 区 ( 等， 1994)， 而构架区保持不变。在克隆用于
    亲和力成熟之前， 所有亲本 Fab 片段从相应的表达载体 (108x9_MH) 经过 XbaI/CN 102459334 A说明书23_LHC 产生105/123 页EcoRI 转移到 CysDisplayTM 载体 个 BssHII 位点从 HuCAL 展示载体25_LHC 中。通过去除干扰文库克隆的一 25_LHC， 用于 H-CDR2 优化。
     为了优化亲本 Fabs 的 L-CDR3， 通过 BpiI/SphI 去除轻链 (405bp) 的 L-CDR3、 构架 4 和恒定区， 并用多样化 L-CDR3 与构架 4 和所述恒定域的所有组成成分替换。大约 1.5μg 的 Fab 载体片段与 3 到 5 倍摩尔过量的携带多样化 L-CDR3s 的插入片段连接。在第二个文 库组中， 使 H-CDR2(XhoI/BssHII) 多样化， 而连接构架区保持不变。为了监测克隆效率， 在 将多样化 H-CDR2 盒克隆之前用模拟物替换亲本 H-CDR2。
     在 4ml 大肠杆菌 TOP10F 细胞 (Invitrogen， Carlsbad， CA， USA) 中将文库的连接 混合物电穿孔， 产生 108 到 109 个独立克隆。该文库大小保证覆盖理论多样性。如此处所 述进行文库的扩增。对于质量控制， 随机挑取单个克隆并进行测序。
     制备噬菌体用于亲和力成熟淘选
     在 含 有 34μg/ml 氯 霉 素 和 1 ％ 葡 萄 糖 (2xYT-CG) 的 2xYT 培 养 基 中 扩 增 成熟文库。用 OD600nm 为 0.5 的 VCSM13 辅助噬菌体感染后 ( 在 37℃， 不摇动 30 分钟 ； 在 37℃， 250rpm 摇动 30 分钟 )， 收集细胞 (4120xg ； 5 分钟 ； 4℃ )， 在 2xYT/34μg/ ml 氯霉素 /50μg/ml 卡那霉素 /0.25mMIPTG 中重悬浮并在 22℃下培养过夜。从上清液中 PEG 沉淀噬菌体两次， 在 PBS 中重悬浮并如下所述用于成熟淘选。
     (a) 成熟淘选
     用于成熟中的选择方法是如上文所述的溶液淘选。 为了增加淘选的严格性并选择 提高的解离速率， 降低抗原浓度并应用延长的洗涤条件 ( 高达 24 小时 )。在 4℃下进行过 夜洗涤步骤， 所有其他洗涤步骤在室温下进行。
     选择亲和力成熟的候选物
     已经在多种测定中表征了来自初次淘选的 Fabs。 根据以下标准将它们分级并分组 成可能的成熟候选物 ：
     ●结合 C3b 相比于结合 C3 的选择性
     ●溶血测定中的潜力
     ● C3b 和 MAC 沉积测定中的潜力
     ●作用方式
     ●表位箱
     ●亲和力
     8 个一级抗体进行成熟， 其因此在下文中称为 “亲本” 抗体。
     亲本抗体 MOR08035、 8598 和 8599 属于初次淘选后发现的最大一组 Fabs。它们是 表位箱 D 的成员， 在功能测定中展示活性， 并抑制 C3 和 C5 转化酶。这些抗体强烈抑制因子 B 与 C3b 的结合， 抑制因子 H 结合的程度较低。
     亲本抗体 MOR08552 展示相同的特征， 只是其具有稍微不同的表位 ( 箱 C)。
     MOR08672 和 MOR08675 均属于表位箱 D。它们非常好地抑制因子 H 的结合， 但仅显 示对其它因子结合的弱抑制。它们可能通过与上文抗体不同的机制起作用。同样， 缺少其 它因子的竞争可以导致以较低亲和力实现相同潜力。这种论点尤其用于 MOR08675， 其显示 适当的潜力， 尽管与 C3b 的亲和力实际上是低的。MOR08555 是表位组 C 的成员， 其与 MOR08305 组具有相似的特征， 但不抑制 C5 转化酶。 MOR08653 属于表位箱 B， 其与箱 C 部分重叠。其在功能测定中的存在导致对所检 测的所有机制的抑制 ： 因子 P、 因子 B 和因子 H 的结合、 C3b 二聚体形成的抑制以及 C3 和 C5 转化酶的抑制。
     分别构建来自各亲本的成熟文库， 以能够在淘选库的组成中维持灵活性。在稍晚 时间点上编辑库。对于各亲本抗体， 根据抗体发挥的主要抑制机制定义靶 KD 值。在 2 个库 的各库中编辑 MOR08598 和 MOR08653， 还有 MOR08555 和 MOR08599。在每各库中， 抗体展示 对抗原的相似亲和力， 很好地表达， 具有相同的靶 KD， 并且不共有重叠表位。
     用于亲和力成熟的文库
     通过 LCDR3 和 HCDR2 盒的平行交换进行亲和力成熟。通过三核苷酸定向盒诱变
    优化 CDR 序列。将来自表达载体 25 中。
    x9_Fab_MH 的 Fab 片段克隆到噬菌粒载体通过标准克隆方法产生 16 个不同的亲和力成熟文库 ( 对于各亲本抗体， 一个 LCDR3 和一个 HCDR3 文库 ) 并将多样化的克隆转化到电感受态大肠杆菌 TOP10F ′细胞 (Invitrogen) 中。文库大小合适， 在 5x108-4x109 范围内。对随机挑取的克隆测序显示 100％的多样性。在挑取的克隆中没有发现亲本结合子。最后， 分别制备了所有 16 个文库 的噬菌体。
     用于亲和力成熟的淘选策略
     在选择过程中分别保存 HCDR2 和 LCDR3 文库。8 个亲本中的 4 个处理为前导 ； 其 余 4 个亲本在 2 个库中各自排列。从所产生的亲和力成熟文库中复苏的约 1012 个噬菌体 进行成熟淘选。
     使用生物素化的抗原进行使用各噬菌体库的溶液淘选， 在人和 cynoC3b 之间交 替。为了增加淘选严格性并选择提高的解离速率， 降低抗原浓度并应用延长的洗涤条件 ( 高达 24 小时 )。在上文中概述了淘选和洗涤条件。成熟淘选后， 将富集的噬菌粒库亚克 隆到
    x9_MH 表达载体中。亲和力筛选和成熟淘选结果
     从所有淘选中筛选了共 2464 个克隆作为在人 C3b 上具有提高亲和力的细菌裂解 物。通过溶液平衡滴定 (SET) 评估初步的亲和力。认为估计与其亲本克隆相比亲和力提高 的克隆是初级命中。 从各淘选子库中获得初级命中， 并对所有初级命中测序， 8305-LCDR3 文库除外， 其 中对 65 个初级命中最好的 17 个测序。在 261 个初级命中中鉴定了共 173 条独特序列。可 鉴定来自所有亲本 Fabs( 除了 MOR08598) 的衍生物。从亲本 MOR08552 和 MOR08599 中没有 鉴定到 HCDR2 成熟的衍生物。
     选择亲和力优化的 Fabs 用于蛋白质纯化
     将独特的初级命中挑取到微孔培养板中， 并用于微量表达 Fab。Fab 裂解物用于第 二轮筛选中， 在捕获 ELISA 中检测与人 C3b、 cyno C3b 的结合、 在捕获 ELISA 中检查与对抗 靶标 C3d 和 C5 的交叉反应性， 并进行反筛。通过筛选的克隆继续用于研究。目的是从各亲 本中大规模表达并纯化大约 12 种衍生物。在多于 12 种衍生物通过第二轮筛选的情况下，
     用于蛋白质纯化的选择基于序列变异性。以下段落详细描述了各淘选子库的选择方法。
     已经从亲本 MOR08305 中鉴定了在 HCDR2 中成熟的 23 个独特克隆， 和在 LCDR3 中成 熟的 11 个克隆。 21/23HCDR2 成熟的克隆通过了反筛， 并且 18/21 与人 C3b 很好地结合。 但仅 1/18 克隆与 cyno C3b 显示很好的结合。选择该克隆 (MOR09124) 用于大规模纯化。根据序 列变异性选择额外的 5 个克隆用于大规模纯化。纯化对 MOR09122 不起作用。3/11LCDR3 成 熟的克隆不经过反筛， 但 2/3 包括在大规模纯化中 (MOR09130 和 9131)， 因为它们在人 C3b 上的高结合信号暗示了低亲和力， 其反过来可导致在血清上的残余结合。纯化对 MOR09132 不起作用。
     已经从亲本 8552 中鉴定了 16 个 LCDR3 成熟的衍生物。根据上文描述的相似标准 选择 7/16 的衍生物用于大规模纯化。但对于它们全部， 纯化均失败了。因此， 所有剩余 9 种衍生物进行大规模纯化。纯化仅对 2/9(MOR09308 和 9313) 起作用。
     已经从亲本 MOR08555 中鉴定到了在 HCDR2 中成熟的 1 个独特克隆， 和在 LCDR3 中 成熟的 3 个独特克隆。因为总共仅有 4 种衍生物， 决定全部纯化它们， 不管它们在第二轮筛 选中的行为。
     已经从亲本 MOR08599 中鉴定到了在 LCDR3 中成熟的 25 个独特克隆。它们中的大 多数在第二轮筛选过程中进行的所有测试中表现良好。 用于大规模纯化的克隆的选择基于 序列变异性。
     已经从亲本 MOR08653 中鉴定到了在 HCDR2 中成熟的 25 个独特克隆， 和在 LCDR3 中 成熟的 10 个独特克隆。各亚组中仅 1 个在反筛中表现良好。这些克隆 (MOR09198 和 9202) 继续用于研究。其它克隆的选择基于序列变异性。
     已经从亲本 MOR08672 中鉴定到了在 HCDR2 中成熟的 5 个独特克隆， 和在 LCDR3 中 成熟的 29 个独特克隆。仅 1/5HCDR2 成熟的克隆通过反筛， 并继续用于研究 (MOR09139)。 选择了 2 个额外的 HCDR2 成熟的克隆。纯化仅对 MOR09137 起作用。大多数 LCDR3 成熟的 克隆在第二轮筛选中表现良好。这些克隆的选择基于序列变异性。
     已经从亲本 MOR08675 中鉴定到了在 HCDR2 中成熟的 7 个独特克隆， 和在 LCDR3 中 成熟的 17 个独特克隆。1/7HCDR2 成熟的克隆显示仅与人和 cyno C3b 的弱结合， 并且被排 除在外。在剩余的 6 个克隆中， 仅 3 个不含有潜在的糖基化位点， 并进行大规模纯化。在选 择中包括含有潜在的糖基化位点的 2 个额外克隆。大多数 LCDR3 成熟的克隆在第二轮筛选 中表现良好。这些克隆的选择基于序列变异性。
     选择亲和力优化的 Fabs 继续研究
     考虑了先前部分中给出的所有可用数据， 包括未显示的与亲和力优化的 Fabs 的 表征相关的数据 ( 例如， 结合亲和力、 溶血的抑制、 C3b 沉积的抑制 ) 后， 选择最佳 Fabs 继续 研究。选择由 22 个成熟的 Fabs 组成， 其来自 4 种不同的亲本抗体。表 5 概述了所选 Fabs 的关键特征。
     表5： 被选择用于继续研究的 22 个成熟的 Fabs 的关键特征
    优化的 Fabs 的 IgG 转化以及在 IgG 水平上的杂交克隆
     将所有 8 个亲本 Fabs、 几个成熟的 Fabs 和具有期望谱的几个成熟修复 ( 去除潜在 糖基化位点的 )Fabs 亚克隆到人 IgG 形式中。
     通过用轻链和重链构建体的组合转染细胞完成 IgG 水平上的杂交克隆。因为 MOR09124 是鉴定到的唯一 HCDR2 成熟的克隆， 所以杂交克隆仅对各家族 (MOR08305 衍生 物 ) 是可能的， 其中 MOR09121 的重链与其它成熟家族成员的轻链组合。为杂交克隆给出了 新的 MOR 号， 其概述于表 8 中。
     表8： 杂交克隆抗体的 MOR 号。
    
     MOR0 9395 9396 9397 9398 9399 9400
     类型 杂交克隆 杂交克隆 杂交克隆 杂交克隆 杂交克隆 杂交克隆 MOR0 的重链 9124 9124 9124 9124 9124 9124 MOR0 的轻链 9128 9129 9130 9131 9255 9256在上述亲和力成熟的 Fabs、 修复的 Fabs( 去除糖基化位点的 )， 和杂交克隆的 Fabs 中， 根据此处描述的方法测定 Fabs 9124、 9397、 9398、 9136、 9141、 9373 和 9423 的结合特征。表 9 概述了这些 Fabs 的结合亲和力、 功能潜能和补体因子结合的抑制。
    在下文详细描述了用于测定在表 8 中概述的 Fabs 的结合亲和力和功能性质的方法。如从表 8 中的数据可以看出， 本发明的 Fab 片段能够以低于或等于 100pM， 在许多情况 下以低于或等于 10pM 的亲和力结合人和猕猴 C3b。此外， Fab 片段以低于或等于 100nM， 在 大多数情况下低于或等于 50nM 的 IC50 显示对人和猕猴 C3b 的功能潜能。
     实施例 4IgG 形式的 C3b 结合子的产生和表征
     IgGs 的种系化
     通过 Geneart(Geneart AG， Regensburg， Germany) 将编码轻链和重链的免疫球蛋 白可变区的 pM2 表达载体中的区域种系化并进行优化， 以匹配种系化序列， 避免不适合在 哺乳动物细胞中表达的密码子， 并避免隐藏的剪接位点。 将所有重链的 N 末端 QVQ 变成 EVQ， 因为末端 Q 可能形成 pyroglutamine。选择来自各亲本家族的抗体， 用于种系化 / 优化。简 言之， 如下在 IgG 形式中种系化并表达抗体。
     转化成 IgG
     为了表达全长免疫球蛋白， 将 Fab 重链 (VH) 和轻链 (VL) 的可变结构域片段从 Fab 表达载体亚克隆到 IgG1 表达载体中。限制酶 MfeI 和 BlpI 用于将 VH 结构域片段亚克隆到 2_h_IgG1AA 中， 其中 234 和 235 位上的亮氨酸突变成丙氨酸来消除 FcRγ 结 合并减弱效应功能。经 EcoRV 和 BsiWI 位点将 VL 结构域片段亚克隆至 Igκ 中， 而使用 EcoRV 和 HpaI 完成亚克隆到
    2_h_2_h_Igλ2 中。人 IgG 的瞬时表达和纯化
     用 1 ∶ 1 的比例的 IgG 重链和轻链表达载体 DNA 转染真核 HKB11 和 HEK293 细胞。 在转染后 3 天或 7 天收集细胞培养物上清液， 并进行标准的 A 蛋白亲和层析 (MabSelect SURE， GE Healthcare)。除非另有说明， 缓冲液交换成 1x Dulbcecco ′ s PBS(pH 7.2， Invitrogen) 并无菌过滤样品 (0.2μm)。 在 SDS-PAGE 中或通过使用 Agilent BioAnalyzer 分析变性的还原和非还原条件下的 IgG 的纯度， 并通过 HP-SEC 分析天然状态中 IgG 的纯 度。
     为种系化的抗体给出了新的 MOR 号， 如表 10 中所示。
     表 10 ： 种系化的抗体的 MOR 号。
     种系化抗体的 MOR0 9555 9556 9609 9610 9611 9612 祖先抗体的 MOR0 9140 9124 9136 9141 9397 9398114CN 102459334 A 9613 9674 9675
    说明书9314 9373 9423111/123 页当然， 进一步表征了种系化抗体 9556、 9611、 9612、 9609、 9610、 9674 和 9675。
     亲和力测定
     C3bneo 抗体通过结合 C3b 分子上的新表位阻断补体激活。C3b 上的新表位也是血 浆中其它丰富补体蛋白的结合位点， 例如因子 H、 因子 B 和因子 P， 其通过旁路途径调节补体 激活。C3bneo 抗体因此应该具有高的亲和力， 以与这些丰富补体蛋白竞争， 来通过阻断这 些补体蛋白结合 C3b 而有效阻断补体激活。高亲和力为实现低治疗剂量所需。例如， 血浆 中因子 H 的浓度在 3μM 左右， 因子 H 与 C3b 的结合亲和力 (Kd) 是～ 30nM ； 因子 H 浓度比 其 Kd 高 100 倍。当 C3bneo 抗体与因子 H 竞争结合 C3b 时， 其需要 10pM Kd C3bneo 抗体的 1nM 浓度 ( 高于其 Kd100 倍抗体浓度 ) 来抑制因子 H 结合 C3b 的 50％。等于或低于 10pM Kd C3bneo 抗体因此会以适当的治疗抗体剂量实现旁路途径补体激活的有效阻断。因此， 选择的本发明的抗体分子具有低于或等于 65pM， 优选低于或等于 10pM 范围的高结合亲和 力。例如， 选择本发明的抗体分子以对 C3b 具有 9、 8、 7、 6、 5、 4、 3 或 2pM 或更低的结合亲和 力 ( 即， 低于 2pM 的更高亲和力 )。
     如下通过 Biacore 和溶液平衡滴定 (SET) 测定种系化的 IgG 抗体结合 C3b 的亲和 力。
     Biacore 测定
     使用 CM5 传感器芯片 (GE Healthcare， BR-1005-30) 在 25℃下以 BIAcore T100(GE Healthcare) 完 成 Biacore 动 力 学 实 验。 运 行 缓 冲 液 是 HBS-EP(+)(GE Healthcare， BR-1001-88)。简言之， 进行以下步骤以测定结合亲和力。
     ●制备抗 C3d IgG 固定化的传感器芯片 ： 根据供应商的说明书 (GEHealthcare， BR-1000-50)， 通过使用氨基偶联方法， 以 10ul/ 分钟的流速在 CM5 芯片上将兔抗 C3d 多 克隆抗体 (Abcam， ab-15981)( 在乙酸盐 pH5.0 偶联缓冲液中 50ug/ml(GE Healthcare， BR-1003-51)) 偶联到两个不同的流动池 (Fc1 和 2) 上 600 秒。最终固定化的水平将＞ 7000RU。
     ●在第二个流动池上捕获 C3b ： 在第二个流动池上以 10ul/ 分钟注射运行缓冲液 中的 1ug/ml 的 C3b， 以对 Fab 而言达到～ 70RU 的捕获水平， 或对 IgG 动力学分析而言达到～ 20RU 的水平。
     ●在两个流动池上注射不同浓度的抗 C3b Fab 或 IgG ： 在两个流动池 (Fc1 和 2) 上 以 60ul/ 分钟注射抗 C3b 溶液 ( 在运行缓冲液中 0.3125nM ～ 10nM ； 1 ∶ 2 系列稀释 )240 秒。
     ●解离 ： 在两个流动池上以 60ul/ 分钟注射 HBS-EP(+) 运行缓冲液， 以监测 C3b 与 抗 C3b Fab/IgG 之间的解离。对于 5nM 和 2.5M Fab/IgG 浓度， 解离时间设置为 2400 秒， 而 对于包括另一 5nM Fab/IgG 浓度的所有其它浓度设置为 300 秒。
     ●再生 ： 在两个流动池上以甘氨酸 -HCl pH1.6( 从甘氨酸 -HCl pH1.5 和甘氨酸pH2.0， GE Healthcare 制备 )+0.05％ P20 表面活性剂 (GEHealthcare， BR-1000-54)， 60ul/ 分钟的流速在各循环结束时进行再生 40 秒， 两次。
     ●动力学分析 ： 以 BIAevaluation 1.1 软件通过应用 1 ∶ 1 结合模型获得动力学 速率常数， 其中局部拟合 Rmax 值。
     在下文表 11 中显示了 Biacore 结合动力学测定的结果。如所示， 此处所述的抗体 对人 C3b 显示高亲和力结合， KD 值通常低于或等于 10pM， 并在许多情况下低于或等于 5pM。 这些抗体对 cyno C3b 也显示非常高的亲和力 ( 低于 200pM 的结合亲和力 )。
     表 11
    SET 测定
     对于通过溶液平衡滴定 (SET) 对 KD 的测定， 使用抗体蛋白质的单体级分 ( 至少 90％的单体含量， 通过分析 SEC 分析 ； Superdex75(AmershamPharmacia) 用于 Fab 或 Tosoh G3000SWXL(Tosoh Bioscience) 用于 IgG)。
     基本如参考文献中所述进行溶液中的亲和力测定 (Friguet 等 305-19)。 为了提高 SET 方法的灵敏度和准确度， 从经典 ELISA 转换成基于 ECL 的技术 (Haenel 等， 2005)。 TM
     根据制造商的说明书利用 MSD Sulfo-TAG NHS-Ester(Meso ScaleDiscovery， Gaithersburg， MD， USA) 标记 1mg/ml 山羊抗人 (Fab)2 片段特异性抗体 (Dianova)。
     在聚丙烯微量滴定板中进行实验并以含有 0.5％ BSA 和 0.02％ Tween20 的 PBS pH 7.4 作为测定缓冲液。以比预期 KD 高至少 10 倍的浓度开始， 以 2n 系列稀释未标记的人 C3b 或 cyno C3b。没有抗原的孔用于测定 Bmax 值 ； 具有测定缓冲液的孔用作测定背景。加入 例如 10pM Fab(60μL 终体积中的终浓度 ) 后， 在室温下过夜温育混合物。所应用的 Fab 浓 度与预期 KD 相似或低于预期 KD。
     用 PBS 中 0.05μg/ml 人 C3b(30μL/ 孔 ) 过夜包被标准 MSD 平板， 并用 PBS 中的 3％ BSA 封闭 1 小时。用测定缓冲液洗涤平板后， 将平衡的样品转移到那些平板中 ( 每孔 30μL) 并温育 20 分钟。洗涤后， 向 MSD 平板中加入 30μL/ 孔最终稀释 1 ∶ 1500 的 MSD 磺
     基 - 标签标记的检测抗体 ( 山羊抗人 (Fab)2)， 并在室温下 Eppendorf 摇床上 (700rpm) 温 育 30 分钟。
     洗涤平板并加入含表面活性剂的 30μL/ 孔 MSD Read 缓冲液 T 后， 使用 Sector 成 像仪 6000(Meso Scale Discovery， Gaithersburg， MD， USA) 检测电化学发光信号。
     用 XLfit(IDBS) 软件， 应用定制的拟合模型评估数据。对于 Fab 分子的 KD 测定， 使用以下拟合模型 ( 根据 Haenel 等， 2005， 根据 Abraham 等改进 ) ：
    [Fab]t ： 应用的总 Fab 浓度
     X： 应用的总可溶性抗原浓度 ( 结合位点 )
     Bmax ： 没有抗原的 Fab 的最大信号
     KD ： 亲和力
     原则上， 应用相同的方案来测定 IgG 分子的 KD 值， 除以下不同 ： 向稀释系列的抗原 中加入完整 IgG 分子， 而不是 Fab 分子， 并且在室温下平衡过夜。随后， 如上所述处理样品。
     对于数据评估， 即 IgG 分子的 KD 测定， 使用 IgG 的以下拟合模型 ( 根据 Piehler 等， 1997 改进 ) ：
    [IgG] ： 应用的总 IgG 浓度
     x： 应用的总可溶性抗原浓度 ( 结合位点 )
     Bmax ： 没有抗原的 IgG 的最大信号
     KD ： 亲和力
     尽管没有特定地显示， SET 数据验证了此处所述的抗体是人 C3b 的高亲和力结合 子， 其结合亲和力在低于或等于 10pM， 在许多情况下低于或等于 5pM 的范围内。同样地， 此 处描述的抗体以高亲和力结合猕猴 C3b， 通常以低于或等于 200pM 的 KD 结合猕猴 C3b。
     C3b 抗体显示对 C3 的显著结合选择性
     检查 C3b 抗体， 以测定它们对 C3b 的结合相对于 C3b 前体 C3 是否是选择性的。简 言之， 通过进行以下步骤测定对 C3b 的结合选择性。用碳酸盐缓冲液中 2μg/ml 的抗 C3d 兔单克隆抗体 (abcam 17453) 以 100μl/ 孔包被 Maxisorp 平板 Nunc(442404)。密封平 板并在 4 ℃下温育过夜。抽干平板并用 PBS/0.5 ％ Tween 20 洗涤 3 次。用稀释剂 (PBS， 4％ BSA Fraction V(Fisher ICN16006980)， 0.1％ Tween 20(Sigma P1379)， 0.1％ Triton X-100(Sigma P234729)) 封闭平板， 并在室温下温育 2 小时或在 4℃下温育过夜。然后用 PBS/0.5％ Tween 20 洗涤平板一次。 在稀释剂中以 1μg/ml 稀释纯化的 C3b( 补体技术 A114 lot 21) 和 C3( 补体技术 A113c)， 并在每孔中接种 100μl。在室温下温育 1 小时。然后用 PBS/0.5％ Tween 20 洗涤 3 次。以 100nM 稀释 Fabs， 随后在稀释剂中稀释 ( 或更高浓度 )， 并在每孔中接种 100μl。在室温下温育 1 小时。用 PBS/0.5％ Tween 20 洗涤平板 3 次。在
     稀释剂中加入 100μl/ 孔的 1 ∶ 400 的抗组氨酸 HRP 单克隆检测抗体， 并在室温下温育 1 小时。然后用 PBS/0.5％ Tween 20 洗涤 4 次。加入 100μl 的 TMB 底物 (Pierce 34028)， 并在室温下温育高达 5 分钟。向各孔中加入 50μl 的终止溶液 (2N 硫酸 )， 并在 450nm 处读 取平板， 并在 570nm 处校正塑料读数。
     如图 1 所示， C3b 抗体对 C3 结合具有选择性。抗体实现了相对于 C3 结合高 1000 倍的 C3b 结合选择性。尽管图 1 显示了对抗体 9556 的结合选择性的实例， 1000 倍的结合选 择性是此处公开的七种 IgG C3b 抗体具有的性质。
     C3b 抗体抑制备选补体途径
     为了证明抗 C3b 抗体抑制备选补体途径， 进行以下测定。
     溶血测定
     溶血测定是基本的功能测定， 其检测补体激活并已经用于评估抗人 C3b mAbs 和 Fab 分 子 阻 断 红 细 胞 (RBCs) 通 过 补 体 途 径 溶 解 的 能 力 (Evanset al.(1995).In vitro and in vivo inhibition of complement activity by asingle-chain Fv fragment recognizing human C5.Mol Immunol 32， 1183-1195 ； Thomas et al.(1996). Inhibition of complement activity byhumanized anti-C5 antibody and single-chain Fv.Mol Immunol 33， 1389-1401 ； Rinder et al.(1995).Blockade of C5a and C5b-9 generationinhibits leukocyte and platelet activation during extracorporeal circulation.J Clin Invest 96， 1564-1572)。简言之， 对于经典途径测定， 敏化的红细胞 用作通过血清中存在的补体蛋白质进行溶解的靶标。该测定对于高亲和力抗人 C3b mAbs 的表征和筛选是重要的。
     从 Rinder 等， (1995) 和 Thomas 等， (1996) 改进该方法。
     试剂 ：
     兔红细胞 (Rb RBCs)-Lampire， Cat#7246408
     人血清 -Novartis Blood Research Program ； 或 Cyno 血清 -AlphaGenesis
     明胶佛罗那缓冲液 (GVB)-Boston BioProducts， Cat#IBB-300
     EGTA-Boston BioProducts， Cat#BM-151
     MgCl2
     U 型底 96- 孔板 -Corning， Cat#3795
     平底 96 孔板 -Corning， Cat#3370
     NP-40-Sigma， Cat#74385
     方案 ：
     1. 洗涤 Rb RBCs 并在 GVB/EGTA/Mg++ 中调整至 8.33e7 细胞 /ml
     2. 向 96 孔圆底平板的孔中加入在 GVB 中稀释的 50μl Ab ； Ab 的浓度应该是期望 终浓度的 2 倍。
     3. 加入在含有 EGTA 和 Mg++ 的 GVB 中稀释的 50μl 血清。
     a. 制备对照孔 ： 血清 +0nM Ab， 0％溶解对照 ( 仅缓冲液 )、 100％溶解对照 (0.1％ NP-40)， 和血清、 缓冲液， 和 NP-40 对照。
     b. 如果对 10％血清检测 Ab， 使用 10mM EGTA 和 5mM Mg++( 最终 ) ； 如果对 50％血 清检测 Ab， 使用 15-30mM EGTA， 5mM Mg++( 最终 )。4. 在室温下温育 30 分钟。
     5. 向样品和对照孔中加入 30μl Rb RBCs ； 向空白孔中加入 30μl 缓冲液。 在 37℃ 下温育 30 分钟。
     6. 在 2000rpm 下离心平板 5 分钟。
     7. 收集上清液， 转移至平底平板中。
     8. 读取 OD415 和 OD570。计算％溶血 ：
    图 2 显示了抗 C3b 抗体在 10％人或猕猴血清中抑制溶血的能力的实例。 此处所述 的各 C3b 抗体以低于或等于 50nM 的 IC50 抑制溶血。
     相反， 当使用敏化的红细胞进行测定时， 为了检查经典补体途径的激活， 发现此处 所述的抗 C3b 抗体不激活经典补体途径 ( 数据未显示 )。
     C3b 沉积测定
     测定在旁路途径中补体 C3 的抑制剂活性的一种方法是测定其沉积在酵母多糖上 的分解产物 C3b。根据以下步骤进行这种基于 ELISA 的测定 ： 在 4℃下 Maxisorp 384- 孔 ELISA 平板 (Nunc 464718) 中用碳酸盐缓冲液， pH 9.6(Pierce Cat#28382) 中 25μl 的 1mg/ml Zymosan A(Sigma Z4250) 包被过夜。第二天， 抽吸酵母多糖包被的平板并用每孔 100μl 的 ELISA 封闭缓冲液， Synblock(AbD Serotec BUFO34C) 在室温下封闭 2 小时。在
    各反应中， 向补充 MgCl2 和 EGTA( 最终总的反应浓度为 1mM MgCl2 和 10mMEGTA) 的 10％血 清中加入在明胶佛罗那缓冲液 (Boston BioproductsIBB320-10mM Barbital， 145mM NaCl， 0.1％明胶， 0.5mM MgCl2， 10mMEGTA) 中系列稀释的抑制剂。 阳性对照不含有抑制剂， 而阴性 对照含有 25mM EDTA。通过在室温下温育 30 分钟允许混合物达到平衡。为了去除封闭缓冲 液， 抽吸平板并用 TBS/0.05％ Tween-20 洗涤一次。 向平板中加入每孔 25μl 含有抑制剂的 10％血清或对照， 并在 37℃下温育 30 分钟 ( 先前通过时间过程测定在酵母多糖上的 C3b 沉 积的线性范围内 )。30 分钟温育后， 用 TBS/0.05％ Tween-20 洗涤平板 3 次。为了检测酵母 多糖上的 C3b 沉积， 向平板中加入在含有 2％ BSA Fraction V(Fisher Cat# ICN16006980)、 0.1％ Tween20(Sigma Cat#P1379) 和 0.1％ TritonX-100(SigmaCat#P234729) 的 PBS 中根 据制造商稀释的鸡抗人 C3-HRP 缀合的多克隆抗体 (Immunology Consultants Laboratory， Inc.Cat#CC3-80P-1)， 并在室温下温育 1 小时。然后， 用 TBS/0.05％ Tween-20 洗涤平板 3 次， 然后加入 25μl 的 Ultra TMB 底物溶液 (Pierce Cat#34028.)。当孔中的溶液变蓝时， 用 15μl 的 2N 硫酸终止反应。使用 Spectromax 在 450nm 读取平板 (OD450-570nm 读数 )， 在 570nm 处为塑料平板进行校正。使用以下公式计算在酵母多糖上 C3b 沉积的百分比 ：
    图 3 显示了 C3b 抗体抑制 C3 产生为 C3b 的分解产物的能力的实例。显示各检测 抗体以至少低于或等于 10nM 的 IC50 抑制 C3b 沉积。
     MAC 沉积测定
     测定 C3b 抗体抑制备选补体途径的功能能力的另一种测定是测定抗体抑制产生 膜攻击复合体 (MAC) 的能力， 其位于 C3b 加工的下游。简言之， 以碳酸盐缓冲液， pH 9.5 中 1mg/ml 在平板上包被 Zymosan A(Sigma) 来激活旁路途径。Fabs 或 IgGs 各自与血清 (2％ 血清， 5mM MgCl2， 10mMEDTA) 预温育， 然后加入到平板中并在室温下温育过夜。 用 TBST 洗涤 平板 3 次后， 通过与抗 C5b-9-ALP(Diatec) 温育 1 小时， 然后用 TBST 洗涤 3 次， 并与补充有 2mM MgCl2 的 4- 甲基伞形酮磷酸酯 (Fisher) 温育 30 分钟来检测 MAC。用 0.2M EDTA 终止 反应， 并在 ex ＝ 355nm， em ＝ 460nm 处读取平板。计算各样品相对于基线 (EDTA 处理的人 血清 ) 和阳性对照 ( 人血清 ) 的 MAC 沉积的抑制， 并利用 PRISM 来产生 IC50 曲线。
     图 4 显示了示例性数据， 其证明 C3b 抗体抑制 MAC 沉积的能力， 因此表明抗体抑制 补体旁路。尤其是， 抗体以低于或等于 5nM 的 IC50 抑制 MAC 沉积。
     C3a 和 C5a 产生的抑制
     可用于测定 C3b 抗体抑制补体旁路的能力的另一种测定是测量 C3a 和 C5a 的产 生， 两者是旁路途径中 C3b 下游的激活产物。
     简言之， 由申请人开发了 C5a-des-Arg ELISA 来测定溶血过程中 C5a 的产生以证 实溶血测定中抑制性的抗体也抑制 C5 切割成 C5a 和 C5b。
     用 包 被 缓 冲 液 ( 碳 酸 氢 盐 pH 9.5-9.8) 中 1μg/ml 的 100μl/ 孔 小 鼠 抗 人 C5a-des-Arg(US Biologics) 包被 Maxisorp 平板， 并将其在 4℃温育过夜。用 PBST 洗涤 3 次后， 用 300μl/ 孔稀释剂 (Synblock， AbD Serotec) 在室温下封闭所述平板 2 小时。抽 出封闭溶液后， 以稀释剂稀释的 100μl 样品或标准品在室温下温育 1 小时。如下制备标准 品： 以 20ng/ml 标准品 (rC5a-des-Arg) 开始， 制备 1 ∶ 4 连续稀释液用于 7 点曲线。在稀 释液剂中以 1 ∶ 5 稀释溶血测定的样品 ( 溶血测定上清液应该储存在 -80℃， 直至用于 C5a ELISA)。中间用 PBST 洗涤平板 3 次。
     加入稀释剂中稀释的 100μl/ 孔的 0.4μg/ml 检测抗体 ( 生物素 - 山羊抗人 c5a， R&D Systems)， 并且在室温下温育 1 小时后， 加入 HRP 稀释剂 ( 聚 -HRP 稀释剂 ) 中 1 ∶ 5000 稀释的 100μl/ 孔 Strep-HRP( 聚 -HRP 链霉抗生物素蛋白 )30 分钟。用 PBST 洗涤 4 次 后， 加入 100μl/ 孔 TMB 底物 (UltraTMB 底物溶液 )5-10 分钟。用 50μl/ 孔终止溶液 (2N H2SO4) 终止反应。读取吸光度 (A450-A570) 并使用 SoftMax Pro 分析数据。
     同样地， 由申请人开发了 C3a-des-Arg ELISA 来测定溶血过程中的 C3a 产生， 以验 证在溶血测定中抑制性的抗体也抑制 C3 切割成 C3a 和 C3b。
     用 包 被 缓 冲 液 ( 碳 酸 氢 盐 pH 9.5-9.8) 中 1μg/ml 的 100μl/ 孔 小 鼠 抗 人 C3a-des-Arg neo(US Biologics) 包被 Maxisorp 平板， 并将其在 4℃温育过夜。用 PBST 洗 涤 3 次后， 用 300μl/ 孔稀释剂 (Synblock， AbD Serotec) 在室温下封闭所述平板 2 小时。 抽出封闭溶液后， 以稀释剂稀释的 100μl 样品或标准品在室温下温育 1 小时。如下制备标 准品 ： 以 1μg/ml 标准品 (rC3a-des-Arg) 开始， 制备 1 ∶ 3 连续稀释液用于 8 点曲线。在 稀释液剂以 1 ∶ 5 稀释溶血测定的样品 ( 溶血测定上清液应该储存在 -80℃， 直至用于 C5a ELISA)。中间用 PBST 洗涤平板 3 次。
     加入稀释剂中稀释的 100μl/ 孔的 10μg/ml 检测抗体 ( 生物素 - 小鼠抗人 c3a， Chemicon 和内部生物素化的 )， 并且在室温下温育 1 小时后， 加入 HRP 稀释剂 ( 聚 -HRP 稀释剂 ) 中 1 ∶ 5000 稀释的 100μl/ 孔 Strep-HRP( 聚 -HRP 链霉抗生物素蛋白 )30 分钟。用 PBST 洗涤 4 次后， 加入 100μl/ 孔 TMB 底物 (Ultra TMB 底物溶液 )5-10 分钟。用 50μl/ 孔终止溶液 (2NH2SO4) 终止反应。 读取吸光度 (A450-A570) 并使用 SoftMax Pro 分析数据。
     如图 5 所示， C3b 抗体能够通过抑制产生 C3a 和 C5a 阻断旁路途径驱动的补体激 活。更尤其是， 此处所述的 C3b 抗体如抑制 C3a 和 C5a 产生所测定以低于或等于 50nM 的 IC50 抑制旁路途径。
     C3b 抗体抑制体外 C3 转化酶活性
     基于 C3 水空转 (Tick-over) 转化酶凝胶的测定
     在该测定中， Fabs/IgGs 与 10％的含 C3- 水的 C3 预温育， 以便当加入因子 D 和因 子 B 时， 可以测量通过 C3 水空转的转化酶活性。以以下终浓度使用蛋白质试剂 ： 天然因子 B(100nM)、 因子 D(40nM)、 C3(400nM)、 MgCl(5mM) 和 Fab/IgG 1000nM， 随后进行稀释。在 96 孔聚丙烯平板中， 加入多种稀释度的 Fabs/IgGs( 包括 PBS 对照样品 )。为此， 加入 C3 并在 室温下温育 1 小时。然后将因子 B、 因子 D 和 MgCl 的储存混合物加入到 1XPBS 中。1 小时 温育后， 将适当量的反应混合物加入到每孔 Fab/IgG-C3 中。立即取 0 时间点， 加入 4X 样品 缓冲液， 并放置在 95℃。允许转化酶反应在室温下温育 15 分钟。然后取最后的时间点， 加 入 4X 样品缓冲液， 并放置在 95℃。在还原条件下 4-12％ Bis-Tris 凝胶上为各样品运行总 体积 ( 也可在省略因子 D 的单独反应中产生 0 时间点 )。
     基于 C3b 凝胶的转化酶测定
     设计该测定， 以便 Fabs/IgGs 与 C3b 预温育。 温育后， 将其加入到 C3 反应混合物中 以检测转化酶活性。以以下终浓度使用蛋白质试剂 ： 天然 C3b(32nM)、 天然因子 B(100nM)、 因子 D(40nM)、 C3(400nM)、 MgCl(5mM) 和 Fab/IgG 1000nM， 随后进行稀释。在 96 孔聚丙烯 平板中， 加入适当体积的多种稀释度的 Fabs/IgGs( 包括 PBS 对照样品 )。为此， 每孔加入 适当量的 C3。在 37℃下温育 1 小时。然后将因子 B、 因子 D 和 MgCl 的储存混合物加入到 1XPBS 中。1 小时温育后， 向储存混合物中加入 C3， 并将适当量的反应混合物立即加入到各 孔 Fab/IgG-C3 中。立即取 0 时间点， 加入 4X 样品缓冲液， 并放置在 95℃。允许转化酶反应 在室温下温育 15 分钟。然后取最后的时间点， 加入 4X 样品缓冲液， 并放置在 95℃。在还原 条件下 4-12％ Bis-Tris 凝胶上为各样品运行总体积 ( 也可在省略因子 D 的单独反应中产 生 0 时间点 )。
     进行基于 C3 转化酶凝胶的测定
     设计该测定， 以便使用 C3b、 因子 B 突变体和因子 D 产生稳定的转化酶。 为此， 加入 Fabs/IgGs 并允许温育。 然后加入 C3， 并取样品进行分析。 C3 不能形成转化酶。 以以下终浓 度使用蛋白质试剂 ： 天然 C3b(32nM)、 天然因子 B 突变体 (16nM)、 因子 D(40nM)、 C3(400nM)、 MgCl(5mM) 和 Fab/IgG 1000nM， 随后进行稀释。在 96 孔聚丙烯平板中， 加入 c3b、 因子 B、 因 子 D 和 MgCl， 并在 37℃下温育 10 分钟。然后加入适当稀释的 fabs/IgGs(PBS 对照 ) 并在 37℃下温育 20 分钟。然后加入 C3 并在室温下温育 15 分钟。立即取 0 时间点， 加入 4X 样 品缓冲液， 并放置在 95℃。允许转化酶反应在室温下温育 15 分钟。然后取最后的时间点， 加入 4X 样品缓冲液， 并放置在 95℃。在还原条件下 4-12％ Bis-Tris 凝胶上运行各样品的 总体积 ( 也可在省略因子 D 的单独反应中产生 0 时间点 )。
     如图 6 中所示， C3b 抗体抑制旁路途径体外 C3 转化酶活性。 图 6A 显示了 SDS-PAGE凝胶， 其显示了空转转化酶活性的抑制。图 6B 显示了 6A 凝胶中对 C3b 产生的抑制的定量。 图 6C 显示了抗 C3b 抗体抑制预形成的 C3 转化酶活性。
     C3b 抗体体外抑制 C5 转化酶活性
     为了进一步表征抗 C3b 抗体抑制补体旁路的能力， 检查抗体抑制 C5 转化酶激活 的能力。简言之， 通过与纯化的 C3 和胰蛋白酶 (Sigma) 在室温下温育 10 分钟在 Zymosan A(Sigma) 上沉积 C3b。将酵母多糖离心并去除上清液， 通过加入纯化的 C3、 fB、 fD 和 NiCl2 扩增 C3b。重复扩增步骤， 直至在酵母多糖上达到想要密度的 C3b。
     Fabs/IgGs 与 Zymosan-C3b 在 室 温 下 预 温 育 45 分 钟。 加 入 纯 化 的 蛋 白 质 (Complement Tech) ： C5(100nM)、 C6(100nM)、 fB(500nM)、 fD(160nM) 和 5mM NiCl2。反应在 37℃下温育 5 中， 并通过 1 ∶ 10 稀释到冰冷的 GVB+10mM EDTA 中来终止反应。使用溶血测 定， 通过向 chRBCs(8E7/ml) 和 2％人血清中加入反应产物， 并在 37 ℃下温育 30 分钟来定 量 C5bC6 水平。在 2000rpm 下将细胞离心 5 分钟， 并在 A415/A570 处读取上清液。纯化的 C5bC6 蛋白质 (Complement Tech) 用作标准曲线。
     如图 7 所示， C3b 抗体抑制旁路途径体外 C5 转化酶活性。
     通过 C3b 抗体阻断补体因子结合 C3b
     进行以下实验， 以测定抗 C3b 抗体抑制 C3b 与补体旁路其它成员之间相互作用的 能力， 并因此证明了抗体抑制补体旁路的可能机制。简言之， 在室温下 48 小时温育期间使 用 AminoLink Reductant(Pierce) 将纯化的 C3b 和 fP 缀合到未缀合的受体或供体珠子 (PerkinElmer) 上。使用羧甲基胺半盐酸盐 (Aldrich) 淬灭珠子， 通过在 13000rpm 下离 心并用 0.1M TBST 洗涤三次进行纯化。在室温下使用 20 倍摩尔过量的 NHS 生色的生物素 (Pierce) 在 30 分钟温育期间生物素化纯化的 fB(D24G/N260D) 和 fH， 并使用 Zeba 0.5ml 脱盐柱 (Pierce) 进行纯化。
     对于 C3b-C3b 和 C3b-fP 的近似性， Fabs 或 IgGs 分别与 C3b 受体珠子 (20μg/ml) 在室温下预温育 60 分钟。然后加入 C3b- 供体珠子或 fP- 供体珠子 (20μg/ml)， 并在读数 前在室温下温育平板过夜。 对于 C3b-fB 和 C3b-fH 的近似性， 抗体与 C3b- 受体珠子 (20μg/ ml) 在室温下预温育 60 分钟。然后加入生物素化的 fB(D24G/N260D) 或 fH， 并在室温下温 育 60 分钟。然后加入 SA- 供体珠子 (20μg/ml)， 并在读数前在室温下过夜温育平板钟。在 BMGPherastar 上读取平板 (ex ＝ 680， em ＝ 520-620)。
     如图 8 所示， C3b 抗体阻断了几种补体因子与 C3b 的结合。如图中所见， 抗 C3b 抗 体利用不同的作用机制来阻断补体旁路。图 8A 显示了通过 C3b 抗体抑制因子 B 结合 C3b。 图 8B 显示了通过 C3b 抗体抑制因子 P 结合 C3b。图 8C 显示了通过 C3b 抗体抑制因子 H 结 合 C3b。图 8D 显示了通过 C3b 抗体抑制 C3b-C3b 二聚体形成。
     C3b 抗体不与人 C3d 或人 C5 交叉反应
     检测抗 C3b 抗体与人 C3d 和 C5 的交叉反应性。
     用于检测与人 C3b、 人 C3d 或 cyno C3b 的结合的 EILSAs 中的捕获抗体是针对 C3d 蛋白质兔多克隆抗人 C3d Ab， Abcam) 的抗体， 其为 C3b 的亚结构域。用在 PBS 中稀释至 2μg/ml 的捕获抗体填充 Maxisorp 平板的孔。密封平板并在 4℃下温育过夜。为了检测 Fabs 与 C5 的结合， 捕获抗体是以 5μg/ml 的终浓度使用的抗 C5 抗体 (US Biologicals)。
     第二天， 通过加入 PBST/5％奶粉封闭平板上剩余的结合位点。平板在室温下温育1 小时， 然后用 PBST 洗涤 2 次。以在 PBST/5％奶粉中稀释的 2.5μg/ml 的终浓度加入 C3b。 平板在室温下温育 1 小时， 然后用 PBST 洗涤 3 次。制备 Fabs 的系列稀释， 然后加入到封闭 的平板中。平板在室温下温育 1-2 小时， 然后用 PBST 洗涤 3 次。
     对于 Fabs 的检测， 加入抗 HIS AP- 缀合的抗体 (Invitrogen， 46-0284)， 平板在室 温下温育 1 小时， 然后用 PBST 洗涤 5 次。根据制造商的说明书使用荧光底物 AttoPhos。在 Tecan GENios Pro 平板读数器上测定荧光。
     分别在图 9 和 10 中显示了来自这些实验的 C3d 和 C5 的结果。如所示， C3b 抗体 不结合 C3d 或 C5。
     C3b 抗体等同地识别 iC3b 和 C3c
     为了测定此处所述的抗 C3b 抗体是否可以结合补体途径组分 iC3b 和 C3c， 进行 以下步骤 ： 直接向 Coat Maxisorp 平板 Nunc(442404) 以每孔 100μl 加入碳酸盐缓冲液中 的 2μg/ml iC3b( 补体技术 A115)、 C3d( 补体技术 A117) 或 C3c( 补体技术 A116)。密封 平板并在 4℃下温育过夜。抽吸平板并用 PBS/0.5％ Tween 20 洗涤 3 次。以稀释剂 (PBS， 4％ BSA Fraction V(Fisher ICN16006980)， 0.1％ Tween 20(Sigma P1379)， 0.1％ Triton X-100(Sigma P234729)) 封闭平板， 并在室温下温育 2 小时或在 4℃下温育过夜。然后用 PBS/0.5％ Tween 20 洗涤平板 1 次。以 100nM 稀释 Fabs， 随后在稀释液中稀释 ( 或如果需 要， 更高浓度 )， 并在每孔中接种 100μl。在室温下温育 1 小时。用 PBS/0.5％ Tween 20 洗涤平板 3 次。在稀释液中加入 100μl/ 孔的 1 ∶ 400 的抗组氨酸 HRP 单克隆检测抗体， 并在室温下温育 1 小时。然后用 PBS/0.5％ Tween 20 洗涤 4 次。加入 100μl 的 TMB 底物 (Pierce 34028)， 并在室温下温育高达 5 分钟。 向各孔中加入 50μl 的终止溶液 (2N 硫酸 )， 并在 450nm 处读取平板， 并在 570nm 处校正塑料平板读数。
     如图 11 中所示， C3b 抗体与 iC3b 和 C3c 交叉反应。
     物种交叉反应性
     为了测定除了人和猕猴， 此处所述的抗 C3b 抗体是否结合来自其它物种的 C3b， 如 上文所述进行溶血测定。用于各物种的血清浓度如下 ： 10％大鼠血清 ； 20％兔血清 ； 10％猪 血清 ； 20％小鼠血清 ； 10％豚鼠血清 ； 和 10％狗血清。如图 12 中所示， C3b 抗体能够与几种 物种交叉反应， 所述物种包括大鼠、 兔、 猪、 小鼠和豚鼠。
     Fab 形式的 C3bneo 结合子
     除了上文描述的全长 IgG 形式的抗 C3b 抗体， 相同的可变域用于构建 Fab 形式的 抗原结合片段。评估抗 C3b Fabs， 以根据上文描述的方法测定其结合特征。表 11 概述了亚 组 Fabs 的补体因子结合的结合亲和力、 功能潜能和抑制。
    
    本发明的实施方案 本发明包括， 但不限于以下实施方案 ：1. 分离的抗体或其抗原结合片段， 其特异性结合人或猕猴补体 C3b 蛋白， 其中所 述抗体以低于或等于 100pM 的 KD 结合人 C3b。
     2. 前述段落中的分离的抗体或其抗原结合片段， 其中所述抗体或其抗原结合片段 也以低于或等于 250pM 的 KD 结合猕猴 C3b。
     3. 任何前述段落中的分离的抗体或其抗原结合片段， 其中所述抗体或其抗原结合 片段以低于或等于 10pM 的 KD 结合人 C3b。
     4. 任何前述段落中的分离的抗体或其抗原结合片段， 其中所述抗体或其抗原结合 片段以低于或等于 2pM 的 KD 结合人 C3b。
     5. 任何前述段落中的分离的抗体， 其中所述抗体如通过体外溶血测定法所测定以 低于或等于 65nM 的 IC50 抑制人补体旁路。
     6. 任何前述段落中的分离的抗体， 其中所述抗体如通过体外 C3b 沉积所测定以低 于或等于 50nM 的 IC50 抑制人补体旁路。
     7. 任何前述段落中的分离的抗体， 其中所述抗体如通过补体膜攻击复合体的沉积 所测定以低于或等于 5nM 的 IC50 抑制人补体旁路。
     8. 任何前述段落中的分离的抗体， 其中所述抗体如通过产生 C3a 和 C5a 所测定以 低于或等于 100nM 的 IC50 抑制补体旁路。
     9. 任何前述段落中的分离的抗体或其抗原结合片段， 其中所述抗体或其抗原结合 片段特异性结合人或猕猴的补体 C3b 蛋白， 并与表 1 中描述的抗体交叉竞争。
     10. 任何前述段落中的分离的抗体， 其中所述抗体是单克隆抗体。
     11. 任何前述段落中的分离的抗体， 其中所述抗体是人或人源化抗体。
     12. 任何前述段落中的分离的抗体， 其中所述抗体是嵌合抗体。
     13. 任何前述段落中的分离的抗体， 其中所述抗体是单链抗体。
     14. 任何前述段落中的分离的抗体， 其中所述抗体是 Fab 片段或 ScFv 片段。
     15. 任何前述段落中的分离的抗体， 其中所述抗体是 IgG 同种型。
     16. 任何前述段落中的分离的抗体， 其中所述抗体包括这样的构架， 其中氨基酸已 经替换到来自各人 VH 或 VL 种系序列的抗体构架。
     17. 任何前述段落中的分离的抗体， 其中所述抗体以比所述抗体结合 C3 的亲和力 高至少 1000 倍的亲和力结合 C3b。
     18. 任何前述段落中的分离的抗体或其抗原结合片段， 其中所述抗体或其抗原结 合片段包含选自 SEQ ID NOs ： 1、 15、 29、 43、 57、 71、 85、 99、 113、 127、 141、 155、 169 和 183 的重 链 CDR1 ； 选自 SEQ ID NOs ： 2、 16、 30、 44、 58、 72、 86、 100、 114、 128、 142、 156、 170 和 184 的重 链 CDR2 ； 和选自 SEQ ID NOs ： 3、 17、 31、 45、 59、 73、 87、 101、 115、 129、 143、 157、 171 和 185 的 重链 CDR3， 其中所述分离的抗体或其抗原结合片段结合补体蛋白 C3b。
     19. 任何前述段落中的分离的抗体或其抗原结合片段， 其中所述抗体或其抗原结 合片段包含选自 SEQ ID NOs ： 4、 18、 32、 46、 60、 74、 88、 102、 116、 130、 144、 158、 172 和 186 的 轻链 CDR1 ； 选自 SEQ ID NOs ： 5、 19、 33、 47、 61、 75、 89、 103、 117、 131、 145、 159、 173 和 187 的 轻链 CDR2 ； 和选自 SEQ ID NOs ： 6、 20、 34、 48、 62、 76、 90、 104、 118、 132、 146、 160、 174 和 188 的轻链 CDR3， 其中所述分离的单克隆抗体或其抗原结合片段结合补体蛋白 C3b。
     20. 任何前述段落中的分离的抗体或其抗原结合片段， 其中所述单克隆抗体还包含选自 SEQ ID NOs ： 4、 18、 32、 46、 60、 74、 88、 102、 116、 130、 144、 158、 172 和 186 的轻链 CDR1 ； 选自 SEQ ID NOs ： 5、 19、 33、 47、 61、 75、 89、 103、 117、 131、 145、 159、 173 和 187 的轻链 CDR2 ； 和 选自 SEQ ID NOs ： 6、 20、 34、 48、 62、 76、 90、 104、 118、 132、 146、 160、 174 和 188 的轻链 CDR3。
     21. 任何前述段落中的分离的抗体或其抗原结合片段， 其中所述抗体或抗原结合 片段包含选自 SEQ ID NOs ： 7、 21、 35、 49、 63、 77、 91、 105、 119、 133、 147、 161、 175 和 189 的重 链可变域序列， 还包括选自 SEQ IDNOs ： 8、 22、 36、 50、 64、 78、 92、 106、 120、 134、 148、 162、 176 和 190 的轻链可变域序列， 其中所述分离的抗体或其抗原结合片段结合补体蛋白 C3b。
     22. 任何前述段落中的分离的抗体或其抗原结合片段， 其中所述抗体或其抗原结 合片段包含与选自 SEQ ID NOs ： 7、 21、 35、 49、 63、 77、 91、 105、 119、 133、 147、 161、 175 和 189 的序列具有至少 95％序列同一性的重链可变域， 其中所述抗体结合 C3b。
     23. 任何前述段落中的分离的抗体或其抗原结合片段， 其中所述抗体或其抗原结 合片段包含与选自 SEQ ID NOs 8、 22、 36、 50、 64、 78、 92、 106、 120、 134、 148、 162、 176 和 190 的序列具有至少 95％序列同一性的轻链可变域， 其中所述抗体结合 C3b。
     24. 任何前述段落中的抗体或其抗原结合片段， 其中所述抗体或其抗原结合片段 还包含与选自 SEQ ID NOs 8、 22、 36、 50、 64、 78、 92、 106、 120、 134、 148、 162、 176 和 190 的序 列具有至少 95％序列同一性的轻链可变域。
     25. 任何前述段落中的分离的抗体或其抗原结合片段， 其中所述抗体或其抗原结 合片段包含选自 SEQ ID NOs 9、 23、 37、 51、 65、 79、 93、 107、 121、 135、 149、 163、 177 和 191 的 序列具有至少 95％序列同一性的重链， 其中所述抗体结合 C3b。
     26. 任何前述段落中的分离的抗体或其抗原结合片段， 其中所述抗体或其抗原结 合片段包含与选自 SEQ ID NOs 10、 24、 38、 52、 66、 80、 94、 108、 122、 136、 150、 164、 178 和 192 的序列具有至少 95％序列同一性的轻链， 其中所述抗体结合 C3b。
     27. 任何前述段落中的分离的抗体或其抗原结合片段， 其还包含与选自 SEQ ID NOs 10、 24、 38、 52、 66、 80、 94、 108、 122、 136、 150、 164、 178 和 192 的序列具有至少 95％序列 同一性的轻链。
     28. 药物组合物， 其包含任何前述段落的抗体或其抗原结合片段和药学上可接受 的载体。
     29. 分离的核酸， 其包含编码这样的多肽的序列， 所述多肽包含与选自 SEQ ID NOs ： 7、 21、 35、 49、 63、 77、 91、 105、 119、 133、 147、 161、 175 和 189 的序列具有至少 95％序列同 一性的重链可变域。
     30. 分离的核酸， 其包含编码这样的多肽的序列， 所述多肽包含与选自 SEQ ID NOs 8、 22、 36、 50、 64、 78、 92、 106、 120、 134、 148、 162、 176 和 190 的序列具有至少 95％序列同一性 的轻链可变域。
     31. 载体， 其包括前述段落的核酸。
     32. 分离的宿主细胞， 其包含编码任何前述段落的抗体或其抗原结合片段的重链 的重组 DNA 序列， 和编码任何前述段落的抗体或其抗原结合片段的轻链的第二条重组 DNA 序列， 其中所述 DNA 序列有效连接启动子， 并能够在宿主细胞中表达。
     33. 前述段落的分离的宿主细胞， 其中所述抗体是人单克隆抗体。
     34. 先前两段中的分离的宿主细胞， 其中所述宿主细胞是非人哺乳动物细胞。35. 治疗年龄相关性黄斑变性的方法， 其包括向需要治疗的受试者施用有效量的 包含前述段落的抗体或其抗原结合片段的组合物。
     36. 前述段落的方法， 其中所述受试者是人。
     37. 在受试者中抑制补体旁路的方法， 其包括向需要抑制的受试者施用有效量的 包含前述段落的抗体或其抗原结合片段的组合物。
     38. 前述段落的方法， 其中所述受试者是人。
     此处引用的所有专利、 专利申请和出版的参考文献以其整体引入作为参考。尽管 参考本发明的优选实施方案特别显示并描述了本发明， 但本领域技术人员应该理解的是， 其中可在形式和细节上进行多种改变， 但不背离所附权利要求包括的本发明的范围。127CN 102459334 A
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     本发明还涉及分离的抗体或其抗原结合片段， 其包括与选自 SEQ IDNOs ： 7、 21、 35、 49、 63、 77、 91、 105、 119、 133、 147、 161、 175 和 189 的序列具有至少 95％序列同一性的重链可 变域， 其中所述抗体结合 C3b。一方面， 分离的抗体或其抗原结合片段还包括与选自 SEQ ID NOs 8、 22、 36、 50、 64、 78、 92、 106、 120、 134、 148、 162、 176 和 190 的序列具有至少 95％序列同 一性的轻链可变域。
     本发明还涉及分离的抗体或其抗原结合片段， 其包括与选自 SEQ IDNOs 8、 22、 36、 50、 64、 78、 92、 106、 120、 134、 148、 162、 176 和 190 的序列具有至少 95％序列同一性的轻链可 变域， 其中所述抗体结合 C3b。
     本发明还进一步涉及分离的抗体或其抗原结合片段， 其包括与选自 SEQ ID NOs 9、 23、 37、 51、 65、 79、 93、 107、 121、 135、 149、 163、 177 和 191 的序列具有至少 95％序列同一性 的重链， 其中所述抗体结合 C3b。一方面， 分离的抗体或其抗原结合片段还包括与选自 SEQ ID NOs10、 24、 38、 52、 66、 80、 94、 108、 122、 136、 150、 164、 178 和 192 的序列具有至少 95％序 列同一性的轻链。 本发明进一步涉及分离的抗体或其抗原结合片段， 其包括与选自 SEQID NOs 10、 24、 38、 52、 66、 80、 94、 108、 122、 136、 150、 164、 178 和 192 的序列具有至少 95％序列同一性的 轻链， 其中所述抗体结合 C3b。
     本发明还包括药物组合物， 其包含此处描述的抗体组合物以及药学上可接受的载 体。 尤其是， 本发明包括药物组合物， 其包含表 1 的抗体或其抗原结合片段， 例如抗体 9556、 9611、 9612、 9609、 9610、 9674、 9675、 9124、 9397、 9398、 9136、 9141、 9373 或 9423。本发明还包 括药物组合物， 其包含表 1 的两种或多种抗体或其抗原结合片段的组合。
     本发明还包括分离的核酸， 其包含编码这样的多肽的序列， 所述多肽包括与选自 SEQ ID NOs ： 7、 21、 35、 49、 63、 77、 91、 105、 119、 133、 147、 161、 175 和 189 的 序 列 具 有 至 少 95％序列同一性的重链可变域。
     本发明还涉及分离的核酸， 其包含编码这样的多肽的序列， 所述多肽包括与选自 SEQ ID NOs 8、 22、 36、 50、 64、 78、 92、 106、 120、 134、 148、 162、 176 和 190 的 序 列 具 有 至 少 95％序列同一性的轻链可变域。
     一方面， 本发明还包括这样的载体， 其包括一种或多种此处描述的核酸分子。
     本发明还包括分离的宿主细胞， 其包括编码上文描述的抗体重链的重组 DNA 序 列， 和编码所述抗体轻链的第二个重组 DNA 序列， 其中所述 DNA 序列有效连接启动子， 并能 够在宿主细胞中表达。期望抗体可以是人单克隆抗体。还期望宿主细胞是非人哺乳动物细 胞。
     本发明还涉及治疗年龄相关性黄斑变性的方法， 其中所述方法包括向需要治疗的 受试者施用有效量的包含此处描述的抗体或其片段的组合物的步骤。期望受试者是人。
     本发明还提供在受试者中抑制补体旁路的方法， 其中所述方法包括向需要抑制的 受试者施用有效量的包含此处描述的抗体或其抗原结合片段的组合物的步骤。一方面， 受 试者是人。
     本发明还包括药物组合物， 其包含此处描述的抗体组合物以及药学上可接受的载 体。 尤其是， 本发明包括药物组合物， 其包含表 1 的抗体或其抗原结合片段， 例如抗体 9556、 9611、 9612、 9609、 9610、 9674、 9675、 9124、 9397、 9398、 9136、 9141、 9373 或 9423。本发明还包 括药物组合物， 其包含表 1 的两种或多种抗体或其抗原结合片段的组合。
     本发明还包括分离的核酸， 其包含编码这样的多肽的序列， 所述多肽包括与选自 SEQ ID NOs ： 7、 21、 35、 49、 63、 77、 91、 105、 119、 133、 147、 161、 175 和 189 的 序 列 具 有 至 少 95％序列同一性的重链可变域。
     本发明还涉及分离的核酸， 其包含编码这样的多肽的序列， 所述多肽包括与选自 SEQ ID NOs 8、 22、 36、 50、 64、 78、 92、 106、 120、 134、 148、 162、 176 和 190 的 序 列 具 有 至 少 95％序列同一性的轻链可变域。
     一方面， 本发明还包括这样的载体， 其包括一种或多种此处描述的核酸分子。
     本发明还包括分离的宿主细胞， 其包括编码上文描述的抗体重链的重组 DNA 序 列， 和编码所述抗体轻链的第二个重组 DNA 序列， 其中所述 DNA 序列有效连接启动子， 并能 够在宿主细胞中表达。期望抗体可以是人单克隆抗体。还期望宿主细胞是非人哺乳动物细 胞。
     本发明还涉及治疗年龄相关性黄斑变性的方法， 其中所述方法包括向需要治疗的 受试者施用有效量的包含此处描述的抗体或其片段的组合物的步骤。期望受试者是人。
     本发明还提供在受试者中抑制补体旁路的方法， 其中所述方法包括向需要抑制的 受试者施用有效量的包含此处描述的抗体或其抗原结合片段的组合物的步骤。一方面， 受 试者是人。
     本发明还提供抑制 C3b 结合因子 B、 P 或 H 的方法， 其包括使 C3b 与此处描述的抗 C3b 抗体或其片段接触。
     本发明还提供抑制 C3 转变酶、 C4 转变酶和 C3b-C3b 二聚体形成的方法， 其包括使 C3b 与抗 C3b 抗体或其片段接触。
     本发明还包括分离的抗体或其抗原结合片段， 其包含与选自 SEQ IDNOs ： 1、 2、 3、 4、 5、 6、 15、 16、 17、 18、 19、 20、 29、 30、 31、 32、 33、 34、 43、 44、 45、 46、 47、 48、 57、 58、 59、 60、 61、 62、 71、 72、 73、 74、 75、 76、 85、 86、 87、 88、 89 和 90 的序列具有至少 80％、 85％、 90％， 以及高达至 少 95 ％的序列同一性的至少一个互补性决定区 (CDR) 序列， 其中所述抗体结合补体蛋白 C3b。
     本发明还包括分离的抗体或其抗原结合片段， 其包含选自 SEQ IDNOs ： 1、 2、 3、 15、 16、 17、 29、 30、 31、 43、 44、 45、 57、 58、 59、 71、 72、 73、 85、 86 和 87 的至少一个重链 CDR 序列， 其 中所述抗体结合 C3b。
     本发明还包括分离的抗体或其抗原结合片段， 其包含选自 SEQ IDNOs ： 4、 5、 6、 18、 19、 20、 32、 33、 34、 46、 47、 48、 60、 61、 62、 74、 75、 76、 88、 89 和 90 的至少一个轻链 CDR 序列， 其 中所述抗体结合 C3b。 本发明还包括分离的抗原结合多肽， 其包含选自 SEQ ID NOs ： 1、 15、 29、 43、 57、 71 和 85 的重链 CDR1 ； 选自 SEQ ID NOs ： 2、 16、 30、 44、 58、 72 和 86 的重链 CDR2 ； 和选自 SEQ ID NOs ： 3、 17、 31、 45、 59、 73 和 87 的重链 CDR3， 其中所述抗原结合多肽结合补体蛋白 C3b。
     本发明还包括抗原结合多肽， 其包含选自 SEQ ID NOs ： 4、 18、 32、 46、 60、 74 和 88 的 轻链 CDR1 ； 选自 SEQ ID NOs 5、 19、 33、 47、 61、 75 和 89 的轻链 CDR2 ； 和选自 SEQ ID NOs 6、 20、 34、 48、 62、 76 和 90 的轻链 CDR3， 其中所述抗原结合多肽结合补体蛋白 C3b。
     除了包括上文指出的重链 CDR 序列的抗原结合多肽外， 抗原结合多肽还包括选自 SEQ ID NOs ： 4、 18、 32、 46、 60、 74 和 88 的轻链 CDR1 ； 选自 SEQ ID NOs 5、 19、 33、 47、 61、 75 和 89 的轻链 CDR2 ； 和选自 SEQID NOs 6、 20、 34、 48、 62、 76 和 90 的轻链 CDR3。
     此处描述的抗体结合多肽以低于或等于 100pM， 优选低于或等于 10pM， 优选低于 或等于 2pM 的 KD 结合 C3b。此外， 优选地， 抗原结合多肽结合人和猕猴 C3b。
     本发明还包括调节 C3b 的方法， 其包括向需要调节的受试者施用有效量的抗体、 其抗原结合片段或此处描述的抗原结合多肽。
     任何上述抗体或其抗原结合片段可以是单克隆抗体或其抗原结合片段。
     定义
     除非另有定义， 此处所用的所有技术和科技术语具有本发明所属领域中普通技术 人员通常理解的相同意思。
     如此处所用的术语 “抗体” 包括完整抗体及其任何抗原结合片段 ( 即 “抗原结合部 分” ) 或单链。天然存在的 “抗体” 是包含通过二硫键相互连接的至少两条重 (H) 链和两条 轻 (L) 链的糖蛋白。每一重链包含重链可变区 ( 此处缩写为 VH) 和重链恒定区。所述重链 恒定区包含三个结构域， CH1、 CH2 和 CH3。每一轻链包含轻链可变区 ( 缩写为 VL) 和轻链恒 定区。所述轻链恒定区包含一个结构域 CL。VH 和 VL 区可进一步细分成高变区， 称为互补 决定区 (CDR)， 它们散布着称为构架区 (FR) 的更保守的区域。每一 VH 和 VL 由以下面顺序 从氨基末端到羧基末端排列的三个 CDR 和四个 FR 组成 ： FR1、 CDR1、 FR2、 CDR2、 FR3、 CDR3、
     FR4。重链和轻链的可变区含有与抗原相互作用的结合域。抗体的恒定区可介导免疫球蛋 白与宿主组织或因子， 包括免疫系统的多种细胞 ( 例如效应细胞 ) 和经典补体系统的第一 个组分 (Clq) 的结合。
     如此处所用， 术语抗体的 “抗原结合部分” 指完整抗体的一个或更多片段， 其保留 与给定抗原 ( 例如 C3b) 特异性结合的能力。可通过完整抗体的片段进行抗体的抗原结合 功能。术语抗体的 “抗原结合部分” 中包括的结合片段的实例包括 Fab 片段， 其为 VL、 VH、 CL 和 CH1 结构域组成的单价片段 ； F(ab)2 片段， 其为包含在铰链区通过二硫键连接的两个 Fab 片段的二价片段 ； 由 VH 和 CH1 结构域组成的 Fd 片段 ； 由抗体单条臂的 VL 和 VH 结构域 组成的 Fv 片段 ； 单结构域抗体 (dAb) 片段 (Ward 等， 1989Nature 341 ： 544-546)， 其由 VH 结 构域或 VL 结构域组成 ； 和分离的互补决定区 (CDR)。
     此外， 尽管 Fv 片段的两个结构域 VL 和 VH 由单独的基因编码， 但可使用重组方法， 通过人工肽接头将它们连接， 所述人工肽接头使得它们能够制备成单条蛋白质链， 其中 VL 和 VH 区域配对形成单价分子 ( 称为单链 Fv(scFv) ； 参阅例如 Bird 等， 1988 Science 242 ： 423-426 ； 和 Huston 等， 1988Proc.Natl.Acad.Sci.85 ： 5879-5883)。 此类单链抗体包括抗体 的一个或更多 “抗原结合部分” 。使用本领域技术人员已知的常规技术获得这些抗体片段， 并筛选所述片段， 以与完整抗体相同的方式使用所述片段。
     抗 原 结 合 部 分 也 可 掺 入 到 单 结 构 域 抗 体、 巨 型 抗 体 (maxibodies)、 微型抗体 (minibodies)、 胞内抗体、 双抗体、 三抗体、 四抗体、 v-NAR 和 bis-scFv( 参阅例如 Hollinger 和 Hudson， 2005， Nature Biotechnology， 23， 9， 1126-1136)。抗体的抗原结合部分可移植 到基于多肽如 III 型纤连蛋白 (Fn3) 的支架中 ( 参阅美国专利号 6,703,199， 其描述了纤连 蛋白多肽单抗体体 )。
     抗原结合部分可掺入到包含一对串联 Fv 区段 (VH-CH1-VH-CH1) 的单链分子中， 所述串联 Fv 区段与互补轻链多肽一起形成一对抗原结合区 (Zapata 等， 1995 Protein Eng.8(10) ： 1057-1062 ； 和美国专利号 5,641,870)。
     如此处所用， 术语 “亲和力” 指抗体与抗原在单个抗原位点上相互作用的强度。在 每一抗原位点中， 抗体 “臂” 的可变区与抗原在许多位点上通过弱的非共价力相互作用 ； 相 互作用越多， 亲和力越强。
     如此处所用， 术语 “亲合力” 指抗体 - 抗原复合物的总稳定性或强度的信息化量 度。其受三个主要因素控制 ： 抗体表位亲和力 ； 抗原与抗体两者的效价 ； 和相互作用部分的 结构排列。最终这些因素决定了抗体的特异性， 即特定抗原结合精确抗原表位的可能性。
     术语 “氨基酸” 指天然发生的和合成的氨基酸， 以及与天然发生的氨基酸以相似方 式起作用的氨基酸类似物和氨基酸模拟物。 天然发生的氨基酸是由遗传密码编码的那些氨 基酸， 以及稍后被例如羟脯氨酸、 γ- 羧基谷氨酸和 O- 磷酸丝氨酸修饰的那些氨基酸。 氨基 酸类似物指这样的化合物， 其与天然发生的氨基酸具有相同的基本化学结构， 即与氢结合 的 α 碳、 羧基、 氨基和 R 基团， 例如高丝氨酸、 正亮氨酸、 甲硫氨酸亚砜、 甲硫氨酸甲锍。此 类类似物具有修饰的 R 基团 ( 例如， 正亮氨酸 ) 或修饰的肽骨架， 但保留了与天然发生的氨 基酸相同的基本化学结构。 氨基酸模拟物指具有与氨基酸的一般化学结构不同结构的化合 物， 但它以与天然发生的氨基酸类似的方式起作用。
     如此处所用， 术语 “结合特异性” 指各抗体结合位点与仅一个抗原决定簇相互作用的能力。抗体的结合部位位于分子的 Fab 部分， 并从重链和轻链的高变区构建。抗体的结 合亲和力是单个抗原决定簇与抗体上单个结合部位之间反应的强度。 其为抗原决定簇与抗 体结合部位之间起作用的吸引力和排斥力的总和。
     两 个 实 体 之 间 的 特 异 性 结 合 表 示 平 衡 常 数 (KA) 为 至 少 1x107M-1、 108M-1、 109M-1、 1010M-1、 1011M-1、 1012M-1、 1013M-1 的结合。短语与抗体 ( 例如， C3b 结合抗体 ) 的 “特异性 ( 或选择性 ) 结合” 指决定近亲抗原 ( 例如人 C3b 或猕猴 C3b) 在蛋白质和其它 生物产品的异质群体中的存在的结合反应。除了上文指出的平衡常数 (KA)， 本发明的 C3b 结合抗体通常还具有约 1x10-2s-1、 1x10-3s-1、 1x10-4s-1、 1x10-5s-1 或更低的解离速率 常数 (Kd)， 并且以比其结合非特异性抗原 ( 例如 C3) 的亲和力至少 10 倍， 优选 100 倍， 或高 达 1000 倍或更高的亲和力结合 C3b。 。短语 “识别抗原的抗体” 和 “对抗原特异的抗体” 此 处可与 “特异性结合抗原的抗体” 互换使用。
     如此处所用， “neo- 表位” 或 “neo- 抗原” 可互换使用， 并且是蛋白水解切割 C3 后 C3b 上存在的蛋白质的抗原部分。这些 neo- 表位在未切割的 C3 上不容易接近。
     术语 “与黄斑变性相关的状况或病症” 指任何多种这样的状况， 其中例如因黄斑细 胞生长降低引起视网膜黄斑变性或无功能， 增加了黄斑细胞 ( 例如 RPE 细胞 ) 的死亡或重 排、 正常生物学功能的丧失， 或这些事件的组合。黄斑变性导致细胞组织结构的完整性和 / 或正常黄斑的胞外基质的缺失和 / 或黄斑细胞的功能缺失。黄斑变性相关病症的实例包括 AMD、 北卡罗来纳黄斑营养不良、 Sorsby′ s 眼底营养不良、 隐性黄斑营养不良、 模式营养不 良、 卵黄状黄斑变性、 显性玻璃疣， 和 malattia leventinese( 辐射玻璃疣 )。 该术语还包括 黄斑异常和 / 或变性之前或之后发生的黄斑外改变。因此， 术语 “黄斑变性相关病症” 还广 泛地包括改变或损坏黄斑完整性或功能的任何状况 ( 例如， RPE 或 Bruch′ s 膜的损伤 )。 例如， 该术语包括视网膜脱落、 脉络膜视网膜变性、 视网膜变性、 光感受器退化、 RPE 变性、 粘 多糖病、 视杆 - 视椎营养不良、 视椎 - 视杆营养不良和视椎变性。
     术语 “补体组分” 、 “补体蛋白” 或 “补体组分蛋白” 指参与激活补体系统的分子。经 典途径组分包括， 例如 C1q、 C1r、 C1s、 C4、 C2、 C3、 C5、 C6、 C7、 C8、 C9 和 C5b-9 复合体 ( 膜攻 击复合体 ： MAC)。旁路途径组分包括， 例如因子 B、 因子 D、 备解素、 H 和 I。
     术语 “调节” 或 “调节” 在此处互换使用， 指活性或生物学过程 ( 例如， 补体过程 ) 的上调 ( 即， 激活或刺激 ( 例如， 通过激动或加强 )) 和下调 ( 即， 抑制或阻遏 ( 例如， 通过 拮抗、 降低或抑制 ))。 “调节” 旨在描述过程的上调或下调。可通过刺激物的拮抗剂抑制通 过该刺激物上调的过程。相反地， 可通过修饰剂的激动剂抑制通过该修饰剂下调的过程。
     术语 “补体途径相关分子” 、 “补体途径分子” 和 “补体途径相关蛋白” 可互换使用， 并指在补体激活和响应激活的补体系统介导的或激活的补体系统触发的下游细胞活性中 起作用的多种分子。它们包括补体途径的起始物 ( 即， 直接或间接触发补体系统激活的分 子 )、 在补体激活过程中产生的或起作用的分子 ( 例如， 补体蛋白 / 酶， 如 C3、 C5、 C5b-9、 因 子 B、 因子 D、 MASP-1 和 MASP-2)、 补体受体或抑制剂 ( 例如， 簇蛋白、 玻连蛋白、 CR1 或 CD59)， 和激活的补体系统调节或触发的分子 ( 例如， 膜攻击复合体抑制因子、 MACIF ； 参阅例如， ugita 等， J Biochem， 106 ： 589-92， 1989)。因此， 除了此处指出的补体蛋白， 补体途径相关 分子还包括， 例如 C3/C5 转变酶调节子 (RCA)， 如补体受体类型 1( 也称为 CR1 或 CD35)、 补 体受体类型 2( 也称为 CR2 或 CD21)、 膜辅因子蛋白 (MCP 或 CD46)， 和 C4bBP ； MAC 调节子， 如玻连蛋白、 簇蛋白 ( 也称为 “SP40， 40” )、 CRP、 CD59， 和同源限制因子 (HRF) ； 免疫球蛋白链， 如 Igκ、 Igλ 或 Igγ ； C1 抑制剂 ； 和其它蛋白质， 如 CR3、 CR4(CD11b/18) 和 DAF(CD 55)。
     术语 “补体途径调节的细胞活性” 包括因以下引起的细胞损伤 ： C5b-9 攻击复合 体、 血管通透性改变、 平滑肌细胞的收缩和迁移、 T 细胞增殖、 免疫粘着、 树突状细胞、 单核细 胞、 粒细胞和血小板的聚集、 嗜中性粒细胞 (PMN) 和巨噬细胞的吞噬、 迁移和激活。
     此外， 补体途径的激活导致补体途径中副产物产生的促炎症反应的增加。与补体 途径激活相关的病症包括肾炎、 哮喘、 再灌注损伤、 血液透析、 类风湿性关节炎、 全身性红 斑狼疮、 牛皮癣、 多发性硬化症、 移植、 阿尔茨海默氏病、 aHUS、 MPGN II 或任何其它补体介 导的疾病。与黄斑变性相关的病症包括 AMD、 北卡罗来纳黄斑营养不良、 Sorsby′ s 眼底 营养不良、 隐性黄斑营养不良、 模式营养不良、 卵黄状黄斑变性、 显性玻璃疣， 和 malattia leventinese( 辐射玻璃疣 )、 黄斑异常和 / 或变性之前或之后发生的黄斑外改变、 视网膜脱 落、 脉络膜视网膜变性、 视网膜变性、 光感受器退化、 RPE 变性、 粘多糖病、 视杆 - 视椎营养不 良、 视椎 - 视杆营养不良和视椎变性粘多糖病。
     如此处所用， 术语 “受试者” 包括任何人或非人动物。
     术语 “非人动物” 包括所有的非人脊椎动物， 例如哺乳动物和非哺乳动物， 如非人 灵长类、 啮齿类、 兔、 绵羊、 狗、 猫、 马、 奶牛、 鸟、 两栖动物、 爬行动物等。 术语 “嵌合抗体” 是这样的抗体分子， 其中 (a) 恒定区或其部分被改变、 替换或交 换， 使得抗原结合位点 ( 可变区 ) 连接不同种类或改变种类的恒定区、 效应功能和 / 或物 种， 或赋予嵌合抗体新性质的完全不同的分子， 例如酶、 毒素、 激素、 生长因子、 药物等 ； 或 (b) 可变区或其部分被具有不同或改变抗原特异性的可变区改变、 替换或交换。例如， 可通 过来自人免疫球蛋白的恒定区替换小鼠恒定区来修饰小鼠抗体。由于用人恒定区进行替 换， 嵌合抗体在识别抗原中可保留其特异性， 同时与最初的小鼠抗体相比， 在人中具有降低 的抗原性。
     术语 “补体 C3b 蛋白” 或 “C3b” 互换使用， 并指不同物种中的 C3b 蛋白。例如， 人 C3b 具有 SEQ ID NO ： 197(A 链 ) 和 198(B 链 ) 中阐明的序列。 可从 Complement Technology Inc.(Tyler， TX) 获得人 C3b。如下文实施例部分阐明产生猕猴 C3b。
     术语 “保守修饰的变体” 应用到氨基酸和核酸序列。对于特定核酸序列， 保守修饰 的变体指编码相同或基本相同氨基酸序列的那些核酸， 或者其中所述核酸不编码氨基酸序 列， 则指基本相同的序列。 因为遗传密码的简并性， 大量功能相同的核酸编码任何给定的蛋 白质。例如， 密码子 GCA、 GCC、 GCG 和 GCU 均编码氨基酸丙氨酸。因此， 在每一位置上 ( 其中 密码子确定丙氨酸 )， 可将所述密码子改变成任何所述相应的密码子， 而不改变所编码的多 肽。此类核酸变异是 “沉默变异” ， 其为保守修饰变异的一种。此处编码多肽的每一核酸序 列也描述了所述核酸的每一种可能的沉默变异。 本领域技术人员将认识到可修饰核酸中的 每一密码子 ( 除了 AUG， 其通常是甲硫氨酸的唯一密码子， 和 TGG， 其通常是色氨酸的唯一密 码子 )， 以产生功能上相同的分子。因此， 在每一所述序列中暗含了编码多肽的核酸的每一 沉默变异。
     对于多肽序列， “保守修饰的变体” 包括对多肽序列的各替换、 缺失或添加， 其导致 对氨基酸用化学上类似的氨基酸进行替换。 提供功能上类似的氨基酸的保守替换表为本领 域所熟知。此类保守修饰变体除了并且不排斥本发明的多态性变体、 种间同源物和等位基
     因。 以下 8 组含有彼此为保守替换的氨基酸 ： 1) 丙氨酸 (A)、 甘氨酸 (G) ； 2) 天冬氨酸 (D)， 谷 氨酸 (E) ； 3) 天冬酰胺 (N)， 谷氨酰胺 (Q) ； 4) 精氨酸 (R)， 赖氨酸 (K) ； 5) 异亮氨酸 (I)， 亮氨 酸 (L)， 甲硫氨酸 (M)， 缬氨酸 (V) ； 6) 苯丙氨酸 (F)， 酪氨酸 (Y)， 色氨酸 (W) ； 7) 丝氨酸 (S)， 苏氨酸 (T) ； 和 8) 半胱氨酸 (C)、 甲硫氨酸 (M)( 参阅例如， Creighton， Proteins(1984))。 在一些实施方案中， 术语 “保守序列修饰” 用于指不显著影响或改变含有氨基酸序列的抗体 的结合特征的氨基酸修饰。
     术语 “交叉 - 阻断” 、 “交叉 - 阻断的” 在此处可互换使用， 表示抗体或其它结合剂 在标准的竞争性结合测定中干扰其它抗体或结合剂与 C3 结合的能力。
     可使用标准竞争结合测定法来测定抗体或其它结合剂能够干扰另一抗体或结合 分子与 C3 结合的能力或程度， 并因此是否可以被称为本发明的交叉阻断。一种合适的测定 法包括使用 Biacore 技术 ( 例如通过使用 BIAcore3000 仪器 (Biacore， Uppsala， Sweden))， 其可以使用表面等离振子共振技术测量相互作用的程度。 用于测量交叉阻断的另一测定法 使用基于 ELISA 的方法。
     术语 “表位” 表示能够特异性结合抗体的蛋白质决定簇。 表位一般由分子的化学活 性表面基团， 如氨基酸或糖侧链组成， 并一般具有特定的三维结构特征， 以及比电荷特征。 构象和非构象表位可以区分开， 因为在变性溶剂的存在下失去与前者的结合， 而不失去与 后者的结合。 如此处所用， 术语 IgG 抗体或其片段 ( 例如， Fab 片段 ) 的 “高亲和力” 指对靶抗原 具有 10-8M 或更低、 10-9M 或更低、 10-10M、 或 10-11M 或更低、 或 10-12M 或更低、 或 10-13M 或更低的 KD 的抗体。然而， “高亲和力” 结合对于其它抗体同种型可以发生变化。例如， 对 于 IgM 同种型的 “高亲和力” 结合指具有 10-7M 或更低， 或 10-8M 或更低的 KD 的抗体。一方 面， 此处描述的抗 C3b 抗体或其抗原结合片段具有低于或等于 1nM， 优选低于或等于 200pM， 更优选低于或等于 100pM， 并甚至更优选低于或等于 10pM 的 KD。
     如此处所用， 术语 “人抗体” 旨在包括具有可变区的抗体， 在所述可变区中构架和 CDR 区均来自人来源的序列。 此外， 如果抗体含有恒定区， 所述恒定区也来自此类人序列， 例 如人种系序列， 或突变形式的人种系序列。本发明的人抗体可包括不由人序列编码的氨基 酸残基 ( 例如， 通过体外随机或位点特异性诱变或通过体内体细胞突变引入的突变 )。
     术语 “人单克隆抗体” 指具有可变区的显示单一结合特异性的抗体， 在所述可变区 中构架和 CDR 区均来自人序列。在一个实施方案中， 所述人单克隆抗体由杂交瘤产生， 所述 杂交瘤包括从转基因非人动物， 例如转基因小鼠中获得的 B 细胞， 所述转基因非人动物具 有融合到无限增殖细胞中的包含人重链转基因和轻链转基因的基因组。
     “人源化” 抗体是保留非人抗体的反应性， 而在人中具有更低免疫原性的抗体。 例如这可通过保留非人 CDR 区并用它们的人类对应物替换抗体剩余部分 ( 即， 恒定区以 及可变区的构架部分 ) 来实现。参阅例如， Morrison 等， Proc.Natl.Acad.Sci.USA， 81 ： 6851-6855， 1984 ； Morrison 和 Oi， Adv.Immunol.， 44 ： 65-92， 1988 ； Verhoeyen 等， Science， 239 ： 1534-1536， 1988 ； Padlan， Molec.Immun.， 28 ： 489-498， 1991 ； 和 Padlan， Molec. Immun.， 31 ： 169-217， 1994。人工程化技术的其它实例包括， 但不限于在 US5,766,886 中公 开的 Xoma 技术。
     在两条或更多核酸或多肽序列的上下文中， 术语 “相同的” 或百分比 “同一性” 指
     相同的两条或更多序列或子序列。 当使用以下的序列比较算法或通过手工比对和视觉检查 测定， 比较并比对在比较窗内或指定区域内用于最大对应时， 如果两条序列具有特定百分 比 ( 即， 在特定区域上或当不指定时， 在全长序列上 60％同一性， 任选地 65％、 70％、 75％、 80％、 85％、 90％、 95％或 99％同一性 ) 的相同氨基酸残基或核苷酸， 那么两条序列 “基本相 同” 。任选地， 同一性存在于长度至少约 50 个核苷酸 ( 或 10 个氨基酸 ) 的区域， 或更优选 地在长度至少 100 到 500 或 1000 或更多核苷酸 ( 或 20、 50、 200 或更多氨基酸 ) 的区域。
     对于序列比较， 通常一条序列作为参考序列， 测试序列与其进行比较。 当使用序列 比较算法时， 将测试和参考序列输入计算机， 如果需要， 指定子序列坐标， 并指定序列算法 程序参数。可使用默认程序参数， 或可指定可选参数。所述序列比较算法然后基于程序参 数计算测试序列相对于参考序列的百分比序列同一性。
     如此处所用， “比较窗口”包括参考选自 20 到 600、 一般约 50 到约 200， 更一般 约 100 到约 150 的任何一定数量相邻位置的区段， 其中可在两条序列进行最佳比对后将 序列与相同数量相邻位置的参考序列进行比较。用于比较的序列比对方法为本领域所熟 知。例如通过 Smith 和 Waterman(1970)Adv.Appl.Math.2 ： 482c 的局部同源性算法， 通过 Needleman 和 Wunsch， J.Mol.Biol.48 ： 443， 1970 的同源性比对算法， 通过搜索 Pearson 和 Lipman， Proc.Nat’ l.Acad.Sci.USA 85 ： 2444， 1988 的相似性方法， 通过这些算法的计算机 化实现 (Wisconsin Genetics Software Package， Genetics Computer Group， 575 Science Dr.， Madison， WI 中的 GAP、 BESTFIT、 FASTA 和 TFASTA)， 或通过手工比对和视觉检查 ( 参 阅， 例如 Brent 等， Current Protocols in Molecular Biology， John Wiley&Sons， Inc. (Ringbou 编辑， 2003)) 进行序列最佳比对用于比较。
     适合于测定百分比序列同一性和序列相似性的算法的两个实例是 BLAST 和 BLAST 2.0 算法， 其分别描述于 Altschul 等， Nuc.Acids Res.25 ： 3389-3402， 1977 ； 和 Altschul 等， J.Mol.Biol.215 ： 403-410， 1990 中。用于进行 BLAST 分析的软件通过 National Center for BiotechnologyInformation 公开获得。该算法包括首先通过鉴定查询序列中长度为 W 的短字来鉴定高得分序列对 (HSPs)， 当在数据库序列中用相同长度的字比对时， 所述短字 匹配或满足某一正值阈值得分 T。T 称为邻近字得分阈值 (Altschul 等， 上文 )。这些初始 邻近字命中作为起始搜索的种子， 以发现含有它们的更长 HSPs。 只要可增加累积比对得分， 则沿每一序列的两个方向延伸字命中。对于核苷酸序列， 使用参数 M( 对一对匹配残基的奖 赏得分 ； 总＞ 0) 和 N( 对错配残基的罚分 ； 总＜ 0) 计算累积得分。对于氨基酸序列， 使用 得分矩阵来计算累积得分。当 ： 所述累积比对得分从其最高达到值跌落 X 量 ； 因一个或更 多负得分残基比对累积， 所述累积比对得分到达零或以下 ； 或到达任何一条序列的末端时， 停止字命中在每一方向上的延伸。BLAST 算法参数 W、 T 和 X 决定了比对的灵敏度和速度。 BLASTN 程序 ( 对于核苷酸序列 ) 使用默认字长 (W)11、 期望值 (E)10、 M ＝ 5、 N ＝ -4 和两 条链的比较。对于氨基酸序列， BLASTP 程序使用默认字长 3， 和期望值 (E)10 和 BLOSUM62 得分矩阵 ( 参阅 Henikoff 和 Henikoff， Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89 ： 10915， 1989) 比对 (B)50、 期望值 (E)10、 M ＝ 5、 N ＝ -4 和两条链的比较。
     BLAST 算法也进行两条序列之间相似性的统计学分析 ( 参阅例如， Karlin 和 Altschul， Proc.Natl.Acad.Sci.U SA 90 ： 5873-5787， 1993)。BLAST 算法提供的一种相似 性测量是最小总和概率 (P(N))， 其提供两条核苷酸或氨基酸序列之间偶然发生匹配的概率的指示。例如， 如果测试核酸与参考核酸的比较中最小总和概率低于约 0.2， 更优选低于约 0.01， 并最优选低于约 0.001， 那么认为核酸与参考序列相似。
     也可使用已经整合到 ALIGN 算法 ( 版本 2.0) 的 E.Meyers 和 W.Miller(Comput. Appl.Biosci.， 4： 11-17， 1988) 的算法， 使用 PAM120 加权残基表， 空位长度罚分 12 和空位 罚分 4 测定两条氨基酸序列之间的百分比同一性。 此外， 可使用已经整合到 GCG 软件包 ( 可 在 www.gcg.com 上获得 ) 中的 GAP 程序的 Needleman 和 Wunsch(J.Mol， Biol.48 ： 444-453， 1970) 算法， 使用 Blossom 62 矩阵或 PAM250 矩阵， 以及空位加权 16、 14、 12、 10、 8、 6或4和 长度加权 1、 2、 3、 4、 5 或 6 来测定两条氨基酸序列之间的百分比同一性。
     除了上文指出的序列同一性的百分比， 两条核酸序列或多肽基本相同的另一指示 是第一条核酸编码的多肽与针对第二条核酸编码的多肽产生的抗体免疫交叉反应， 如下文 描述。因此， 多肽通常与第二条多肽基本相同， 例如， 其中两条肽仅因保守替换而不同。两 条核酸序列基本相同的另一指示是两个分子或其互补序列在严格条件下彼此杂交， 如下文 描述。两条核酸序列基本相同的又一指示是可使用相同的引物来扩增所述序列。
     术语 “分离的抗体” 指抗体， 其基本不含具有不同抗原特异性的其它抗体 ( 例如， 特异性结合 C3b 的分离的抗体基本不含特异性结合除 C3b 外的抗原的抗体 )。 然而， 特异性 结合 C3b 的分离的抗体可对其它抗原具有交叉反应性。此外， 分离的抗体可基本不含其它 细胞物质和 / 或化学品。
     术语 “同种型” 指重链恒定区基因提供的抗体种类 ( 例如， IgM、 IgE、 IgG 如 IgG1 或 IgG4)。 同种型也包括这些种类中一种的修饰形式， 其中已经进行修饰以改变 Fc 功能， 例 如来增强或减弱效应功能或与 Fc 受体的结合。
     如此处所用， 术语 “Kassoc” 或 “Ka” 旨在指特定抗体 - 抗原相互作用的结合速率， 而如此处所用， 术语 “Kdis” 或 “Kd” 旨在指特定抗体 - 抗原相互作用的解离速率。如此处 所用， 术语 “KD” 旨在指解离常数， 其获得于 Kd 与 Ka 的比值 ( 即 Kd/Ka) 并表达为摩尔浓度 (M)。可使用本领域熟知的方法测定抗体的 KD 值。用于测定抗体 KD 的方法是通过使用表 面等离振子共振， 或使用生物传感器系统如 系统。
     如此处所用， 术语 “单克隆抗体” 或 “单克隆抗体组合物” 指单个分子组合物的抗 体分子的制剂。单克隆抗体组合物对特定表位显示单一结合特异性和亲和力。
     术语 “核酸” 此处与术语 “多核苷酸” 可互换使用， 并指单链或双链形式的脱氧核 糖核苷酸或核糖核苷酸及其聚合物。 所述术语包括含有已知核苷酸类似物或修饰的骨架残 基或键的核酸， 其为合成的、 天然发生的和非天然发生的， 其与参考核酸具有相似的结合性 质， 并且其以与参考核苷酸相似的方式进行代谢。 此类类似物的实例包括， 但不限于硫代磷 酸酯、 氨基磷酸酯、 甲基膦酸酯、 手性 - 甲基膦酸酯、 2-O- 甲基核糖核苷酸、 肽核酸 (PNA)。
     除非另有指出， 特定核酸序列也暗中包括其保守修饰的变体 ( 例如简并密码子替 换 ) 和互补序列， 以及明确指出的序列。尤其是， 如下文详细描述， 可通过产生这样的序列 完成简并密码子替换， 其中用混和碱基和 / 或脱氧肌苷残基替换一个或更多所选 ( 或全部 ) 密码子的第三个位置 (Batzer 等， Nucleic Acid Res.19 ： 5081， 1991 ； Ohtsuka 等， J.Biol. Chem.260 ： 2605-2608， 1985 ； 和 Rossolini 等， Mol.Cell.Probes 8 ： 91-98， 1994)。
     术语 “有效连接” 指两个和更多多核苷酸 ( 例如 DNA) 区段的功能关系。通常， 其 指转录调节序列与转录序列之间的功能关系。例如， 如果启动子或增强子序列刺激或调节编码序列在适当宿主细胞或其它表达系统中的转录， 那么该启动子或增强子序列有效连接 编码序列。一般地， 有效连接转录序列的启动子转录调节序列与转录序列在物理空间上邻 近， 即它们是顺式作用。然而， 一些转录调节序列， 如增强子不需要与编码序列 ( 增强子增 强其转录 ) 在物理空间上邻近或位于其附近。
     如此处所用， 术语 “优化的” 表示已经使用生产细胞或生物， 一般是真核细胞， 例如 毕赤酵母细胞、 中国仓鼠卵巢细胞 (CHO) 或人细胞中优选的密码子改变核苷酸序列， 以编 码氨基酸序列。将优化的核苷酸序列改造以完全或最大可能地保留起始核苷酸序列 ( 其也 称为 “亲本” 序列 ) 最初编码的氨基酸序列。已经改造了此处的优化序列以具有哺乳动物 细胞中优选的密码子。 然而， 此处也考虑其它真核细胞或原核细胞中这些序列的优化表达。 优化的核苷酸序列编码的氨基酸序列也称为优化的。
     术语 “多肽” 和 “蛋白质” 此处互换使用来指氨基酸残基的聚合物。所述术语应用 到氨基酸聚合物， 其中一个或更多氨基酸残基是相应天然发生氨基酸的人工化学模拟物， 还应用到天然发生的氨基酸聚合物和非天然发生的氨基酸聚合物。除非另有指出， 特定的 多肽序列也暗中包括其保守修饰的变体。
     如此处所用， 术语 “重组人抗体” 包括通过重组方法制备、 表达、 产生或分离的所有 人抗体， 如从对人免疫球蛋白基因转基因或转染色体的动物 ( 例如小鼠 ) 或从中制备的杂 交瘤中分离的抗体、 从经转化以表达人抗体的宿主细胞， 例如从转染瘤中分离的抗体、 从重 组、 组合人抗体库文中分离的抗体， 和通过任何其它手段制备、 表达、 产生或分离的抗体， 所 述手段包括将全部或部分人免疫球蛋白基因、 序列剪切成其它 DNA 序列。此类重组人抗体 具有可变区， 其中构架和 CDR 区均来自人种系免疫球蛋白序列。然而在某些实施方案中， 此 类重组人抗体可进行体外诱变 ( 或者， 当使用人 Ig 序列转基因的动物时， 进行体内体细胞 诱变 )， 因此重组抗体的 VH 和 VL 区的氨基酸序列是当来自并与人种系 VH 和 VL 序列相关时 可能在体内人抗体种系所有组成成分中不天然存在的序列。
     术语 “重组宿主细胞” ( 或简单地 “宿主细胞” ) 指已经向其中引入重组表达载体 的细胞。应理解此类术语不仅旨在指特定受试者细胞， 还指此细胞的后代。因为某些修饰 可能因突变或环境影响而在后代中出现， 所以该后代实际上可能与亲本细胞不相同， 但仍 然包括在此处所用术语 “宿主细胞” 的范围内。
     术语 “受试者” 包括人和非人动物。非人动物包括所有的脊椎动物， 例如哺乳动物 和非哺乳动物， 如非人灵长类、 羊、 狗、 奶牛、 鸡、 两栖动物和爬行动物。 除了指出时， 术语 “患 者” 或 “受试者” 此处可互换使用。
     术语 “治疗” 包括施用组合物或抗体， 以防止或延迟症状、 并发症或疾病 ( 例如 AMD) 的生物化学指征的开始， 缓解症状或阻止或抑制疾病、 状况或病症的进一步发展。 治疗 可以是预防性的 ( 以防止或延迟疾病开始， 或防止其临床或亚临床症状的表现 ) 或在疾病 表现后治疗性抑制或缓解症状。
     术语 “载体” 旨在指能够转运已经连接另一多核苷酸的多核苷酸分子。一种类型 的载体是 “质粒” ， 其指已经连接额外 DNA 片段的环形双链 DNA 环。另一类型的载体是病毒 载体， 如腺伴随病毒载体 (AAV 或 AAV2)， 其中额外的 DNA 区段可连接到病毒基因组内。某 些载体能够在其中引入载体的宿主细胞中进行自主复制 ( 例如， 具有细菌复制起点的细菌 载体和游离型哺乳动物载体 )。其它载体 ( 例如非游离型哺乳动物载体 ) 可在引入宿主细胞后整合到宿主细胞的基因组中， 并由此与所述宿主基因组一起复制。 此外， 某些载体能够 指导它们有效连接的基因的表达。此类载体此处称为 “重组表达载体” ( 或简单地， “表达 载体” )。一般而言， 在重组 DNA 技术中有用的表达载体经常是质粒的形式。在本说明书中， “质粒” 和 “载体” 可互换使用， 因为质粒是载体的最常用形式。然而， 本发明旨在包括此类 其它形式的表达载体， 如病毒载体 ( 例如， 复制缺陷型逆转录病毒、 腺病毒和腺伴随病毒 )， 其起等同的功能。
     如此处所用， 术语 “C3b 活性” 表示 C3b 产生下游的补体旁路的活性， 包括但不限于 例如 C3 转变酶的活性， C5 转变酶的活性。可使用此处描述的测定， 如但不限于溶血测定， 测定 C3a 和 C5a 产生的测定、 C3b 沉积测定， 和膜攻击复合体 (MAC) 沉积测定来测定 C3b 活 性。如此处所用， “C3b 活性的改变” 或 “C3b 活性的调节” 指通过一种或多种此处描述的测 定法测定 C3b 活性， 其中 C3b 活性相对于相关对照增加或降低至少 10％。 例如， 当存在抗体 或片段的情况下 C3b 活性相对于缺少抗体或片段情况下 C3b 的活性降低或增加至少 10％ 时， 可以说本发明的抗体或抗原结合片段调节 C3b 活性。
     如此处所用， 术语 “cyno” 或 “猕猴” 指猕猴 (Macaca fascicularis)。
     附图简述 图 1 显示， C3b 抗体以相对于 C3 高至少 1000 倍的选择性结合 C3b。
     图 2 显示了在 10％人或猕猴血清中抗 C3b 抗体抑制溶血的能力的实例。
     图 3 显示了 C3b 抗体抑制 C3b 产生为 C3 分解产物的能力的实例。
     图 4 显示了证明 C3b 抗体抑制 MAC 沉积的能力的示例性数据。
     图 5 显示， C3b 抗体通过抑制产生 C3a 和 C5a 阻断旁路途径驱动的补体激活。
     图 6A 显示了 SDS-PAGE 凝胶， 其显示了 tick-over 转变酶活性的抑制。图 6B 显示 了 6A 凝胶中对 C3b 产生的抑制的定量。图 6C 显示了抗 C3b 抗体抑制预形成的 C3 转变酶 活性。
     图 7 显示抗体 C3b 抗体体外抑制 C5 转化酶活性。
     图 8A 显示了通过 C3b 抗体抑制因子 B 结合 C3b。图 8B 显示了通过 C3b 抗体抑制 因子 P 结合 C3b。图 8C 显示了通过 C3b 抗体抑制因子 H 结合 C3b。图 8D 显示了通过 C3b 抗体抑制 C3b-C3b 二聚体形成。
     图 9 显示了针对 C3d 的抗体交叉反应性测定的结果。
     图 10 显示了针对 C5 的抗体交叉反应性测定的结果。
     图 11 显示了测定 C3b 抗体是否结合 i C3b 或 C3c 的结合测定的结果。
     图 12 显示了物种交叉反应性研究的结果。图 12A 显示了大鼠交叉反应性。图 12B 显示了兔交叉反应性。图 12C 显示了猪交叉反应性。图 12D 显示了小鼠交叉反应性。图 12E 显示了豚鼠交叉反应性。图 12F 显示了狗交叉反应性。
     发明详述
     本发明部分基于这样抗体分子的发现， 所述抗体分子特异性结合人和猕猴 C3b。 本 发明涉及全长 IgG 形式的抗体 ( 参阅例如， 抗体 9556、 9611、 9612、 9609、 9610、 9674 和 9675) 以及其抗原结合片段， 如 Fab 片段 ( 例如， 参阅抗体 9124、 9397、 9398、 9136、 9141、 9373 和 9423)。
     因此， 本发明提供特异性结合补体 C3b 蛋白 ( 例如， 人 C3b， 猕猴 C3b) 的抗体、 药物
     组合物、 生产方法和使用此类抗体和组合物的方法。
     C3b 抗体
     本发明提供特异性结合 C3b( 例如， 人 C3b， 猕猴 C3b) 的抗体。 在一些实施方案中， 本发明提供特异性结合人和猕猴 C3b 的抗体。本发明的抗体包括， 但不限于如实施例中所 述分离的人单克隆抗体。
     本发明提供特异性结合 C3b 蛋白质 ( 例如， 人和 / 或猕猴 C3b) 的抗体， 所述抗体包 含具有 SEQ ID NO ： 7、 21、 35、 49、 63、 77、 91、 105、 119、 133、 147、 161、 175 和 189 的氨基酸序列 的 VH 结构域。本发明还提供特异性结合 C3b 蛋白质 ( 例如， 人和 / 或猕猴 C3b) 的抗体， 所 述抗体包含具有下文表 1 中列出的任何一个 VH CDRs 的氨基酸序列的 VH CDR。具体而言， 本发明提供特异性结合 C3b 蛋白质 ( 例如， 人和 / 或猕猴 C3b) 的抗体， 所述抗体包含 ( 或 者， 组成为 ) 具有下文表 1 中列出的任何一个 VH CDRs 的氨基酸序列的一个、 两个、 三个、 四 个、 五个或更多 VH CDRs。
     本发明提供特异性结合 C3b 蛋白质 ( 例如， 人和 / 或猕猴 C3b) 的抗体， 所述抗体包 含具有 SEQ ID NO ： 8、 22、 36、 50、 64、 78、 92、 106、 120、 134、 148、 162、 176 和 190 的氨基酸序列 的 VL 结构域。本发明还提供特异性结合 C3b 蛋白质 ( 例如， 人和 / 或猕猴 C3b) 的抗体， 所 述抗体包含具有下文表 1 中列出的任何一个 VL CDRs 的氨基酸序列的 VL CDR。具体而言， 本发明提供特异性结合 C3b 蛋白质 ( 例如， 人和 / 或猕猴 C3b) 的抗体， 所述抗体包含 ( 或 者， 组成为 ) 具有下文表 1 中列出的任何一个 VL CDRs 的氨基酸序列的一个、 两个、 三个或 更多 VL CDRs。
     本发明的其它抗体包括已经突变的氨基酸， 其在 CDR 区中仍然与表 1 所述序列中 描述的 CDR 区具有至少百分之 60、 70、 80、 85、 90 或 95 的同一性。在一些实施方案中， 其包 括突变氨基酸序列， 其中当与表 1 所述序列中描述的 CDR 区比较时 CDR 区中不超过 1、 2、 3、 4 或 5 个氨基酸已经发生突变。
     本发明还提供编码特异性结合 C3b 蛋白质 ( 例如， 人和 / 或猕猴 C3b) 的抗体的 VH、 VL、 全长重链和全长轻链的核酸序列。可优化此类核酸序列用于在哺乳动物细胞中表 达 ( 例如， 表 1 显示了抗体 9556、 9611、 9612、 9609、 9610、 9674 和 9675， 以及 Fab 片段 9124、 9397、 9398、 9136、 9141、 9373 和 9423 的重链和轻链的优化核酸序列 )。
     表 1. 本发明 C3b 抗体、 Fabs 与 C3b 蛋白质的实例
     表1
    
    
    
    
    
    
    
    
    
    
    
    
    
    
    
    
    
    
    
    
    
    
    
    
    
    
    
    本发明的其它抗体包括其中氨基酸或编码氨基酸的核酸已经发生突变， 但与表 1 中描述的序列仍然具有至少百分之 60、 65、 70、 75、 80、 85、 90 或 95 的同一性的那些抗体。在 一些实施方案中， 其包括突变氨基酸序列， 其中当与表 1 所述序列中描述的序列中的可变 区比较时在可变区内不超过 1、 2、 3、 4 或 5 个氨基酸已经发生突变， 但却保留基本相同的治 疗活性。
     因为这些抗体中每一抗体均可结合 C3b， 所以可以 “混和并匹配” VH、 VL、 全长轻链 和全长重链序列 ( 氨基酸序列和编码所述氨基酸序列的核苷酸序列 )， 以产生本发明的其 它 C3b 结合抗体。可使用本领域已知的结合测定法 ( 例如， ELISA， 和实施例部分中描述的 其它测定法 ) 测试此类 “混和并匹配的” C3b 结合抗体。当这些链进行混合和匹配时， 应该 用结构相似的 VH 序列替换来自特定 VH/VL 配对的 VH 序列。 同样， 应该用结构相似的全长重 链序列替换来自特定全长重链 / 全长轻链配对的全长重链序列。同样， 应该用结构相似的 VL 序列替换来自特定 VH/VL 配对的 VL 序列。同样应该用结构相似的全长轻链序列替换来 自特定全长重链 / 全长轻链配对的全长轻链序列。因此， 一方面， 本发明提供分离的单克隆 抗体或其抗原结合区， 其具有 ： 包含选自 SEQ ID NO ： 7、 21、 35、 49、 63、 77、 91、 105、 119、 133、 147、 161、 175 和 189 的氨基酸序列的重链可变域 ； 和包含选自 SEQ ID NO ： 8、 22、 36、 50、 64、 78、 92、 106、 120、 134、 148、 162、 176 和 190 的氨基酸序列的轻链可变域 ； 其中所述抗体特异 性结合 C3b( 例如， 人和 / 或猕猴 C3b)。
     另一方面， 本发明提供 (i) 分离的单克隆抗体， 其具有 ： 包含选自 SEQID NOs ： 9、 23、 37、 51、 65、 79、 93、 107、 121、 135、 149、 163、 177 和 191 的氨基酸序列的全长重链， 已经优 化所述氨基酸序列用于在哺乳动物细胞中表达 ； 和包含选自 SEQ ID NOs ： 10、 24、 38、 52、 66、 80、 94、 108、 122、 136、 150、 164、 178 和 192 的氨基酸序列的全长轻链， 已经优化所述氨基酸
     序列用于在哺乳动物细胞中表达 ； 或 (ii) 包含其抗原结合部分的功能蛋白质。
     另一方面， 本发明提供 C3b 结合抗体， 其包含如表 1 中所述的重链和轻链 CDR1s、 CDR2s 和 CDR3s， 或其组合。 所述抗体的 VH CDR1s 的氨基酸序列示于 SEQ ID NOs ： 1、 15、 29、 43、 57、 71、 85、 99、 113、 127、 141、 155、 169 和 183 中。所述抗体的 VH CDR2s 的氨基酸序列示 于 SEQID NOs ： 2、 16、 30、 44、 58、 72、 86、 100、 114、 128、 142、 156、 170 和 184 中。 所述抗体的 VH CDR3s 的氨基酸序列示于 SEQ ID NOs ： 3、 17、 31、 45、 59、 73、 87、 101、 115、 129、 143、 157、 171 和 185 中。所述抗体的 VL CDR1s 的氨基酸序列示于 SEQ ID NOs ： 4、 18、 32、 46、 60、 74、 88、 102、 116、 130、 144、 158、 172 和 186 中。 所述抗体的 VL CDR2s 的氨基酸序列示于 SEQ ID NOs ： 5、 19、 33、 47、 61、 75、 89、 103、 117、 131、 145、 159、 173 和 187 中。 所述抗体的 VL CDR3s 的氨基 酸序列示于 SEQ ID NOs ： 6、 20、 34、 48、 62、 76、 90、 104、 118、 132、 146、 160、 174 和 188 中。 使用 Kabat 系统描绘 CDR 区 (Kabat， E.A.， 等， 1991Sequences of Proteins of Immunological Interest， 第五版， U.S.Departmentof Health and Human Services， NIH 公开号 91-3242)。
     如果这些抗体中的每一抗体均可结合 C3b 并且主要通过 CDR1、 2 和 3 区提供抗原 结合特异性， VH CDR1、 2 和 3 序列和 VL CDR1、 2 和 3 序列就可进行 “混和并匹配” ( 即， 可 将来自不同抗体的 CDRs 进行混和并匹配， 尽管每一抗体优选含有 VH CDR1、 2 和 3 以及 VL CDR1、 2 和 3， 以产生本发明的其它 C3b 结合分子 )。 可使用本领域已知的结合测定法和实施 例中描述的那些方法 ( 例如 ELISA) 来测试此类 “混和并匹配的” C3b 结合抗体。当 VH CDR 序列进行混和并匹配时， 应该用结构相似的 CDR 序列替换来自特定 VH 序列的 CDR1、 CDR2 和 / 或 CDR3。同样， 当 VL CDR 序列进行混和并匹配时， 应该用结构相似的 CDR 序列替换来自 特定 VL 序列的 CDR1、 CDR2 和 / 或 CDR3 序列。对本领域普通技术人员显而易见的是可用来 自此处对本发明单克隆抗体所示的 CDR 序列的结构相似的序列替换一个或更多 VH 和 / 或 VL CDR 区来产生新的 VH 和 VL 序列。 在一个实施方案中， 除了上述的， 此处描述的抗体的抗 原结合片段可包含 VHCDR1、 2 和 3， 或 VL CDR 1、 2 和 3， 其中所述片段作为单个可变域结合 C3b。
     因此， 本发明提供分离的单克隆抗体或其抗原结合区， 其包含 ： 包含选自 SEQ ID NOs ： 1、 15、 29、 43、 57、 71、 85、 99、 113、 127、 141、 155、 169 和 183 的氨基酸序列的重链可变区 CDR1 ； 包含选自 SEQ ID NOs ： 2、 16、 30、 44、 58、 72、 86、 100、 114、 128、 142、 156、 170 和 184 的氨 基酸序列的重链可变区 CDR2 ； 包含选自 SEQ ID NOs ： 3、 17、 31、 45、 59、 73、 87、 101、 115、 129、 143、 157、 171 和 185 的氨基酸序列的重链可变区 CDR3 ； 包含选自 SEQ ID NOs ： 4、 18、 32、 46、 60、 74、 88、 102、 116、 130、 144、 158、 172 和 186 的氨基酸序列的轻链可变区 CDR1 ； 包含选自 SEQ ID NOs ： 5、 19、 33、 47、 61、 75、 89、 103、 117、 131、 145、 159、 173 和 187 的氨基酸序列的轻 链可变区 CDR2 ； 包含选自 SEQ ID NOs ： 6、 20、 34、 48、 62、 76、 90、 104、 118、 132、 146、 160、 174 和 188 的氨基酸序列的轻链可变区 CDR3 ； 其中所述抗体特异性结合 C3b。
     本发明包括具有表 1 中抗体 9556 的重链和轻链序列的抗体或其抗原结合片段。 本 发明包括具有表 1 中抗体 9611 的重链和轻链序列的抗体或其抗原结合片段。本发明包括 具有表 1 中抗体 9612 的重链和轻链序列的抗体或其抗原结合片段。本发明还包括具有表 1 中抗体 9609 的重链和轻链序列的抗体或其抗原结合片段。本发明包括具有表 1 中抗体 9610 的重链和轻链序列的抗体或其抗原结合片段。本发明还包括具有表 1 中抗体 9674 的 重链和轻链序列的抗体或其抗原结合片段。本发明又进一步包括具有表 1 中 9675 抗体的重链和轻链序列的抗体或其抗原结合片段。本发明包括具有表 1 中 9124 抗体的重链和轻 链序列的抗体或其抗原结合片段。本发明还包括具有表 1 中 9397 抗体的重链和轻链序列 的抗体或其抗原结合片段。本发明还包括具有表 1 中 9398 抗体的重链和轻链序列的抗体 或其抗原结合片段。本发明还包括具有表 1 中 9136 抗体的重链和轻链序列的抗体或其抗 原结合片段。本发明还包括具有表 1 中 9141 抗体的重链和轻链序列的抗体或其抗原结合 片段。本发明又进一步包括具有表 1 中 9373 抗体的重链和轻链序列的抗体或其抗原结合 片段。本发明还包括具有表 1 中 9423 抗体的重链和轻链序列的抗体或其抗原结合片段。
     在特定实施方案中， 特异性结合 C3b 的抗体包含 SEQ ID NO ： 1 的重链可变区 CDR1 ； SEQ ID NO ： 2 的重链可变区 CDR2 ； SEQ ID NO ： 3 的重链可变区 CDR3 ； SEQ ID NO ： 4 的轻链 可变区 CDR1 ； SEQ ID NO ： 5 的轻链可变区 CDR2 ； 和 SEQ ID NO ： 6 的轻链可变区 CDR3。在另 一特定实施方案中， 特异性结合 C3b 的抗体包含 SEQ ID NO ： 15 的重链可变区 CDR1 ； SEQ ID NO ： 16 的重链可变区 CDR2 ； SEQ ID NO ： 17 的重链可变区 CDR3 ； SEQ ID NO ： 18 的轻链可变 区 CDR1 ； SEQ ID NO ： 19 的轻链可变区 CDR2 ； 和 SEQ ID NO ： 20 的轻链可变区 CDR3。
     在另一特定实施方案中， 特异性结合 C3b 的抗体包含 SEQ ID NO ： 29 的重链可变区 CDR1 ； SEQ ID NO ： 30 的重链可变区 CDR2 ； SEQ ID NO ： 31 的重链可变区 CDR3 ； SEQ ID NO ： 32 的轻链可变区 CDR1 ； SEQ ID NO ： 33 的轻链可变区 CDR2 ； 和 SEQ ID NO ： 34 的轻链可变区 CDR3。在另一特定实施方案中， 特异性结合 C3b 的抗体包含 SEQ ID NO ： 43 的重链可变区 CDR1 ； SEQ ID NO ： 44 的重链可变区 CDR2 ； SEQ ID NO ： 45 的重链可变区 CDR3 ； SEQ ID NO ： 46 的轻链可变区 CDR1 ； SEQ ID NO ： 47 的轻链可变区 CDR2 ； 和 SEQ ID NO ： 48 的轻链可变区 CDR3。
     在另一特定实施方案中， 特异性结合 C3b 的抗体包含 SEQ ID NO ： 57 的重链可变区 CDR1 ； SEQ ID NO ： 58 的重链可变区 CDR2 ； SEQ ID NO ： 59 的重链可变区 CDR3 ； SEQ ID NO ： 60 的轻链可变区 CDR1 ； SEQ ID NO ： 61 的轻链可变区 CDR2 ； 和 SEQ ID NO ： 62 的轻链可变区 CDR3。在另一特定实施方案中， 特异性结合 C3b 的抗体包含 SEQ ID NO ： 71 的重链可变区 CDR1 ； SEQ ID NO ： 72 的重链可变区 CDR2 ； SEQ ID NO ： 73 的重链可变区 CDR3 ； SEQ ID NO ： 74 的轻链可变区 CDR1 ； SEQ ID NO ： 75 的轻链可变区 CDR2 ； 和 SEQ ID NO ： 76 的轻链可变区 CDR3。
     在另一特定实施方案中， 特异性结合 C3b 的抗体包含 SEQ ID NO ： 85 的重链可变区 CDR1 ； SEQ ID NO ： 86 的重链可变区 CDR2 ； SEQ ID NO ： 87 的重链可变区 CDR3 ； SEQ ID NO ： 88 的轻链可变区 CDR1 ； SEQ ID NO ： 89 的轻链可变区 CDR2 ； 和 SEQ ID NO ： 90 的轻链可变区 CDR3。
     在某些实施方案中， 特异性结合 C3b 的抗体是表 1 中描述的抗体。 在优选实施方案 中， 结合 C3b 的抗体是 9556。在其它优选实施方案中， 结合 C3b 的抗体是 9610。在其它优 选实施方案中， 结合 C3b 的抗体是 9674。在其它优选实施方案中， 结合 C3b 的抗体是 9675。 在又一其它优选实施方案中， 结合 C3b 的抗体是 9609。
     如此处所用， 人抗体包含重链或轻链可变区或全长重链或轻链， 其 “产自” 或 “来 自” 特定种系序列， 如果抗体的可变区或全长链获自使用人种系免疫球蛋白基因的系统的 话。 此类系统包括用目的抗原免疫携带人免疫球蛋白基因的转基因小鼠或利用目的抗原筛 选在噬菌体上展示的人免疫球蛋白基因文库。 例如可通过比较人抗体的氨基酸序列与人种系免疫球蛋白的氨基酸序列并选择与人抗体的序列在序列上最相近 ( 即， 最高％同一性 ) 的人种系免疫球蛋白序列来鉴定 “产自” 或 “来自” 人种系免疫球蛋白序列的人抗体。 “产 自” 或 “来自” 特定人种系免疫球蛋白序列的人抗体可含有与种系序列相比例如因天然发 生的体细胞突变或刻意引入定点突变的氨基酸差异。然而， 在 VH 或 VL 构架区， 所选人抗体 在氨基酸序列上通常与人种系免疫球蛋白基因编码的氨基酸序列具有至少 90％的同一性， 并含有氨基酸残基， 当与其它物种的种系免疫球蛋白氨基酸序列 ( 例如， 鼠类种系序列 ) 比 较时， 其将人抗体鉴定为人的。 在某些情况下， 人抗体在氨基酸序列上与种系免疫球蛋白基 因编码的氨基酸序列具有至少 60％、 70％、 80％、 90％或至少 95％， 或甚至至少 96％、 97％、 98％或 99％的同一性。通常， 重组人抗体与人种系免疫球蛋白基因编码的氨基酸序列在 VH 或 VL 构架区具有不超过 10 个氨基酸的差异。在某些情况下， 人抗体与种系免疫球蛋白基 因编码的氨基酸序列具有不超过 5 个， 或甚至不超过 4、 3、 2 或 1 个氨基酸的差异。人种系 免疫球蛋白基因的实例包括， 但不限于下文描述的可变域种系片段以及 DP47 和 DPK9。
     同源抗体
     在另一实施方案中， 本发明提供包含与表 1 所述序列同源的氨基酸序列的抗体或 其抗原结合片段， 并且所述抗体结合 C3b 蛋白质 ( 例如， 人和 / 或猕猴 C3b)， 并保留表 1 所 述那些抗体的期望功能性质。
     例如， 本发明提供包含重链可变域和轻链可变域的分离的单克隆抗体 ( 或其功能 抗原结合片段 )， 其中所述重链可变域包含与选自 SEQ ID NO ： 7、 21、 35、 49、 63、 77、 91、 105、 119、 133、 147、 161、 175 和 189 的氨基酸序列具有至少 80％、 至少 90％或至少 95％同一性的 氨基酸序列 ； 所述轻链可变域包含与选自 SEQ ID NO ： 8、 22、 36、 50、 64、 78、 92、 106、 120、 134、 148、 162、 176 和 190 的氨基酸序列具有至少 80％、 至少 90％或至少 95％同一性的氨基酸 序列 ； 所述抗体特异性结合 C3b( 例如， 人和 / 或猕猴 C3b)， 并且所述抗体在溶血测定中可 以抑制红细胞溶解。在特定实例中， 此类抗体在 10％人或猕猴血清的溶血测定中具有低于 50nM 的 IC50 值。
     在其它实施方案中， VH 和 / 或 VL 氨基酸序列可以与表 1 中阐明的序列具有 50％、 60％、 70％、 80％、 90％、 95％、 96％、 97％、 98％或 99％的同一性。在其它实施方案中， VH 和 / 或 VL 氨基酸序列可以相同， 只是在不超过 1、 2、 3、 4 或 5 个氨基酸位置上具有氨基酸替换。 可通过诱变 ( 例如定点或 PCR 介导诱变 ) 分别编码 SEQ ID NO ： 7、 21、 35、 49、 63、 77、 91、 105、 119、 133、 147、 161、 175、 189、 8、 22、 36、 50、 64、 78、 92、 106、 120、 134、 148、 162、 176 和 190 的核 酸分子来获得这样的抗体， 所述抗体具有与表 1 所述的那些抗体的 VH 和 VL 区具有高 ( 即， 80％或更高 ) 同一性的 VH 和 VL 区， 然后使用此处所述的功能测定法测试所编码的经改变 的抗体保留的功能。
     在其它实施方案中， 全长重链和 / 或全长轻链氨基酸序列与表 1 中阐明的序列具 有 50％、 60％、 70％、 80％、 90％、 95％、 96％、 97％、 98％或 99％的同一性。可通过诱变 ( 例 如定点或 PCR 介导的诱变 ) 分别编码此类多肽的核酸分子来获得这样的抗体， 其具有分别 与 SEQ ID NOs ： 9、 23、 37、 51、 65、 79、 93、 107、 121、 135、 149、 163、 177 和 191 任何一个的全长 重链和 SEQ ID NOs ： 10、 24、 38、 52、 66、 80、 94、 108、 122、 136、 150、 164、 178 和 192 任何一个的 全长轻链具有高 ( 即， 80％或更高 ) 同一性的全长重链和全长轻链， 然后使用此处所述的功 能测定法测试编码的经改变抗体保留的功能。在其它实施方案中， 全长重链和 / 或全长轻链核苷酸序列与上文阐明的序列具有 60％、 70％、 80％、 90％、 95％、 96％、 97％、 98％或 99％的同一性。
     在其它实施方案中， 重链和 / 或轻链核苷酸序列的可变区与上文阐明的序列具有 60％、 70％、 80％、 90％、 95％、 96％、 97％、 98％或 99％的同一性。
     如此处所用， 两条序列之间的百分比同一性是所述序列共有的相同位置数量的函 数 ( 即， ％同一性等于相同位置的数量 / 位置总数 x100)， 其中考虑空位数量和每一空位长 度， 需要引入所述空位用于两条序列的最佳比对。 如下文非限制性实施例所述， 可使用数学 算法完成两条序列之间序列的比较和百分比同一性的确定。
     此外或备选地， 本发明的蛋白质序列可进一步用作 “查询序列” 以针对公共数据库 进行搜索， 例如来鉴定相关序列。 例如， 可使用 Altschul 等， 1990 J.Mol.Biol.215 ： 403-10 的 BLAST 程序 ( 版本 2.0) 进行此类搜索。
     具有保守修饰的抗体
     在某些实施方案中， 本发明的抗体具有包含 CDR1、 CDR2 和 CDR3 序列的重链可变 区和包含 CDR1、 CDR2 和 CDR3 序列的轻链可变区， 其中一个或更多这些 CDR 序列具有基于 此处所述抗体的特定氨基酸序列或其保守修饰， 并且其中所述抗体保留本发明 C3b 结合抗 体的期望功能性质。因此， 本发明提供分离的单克隆抗体， 或其功能抗原结合片段， 其由包 含 CDR1、 CDR2 和 CDR3 序列的重链可变区和包含 CDR1、 CDR2 和 CDR3 序列的轻链可变区组 成， 其中 ： 所述重链可变区 CDR1 氨基酸序列选自 SEQID NOs ： 1、 15、 29、 43、 57、 71、 85、 99、 113、 127、 141、 155、 169 和 183， 及其保守修饰 ； 所述重链可变区 CDR2 氨基酸序列选自 SEQ ID NOs ： 2、 16、 30、 44、 58、 72、 86、 100、 114、 128、 142、 156、 170 和 184， 及其保守修饰 ； 所述重链可 变区 CDR3 氨基酸序列选自 SEQ ID NOs ： 3、 17、 31、 45、 59、 73、 87、 101、 115、 129、 143、 157、 171 和 185， 及其保守修饰 ； 所述轻链可变区 CDR1 氨基酸序列选自 SEQ ID NOs ： 4、 18、 32、 46、 60、 74、 88、 102、 116、 130、 144、 158、 172 和 186， 及其保守修饰 ； 所述轻链可变区 CDR2 氨基酸 序列选自 SEQ ID NOs ： 5、 19、 33、 47、 61、 75、 89、 103、 117、 131、 145、 159、 173 和 187， 及其保守 修饰 ； 所述轻链可变区 CDR3 氨基酸序列选自 SEQ ID NOs ： 6、 20、 34、 48、 62、 76、 90、 104、 118、 132、 146、 160、 174 和 188， 及其保守修饰 ； 所述抗体或其抗原结合片段特异性结合 C3b， 并在 如此处所述溶血测定中抑制红细胞溶解。
     在其它实施方案中， 优化用于在哺乳动物细胞中表达的本发明的抗体具有全长重 链序列和全长轻链序列， 其中一个或更多这些序列具有基于此处所述抗体的特定氨基酸序 列或其保守修饰， 并且其中所述抗体保留本发明 C3b 结合抗体的期望功能性质。因此， 本发 明提供优化用于在哺乳动物细胞中表达的分离的单克隆抗体， 其由全长重链和全长轻链组 成， 其中 ： 所述全长重链具有选自 SEQ ID NOs ： 9、 23、 37、 51、 65、 79、 93、 107、 121、 135、 149、 163、 177 和 191 的氨基酸序列， 及其保守修饰 ； 并且所述全长轻链具有选自 SEQ ID NOs ： 10、 24、 38、 52、 66、 80、 94、 108、 122、 136、 150、 164、 178 和 192 的氨基酸序列， 及其保守修饰 ； 所述 抗体特异性结合 C3b( 例如， 人和 / 或猕猴 C3b) ； 并且所述抗体在如此处所述的溶血测定中 抑制红细胞溶解。在特定实施方案中， 当使用用 100pM 人 C5 重构的人 C5 耗尽的血清时， 此 类抗体在 10％人或猕猴血清的溶血测定中具有低于 50nM 的 IC50 值。
     结合相同表位的抗体
     本发明提供与表 1 所述 C3b 结合抗体结合相同表位的抗体。 因此可基于它们在 C3b结合测定中与本发明其它抗体交叉竞争 ( 例如以统计学上显著的方式竞争性抑制结合 ) 的 能力鉴定额外的抗体。测试抗体抑制本发明抗体与 C3b 蛋白质 ( 例如， 人和 / 或猕猴 C3b) 结合的能力显示所述测试抗体可与该抗体竞争结合 C3b ； 根据非限制性理论， 该抗体和与 其竞争的抗体结合 C3b 上相同或相关 ( 例如， 结构上相似或空间上接近 ) 的表位。在某一 实施方案中， 与本发明抗体结合 C3b 上相同表位的抗体是人单克隆抗体。可如此处所述制 备并分离这种人单克隆抗体。 如此处所用， 当竞争抗体浓度高于竞争抗体的 106xKD， 竞争抗 体抑制本发明抗体结合 C3b 高于 50％时， 抗体 “竞争” 结合。
     改造和修饰的抗体
     还可使用具有一个或更多此处所示 VH 和 / 或 VL 序列的抗体作为起始材料制备本 发明的抗体， 以改造修饰的抗体， 所述修饰的抗体可以具有从起始抗体改变的性质。 可通过 修饰一个或两个可变区 ( 即， VH 和 / 或 VL)， 例如一个或更多 CDR 区和 / 或一个或更多构架 区内的一个或更多残基来改造抗体。此外或备选地， 可通过在恒定区内修饰残基来改造抗 体， 例如来改变所述抗体的效应功能。
     可以进行的一种类型的可变区改造是 CDR 移植。抗体主要通过定位在六个重链和 轻链互补决定区 (CDRs) 中的氨基酸残基与靶抗原相互作用。为此， CDRs 内的氨基酸序列 在各抗体之间比 CDRs 外的序列更多样化。因为 CDR 序列负责多数抗体 - 抗原相互作用， 所以通过构建表达载体来表达模拟特定天然发生抗体的性质的重组抗体是可能的， 所述表 达载体包括移植到具有不同性质的不同抗体的构架序列上的来自特定天然发生抗体的 CDR 序列 ( 参阅例如， Riechmann， L. 等， 1998 Nature 332 ： 323-327 ； Jones， P. 等， 1986 Nature 321 ： 522-525 ； Queen， C. 等， 1989Proc.Natl.Acad.， U.S.A.86 ： 10029-10033 ； Winter 的 美 国 专 利 号 5,225,539， 和 Queen 等 的 美 国 专 利 号 5,530,101 ； 5,585,089 ； 5,693,762 和 6,180,370)。
     因此， 本发明的另一实施方案涉及分离的单克隆抗体， 或其抗原结合片段， 其包含 重链可变区， 所述重链可变区分别包含具有选自 SEQ ID NOs ： 1、 15、 29、 43、 57、 71、 85、 99、 113、 127、 141、 155、 169 和 183 的氨基酸序列的 CDR1 序列 ； 具有选自 SEQ ID NOs ： 2、 16、 30、 44、 58、 72、 86、 100、 114、 128、 142、 156、 170 和 184 的氨基酸序列的 CDR2 序列 ； 具有选自 SEQ ID NOs ： 3、 17、 31、 45、 59、 73、 87、 101、 115、 129、 143、 157、 171 和 185 的氨基酸序列的 CDR3 序 列； 和轻链可变区， 所述轻链可变区分别包含具有选自 SEQ ID NOs ： SEQ ID NOs ： 4、 18、 32、 46、 60、 74、 88、 102、 116、 130、 144、 158、 172 和 186 的氨基酸序列的 CDR1 序列 ； 具有选自 SEQ ID NOs ： SEQ ID NOs ： 5、 19、 33、 47、 61、 75、 89、 103、 117、 131、 145、 159、 173 和 187 的氨基酸序 列的 CDR2 序列 ； 具有选自 SEQ ID NOs ： 6、 20、 34、 48、 62、 76、 90、 104、 118、 132、 146、 160、 174 和 188 的氨基酸序列的 CDR3 序列。因此， 此类抗体含有单克隆抗体的 VH 和 VL CDR， 但仍然 含有来自这些抗体的不同构架序列。
     可从公共 DNA 数据库或包括种系抗体基因序列的出版的参考文献中获得此类 构架序列。例如， 人重链和轻链可变区基因的种系 DNA 序列可见于 “VBase” 人种系序列 数 据 库 ( 可 在 互 联 网 www.mrc-cpe.cam.ac.uk/vbase 上 获 得 )， 以 及 Kabat， E.A.， 等， 1991 Sequences ofProteins of Immunological Interest，第 五 版， U.S.Department of Healthand Human Services， NIH 公开号 91-3242 ； Tomlinson， I.M.， 等， 1992 J.fol. Biol.227 ： 776-798 ； 和 Cox， J.P.L. 等， 1994 Eur.J Immunol.24 ： 827-836 ； 各自内容此处明确引入作为参考。
     用于本发明抗体的构架序列的实例是与本发明所选抗体使用的构架序列， 例如本 发明单克隆抗体使用的共有序列和 / 或构架序列在结构上相似的那些构架序列。VH CDR1、 2 和 3 序列， 以及 VL CDR1、 2 和 3 序列可移植到与见于构架序列来源的种系免疫球蛋白基 因中的序列具有相同序列的构架区上， 或者所述 CDR 序列可移植到与种系序列相比含有一 个或更多突变的构架区上。例如， 已经发现有利的是在某些情况下在构架区内突变残基以 维持或增强抗体的抗原结合力 ( 参阅例如， Queen 等的美国专利号 5,530,101 ； 5,585,089 ； 5,693,762 和 6,180,370)。可用作其上构建此处所述抗体和抗原结合片段的支架的构架包 括， 但不限于 VH1A、 VH1B、 VH3、 Vk1、 Vl2 和 Vk2。额外的构架为本领域所知， 并可见于例如万 维网 vbase.mrc-cpe.cam.ac.uk/index.php ？ &MMN_position ＝ 1:1 上的 vBase 数据库。
     另一类型的可变区修饰是在 VH 和 / 或 VL CDR1、 CDR2 和 / 或 CDR3 区内突变氨基 酸残基， 由此改善目的抗体的一种或更多结合性质 ( 例如， 亲和力 )， 称为 “亲和力成熟” 。 可 进行定点诱变或 PCR 介导的诱变引入突变， 并在如此处所述以及实施例中提供的体外或体 内测定中评估对抗体结合或其它目的功能性质的影响。可引入保守修饰 ( 如上文讨论 )。 所述突变可以是氨基酸替换、 添加或缺失。此外， 通常改变 CDR 区内不超过 1、 2、 3、 4或5个 残基。
     因此， 在另一实施方案中， 本发明提供分离的 C3b 结合单克隆抗体， 或其抗原结合 片段， 其由重链可变区组成， 所述重链可变区具有 ： 由选自 SEQ ID NOs ： 1、 15、 29、 43、 57、 71、 85、 99、 113、 127、 141、 155、 169 和 183 的氨基酸序列， 或与 SEQ ID NOs ： 1、 15、 29、 43、 57、 71、 85、 99、 113、 127、 141、 155、 169 和 183 相比具有 1、 2、 3、 4 或 5 个氨基酸替换、 缺失或添加的 氨基酸序列组成的 VH CDR1 区 ； 具有选自 SEQ IDNOs ： 2、 16、 30、 44、 58、 72、 86、 100、 114、 128、 142、 156、 170 和 184 的氨基酸序列， 或与 SEQ ID NOs ： 2、 16、 30、 44、 58、 72、 86、 100、 114、 128、 142、 156、 170 和 184 相比具有 1、 2、 3、 4 或 5 个氨基酸替换、 缺失或添加的氨基酸序列的 VH CDR2 区 ； 具有选自 SEQ ID NOs ： 3、 17、 31、 45、 59、 73、 87、 101、 115、 129、 143、 157、 171 和 185 的氨基酸序列， 或与 SEQ ID NOs ： 3、 17、 31、 45、 59、 73、 87、 101、 115、 129、 143、 157、 171 和 185 相比具有 1、 2、 3、 4 或 5 个氨基酸替换、 缺失或添加的氨基酸序列的 VH CDR3 区 ； 具有选自 SEQ ID NOs ： 4、 18、 32、 46、 60、 74、 88、 102、 116、 130、 144、 158、 172 和 186 的氨基酸序列， 或与 SEQID NOs ： 4、 18、 32、 46、 60、 74、 88、 102、 116、 130、 144、 158、 172 和 186 相比具有 1、 2、 3、 4或 5 个氨基酸替换、 缺失或添加的氨基酸序列的 VL CDR1 区 ； 具有选自 SEQ ID NOs ： 5、 19、 33、 47、 61、 75、 89、 103、 117、 131、 145、 159、 173 和 187 的氨基酸序列， 或与 SEQ ID NOs ： 5、 19、 33、 47、 61、 75、 89、 103、 117、 131、 145、 159、 173 和 187 相比具有 1、 2、 3、 4 或 5 个氨基酸替换、 缺失 或添加的氨基酸序列的 VL CDR2 区 ； 和具有选自 SEQ ID NOs ： 6、 20、 34、 48、 62、 76、 90、 104、 118、 132、 146、 160、 174 和 188 的氨基酸序列， 或与 SEQ ID NOs ： 6、 20、 34、 48、 62、 76、 90、 104、 118、 132、 146、 160、 174 和 188 相比具有 1、 2、 3、 4 或 5 个氨基酸替换、 缺失或添加的氨基酸序 列的 VL CDR3 区。
     抗原结合域移植到备选构架或支架中
     可使用多种抗体 / 免疫球蛋白构架或支架， 只要所得多肽包括至少一个特异性结 合 C3b 的抗原结合区。此类构架或支架包括人免疫球蛋白或其片段的 5 个主要个体基因 型， 并包括其它动物物种， 优选具有人源化方面的动物物种的免疫球蛋白。单重链抗体， 如在骆驼中鉴定的那些单重链抗体在该方面十分重要。 本领域技术人员不断发现并开发新的 构架、 支架和片段。
     一方面， 本发明涉及使用其上可移植本发明 CDRs 的非免疫球蛋白支架产生基 于非免疫球蛋白的抗体。可以使用已知或未知非免疫球蛋白构架和支架， 只要它们包 含对靶 C3b 蛋白质 ( 例如， 人和 / 或猕猴 C3b) 特异的结合区。已知的非免疫球蛋白构 架 或 支 架 包 括， 但 不 限 于 纤 连 蛋 白 (Compound Therapeutics， Inc.， Waltham， MA)、 锚 蛋 白 (MolecularPartners AG， Zurich， Switzerland)、 结 构 域 抗 体 (Domantis， Ltd.， Cambridge， MA， and Ablynx nv， Zwijnaarde， Belgium)、脂 笼 蛋 白 (PierisProteolab AG， Freising， Germany)、 小 模 块 免 疫 药 物 (TrubionPharmaceuticals Inc.， Seattle， WA)、 maxybodies(Avidia， Inc.， MountainView， CA)、 A 蛋 白 (Affibody AG， Sweden) 和 affilin(γ- 晶体蛋白或泛素 )(Scil Proteins GmbH， Halle， Germany)。
     纤连蛋白支架基于纤连蛋白类型 III 结构域 ( 例如， 纤连蛋白类型 III 的第十个 模块 (10Fn3 结构域 ))。纤连蛋白类型 III 结构域具有在两个 β 折叠之间分布的 7 个或 8 个 β 链， 所述两个 β 折叠自身彼此包装形成蛋白质的核心， 并进一步含有将 β 链彼此连 接且暴露在溶剂中的环 ( 与 CDRs 类似 )。在 β 折叠夹层每一边缘具有至少三个这样的环， 其中所述边缘是与 β 链方向垂直的蛋白质边界 ( 参阅 US 6,818,418)。 这些基于纤连蛋白 的支架不是免疫球蛋白， 尽管总体折叠与最小功能抗体片段、 在骆驼和骆马 IgG 中包含完 整抗原识别单位的重链可变区十分相近。因为该结构， 非免疫球蛋白抗体模拟与自然界中 相似的抗原结合性质以及与抗体的那些亲和力相似的亲和力。 这些支架可用于体外环随机 化和改组策略， 其与体内抗体的亲和力成熟过程相似。这些基于纤连蛋白的分子可用作支 架， 其中使用标准克隆技术用本发明的 CDRs 替换所述分子的环区。
     锚蛋白技术基于使用具有锚蛋白来源的重复模块的蛋白质作为携带可变区的支 架， 所述可变区可用于结合不同靶标。所述锚蛋白重复模块是由两个反向平行的 α 螺旋和 β 转角组成的 33 个氨基酸的多肽。通过使用核糖体展示对可变区的结合进行最大优化。
     Avimers 来自含有如 LRP-1 蛋白质的天然 A 结构域。这些结构域天然地用于蛋白 质 - 蛋白质相互作用， 并且在人中超过 250 个蛋白质在结构上基于 A 结构域。Avimers 由通 过氨基酸接头连接的大量不同的 “A 结构域” 单体 (2-10) 组成。可使用例如美国专利申请 公开号 20040175756 ； 20050053973 ； 20050048512 和 20060008844 中描述的方法产生可以 结合靶抗原的 Avimers。
     Affibody 亲和配体是由基于 A 蛋白一个 IgG 结合域的支架的三螺旋束组成的小的 简单蛋白质。A 蛋白是来自细菌金黄色葡萄球菌 (Staphylococcus aureus) 的表面蛋白。 该支架结构域由 58 个氨基酸组成， 其中 13 个随机化以产生具有大量配体变体的 affibody 文库 ( 参阅例如， US5,831,012)。Affibody 分子模拟抗体， 它们与 150kDa 的抗体分子量相 比具有 6kDa 的分子量。尽管其具有小的尺寸， 但 affibody 分子的结合位点与抗体的结合 位点类似。
     Anticalins 是 Pieris ProteoLab AG 公司开发的产品。 它们衍生自脂笼蛋白， 其为 一大类小且坚固的蛋白质， 一般参与生理运输或储藏化学敏感的或不溶解的化合物。若干 天然脂笼蛋白在人组织或体液中产生。蛋白质结构表明为免疫球蛋白， 在刚性构架上面具 有高变环。然而， 与抗体或它们的重组片段相比， 脂笼蛋白由具有 160 到 180 个氨基酸残基的单条多肽链组成， 仅比单个免疫球蛋白结构域稍大。构成结合口袋的四环组显示明显的 结构可塑性并耐受多种侧链。因此结合位点在专有方法中可重塑， 以识别具有高亲和力和 特异性的不同形状的规定靶分子。 脂笼蛋白家族的一个蛋白质——Pieris Brassicae 的后 胆色素结合蛋白 (BBP) 已经用于通过诱变处理四环组来开发 anticalins。 描述 anticalins 的专利申请的一个实例在 PCT 公开号 WO 199916873 中。
     Affilin 分子是设计用来针对蛋白质和小分子具有特异亲和力的小的非免疫球蛋 白蛋白质。可从两个文库中非常快速地选择新的 affilin 分子， 每一所述文库基于来自不 同人的支架蛋白。 Affilin 分子与免疫球蛋白蛋白质不显示任何结构同源性。 目前， 使用两 个 affilin 支架， 其中一个是 γ 晶体蛋白——人结构晶状体蛋白质， 另一个是 “泛素” 超家 族蛋白质。两个人支架均非常小， 显示高的温度稳定性， 并对 pH 改变和变性剂几乎是有抵 抗力的。该高稳定性主要是因为蛋白质扩展的 β 折叠结构。γ 晶体蛋白来源的蛋白质的 实例描述于 WO200104144 中， 并且 “泛素样” 蛋白质的实例描述于 WO2004106368 中。
     蛋白质表位模拟 (PEM) 是模拟蛋白质 β 发夹二级结构的中等大小、 环形的、 肽样 分子 (MW 1-2kDa)， 所述主要二级结构参与蛋白质 - 蛋白质相互作用。
     人抗体或人源化抗体
     本发明提供特异性结合 C3b 蛋白质 ( 例如， 人和 / 或猕猴 C3b) 的完全人抗体。与 嵌合或人源化抗体相比， 当对人受试者施用时， 本发明的人 C3b 结合抗体具有进一步降低 的抗原性。
     可使用本领域已知的方法产生人 C3b 结合抗体。例如， 人类工程技术用于将非人 抗体转变成改造的人抗体。美国专利公开号 20050008625 描述了用抗体中人可变区替换非 人抗体可变区的体内方法， 同时维持相同或提供比非人抗体的结合性质更好的结合性质。 所述方法依赖于完全人抗体对非人参考抗体可变区的表位引导的替换。 所得人抗体一般在 结构上与参考非人抗体不相关， 但与所述参考抗体结合相同抗原上的相同表位。 简言之， 在 响应测试抗体结合抗原的报告系统存在下， 通过在细胞中 “竞争者” 与参考抗体 (“测试抗 体” ) 多种杂合物的文库之间建立竞争结合有限量的抗原， 使得可以进行连续表位引导的互 补性替换方法。所述竞争者可以是参考抗体或其衍生物， 如单链 Fv 片段。所述竞争者也可 以是天然的或人造的抗原配体， 其与参考抗体结合相同的表位。所述竞争者唯一需要的是 其可以与参考抗体结合相同的表位， 并且其与参考抗体竞争结合抗原。测试抗体具有来自 非人参考抗体的一个共同的抗原结合 V 区， 和从不同来源如人抗体的所有组成成分库中随 机选择的其它 V 区。来自参考抗体的共同 V 区用作引导者， 将所述测试抗体置于抗原上的 相同表位上， 并且在同一方向， 从而选择是偏向于对参考抗体具有最高抗原结合保真度。
     许多类型的报告系统可用于检测测试抗体与抗原之间期望的相互作用。例如， 互 补报告子片段可分别连接抗原和测试抗体， 使得仅当测试抗体结合抗原时发生片段互补的 报告子激活。当测试抗体和抗原报告片段融合物与竞争者共表达时， 报告子激活变得依赖 于所述测试抗体与竞争者竞争的能力， 其与该测试抗体对抗原的亲和力成比例。可使用的 其它报告系统包括如美国专利申请系列号 10/208,730( 公开号 20030198971) 中公布的自 抑制的报告子再激活系统 (RAIR) 的再激活子， 或在美国专利申请系列 10/076,845( 公开号 20030157579) 中公开的竞争激活系统。
     利用连续表位引导的互补替换系统， 进行选择以鉴定表达单个测试抗体与竞争者、 抗原和报告子组分的细胞。 在这些细胞中， 每一测试抗体一对一地与竞争者竞争结合有 限量的抗原。报告子的活性与结合测试抗体的抗原的量成比例， 其又与测试抗体对抗原的 亲和力和测试抗体的稳定性成比例。当表达为测试抗体时， 开始在其相对于参考抗体的活 性基础上选择测试抗体。第一轮选择的结果是一组 “杂合” 抗体， 其中每一抗体包含来自参 考抗体的相同非人 V 区和来自文库的人 V 区， 并且每一抗体与参考抗体结合抗原上的相同 表位。在第一轮中选择的一个或更多杂合抗体对抗原的亲和力与参考抗体相当或更高。
     在第二个 V 区替换步骤中， 使用在第一步骤中选择的人 V 区作为选择同族人 V 区 的多样文库替换剩余非人参考抗体 V 区的指导。第一轮中选择的杂合抗体也可用作第二轮 选择的竞争者。 第二轮选择的结果是一组完全人抗体， 其在结构上不同于参考抗体， 但与参 考抗体竞争结合相同的抗原。一些所选人抗体与参考抗体结合相同抗原上的相同表位。在 这些所选人抗体中， 一个或更多抗体以与参考抗体相当或比其高的亲和力结合相同表位。
     使用上文描述的一种小鼠或嵌合 C3b 结合抗体作为参考抗体， 可容易地使用该方 法来产生以相同结合特异性及相同或更高结合亲和力结合人 C3b 的人抗体。此外， 也可从 通常生产人抗体的公司， 例如 KaloBios， Inc.(Mountain View， CA) 通过商业途径获得此类 人 C3b 结合抗体。
     骆驼 (camelid) 抗体
     从骆驼和单峰骆驼 (Camelus bactrianus 和 Calelus dromaderius) 家族的成员， 包括新世界成员如骆马物种 (Lama paccos、 Lama glama 和 Lamavicugna) 中获得的抗体蛋 白质已经在大小、 结构复杂性和对人受试者的抗原性方面进行了表征。自然界中发现的来 自该哺乳动物家族的某些 IgG 抗体缺少轻链， 并因此在结构上不同于来自其它动物的抗体 的两条重链和两条轻链的典型四链四级结构。参阅 PCT/EP93/02214(1994 年 3 月 3 日公开 的 WO 94/04678)。
     可通过遗传改造获得鉴定为 VHH 的小的单个可变结构域的骆驼抗体的区域， 以产 生对靶标具有高亲和力的小蛋白质， 得到低分子量的抗体来源蛋白质， 称为 “骆驼纳米抗 体” 。参阅 1998 年 6 月 2 日提交的美国专利号 5,759,808 ； 还参阅 Stijlemans， B. 等， 2004J Biol Chem 279 ： 1256-1261 ； Dumoulin， M. 等， 2003 Nature 424 ： 783-788 ； Pleschberger， M. 等 2003Bioconjugate Chem 14 ： 440-448 ； Cortez-Retamozo， V. 等 2002 Int JCancer 89 ： 456-62 ； 和 Lauwereys， M. 等 1998 EMBO J 17 ： 3512-3520。 例 如 从 Ablynx， Ghent， Belgium 通过商业途径获得骆驼抗体和抗体片段的改造库。 如同非人来源的其它抗体一样， 可重组改变骆驼抗体的氨基酸序列， 来获得与人序列更像的序列， 即纳米抗体可以进行 “人 源化” 。因此， 骆驼抗体对人的天然低抗原性可进一步降低。
     骆驼纳米抗体的分子量是人 IgG 分子的大概十分之一， 并且所述蛋白质物理直径 仅几纳米。 小尺寸的一种结果是骆驼纳米抗体能够结合更大抗体蛋白质在功能上看不见的 抗原位点， 即骆驼纳米抗体可用作使用经典免疫技术检测不到的抗原的试剂， 并可能用作 治疗剂。因此， 小尺寸的另一结果是骆驼纳米抗体因此可抑制靶蛋白质的沟或窄缝中特异 位点的结合， 并因而可具有这样的能力， 其比典型抗体更像典型的低分子量药物的功能。
     低分子量和紧密尺寸还导致骆驼纳米抗体极其热稳定， 对极端 pH 和蛋白酶解消 化稳定， 并且抗原性弱。 另一结果是骆驼纳米抗体容易从循环系统转移到组织， 甚至穿过血 脑屏障， 可治疗影响神经组织的病症。纳米抗体可进一步利于药物运输穿过血脑屏障。参阅 2004 年 8 月 19 日公开的美国专利申请 20040161738。这些特征与对人的低抗原性结合 表明巨大的治疗潜能。另外， 这些分子可在原核细胞， 如大肠杆菌 (E.coli) 中完全表达， 并 用噬菌体表达为融合蛋白， 且是有功能的。
     因此， 本发明的特征是对 C3b 具有高亲和力的骆驼抗体或纳米抗体。在此处的某 些实施方案中， 所述骆驼抗体或纳米抗体在骆驼动物中天然产生， 即， 使用此处为其它抗体 描述的技术， 用 C3b 或其肽片段免疫骆驼来产生。或者， 改造， 即如此处实施例中所述使用 C3b 作为靶标的淘选方法， 通过例如从展示适当诱导的骆驼纳米抗体蛋白质的噬菌体文库 中选择产生 C3b 结合的骆驼纳米抗体。可通过遗传改造进一步定制改造的纳米抗体， 以在 受体受试者中具有从 45 分钟到两周的半衰期。在特定实施方案中， 如 PCT/EP93/02214 所 述， 通过将本发明人抗体的重链或轻链的 CDRs 序列移植到纳米抗体或单结构域抗体构架 序列中来获得骆驼抗体或纳米抗体。
     双特异性分子和多价抗体
     另一方面， 本发明描述了包含本发明 C3b 结合抗体或其片段的双特异性或多特异 性分子。本发明的抗体或其抗原结合片段可衍生或连接另一功能分子， 例如另一肽或蛋白 质 ( 例如， 另一抗体或受体的配体 )， 来产生结合至少两种不同结合位点或靶分子的双特异 性分子。本发明的抗体可实际上衍生或连接超过一种其它功能分子， 以产生结合多于两种 不同结合位点和 / 或靶分子的多特异性分子 ； 此处所用的术语 “双特异性分子” 也旨在包括 此类多特异性分子。为了产生本发明的双特异性分子， 本发明的抗体可在功能上连接 ( 例 如， 通过化学偶联、 遗传融合、 非共价结合或其它 ) 一个或更多其它结合分子， 如另一抗体、 抗体片段、 肽或结合模拟物， 以便产生双特异性分子。
     因此， 本发明包括双特异性分子， 其包含对 C3b 的至少第一种结合特异性， 和对第 二个靶表位的第二种结合特异性。例如， 所述第二个靶表位是 C3b 的不同于第一个靶表位 的另一表位。
     此外， 对于其中双特异性分子是多特异性的发明， 除了第一个和第二个靶表位之 外， 所述分子可以还包括第三种结合特异性。
     在一个实施方案中， 本发明的双特异性分子包含作为结合特异性的至少一种抗 体， 或其抗体片段， 包括例如， Fab、 Fab′、 F(ab′ )2、 Fv 或单链 Fv。所述抗体还可以是轻链 或重链二聚体， 或其任何最小片段， 如 Ladner 等美国专利号 4,946,778 中描述的 Fv 或单链 构建体。
     双抗体是二价的双特异性分子， 其中 VH 和 VL 结构域在单条多肽链上表达， 通 过太短以至于不能在同一条链上两个结构域之间配对的接头连接。所述 VH 和 VL 结构 域与另一条链的互补结构域配对， 由此产生两个抗原结合位点 ( 参阅例如， Holliger 等， 1993Proc.Natl.Acad.Sci.USA90 ： 6444-6448 ； Poljak 等， 1994 Structure 2 ： 1121-1123)。 可 通 过 在 同 一 细 胞 中 表 达 具 有 结 构 VHA-VLB 和 VHB-VLA(VH-VL 构 型 )， 或 VLA-VHB 和 VLB-VHA(VL-VH 构型 ) 的两条多肽链来产生双抗体。大多数的双抗体在细菌中以可溶形 式表达。通过连接两条双抗体形成多肽链与大约 15 个氨基酸残基的接头产生单链双抗体 (scDb)( 参 阅 Holliger 和 Winter， 1997 CancerImmunol.Immunother.， 45(3-4) ： 128-30 ； Wu 等， 1996 Immunotechnology， 2(1) ： 21-36)。scDb 在细菌中以可溶的活性单体形式表达 ( 参 阅 Holliger 和 Winter， 1997 Cancer Immunol.Immunother.， 45(34) ： 128-30 ； Wu 等，1996Immunotechnology， 2(1) ： 21-36 ； Pluckthun 和 Pack， 1997Immunotechnology， 3(2) ： 83-105 ； Ridgway 等， 1996 Protein Eng.， 9(7) ： 617-21)。双抗体可融合到 Fc 上， 以产生 “二 - 双抗体” ( 参阅 Lu 等， 2004J.Biol.Chem.， 279(4) ： 2856-65)。
     可用于本发明的双特异性分子中的其它抗体是鼠类、 嵌合和人源化单克隆抗体。
     可使用本领域已知的方法， 通过缀合成分结合特异性来制备本发明的双特异性分 子。例如， 可单独产生双特异性分子的每一结合特异性， 然后相互缀合。当结合特异性是 蛋白质或肽时， 多种偶联或交联剂可用于共价缀合。交联剂的实例包括 A 蛋白、 碳二亚胺、 N- 琥珀酰亚胺基 -S- 乙酰 - 硫代乙酸酯 (SATA)、 5， 5′ - 二硫代双 (2- 硝基苯甲酸 )(DTNB)、 邻 - 亚苯基二马来酰亚胺 (oPDM)、 N- 琥珀酰亚胺基 -3-(2- 吡啶基二硫代 ) 丙酸酯 (SPDP) 和磺基琥珀酰亚胺基 4-(N- 马来酰亚胺基甲基 ) 环己烷 -l- 羧酸酯 ( 磺基 -SMCC)( 参阅例 如， Karpovsky 等， 1984 J.Exp.Med.160 ： 1686 ； Liu， MA 等， 1985 Proc.Natl.Acad.Sci.USA 82 ： 8648)。其它方法包括在 Paulus， 1985Behring Ins.Mitt.No.78， 118-132 ； Brennan 等， 1985 Science 229 ： 81-83 和 Glennie 等， 1987 J.Immunol.139 ： 2367-2375 中描述的那些。 缀合剂是 SATA 和磺基 -SMCC， 两者均可从 Pierce Chemical Co.(Rockford， IL) 获得。
     当结合特异性是抗体时， 它们可通过两条重链的 C 末端铰链区的巯基成键而缀 合。在特定实施方案中， 在缀合之前修饰铰链区以含有奇数个巯基残基， 例如 1 个。
     或者， 两种结合特异性可在相同载体中编码， 并在相同宿主细胞中表达并装配。 其 中双特异性分子是 mAb x mAb、 mAb x Fab、 Fab x F(ab′ )2 或配体 x Fab 融合蛋白质时， 该 方法是特别有用的。本发明的双特异性分子可以单链分子， 其包含一个单链抗体和结合决 定簇， 或包含两个结合决定簇的单链双特异性分子。双特异性分子可包含至少两个单链分 子。 例如在美国专利号 5,260,203 ； 美国专利号 5,455,030 ； 美国专利号 4,881,175 ； 美国专 利号 5,132,405 ； 美国专利号 5,091,513 ； 美国专利号 5,476,786 ； 美国专利号 5,013,653 ； 美国专利号 5,258,498 ； 和美国专利号 5,482,858 中描述了用于制备双特异性分子的方法。
     例如， 通过酶联免疫吸附测定 (ELISA)、 放射免疫测定 (REA)、 FACS 分析、 生物测定 ( 例如生长抑制 )、 或 Western 印迹测定来验证双特异性分子与其特异性靶标的结合。这些 测定法中的每一种一般通过使用对目的复合体特异的标记试剂 ( 例如抗体 ) 检测特别重要 的蛋白质 - 抗体复合物的存在。
     另一方面， 本发明提供多价化合物， 其包含结合 C3b 的本发明抗体的至少两个相 同或不同的抗原结合部分。 所述抗原结合部分可通过蛋白质融合或共价或非共价键而连接 在一起。或者， 已经为双特异性分子描述了连接方法。例如通过交联本发明的抗体与结合 本发明抗体的恒定区， 例如 Fc 或铰链区获得四价化合物。
     例 如 在 Borean 专 利 EP 1 012 280B1 中 描 述 了 三 聚 化 结 构 域。 例 如 在 PCT/ EP97/05897 中描述了五聚化模块。
     具有延长半衰期的抗体
     本发明提供特异性结合 C3b 蛋白质的在体内具有延长半衰期的抗体。
     许多因素可影响蛋白质在体内的半衰期。例如， 肾过滤、 肝中的新陈代谢、 蛋白酶 解酶 ( 蛋白酶 ) 的降解和免疫原性应答 ( 例如， 抗体的蛋白质中和及巨噬细胞和树突状 细胞的吸收 )。多种策略可用于延长本发明抗体的半衰期。例如， 通过化学连接聚乙二醇 (PEG)、 reCODE PEG、 抗体支架、 聚唾液酸 (PSA)、 羟乙基淀粉 (HES)、 白蛋白结合配体、 和糖类保护层 ； 通过遗传融合到结合血清蛋白质的蛋白质， 如白蛋白、 IgG、 FcRn， 和转移 ； 通过偶 联 ( 遗传上或化学上 ) 到其它结合部分， 所述结合部分结合血清蛋白质， 如纳米抗体、 Fabs、 DARPins、 avimers、 affibodies 和 anticalins ； 通过遗传融合 rPEG、 白蛋白、 白蛋白的结构 域、 白蛋白结合蛋白质和 Fc ； 或通过掺入到 nancarriers 中， 减缓释放制剂和医疗设备。
     为了延长抗体在体内的血清循环， 可使用或不使用多功能接头通过 PEG 位点特异 性缀合到抗体 N 或 C 末端或通过赖氨酸残基上存在的 ε 氨基将惰性聚合分子如高分子量 PEG 附着到抗体或其片段上。为了聚乙二醇化抗体， 抗体或其片段通常与聚乙二醇 (PEG)， 如 PEG 的活性酯或醛衍生物在其中一个或更多 PEG 基团变得附着到抗体或其片段的条件下 进行反应。可利用活性 PEG 分子 ( 或类似活性水溶性聚合物 ) 通过酰化反应或烷化反应进 行聚乙二醇化。如此处所用， 术语 “聚乙二醇” 旨在包括任何的 PEG 形式， 其已经用于衍生 其它蛋白质， 如单 (C1-C10) 烷氧基或芳氧基 - 聚乙二醇或聚乙二醇 - 马来酰亚胺。在某些 实施方案中， 待聚乙二醇化的抗体是无糖基化抗体。使用导致生物活性损失最小的线性或 分支聚合物衍生化。可通过 SDS-PAGE 和质谱密切监测缀合的程度， 来保证 PEG 分子与抗体 的正确缀合。可通过大小排排阻或通过离子交换层析从抗体 -PEG 缀合物中分离未反应的 PEG。可使用本领域技术人员熟知的方法， 例如通过此处描述的免疫测定法测试 PEG 衍生抗 体的结合活性以及体内功效。聚乙二醇化蛋白质的方法为本领域所知， 并可应用到本发明 的抗体中。参阅例如， Nishimura 等的 EP 0 154 316 和 Ishikawa 等的 EP 0 401 384。
     其它修改的聚乙二醇化技术包括重建化学正交指导的改造技术 (ReCODE PEG)， 其 将化学上特定的侧链通过包括 tRNA 合成酶和 tRNA 的重建系统掺入到生物合成蛋白质中。 该技术能够在大肠杆菌、 酵母和哺乳动物细胞中将多于 30 个新氨基酸掺入到生物合成蛋 白质中。所述 tRNA 将非天然氨基酸掺入到琥珀密码子定位的任何位置， 使琥珀密码子从终 止密码子转化成信令化学上特定的氨基酸掺入的一个密码子。
     重组聚乙二醇化技术 (rPEG) 也可用于血清半衰期延长。该技术包括将 300-600 个氨基酸未组织的蛋白质尾巴融合到现有的药物蛋白质上。 因为该未组织蛋白质链的表观 分子量比其实际分子量大约 15 倍， 所以极大延长了该蛋白质的血清半衰期。与需要化学缀 合和再纯化的常规聚乙二醇化相反， 该制备方法极其简化并且产品是同质的。
     多唾液酸化是另一种技术， 其使用天然聚合物聚唾液酸 (PSA) 来延长活性生命并 提高治疗肽和蛋白质的稳定性。PSA 是唾液酸的聚合物 ( 糖 )。当用于蛋白质和治疗肽药 物递送时， 聚唾液酸在缀合上提供保护性微环境。这增加了治疗蛋白质在循环中的活性生 命并防止其被免疫系统识别。 PSA 聚合物天然见于人体中。 其被某些细菌采用， 所述细菌进 化了超过数百万年， 用所述 PSA 聚合物包被自身的壁。通过分子拟态， 这些天然多唾液酸化 细菌然后能够挫败身体的防御系统。 PSA 是自然界的最终偷窃技术， 可容易地自此类细菌大 量产生并具有预定的物理特点。甚至当与蛋白质偶联时， 细菌 PSA 也是完全非免疫原性的， 因为它与人体中的 PSA 在化学上相同。
     另一技术包括使用连接抗体的羟乙基淀粉 (“HES” ) 衍生物。HES 是来自蜡状玉 米淀粉的修饰的天然聚合物， 并可通过身体的酶进行新陈代谢。一般施用 HES 溶液来替换 不足的血液体积并改善血液的流变学性质。 抗体的羟乙基化使得能够通过提高分子的稳定 性， 以及降低肾清除率来延长循环半衰期， 产生提高的生物学活性。通过改变不同的参数， 如 HES 的分子量， 可定制广泛的 HES 抗体缀合物。也可通过向 IgG 恒定结构域或其 FcRn 结合片段 ( 优选 Fc 或铰链 Fc 结构域片 段 ) 中引入一个或更多氨基酸修饰 ( 即， 替换、 插入或缺失 ) 产生在体内具有增加的半衰 期的抗体。参阅例如， 国际公开号 WO 98/23289 ； 国际公开号 WO 97/34631 ； 和美国专利号 6,277,375。
     另外， 抗体可缀合到白蛋白 ( 例如， 人血清白蛋白 ； HSA) 上， 以使抗体或抗体片段 在体内更稳定或在体内具有更长的半衰期。技术为本领域所熟知， 参阅例如国际公开号 WO 93/15199、 WO 93/15200 和 WO 01/77137 ； 和欧洲专利号 EP 413,622。此外， 在上文描述的 双特异性抗体的背景中， 可设计抗体的特异性， 以便抗体的一个结合域结合 C3b， 而抗体的 第二个结合域结合血清白蛋白， 优选 HSA。
     提高半衰期的策略特别用于纳米抗体、 基于纤连蛋白的结合子， 和期望提高体内 半衰期的其它抗体或蛋白质。
     抗体缀合物
     本发明提供特异性结合 C3b 蛋白质的抗体或其片段， 其重组融合或化学缀合 ( 包 括共价和非共价缀合 ) 到异源蛋白质或多肽 ( 或其片段， 优选至少 10、 至少 20、 至少 30、 至少 40、 至少 50、 至少 60、 至少 70、 至少 80、 至少 90 或至少 100 个氨基酸的多肽 )， 以产 生融合蛋白质。具体而言， 本发明提供包含此处所述抗体的抗原结合片段 ( 例如， Fab 片 段、 Fd 片段、 Fv 片段、 F(ab)2 片段、 VH 结构域、 VH CDR、 VL 结构域或 VL CDR) 和异源蛋白 质、 多肽或肽的融合蛋白质。用于融合或缀合蛋白质、 多肽或肽到抗体或抗体片段上的方 法为本领域所知。参阅例如美国专利号 5,336,603、 5,622,929、 5,359,046、 5,349,053、 5,447,851 和 5,112,946 ； 欧洲专利号 EP 307,434 和 EP 367,166 ； 国际公开号 WO 96/04388 和 WO91/06570 ； Ashkenazi 等， 1991， Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88 ： 10535-10539 ； Zheng 等， 1995， J.Immunol.154 ： 5590-5600 ； 和 Vil 等， 1992， Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89 ： 11337-11341。
     可通过基因改组、 基序改组、 外显子改组和 / 或密码子改组 ( 共同称为 “DNA 改 组” ) 的技术产生额外的融合蛋白质。可使用 DNA 改组来改变本发明抗体或其片段的 活性 ( 例如， 具有更高亲和力和更低解离速率的抗体或其片段 )。一般参阅美国专利 号 5,605,793、 5,811,238、 5,830,721、 5,834,252 和 5,837,458 ； Patten 等， 1997， Curr. Opinion Biotechnol.8 ： 724-33 ； Harayama， 1998， Trends Biotechnol.16(2) ： 76-82 ； Hansson 等， 1999， J.Mol.Biol.287 ： 265-76 ； 以及 Lorenzo 和 Blasco， 1998， Biotechniques 24(2) ： 308-313( 这些专利和出版物每一文件以其整体引入作为参考 )。 可在重组之前通过 易错 PCR、 随机核苷酸插入或其它方法进行随机诱变来改变抗体或其片段， 或编码的抗体或 其片段。编码特异性结合 C3b 蛋白质的抗体或其片段的多核苷酸可与一种或更多异源分子 的一个或更多组分、 基序、 断片、 部分、 结构域、 片段等重组。
     此外， 抗体或其片段可融合到标记序列上， 如肽， 以利于纯化。在优选的实施 方案中， 标记氨基酸序列是六组氨酸肽， 如 pQE 载体 (QIAGEN， Inc.， 9259 Eton Avenue， Chatsworth， CA， 91311) 中提供的标签， 其中许多可以通过商业途径获得。如 Gentz 等， 1989， Proc.Natl.Acad.Sci.USA86 ： 821-824 中所述， 六组氨酸提供融合蛋白质的便利纯 化。可用于纯化的其它肽标签包括， 但不限于血凝素 ( “HA” ) 标签， 其对应于来自流行性感 冒血凝素蛋白质的表位 (Wilson 等， 1984， Cell 37 ： 767) 和 “flag” 标签。在其它实施方案中， 本发明的抗体或其片段缀合诊断或检测试剂。此类抗体可用 于监测或预后疾病或病症的开始、 发展、 进行和 / 或严重性， 作为临床试验程序的一部分， 如测定特定治疗的功效。可通过将抗体与可检测物质偶联完成此类诊断和检测， 所述可检 测物质包括但不限于多种酶， 如但不限于， 辣根过氧化物酶、 碱性磷酸酶、 β- 半乳糖苷酶、 或乙酰胆碱酯酶 ； 辅基， 如但不限于链霉抗生物素蛋白生物素和抗生物素蛋白 / 生物素 ； 荧 光物质， 如但不限于伞形酮、 荧光素、 异硫氰酸荧光素、 罗丹明、 二氯三嗪基胺荧光素、 丹磺 酰氯或藻红蛋白 ； 发光物质， 如但不限于鲁米诺 ； 生物发光物质， 如但不限于荧光素酶、 荧 光素和水母发光蛋白 ； 放射性物质， 如但不限于碘 (131I、 125I、 123I 和 121I)、 碳 (14C)、 硫 (35S)、 氚 (3H)、 铟 (115In、 113In、 112In 和 111In)、 锝 (99Tc)、 铊 (201Ti)、 镓 (68Ga、 67Ga)、 钯 (103Pd)、钼 (99Mo)、氙 (133Xe)、氟 (18F)、 153Sm、 177Lu、 159Gd、 149Pm、 140La、 175Yb、 166Ho、 90Y、 47Sc、 186Re、 188Re、 142Pr、 105Rh、 97Ru、 68Ge、 57Co、 65Zn、 85Sr、 32P、 153Gd、 169Yb、 51Cr、 54Mn、 75Se、 113Sn 和 117Tin ； 和使用多种正电子发射断层术的正电子发射金 属， 和非放射性顺磁金属离子。
     本发明还包括缀合治疗部分的抗体或其片段的用途。 抗体或其片段可缀合到治疗 部分， 如细胞毒素， 例如细胞生长抑制剂或细胞自杀剂， 治疗剂或放射性金属离子， 例如 α 粒子发射体。细胞毒素或细胞毒性剂包括对细胞有害的任何试剂。
     另外， 抗体或其片段可缀合到修饰给定生物反应的治疗部分或药物部分。治疗部 分或药物部分不解释为限制为典型的化学治疗剂。例如， 药物部分可以是具有想要的生物 学活性的蛋白质、 肽或多肽。此类蛋白质可包括例如， 毒素如相思豆毒蛋白、 蓖麻毒蛋白 A、 假单胞菌外毒素、 霍乱毒素或白喉毒素 ； 蛋白质如肿瘤坏死因子、 α 干扰素、 β 干扰素、 神 经生长因子、 血小板衍生生长因子、 组织纤溶酶原激活物、 细胞凋亡剂、 抗血管生成剂 ； 或生 物反应修饰因子， 例如淋巴因子。
     此外， 抗体可缀合到治疗部分， 如放射性金属离子， 如 α 粒子发射体， 如用于将放 射性金属离子 ( 包括但不限于 131In、 131LU、 131Y、 131Ho、 131Sm) 缀合到多肽上的 213Bi 或大环螯合剂。在某些实施方案中， 所述大环螯合剂是 1， 4， 7， 10- 四氮杂环十二烷 -N， N’ ， N” ， N’ ” - 四乙酸 (DOTA)， 其可通过接头分子附着到抗体上。此类接头分子为本领域所 熟知， 并描述于 Denardo 等， 1998， Clin Cancer Res.4(10) ： 2483-90 ； Peterson 等， 1999， Bioconjug.Chem.10(4) ： 553-7 ； 和 Zimmerman 等， 1999， Nucl.Med.Biol.26(8) ： 943-50， 每 一参考文献以其整体引入作为参考。
     用 于 将 治 疗 部 分 缀 合 到 抗 体 上 的 技 术 是 众 所 周 知 的， 参 阅 例 如 Arnon 等， “Monoclonal Antibodies For Immunotargeting Of Drugs In CancerTherapy” ， Monoclonal Antibodies And Cancer Therapy， Reisfeld 等 ( 编辑 )， 第 243-56 页 (Alan R.Liss， Inc.1985) ； Hellstrom 等， “Antibodies For DrugDelivery” ， Controlled Drug Delivery( 第 2 版 Robinson 等 ( 编 辑 )，第 623-53 页 (Marcel Dekker， Inc.1987) ； Thorpe， “Antibody Carriers Of CytotoxicAgents In Cancer Therapy ： A Review” ， Monoclonal Antibodies 84 ： Biological And Clinical Applications ， Pinchera 等 ( 编 辑 )， 第 475-506 页 (1985) ； “Analysis， Results， And Future Prospective Of The TherapeuticUse Of Radiolabeled Antibody In Cancer Therapy” ， MonoclonalAntibodies For Cancer Detection And Therapy， Baldwin 等 ( 编 辑 )， 第303-16 页 (Academic Press 1985)， 和 Thorpe 等， 1982， Immunol.Rev.62 ： 119-58。
     抗体也可附着到固相支持体上， 所述固相支持体特别用于靶抗原的免疫测定或纯 化。 此类固相支持体包括， 但不限于玻璃、 纤维素、 聚丙烯酰胺、 尼龙、 聚苯乙烯、 聚氯乙烯或 聚丙烯。
     产生本发明抗体的方法
     编码抗体的核酸
     本发明提供基本纯化的核酸分子， 其编码包含上文描述的 C3b 结合抗体链的区段 或结构域的多肽。 本发明的一些核酸包含编码示于 SEQ ID NO ： 7、 21、 35、 49、 63、 77、 91、 105、 119、 133、 147、 161、 175 和 189 的重链可变区的核苷酸序列， 和 / 或编码示于 SEQ ID NO ： 8、 22、 36、 50、 64、 78、 92、 106、 120、 134、 148、 162、 176 的轻链可变区的核苷酸序列。在特定实施 方案中， 核酸分子是在表 1 中鉴定的那些核酸分子。 本发明的一些其它核酸分子包含与表 1 中鉴定的那些核酸分子的核苷酸序列基本相同 ( 例如至少 65、 80％、 95％或 99％ ) 的核苷 酸序列。当从适当表达载体进行表达时， 这些多核苷酸编码的多肽能够显示 C3b 抗原结合 能力。
     本发明还提供的是编码来自上文阐明的 C3b 结合抗体的重链和轻链的至少一个 CDR 区以及一般地所有三个 CDR 区的多核苷酸。一些其它多核苷酸编码上文阐明的 C3b 结 合抗体的重链和 / 或轻链的所有或基本上所有可变区序列。因为密码子的简并性， 多种核 酸序列编码每一种免疫球蛋白氨基酸序列。
     本发明的核酸分子可编码抗体的可变区和恒定区。 一些本发明的核酸序列包含编 码成熟重链序列的核苷酸， 所述成熟重链序列与在 SEQ IDNOs ： 9、 23、 37、 51、 65、 79、 93、 107、 121、 135、 149、 163、 177 和 191 中阐明的成熟重链序列基本相同 ( 例如， 至少 80 ％、 90 ％或 99％ )。一些其它核酸序列包含编码成熟轻链序列的核苷酸， 所述成熟轻链序列与在 SEQID NOs ： 10、 24、 38、 52、 66、 80、 94、 108、 122、 136、 150、 164、 178 和 192 中阐明的成熟轻链序列基 本相同 ( 例如， 至少 80％、 90％或 99％ )。
     可通过从头固相 DNA 合成或通过 PCR 诱变编码 C3b 结合抗体或其结合片段的现有 序列 ( 例如下文实施例中描述的序列 ) 来产生多核苷酸序列。可通过本领域已知的方法， 如 Narang 等， 1979， Meth.Enzymol.68 ∶ 90 的磷酸三酯法 ； Brown 等， Meth.Enzymol.68 ： 109， 1979 的磷酸二酯法 ； Beaucage 等， Tetra.Lett.， 22 ： 1859， 1981 的二乙基亚磷酰胺法 ； 和美国专利号 4,458,066 的固相支持物法完成核酸的直接化学合成。如 PCR Technology ： Principles and Applications for DNA Amplification， H.A.Erlich( 编辑 )， Freeman Press， NY， NY， 1992 ； PCR Protocols ： A Guide to Methods andApplications， Innis 等 ( 编 辑 )， Academic Press， San Diego， CA， 1990 ； Mattila 等， Nucleic Acids Res.19 ： 967， 1991 ； 和 Eckert 等， PCR Methodsand Applications 1 ： 17， 1991 中描述的进行通过 PCR 向多核苷 酸序列中引入突变。
     本发明还提供用于产生上文所述 C3b 结合抗体的表达载体和宿主细胞。可使用 多种表达载体来表达编码 C3b 结合抗体链或结合片段的多核苷酸。基于病毒的表达载体 和非病毒表达载体均可用于在哺乳动物宿主细胞中产生抗体。非病毒载体和系统包括质 粒、 游离型载体， 通常具有用于表达蛋白质或 RNA 的表达盒， 和人工染色体 ( 参阅例如， Harrington 等， NatGenet 15 ： 345， 1997)。例如， 用于在哺乳动物 ( 例如人 ) 细胞中表达C3b 结合多核苷酸和多肽的非病毒载体包括 pThioHis A、 B&C、 pcDNA3.1/His、 pEBVHis A、 B&C(Invitrogen， San Diego， CA)、 MPSV 载体， 和本领域中已知用于表达其它蛋白质的许多 其它载体。 有用的病毒载体包括基于逆转录病毒、 腺病毒、 腺伴随病毒、 疱疹病毒的载体、 基 于 SV40、 乳头瘤病毒、 HBP EB 病毒、 痘苗病毒载体和 Semliki Forest 病毒 (SFV) 的载体。 参 阅， Brent 等， 上文 ； Smith， Annu.Rev.Microbiol.49 ： 807， 1995 ； 和 Rosenfeld 等， Cell 68 ： 143， 1992。
     表达载体的选择依赖于其中待表达所述载体的预期宿主细胞。通常， 所述表达载 体含有有效连接编码 C3b 结合抗体链或片段的多核苷酸的启动子和其它调节序列 ( 例如， 增强子 )。 在一些实施方案中， 使用诱导型启动子来防止插入序列的表达 ( 除了在诱导条件 下之外 )。诱导型启动子包括， 例如阿拉伯糖、 lacZ、 金属硫蛋白启动子或热激启动子。可 在非诱导条件下扩大转化生物的培养， 而不偏向编码序列的群体， 宿主细胞能更好地耐受 所述编码序列的表达产物。除了启动子， 也需要或想要其它调节元件用于 C3b 结合抗体链 或片段的有效表达。这些元件通常包括 ATG 起始密码子和邻近核糖体结合位点或其它序 列。此外， 可通过包括适合于使用中的细胞系统的增强子来增强表达的效率 ( 参阅例如， Scharf 等， Results Probl.Cell Differ.20 ： 125， 1994 ； 和 Bittner 等， Meth.Enzymol.， 153 ： 516， 1987)。例如， SV40 增强子或 CMV 增强子可用于提高哺乳动物宿主细胞中的表达。
     表达载体也可提供分泌信号序列位置， 以与插入的 C3b 结合抗体序列编码的多肽 形成融合蛋白质。更经常地， 所述插入的 C3b 结合抗体序列在包括在载体中之前连接信号 序列。待用于接受编码 C3b 结合的抗体轻链和重链可变结构域的序列的载体有时候也编码 恒定区或其部分。此类载体允许可变区表达为与恒定区的融合蛋白质， 由此导致完整抗体 或其片段的产生。通常， 此类恒定区是人的恒定区。
     用于携带并表达 C3b 结合抗体链的宿主细胞可以是原核细胞或真核细胞。大肠杆 菌是用于克隆并表达本发明多核苷酸的一种原核宿主。 适于使用的其它微生物宿主包括芽 孢杆菌， 如枯草杆菌 (Bacillus subtilis)， 和其它肠杆菌科 (enterobacteriaceae)， 如沙 门氏菌属 (Salmonella)、 沙雷氏菌属 (Serratia) 和多种假单胞菌属 (Pseudomonas) 物种。 在这些原核宿主中， 也可以制备表达载体， 其通常含有与所述宿主细胞相容的表达控制序 列 ( 例如， 复制起点 )。此外， 存在任何数量的多种众所周知的启动子， 如乳糖启动子系统、 色氨酸 (trp) 启动子系统、 β- 内酰胺酶启动子系统， 或来自 λ 噬菌体的启动子系统。所 述启动子通常任选地与操纵子序列控制表达， 并具有核糖体结合位点序列等， 用于起始并 完成转录和翻译。其它微生物， 如酵母也可用于表达本发明的 C3b 结合多肽。也可使用昆 虫细胞与杆状病毒载体组合。
     在一些优选的实施方案中， 哺乳动物宿主细胞用于表达并产生本发明的 C3b 结合 多肽。例如， 它们可以是表达内源免疫球蛋白基因的杂交瘤细胞系 ( 例如， 实施例中描述 的 1D6.C9 骨髓瘤杂交瘤克隆 ) 或携带外源表达载体的哺乳动物细胞系 ( 例如， 下文示例的 SP2/0 骨髓瘤细胞 )。这些包括任何正常致死或正常或非正常永生动物或人细胞。例如， 已 经开发了能够分泌完整免疫球蛋白的大量合适宿主细胞系， 包括 CHO 细胞系、 多种 Cos 细胞 系、 HeLa 细胞、 骨髓瘤细胞系、 转化的 B 细胞和杂交瘤。一般在例如 Winnacker， FROM GENES TO CLONES， VCH Publishers， N.Y.， N.Y.， 1987 中讨论了哺乳动物组织细胞培养物表达多 肽的用途。 用于哺乳动物宿主细胞的表达载体可包括表达控制序列， 如复制起点、 启动子和增强子 ( 参阅例如， Queen 等， Immunol.Rev.89 ： 49-68， 1986)、 和必要的加工信息位点， 如 核糖体结合位点、 RNA 剪接位点、 多腺苷酸化位点和转录终止子序列。这些表达载体一般含 有来自哺乳动物基因或来自哺乳动物病毒的启动子。合适的启动子可以是组成型的、 细胞 类型特异的、 阶段特异的、 和 / 或可调整的或可调节的。有用的启动子包括， 但不限于金属 硫蛋白启动子、 组成型腺病毒主要晚期启动子、 地塞米松诱导型 MMTV 启动子、 SV40 启动子、 MRP polIII 启动子、 组成型 MPSV 启动子、 四环素诱导型 CMV 启动子 ( 如人立即早期 CMV 启 动子 )、 组成型 CMV 启动子和本领域已知的启动子 - 增强子组合。
     用于引入含有目的多核苷酸序列的表达载体的方法根据细胞宿主的类型变化。 例 如， 氯化钙转染通常用于原核细胞， 而磷酸钙处理或电穿孔可用于其它细胞宿主。( 一般参 阅 Sambrook， 等， 上文 )。其它方法包括， 例如电穿孔、 磷酸钙处理、 脂质体介导的转化、 注射 和显微注射、 生物射弹方法、 病毒体、 免疫脂质体、 聚阳离子 ： 核酸缀合物、 裸 DNA、 人工病毒 体、 与疱疹病毒结构蛋白 VP22 的融合物 (Elliot 和 O′ Hare， Cell 88 ： 223， 1997)、 DNA 的 试剂增强的吸收和离体转导。对于重组蛋白质的长期、 高产量生产， 通常想要稳定表达。例 如， 可使用含有病毒复制起点或内源表达元件和选择标记基因的本发明的表达载体制备稳 定表达 C3b 结合抗体链或结合片段的细胞系。引入载体后， 可以允许细胞在富集培养基中 生长 1-2 天后转换到选择性培养基。选择标记的目的是赋予选择抗性， 并且其存在允许成 功表达所引入序列的细胞在选择性培养基中生长。 使用对细胞类型合适的组织培养技术增 殖具有抗性的稳定转染的细胞。
     本发明单克隆抗体的产生
     可 通 过 多 种 技 术， 包 括 常 规 单 克 隆 抗 体 方 法， 例 如 Kohler 和 Milstein， 1975 Nature 256 ： 495 的标准体细胞杂交技术来产生单克隆抗体 (mAbs)。可使用产生单克隆抗 体的许多技术， 例如， 病毒转化或 B 淋巴细胞的致癌性转化。
     用于制备杂交瘤的动物系统是鼠类系统。小鼠中杂交瘤的产生是良好建立的程 序。分离免疫的脾细胞用于融合的免疫方案和技术为本领域所知。融合配偶体 ( 例如鼠类 骨髓瘤细胞 ) 和融合步骤也是已知的。
     可在如上文描述制备的鼠类单克隆抗体的序列基础上制备本发明的嵌合或人源 化抗体。 可使用标准分子生物学技术从目的鼠类杂交瘤中获得编码重链和轻链免疫球蛋白 的 DNA， 并进行改造以含有非鼠类 ( 例如， 人 ) 免疫球蛋白序列。 例如， 为了产生嵌合抗体， 可 使用本领域已知的方法将鼠类可变区连接到人恒定区 ( 参阅例如， Cabilly 等的美国专利 号 4,816,567)。为了产生人源化抗体， 可使用本领域已知的方法将鼠类 CDR 区插入人构架 中。 参阅例如， Winter 的美国专利号 5225539， 和 Queen 等的美国专利号 5530101 ； 5585089 ； 5693762 和 6180370。
     在某一实施方案中， 本发明抗体是人单克隆抗体。可使用携带人免疫系统的部分 而非小鼠系统的转基因或转染色体小鼠产生针对 C3b 的此类人单克隆抗体。这些转基因和 转染色体小鼠包括此处分别称为 HuMAb 小鼠和 KM 小鼠的小鼠， 并在此处统称为 “人 Ig 小 鼠” 。
     HuMAb 小鼠 (Medarex， Inc.) 含有编码未重排人重链 (μ 和 γ) 和 K 轻链免 疫球蛋白序列的人免疫球蛋白基因小基因座 (miniloci)， 以及失活内源 μ 和 K 链基因 座的靶向突变 ( 参阅例如， Lonberg， 等， 1994Nature368(6474) ： 856-859)。因此， 小鼠显示降低表达的小鼠 IgM 或 K， 并且响应免疫时， 引入的人重链和轻链转基因经历类别转 换和体细胞突变， 产生高亲和力人 IgGK 单克隆抗体 (Lonberg， N. 等， 1994 上文 ； 综述见 于 Lonberg， N.， 1994 Handbook of Experimental Pharmacology 113 ： 49-101 ； Lonberg， N. 和 Huszar， D.， 1995 Intern.Rev.Immunol.13 ： 65-93， 以及 Harding， F. 和 Lonberg， N.， 1995 Ann.N.Y.Acad.Sci.764 ： 536-546)。HuMAb 小鼠的制备和用途以及该小鼠携带的基因 组修饰进一步描述于 Taylor， L. 等， 1992Nucleic Acids Research 20 ： 6287-6295 ； Chen， J. 等， 1993 InternationalImmunology 5 ： 647-656 ； Tuaillon 等， 1993Proc.Natl.Acad. Sci.USA94 ： 3720-3724 ； Choi 等， 1993Nature Genetics 4 ： 117-123 ； Chen， J. 等， 1993EMBO J.12 ： 821-830 ； Tuaillon 等， 1994 J.Immunol.152 ： 2912-2920 ； Taylor ， L. 等， 1994 International Immunology 579-591 ； 和 Fishwild， D. 等， 1996 Nature Biotechnology 14 ： 845-851， 所有参考文献的内容以其整体明确引入作为参考。进一步参阅均为 Lonberg 和 Kay 的 美 国 专 利 号 5,545,806 ； 5,569,825 ； 5,625,126 ； 5,633,425 ； 5,789,650 ； 5,877,397 ； 5,661,016 ； 5,814,318 ； 5,874,299 和 5,770,429 Surani 等 的 美 国 专 利 号 5,545,807 ； 均为 Lonberg 和 Kay 的 PCT 公开号 WO 92103918、 WO 93/12227、 WO 94/25585、 WO97113852、 WO 98/24884 和 WO 99/45962 ； 和 Korman 等的 PCT 公开号 WO 01/14424。
     在另一实施方案中， 可使用在转基因和转染色体上携带人免疫球蛋白序列的小 鼠， 如携带人重链转基因和人轻链转染色体的小鼠产生本发明的人抗体。在 Ishida 等的 PCT 公开 WO 02/43478 中详细描述了此处称为 “KM 小鼠” 的这种小鼠。
     进一步， 表达人免疫球蛋白基因的备选转基因动物系统可在本领域中获得， 并可 用于产生本发明的 C3b 结合抗体。例如， 可使用称为 Xenomouse(Abgenix， Inc.) 的备选 转基因系统。在例如 Kucherlapati 等的美国专利号 5,939,598 ； 6,075,181 ； 6,114,598 ； 6,150,584 和 6,162,963 中描述了此类小鼠。
     此外， 表达人免疫球蛋白基因的备选转染色体动物系统可在本领域中获得， 并可 用于产生本发明的 C3b 结合抗体。例如， 可使用称为 “TC 小鼠” 的携带人重链转染色体和人 轻链转染色体的小鼠 ； 在 Tomizuka 等， 2000Proc.Natl.Acad.Sci.USA 97 ： 722-727 中描述 了这种小鼠。另外， 携带人重链和轻链转染色体的奶牛已经描述于本领域中 (Kuroiwa 等， 2002 NatureBiotechnology 20 ： 889-894)， 并可用于产生本发明的 C3b 结合抗体。
     也可使用噬菌体展示方法制备本发明的人单克隆抗体， 用于筛选人免疫球蛋白基 因文库。在本领域中建立或在下文实施例中描述了用于分离人抗体的此类噬菌体展示方 法。 参阅例如 ： Ladner 等的美国专利号 5,223,409 ； 5,403,484 ； 和 5,571,698 ； Dower 等的美 国专利号 5,427,908 和 5,580,717 ； McCafferty 等的美国专利号 5,969,108 和 6,172,197 ； 和 Griffiths 等的美国专利号 5,885,793 ； 6,521,404 ； 6,544,731 ； 6,555,313 ； 6,582,915 和 6,593,081。
     也可使用 SCID 小鼠制备本发明的人单克隆抗体， 在所述 SCID 小鼠中已经重建了 人免疫细胞， 使得在免疫后产生人抗体应答。例如在 Wilson 等的美国专利号 5,476,996 和 5,698,767 中描述了此类小鼠。
     构架或 Fc 改造
     本发明的改造抗体包括其中 VH 和 / 或 VL 内构架残基已经进行了修饰， 例如以改 善抗体性质的那些抗体。通常进行这些构架修饰以降低抗体的免疫原性。例如， 一种方法是将一个或更多构架残基 “回复突变” 成相应的种系序列。更特别地， 已经经历体细胞突变 的抗体含有不同于抗体来源种系序列的构架残基。 可通过比较抗体构架序列与抗体来源的 种系序列来鉴定此类残基。为了将构架区序列恢复成它们的种系构型， 例如通过定点诱变 可以将体细胞突变 “回复突变” 到种系序列中。此类 “回复突变的” 抗体也旨在包括在本发 明内。
     另一类型的构架修饰包括突变构架区， 或甚至一个或更多 CDR 区内的一个或更多 残基， 来去除 T 细胞表位， 由此降低抗体的潜在免疫原性。该方法也称为 “去免疫化” ， 并进 一步详细描述于 Carr 等的美国专利公开号 20030153043 中。
     除了在构架或 CDR 区内进行修饰外或作为备选， 可改造本发明的抗体以包括 Fc 区 内的修饰， 通常用来改变抗体的一种或更多功能性质， 如血清半衰期、 补体结合、 Fc 受体结 合， 和 / 或抗原依赖性细胞毒性。 另外， 可化学修饰 ( 例如， 一个或更多化学部分可附着到抗 体上 ) 或修饰本发明的抗体以改变其糖基化， 再次用于改变抗体的一种或更多功能性质。 在下文中进一步详细描述了这些实施方案中每一个实施方案。Fc 区中残基的编号是 Kabat 的 EU 指数的编号。
     在一个实施方案中， 修饰 CH1 的铰链区， 使得改变， 例如增加或减少铰链区中半胱 氨酸残基的数量。在 Bodmer 等的美国专利号 5,677,425 中进一步描述了该方法。改变 CH1 的铰链区中半胱氨酸残基的数量， 例如用来便于轻链和重链装配， 或提高或降低抗体的稳 定性。
     在另一实施方案中， 突变抗体的 Fc 铰链区， 以降低抗体的生物半衰期。更特别地， 向 Fc 铰链片段的 CH2-CH3 结构域界面区引入一个或更多氨基酸突变， 使得抗体相对于天然 的 Fc 铰链结构域 SpA 结合具有受损的葡萄球菌蛋白 A(SpA) 结合。在 Ward 等的美国专利 号 6,165,745 中进一步描述了该方法。
     在另一实施方案中， 修饰抗体以增加其生物半衰期。多种方法是可能的。例如， 可 引入一个或更多以下突变 ： T252L、 T254S、 T256F， 如 Ward 的美国专利号 6,277,375 中所述。 或者， 为了增加生物学半衰期， 可在 CH1 或 CL 区内改变抗体， 以含有取自 IgG 的 Fc 区的 CH2 结构域的两个环的挽救受体结合表位， 如 Presta 等的美国专利号 5,869,046 和 6,121,022 所述。
     在其它实施方案中， 通过用不同氨基酸残基替换至少一个氨基酸残基来改变 Fc 区域， 以改变抗体的效应功能。例如， 可用不同氨基酸残基替换一个或更多氨基酸， 使得所 述抗体对效应配体具有改变的亲和力， 但保留亲本抗体的抗原结合能力。对其亲和力改变 的效应配体可以是例如， Fc 受体或补体的 C1 组分。在 Winter 等的美国专利号 5,624,821 和 5,648,260 中进一步详细描述了该方法。
     在另一实施方案中， 可用不同氨基酸残基替换选自氨基酸残基的一个或更多氨 基酸， 使得抗体具有改变的 C1q 结合 / 或降低的或消除的补体依赖性细胞毒性 (CDC)。在 Idusogie 等的美国专利号 6,194,551 中进一步详细描述了该方法。
     在另一实施方案中， 改变一个或更多氨基酸残基， 由此改变抗体固定补体的能力。 在 Bodmer 等的 PCT 公开 WO 94/29351 中进一步详细描述了该方法。
     在再一实施方案中， 修饰 Fc 区以提高抗体介导抗体依赖性细胞毒性 (ADCC) 的 能力和 / 或通过修饰一个或更多氨基酸来增加抗体对 Fcγ 受体的亲和力。在 Presta 的PCT 公开 WO 00/42072 中进一步详细了描述该方法。此外， 已经在人 IgG1 上对 FcγRl、 FcγRII、 FcγRIII 和 FcRn 的结合位点进行作图， 并且已经描述了具有提高结合的变体 ( 参 阅 Shields， R.L. 等， 2001 J.Biol.Chen.276 ： 6591-6604)。
     在再一实施方案中， 修饰抗体的糖基化。例如， 可制备无糖基化抗体 ( 即， 所述抗 体缺少糖基化 )。可改变糖基化， 例如用来增加抗体对 “抗原” 的亲和力。可通过例如改变 抗体序列中一个或更多糖基化位点来完成此类糖类修饰。例如， 可进行一个或更多氨基酸 替换， 由此去除该位点上的糖基化， 所述氨基酸替换导致一个或更多可变区构架糖基化位 点的去除。这种无糖基化可增加抗体对抗原的亲和力。在 Co 等的美国专利号 5,714,350 和 6,350,861 中进一步详细了描述该方法。
     此外或备选地， 可以制备具有改变类型糖基化的抗体， 如具有减少量的岩藻糖残 基的低岩藻糖化抗体或具有增加的二等分 GlcNac 结构的抗体。已经显示此类改变的糖基 化模式提高抗体的 ADCC 能力。例如通过在具有改变的糖基化机器的宿主细胞中表达抗体 来完成此类糖类修饰。已经在本领域中描述了具有改变糖基化机器的细胞， 并且其可用作 宿主细胞， 在其中表达本发明重组抗体， 由此产生具有改变的糖基化的抗体。例如， Hang 等 的 EP 1,176,195 描述了具有功能破坏的 FUT8 基因的细胞系， 该基因编码岩藻糖转移酶， 使 得在这种细胞系中表达的抗体显示低岩藻糖化。Presta 的 PCT 公开 WO 03/035835 描述了 变体 CHO 细胞系 Lecl3 细胞， 其将岩藻糖附着到 Asn(297)- 连接的糖类上的能力降低， 也 导致在该宿主细胞中表达的抗体的低岩藻糖化 ( 也参阅 Shields， R.L. 等， 2002 J.Biol. Chem.277 ： 26733-26740)。 Umana 等的 PCT 公开 WO 99/54342 描述了经改造以表达糖蛋白修 饰糖基转移酶 ( 例如， β(1， 4)-N 乙酰葡糖氨基转移酶 III(GnTIII))， 使得在改造的细胞系 中表达的抗体显示增加的二等分 GlcNac 结构， 其导致抗体的 ADCC 活性提高 ( 也参阅 Umana 等， 1999 Nat.Biotech.17 ： 176-180)。
     改造改变的抗体的方法
     如上讨论， 此处显示的具有 VH 和 VL 序列或全长重链和轻链序列的 C3b 结合抗体 可用于通过修饰全长重链和 / 或轻链序列、 VH 和 / 或 VL 序列、 或附着到其上的恒定区产生 新的 C3b 结合抗体。因此， 在本发明的另一方面， 本发明 C3b 结合抗体的结构特征用于产生 结构上相关的 C3b 结合抗体， 其保留了本发明抗体的至少一种功能性质， 如结合人 C3b， 以 及抑制 C3b 的一种或更多功能性质 ( 例如， 在溶血测定中抑制红细胞溶解 )。
     例如， 本发明抗体的一个或更多 CDR 区或其突变可与已知的构架区和 / 或其它 CDRs 重组组合以产生本发明额外的重组改造的 C3b 结合抗体， 如上讨论。其它类型的修饰 包括在先前部分中描述的那些。用于改造方法的起始材料是此处提供的一个或更多 VH 和 / 或 VL 序列， 或其一个或更多 CDR 区。为了产生改造的抗体， 不必实际制备 ( 即， 表达为蛋 白质 ) 具有此处提供的一个或更多 VH 和 / 或 VL 序列， 或其一个或更多 CDR 区的抗体。而 是， 序列中包含的信息用作起始材料， 来产生来自初始序列的 “第二代” 序列， 然后制备所述 “第二代” 序列并将其表达为蛋白质。
     因此， 在另一实施方案中， 本发明提供用于制备 C3b 结合抗体 ； 改变重链可变区抗 体序列和 / 或轻链可变区抗体序列内的至少一个氨基酸残基来产生至少一个改变的抗体 序列 ； 并将所述改变的抗体序列表达为蛋白质的方法， 所述 C3b 结合抗体由以下组成 ： 具有 选自 SEQ ID NOs ： 1、 15、 29、 43、 57、 71、 85、 99、 113、 127、 141、 155、 169 和 183 的 CDR1 序列、 选自 SEQ ID NOs ： 2、 16、 30、 44、 58、 72、 86、 100、 114、 128、 142、 156、 170 和 184 序列， 和 / 或选自 SEQ ID NOs ： 3、 17、 31、 45、 59、 73、 87、 101、 115、 129、 143、 157、 171 和 185 的 CDR3 序列的重链 可变区抗体序列 ； 和具有选自 SEQ ID NOs ： 4、 18、 32、 46、 60、 74、 88、 102、 116、 130、 144、 158、 172 和 186 的 CDR1 序列、 选自 SEQ ID NOs ： SEQ ID NOs ： 5、 19、 33、 47、 61、 75、 89、 103、 117、 131、 145、 159、 173 和 187 的 CDR2 序列， 和 / 或选自 SEQ ID NOs ： 6、 20、 34、 48、 62、 76、 90、 104、 118、 132、 146、 160、 174 和 188 的 CDR3 序列的轻链可变区抗体序列。
     因此， 在另一实施方案中， 本发明提供用于制备经过优化以在哺乳动物细胞中表 达的 C3b 结合抗体 ； 改变全长重链抗体序列和 / 或全长轻链抗体序列内的至少一个氨基酸 残基来产生至少一个改变的抗体序列 ； 并将所述改变的抗体序列表达为蛋白质的方法， 所 述 C3b 结合抗体由以下组成 ： 具有选自 SEQ ID NOs ： 9、 23、 37、 51、 65、 79、 93、 107、 121、 135、 149、 163、 177 和 191 的序列的全长重链抗体序列 ； 和具有选自 SEQ ID NOs ： 10、 24、 38、 52、 66、 80、 94、 108、 122、 136、 150、 164、 178 和 192 的序列的全长轻链抗体序列。
     也 可 通 过 筛 选 抗 体 文 库 制 备 改 变 的 抗 体 序 列， 所述抗体文库具有如 US20050255552 中描述的固定的 CDR3 序列或最小基本结合决定簇以及 CDR1 和 CDR2 序列上 的多样性。可根据适合于从抗体文库中筛选抗体的任何筛选技术， 如噬菌体展示技术进行 筛选。
     标准分子生物学技术可用于制备和表达改变的抗体序列。 所述改变的抗体序列编 码的抗体是保留此处所述 C3b 结合抗体的一种、 一些或所有功能性质的抗体， 所述功能性 质包括， 但不限于与人和 / 或猕猴 C3b 的特异性结合 ； 和所述抗体在溶血测定中抑制红细胞 溶解。
     可使用本领域中可得的标准测定法， 如在实施例中阐明的那些测定法 ( 例如， ELISA) 评估经改变的抗体的功能性质。
     在本发明改造抗体的方法的某些实施方案中， 可沿全部或部分 C3b 结合抗体编码 序列随机或选择性引入突变， 并且可如此处描述的筛选所得的经修饰 C3b 结合抗体的结合 活性和 / 或其它功能性质。已经在本领域中描述了突变方法。例如， Short 的 PCT 公开 WO 02/092780 描述了使用饱和诱变、 合成连接装配或其组合用于产生并筛选抗体突变的方法。 或者， Lazar 等的 PCT 公开 WO 03/074679 描述了使用计算筛选方法来优化抗体理化性质的 方法。
     本发明抗体的表征
     可通过多种功能测定表征本发明的抗体。例如， 它们可通过它们在溶血测定中抑 制红细胞溶解的能力、 与 C3b 蛋白质 ( 例如， 人和 / 或猕猴 C3b) 的亲和力、 它们抑制 C3a 或 C5a 产生的能力、 它们抑制 C3b 沉积的能力、 表位装箱 (binning)、 它们对蛋白酶解的抗性、 及阻断补体级联的能力， 例如它们抑制 MAC 形成的能力来表征。
     多种方法可用于测定补体途径分子的存在和补体系统的激活 ( 参阅例如， 美国专 利号 6,087,120 ； 和 Newell 等， J Lab Clin Med， 100 ： 437-44， 1982)。例如， 可通过 (i) 测 定红细胞的补体介导的溶解 ( 溶血 ) 的抑制 ； (ii) 测定抑制 C3 或 C5 切割的能力 ； 和 (iii) 旁路途径介导的溶血的抑制来监测补体活性。
     两种最常用的技术是溶血测定 ( 参阅例如 Baatrup 等， Ann Rheum Dis， 51 ： 892-7， 1992) 和免疫学测定 ( 参阅例如 Auda 等， Rheumatol Int， 10 ： 185-9， 1990)。所述溶血技术测量经典或旁路途径中完整序列的功能能力。 免疫学技术测量特定补体组分或裂解产物的 蛋白质浓度。在本发明方法中可用于检测补体激活或测定补体组分活性的其它测定法包 括， 例如 T 细胞增殖测定 (Chain 等， J Immunol Methods， 99 ： 221-8， 1987) 和迟发型超敏反 应 (DTH) 测定 (Forstrom 等， 1983， Nature 303 ： 627-629 ； Halliday 等， 1982， Assessment of Immune Status by the Leukocyte Adherence Inhibition Test， Academic， New York 第 1-26 页 ； Koppi 等， 1982， Cell.Immunol.66 ： 394-406 ； 和美国专利号 5,843,449)。
     在溶血技术中， 所有的补体组分必须存在且具有功能。因此， 溶血技术可筛选功 能完整性和补体系统的不足 ( 参阅例如 Dijk 等， J ImmunolMethods 36 ： 29-39， 1980 ； Minh 等， Clin Lab Haematol.5 ： 23-341983 ； 和 Tanaka 等， J Immunol 86 ： 161-170， 1986)。为了 测定经典途径的功能能力， 用溶血素包被的羊红细胞 ( 针对绵羊红细胞的兔 IgG) 或用兔抗 鸡抗体致敏的鸡红细胞用作靶细胞 ( 致敏细胞 )。 这些 Ag-Ab 复合体激活了经典途径， 并当 所述组分有功能且以足够浓度存在时导致靶细胞的溶解。为了确定旁路途径的功能能力， 兔红细胞用作靶细胞 ( 参阅例如美国专利号 6,087,120)。
     为了测试抗体抑制 MAC( 膜攻击复合体 ) 形成的能力， 可进行 MAC 沉积测定。简言 之， 酵母多糖可用于激活旁路途径， 并且 IgM 可用于激活经典途径。用人血清预温育 Fabs， 并将其加到用酵母多糖或 IgM 包被的平板中。 可计算每一样品的 MAC 沉积相对于基线 (EDTA 处理的人血清 ) 和阳性对照 ( 人血清 ) 的百分比抑制。
     为了测试本发明抗体在替代途径中抑制补体蛋白 C3 的能力， 测定在酵母多糖上 沉积的 C3 分解产物 C3b 的产生。在下文实施例中详细描述了用于测定 C3b 沉积的特定方 法。
     可 通 过 例 如 使 用 特 异 性 抗 C5a 抗 体， 如 从 US Biologics 获 得 的 小 鼠 抗 人 C5a-des-Arg 抗体的 ELISA 测定法抗体抑制测定 C5 分解产物 C5a 的产生的能力。
     可通过直接标记目的抗体检测抗体结合 C3b 的能力， 或不标记抗体并使用本领域 中已知的多种夹层测定法间接检测结合。
     在一些实施方案中， 本发明的 C3b 结合抗体阻断或竞争参考 C3b 结合抗体与 C3b 多肽的结合。这些可以是上文描述的完全人 C3b 结合抗体。它们也可以是其它小鼠、 嵌合 或人源化 C3b 结合抗体， 其与参考抗体结合相同的表位。阻断或竞争参考抗体结合的能力 表明测试中的 C3b 结合抗体结合参考抗体定义的相同或相似表位， 或与参考 C3b 结合抗体 结合的表位足够接近的表位。此类抗体尤其可能具有为参考抗体鉴定到的有利性质。可通 过例如竞争结合测定法来确定阻断参考抗体或与其竞争的能力。利用竞争结合测定法， 检 测测试中的抗体抑制参考抗体特异结合共同抗原， 如 C3b 多肽的能力。如果过量的测试抗 体基本抑制参考抗体的结合， 那么测试抗体与参考抗体竞争对抗原的特异性结合。基本抑 制表示测试抗体降低参考抗体的特异结合通常至少 10％、 25％、 50％、 75％或 90％。
     有许多已知的竞争结合测定法， 其可用于评估 C3b 结合抗体与参考 C3b 结合抗体 竞争结合 C3b 蛋白质。这些测定法包括， 例如固相直接或间接放射免疫测定 (RIA)、 固相 直接或间接酶免疫测定 (EIA)、 夹层竞争测定 ( 参阅 Stahli 等， Methods in Enzymology 9： 242-253， 1983) ； 固 相 直 接 生 物 素 - 亲 和 素 EIA( 参 阅 Kirkland 等， J.Immunol.137 ： 3614-3619， 1986) ； 固相直接标记测定、 固相直接标记夹层测定 ( 参阅 Harlow&Lane， 上文 ) ； 使 用 I-125 标 记 的 固 相 直 接 标 记 RIA( 参 阅 Morel 等， Molec.Immunol.25 ： 7-15， 1988) ；固相直接生物素 - 亲和素 EIA(Cheung 等， Virology 176 ： 546-552， 1990) ； 和直接标记的 RIA(Moldenhauer 等， Scand.J.Immunol.32 ： 77-82， 1990)。通常， 这种测定包括使用结合到 固体表面或细胞的纯化抗原， 所述固体表面或细胞携带未标记的测试 C3b 结合抗体和标记 的参考抗体中任何一种。 通过测定在测试抗体存在下结合到固体表面或细胞上的标记的量 来测定竞争抑制。所述测试抗体一般过量存在。通过竞争测定鉴定的抗体 ( 竞争抗体 ) 包 括与参考抗体结合相同表位的抗体和结合邻近表位的抗体， 所述临近表位与参考抗体结合 的表位足够接近以发生位阻。
     为了测定所选的 C3b 结合单克隆抗体是否结合唯一的表位， 可使用市售试剂 ( 例 如， 来自 Pierce， Rockford， IL 的试剂 ) 将每一抗体生物素化。 可使用 C3b 多肽包被的 ELISA 平板， 使用未标记单克隆抗体和生物素化单克隆抗体进行竞争研究。可利用链霉抗生物素 蛋白 - 亲和素 - 碱性磷酸酶探针检测生物素化的 MAb 结合。为了测定纯化的 C3b 结合抗体 的同种型， 可进行同种型 ELISA。例如， 可用 1μg/ml 抗人 IgG 在 4℃下过夜包被微量滴定 板的孔。用 1％ BSA 封闭后， 平板与 1μg/ml 或更少的单克隆 C3b 结合抗体或纯化的同种型 对照在室温下反应 1 到 2 小时。所述孔然后与人 IgGl 或人 IgM 特异性碱性磷酸酶缀合的 探针反应。然后将平板显影， 并对其进行分析， 以便测定纯化抗体的同种型。
     为了证明单克隆 C3b 结合抗体与表达 C3b 多肽的肝细胞的结合， 可使用流式细胞 术。简言之， 表达 C3b 的细胞系 ( 在标准生长条件下生长 ) 可与含 0.1％ BSA 和 10％胎牛 血清的 PBS 中多种浓度的 C3b 结合抗体混和， 并在 37℃下温育 1 小时。洗涤后， 细胞与萤光 素标记的抗人 IgG 抗体在与一级抗体染色相同的条件下反应。可通过 FACScan 仪器使用光 和侧向散射性质门控单个细胞来分析样品。 ( 除了或者替代 ) 流式细胞术测定外， 还可使用 利用荧光显微术的备选测定法。 可如上所述将细胞染色， 并通过荧光显微术检测所述细胞。 该方法允许显示单个细胞， 但根据抗原的密度具有降低的灵敏度。
     可通过蛋白质印迹进一步测试本发明的 C3b 结合抗体与 C3b 多肽或抗原片段的反 应性。 简言之， 可制备纯化的 C3b 多肽或融合蛋白质， 或来自表达 C3b 的细胞的细胞提取物， 并进行十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳。电泳后， 将分离的抗原转移到硝基纤维素膜 上， 用 10％胎牛血清封闭， 并用待测试的单克隆抗体探测。 可使用抗人 IgG 碱性磷酸酶检测 人 IgG 结合， 并用 BCIP/NBT 底物片剂 (Sigma Chem.Co.， St.Louis， MO) 显色。
     在下文实施例部分也描述了功能测定的实例。
     预防和治疗用途
     本发明提供了通过向需要治疗的受试者施用有效量的本发明抗体治疗与提高的 补体活性相关的疾病或病症的方法。在特定实施方案中， 本发明提供了通过向需要治疗的 受试者施用有效量的本发明抗体治疗年龄相关性黄斑变性 (AMD) 的方法。
     尤其可使用本发明的抗体来预防干性 AMD 向湿性 AMD 的发展、 减慢和 / 或防止地 图样萎缩的发展、 治疗或预防黄斑水肿、 和改善因干性 AMD 发展引起的视力丧失。其也可以 与抗 VEGF 治疗组合使用来治疗湿性 AMD 患者。
     在一些实施方案中， 本发明提供通过向需要治疗的受试者施用有效量的本发明抗 体治疗补体相关疾病或病症的方法。 已知补体相关疾病或病症的实例包括 ： 神经障碍、 多发 性硬化、 中风、 吉 - 巴综合征、 外伤性脑损伤、 帕金森病、 不恰当或不想要补体激活的疾病、 血液透析并发症、 超急性同种异体移植物排斥、 异种移植物排斥、 IL-2 治疗过程中白细胞介素 2 诱导的毒性、 炎性疾病、 自身免疫病炎症、 克隆病、 成人呼吸道窘迫综合征、 包括烧伤或 冻伤的热伤、 局部缺血后再灌注状况、 心肌梗塞、 气囊血管成形术、 心肺转流术或肾脏转流 术中的泵后综合征、 血液透析、 肾缺血、 表面重建后肠系膜动脉再灌注、 传染病或脓毒、 免疫 复合物病症和自身免疫性疾病、 类风湿性关节炎、 系统性红斑狼疮 (SLE)、 SLE 肾炎、 增殖性 肾炎、 溶血性贫血、 和重症肌无力。 此外， 其它已知补体相关疾病是肺部疾病和病症， 如呼吸 困难、 咯血、 ARDS、 哮喘、 慢性阻塞性肺疾病 (COPD)、 肺气肿、 肺栓塞和梗塞、 肺炎、 致纤维化 粉尘疾病、 惰性粉尘和矿物质 ( 例如， 硅、 煤炭粉末、 铍和石棉 )、 肺纤维化、 有机粉尘疾病、 化学损伤 ( 因刺激性气体和化学物质， 例如氯、 光气、 二氧化硫、 硫化氢、 二氧化氮、 铵和盐 酸 )、 烟雾损伤、 热损伤 ( 例如， 烧伤、 冻伤 )、 哮喘、 变态反应、 支气管收缩、 超敏感性肺炎、 寄 生虫病、 肺出血肾炎综合征、 肺血管炎和免疫复合物相关的炎症。
     在特定实施方案中， 本发明提供通过向需要治疗的受试者施用有效量的本发明抗 体治疗补体相关疾病或病症的方法， 其中所述疾病或病症是哮喘、 关节炎 ( 例如， 类风湿性 关节炎 )、 自身免疫性心脏病、 多发性硬化、 炎性肠病、 缺血 - 再灌注损伤、 巴 - 西综合征、 血 液透析、 系统性红斑狼疮、 红斑狼疮、 牛皮癣、 多发性硬化、 移植、 中枢神经系统疾病如阿尔 茨海默氏病和其它神经变性状况、 aHUS、 肾小球肾炎、 大疱性类天疱疮或 MPGNII。
     在特定实施方案中， 本发明提供通过向需要治疗的受试者施用有效量的包含本发 明抗体的组合物来治疗肾小球肾炎的方法。 肾小球肾炎的症状包括， 但不限于蛋白尿 ； 降低 的肾小球滤过率 (GFR) ； 血清电解质改变， 包括氮质血症 ( 尿毒症、 过度血尿氮 -BUN) 和盐 滞留， 致使水滞留， 导致高血压和水肿 ； 血尿和异常尿沉淀， 包括红细胞管型 ； 低白蛋白血 症； 高脂血症 ； 和脂肪尿。在特定实施方案中， 本发明提供通过向需要治疗的受试者施用有 效量的包含本发明抗体的组合物来治疗阵发性夜间血红蛋白尿 (PNH) 的方法。
     在特定实施方案中， 本发明提供通过向需要治疗的受试者施用有效量的包含本发 明抗体的组合物来减少与体外循环相关的免疫和止血系统功能异常的方法。 本发明的抗体 可用于任何方法中， 所述方法涉及使患者血管中血液循环穿过导管， 并回流到患者血管中， 所述导管具有网眼表面， 所述网眼表面包含能够引起补体激活、 血小板激活、 白细胞激活或 血小板 - 白细胞粘着至少一种的材料。此类方法包括， 但不限于所有形式的 ECC， 以及涉及 向患者血液循环中引入人工或外源器官、 组织或血管的方法。
     也可利用治疗与黄斑变性相关状况的已知方法， 如在美国专利号 6,218,368 中描 述的抗生素治疗向待用本发明治疗剂治疗的受试者施用其它治疗剂。在其它治疗中， 免疫 抑制剂如环孢菌素是能够抑制免疫应答的治疗剂。这些治疗剂包括细胞毒性药物、 皮质类 固醇、 非类固醇抗炎药物 (NSAIDs)、 特异的 T 淋巴细胞免疫抑制剂， 和抗体或其片段 ( 参阅 Physicians′ Desk Reference， 第 53 版， Medical Economics Company Inc.， Montvale， N.J.(1999))。通常以一周、 一个月、 三个月、 六个月或一年的间隔继续免疫抑制治疗。在一 些患者中， 在患者余生中施用治疗。
     当本发明的治疗剂与另一治疗剂一起施用时， 可以任何顺序连续施用或同时施用 两种治疗剂。在一些方面， 本发明的抗体向也接受第二种治疗剂 ( 例如维替泊芬 ) 治疗的 受试者施用。另一方面， 结合分子与外科治疗结合施用。
     与 C3b 结合抗体组合治疗的合适治疗剂包括本领域中已知的治疗剂， 其能够调节 补体组分的活性 ( 参阅例如， 美国专利号 5,808,109)。已经报道其它治疗剂降低补体介导的活性。此类治疗剂包括 ： 氨基酸 (Takada， Y. 等 Immunology 1978， 34， 509) ； 膦酸酯 (Becker， L.Biochem.Biophy.Acta 1967， 147， 289)、 聚阴离子物质 (Conrow， R.B. 等 J.Med. Chem.1980， 23， 242) ； 磺酰氟 (Hansch， C. ； Yoshimoto， M.J.Med.Chem.1974， 17， 1160， 和其 中引用的参考文献 ) ； 多核苷酸 (DeClercq， P.F. 等 Biochem.Biophys.Res.Commun.1975， 67， 255) ；海 松 酸 (Glovsky， M.M. 等 J.Immunol.1969， 102， 1) ；卟 吩 (Lapidus， M. 和 Tomasco， J.Immunopharmacol.1981， 3， 137) ； 一些抗炎药 (Burge， J.J. 等 J.Immunol.1978， 120， 1625) ； 酚 类 (Muller-Eberhard， H.J.1978， Molecular Basis of Biological DegradativeProcesses， Berlin， R.D. 等， 编辑 Academic Press， New York， 第 65 页 ) ； 和苄 脒类 (Vogt， W. 等 Immunology 1979， 36， 138)。这些治疗剂中的一些治疗剂通过一般性抑 制蛋白酶和酯酶起作用。其它治疗剂对补体途径中任何特定中间步骤并不是特异的， 但是 却抑制补体激活的一个以上的步骤。后面化合物的实例包括苄脒类， 其阻断 C1、 C4 和 C3b 的利用 ( 参阅例如 Vogt 等 Immunol.1979， 36， 138)。
     可抑制补体组分活性的本领域已知的额外治疗剂包括来自葡萄穗霉属 (Stachybotrys) 的真菌代谢物 K-76(Corey 等， J.Amer.Chem.Soc.104 ： 5551， 1982)。 已经显 示 K-76 和 K-76COOH 主要在 C3b 步抑制补体 (Hong 等， J.Immunol.122 ： 2418， 1979 ； Miyazaki 等， Microbiol.Immunol.24 ： 1091， 1980)， 并防止从正常人补体中产生趋化因子 (Bumpers 等， Lab.Clinc.Med.102 ： 421， 1983)。在高浓度的 K-76 或 K-76COOH 中， 显示了对 C2、 C3、 C6、 C7 和 C9 与其各自先前媒介物的反应的一定抑制。也已经报道了 K-76 或 K-76COOH 抑 制补体的 C3b 激活系统 (Hong 等， J.Immunol.127 ： 104-108， 1981)。用于实践本发明方法 的其它合适治疗剂包括灰黄霉素 (griseofulvin)(Weinberg， Principles of Medicinal Chemistry， 第 2 版， Foye， W.O.， 编辑， Lea&Febiger， Philadelphia， Pa.， 第 813 页， 1981)、 isopannarin(Djura 等， Aust.J.Chem.36 ： 1057， 1983) 和 Siphonodictyoncoralli-phagum 的代谢物 (Sullivan 等， Tetrahedron 37 ： 979， 1981)。
     组合治疗方案可以是累加的， 或其可以产生协同结果 ( 例如， 补体途径活性的减 少超出组合使用两种治疗剂的预期 )。 在一些实施方案中， 本发明提供使用本发明的 C3b 结 合抗体和抗血管发生剂， 如抗 VEGF 治疗剂来预防和 / 或治疗 AMD 或如上所述另一补体相关 疾病的组合治疗。
     诊断用途
     一方面， 本发明包括用于在生物学样品 ( 例如， 血液、 血清、 细胞、 组织 ) 的背景中 或遭受疾病或病症、 或处于发生与 AMD 相关病症的风险的个体中测定 C3b 蛋白质和 / 或核 酸表达以及 C3b 蛋白质功能的诊断测定法。
     诊断测定法， 如竞争性测定法依赖于标记的类似物 (“示踪物” ) 与测试样品分析 物竞争共同结合配偶体上有限数量的结合位点的能力。 结合配偶体一般在竞争前或竞争后 不溶解， 然后结合到结合配偶体上的示踪物和分析物与未结合的示踪物和分析物分离。通 过倾析 ( 其中结合配偶体预先不溶解 ) 或通过离心 ( 其中竞争反应后结合配偶体沉淀 ) 完 成该分离。 如通过标记物质的量测定， 测试样品分析物的量与结合的示踪物的量成反比。 制 备已知量的分析物的剂量反应曲线， 并与测试结果进行比较， 以定量测定测试样品中存在 的分析物的量。当酶用作检测标记时， 这些测定称为 ELISA 系统。在该形式的测定中， 抗体 与 C3b 结合抗体之间的竞争性结合导致结合的 C3b 蛋白质， 优选本发明的 C3b 表位成为血清样品中抗体的量度， 最特别的是中和血清样品中的抗体。
     测定的显著优势是直接对中和抗体 ( 即， 干扰与 C3b 蛋白质， 尤其是表位结合的那 些抗体 ) 进行测定。这种测定， 特别是 ELISA 测试形式在临床环境和常规血液筛查中具有 相当多的应用。
     免疫学技术使用针对多种补体组分 ( 例如 C3、 C4、 C5) 的不同表位的多克隆或单 克隆抗体来检测例如， 补体组分的裂解产物 ( 参阅例如， Hugli 等， Immunoassays Clinical Laboratory Techniques 443-460， 1980 ； Gorski 等， JImmunol Meth 47 ： 61-73， 1981 ； Linder 等， J Immunol Meth 47 ： 49-59， 1981 ；和 Burger 等， J Immunol 141 ： 553-558， 1988)。然后可测定抗体与所述裂解产物和已知浓度的标记裂解产物的竞争结合。可获得 多种测定， 如放射免疫测定、 ELISA′ s 和放射扩散测定来检测补体裂解产物。
     免疫学技术提供高灵敏度来检测补体激活， 因为它们允许测定来自患有或不患有 黄斑变性相关病症的测试受试者和对照受试者的血液中裂解产物的形成。因此， 在本发明 的一些实施方案中， 通过测试受试者的血浆中补体组分的可溶性裂解产物的定量来测定 异常补体激活以获得对眼病症相关病症的诊断。如在 Chenoweth 等， N Engl J Med 304 ： 497-502， 1981 ； 和 Bhakdi 等， Biochim Biophys Acta 737 ： 343-372， 1983 中描述进行测定。 优选地， 仅测定体内形成的补体激活。这可通过在含有补体系统的抑制剂的培养基中收集 来自受试者的生物学样品 ( 例如血清 )， 随后在所述样品中测定补体激活 ( 例如裂解产物的 定量 ) 来完成。
     在患有眼疾病或病症相关病症的患者的临床诊断或监测中， 补体蛋白质的检测与 来自正常受试者的相应生物学样品中的水平的比较表明患者患有与黄斑变性相关的病症。
     在 US2006/0067935 中描述了体内诊断或成像。简言之， 这些方法一般包括向患者 施用或引入诊断有效量的 C3b 结合分子， 其有效附着到通过非创性方法可检测的标记或标 签上。允许抗体 - 标记缀合物足够时间定位并结合眼睛内的补体蛋白质。然后将所述患者 暴露在检测设备下来鉴定可检测标记， 因此在患者眼睛中形成 C3b 结合分子的定位图像。 通过检测抗体 - 标记是否结合眼睛的组分来检测 C3b 结合抗体或其抗原结合片段的存在。 与未患有 AMD 疾病的正常个体相比， 所选补体蛋白质或蛋白质组合增加水平的检测表明与 黄斑变性相关的病症的倾向性和 / 或发作。也优选本发明的这些方面用于眼睛成像方法以 及组合的血管发生诊断和治疗方法。
     本发明还涉及预测医学领域， 其中诊断测定、 预后测定、 药物基因组学和监测临床 试验用于预后 ( 预测 ) 目的， 由此预防性治疗个体。
     本发明还提供用于测定个体是否具有发生与补体途径活性失调相关病症的风险 的预后 ( 或预测 ) 测定法。例如， 可测定生物学样品中 C3b 基因中的突变。此类测定法可 用于预后或预测目的， 由此在病症发作之前预防性治疗个体， 所述病症的特征在于 C3b 蛋 白质、 核酸表达或活性或与其相关。
     本发明的另一方面提供用于在个体中测定 C3b 核酸表达或 C3b 蛋白质活性的方 法， 由此为该个体选择适当的治疗剂或预防剂 ( 此处称为 “药物基因组学” )。药物基因组学 允许基于个体的基因型来选择治疗剂 ( 例如， 药物 ) 用于个体的治疗性或预防性治疗 ( 例 如， 检查个体的基因型以测定所述个体对特定治疗剂应答的能力 )。
     本发明的另一方面涉及在临床试验中监测治疗剂 ( 例如， 药物 ) 对 C3b 蛋白质的表达或活性的影响。
     药物组合物
     本发明提供包含与药学上可接受的载体一起配制的 C3b 结合抗体 ( 完整的或结合 片段 ) 的药物组合物。所述组合物可额外地含有适合于治疗或预防补体相关疾病 ( 例如 AMD) 的一种或更多其它治疗剂。药学上可接受的载体增强或稳定组合物， 或者可用于利于 组合物的制备。 药学上可接受的载体包括， 生理上相容的溶剂、 分散介质、 包衣、 抗细菌和抗 真菌剂、 等渗剂和吸收延迟剂等。
     可通过本领域已知的多种方法施用本发明的药物组合物。施用的途径和 / 或方式 根据想要的结果而变化。优选静脉、 肌内、 腹膜内、 或皮下施用、 或在靶位点附近施用。在特 定实施方案中， 配制本发明的抗体， 使得它们可经玻璃体内向眼睛施用。 药学上可接受的载 体应适合于静脉内、 肌内、 皮下、 肠胃外、 脊柱或表皮施用 ( 例如通过注射或输注 )。根据施 用途径， 可以材料包衣活性化合物， 即抗体， 双特异和多特异分子， 以保护所述化合物免于 酸和可能失活所述化合物的其它自然条件的作用。
     组合物应该是无菌且是流体的。 可使用包衣， 如卵磷脂， 在分散情况下维持需要的 颗粒大小并使用表面活性剂来维持适当的流动性。在许多情况下， 优选在组合物中包括等 渗剂， 例如， 糖、 多元醇如甘露醇或山梨醇、 和氯化钠。 可通过在组合物中引入延迟吸收的物 质 ( 例如单硬脂酸铝或明胶 ) 产生可注射组合物的长期吸收。
     可根据本领域所熟知的且常规实践的方法制备本发明的药物组合物。参阅例如， Remington ： The Science and Practice of Pharmacy， MackPublishing Co.， 第 20 版， 2000 ； 和 Sustained and Controlled Release DrugDelivery Systems， J.R.Robinson， 编 辑， Marcel Dekker， Inc.， New York， 1978。优选在 GMP 条件下制备药物组合物。通常， 在 本发明的药物组合物中使用治疗有效剂量或有效剂量的 C3b 结合抗体。通过本领域技术人 员已知的常规方法将 C3b 结合抗体配制成药学上可接受的剂量形式。调整剂量方案来提供 最想要的应答 ( 例如， 治疗应答 )。 例如， 可施用快速灌注， 可随时间施用若干分份剂量或根 据治疗情形的紧急性指示按比例减少或增加剂量。 以剂量单位形式配制肠胃外组合物尤其 利于容易施用和剂量的均一性。 此处所用的剂量单位形式指适合作为待治疗的受试者的单 一剂量的物理分离单位 ； 每一单位含有预定量的活性化合物， 其经计算以产生与需要的药 学载体相关的想要的治疗效果。
     可改变本发明药物组合物中活性成份的实际剂量水平， 以获得活性成份的量， 其 对特定患者、 组合物和施用方式有效实现想要的治疗应答， 而对所述患者无毒。 所选剂量水 平依赖于多种药物代谢动力学因素， 包括所用本发明具体组合物或其酯、 盐或酰胺的活性、 施用途径、 施用时间、 所用特定化合物的排泄速率、 治疗的持续时间、 与所用特定组合物组 合使用的其它药物、 化合物和 / 或物质、 年龄、 性别、 体重、 状况、 一般健康和待治疗患者的 先前医疗史等因素。
     医师或兽医可以比需要达到想要的治疗效果更低的水平开始施用药物组合物中 所用本发明抗体的剂量， 并逐渐增加剂量， 直至达到想要的效果。一般地， 用于治疗此处描 述的变应性炎性病症的本发明组合物的有效剂量根据许多不同因素而变化， 所述因素包括 施用手段、 靶位点、 患者的生理状态、 患者是人还是动物、 施用的其它药剂、 以及治疗是预防 性的还是治疗性的。 需要滴定治疗剂量以使安全性和效力达到最佳。 对于抗体的全身施用，剂量范围在约 0.0001 到 100mg/kg 宿主体重， 并更一般在 0.01 到 15mg/kg 宿主体重之间。 示例性治疗方案使得每两周一次或每月一次或每 3 到 6 个月一次进行全身施用。对于抗体 的玻璃体内施用， 剂量范围在约 0.0001 到约 10mg 之间。示例性治疗方案使得每两周一次 或每月一次或每 3 到 6 个月一次进行全身施用。
     一般在多种情况下施用抗体。单次剂量的间隔可以是每周一次、 每月一次或每年 一次。如通过测定患者中 C3b 结合抗体的血液水平指示， 间隔也可以是不规则的。在全身 施用的一些方法中， 调整剂量以达到 1-1000μg/ml 的血浆抗体浓度， 在一些方法中达到 25-500μg/ml。或者， 抗体可作为持续释放制剂施用， 在所述情况下需要更不频繁的施用。 剂量和频率根据抗体在患者体内的半衰期而变化。一般地， 人源化抗体比嵌合抗体和非人 抗体显示更长的半衰期。施用的剂量和频率可根据治疗是预防性的还是治疗性的而变化。 在预防性应用中， 在长时间段内以相对不频繁的间隔施用相对低的剂量。一些患者在其余 生继续接受治疗。 在治疗性应用中， 有时候需要在相对短间隔内相对高的剂量， 直至疾病的 发展减慢或终止， 并优选直至所述患者显示疾病症状部分或彻底改善。 此后， 可对患者施用 预防性方案。 实施例 提供以下实施例来进一步阐明本发明， 但不限制其范围。本发明的其它变型对本 领域的普通技术人员而言是显而易见的并包括在所附权利要求中。
     实施例 1 ： 抗原的产生和质量控制
     生物素化 C3b 的产生
     使用来自的 Pierce 标记试剂， 以 20 倍摩尔过量的生物素化试剂生物化纯化的 C3b。在室温下进行生物素化， 并使用 0.5ml Zeba Spin 脱盐柱分离未缀合的生物素。使用 EZ-Link NHS-LC-LC- 生物素标记 C3b 的赖氨酸残基， 并使用 EZ-Link Maleimide-PEG2- 生 物素标记半胱氨酸残基。使用 HABA 测定和 LC-MS/MS 定量生物素化的程度。通过 LC-MS/MS 验证参与 C3 上硫酯键形成的单个半胱氨酸的生物素化。
     结合琼脂糖珠子的 C3b 的产生
     使 用 来 自 Amersham Biosciences(17-0851-01) 的 PD-10 脱 盐 柱 将 纯 化 的 C3b(Quidel A413， lot 903726) 缓冲液交换成偶联缓冲液 (50mM Tris， 5mM EDTA-Na， pH 8.5)。SulfoLink 偶联凝胶 (Pierce 20401) 和所有其它试剂均平衡至室温。以 4 凝胶床 体积的偶联缓冲液平衡 SulfoLink 偶联凝胶， 并离心， 去除上清液。然后将缓冲液交换的 C3b 蛋白溶液加入到离心平衡的 SulfoLink 偶联凝胶 (SulfoLink Coupling Gel) 中。混 合物在室温下摇动 15 分钟， 然后在不混合的情况下保持静止 30 分钟。然后用 3 凝胶床体 积的偶联缓冲液洗涤缀合的 C3b 偶联凝胶。然后， 向 C3b 偶联凝胶中加入 1 凝胶床体积的 Quenching Reagent( 偶联缓冲液中 50mM L- 半胱氨酸 -HCL(44889))， 并在室温下保持摇动 15 分钟。15 分钟后， 缀合的 C3b 偶联凝胶在室温下不混合的情况下保持 30 分钟。用至少 6 凝胶床体积的洗涤溶液 (1M NaCl) 洗涤缀合的 C3b 偶联凝胶， 然后用 2 凝胶床体积的除气 StorageBuffer( 含有 0.05％叠氮化纳的磷酸盐缓冲盐水 ) 进行洗涤。最后的步骤是向凝 胶床体积中加入 1 凝胶床体积的 Storage Buffer 至估计 1mg/ml 的蛋白质。
     C3b-SulfoLink 偶联凝胶蛋白浓度测定
     以下量的 C3b 在还原条件下 4-12％变性蛋白质凝胶上运行 ： 2μg、 1.5μg、 1μg、 0.75μg、 0.5μg 和 0.25μg。在这些泳道后， 还将 2μl、 4μl 和 8μl 的 50 ％珠子悬浮液 (C3b 偶联凝胶 ) 在还原性条件下上样。 由于 α 链与珠子共价连接， 它在蛋白质凝胶上将不 会出现， 因此通过比较 β 链来测定蛋白质浓度。估计 1μl 的偶联凝胶有约 1μg 的 C3b， 因 此可获得大于 90％的偶联效率。
     计算在 SulfoLink 偶联凝胶上活性 C3b 百分比
     用在 4 种不同浓度 (0.122μM、 0.244μM、 0.367μM 和 0.489μM) 的因子 B、 固定 浓度的可溶性 C3b( 所有 4 种浓度均为 0.294μM) 和固定浓度的因子 D( 所有 4 种浓度均为 0.47μM) 设置四种对照。从这些对照反应中省略因子 P。反应在 37℃下温育 15 分钟。此 时将所有对照样品立即加入到 4X 的样品缓冲液中并放于 95℃ 10 分钟， 以稍后在 4-12％ Bis-Tris 蛋白质凝胶上电泳。 C3b 偶联的珠子浓度为每 1mg 柱床体积约 1mg C3b。 以下 7 个 反应由 0.294μM 固定浓度的偶联 C3b 的珠子、 2.68μM 固定浓度的因子 P 和 0.95μM 固定浓 度的因子 D 组成。因子 B 的浓度如下 ： 0.367μM、 0.489μM、 0.978μM、 1.467μM、 1.955μM、 2.933μM 和 3.910μM。对于这 7 个反应， 除因子 D 外均在 37℃下温育 30 分钟。经 30 分钟 温育后， 加入 0.95uM 的因子 D 并将反应温育 2 分钟。此时将所有样品立即加入到 4X 样品 缓冲液中并在还原性条件下在 4-12％ Bis-Tris 凝胶上电泳。 当分析数据时， 在所有泳道中 比较 Bb 条带。
     珠子 -C3b 稳定性
     在 C3b-SulfoLink 偶联凝胶缀合后， 将珠子离心并在 100％甘油 ( 使甘油终浓度为 50％ ) 中轻轻重悬浮。随后将珠子置于 -80℃进行几次冻融 ( 检测了高达 3 次 )。随后在冰 上解冻珠子并转移至 15ml 锥形管中。加入 5 柱体积的 1XPBS 来重悬浮珠子。将其在 850g 离心 5 分钟。完成用 10 柱体积的 1XPBS 进行的两次额外洗涤。最终步骤是用 1XPBS 重悬 浮珠子获得终浓度 50％的浆料溶液。每次冻融检测 Bb 产生 ： 与 3μM 因子 B、 0.5μM 因子 D、 1μM 的 C3b 珠子和 5mM 的 MgCl 温育 1 小时并寻找完全的 Bb 产生。除此之外， 在 -80℃ 储存几周后经 Bb 产生检测冰冻的珠子。
     Cyno C3 的纯化和 Cyno C3b 的产生
     Cyno 血浆购自 Alphagenesis(Yemassee， SC)。用 PBS、 10mM EDTA 和 2 份完全的混 和抑制剂片剂 (Roche) 将 50ml 血浆稀释到 200ml。缓慢将 40％的 PEG6000 加入到溶液中 至终浓度为 4％， 并在 4 度轻轻搅拌额外 30 分钟。通过在 17,500rpm 下离心 20 分钟去除沉 淀。再次将 PEG6000 加入到上清液中至终浓度为 12.5％并在 4 度搅拌 30 分钟。17,500rpm 下离心 20 分钟后去除上清液。在 50ml 1XPBS、 10mM EDTA 缓冲液中再次溶解沉淀， 并将含 C3 的溶液通过 15ml 的蛋白质 G(GE) 柱子两次以去除 CynoIgG。用 4L 20mM Tris pH 8.0、 10mM EDTA 对来自蛋白质 G 柱子的流出液透析过夜。同时， 用 0.5M NaOH 将 20ml MonoQ 柱 (GE) 清洗， 并随后用水和大量体积的 20mM Tris pH8.0 和 10mM EDTA 清洗直至柱基线清楚 且平衡。随后将透析的溶液装载至 ATKA 100(GE) 的 MonoQ 柱中， 流速为 0.8ml/ 分钟。装 载后， 用 10 柱体积的 20mM Tris pH 8.0 和 10mM EDTA 洗涤柱子或直至基线达到稳定。用 20 柱体积的从 0 至 500mM 的 NaCl 线性梯度将所述蛋白质从柱子上洗脱下来并以 4ml/ 管收 集级分。在非还原和还原性条件下经 SDS-PAGE 凝胶鉴定级分中的 C3 蛋白峰。进一步经蛋 白质印迹和 MS 肽谱分析验证 C3。随后将纯度为 85％的 C3 级分混合并用 PBS 缓冲液通过2660sephacryl 300 凝胶过滤柱 (GE) 进一步纯化。同样经 SDS-PAGE 和 MS 分析证实 C3 峰 级分。混合纯的级分并用 millipore 浓缩器浓缩至约 1mg/ml， 等份分装并保存在 -80 度冰 箱用于后续使用。
     在 PBS 缓冲液中将 Cyno C3 稀释至 500ug/ml。通过在 PBS 缓冲液中加入 0.4μM fB(Comptech)、 0.05μM fD(CompTech) 和 5mM MgCl2 将 C3 完全转化为 C3b， 并在室温温育 30 分钟。随后通过 2660sephacryl 300 凝胶过滤柱将所述 C3b 进一步纯化。混合含 C3b 的 峰组分， 其由 millipore 浓缩器浓缩。在 C3 转化酶测定中检测 cyno C3b 的活性。所述蛋 白质显示出与人 C3b(CompTech) 相当的 Bb 产生活性。
     通过补体因子和商品化抗体结合进行 C3b 试剂的质量控制
     酶联免疫吸附测定 (ELISA) 结合 ( 表位保守性 )
     在 ELISA 中比较生物素化的 C3b 分子和非生物素化的 C3b， 来评估由市售抗体识别 的 C3b 表位的保守性。
     用包被缓冲液 ( 碳酸氢盐 pH 9.5-9.8) 中 2μg/ml 的 100μl/ 孔市售抗 C3 或抗 C3b 抗体包被 Maxisorp 板， 并将其在 4℃温育过夜。用 PBST 洗涤 3 次后， 用 300μl/ 孔稀 释剂 (Synblock， AbD Serotec) 在室温下封闭所述板 2 小时。抽出封闭溶液后， 在稀释剂 中稀释的 100μl C3b(+/- 生物素 ) 样品在室温下温育 1 小时。加入在稀释剂 ( 多聚 HRP 稀释剂 ) 中 1 ∶ 5000 稀释的 100μl/ 孔 Strep-HRP( 聚 HRP 链霉抗生物素蛋白 ) 或 HRP 缀 合的抗 C3Ab 30 分钟。用 PBST 洗涤 4 次后， 加入 100μl/ 孔 TMB 底物 (Ultra TMB 底物溶 液 )5-10 分钟。 通过 50μl/ 孔的终止液 (2N H2SO4) 来终止反应。 读取吸光度 (A450-A570) 并使用 SoftMax Pro 分析数据。
     通过补体因子和商业化 Abs 的结合
     检测琼脂糖珠子上固定的 C3b 其结合商业化抗体和补体因子蛋白的能力。
     向各管中加入 4μl 的 C3b 珠子浆料 ( 对应于～ 1μg 的 C3b)。将珠子重悬浮于 100μl 稀释剂中。然后利用稀释剂 +Ab 或补体因子蛋白使管中的总体积达到 200μl。在 室温下摇动管 1 小时， 然后用稀释剂洗涤 1 次。向小柱中应用珠子浆料， 并再洗涤 2 次。快 速甩出剩余的液体 (1,200G， 1 分钟 )。塞紧柱子， 然后加入稀释剂中 500μl 的二级抗体或 抗补体因子 Ab(1 ∶ 5000)。在室温下温育 1 小时， 然后用稀释剂洗涤 4 次。[ 对于补体因 子， 利用二级 Ab 重复上述步骤 ]。快速甩出剩余的液体 (1,200G， 1 分钟 )。填充柱子， 然 后加入 100μl 的 TMB 底物。将液体快速甩入 (1,200G， 1 分钟 ) 新鲜管中。转移溶液到 96 孔板中。用 50μl/ 孔终止溶液 (2N H2SO4) 终止反应。读取吸光度 (A450-A570)， 并使用 SoftMax Pro 分析数据。
     实施例 2 ： 从 HuCAL 文库中产生 C3b 特异性抗体
     使用市售噬菌体展示文库 Morphosys HuCAL 文库作为抗体变体蛋白 质来源， 通过选择具有高结合亲和力的克隆产生抗 C3b 抗体。HuCAL 文库是 Fab 文库 (Knappik 等， 2000)， 其中所有六个 CDR 均因适当突变而变得多样化， 并且其使用 CysDisplay TM 技术将 Fab 连接到噬菌体表面 ( 例如见 WO01/05950)。
     HuCAL 噬菌体 - 抗体提供为 12 个单独的子库 ： VH1κ、 VH1λ、 VH2κ、 VH2λ、 VH3κ、 VH3λ、 VH4κ、 VH4λ、 VH5κ、 VH5λ、 VH6κ、 VH6λ。根据特定实验需要， 可以 任何组合混合 12 个子库。对于结合 C3b 的抗体的选择， 应用三种不同的淘选策略 ：a) 利用生物素化的人 C3b 的溶液淘选， 其中通过链霉抗生物素蛋白磁珠捕获噬菌 体 - 抗原复合体，
     b) 基于珠子的淘选， 其中 C3b 结合到琼脂糖珠子上， 和
     c) 差异肽淘选， 其中偶联到载体蛋白的肽上的选择循环与全长 C3b( 结合琼脂糖 珠子的生物素化 ) 上的选择循环交替进行。
     噬菌粒复苏、 噬菌体扩增和纯化
     在 含 有 34μg/ml 氯 霉 素 和 1 ％ 葡 萄 糖 的 2xYT 培 养 基 (2xYT-CG) 中 扩 增 HuCAL 文库。在用 OD600nm 为 0.5 的 VCSM13 辅助噬菌体感染后 (37℃下不摇动， 30 分钟 ； 37℃下 250rpm 摇动 30 分钟 )， 将细胞离心 (4120g ； 5 分钟 ； 4℃ )， 在 2xYT/34μg/ ml 氯霉素 /50μg/ml 卡那霉素 /0.25mM IPTG 中重悬浮， 并在 22℃下培养过夜。从上清液 中 PEG 沉淀噬菌体， 将其在 PBS/20％甘油中重悬浮并储存在 -80℃。 如下进行两个淘选循环 之间的噬菌体扩增 ： 用洗脱的噬菌体感染对数中期大肠杆菌 TG1 细胞并接种到补充有 1％ 葡萄糖和 34μg/ml 氯霉素的 LB 琼脂 (LB-CG 平板 ) 上。在 30℃下过夜温育后， 从琼脂平板 上刮去所述 TG1 菌落， 并将其用于接种 2xYT-CG， 直至达到 0.5 的 OD600nm。如上所述加入 VCSM13 辅助噬菌体用于感染。
     溶液淘选
     用于该淘选策略中的抗原是生物素化的 C3b。存在生物素化 C3b 的两种不同生物 素化的变体。 在一种变体中， 生物素通过附着到 C3b 上半胱氨酸残基的马来酰亚胺 -PEG- 接 头连接 C3b。该变体在下文中称为 C3b- 半胱氨酸 - 生物素。在另一变体中， 生物素通过附 着到 C3b 上的 3 个不同赖氨酸残基的磺基 -NHS-LCLC- 接头连接 C3b。该变体在下文中称为 C3b- 赖氨酸 - 生物素。在选择循环中交替进行两种不同变体上的选择， 以不选择结合接头 分子的噬菌体。
     用 PBS 洗 涤 链 霉 抗 生 物 素 蛋 白 磁 珠 (Dynabeads M-280 ； Dynal) 一 次， 并用 Chemiblocker 在室温下封闭 2 小时。还在旋转器上利用 Chemiblocker 在室温下封闭 PBS 洗脱的噬菌体 1-2 小时。封闭的噬菌体针对封闭的链霉抗生物素蛋白磁珠预吸附两次 30 分钟。将噬菌体上清液转移到新封闭的 2ml 反应管中， 加入人生物素化的 C3b， 并将混合物 在室温下旋转器上温育 1-2 小时。向各淘选库中加入 100μl 封闭的链霉抗生物素蛋白磁 珠， 并在旋转器上温育 20 分钟。用颗粒分离器 (Dynal MPC-E) 收集珠子大概 2.5 分钟， 并 小心地去除溶液。
     然后使用旋转器在 PBST 中洗涤珠子 7 次， 随后用 PBS 再洗涤 3 次。向各管中加 入 10mM Tris/HCl pH 8 中的 200μl 20mM DTT 从 Dynabeads 上洗脱噬菌体， 并温育 10 分 钟。通过磁性颗粒分离器去除 Dynabeads， 并向生长至 OD600nm 为 0.6-0.8 的 14ml 大肠杆 菌 TG-1 培养物中加入上清液。为了噬菌体感染， 在 37℃下 50ml 塑料管中不摇动情况下温 育所述培养物 45 分钟。4120xg 离心 5 分钟后， 细菌沉淀物各自在 800μl 2xYT 培养基中重 悬浮， 接种到 3xYT-CG 琼脂平板上， 并在 37℃下温育过夜。从所述平板上刮去菌落， 如上所 述复苏噬菌体并进行扩增。以与第一轮选择相同的方式进行第二轮和第三轮选择。
     为了选择 C3b 特异性噬菌体， 在多个子库中应用利用 C3 蛋白质的几种不同封闭方 法。一般地， 当用 Chemiblocker 封闭噬菌体时， 加入纯化的 C3 或含有 C3 的血清， 并在旋转 器上温育 1-2 小时。因此， 当与 C3b 接触时， 可能的 C3b/C3 交叉反应性噬菌体应该已结合到抗原上并应仅选择 C3b 特异性噬菌体。对于淘选 1812.1， 以 10 倍摩尔过量加入纯化的 C3( 仅在第一轮过程中 )。对淘选 1889 的子库 1-6 不应用封闭。对于子库 7-12， 在所有三 轮选择中应用使用人血清的多种封闭条件。对于子库 7 和 8， 加入未稀释的人血清， 产生超 过 C3b 大约 70 倍摩尔过量的 C3。因为我们担心血清因子可能降解 C3b， 所以加入蛋白酶抑 制剂 (Pefabloc SC， Roche， 终浓度 4mM)。对于子库 9-12， 加入稀释的人血清， 产生超过 C3b 大约 2 倍摩尔过量的 C3。子库 9 和 10 含有蛋白质抑制剂， 对于库 11 和 12 不加入抑制剂。
     基于珠子的淘选
     用于基于珠子淘选的抗原是偶联 sulfolink 琼脂糖珠子的 C3b。通过 MorphoSys 利用半胱氨酸 ( 来自 SulfoLink Immobilization Trial Kit) 处理琼脂糖珠子 (SulfoLink Coupling Gel) 产生用于将噬菌体预吸附到封闭的柱子上的珠子， 所述半胱氨酸封闭珠子 上所有可能的结合位点。
     在旋转器上室温下， 用 Chemiblocker 封闭 PBS 稀释的噬菌体 1-2 小时。封闭的噬 菌体预吸附封闭的琼脂糖珠子两次， 30 分钟。将噬菌体上清液转移到新的封闭的 2ml 反应 管中， 加入偶联人 C3b 的琼脂糖珠子， 并在旋转器上室温下温育混合物 1-2 小时。通过在台 式离心机中离心 (1000g， 1 分钟 ) 收集琼脂糖珠子， 并去除上清液。通过在 1ml 洗涤缓冲液 中温和重悬浮、 在洗涤缓冲液中温育并通过离心收集来反复洗涤沉淀物。
     通过向各管中加入 10mM Tris/HCl pH 8 中的 200μl 20mM DTT， 并温育 10 分钟从 琼脂糖珠子上洗脱噬菌体。通过离心沉淀珠子， 并向生长至 OD600nm 为 0.6-0.8 的 14ml 大 肠杆菌 TG-1 培养物中加入上清液。为了噬菌体感染， 在 37℃下 50ml 塑料管中不摇动情况 下温育所述培养物 45 分钟。4120xg 下离心 5 分钟后， 细菌沉淀物各自在 800μl 2xYT 培养 基中重悬浮， 接种到 3xYT-CG 琼脂平板上， 并在 37℃下温育过夜。从平板上刮去菌落， 如此 处所述复苏噬菌体并进行扩增。以与第一轮选择相同的方式进行第二和第三轮选择。
     琼脂糖珠子的沉淀物难以看得见， 并且容易溶解在上清液中。因此， 决定使用至 少 25μl 珠子， 以能够看得见沉淀物。这导致相对高的抗原浓度， 其对于第一轮对于所有子 库是不同的， 因为使用了不同的体积。第一轮子库中 C3b 的浓度大约如下 ： 子库 1820.1 中 为 189nM、 子库 1820.2 中为 128nM、 子库 1820.3 中为 257nM、 子库 1820.4 中为 98nM、 子库 1820.5 和 1820.6 中为 66nM。在第二轮选择中， C3b 浓度是， 子库 1820.1-3 中为 112nM， 子 库 1820.4-6 中为 57nM。在第三轮选择中， C3b 的浓度在所有子库中为 57nM。
     通过加入纯化的 C3 至大约 475nM 的终浓度将利用 C3 的封闭应用到子库 1820.4-6 的第一轮选择中。
     差异肽淘选
     用于差异肽淘选的抗原是代表 C3b 上不同表位的肽。这些肽在蛋白质结构分析中 已经鉴定为 C3b 特异的， 所述分析比较 C3b 相比于 C3 上表面暴露的残基。通过上文描述的 MorphoSys 进行与两种不同载体蛋白 BSA 和转铁蛋白的偶联。在选择循环中必须交替两种 不同的载体蛋白， 以不选择结合载体蛋白的噬菌体。此外， 在肽上的选择循环与在全长 C3b 上的选择循环交替进行， 以保证所选的噬菌体结合到正确折叠的全长 C3b 上。
     肽淘选中的实际淘选步骤是使用肽偶联载体蛋白作为结合 Maxisorp 平板的抗原 的固相淘选。用 PBS 中浓度为 50μg/ml 的偶联肽的 300μl 载体蛋白包被 Maxisorp 平板 (F96 Nunc-Immunoplate) 一定数量的孔 ( 取决于预封闭噬菌体的体积 )。密封平板并在4℃温育过夜。
     用 400μl PBS 洗 涤 包 被 的 孔 两 次， 并 在 微 量 滴 定 板 摇 床 上 室 温 下 用 350μl PBS/5％奶粉封闭 2 小时。在旋转器上室温下用 PBST/5％奶粉和终浓度为 0.5％ (v/v) 的 未偶联载体蛋白封闭噬菌体 2 小时。在封闭程序后用 400μl PBS 洗涤包被的孔两次。向 各包被孔中加入 300μl 预封闭的噬菌体， 并在摇床上室温下温育 2 小时。通过加入七次 400μl PBST 进行洗涤， 然后用 PBS 洗涤七次 ( 细节见表 8 和 10)。
     以每孔 10mM Tris/HCl pH8 中的 300μl 20mM DTT 从平板上洗脱噬菌体 10 分钟。 向在 37℃下 2YT 培养基中生长至 OD600 为 0.6-0.8 的 14ml 大肠杆菌 TG-1 中加入 DTT 噬菌 体洗脱液， 并为了噬菌体感染， 在 37℃下 50ml 塑料管中不摇动情况下温育 45 分钟。 4120xg 离心 5 分钟后， 细菌沉淀物各自在 600μl 2xYT 培养基中重悬浮， 接种到 3xYT-CG 琼脂平板 上， 并在 37℃下温育过夜。从所述平板上刮去菌落， 如此处所述复苏噬菌体并进行扩增。
     对于淘选 1849， 第一轮和第三轮选择是如上所述进行的肽淘选。第二轮是如此处 所述在结合琼脂糖珠子的 C3b 上的选择， 稍微做了以下修改 ： 已经使用奶粉而非半胱氨酸 封闭了用于噬菌体预吸附的琼脂糖珠子上的结合位点， 还如上所述在 PBST/5％奶粉中预封 闭所述噬菌体。对于淘选 1883， 第一轮和第三轮选择是使用如此处所述进行的生物素化 C3b 的溶液淘选。第二轮是如上所述的肽淘选 ( 该部分 )。
     淘选结果
     三轮淘选后选择的克隆已经亚克隆到表达载体中， 然后筛选与用于选择中的 C3b 或肽的结合。认为显示高于背景水平至少 2 倍的结合信号的克隆为初级命中。
     第一轮溶液淘选 1812 的输出是筛选在 Neutravidin 平板上与生物素化的 C3b 的 结合， 产生 531 个初级命中。以 C3b 筛选鉴定的 78 个克隆平行进行在生物素化的 C3 上的 筛选， 其在 C3b 上比在 C3 上显示更强的信号。78 个克隆的序列分析揭示了 27 条独特序列， 其中 19 条是结合并纯化的。仅小比例的这些克隆在捕获 ELISA 中显示与 cyno C3b 的交叉 反应性。鉴定 cyno 交叉反应性 C3bneo 抗体为本发明抗体的期望性状， 并特异选择 C3bneo 结合子的 cyno 交叉反应性。从 Cyno 猴血浆中纯化 Cyno C3b 蛋白， 并且在筛选过程中纯的 cyno C3b 作为抗原与人 C3b 一起使用。猕猴是极好的非人灵长类安全 / 毒性物种。期望 C3bneo 抗体与 cyno 的潜力和亲和力在人的 5-10 倍以内。选择该标准， 以实现对 cyno 中 C3b 浓度的显著抑制， 因此允许评估显著抑制 C3b 浓度引起的可能毒性。在筛选期， 因为没 有或有弱 cyno 交叉反应性， 必须丢弃许多克隆。为了鉴定更多的 cyno 交叉反应性克隆， 进 行淘选 1812 的再筛选。为了再筛选， 选择 178 个克隆， 其已经在 Neutravidin 平板上显示 了与 C3b 的显著结合 ( 高于背景至少 5 倍 ) 并且之前并未测序过。178 个克隆中的 38 个显 示与 cyno C3b 的结合， 并进一步进行 C3 反筛 (counter screen)。38 个克隆中的 10 个进 行反筛， 产生纯化的 1 个新的独特克隆。
     使用巯基平板的 ELISA 用于筛选基于珠子的淘选 1820。79 个初级命中， 49 个在 C3b 上比在 C3 上显示更强的信号。将这些测序， 产生 13 条独特序列， 其中 7 条是结合且纯 化的。
     筛选来自不同肽淘选 1849 的微表达 Fabs 与用于各选择的肽的结合。偶联肽的载 体蛋白用作 ELISA 中的直接包被抗原。 鉴定了 2944 中的 566 个初级命中， 但仅 22 个初级命 中显示高于背景至少 5 倍的信号。这 22 个克隆和 32 个额外克隆 ( 其显示接近背景 5 倍的信号 ) 进一步进行筛选， 以检查与全长 C3b 的结合。54 个克隆中没有一个显示与全长 C3b 的结合。
     与先前的差异肽淘选相反， 在差异肽淘选 1883 中进行全长 C3b 上的两轮选择和肽 上的仅一轮选择。淘选 1883 的结果是在捕获 ELISA 中筛选与 C3b 的结合。4416 个克隆的 筛选产生了 497 个初级命中。已经显示高于背景至少 5 倍信号的 275 个初级命中进一步进 行反筛。将经过反筛的 183 个克隆测序， 产生 9 个独特克隆。7 个独特克隆是结合且纯化 的。
     第二轮溶液筛选 1889 的结果是在捕获 ELISA 中筛选与 C3b 的结合， 产生 4416 个初 级命中的 2878 个。大多数初级命中 (2469/2878) 显示高于背景至少 5 倍的结合信号。决 定挑选 396 个代表性克隆进行反筛， 其来自不同淘选子库并具有不同的信号强度。 396 个克 隆中的 158 个通过反筛， 并进行测序， 产生 14 条独特序列和最终 11 个纯化的 Fabs。为了 不丢失任何感兴趣的克隆， 检测对 C3b 具有高于背景至少 5 倍结合信号的剩余克隆与 cyno C3b 的结合， 所述剩余克隆 (2073/2469) 未曾进行反筛选。筛选所得的 129 个 cyno 交叉反 应性克隆对 C3b 相比于 C3 的特异性。25 个克隆显示优于 C3 结合的 C3b 选择性， 最后产生 4 条新的独特序列。4 个克隆中的 3 个是结合且纯化的。
     表位装箱 (Epitope bining)
     根据制造商说明， 使用试剂盒 (ECL Protein biotinylation Module， GE) 生物素 化纯化的 Fabs。通过使其流过 Zeba Desalt Spin Column(Pierce) 从未结合的生物素上 清洗生物素化的 Fab。检测与生物素化的 Fab 的人 C3b 的结合活性， 在捕获 ELISA( 此处所 述 ) 中直接与其未生物素化的前体 (progenitor) 比较。仅挑选其结合活性未受生物素化 影响的 Fabs 继续研究。
     通过竞争 ELISA 进行表位装箱。所用的捕获抗体是指向 C3b 蛋白质兔多克隆抗人 C3d Ab， Abcam 的抗体， 其是 C3b 的亚结构域。用在 PBS 中稀释到 2μg/ml 的捕获抗体填充 Maxisorp 平板的孔。密封平板并在 4℃下温育过夜。
     第二天， 通过加入 PBST/5％奶粉封闭平板上剩余的结合位点。平板在室温下温育 1 小时， 然后用 PBST 洗涤 2 次。以在 PBST/5％奶粉中稀释的终浓度为 2.5μg/ml 加入 C3b。 平板在室温下温育 1 小时， 然后用 PBST 洗涤 2 次。
     同时， 均在 PBS 中稀释的终浓度 2.5μg/ml 的 C3b、 生物素化的 Fab 和未生物素化 的 Fab( 高于生物素化的 Fab 100 倍摩尔过量 ) 加入到孔中。平板在室温下温育 1 小时， 然 后用 PBST 洗涤 2 次。
     为了检测生物素化的 Fabs， 加入 AP 缀合的链霉抗生素蛋白 (Zymed)， 平板在室温 下温育 1 小时， 然后用 TBST 洗涤 5 次。根据制造商的说明书使用荧光底物 AttoPhos。在 Tecan GENios Pro 平板读出器上测量荧光。
     通过如上所述的竞争 ELISA 进行表位装箱。向人 C3b 中加入生物素化的 Fab 和未 生物素化的 Fab(100 倍过量 ) 的混合物。检测生物素标记。阴性对照 Fab MOR03207 获得 的信号设置为 100％值。与 100％信号相比评定抑制。
     鉴定了 6 个表位组 ( 在下文表中进行了概述 )。组 B 和 C， 以及组 D 和 E 共有部分 重叠的表位。
     表2： 表位组的概述
    实施例 3. 亲和力成熟和优化
     产生亲和力成熟文库
     为了增加所选抗体片段的亲和力和生物活性， 使用三核苷酸定向诱变通过盒诱变 平行地优化 L-CDR3 和 H-CDR2 区 ( 等， 1994)， 而构架区保持不变。在克隆用于
    亲和力成熟之前， 所有亲本 Fab 片段从相应的表达载体 (108x9_MH) 经过 XbaI/CN 102459334 A说明书23_LHC 产生105/123 页EcoRI 转移到 CysDisplayTM 载体 个 BssHII 位点从 HuCAL 展示载体25_LHC 中。通过去除干扰文库克隆的一 25_LHC， 用于 H-CDR2 优化。
     为了优化亲本 Fabs 的 L-CDR3， 通过 BpiI/SphI 去除轻链 (405bp) 的 L-CDR3、 构架 4 和恒定区， 并用多样化 L-CDR3 与构架 4 和所述恒定域的所有组成成分替换。大约 1.5μg 的 Fab 载体片段与 3 到 5 倍摩尔过量的携带多样化 L-CDR3s 的插入片段连接。在第二个文 库组中， 使 H-CDR2(XhoI/BssHII) 多样化， 而连接构架区保持不变。为了监测克隆效率， 在 将多样化 H-CDR2 盒克隆之前用模拟物替换亲本 H-CDR2。
     在 4ml 大肠杆菌 TOP10F 细胞 (Invitrogen， Carlsbad， CA， USA) 中将文库的连接 混合物电穿孔， 产生 108 到 109 个独立克隆。该文库大小保证覆盖理论多样性。如此处所 述进行文库的扩增。对于质量控制， 随机挑取单个克隆并进行测序。
     制备噬菌体用于亲和力成熟淘选
     在 含 有 34μg/ml 氯 霉 素 和 1 ％ 葡 萄 糖 (2xYT-CG) 的 2xYT 培 养 基 中 扩 增 成熟文库。用 OD600nm 为 0.5 的 VCSM13 辅助噬菌体感染后 ( 在 37℃， 不摇动 30 分钟 ； 在 37℃， 250rpm 摇动 30 分钟 )， 收集细胞 (4120xg ； 5 分钟 ； 4℃ )， 在 2xYT/34μg/ ml 氯霉素 /50μg/ml 卡那霉素 /0.25mMIPTG 中重悬浮并在 22℃下培养过夜。从上清液中 PEG 沉淀噬菌体两次， 在 PBS 中重悬浮并如下所述用于成熟淘选。
     (a) 成熟淘选
     用于成熟中的选择方法是如上文所述的溶液淘选。 为了增加淘选的严格性并选择 提高的解离速率， 降低抗原浓度并应用延长的洗涤条件 ( 高达 24 小时 )。在 4℃下进行过 夜洗涤步骤， 所有其他洗涤步骤在室温下进行。
     选择亲和力成熟的候选物
     已经在多种测定中表征了来自初次淘选的 Fabs。 根据以下标准将它们分级并分组 成可能的成熟候选物 ：
     ●结合 C3b 相比于结合 C3 的选择性
     ●溶血测定中的潜力
     ● C3b 和 MAC 沉积测定中的潜力
     ●作用方式
     ●表位箱
     ●亲和力
     8 个一级抗体进行成熟， 其因此在下文中称为 “亲本” 抗体。
     亲本抗体 MOR08035、 8598 和 8599 属于初次淘选后发现的最大一组 Fabs。它们是 表位箱 D 的成员， 在功能测定中展示活性， 并抑制 C3 和 C5 转化酶。这些抗体强烈抑制因子 B 与 C3b 的结合， 抑制因子 H 结合的程度较低。
     亲本抗体 MOR08552 展示相同的特征， 只是其具有稍微不同的表位 ( 箱 C)。
     MOR08672 和 MOR08675 均属于表位箱 D。它们非常好地抑制因子 H 的结合， 但仅显 示对其它因子结合的弱抑制。它们可能通过与上文抗体不同的机制起作用。同样， 缺少其 它因子的竞争可以导致以较低亲和力实现相同潜力。这种论点尤其用于 MOR08675， 其显示 适当的潜力， 尽管与 C3b 的亲和力实际上是低的。MOR08555 是表位组 C 的成员， 其与 MOR08305 组具有相似的特征， 但不抑制 C5 转化酶。 MOR08653 属于表位箱 B， 其与箱 C 部分重叠。其在功能测定中的存在导致对所检 测的所有机制的抑制 ： 因子 P、 因子 B 和因子 H 的结合、 C3b 二聚体形成的抑制以及 C3 和 C5 转化酶的抑制。
     分别构建来自各亲本的成熟文库， 以能够在淘选库的组成中维持灵活性。在稍晚 时间点上编辑库。对于各亲本抗体， 根据抗体发挥的主要抑制机制定义靶 KD 值。在 2 个库 的各库中编辑 MOR08598 和 MOR08653， 还有 MOR08555 和 MOR08599。在每各库中， 抗体展示 对抗原的相似亲和力， 很好地表达， 具有相同的靶 KD， 并且不共有重叠表位。
     用于亲和力成熟的文库
     通过 LCDR3 和 HCDR2 盒的平行交换进行亲和力成熟。通过三核苷酸定向盒诱变
    优化 CDR 序列。将来自表达载体 25 中。
    x9_Fab_MH 的 Fab 片段克隆到噬菌粒载体通过标准克隆方法产生 16 个不同的亲和力成熟文库 ( 对于各亲本抗体， 一个 LCDR3 和一个 HCDR3 文库 ) 并将多样化的克隆转化到电感受态大肠杆菌 TOP10F ′细胞 (Invitrogen) 中。文库大小合适， 在 5x108-4x109 范围内。对随机挑取的克隆测序显示 100％的多样性。在挑取的克隆中没有发现亲本结合子。最后， 分别制备了所有 16 个文库 的噬菌体。
     用于亲和力成熟的淘选策略
     在选择过程中分别保存 HCDR2 和 LCDR3 文库。8 个亲本中的 4 个处理为前导 ； 其 余 4 个亲本在 2 个库中各自排列。从所产生的亲和力成熟文库中复苏的约 1012 个噬菌体 进行成熟淘选。
     使用生物素化的抗原进行使用各噬菌体库的溶液淘选， 在人和 cynoC3b 之间交 替。为了增加淘选严格性并选择提高的解离速率， 降低抗原浓度并应用延长的洗涤条件 ( 高达 24 小时 )。在上文中概述了淘选和洗涤条件。成熟淘选后， 将富集的噬菌粒库亚克 隆到
    x9_MH 表达载体中。亲和力筛选和成熟淘选结果
     从所有淘选中筛选了共 2464 个克隆作为在人 C3b 上具有提高亲和力的细菌裂解 物。通过溶液平衡滴定 (SET) 评估初步的亲和力。认为估计与其亲本克隆相比亲和力提高 的克隆是初级命中。 从各淘选子库中获得初级命中， 并对所有初级命中测序， 8305-LCDR3 文库除外， 其 中对 65 个初级命中最好的 17 个测序。在 261 个初级命中中鉴定了共 173 条独特序列。可 鉴定来自所有亲本 Fabs( 除了 MOR08598) 的衍生物。从亲本 MOR08552 和 MOR08599 中没有 鉴定到 HCDR2 成熟的衍生物。
     选择亲和力优化的 Fabs 用于蛋白质纯化
     将独特的初级命中挑取到微孔培养板中， 并用于微量表达 Fab。Fab 裂解物用于第 二轮筛选中， 在捕获 ELISA 中检测与人 C3b、 cyno C3b 的结合、 在捕获 ELISA 中检查与对抗 靶标 C3d 和 C5 的交叉反应性， 并进行反筛。通过筛选的克隆继续用于研究。目的是从各亲 本中大规模表达并纯化大约 12 种衍生物。在多于 12 种衍生物通过第二轮筛选的情况下，
     用于蛋白质纯化的选择基于序列变异性。以下段落详细描述了各淘选子库的选择方法。
     已经从亲本 MOR08305 中鉴定了在 HCDR2 中成熟的 23 个独特克隆， 和在 LCDR3 中成 熟的 11 个克隆。 21/23HCDR2 成熟的克隆通过了反筛， 并且 18/21 与人 C3b 很好地结合。 但仅 1/18 克隆与 cyno C3b 显示很好的结合。选择该克隆 (MOR09124) 用于大规模纯化。根据序 列变异性选择额外的 5 个克隆用于大规模纯化。纯化对 MOR09122 不起作用。3/11LCDR3 成 熟的克隆不经过反筛， 但 2/3 包括在大规模纯化中 (MOR09130 和 9131)， 因为它们在人 C3b 上的高结合信号暗示了低亲和力， 其反过来可导致在血清上的残余结合。纯化对 MOR09132 不起作用。
     已经从亲本 8552 中鉴定了 16 个 LCDR3 成熟的衍生物。根据上文描述的相似标准 选择 7/16 的衍生物用于大规模纯化。但对于它们全部， 纯化均失败了。因此， 所有剩余 9 种衍生物进行大规模纯化。纯化仅对 2/9(MOR09308 和 9313) 起作用。
     已经从亲本 MOR08555 中鉴定到了在 HCDR2 中成熟的 1 个独特克隆， 和在 LCDR3 中 成熟的 3 个独特克隆。因为总共仅有 4 种衍生物， 决定全部纯化它们， 不管它们在第二轮筛 选中的行为。
     已经从亲本 MOR08599 中鉴定到了在 LCDR3 中成熟的 25 个独特克隆。它们中的大 多数在第二轮筛选过程中进行的所有测试中表现良好。 用于大规模纯化的克隆的选择基于 序列变异性。
     已经从亲本 MOR08653 中鉴定到了在 HCDR2 中成熟的 25 个独特克隆， 和在 LCDR3 中 成熟的 10 个独特克隆。各亚组中仅 1 个在反筛中表现良好。这些克隆 (MOR09198 和 9202) 继续用于研究。其它克隆的选择基于序列变异性。
     已经从亲本 MOR08672 中鉴定到了在 HCDR2 中成熟的 5 个独特克隆， 和在 LCDR3 中 成熟的 29 个独特克隆。仅 1/5HCDR2 成熟的克隆通过反筛， 并继续用于研究 (MOR09139)。 选择了 2 个额外的 HCDR2 成熟的克隆。纯化仅对 MOR09137 起作用。大多数 LCDR3 成熟的 克隆在第二轮筛选中表现良好。这些克隆的选择基于序列变异性。
     已经从亲本 MOR08675 中鉴定到了在 HCDR2 中成熟的 7 个独特克隆， 和在 LCDR3 中 成熟的 17 个独特克隆。1/7HCDR2 成熟的克隆显示仅与人和 cyno C3b 的弱结合， 并且被排 除在外。在剩余的 6 个克隆中， 仅 3 个不含有潜在的糖基化位点， 并进行大规模纯化。在选 择中包括含有潜在的糖基化位点的 2 个额外克隆。大多数 LCDR3 成熟的克隆在第二轮筛选 中表现良好。这些克隆的选择基于序列变异性。
     选择亲和力优化的 Fabs 继续研究
     考虑了先前部分中给出的所有可用数据， 包括未显示的与亲和力优化的 Fabs 的 表征相关的数据 ( 例如， 结合亲和力、 溶血的抑制、 C3b 沉积的抑制 ) 后， 选择最佳 Fabs 继续 研究。选择由 22 个成熟的 Fabs 组成， 其来自 4 种不同的亲本抗体。表 5 概述了所选 Fabs 的关键特征。
     表5： 被选择用于继续研究的 22 个成熟的 Fabs 的关键特征
    优化的 Fabs 的 IgG 转化以及在 IgG 水平上的杂交克隆
     将所有 8 个亲本 Fabs、 几个成熟的 Fabs 和具有期望谱的几个成熟修复 ( 去除潜在 糖基化位点的 )Fabs 亚克隆到人 IgG 形式中。
     通过用轻链和重链构建体的组合转染细胞完成 IgG 水平上的杂交克隆。因为 MOR09124 是鉴定到的唯一 HCDR2 成熟的克隆， 所以杂交克隆仅对各家族 (MOR08305 衍生 物 ) 是可能的， 其中 MOR09121 的重链与其它成熟家族成员的轻链组合。为杂交克隆给出了 新的 MOR 号， 其概述于表 8 中。
     表8： 杂交克隆抗体的 MOR 号。
    
     MOR0 9395 9396 9397 9398 9399 9400
     类型 杂交克隆 杂交克隆 杂交克隆 杂交克隆 杂交克隆 杂交克隆 MOR0 的重链 9124 9124 9124 9124 9124 9124 MOR0 的轻链 9128 9129 9130 9131 9255 9256在上述亲和力成熟的 Fabs、 修复的 Fabs( 去除糖基化位点的 )， 和杂交克隆的 Fabs 中， 根据此处描述的方法测定 Fabs 9124、 9397、 9398、 9136、 9141、 9373 和 9423 的结合特征。表 9 概述了这些 Fabs 的结合亲和力、 功能潜能和补体因子结合的抑制。
    在下文详细描述了用于测定在表 8 中概述的 Fabs 的结合亲和力和功能性质的方法。如从表 8 中的数据可以看出， 本发明的 Fab 片段能够以低于或等于 100pM， 在许多情况 下以低于或等于 10pM 的亲和力结合人和猕猴 C3b。此外， Fab 片段以低于或等于 100nM， 在 大多数情况下低于或等于 50nM 的 IC50 显示对人和猕猴 C3b 的功能潜能。
     实施例 4IgG 形式的 C3b 结合子的产生和表征
     IgGs 的种系化
     通过 Geneart(Geneart AG， Regensburg， Germany) 将编码轻链和重链的免疫球蛋 白可变区的 pM2 表达载体中的区域种系化并进行优化， 以匹配种系化序列， 避免不适合在 哺乳动物细胞中表达的密码子， 并避免隐藏的剪接位点。 将所有重链的 N 末端 QVQ 变成 EVQ， 因为末端 Q 可能形成 pyroglutamine。选择来自各亲本家族的抗体， 用于种系化 / 优化。简 言之， 如下在 IgG 形式中种系化并表达抗体。
     转化成 IgG
     为了表达全长免疫球蛋白， 将 Fab 重链 (VH) 和轻链 (VL) 的可变结构域片段从 Fab 表达载体亚克隆到 IgG1 表达载体中。限制酶 MfeI 和 BlpI 用于将 VH 结构域片段亚克隆到 2_h_IgG1AA 中， 其中 234 和 235 位上的亮氨酸突变成丙氨酸来消除 FcRγ 结 合并减弱效应功能。经 EcoRV 和 BsiWI 位点将 VL 结构域片段亚克隆至 Igκ 中， 而使用 EcoRV 和 HpaI 完成亚克隆到
    2_h_2_h_Igλ2 中。人 IgG 的瞬时表达和纯化
     用 1 ∶ 1 的比例的 IgG 重链和轻链表达载体 DNA 转染真核 HKB11 和 HEK293 细胞。 在转染后 3 天或 7 天收集细胞培养物上清液， 并进行标准的 A 蛋白亲和层析 (MabSelect SURE， GE Healthcare)。除非另有说明， 缓冲液交换成 1x Dulbcecco ′ s PBS(pH 7.2， Invitrogen) 并无菌过滤样品 (0.2μm)。 在 SDS-PAGE 中或通过使用 Agilent BioAnalyzer 分析变性的还原和非还原条件下的 IgG 的纯度， 并通过 HP-SEC 分析天然状态中 IgG 的纯 度。
     为种系化的抗体给出了新的 MOR 号， 如表 10 中所示。
     表 10 ： 种系化的抗体的 MOR 号。
     种系化抗体的 MOR0 9555 9556 9609 9610 9611 9612 祖先抗体的 MOR0 9140 9124 9136 9141 9397 9398114CN 102459334 A 9613 9674 9675
    说明书9314 9373 9423111/123 页当然， 进一步表征了种系化抗体 9556、 9611、 9612、 9609、 9610、 9674 和 9675。
     亲和力测定
     C3bneo 抗体通过结合 C3b 分子上的新表位阻断补体激活。C3b 上的新表位也是血 浆中其它丰富补体蛋白的结合位点， 例如因子 H、 因子 B 和因子 P， 其通过旁路途径调节补体 激活。C3bneo 抗体因此应该具有高的亲和力， 以与这些丰富补体蛋白竞争， 来通过阻断这 些补体蛋白结合 C3b 而有效阻断补体激活。高亲和力为实现低治疗剂量所需。例如， 血浆 中因子 H 的浓度在 3μM 左右， 因子 H 与 C3b 的结合亲和力 (Kd) 是～ 30nM ； 因子 H 浓度比 其 Kd 高 100 倍。当 C3bneo 抗体与因子 H 竞争结合 C3b 时， 其需要 10pM Kd C3bneo 抗体的 1nM 浓度 ( 高于其 Kd100 倍抗体浓度 ) 来抑制因子 H 结合 C3b 的 50％。等于或低于 10pM Kd C3bneo 抗体因此会以适当的治疗抗体剂量实现旁路途径补体激活的有效阻断。因此， 选择的本发明的抗体分子具有低于或等于 65pM， 优选低于或等于 10pM 范围的高结合亲和 力。例如， 选择本发明的抗体分子以对 C3b 具有 9、 8、 7、 6、 5、 4、 3 或 2pM 或更低的结合亲和 力 ( 即， 低于 2pM 的更高亲和力 )。
     如下通过 Biacore 和溶液平衡滴定 (SET) 测定种系化的 IgG 抗体结合 C3b 的亲和 力。
     Biacore 测定
     使用 CM5 传感器芯片 (GE Healthcare， BR-1005-30) 在 25℃下以 BIAcore T100(GE Healthcare) 完 成 Biacore 动 力 学 实 验。 运 行 缓 冲 液 是 HBS-EP(+)(GE Healthcare， BR-1001-88)。简言之， 进行以下步骤以测定结合亲和力。
     ●制备抗 C3d IgG 固定化的传感器芯片 ： 根据供应商的说明书 (GEHealthcare， BR-1000-50)， 通过使用氨基偶联方法， 以 10ul/ 分钟的流速在 CM5 芯片上将兔抗 C3d 多 克隆抗体 (Abcam， ab-15981)( 在乙酸盐 pH5.0 偶联缓冲液中 50ug/ml(GE Healthcare， BR-1003-51)) 偶联到两个不同的流动池 (Fc1 和 2) 上 600 秒。最终固定化的水平将＞ 7000RU。
     ●在第二个流动池上捕获 C3b ： 在第二个流动池上以 10ul/ 分钟注射运行缓冲液 中的 1ug/ml 的 C3b， 以对 Fab 而言达到～ 70RU 的捕获水平， 或对 IgG 动力学分析而言达到～ 20RU 的水平。
     ●在两个流动池上注射不同浓度的抗 C3b Fab 或 IgG ： 在两个流动池 (Fc1 和 2) 上 以 60ul/ 分钟注射抗 C3b 溶液 ( 在运行缓冲液中 0.3125nM ～ 10nM ； 1 ∶ 2 系列稀释 )240 秒。
     ●解离 ： 在两个流动池上以 60ul/ 分钟注射 HBS-EP(+) 运行缓冲液， 以监测 C3b 与 抗 C3b Fab/IgG 之间的解离。对于 5nM 和 2.5M Fab/IgG 浓度， 解离时间设置为 2400 秒， 而 对于包括另一 5nM Fab/IgG 浓度的所有其它浓度设置为 300 秒。
     ●再生 ： 在两个流动池上以甘氨酸 -HCl pH1.6( 从甘氨酸 -HCl pH1.5 和甘氨酸pH2.0， GE Healthcare 制备 )+0.05％ P20 表面活性剂 (GEHealthcare， BR-1000-54)， 60ul/ 分钟的流速在各循环结束时进行再生 40 秒， 两次。
     ●动力学分析 ： 以 BIAevaluation 1.1 软件通过应用 1 ∶ 1 结合模型获得动力学 速率常数， 其中局部拟合 Rmax 值。
     在下文表 11 中显示了 Biacore 结合动力学测定的结果。如所示， 此处所述的抗体 对人 C3b 显示高亲和力结合， KD 值通常低于或等于 10pM， 并在许多情况下低于或等于 5pM。 这些抗体对 cyno C3b 也显示非常高的亲和力 ( 低于 200pM 的结合亲和力 )。
     表 11
    SET 测定
     对于通过溶液平衡滴定 (SET) 对 KD 的测定， 使用抗体蛋白质的单体级分 ( 至少 90％的单体含量， 通过分析 SEC 分析 ； Superdex75(AmershamPharmacia) 用于 Fab 或 Tosoh G3000SWXL(Tosoh Bioscience) 用于 IgG)。
     基本如参考文献中所述进行溶液中的亲和力测定 (Friguet 等 305-19)。 为了提高 SET 方法的灵敏度和准确度， 从经典 ELISA 转换成基于 ECL 的技术 (Haenel 等， 2005)。 TM
     根据制造商的说明书利用 MSD Sulfo-TAG NHS-Ester(Meso ScaleDiscovery， Gaithersburg， MD， USA) 标记 1mg/ml 山羊抗人 (Fab)2 片段特异性抗体 (Dianova)。
     在聚丙烯微量滴定板中进行实验并以含有 0.5％ BSA 和 0.02％ Tween20 的 PBS pH 7.4 作为测定缓冲液。以比预期 KD 高至少 10 倍的浓度开始， 以 2n 系列稀释未标记的人 C3b 或 cyno C3b。没有抗原的孔用于测定 Bmax 值 ； 具有测定缓冲液的孔用作测定背景。加入 例如 10pM Fab(60μL 终体积中的终浓度 ) 后， 在室温下过夜温育混合物。所应用的 Fab 浓 度与预期 KD 相似或低于预期 KD。
     用 PBS 中 0.05μg/ml 人 C3b(30μL/ 孔 ) 过夜包被标准 MSD 平板， 并用 PBS 中的 3％ BSA 封闭 1 小时。用测定缓冲液洗涤平板后， 将平衡的样品转移到那些平板中 ( 每孔 30μL) 并温育 20 分钟。洗涤后， 向 MSD 平板中加入 30μL/ 孔最终稀释 1 ∶ 1500 的 MSD 磺
     基 - 标签标记的检测抗体 ( 山羊抗人 (Fab)2)， 并在室温下 Eppendorf 摇床上 (700rpm) 温 育 30 分钟。
     洗涤平板并加入含表面活性剂的 30μL/ 孔 MSD Read 缓冲液 T 后， 使用 Sector 成 像仪 6000(Meso Scale Discovery， Gaithersburg， MD， USA) 检测电化学发光信号。
     用 XLfit(IDBS) 软件， 应用定制的拟合模型评估数据。对于 Fab 分子的 KD 测定， 使用以下拟合模型 ( 根据 Haenel 等， 2005， 根据 Abraham 等改进 ) ：
    [Fab]t ： 应用的总 Fab 浓度
     X： 应用的总可溶性抗原浓度 ( 结合位点 )
     Bmax ： 没有抗原的 Fab 的最大信号
     KD ： 亲和力
     原则上， 应用相同的方案来测定 IgG 分子的 KD 值， 除以下不同 ： 向稀释系列的抗原 中加入完整 IgG 分子， 而不是 Fab 分子， 并且在室温下平衡过夜。随后， 如上所述处理样品。
     对于数据评估， 即 IgG 分子的 KD 测定， 使用 IgG 的以下拟合模型 ( 根据 Piehler 等， 1997 改进 ) ：
    [IgG] ： 应用的总 IgG 浓度
     x： 应用的总可溶性抗原浓度 ( 结合位点 )
     Bmax ： 没有抗原的 IgG 的最大信号
     KD ： 亲和力
     尽管没有特定地显示， SET 数据验证了此处所述的抗体是人 C3b 的高亲和力结合 子， 其结合亲和力在低于或等于 10pM， 在许多情况下低于或等于 5pM 的范围内。同样地， 此 处描述的抗体以高亲和力结合猕猴 C3b， 通常以低于或等于 200pM 的 KD 结合猕猴 C3b。
     C3b 抗体显示对 C3 的显著结合选择性
     检查 C3b 抗体， 以测定它们对 C3b 的结合相对于 C3b 前体 C3 是否是选择性的。简 言之， 通过进行以下步骤测定对 C3b 的结合选择性。用碳酸盐缓冲液中 2μg/ml 的抗 C3d 兔单克隆抗体 (abcam 17453) 以 100μl/ 孔包被 Maxisorp 平板 Nunc(442404)。密封平 板并在 4 ℃下温育过夜。抽干平板并用 PBS/0.5 ％ Tween 20 洗涤 3 次。用稀释剂 (PBS， 4％ BSA Fraction V(Fisher ICN16006980)， 0.1％ Tween 20(Sigma P1379)， 0.1％ Triton X-100(Sigma P234729)) 封闭平板， 并在室温下温育 2 小时或在 4℃下温育过夜。然后用 PBS/0.5％ Tween 20 洗涤平板一次。 在稀释剂中以 1μg/ml 稀释纯化的 C3b( 补体技术 A114 lot 21) 和 C3( 补体技术 A113c)， 并在每孔中接种 100μl。在室温下温育 1 小时。然后用 PBS/0.5％ Tween 20 洗涤 3 次。以 100nM 稀释 Fabs， 随后在稀释剂中稀释 ( 或更高浓度 )， 并在每孔中接种 100μl。在室温下温育 1 小时。用 PBS/0.5％ Tween 20 洗涤平板 3 次。在
     稀释剂中加入 100μl/ 孔的 1 ∶ 400 的抗组氨酸 HRP 单克隆检测抗体， 并在室温下温育 1 小时。然后用 PBS/0.5％ Tween 20 洗涤 4 次。加入 100μl 的 TMB 底物 (Pierce 34028)， 并在室温下温育高达 5 分钟。向各孔中加入 50μl 的终止溶液 (2N 硫酸 )， 并在 450nm 处读 取平板， 并在 570nm 处校正塑料读数。
     如图 1 所示， C3b 抗体对 C3 结合具有选择性。抗体实现了相对于 C3 结合高 1000 倍的 C3b 结合选择性。尽管图 1 显示了对抗体 9556 的结合选择性的实例， 1000 倍的结合选 择性是此处公开的七种 IgG C3b 抗体具有的性质。
     C3b 抗体抑制备选补体途径
     为了证明抗 C3b 抗体抑制备选补体途径， 进行以下测定。
     溶血测定
     溶血测定是基本的功能测定， 其检测补体激活并已经用于评估抗人 C3b mAbs 和 Fab 分 子 阻 断 红 细 胞 (RBCs) 通 过 补 体 途 径 溶 解 的 能 力 (Evanset al.(1995).In vitro and in vivo inhibition of complement activity by asingle-chain Fv fragment recognizing human C5.Mol Immunol 32， 1183-1195 ； Thomas et al.(1996). Inhibition of complement activity byhumanized anti-C5 antibody and single-chain Fv.Mol Immunol 33， 1389-1401 ； Rinder et al.(1995).Blockade of C5a and C5b-9 generationinhibits leukocyte and platelet activation during extracorporeal circulation.J Clin Invest 96， 1564-1572)。简言之， 对于经典途径测定， 敏化的红细胞 用作通过血清中存在的补体蛋白质进行溶解的靶标。该测定对于高亲和力抗人 C3b mAbs 的表征和筛选是重要的。
     从 Rinder 等， (1995) 和 Thomas 等， (1996) 改进该方法。
     试剂 ：
     兔红细胞 (Rb RBCs)-Lampire， Cat#7246408
     人血清 -Novartis Blood Research Program ； 或 Cyno 血清 -AlphaGenesis
     明胶佛罗那缓冲液 (GVB)-Boston BioProducts， Cat#IBB-300
     EGTA-Boston BioProducts， Cat#BM-151
     MgCl2
     U 型底 96- 孔板 -Corning， Cat#3795
     平底 96 孔板 -Corning， Cat#3370
     NP-40-Sigma， Cat#74385
     方案 ：
     1. 洗涤 Rb RBCs 并在 GVB/EGTA/Mg++ 中调整至 8.33e7 细胞 /ml
     2. 向 96 孔圆底平板的孔中加入在 GVB 中稀释的 50μl Ab ； Ab 的浓度应该是期望 终浓度的 2 倍。
     3. 加入在含有 EGTA 和 Mg++ 的 GVB 中稀释的 50μl 血清。
     a. 制备对照孔 ： 血清 +0nM Ab， 0％溶解对照 ( 仅缓冲液 )、 100％溶解对照 (0.1％ NP-40)， 和血清、 缓冲液， 和 NP-40 对照。
     b. 如果对 10％血清检测 Ab， 使用 10mM EGTA 和 5mM Mg++( 最终 ) ； 如果对 50％血 清检测 Ab， 使用 15-30mM EGTA， 5mM Mg++( 最终 )。4. 在室温下温育 30 分钟。
     5. 向样品和对照孔中加入 30μl Rb RBCs ； 向空白孔中加入 30μl 缓冲液。 在 37℃ 下温育 30 分钟。
     6. 在 2000rpm 下离心平板 5 分钟。
     7. 收集上清液， 转移至平底平板中。
     8. 读取 OD415 和 OD570。计算％溶血 ：
    图 2 显示了抗 C3b 抗体在 10％人或猕猴血清中抑制溶血的能力的实例。 此处所述 的各 C3b 抗体以低于或等于 50nM 的 IC50 抑制溶血。
     相反， 当使用敏化的红细胞进行测定时， 为了检查经典补体途径的激活， 发现此处 所述的抗 C3b 抗体不激活经典补体途径 ( 数据未显示 )。
     C3b 沉积测定
     测定在旁路途径中补体 C3 的抑制剂活性的一种方法是测定其沉积在酵母多糖上 的分解产物 C3b。根据以下步骤进行这种基于 ELISA 的测定 ： 在 4℃下 Maxisorp 384- 孔 ELISA 平板 (Nunc 464718) 中用碳酸盐缓冲液， pH 9.6(Pierce Cat#28382) 中 25μl 的 1mg/ml Zymosan A(Sigma Z4250) 包被过夜。第二天， 抽吸酵母多糖包被的平板并用每孔 100μl 的 ELISA 封闭缓冲液， Synblock(AbD Serotec BUFO34C) 在室温下封闭 2 小时。在
    各反应中， 向补充 MgCl2 和 EGTA( 最终总的反应浓度为 1mM MgCl2 和 10mMEGTA) 的 10％血 清中加入在明胶佛罗那缓冲液 (Boston BioproductsIBB320-10mM Barbital， 145mM NaCl， 0.1％明胶， 0.5mM MgCl2， 10mMEGTA) 中系列稀释的抑制剂。 阳性对照不含有抑制剂， 而阴性 对照含有 25mM EDTA。通过在室温下温育 30 分钟允许混合物达到平衡。为了去除封闭缓冲 液， 抽吸平板并用 TBS/0.05％ Tween-20 洗涤一次。 向平板中加入每孔 25μl 含有抑制剂的 10％血清或对照， 并在 37℃下温育 30 分钟 ( 先前通过时间过程测定在酵母多糖上的 C3b 沉 积的线性范围内 )。30 分钟温育后， 用 TBS/0.05％ Tween-20 洗涤平板 3 次。为了检测酵母 多糖上的 C3b 沉积， 向平板中加入在含有 2％ BSA Fraction V(Fisher Cat# ICN16006980)、 0.1％ Tween20(Sigma Cat#P1379) 和 0.1％ TritonX-100(SigmaCat#P234729) 的 PBS 中根 据制造商稀释的鸡抗人 C3-HRP 缀合的多克隆抗体 (Immunology Consultants Laboratory， Inc.Cat#CC3-80P-1)， 并在室温下温育 1 小时。然后， 用 TBS/0.05％ Tween-20 洗涤平板 3 次， 然后加入 25μl 的 Ultra TMB 底物溶液 (Pierce Cat#34028.)。当孔中的溶液变蓝时， 用 15μl 的 2N 硫酸终止反应。使用 Spectromax 在 450nm 读取平板 (OD450-570nm 读数 )， 在 570nm 处为塑料平板进行校正。使用以下公式计算在酵母多糖上 C3b 沉积的百分比 ：
    图 3 显示了 C3b 抗体抑制 C3 产生为 C3b 的分解产物的能力的实例。显示各检测 抗体以至少低于或等于 10nM 的 IC50 抑制 C3b 沉积。
     MAC 沉积测定
     测定 C3b 抗体抑制备选补体途径的功能能力的另一种测定是测定抗体抑制产生 膜攻击复合体 (MAC) 的能力， 其位于 C3b 加工的下游。简言之， 以碳酸盐缓冲液， pH 9.5 中 1mg/ml 在平板上包被 Zymosan A(Sigma) 来激活旁路途径。Fabs 或 IgGs 各自与血清 (2％ 血清， 5mM MgCl2， 10mMEDTA) 预温育， 然后加入到平板中并在室温下温育过夜。 用 TBST 洗涤 平板 3 次后， 通过与抗 C5b-9-ALP(Diatec) 温育 1 小时， 然后用 TBST 洗涤 3 次， 并与补充有 2mM MgCl2 的 4- 甲基伞形酮磷酸酯 (Fisher) 温育 30 分钟来检测 MAC。用 0.2M EDTA 终止 反应， 并在 ex ＝ 355nm， em ＝ 460nm 处读取平板。计算各样品相对于基线 (EDTA 处理的人 血清 ) 和阳性对照 ( 人血清 ) 的 MAC 沉积的抑制， 并利用 PRISM 来产生 IC50 曲线。
     图 4 显示了示例性数据， 其证明 C3b 抗体抑制 MAC 沉积的能力， 因此表明抗体抑制 补体旁路。尤其是， 抗体以低于或等于 5nM 的 IC50 抑制 MAC 沉积。
     C3a 和 C5a 产生的抑制
     可用于测定 C3b 抗体抑制补体旁路的能力的另一种测定是测量 C3a 和 C5a 的产 生， 两者是旁路途径中 C3b 下游的激活产物。
     简言之， 由申请人开发了 C5a-des-Arg ELISA 来测定溶血过程中 C5a 的产生以证 实溶血测定中抑制性的抗体也抑制 C5 切割成 C5a 和 C5b。
     用 包 被 缓 冲 液 ( 碳 酸 氢 盐 pH 9.5-9.8) 中 1μg/ml 的 100μl/ 孔 小 鼠 抗 人 C5a-des-Arg(US Biologics) 包被 Maxisorp 平板， 并将其在 4℃温育过夜。用 PBST 洗涤 3 次后， 用 300μl/ 孔稀释剂 (Synblock， AbD Serotec) 在室温下封闭所述平板 2 小时。抽 出封闭溶液后， 以稀释剂稀释的 100μl 样品或标准品在室温下温育 1 小时。如下制备标准 品： 以 20ng/ml 标准品 (rC5a-des-Arg) 开始， 制备 1 ∶ 4 连续稀释液用于 7 点曲线。在稀 释液剂中以 1 ∶ 5 稀释溶血测定的样品 ( 溶血测定上清液应该储存在 -80℃， 直至用于 C5a ELISA)。中间用 PBST 洗涤平板 3 次。
     加入稀释剂中稀释的 100μl/ 孔的 0.4μg/ml 检测抗体 ( 生物素 - 山羊抗人 c5a， R&D Systems)， 并且在室温下温育 1 小时后， 加入 HRP 稀释剂 ( 聚 -HRP 稀释剂 ) 中 1 ∶ 5000 稀释的 100μl/ 孔 Strep-HRP( 聚 -HRP 链霉抗生物素蛋白 )30 分钟。用 PBST 洗涤 4 次 后， 加入 100μl/ 孔 TMB 底物 (UltraTMB 底物溶液 )5-10 分钟。用 50μl/ 孔终止溶液 (2N H2SO4) 终止反应。读取吸光度 (A450-A570) 并使用 SoftMax Pro 分析数据。
     同样地， 由申请人开发了 C3a-des-Arg ELISA 来测定溶血过程中的 C3a 产生， 以验 证在溶血测定中抑制性的抗体也抑制 C3 切割成 C3a 和 C3b。
     用 包 被 缓 冲 液 ( 碳 酸 氢 盐 pH 9.5-9.8) 中 1μg/ml 的 100μl/ 孔 小 鼠 抗 人 C3a-des-Arg neo(US Biologics) 包被 Maxisorp 平板， 并将其在 4℃温育过夜。用 PBST 洗 涤 3 次后， 用 300μl/ 孔稀释剂 (Synblock， AbD Serotec) 在室温下封闭所述平板 2 小时。 抽出封闭溶液后， 以稀释剂稀释的 100μl 样品或标准品在室温下温育 1 小时。如下制备标 准品 ： 以 1μg/ml 标准品 (rC3a-des-Arg) 开始， 制备 1 ∶ 3 连续稀释液用于 8 点曲线。在 稀释液剂以 1 ∶ 5 稀释溶血测定的样品 ( 溶血测定上清液应该储存在 -80℃， 直至用于 C5a ELISA)。中间用 PBST 洗涤平板 3 次。
     加入稀释剂中稀释的 100μl/ 孔的 10μg/ml 检测抗体 ( 生物素 - 小鼠抗人 c3a， Chemicon 和内部生物素化的 )， 并且在室温下温育 1 小时后， 加入 HRP 稀释剂 ( 聚 -HRP 稀释剂 ) 中 1 ∶ 5000 稀释的 100μl/ 孔 Strep-HRP( 聚 -HRP 链霉抗生物素蛋白 )30 分钟。用 PBST 洗涤 4 次后， 加入 100μl/ 孔 TMB 底物 (Ultra TMB 底物溶液 )5-10 分钟。用 50μl/ 孔终止溶液 (2NH2SO4) 终止反应。 读取吸光度 (A450-A570) 并使用 SoftMax Pro 分析数据。
     如图 5 所示， C3b 抗体能够通过抑制产生 C3a 和 C5a 阻断旁路途径驱动的补体激 活。更尤其是， 此处所述的 C3b 抗体如抑制 C3a 和 C5a 产生所测定以低于或等于 50nM 的 IC50 抑制旁路途径。
     C3b 抗体抑制体外 C3 转化酶活性
     基于 C3 水空转 (Tick-over) 转化酶凝胶的测定
     在该测定中， Fabs/IgGs 与 10％的含 C3- 水的 C3 预温育， 以便当加入因子 D 和因 子 B 时， 可以测量通过 C3 水空转的转化酶活性。以以下终浓度使用蛋白质试剂 ： 天然因子 B(100nM)、 因子 D(40nM)、 C3(400nM)、 MgCl(5mM) 和 Fab/IgG 1000nM， 随后进行稀释。在 96 孔聚丙烯平板中， 加入多种稀释度的 Fabs/IgGs( 包括 PBS 对照样品 )。为此， 加入 C3 并在 室温下温育 1 小时。然后将因子 B、 因子 D 和 MgCl 的储存混合物加入到 1XPBS 中。1 小时 温育后， 将适当量的反应混合物加入到每孔 Fab/IgG-C3 中。立即取 0 时间点， 加入 4X 样品 缓冲液， 并放置在 95℃。允许转化酶反应在室温下温育 15 分钟。然后取最后的时间点， 加 入 4X 样品缓冲液， 并放置在 95℃。在还原条件下 4-12％ Bis-Tris 凝胶上为各样品运行总 体积 ( 也可在省略因子 D 的单独反应中产生 0 时间点 )。
     基于 C3b 凝胶的转化酶测定
     设计该测定， 以便 Fabs/IgGs 与 C3b 预温育。 温育后， 将其加入到 C3 反应混合物中 以检测转化酶活性。以以下终浓度使用蛋白质试剂 ： 天然 C3b(32nM)、 天然因子 B(100nM)、 因子 D(40nM)、 C3(400nM)、 MgCl(5mM) 和 Fab/IgG 1000nM， 随后进行稀释。在 96 孔聚丙烯 平板中， 加入适当体积的多种稀释度的 Fabs/IgGs( 包括 PBS 对照样品 )。为此， 每孔加入 适当量的 C3。在 37℃下温育 1 小时。然后将因子 B、 因子 D 和 MgCl 的储存混合物加入到 1XPBS 中。1 小时温育后， 向储存混合物中加入 C3， 并将适当量的反应混合物立即加入到各 孔 Fab/IgG-C3 中。立即取 0 时间点， 加入 4X 样品缓冲液， 并放置在 95℃。允许转化酶反应 在室温下温育 15 分钟。然后取最后的时间点， 加入 4X 样品缓冲液， 并放置在 95℃。在还原 条件下 4-12％ Bis-Tris 凝胶上为各样品运行总体积 ( 也可在省略因子 D 的单独反应中产 生 0 时间点 )。
     进行基于 C3 转化酶凝胶的测定
     设计该测定， 以便使用 C3b、 因子 B 突变体和因子 D 产生稳定的转化酶。 为此， 加入 Fabs/IgGs 并允许温育。 然后加入 C3， 并取样品进行分析。 C3 不能形成转化酶。 以以下终浓 度使用蛋白质试剂 ： 天然 C3b(32nM)、 天然因子 B 突变体 (16nM)、 因子 D(40nM)、 C3(400nM)、 MgCl(5mM) 和 Fab/IgG 1000nM， 随后进行稀释。在 96 孔聚丙烯平板中， 加入 c3b、 因子 B、 因 子 D 和 MgCl， 并在 37℃下温育 10 分钟。然后加入适当稀释的 fabs/IgGs(PBS 对照 ) 并在 37℃下温育 20 分钟。然后加入 C3 并在室温下温育 15 分钟。立即取 0 时间点， 加入 4X 样 品缓冲液， 并放置在 95℃。允许转化酶反应在室温下温育 15 分钟。然后取最后的时间点， 加入 4X 样品缓冲液， 并放置在 95℃。在还原条件下 4-12％ Bis-Tris 凝胶上运行各样品的 总体积 ( 也可在省略因子 D 的单独反应中产生 0 时间点 )。
     如图 6 中所示， C3b 抗体抑制旁路途径体外 C3 转化酶活性。 图 6A 显示了 SDS-PAGE凝胶， 其显示了空转转化酶活性的抑制。图 6B 显示了 6A 凝胶中对 C3b 产生的抑制的定量。 图 6C 显示了抗 C3b 抗体抑制预形成的 C3 转化酶活性。
     C3b 抗体体外抑制 C5 转化酶活性
     为了进一步表征抗 C3b 抗体抑制补体旁路的能力， 检查抗体抑制 C5 转化酶激活 的能力。简言之， 通过与纯化的 C3 和胰蛋白酶 (Sigma) 在室温下温育 10 分钟在 Zymosan A(Sigma) 上沉积 C3b。将酵母多糖离心并去除上清液， 通过加入纯化的 C3、 fB、 fD 和 NiCl2 扩增 C3b。重复扩增步骤， 直至在酵母多糖上达到想要密度的 C3b。
     Fabs/IgGs 与 Zymosan-C3b 在 室 温 下 预 温 育 45 分 钟。 加 入 纯 化 的 蛋 白 质 (Complement Tech) ： C5(100nM)、 C6(100nM)、 fB(500nM)、 fD(160nM) 和 5mM NiCl2。反应在 37℃下温育 5 中， 并通过 1 ∶ 10 稀释到冰冷的 GVB+10mM EDTA 中来终止反应。使用溶血测 定， 通过向 chRBCs(8E7/ml) 和 2％人血清中加入反应产物， 并在 37 ℃下温育 30 分钟来定 量 C5bC6 水平。在 2000rpm 下将细胞离心 5 分钟， 并在 A415/A570 处读取上清液。纯化的 C5bC6 蛋白质 (Complement Tech) 用作标准曲线。
     如图 7 所示， C3b 抗体抑制旁路途径体外 C5 转化酶活性。
     通过 C3b 抗体阻断补体因子结合 C3b
     进行以下实验， 以测定抗 C3b 抗体抑制 C3b 与补体旁路其它成员之间相互作用的 能力， 并因此证明了抗体抑制补体旁路的可能机制。简言之， 在室温下 48 小时温育期间使 用 AminoLink Reductant(Pierce) 将纯化的 C3b 和 fP 缀合到未缀合的受体或供体珠子 (PerkinElmer) 上。使用羧甲基胺半盐酸盐 (Aldrich) 淬灭珠子， 通过在 13000rpm 下离 心并用 0.1M TBST 洗涤三次进行纯化。在室温下使用 20 倍摩尔过量的 NHS 生色的生物素 (Pierce) 在 30 分钟温育期间生物素化纯化的 fB(D24G/N260D) 和 fH， 并使用 Zeba 0.5ml 脱盐柱 (Pierce) 进行纯化。
     对于 C3b-C3b 和 C3b-fP 的近似性， Fabs 或 IgGs 分别与 C3b 受体珠子 (20μg/ml) 在室温下预温育 60 分钟。然后加入 C3b- 供体珠子或 fP- 供体珠子 (20μg/ml)， 并在读数 前在室温下温育平板过夜。 对于 C3b-fB 和 C3b-fH 的近似性， 抗体与 C3b- 受体珠子 (20μg/ ml) 在室温下预温育 60 分钟。然后加入生物素化的 fB(D24G/N260D) 或 fH， 并在室温下温 育 60 分钟。然后加入 SA- 供体珠子 (20μg/ml)， 并在读数前在室温下过夜温育平板钟。在 BMGPherastar 上读取平板 (ex ＝ 680， em ＝ 520-620)。
     如图 8 所示， C3b 抗体阻断了几种补体因子与 C3b 的结合。如图中所见， 抗 C3b 抗 体利用不同的作用机制来阻断补体旁路。图 8A 显示了通过 C3b 抗体抑制因子 B 结合 C3b。 图 8B 显示了通过 C3b 抗体抑制因子 P 结合 C3b。图 8C 显示了通过 C3b 抗体抑制因子 H 结 合 C3b。图 8D 显示了通过 C3b 抗体抑制 C3b-C3b 二聚体形成。
     C3b 抗体不与人 C3d 或人 C5 交叉反应
     检测抗 C3b 抗体与人 C3d 和 C5 的交叉反应性。
     用于检测与人 C3b、 人 C3d 或 cyno C3b 的结合的 EILSAs 中的捕获抗体是针对 C3d 蛋白质兔多克隆抗人 C3d Ab， Abcam) 的抗体， 其为 C3b 的亚结构域。用在 PBS 中稀释至 2μg/ml 的捕获抗体填充 Maxisorp 平板的孔。密封平板并在 4℃下温育过夜。为了检测 Fabs 与 C5 的结合， 捕获抗体是以 5μg/ml 的终浓度使用的抗 C5 抗体 (US Biologicals)。
     第二天， 通过加入 PBST/5％奶粉封闭平板上剩余的结合位点。平板在室温下温育1 小时， 然后用 PBST 洗涤 2 次。以在 PBST/5％奶粉中稀释的 2.5μg/ml 的终浓度加入 C3b。 平板在室温下温育 1 小时， 然后用 PBST 洗涤 3 次。制备 Fabs 的系列稀释， 然后加入到封闭 的平板中。平板在室温下温育 1-2 小时， 然后用 PBST 洗涤 3 次。
     对于 Fabs 的检测， 加入抗 HIS AP- 缀合的抗体 (Invitrogen， 46-0284)， 平板在室 温下温育 1 小时， 然后用 PBST 洗涤 5 次。根据制造商的说明书使用荧光底物 AttoPhos。在 Tecan GENios Pro 平板读数器上测定荧光。
     分别在图 9 和 10 中显示了来自这些实验的 C3d 和 C5 的结果。如所示， C3b 抗体 不结合 C3d 或 C5。
     C3b 抗体等同地识别 iC3b 和 C3c
     为了测定此处所述的抗 C3b 抗体是否可以结合补体途径组分 iC3b 和 C3c， 进行 以下步骤 ： 直接向 Coat Maxisorp 平板 Nunc(442404) 以每孔 100μl 加入碳酸盐缓冲液中 的 2μg/ml iC3b( 补体技术 A115)、 C3d( 补体技术 A117) 或 C3c( 补体技术 A116)。密封 平板并在 4℃下温育过夜。抽吸平板并用 PBS/0.5％ Tween 20 洗涤 3 次。以稀释剂 (PBS， 4％ BSA Fraction V(Fisher ICN16006980)， 0.1％ Tween 20(Sigma P1379)， 0.1％ Triton X-100(Sigma P234729)) 封闭平板， 并在室温下温育 2 小时或在 4℃下温育过夜。然后用 PBS/0.5％ Tween 20 洗涤平板 1 次。以 100nM 稀释 Fabs， 随后在稀释液中稀释 ( 或如果需 要， 更高浓度 )， 并在每孔中接种 100μl。在室温下温育 1 小时。用 PBS/0.5％ Tween 20 洗涤平板 3 次。在稀释液中加入 100μl/ 孔的 1 ∶ 400 的抗组氨酸 HRP 单克隆检测抗体， 并在室温下温育 1 小时。然后用 PBS/0.5％ Tween 20 洗涤 4 次。加入 100μl 的 TMB 底物 (Pierce 34028)， 并在室温下温育高达 5 分钟。 向各孔中加入 50μl 的终止溶液 (2N 硫酸 )， 并在 450nm 处读取平板， 并在 570nm 处校正塑料平板读数。
     如图 11 中所示， C3b 抗体与 iC3b 和 C3c 交叉反应。
     物种交叉反应性
     为了测定除了人和猕猴， 此处所述的抗 C3b 抗体是否结合来自其它物种的 C3b， 如 上文所述进行溶血测定。用于各物种的血清浓度如下 ： 10％大鼠血清 ； 20％兔血清 ； 10％猪 血清 ； 20％小鼠血清 ； 10％豚鼠血清 ； 和 10％狗血清。如图 12 中所示， C3b 抗体能够与几种 物种交叉反应， 所述物种包括大鼠、 兔、 猪、 小鼠和豚鼠。
     Fab 形式的 C3bneo 结合子
     除了上文描述的全长 IgG 形式的抗 C3b 抗体， 相同的可变域用于构建 Fab 形式的 抗原结合片段。评估抗 C3b Fabs， 以根据上文描述的方法测定其结合特征。表 11 概述了亚 组 Fabs 的补体因子结合的结合亲和力、 功能潜能和抑制。
    
    本发明的实施方案 本发明包括， 但不限于以下实施方案 ：1. 分离的抗体或其抗原结合片段， 其特异性结合人或猕猴补体 C3b 蛋白， 其中所 述抗体以低于或等于 100pM 的 KD 结合人 C3b。
     2. 前述段落中的分离的抗体或其抗原结合片段， 其中所述抗体或其抗原结合片段 也以低于或等于 250pM 的 KD 结合猕猴 C3b。
     3. 任何前述段落中的分离的抗体或其抗原结合片段， 其中所述抗体或其抗原结合 片段以低于或等于 10pM 的 KD 结合人 C3b。
     4. 任何前述段落中的分离的抗体或其抗原结合片段， 其中所述抗体或其抗原结合 片段以低于或等于 2pM 的 KD 结合人 C3b。
     5. 任何前述段落中的分离的抗体， 其中所述抗体如通过体外溶血测定法所测定以 低于或等于 65nM 的 IC50 抑制人补体旁路。
     6. 任何前述段落中的分离的抗体， 其中所述抗体如通过体外 C3b 沉积所测定以低 于或等于 50nM 的 IC50 抑制人补体旁路。
     7. 任何前述段落中的分离的抗体， 其中所述抗体如通过补体膜攻击复合体的沉积 所测定以低于或等于 5nM 的 IC50 抑制人补体旁路。
     8. 任何前述段落中的分离的抗体， 其中所述抗体如通过产生 C3a 和 C5a 所测定以 低于或等于 100nM 的 IC50 抑制补体旁路。
     9. 任何前述段落中的分离的抗体或其抗原结合片段， 其中所述抗体或其抗原结合 片段特异性结合人或猕猴的补体 C3b 蛋白， 并与表 1 中描述的抗体交叉竞争。
     10. 任何前述段落中的分离的抗体， 其中所述抗体是单克隆抗体。
     11. 任何前述段落中的分离的抗体， 其中所述抗体是人或人源化抗体。
     12. 任何前述段落中的分离的抗体， 其中所述抗体是嵌合抗体。
     13. 任何前述段落中的分离的抗体， 其中所述抗体是单链抗体。
     14. 任何前述段落中的分离的抗体， 其中所述抗体是 Fab 片段或 ScFv 片段。
     15. 任何前述段落中的分离的抗体， 其中所述抗体是 IgG 同种型。
     16. 任何前述段落中的分离的抗体， 其中所述抗体包括这样的构架， 其中氨基酸已 经替换到来自各人 VH 或 VL 种系序列的抗体构架。
     17. 任何前述段落中的分离的抗体， 其中所述抗体以比所述抗体结合 C3 的亲和力 高至少 1000 倍的亲和力结合 C3b。
     18. 任何前述段落中的分离的抗体或其抗原结合片段， 其中所述抗体或其抗原结 合片段包含选自 SEQ ID NOs ： 1、 15、 29、 43、 57、 71、 85、 99、 113、 127、 141、 155、 169 和 183 的重 链 CDR1 ； 选自 SEQ ID NOs ： 2、 16、 30、 44、 58、 72、 86、 100、 114、 128、 142、 156、 170 和 184 的重 链 CDR2 ； 和选自 SEQ ID NOs ： 3、 17、 31、 45、 59、 73、 87、 101、 115、 129、 143、 157、 171 和 185 的 重链 CDR3， 其中所述分离的抗体或其抗原结合片段结合补体蛋白 C3b。
     19. 任何前述段落中的分离的抗体或其抗原结合片段， 其中所述抗体或其抗原结 合片段包含选自 SEQ ID NOs ： 4、 18、 32、 46、 60、 74、 88、 102、 116、 130、 144、 158、 172 和 186 的 轻链 CDR1 ； 选自 SEQ ID NOs ： 5、 19、 33、 47、 61、 75、 89、 103、 117、 131、 145、 159、 173 和 187 的 轻链 CDR2 ； 和选自 SEQ ID NOs ： 6、 20、 34、 48、 62、 76、 90、 104、 118、 132、 146、 160、 174 和 188 的轻链 CDR3， 其中所述分离的单克隆抗体或其抗原结合片段结合补体蛋白 C3b。
     20. 任何前述段落中的分离的抗体或其抗原结合片段， 其中所述单克隆抗体还包含选自 SEQ ID NOs ： 4、 18、 32、 46、 60、 74、 88、 102、 116、 130、 144、 158、 172 和 186 的轻链 CDR1 ； 选自 SEQ ID NOs ： 5、 19、 33、 47、 61、 75、 89、 103、 117、 131、 145、 159、 173 和 187 的轻链 CDR2 ； 和 选自 SEQ ID NOs ： 6、 20、 34、 48、 62、 76、 90、 104、 118、 132、 146、 160、 174 和 188 的轻链 CDR3。
     21. 任何前述段落中的分离的抗体或其抗原结合片段， 其中所述抗体或抗原结合 片段包含选自 SEQ ID NOs ： 7、 21、 35、 49、 63、 77、 91、 105、 119、 133、 147、 161、 175 和 189 的重 链可变域序列， 还包括选自 SEQ IDNOs ： 8、 22、 36、 50、 64、 78、 92、 106、 120、 134、 148、 162、 176 和 190 的轻链可变域序列， 其中所述分离的抗体或其抗原结合片段结合补体蛋白 C3b。
     22. 任何前述段落中的分离的抗体或其抗原结合片段， 其中所述抗体或其抗原结 合片段包含与选自 SEQ ID NOs ： 7、 21、 35、 49、 63、 77、 91、 105、 119、 133、 147、 161、 175 和 189 的序列具有至少 95％序列同一性的重链可变域， 其中所述抗体结合 C3b。
     23. 任何前述段落中的分离的抗体或其抗原结合片段， 其中所述抗体或其抗原结 合片段包含与选自 SEQ ID NOs 8、 22、 36、 50、 64、 78、 92、 106、 120、 134、 148、 162、 176 和 190 的序列具有至少 95％序列同一性的轻链可变域， 其中所述抗体结合 C3b。
     24. 任何前述段落中的抗体或其抗原结合片段， 其中所述抗体或其抗原结合片段 还包含与选自 SEQ ID NOs 8、 22、 36、 50、 64、 78、 92、 106、 120、 134、 148、 162、 176 和 190 的序 列具有至少 95％序列同一性的轻链可变域。
     25. 任何前述段落中的分离的抗体或其抗原结合片段， 其中所述抗体或其抗原结 合片段包含选自 SEQ ID NOs 9、 23、 37、 51、 65、 79、 93、 107、 121、 135、 149、 163、 177 和 191 的 序列具有至少 95％序列同一性的重链， 其中所述抗体结合 C3b。
     26. 任何前述段落中的分离的抗体或其抗原结合片段， 其中所述抗体或其抗原结 合片段包含与选自 SEQ ID NOs 10、 24、 38、 52、 66、 80、 94、 108、 122、 136、 150、 164、 178 和 192 的序列具有至少 95％序列同一性的轻链， 其中所述抗体结合 C3b。
     27. 任何前述段落中的分离的抗体或其抗原结合片段， 其还包含与选自 SEQ ID NOs 10、 24、 38、 52、 66、 80、 94、 108、 122、 136、 150、 164、 178 和 192 的序列具有至少 95％序列 同一性的轻链。
     28. 药物组合物， 其包含任何前述段落的抗体或其抗原结合片段和药学上可接受 的载体。
     29. 分离的核酸， 其包含编码这样的多肽的序列， 所述多肽包含与选自 SEQ ID NOs ： 7、 21、 35、 49、 63、 77、 91、 105、 119、 133、 147、 161、 175 和 189 的序列具有至少 95％序列同 一性的重链可变域。
     30. 分离的核酸， 其包含编码这样的多肽的序列， 所述多肽包含与选自 SEQ ID NOs 8、 22、 36、 50、 64、 78、 92、 106、 120、 134、 148、 162、 176 和 190 的序列具有至少 95％序列同一性 的轻链可变域。
     31. 载体， 其包括前述段落的核酸。
     32. 分离的宿主细胞， 其包含编码任何前述段落的抗体或其抗原结合片段的重链 的重组 DNA 序列， 和编码任何前述段落的抗体或其抗原结合片段的轻链的第二条重组 DNA 序列， 其中所述 DNA 序列有效连接启动子， 并能够在宿主细胞中表达。
     33. 前述段落的分离的宿主细胞， 其中所述抗体是人单克隆抗体。
     34. 先前两段中的分离的宿主细胞， 其中所述宿主细胞是非人哺乳动物细胞。35. 治疗年龄相关性黄斑变性的方法， 其包括向需要治疗的受试者施用有效量的 包含前述段落的抗体或其抗原结合片段的组合物。
     36. 前述段落的方法， 其中所述受试者是人。
     37. 在受试者中抑制补体旁路的方法， 其包括向需要抑制的受试者施用有效量的 包含前述段落的抗体或其抗原结合片段的组合物。
     38. 前述段落的方法， 其中所述受试者是人。
     此处引用的所有专利、 专利申请和出版的参考文献以其整体引入作为参考。尽管 参考本发明的优选实施方案特别显示并描述了本发明， 但本领域技术人员应该理解的是， 其中可在形式和细节上进行多种改变， 但不背离所附权利要求包括的本发明的范围。127CN 102459334 A
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     本发明还提供抑制 C3 转变酶、 C4 转变酶和 C3b-C3b 二聚体形成的方法， 其包括使 C3b 与抗 C3b 抗体或其片段接触。
     本发明还包括分离的抗体或其抗原结合片段， 其包含与选自 SEQ IDNOs ： 1、 2、 3、 4、 5、 6、 15、 16、 17、 18、 19、 20、 29、 30、 31、 32、 33、 34、 43、 44、 45、 46、 47、 48、 57、 58、 59、 60、 61、 62、 71、 72、 73、 74、 75、 76、 85、 86、 87、 88、 89 和 90 的序列具有至少 80％、 85％、 90％， 以及高达至 少 95 ％的序列同一性的至少一个互补性决定区 (CDR) 序列， 其中所述抗体结合补体蛋白 C3b。
     本发明还包括分离的抗体或其抗原结合片段， 其包含选自 SEQ IDNOs ： 1、 2、 3、 15、 16、 17、 29、 30、 31、 43、 44、 45、 57、 58、 59、 71、 72、 73、 85、 86 和 87 的至少一个重链 CDR 序列， 其 中所述抗体结合 C3b。
     本发明还包括分离的抗体或其抗原结合片段， 其包含选自 SEQ IDNOs ： 4、 5、 6、 18、 19、 20、 32、 33、 34、 46、 47、 48、 60、 61、 62、 74、 75、 76、 88、 89 和 90 的至少一个轻链 CDR 序列， 其 中所述抗体结合 C3b。 本发明还包括分离的抗原结合多肽， 其包含选自 SEQ ID NOs ： 1、 15、 29、 43、 57、 71 和 85 的重链 CDR1 ； 选自 SEQ ID NOs ： 2、 16、 30、 44、 58、 72 和 86 的重链 CDR2 ； 和选自 SEQ ID NOs ： 3、 17、 31、 45、 59、 73 和 87 的重链 CDR3， 其中所述抗原结合多肽结合补体蛋白 C3b。
     本发明还包括抗原结合多肽， 其包含选自 SEQ ID NOs ： 4、 18、 32、 46、 60、 74 和 88 的 轻链 CDR1 ； 选自 SEQ ID NOs 5、 19、 33、 47、 61、 75 和 89 的轻链 CDR2 ； 和选自 SEQ ID NOs 6、 20、 34、 48、 62、 76 和 90 的轻链 CDR3， 其中所述抗原结合多肽结合补体蛋白 C3b。
     除了包括上文指出的重链 CDR 序列的抗原结合多肽外， 抗原结合多肽还包括选自 SEQ ID NOs ： 4、 18、 32、 46、 60、 74 和 88 的轻链 CDR1 ； 选自 SEQ ID NOs 5、 19、 33、 47、 61、 75 和 89 的轻链 CDR2 ； 和选自 SEQID NOs 6、 20、 34、 48、 62、 76 和 90 的轻链 CDR3。
     此处描述的抗体结合多肽以低于或等于 100pM， 优选低于或等于 10pM， 优选低于 或等于 2pM 的 KD 结合 C3b。此外， 优选地， 抗原结合多肽结合人和猕猴 C3b。
     本发明还包括调节 C3b 的方法， 其包括向需要调节的受试者施用有效量的抗体、 其抗原结合片段或此处描述的抗原结合多肽。
     任何上述抗体或其抗原结合片段可以是单克隆抗体或其抗原结合片段。
     定义
     除非另有定义， 此处所用的所有技术和科技术语具有本发明所属领域中普通技术 人员通常理解的相同意思。
     如此处所用的术语 “抗体” 包括完整抗体及其任何抗原结合片段 ( 即 “抗原结合部 分” ) 或单链。天然存在的 “抗体” 是包含通过二硫键相互连接的至少两条重 (H) 链和两条 轻 (L) 链的糖蛋白。每一重链包含重链可变区 ( 此处缩写为 VH) 和重链恒定区。所述重链 恒定区包含三个结构域， CH1、 CH2 和 CH3。每一轻链包含轻链可变区 ( 缩写为 VL) 和轻链恒 定区。所述轻链恒定区包含一个结构域 CL。VH 和 VL 区可进一步细分成高变区， 称为互补 决定区 (CDR)， 它们散布着称为构架区 (FR) 的更保守的区域。每一 VH 和 VL 由以下面顺序 从氨基末端到羧基末端排列的三个 CDR 和四个 FR 组成 ： FR1、 CDR1、 FR2、 CDR2、 FR3、 CDR3、
     本发明还包括抗原结合多肽， 其包含选自 SEQ ID NOs ： 4、 18、 32、 46、 60、 74 和 88 的 轻链 CDR1 ； 选自 SEQ ID NOs 5、 19、 33、 47、 61、 75 和 89 的轻链 CDR2 ； 和选自 SEQ ID NOs 6、 20、 34、 48、 62、 76 和 90 的轻链 CDR3， 其中所述抗原结合多肽结合补体蛋白 C3b。
     除了包括上文指出的重链 CDR 序列的抗原结合多肽外， 抗原结合多肽还包括选自 SEQ ID NOs ： 4、 18、 32、 46、 60、 74 和 88 的轻链 CDR1 ； 选自 SEQ ID NOs 5、 19、 33、 47、 61、 75 和 89 的轻链 CDR2 ； 和选自 SEQID NOs 6、 20、 34、 48、 62、 76 和 90 的轻链 CDR3。
     此处描述的抗体结合多肽以低于或等于 100pM， 优选低于或等于 10pM， 优选低于 或等于 2pM 的 KD 结合 C3b。此外， 优选地， 抗原结合多肽结合人和猕猴 C3b。
     本发明还包括调节 C3b 的方法， 其包括向需要调节的受试者施用有效量的抗体、 其抗原结合片段或此处描述的抗原结合多肽。
     任何上述抗体或其抗原结合片段可以是单克隆抗体或其抗原结合片段。
     定义
     除非另有定义， 此处所用的所有技术和科技术语具有本发明所属领域中普通技术 人员通常理解的相同意思。
     如此处所用的术语 “抗体” 包括完整抗体及其任何抗原结合片段 ( 即 “抗原结合部 分” ) 或单链。天然存在的 “抗体” 是包含通过二硫键相互连接的至少两条重 (H) 链和两条 轻 (L) 链的糖蛋白。每一重链包含重链可变区 ( 此处缩写为 VH) 和重链恒定区。所述重链 恒定区包含三个结构域， CH1、 CH2 和 CH3。每一轻链包含轻链可变区 ( 缩写为 VL) 和轻链恒 定区。所述轻链恒定区包含一个结构域 CL。VH 和 VL 区可进一步细分成高变区， 称为互补 决定区 (CDR)， 它们散布着称为构架区 (FR) 的更保守的区域。每一 VH 和 VL 由以下面顺序 从氨基末端到羧基末端排列的三个 CDR 和四个 FR 组成 ： FR1、 CDR1、 FR2、 CDR2、 FR3、 CDR3、
     FR4。重链和轻链的可变区含有与抗原相互作用的结合域。抗体的恒定区可介导免疫球蛋 白与宿主组织或因子， 包括免疫系统的多种细胞 ( 例如效应细胞 ) 和经典补体系统的第一 个组分 (Clq) 的结合。
     如此处所用， 术语抗体的 “抗原结合部分” 指完整抗体的一个或更多片段， 其保留 与给定抗原 ( 例如 C3b) 特异性结合的能力。可通过完整抗体的片段进行抗体的抗原结合 功能。术语抗体的 “抗原结合部分” 中包括的结合片段的实例包括 Fab 片段， 其为 VL、 VH、 CL 和 CH1 结构域组成的单价片段 ； F(ab)2 片段， 其为包含在铰链区通过二硫键连接的两个 Fab 片段的二价片段 ； 由 VH 和 CH1 结构域组成的 Fd 片段 ； 由抗体单条臂的 VL 和 VH 结构域 组成的 Fv 片段 ； 单结构域抗体 (dAb) 片段 (Ward 等， 1989Nature 341 ： 544-546)， 其由 VH 结 构域或 VL 结构域组成 ； 和分离的互补决定区 (CDR)。
     此外， 尽管 Fv 片段的两个结构域 VL 和 VH 由单独的基因编码， 但可使用重组方法， 通过人工肽接头将它们连接， 所述人工肽接头使得它们能够制备成单条蛋白质链， 其中 VL 和 VH 区域配对形成单价分子 ( 称为单链 Fv(scFv) ； 参阅例如 Bird 等， 1988 Science 242 ： 423-426 ； 和 Huston 等， 1988Proc.Natl.Acad.Sci.85 ： 5879-5883)。 此类单链抗体包括抗体 的一个或更多 “抗原结合部分” 。使用本领域技术人员已知的常规技术获得这些抗体片段， 并筛选所述片段， 以与完整抗体相同的方式使用所述片段。
     抗 原 结 合 部 分 也 可 掺 入 到 单 结 构 域 抗 体、 巨 型 抗 体 (maxibodies)、 微型抗体 (minibodies)、 胞内抗体、 双抗体、 三抗体、 四抗体、 v-NAR 和 bis-scFv( 参阅例如 Hollinger 和 Hudson， 2005， Nature Biotechnology， 23， 9， 1126-1136)。抗体的抗原结合部分可移植 到基于多肽如 III 型纤连蛋白 (Fn3) 的支架中 ( 参阅美国专利号 6,703,199， 其描述了纤连 蛋白多肽单抗体体 )。
     抗原结合部分可掺入到包含一对串联 Fv 区段 (VH-CH1-VH-CH1) 的单链分子中， 所述串联 Fv 区段与互补轻链多肽一起形成一对抗原结合区 (Zapata 等， 1995 Protein Eng.8(10) ： 1057-1062 ； 和美国专利号 5,641,870)。
     如此处所用， 术语 “亲和力” 指抗体与抗原在单个抗原位点上相互作用的强度。在 每一抗原位点中， 抗体 “臂” 的可变区与抗原在许多位点上通过弱的非共价力相互作用 ； 相 互作用越多， 亲和力越强。
     如此处所用， 术语 “亲合力” 指抗体 - 抗原复合物的总稳定性或强度的信息化量 度。其受三个主要因素控制 ： 抗体表位亲和力 ； 抗原与抗体两者的效价 ； 和相互作用部分的 结构排列。最终这些因素决定了抗体的特异性， 即特定抗原结合精确抗原表位的可能性。
     术语 “氨基酸” 指天然发生的和合成的氨基酸， 以及与天然发生的氨基酸以相似方 式起作用的氨基酸类似物和氨基酸模拟物。 天然发生的氨基酸是由遗传密码编码的那些氨 基酸， 以及稍后被例如羟脯氨酸、 γ- 羧基谷氨酸和 O- 磷酸丝氨酸修饰的那些氨基酸。 氨基 酸类似物指这样的化合物， 其与天然发生的氨基酸具有相同的基本化学结构， 即与氢结合 的 α 碳、 羧基、 氨基和 R 基团， 例如高丝氨酸、 正亮氨酸、 甲硫氨酸亚砜、 甲硫氨酸甲锍。此 类类似物具有修饰的 R 基团 ( 例如， 正亮氨酸 ) 或修饰的肽骨架， 但保留了与天然发生的氨 基酸相同的基本化学结构。 氨基酸模拟物指具有与氨基酸的一般化学结构不同结构的化合 物， 但它以与天然发生的氨基酸类似的方式起作用。
     如此处所用， 术语 “结合特异性” 指各抗体结合位点与仅一个抗原决定簇相互作用的能力。抗体的结合部位位于分子的 Fab 部分， 并从重链和轻链的高变区构建。抗体的结 合亲和力是单个抗原决定簇与抗体上单个结合部位之间反应的强度。 其为抗原决定簇与抗 体结合部位之间起作用的吸引力和排斥力的总和。
     两 个 实 体 之 间 的 特 异 性 结 合 表 示 平 衡 常 数 (KA) 为 至 少 1x107M-1、 108M-1、 109M-1、 1010M-1、 1011M-1、 1012M-1、 1013M-1 的结合。短语与抗体 ( 例如， C3b 结合抗体 ) 的 “特异性 ( 或选择性 ) 结合” 指决定近亲抗原 ( 例如人 C3b 或猕猴 C3b) 在蛋白质和其它 生物产品的异质群体中的存在的结合反应。除了上文指出的平衡常数 (KA)， 本发明的 C3b 结合抗体通常还具有约 1x10-2s-1、 1x10-3s-1、 1x10-4s-1、 1x10-5s-1 或更低的解离速率 常数 (Kd)， 并且以比其结合非特异性抗原 ( 例如 C3) 的亲和力至少 10 倍， 优选 100 倍， 或高 达 1000 倍或更高的亲和力结合 C3b。 。短语 “识别抗原的抗体” 和 “对抗原特异的抗体” 此 处可与 “特异性结合抗原的抗体” 互换使用。
     如此处所用， “neo- 表位” 或 “neo- 抗原” 可互换使用， 并且是蛋白水解切割 C3 后 C3b 上存在的蛋白质的抗原部分。这些 neo- 表位在未切割的 C3 上不容易接近。
     术语 “与黄斑变性相关的状况或病症” 指任何多种这样的状况， 其中例如因黄斑细 胞生长降低引起视网膜黄斑变性或无功能， 增加了黄斑细胞 ( 例如 RPE 细胞 ) 的死亡或重 排、 正常生物学功能的丧失， 或这些事件的组合。黄斑变性导致细胞组织结构的完整性和 / 或正常黄斑的胞外基质的缺失和 / 或黄斑细胞的功能缺失。黄斑变性相关病症的实例包括 AMD、 北卡罗来纳黄斑营养不良、 Sorsby′ s 眼底营养不良、 隐性黄斑营养不良、 模式营养不 良、 卵黄状黄斑变性、 显性玻璃疣， 和 malattia leventinese( 辐射玻璃疣 )。 该术语还包括 黄斑异常和 / 或变性之前或之后发生的黄斑外改变。因此， 术语 “黄斑变性相关病症” 还广 泛地包括改变或损坏黄斑完整性或功能的任何状况 ( 例如， RPE 或 Bruch′ s 膜的损伤 )。 例如， 该术语包括视网膜脱落、 脉络膜视网膜变性、 视网膜变性、 光感受器退化、 RPE 变性、 粘 多糖病、 视杆 - 视椎营养不良、 视椎 - 视杆营养不良和视椎变性。
     术语 “补体组分” 、 “补体蛋白” 或 “补体组分蛋白” 指参与激活补体系统的分子。经 典途径组分包括， 例如 C1q、 C1r、 C1s、 C4、 C2、 C3、 C5、 C6、 C7、 C8、 C9 和 C5b-9 复合体 ( 膜攻 击复合体 ： MAC)。旁路途径组分包括， 例如因子 B、 因子 D、 备解素、 H 和 I。
     术语 “调节” 或 “调节” 在此处互换使用， 指活性或生物学过程 ( 例如， 补体过程 ) 的上调 ( 即， 激活或刺激 ( 例如， 通过激动或加强 )) 和下调 ( 即， 抑制或阻遏 ( 例如， 通过 拮抗、 降低或抑制 ))。 “调节” 旨在描述过程的上调或下调。可通过刺激物的拮抗剂抑制通 过该刺激物上调的过程。相反地， 可通过修饰剂的激动剂抑制通过该修饰剂下调的过程。
     术语 “补体途径相关分子” 、 “补体途径分子” 和 “补体途径相关蛋白” 可互换使用， 并指在补体激活和响应激活的补体系统介导的或激活的补体系统触发的下游细胞活性中 起作用的多种分子。它们包括补体途径的起始物 ( 即， 直接或间接触发补体系统激活的分 子 )、 在补体激活过程中产生的或起作用的分子 ( 例如， 补体蛋白 / 酶， 如 C3、 C5、 C5b-9、 因 子 B、 因子 D、 MASP-1 和 MASP-2)、 补体受体或抑制剂 ( 例如， 簇蛋白、 玻连蛋白、 CR1 或 CD59)， 和激活的补体系统调节或触发的分子 ( 例如， 膜攻击复合体抑制因子、 MACIF ； 参阅例如， ugita 等， J Biochem， 106 ： 589-92， 1989)。因此， 除了此处指出的补体蛋白， 补体途径相关 分子还包括， 例如 C3/C5 转变酶调节子 (RCA)， 如补体受体类型 1( 也称为 CR1 或 CD35)、 补 体受体类型 2( 也称为 CR2 或 CD21)、 膜辅因子蛋白 (MCP 或 CD46)， 和 C4bBP ； MAC 调节子， 如玻连蛋白、 簇蛋白 ( 也称为 “SP40， 40” )、 CRP、 CD59， 和同源限制因子 (HRF) ； 免疫球蛋白链， 如 Igκ、 Igλ 或 Igγ ； C1 抑制剂 ； 和其它蛋白质， 如 CR3、 CR4(CD11b/18) 和 DAF(CD 55)。
     术语 “补体途径调节的细胞活性” 包括因以下引起的细胞损伤 ： C5b-9 攻击复合 体、 血管通透性改变、 平滑肌细胞的收缩和迁移、 T 细胞增殖、 免疫粘着、 树突状细胞、 单核细 胞、 粒细胞和血小板的聚集、 嗜中性粒细胞 (PMN) 和巨噬细胞的吞噬、 迁移和激活。
     此外， 补体途径的激活导致补体途径中副产物产生的促炎症反应的增加。与补体 途径激活相关的病症包括肾炎、 哮喘、 再灌注损伤、 血液透析、 类风湿性关节炎、 全身性红 斑狼疮、 牛皮癣、 多发性硬化症、 移植、 阿尔茨海默氏病、 aHUS、 MPGN II 或任何其它补体介 导的疾病。与黄斑变性相关的病症包括 AMD、 北卡罗来纳黄斑营养不良、 Sorsby′ s 眼底 营养不良、 隐性黄斑营养不良、 模式营养不良、 卵黄状黄斑变性、 显性玻璃疣， 和 malattia leventinese( 辐射玻璃疣 )、 黄斑异常和 / 或变性之前或之后发生的黄斑外改变、 视网膜脱 落、 脉络膜视网膜变性、 视网膜变性、 光感受器退化、 RPE 变性、 粘多糖病、 视杆 - 视椎营养不 良、 视椎 - 视杆营养不良和视椎变性粘多糖病。
     如此处所用， 术语 “受试者” 包括任何人或非人动物。
     术语 “非人动物” 包括所有的非人脊椎动物， 例如哺乳动物和非哺乳动物， 如非人 灵长类、 啮齿类、 兔、 绵羊、 狗、 猫、 马、 奶牛、 鸟、 两栖动物、 爬行动物等。 术语 “嵌合抗体” 是这样的抗体分子， 其中 (a) 恒定区或其部分被改变、 替换或交 换， 使得抗原结合位点 ( 可变区 ) 连接不同种类或改变种类的恒定区、 效应功能和 / 或物 种， 或赋予嵌合抗体新性质的完全不同的分子， 例如酶、 毒素、 激素、 生长因子、 药物等 ； 或 (b) 可变区或其部分被具有不同或改变抗原特异性的可变区改变、 替换或交换。例如， 可通 过来自人免疫球蛋白的恒定区替换小鼠恒定区来修饰小鼠抗体。由于用人恒定区进行替 换， 嵌合抗体在识别抗原中可保留其特异性， 同时与最初的小鼠抗体相比， 在人中具有降低 的抗原性。
     术语 “补体 C3b 蛋白” 或 “C3b” 互换使用， 并指不同物种中的 C3b 蛋白。例如， 人 C3b 具有 SEQ ID NO ： 197(A 链 ) 和 198(B 链 ) 中阐明的序列。 可从 Complement Technology Inc.(Tyler， TX) 获得人 C3b。如下文实施例部分阐明产生猕猴 C3b。
     术语 “保守修饰的变体” 应用到氨基酸和核酸序列。对于特定核酸序列， 保守修饰 的变体指编码相同或基本相同氨基酸序列的那些核酸， 或者其中所述核酸不编码氨基酸序 列， 则指基本相同的序列。 因为遗传密码的简并性， 大量功能相同的核酸编码任何给定的蛋 白质。例如， 密码子 GCA、 GCC、 GCG 和 GCU 均编码氨基酸丙氨酸。因此， 在每一位置上 ( 其中 密码子确定丙氨酸 )， 可将所述密码子改变成任何所述相应的密码子， 而不改变所编码的多 肽。此类核酸变异是 “沉默变异” ， 其为保守修饰变异的一种。此处编码多肽的每一核酸序 列也描述了所述核酸的每一种可能的沉默变异。 本领域技术人员将认识到可修饰核酸中的 每一密码子 ( 除了 AUG， 其通常是甲硫氨酸的唯一密码子， 和 TGG， 其通常是色氨酸的唯一密 码子 )， 以产生功能上相同的分子。因此， 在每一所述序列中暗含了编码多肽的核酸的每一 沉默变异。
     对于多肽序列， “保守修饰的变体” 包括对多肽序列的各替换、 缺失或添加， 其导致 对氨基酸用化学上类似的氨基酸进行替换。 提供功能上类似的氨基酸的保守替换表为本领 域所熟知。此类保守修饰变体除了并且不排斥本发明的多态性变体、 种间同源物和等位基
     术语 “补体 C3b 蛋白” 或 “C3b” 互换使用， 并指不同物种中的 C3b 蛋白。例如， 人 C3b 具有 SEQ ID NO ： 197(A 链 ) 和 198(B 链 ) 中阐明的序列。 可从 Complement Technology Inc.(Tyler， TX) 获得人 C3b。如下文实施例部分阐明产生猕猴 C3b。
     术语 “保守修饰的变体” 应用到氨基酸和核酸序列。对于特定核酸序列， 保守修饰 的变体指编码相同或基本相同氨基酸序列的那些核酸， 或者其中所述核酸不编码氨基酸序 列， 则指基本相同的序列。 因为遗传密码的简并性， 大量功能相同的核酸编码任何给定的蛋 白质。例如， 密码子 GCA、 GCC、 GCG 和 GCU 均编码氨基酸丙氨酸。因此， 在每一位置上 ( 其中 密码子确定丙氨酸 )， 可将所述密码子改变成任何所述相应的密码子， 而不改变所编码的多 肽。此类核酸变异是 “沉默变异” ， 其为保守修饰变异的一种。此处编码多肽的每一核酸序 列也描述了所述核酸的每一种可能的沉默变异。 本领域技术人员将认识到可修饰核酸中的 每一密码子 ( 除了 AUG， 其通常是甲硫氨酸的唯一密码子， 和 TGG， 其通常是色氨酸的唯一密 码子 )， 以产生功能上相同的分子。因此， 在每一所述序列中暗含了编码多肽的核酸的每一 沉默变异。
     对于多肽序列， “保守修饰的变体” 包括对多肽序列的各替换、 缺失或添加， 其导致 对氨基酸用化学上类似的氨基酸进行替换。 提供功能上类似的氨基酸的保守替换表为本领 域所熟知。此类保守修饰变体除了并且不排斥本发明的多态性变体、 种间同源物和等位基
     因。 以下 8 组含有彼此为保守替换的氨基酸 ： 1) 丙氨酸 (A)、 甘氨酸 (G) ； 2) 天冬氨酸 (D)， 谷 氨酸 (E) ； 3) 天冬酰胺 (N)， 谷氨酰胺 (Q) ； 4) 精氨酸 (R)， 赖氨酸 (K) ； 5) 异亮氨酸 (I)， 亮氨 酸 (L)， 甲硫氨酸 (M)， 缬氨酸 (V) ； 6) 苯丙氨酸 (F)， 酪氨酸 (Y)， 色氨酸 (W) ； 7) 丝氨酸 (S)， 苏氨酸 (T) ； 和 8) 半胱氨酸 (C)、 甲硫氨酸 (M)( 参阅例如， Creighton， Proteins(1984))。 在一些实施方案中， 术语 “保守序列修饰” 用于指不显著影响或改变含有氨基酸序列的抗体 的结合特征的氨基酸修饰。
     术语 “交叉 - 阻断” 、 “交叉 - 阻断的” 在此处可互换使用， 表示抗体或其它结合剂 在标准的竞争性结合测定中干扰其它抗体或结合剂与 C3 结合的能力。
     可使用标准竞争结合测定法来测定抗体或其它结合剂能够干扰另一抗体或结合 分子与 C3 结合的能力或程度， 并因此是否可以被称为本发明的交叉阻断。一种合适的测定 法包括使用 Biacore 技术 ( 例如通过使用 BIAcore3000 仪器 (Biacore， Uppsala， Sweden))， 其可以使用表面等离振子共振技术测量相互作用的程度。 用于测量交叉阻断的另一测定法 使用基于 ELISA 的方法。
     术语 “表位” 表示能够特异性结合抗体的蛋白质决定簇。 表位一般由分子的化学活 性表面基团， 如氨基酸或糖侧链组成， 并一般具有特定的三维结构特征， 以及比电荷特征。 构象和非构象表位可以区分开， 因为在变性溶剂的存在下失去与前者的结合， 而不失去与 后者的结合。 如此处所用， 术语 IgG 抗体或其片段 ( 例如， Fab 片段 ) 的 “高亲和力” 指对靶抗原 具有 10-8M 或更低、 10-9M 或更低、 10-10M、 或 10-11M 或更低、 或 10-12M 或更低、 或 10-13M 或更低的 KD 的抗体。然而， “高亲和力” 结合对于其它抗体同种型可以发生变化。例如， 对 于 IgM 同种型的 “高亲和力” 结合指具有 10-7M 或更低， 或 10-8M 或更低的 KD 的抗体。一方 面， 此处描述的抗 C3b 抗体或其抗原结合片段具有低于或等于 1nM， 优选低于或等于 200pM， 更优选低于或等于 100pM， 并甚至更优选低于或等于 10pM 的 KD。
     如此处所用， 术语 “人抗体” 旨在包括具有可变区的抗体， 在所述可变区中构架和 CDR 区均来自人来源的序列。 此外， 如果抗体含有恒定区， 所述恒定区也来自此类人序列， 例 如人种系序列， 或突变形式的人种系序列。本发明的人抗体可包括不由人序列编码的氨基 酸残基 ( 例如， 通过体外随机或位点特异性诱变或通过体内体细胞突变引入的突变 )。
     术语 “人单克隆抗体” 指具有可变区的显示单一结合特异性的抗体， 在所述可变区 中构架和 CDR 区均来自人序列。在一个实施方案中， 所述人单克隆抗体由杂交瘤产生， 所述 杂交瘤包括从转基因非人动物， 例如转基因小鼠中获得的 B 细胞， 所述转基因非人动物具 有融合到无限增殖细胞中的包含人重链转基因和轻链转基因的基因组。
     “人源化” 抗体是保留非人抗体的反应性， 而在人中具有更低免疫原性的抗体。 例如这可通过保留非人 CDR 区并用它们的人类对应物替换抗体剩余部分 ( 即， 恒定区以 及可变区的构架部分 ) 来实现。参阅例如， Morrison 等， Proc.Natl.Acad.Sci.USA， 81 ： 6851-6855， 1984 ； Morrison 和 Oi， Adv.Immunol.， 44 ： 65-92， 1988 ； Verhoeyen 等， Science， 239 ： 1534-1536， 1988 ； Padlan， Molec.Immun.， 28 ： 489-498， 1991 ； 和 Padlan， Molec. Immun.， 31 ： 169-217， 1994。人工程化技术的其它实例包括， 但不限于在 US5,766,886 中公 开的 Xoma 技术。
     在两条或更多核酸或多肽序列的上下文中， 术语 “相同的” 或百分比 “同一性” 指
     如此处所用， 术语 “人抗体” 旨在包括具有可变区的抗体， 在所述可变区中构架和 CDR 区均来自人来源的序列。 此外， 如果抗体含有恒定区， 所述恒定区也来自此类人序列， 例 如人种系序列， 或突变形式的人种系序列。本发明的人抗体可包括不由人序列编码的氨基 酸残基 ( 例如， 通过体外随机或位点特异性诱变或通过体内体细胞突变引入的突变 )。
     术语 “人单克隆抗体” 指具有可变区的显示单一结合特异性的抗体， 在所述可变区 中构架和 CDR 区均来自人序列。在一个实施方案中， 所述人单克隆抗体由杂交瘤产生， 所述 杂交瘤包括从转基因非人动物， 例如转基因小鼠中获得的 B 细胞， 所述转基因非人动物具 有融合到无限增殖细胞中的包含人重链转基因和轻链转基因的基因组。
     “人源化” 抗体是保留非人抗体的反应性， 而在人中具有更低免疫原性的抗体。 例如这可通过保留非人 CDR 区并用它们的人类对应物替换抗体剩余部分 ( 即， 恒定区以 及可变区的构架部分 ) 来实现。参阅例如， Morrison 等， Proc.Natl.Acad.Sci.USA， 81 ： 6851-6855， 1984 ； Morrison 和 Oi， Adv.Immunol.， 44 ： 65-92， 1988 ； Verhoeyen 等， Science， 239 ： 1534-1536， 1988 ； Padlan， Molec.Immun.， 28 ： 489-498， 1991 ； 和 Padlan， Molec. Immun.， 31 ： 169-217， 1994。人工程化技术的其它实例包括， 但不限于在 US5,766,886 中公 开的 Xoma 技术。
     在两条或更多核酸或多肽序列的上下文中， 术语 “相同的” 或百分比 “同一性” 指
     相同的两条或更多序列或子序列。 当使用以下的序列比较算法或通过手工比对和视觉检查 测定， 比较并比对在比较窗内或指定区域内用于最大对应时， 如果两条序列具有特定百分 比 ( 即， 在特定区域上或当不指定时， 在全长序列上 60％同一性， 任选地 65％、 70％、 75％、 80％、 85％、 90％、 95％或 99％同一性 ) 的相同氨基酸残基或核苷酸， 那么两条序列 “基本相 同” 。任选地， 同一性存在于长度至少约 50 个核苷酸 ( 或 10 个氨基酸 ) 的区域， 或更优选 地在长度至少 100 到 500 或 1000 或更多核苷酸 ( 或 20、 50、 200 或更多氨基酸 ) 的区域。
     对于序列比较， 通常一条序列作为参考序列， 测试序列与其进行比较。 当使用序列 比较算法时， 将测试和参考序列输入计算机， 如果需要， 指定子序列坐标， 并指定序列算法 程序参数。可使用默认程序参数， 或可指定可选参数。所述序列比较算法然后基于程序参 数计算测试序列相对于参考序列的百分比序列同一性。
     如此处所用， “比较窗口”包括参考选自 20 到 600、 一般约 50 到约 200， 更一般 约 100 到约 150 的任何一定数量相邻位置的区段， 其中可在两条序列进行最佳比对后将 序列与相同数量相邻位置的参考序列进行比较。用于比较的序列比对方法为本领域所熟 知。例如通过 Smith 和 Waterman(1970)Adv.Appl.Math.2 ： 482c 的局部同源性算法， 通过 Needleman 和 Wunsch， J.Mol.Biol.48 ： 443， 1970 的同源性比对算法， 通过搜索 Pearson 和 Lipman， Proc.Nat’ l.Acad.Sci.USA 85 ： 2444， 1988 的相似性方法， 通过这些算法的计算机 化实现 (Wisconsin Genetics Software Package， Genetics Computer Group， 575 Science Dr.， Madison， WI 中的 GAP、 BESTFIT、 FASTA 和 TFASTA)， 或通过手工比对和视觉检查 ( 参 阅， 例如 Brent 等， Current Protocols in Molecular Biology， John Wiley&Sons， Inc. (Ringbou 编辑， 2003)) 进行序列最佳比对用于比较。
     适合于测定百分比序列同一性和序列相似性的算法的两个实例是 BLAST 和 BLAST 2.0 算法， 其分别描述于 Altschul 等， Nuc.Acids Res.25 ： 3389-3402， 1977 ； 和 Altschul 等， J.Mol.Biol.215 ： 403-410， 1990 中。用于进行 BLAST 分析的软件通过 National Center for BiotechnologyInformation 公开获得。该算法包括首先通过鉴定查询序列中长度为 W 的短字来鉴定高得分序列对 (HSPs)， 当在数据库序列中用相同长度的字比对时， 所述短字 匹配或满足某一正值阈值得分 T。T 称为邻近字得分阈值 (Altschul 等， 上文 )。这些初始 邻近字命中作为起始搜索的种子， 以发现含有它们的更长 HSPs。 只要可增加累积比对得分， 则沿每一序列的两个方向延伸字命中。对于核苷酸序列， 使用参数 M( 对一对匹配残基的奖 赏得分 ； 总＞ 0) 和 N( 对错配残基的罚分 ； 总＜ 0) 计算累积得分。对于氨基酸序列， 使用 得分矩阵来计算累积得分。当 ： 所述累积比对得分从其最高达到值跌落 X 量 ； 因一个或更 多负得分残基比对累积， 所述累积比对得分到达零或以下 ； 或到达任何一条序列的末端时， 停止字命中在每一方向上的延伸。BLAST 算法参数 W、 T 和 X 决定了比对的灵敏度和速度。 BLASTN 程序 ( 对于核苷酸序列 ) 使用默认字长 (W)11、 期望值 (E)10、 M ＝ 5、 N ＝ -4 和两 条链的比较。对于氨基酸序列， BLASTP 程序使用默认字长 3， 和期望值 (E)10 和 BLOSUM62 得分矩阵 ( 参阅 Henikoff 和 Henikoff， Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89 ： 10915， 1989) 比对 (B)50、 期望值 (E)10、 M ＝ 5、 N ＝ -4 和两条链的比较。
     BLAST 算法也进行两条序列之间相似性的统计学分析 ( 参阅例如， Karlin 和 Altschul， Proc.Natl.Acad.Sci.U SA 90 ： 5873-5787， 1993)。BLAST 算法提供的一种相似 性测量是最小总和概率 (P(N))， 其提供两条核苷酸或氨基酸序列之间偶然发生匹配的概率的指示。例如， 如果测试核酸与参考核酸的比较中最小总和概率低于约 0.2， 更优选低于约 0.01， 并最优选低于约 0.001， 那么认为核酸与参考序列相似。
     也可使用已经整合到 ALIGN 算法 ( 版本 2.0) 的 E.Meyers 和 W.Miller(Comput. Appl.Biosci.， 4： 11-17， 1988) 的算法， 使用 PAM120 加权残基表， 空位长度罚分 12 和空位 罚分 4 测定两条氨基酸序列之间的百分比同一性。 此外， 可使用已经整合到 GCG 软件包 ( 可 在 www.gcg.com 上获得 ) 中的 GAP 程序的 Needleman 和 Wunsch(J.Mol， Biol.48 ： 444-453， 1970) 算法， 使用 Blossom 62 矩阵或 PAM250 矩阵， 以及空位加权 16、 14、 12、 10、 8、 6或4和 长度加权 1、 2、 3、 4、 5 或 6 来测定两条氨基酸序列之间的百分比同一性。
     除了上文指出的序列同一性的百分比， 两条核酸序列或多肽基本相同的另一指示 是第一条核酸编码的多肽与针对第二条核酸编码的多肽产生的抗体免疫交叉反应， 如下文 描述。因此， 多肽通常与第二条多肽基本相同， 例如， 其中两条肽仅因保守替换而不同。两 条核酸序列基本相同的另一指示是两个分子或其互补序列在严格条件下彼此杂交， 如下文 描述。两条核酸序列基本相同的又一指示是可使用相同的引物来扩增所述序列。
     术语 “分离的抗体” 指抗体， 其基本不含具有不同抗原特异性的其它抗体 ( 例如， 特异性结合 C3b 的分离的抗体基本不含特异性结合除 C3b 外的抗原的抗体 )。 然而， 特异性 结合 C3b 的分离的抗体可对其它抗原具有交叉反应性。此外， 分离的抗体可基本不含其它 细胞物质和 / 或化学品。
     术语 “同种型” 指重链恒定区基因提供的抗体种类 ( 例如， IgM、 IgE、 IgG 如 IgG1 或 IgG4)。 同种型也包括这些种类中一种的修饰形式， 其中已经进行修饰以改变 Fc 功能， 例 如来增强或减弱效应功能或与 Fc 受体的结合。
     如此处所用， 术语 “Kassoc” 或 “Ka” 旨在指特定抗体 - 抗原相互作用的结合速率， 而如此处所用， 术语 “Kdis” 或 “Kd” 旨在指特定抗体 - 抗原相互作用的解离速率。如此处 所用， 术语 “KD” 旨在指解离常数， 其获得于 Kd 与 Ka 的比值 ( 即 Kd/Ka) 并表达为摩尔浓度 (M)。可使用本领域熟知的方法测定抗体的 KD 值。用于测定抗体 KD 的方法是通过使用表 面等离振子共振， 或使用生物传感器系统如 系统。
     如此处所用， 术语 “单克隆抗体” 或 “单克隆抗体组合物” 指单个分子组合物的抗 体分子的制剂。单克隆抗体组合物对特定表位显示单一结合特异性和亲和力。
     术语 “核酸” 此处与术语 “多核苷酸” 可互换使用， 并指单链或双链形式的脱氧核 糖核苷酸或核糖核苷酸及其聚合物。 所述术语包括含有已知核苷酸类似物或修饰的骨架残 基或键的核酸， 其为合成的、 天然发生的和非天然发生的， 其与参考核酸具有相似的结合性 质， 并且其以与参考核苷酸相似的方式进行代谢。 此类类似物的实例包括， 但不限于硫代磷 酸酯、 氨基磷酸酯、 甲基膦酸酯、 手性 - 甲基膦酸酯、 2-O- 甲基核糖核苷酸、 肽核酸 (PNA)。
     除非另有指出， 特定核酸序列也暗中包括其保守修饰的变体 ( 例如简并密码子替 换 ) 和互补序列， 以及明确指出的序列。尤其是， 如下文详细描述， 可通过产生这样的序列 完成简并密码子替换， 其中用混和碱基和 / 或脱氧肌苷残基替换一个或更多所选 ( 或全部 ) 密码子的第三个位置 (Batzer 等， Nucleic Acid Res.19 ： 5081， 1991 ； Ohtsuka 等， J.Biol. Chem.260 ： 2605-2608， 1985 ； 和 Rossolini 等， Mol.Cell.Probes 8 ： 91-98， 1994)。
     术语 “有效连接” 指两个和更多多核苷酸 ( 例如 DNA) 区段的功能关系。通常， 其 指转录调节序列与转录序列之间的功能关系。例如， 如果启动子或增强子序列刺激或调节编码序列在适当宿主细胞或其它表达系统中的转录， 那么该启动子或增强子序列有效连接 编码序列。一般地， 有效连接转录序列的启动子转录调节序列与转录序列在物理空间上邻 近， 即它们是顺式作用。然而， 一些转录调节序列， 如增强子不需要与编码序列 ( 增强子增 强其转录 ) 在物理空间上邻近或位于其附近。
     如此处所用， 术语 “优化的” 表示已经使用生产细胞或生物， 一般是真核细胞， 例如 毕赤酵母细胞、 中国仓鼠卵巢细胞 (CHO) 或人细胞中优选的密码子改变核苷酸序列， 以编 码氨基酸序列。将优化的核苷酸序列改造以完全或最大可能地保留起始核苷酸序列 ( 其也 称为 “亲本” 序列 ) 最初编码的氨基酸序列。已经改造了此处的优化序列以具有哺乳动物 细胞中优选的密码子。 然而， 此处也考虑其它真核细胞或原核细胞中这些序列的优化表达。 优化的核苷酸序列编码的氨基酸序列也称为优化的。
     术语 “多肽” 和 “蛋白质” 此处互换使用来指氨基酸残基的聚合物。所述术语应用 到氨基酸聚合物， 其中一个或更多氨基酸残基是相应天然发生氨基酸的人工化学模拟物， 还应用到天然发生的氨基酸聚合物和非天然发生的氨基酸聚合物。除非另有指出， 特定的 多肽序列也暗中包括其保守修饰的变体。
     如此处所用， 术语 “重组人抗体” 包括通过重组方法制备、 表达、 产生或分离的所有 人抗体， 如从对人免疫球蛋白基因转基因或转染色体的动物 ( 例如小鼠 ) 或从中制备的杂 交瘤中分离的抗体、 从经转化以表达人抗体的宿主细胞， 例如从转染瘤中分离的抗体、 从重 组、 组合人抗体库文中分离的抗体， 和通过任何其它手段制备、 表达、 产生或分离的抗体， 所 述手段包括将全部或部分人免疫球蛋白基因、 序列剪切成其它 DNA 序列。此类重组人抗体 具有可变区， 其中构架和 CDR 区均来自人种系免疫球蛋白序列。然而在某些实施方案中， 此 类重组人抗体可进行体外诱变 ( 或者， 当使用人 Ig 序列转基因的动物时， 进行体内体细胞 诱变 )， 因此重组抗体的 VH 和 VL 区的氨基酸序列是当来自并与人种系 VH 和 VL 序列相关时 可能在体内人抗体种系所有组成成分中不天然存在的序列。
     术语 “重组宿主细胞” ( 或简单地 “宿主细胞” ) 指已经向其中引入重组表达载体 的细胞。应理解此类术语不仅旨在指特定受试者细胞， 还指此细胞的后代。因为某些修饰 可能因突变或环境影响而在后代中出现， 所以该后代实际上可能与亲本细胞不相同， 但仍 然包括在此处所用术语 “宿主细胞” 的范围内。
     术语 “受试者” 包括人和非人动物。非人动物包括所有的脊椎动物， 例如哺乳动物 和非哺乳动物， 如非人灵长类、 羊、 狗、 奶牛、 鸡、 两栖动物和爬行动物。 除了指出时， 术语 “患 者” 或 “受试者” 此处可互换使用。
     术语 “治疗” 包括施用组合物或抗体， 以防止或延迟症状、 并发症或疾病 ( 例如 AMD) 的生物化学指征的开始， 缓解症状或阻止或抑制疾病、 状况或病症的进一步发展。 治疗 可以是预防性的 ( 以防止或延迟疾病开始， 或防止其临床或亚临床症状的表现 ) 或在疾病 表现后治疗性抑制或缓解症状。
     术语 “载体” 旨在指能够转运已经连接另一多核苷酸的多核苷酸分子。一种类型 的载体是 “质粒” ， 其指已经连接额外 DNA 片段的环形双链 DNA 环。另一类型的载体是病毒 载体， 如腺伴随病毒载体 (AAV 或 AAV2)， 其中额外的 DNA 区段可连接到病毒基因组内。某 些载体能够在其中引入载体的宿主细胞中进行自主复制 ( 例如， 具有细菌复制起点的细菌 载体和游离型哺乳动物载体 )。其它载体 ( 例如非游离型哺乳动物载体 ) 可在引入宿主细胞后整合到宿主细胞的基因组中， 并由此与所述宿主基因组一起复制。 此外， 某些载体能够 指导它们有效连接的基因的表达。此类载体此处称为 “重组表达载体” ( 或简单地， “表达 载体” )。一般而言， 在重组 DNA 技术中有用的表达载体经常是质粒的形式。在本说明书中， “质粒” 和 “载体” 可互换使用， 因为质粒是载体的最常用形式。然而， 本发明旨在包括此类 其它形式的表达载体， 如病毒载体 ( 例如， 复制缺陷型逆转录病毒、 腺病毒和腺伴随病毒 )， 其起等同的功能。
     如此处所用， 术语 “C3b 活性” 表示 C3b 产生下游的补体旁路的活性， 包括但不限于 例如 C3 转变酶的活性， C5 转变酶的活性。可使用此处描述的测定， 如但不限于溶血测定， 测定 C3a 和 C5a 产生的测定、 C3b 沉积测定， 和膜攻击复合体 (MAC) 沉积测定来测定 C3b 活 性。如此处所用， “C3b 活性的改变” 或 “C3b 活性的调节” 指通过一种或多种此处描述的测 定法测定 C3b 活性， 其中 C3b 活性相对于相关对照增加或降低至少 10％。 例如， 当存在抗体 或片段的情况下 C3b 活性相对于缺少抗体或片段情况下 C3b 的活性降低或增加至少 10％ 时， 可以说本发明的抗体或抗原结合片段调节 C3b 活性。
     如此处所用， 术语 “cyno” 或 “猕猴” 指猕猴 (Macaca fascicularis)。
     附图简述 图 1 显示， C3b 抗体以相对于 C3 高至少 1000 倍的选择性结合 C3b。
     图 2 显示了在 10％人或猕猴血清中抗 C3b 抗体抑制溶血的能力的实例。
     图 3 显示了 C3b 抗体抑制 C3b 产生为 C3 分解产物的能力的实例。
     图 4 显示了证明 C3b 抗体抑制 MAC 沉积的能力的示例性数据。
     图 5 显示， C3b 抗体通过抑制产生 C3a 和 C5a 阻断旁路途径驱动的补体激活。
     图 6A 显示了 SDS-PAGE 凝胶， 其显示了 tick-over 转变酶活性的抑制。图 6B 显示 了 6A 凝胶中对 C3b 产生的抑制的定量。图 6C 显示了抗 C3b 抗体抑制预形成的 C3 转变酶 活性。
     图 7 显示抗体 C3b 抗体体外抑制 C5 转化酶活性。
     图 8A 显示了通过 C3b 抗体抑制因子 B 结合 C3b。图 8B 显示了通过 C3b 抗体抑制 因子 P 结合 C3b。图 8C 显示了通过 C3b 抗体抑制因子 H 结合 C3b。图 8D 显示了通过 C3b 抗体抑制 C3b-C3b 二聚体形成。
     图 9 显示了针对 C3d 的抗体交叉反应性测定的结果。
     图 10 显示了针对 C5 的抗体交叉反应性测定的结果。
     图 11 显示了测定 C3b 抗体是否结合 i C3b 或 C3c 的结合测定的结果。
     图 12 显示了物种交叉反应性研究的结果。图 12A 显示了大鼠交叉反应性。图 12B 显示了兔交叉反应性。图 12C 显示了猪交叉反应性。图 12D 显示了小鼠交叉反应性。图 12E 显示了豚鼠交叉反应性。图 12F 显示了狗交叉反应性。
     发明详述
     本发明部分基于这样抗体分子的发现， 所述抗体分子特异性结合人和猕猴 C3b。 本 发明涉及全长 IgG 形式的抗体 ( 参阅例如， 抗体 9556、 9611、 9612、 9609、 9610、 9674 和 9675) 以及其抗原结合片段， 如 Fab 片段 ( 例如， 参阅抗体 9124、 9397、 9398、 9136、 9141、 9373 和 9423)。
     因此， 本发明提供特异性结合补体 C3b 蛋白 ( 例如， 人 C3b， 猕猴 C3b) 的抗体、 药物
     图 2 显示了在 10％人或猕猴血清中抗 C3b 抗体抑制溶血的能力的实例。
     图 3 显示了 C3b 抗体抑制 C3b 产生为 C3 分解产物的能力的实例。
     图 4 显示了证明 C3b 抗体抑制 MAC 沉积的能力的示例性数据。
     图 5 显示， C3b 抗体通过抑制产生 C3a 和 C5a 阻断旁路途径驱动的补体激活。
     图 6A 显示了 SDS-PAGE 凝胶， 其显示了 tick-over 转变酶活性的抑制。图 6B 显示 了 6A 凝胶中对 C3b 产生的抑制的定量。图 6C 显示了抗 C3b 抗体抑制预形成的 C3 转变酶 活性。
     图 7 显示抗体 C3b 抗体体外抑制 C5 转化酶活性。
     图 8A 显示了通过 C3b 抗体抑制因子 B 结合 C3b。图 8B 显示了通过 C3b 抗体抑制 因子 P 结合 C3b。图 8C 显示了通过 C3b 抗体抑制因子 H 结合 C3b。图 8D 显示了通过 C3b 抗体抑制 C3b-C3b 二聚体形成。
     图 9 显示了针对 C3d 的抗体交叉反应性测定的结果。
     图 10 显示了针对 C5 的抗体交叉反应性测定的结果。
     图 11 显示了测定 C3b 抗体是否结合 i C3b 或 C3c 的结合测定的结果。
     图 12 显示了物种交叉反应性研究的结果。图 12A 显示了大鼠交叉反应性。图 12B 显示了兔交叉反应性。图 12C 显示了猪交叉反应性。图 12D 显示了小鼠交叉反应性。图 12E 显示了豚鼠交叉反应性。图 12F 显示了狗交叉反应性。
     发明详述
     本发明部分基于这样抗体分子的发现， 所述抗体分子特异性结合人和猕猴 C3b。 本 发明涉及全长 IgG 形式的抗体 ( 参阅例如， 抗体 9556、 9611、 9612、 9609、 9610、 9674 和 9675) 以及其抗原结合片段， 如 Fab 片段 ( 例如， 参阅抗体 9124、 9397、 9398、 9136、 9141、 9373 和 9423)。
     因此， 本发明提供特异性结合补体 C3b 蛋白 ( 例如， 人 C3b， 猕猴 C3b) 的抗体、 药物
     组合物、 生产方法和使用此类抗体和组合物的方法。
     C3b 抗体
     本发明提供特异性结合 C3b( 例如， 人 C3b， 猕猴 C3b) 的抗体。 在一些实施方案中， 本发明提供特异性结合人和猕猴 C3b 的抗体。本发明的抗体包括， 但不限于如实施例中所 述分离的人单克隆抗体。
     本发明提供特异性结合 C3b 蛋白质 ( 例如， 人和 / 或猕猴 C3b) 的抗体， 所述抗体包 含具有 SEQ ID NO ： 7、 21、 35、 49、 63、 77、 91、 105、 119、 133、 147、 161、 175 和 189 的氨基酸序列 的 VH 结构域。本发明还提供特异性结合 C3b 蛋白质 ( 例如， 人和 / 或猕猴 C3b) 的抗体， 所 述抗体包含具有下文表 1 中列出的任何一个 VH CDRs 的氨基酸序列的 VH CDR。具体而言， 本发明提供特异性结合 C3b 蛋白质 ( 例如， 人和 / 或猕猴 C3b) 的抗体， 所述抗体包含 ( 或 者， 组成为 ) 具有下文表 1 中列出的任何一个 VH CDRs 的氨基酸序列的一个、 两个、 三个、 四 个、 五个或更多 VH CDRs。
     本发明提供特异性结合 C3b 蛋白质 ( 例如， 人和 / 或猕猴 C3b) 的抗体， 所述抗体包 含具有 SEQ ID NO ： 8、 22、 36、 50、 64、 78、 92、 106、 120、 134、 148、 162、 176 和 190 的氨基酸序列 的 VL 结构域。本发明还提供特异性结合 C3b 蛋白质 ( 例如， 人和 / 或猕猴 C3b) 的抗体， 所 述抗体包含具有下文表 1 中列出的任何一个 VL CDRs 的氨基酸序列的 VL CDR。具体而言， 本发明提供特异性结合 C3b 蛋白质 ( 例如， 人和 / 或猕猴 C3b) 的抗体， 所述抗体包含 ( 或 者， 组成为 ) 具有下文表 1 中列出的任何一个 VL CDRs 的氨基酸序列的一个、 两个、 三个或 更多 VL CDRs。
     本发明的其它抗体包括已经突变的氨基酸， 其在 CDR 区中仍然与表 1 所述序列中 描述的 CDR 区具有至少百分之 60、 70、 80、 85、 90 或 95 的同一性。在一些实施方案中， 其包 括突变氨基酸序列， 其中当与表 1 所述序列中描述的 CDR 区比较时 CDR 区中不超过 1、 2、 3、 4 或 5 个氨基酸已经发生突变。
     本发明还提供编码特异性结合 C3b 蛋白质 ( 例如， 人和 / 或猕猴 C3b) 的抗体的 VH、 VL、 全长重链和全长轻链的核酸序列。可优化此类核酸序列用于在哺乳动物细胞中表 达 ( 例如， 表 1 显示了抗体 9556、 9611、 9612、 9609、 9610、 9674 和 9675， 以及 Fab 片段 9124、 9397、 9398、 9136、 9141、 9373 和 9423 的重链和轻链的优化核酸序列 )。
     表 1. 本发明 C3b 抗体、 Fabs 与 C3b 蛋白质的实例
     表1
    
    
    
    
    
    
    
    
    
    
    
    
    
    
    
    
    
    
    
    
    本发明的其它抗体包括其中氨基酸或编码氨基酸的核酸已经发生突变， 但与表 1 中描述的序列仍然具有至少百分之 60、 65、 70、 75、 80、 85、 90 或 95 的同一性的那些抗体。在 一些实施方案中， 其包括突变氨基酸序列， 其中当与表 1 所述序列中描述的序列中的可变 区比较时在可变区内不超过 1、 2、 3、 4 或 5 个氨基酸已经发生突变， 但却保留基本相同的治 疗活性。
     因为这些抗体中每一抗体均可结合 C3b， 所以可以 “混和并匹配” VH、 VL、 全长轻链 和全长重链序列 ( 氨基酸序列和编码所述氨基酸序列的核苷酸序列 )， 以产生本发明的其 它 C3b 结合抗体。可使用本领域已知的结合测定法 ( 例如， ELISA， 和实施例部分中描述的 其它测定法 ) 测试此类 “混和并匹配的” C3b 结合抗体。当这些链进行混合和匹配时， 应该 用结构相似的 VH 序列替换来自特定 VH/VL 配对的 VH 序列。 同样， 应该用结构相似的全长重 链序列替换来自特定全长重链 / 全长轻链配对的全长重链序列。同样， 应该用结构相似的 VL 序列替换来自特定 VH/VL 配对的 VL 序列。同样应该用结构相似的全长轻链序列替换来 自特定全长重链 / 全长轻链配对的全长轻链序列。因此， 一方面， 本发明提供分离的单克隆 抗体或其抗原结合区， 其具有 ： 包含选自 SEQ ID NO ： 7、 21、 35、 49、 63、 77、 91、 105、 119、 133、 147、 161、 175 和 189 的氨基酸序列的重链可变域 ； 和包含选自 SEQ ID NO ： 8、 22、 36、 50、 64、 78、 92、 106、 120、 134、 148、 162、 176 和 190 的氨基酸序列的轻链可变域 ； 其中所述抗体特异 性结合 C3b( 例如， 人和 / 或猕猴 C3b)。
     另一方面， 本发明提供 (i) 分离的单克隆抗体， 其具有 ： 包含选自 SEQID NOs ： 9、 23、 37、 51、 65、 79、 93、 107、 121、 135、 149、 163、 177 和 191 的氨基酸序列的全长重链， 已经优 化所述氨基酸序列用于在哺乳动物细胞中表达 ； 和包含选自 SEQ ID NOs ： 10、 24、 38、 52、 66、 80、 94、 108、 122、 136、 150、 164、 178 和 192 的氨基酸序列的全长轻链， 已经优化所述氨基酸
     序列用于在哺乳动物细胞中表达 ； 或 (ii) 包含其抗原结合部分的功能蛋白质。
     另一方面， 本发明提供 C3b 结合抗体， 其包含如表 1 中所述的重链和轻链 CDR1s、 CDR2s 和 CDR3s， 或其组合。 所述抗体的 VH CDR1s 的氨基酸序列示于 SEQ ID NOs ： 1、 15、 29、 43、 57、 71、 85、 99、 113、 127、 141、 155、 169 和 183 中。所述抗体的 VH CDR2s 的氨基酸序列示 于 SEQID NOs ： 2、 16、 30、 44、 58、 72、 86、 100、 114、 128、 142、 156、 170 和 184 中。 所述抗体的 VH CDR3s 的氨基酸序列示于 SEQ ID NOs ： 3、 17、 31、 45、 59、 73、 87、 101、 115、 129、 143、 157、 171 和 185 中。所述抗体的 VL CDR1s 的氨基酸序列示于 SEQ ID NOs ： 4、 18、 32、 46、 60、 74、 88、 102、 116、 130、 144、 158、 172 和 186 中。 所述抗体的 VL CDR2s 的氨基酸序列示于 SEQ ID NOs ： 5、 19、 33、 47、 61、 75、 89、 103、 117、 131、 145、 159、 173 和 187 中。 所述抗体的 VL CDR3s 的氨基 酸序列示于 SEQ ID NOs ： 6、 20、 34、 48、 62、 76、 90、 104、 118、 132、 146、 160、 174 和 188 中。 使用 Kabat 系统描绘 CDR 区 (Kabat， E.A.， 等， 1991Sequences of Proteins of Immunological Interest， 第五版， U.S.Departmentof Health and Human Services， NIH 公开号 91-3242)。
     如果这些抗体中的每一抗体均可结合 C3b 并且主要通过 CDR1、 2 和 3 区提供抗原 结合特异性， VH CDR1、 2 和 3 序列和 VL CDR1、 2 和 3 序列就可进行 “混和并匹配” ( 即， 可 将来自不同抗体的 CDRs 进行混和并匹配， 尽管每一抗体优选含有 VH CDR1、 2 和 3 以及 VL CDR1、 2 和 3， 以产生本发明的其它 C3b 结合分子 )。 可使用本领域已知的结合测定法和实施 例中描述的那些方法 ( 例如 ELISA) 来测试此类 “混和并匹配的” C3b 结合抗体。当 VH CDR 序列进行混和并匹配时， 应该用结构相似的 CDR 序列替换来自特定 VH 序列的 CDR1、 CDR2 和 / 或 CDR3。同样， 当 VL CDR 序列进行混和并匹配时， 应该用结构相似的 CDR 序列替换来自 特定 VL 序列的 CDR1、 CDR2 和 / 或 CDR3 序列。对本领域普通技术人员显而易见的是可用来 自此处对本发明单克隆抗体所示的 CDR 序列的结构相似的序列替换一个或更多 VH 和 / 或 VL CDR 区来产生新的 VH 和 VL 序列。 在一个实施方案中， 除了上述的， 此处描述的抗体的抗 原结合片段可包含 VHCDR1、 2 和 3， 或 VL CDR 1、 2 和 3， 其中所述片段作为单个可变域结合 C3b。
     因此， 本发明提供分离的单克隆抗体或其抗原结合区， 其包含 ： 包含选自 SEQ ID NOs ： 1、 15、 29、 43、 57、 71、 85、 99、 113、 127、 141、 155、 169 和 183 的氨基酸序列的重链可变区 CDR1 ； 包含选自 SEQ ID NOs ： 2、 16、 30、 44、 58、 72、 86、 100、 114、 128、 142、 156、 170 和 184 的氨 基酸序列的重链可变区 CDR2 ； 包含选自 SEQ ID NOs ： 3、 17、 31、 45、 59、 73、 87、 101、 115、 129、 143、 157、 171 和 185 的氨基酸序列的重链可变区 CDR3 ； 包含选自 SEQ ID NOs ： 4、 18、 32、 46、 60、 74、 88、 102、 116、 130、 144、 158、 172 和 186 的氨基酸序列的轻链可变区 CDR1 ； 包含选自 SEQ ID NOs ： 5、 19、 33、 47、 61、 75、 89、 103、 117、 131、 145、 159、 173 和 187 的氨基酸序列的轻 链可变区 CDR2 ； 包含选自 SEQ ID NOs ： 6、 20、 34、 48、 62、 76、 90、 104、 118、 132、 146、 160、 174 和 188 的氨基酸序列的轻链可变区 CDR3 ； 其中所述抗体特异性结合 C3b。
     本发明包括具有表 1 中抗体 9556 的重链和轻链序列的抗体或其抗原结合片段。 本 发明包括具有表 1 中抗体 9611 的重链和轻链序列的抗体或其抗原结合片段。本发明包括 具有表 1 中抗体 9612 的重链和轻链序列的抗体或其抗原结合片段。本发明还包括具有表 1 中抗体 9609 的重链和轻链序列的抗体或其抗原结合片段。本发明包括具有表 1 中抗体 9610 的重链和轻链序列的抗体或其抗原结合片段。本发明还包括具有表 1 中抗体 9674 的 重链和轻链序列的抗体或其抗原结合片段。本发明又进一步包括具有表 1 中 9675 抗体的重链和轻链序列的抗体或其抗原结合片段。本发明包括具有表 1 中 9124 抗体的重链和轻 链序列的抗体或其抗原结合片段。本发明还包括具有表 1 中 9397 抗体的重链和轻链序列 的抗体或其抗原结合片段。本发明还包括具有表 1 中 9398 抗体的重链和轻链序列的抗体 或其抗原结合片段。本发明还包括具有表 1 中 9136 抗体的重链和轻链序列的抗体或其抗 原结合片段。本发明还包括具有表 1 中 9141 抗体的重链和轻链序列的抗体或其抗原结合 片段。本发明又进一步包括具有表 1 中 9373 抗体的重链和轻链序列的抗体或其抗原结合 片段。本发明还包括具有表 1 中 9423 抗体的重链和轻链序列的抗体或其抗原结合片段。
     在特定实施方案中， 特异性结合 C3b 的抗体包含 SEQ ID NO ： 1 的重链可变区 CDR1 ； SEQ ID NO ： 2 的重链可变区 CDR2 ； SEQ ID NO ： 3 的重链可变区 CDR3 ； SEQ ID NO ： 4 的轻链 可变区 CDR1 ； SEQ ID NO ： 5 的轻链可变区 CDR2 ； 和 SEQ ID NO ： 6 的轻链可变区 CDR3。在另 一特定实施方案中， 特异性结合 C3b 的抗体包含 SEQ ID NO ： 15 的重链可变区 CDR1 ； SEQ ID NO ： 16 的重链可变区 CDR2 ； SEQ ID NO ： 17 的重链可变区 CDR3 ； SEQ ID NO ： 18 的轻链可变 区 CDR1 ； SEQ ID NO ： 19 的轻链可变区 CDR2 ； 和 SEQ ID NO ： 20 的轻链可变区 CDR3。
     在另一特定实施方案中， 特异性结合 C3b 的抗体包含 SEQ ID NO ： 29 的重链可变区 CDR1 ； SEQ ID NO ： 30 的重链可变区 CDR2 ； SEQ ID NO ： 31 的重链可变区 CDR3 ； SEQ ID NO ： 32 的轻链可变区 CDR1 ； SEQ ID NO ： 33 的轻链可变区 CDR2 ； 和 SEQ ID NO ： 34 的轻链可变区 CDR3。在另一特定实施方案中， 特异性结合 C3b 的抗体包含 SEQ ID NO ： 43 的重链可变区 CDR1 ； SEQ ID NO ： 44 的重链可变区 CDR2 ； SEQ ID NO ： 45 的重链可变区 CDR3 ； SEQ ID NO ： 46 的轻链可变区 CDR1 ； SEQ ID NO ： 47 的轻链可变区 CDR2 ； 和 SEQ ID NO ： 48 的轻链可变区 CDR3。
     在另一特定实施方案中， 特异性结合 C3b 的抗体包含 SEQ ID NO ： 57 的重链可变区 CDR1 ； SEQ ID NO ： 58 的重链可变区 CDR2 ； SEQ ID NO ： 59 的重链可变区 CDR3 ； SEQ ID NO ： 60 的轻链可变区 CDR1 ； SEQ ID NO ： 61 的轻链可变区 CDR2 ； 和 SEQ ID NO ： 62 的轻链可变区 CDR3。在另一特定实施方案中， 特异性结合 C3b 的抗体包含 SEQ ID NO ： 71 的重链可变区 CDR1 ； SEQ ID NO ： 72 的重链可变区 CDR2 ； SEQ ID NO ： 73 的重链可变区 CDR3 ； SEQ ID NO ： 74 的轻链可变区 CDR1 ； SEQ ID NO ： 75 的轻链可变区 CDR2 ； 和 SEQ ID NO ： 76 的轻链可变区 CDR3。
     在另一特定实施方案中， 特异性结合 C3b 的抗体包含 SEQ ID NO ： 85 的重链可变区 CDR1 ； SEQ ID NO ： 86 的重链可变区 CDR2 ； SEQ ID NO ： 87 的重链可变区 CDR3 ； SEQ ID NO ： 88 的轻链可变区 CDR1 ； SEQ ID NO ： 89 的轻链可变区 CDR2 ； 和 SEQ ID NO ： 90 的轻链可变区 CDR3。
     在某些实施方案中， 特异性结合 C3b 的抗体是表 1 中描述的抗体。 在优选实施方案 中， 结合 C3b 的抗体是 9556。在其它优选实施方案中， 结合 C3b 的抗体是 9610。在其它优 选实施方案中， 结合 C3b 的抗体是 9674。在其它优选实施方案中， 结合 C3b 的抗体是 9675。 在又一其它优选实施方案中， 结合 C3b 的抗体是 9609。
     如此处所用， 人抗体包含重链或轻链可变区或全长重链或轻链， 其 “产自” 或 “来 自” 特定种系序列， 如果抗体的可变区或全长链获自使用人种系免疫球蛋白基因的系统的 话。 此类系统包括用目的抗原免疫携带人免疫球蛋白基因的转基因小鼠或利用目的抗原筛 选在噬菌体上展示的人免疫球蛋白基因文库。 例如可通过比较人抗体的氨基酸序列与人种系免疫球蛋白的氨基酸序列并选择与人抗体的序列在序列上最相近 ( 即， 最高％同一性 ) 的人种系免疫球蛋白序列来鉴定 “产自” 或 “来自” 人种系免疫球蛋白序列的人抗体。 “产 自” 或 “来自” 特定人种系免疫球蛋白序列的人抗体可含有与种系序列相比例如因天然发 生的体细胞突变或刻意引入定点突变的氨基酸差异。然而， 在 VH 或 VL 构架区， 所选人抗体 在氨基酸序列上通常与人种系免疫球蛋白基因编码的氨基酸序列具有至少 90％的同一性， 并含有氨基酸残基， 当与其它物种的种系免疫球蛋白氨基酸序列 ( 例如， 鼠类种系序列 ) 比 较时， 其将人抗体鉴定为人的。 在某些情况下， 人抗体在氨基酸序列上与种系免疫球蛋白基 因编码的氨基酸序列具有至少 60％、 70％、 80％、 90％或至少 95％， 或甚至至少 96％、 97％、 98％或 99％的同一性。通常， 重组人抗体与人种系免疫球蛋白基因编码的氨基酸序列在 VH 或 VL 构架区具有不超过 10 个氨基酸的差异。在某些情况下， 人抗体与种系免疫球蛋白基 因编码的氨基酸序列具有不超过 5 个， 或甚至不超过 4、 3、 2 或 1 个氨基酸的差异。人种系 免疫球蛋白基因的实例包括， 但不限于下文描述的可变域种系片段以及 DP47 和 DPK9。
     同源抗体
     在另一实施方案中， 本发明提供包含与表 1 所述序列同源的氨基酸序列的抗体或 其抗原结合片段， 并且所述抗体结合 C3b 蛋白质 ( 例如， 人和 / 或猕猴 C3b)， 并保留表 1 所 述那些抗体的期望功能性质。
     例如， 本发明提供包含重链可变域和轻链可变域的分离的单克隆抗体 ( 或其功能 抗原结合片段 )， 其中所述重链可变域包含与选自 SEQ ID NO ： 7、 21、 35、 49、 63、 77、 91、 105、 119、 133、 147、 161、 175 和 189 的氨基酸序列具有至少 80％、 至少 90％或至少 95％同一性的 氨基酸序列 ； 所述轻链可变域包含与选自 SEQ ID NO ： 8、 22、 36、 50、 64、 78、 92、 106、 120、 134、 148、 162、 176 和 190 的氨基酸序列具有至少 80％、 至少 90％或至少 95％同一性的氨基酸 序列 ； 所述抗体特异性结合 C3b( 例如， 人和 / 或猕猴 C3b)， 并且所述抗体在溶血测定中可 以抑制红细胞溶解。在特定实例中， 此类抗体在 10％人或猕猴血清的溶血测定中具有低于 50nM 的 IC50 值。
     在其它实施方案中， VH 和 / 或 VL 氨基酸序列可以与表 1 中阐明的序列具有 50％、 60％、 70％、 80％、 90％、 95％、 96％、 97％、 98％或 99％的同一性。在其它实施方案中， VH 和 / 或 VL 氨基酸序列可以相同， 只是在不超过 1、 2、 3、 4 或 5 个氨基酸位置上具有氨基酸替换。 可通过诱变 ( 例如定点或 PCR 介导诱变 ) 分别编码 SEQ ID NO ： 7、 21、 35、 49、 63、 77、 91、 105、 119、 133、 147、 161、 175、 189、 8、 22、 36、 50、 64、 78、 92、 106、 120、 134、 148、 162、 176 和 190 的核 酸分子来获得这样的抗体， 所述抗体具有与表 1 所述的那些抗体的 VH 和 VL 区具有高 ( 即， 80％或更高 ) 同一性的 VH 和 VL 区， 然后使用此处所述的功能测定法测试所编码的经改变 的抗体保留的功能。
     在其它实施方案中， 全长重链和 / 或全长轻链氨基酸序列与表 1 中阐明的序列具 有 50％、 60％、 70％、 80％、 90％、 95％、 96％、 97％、 98％或 99％的同一性。可通过诱变 ( 例 如定点或 PCR 介导的诱变 ) 分别编码此类多肽的核酸分子来获得这样的抗体， 其具有分别 与 SEQ ID NOs ： 9、 23、 37、 51、 65、 79、 93、 107、 121、 135、 149、 163、 177 和 191 任何一个的全长 重链和 SEQ ID NOs ： 10、 24、 38、 52、 66、 80、 94、 108、 122、 136、 150、 164、 178 和 192 任何一个的 全长轻链具有高 ( 即， 80％或更高 ) 同一性的全长重链和全长轻链， 然后使用此处所述的功 能测定法测试编码的经改变抗体保留的功能。在其它实施方案中， 全长重链和 / 或全长轻链核苷酸序列与上文阐明的序列具有 60％、 70％、 80％、 90％、 95％、 96％、 97％、 98％或 99％的同一性。
     在其它实施方案中， 重链和 / 或轻链核苷酸序列的可变区与上文阐明的序列具有 60％、 70％、 80％、 90％、 95％、 96％、 97％、 98％或 99％的同一性。
     如此处所用， 两条序列之间的百分比同一性是所述序列共有的相同位置数量的函 数 ( 即， ％同一性等于相同位置的数量 / 位置总数 x100)， 其中考虑空位数量和每一空位长 度， 需要引入所述空位用于两条序列的最佳比对。 如下文非限制性实施例所述， 可使用数学 算法完成两条序列之间序列的比较和百分比同一性的确定。
     此外或备选地， 本发明的蛋白质序列可进一步用作 “查询序列” 以针对公共数据库 进行搜索， 例如来鉴定相关序列。 例如， 可使用 Altschul 等， 1990 J.Mol.Biol.215 ： 403-10 的 BLAST 程序 ( 版本 2.0) 进行此类搜索。
     具有保守修饰的抗体
     在某些实施方案中， 本发明的抗体具有包含 CDR1、 CDR2 和 CDR3 序列的重链可变 区和包含 CDR1、 CDR2 和 CDR3 序列的轻链可变区， 其中一个或更多这些 CDR 序列具有基于 此处所述抗体的特定氨基酸序列或其保守修饰， 并且其中所述抗体保留本发明 C3b 结合抗 体的期望功能性质。因此， 本发明提供分离的单克隆抗体， 或其功能抗原结合片段， 其由包 含 CDR1、 CDR2 和 CDR3 序列的重链可变区和包含 CDR1、 CDR2 和 CDR3 序列的轻链可变区组 成， 其中 ： 所述重链可变区 CDR1 氨基酸序列选自 SEQID NOs ： 1、 15、 29、 43、 57、 71、 85、 99、 113、 127、 141、 155、 169 和 183， 及其保守修饰 ； 所述重链可变区 CDR2 氨基酸序列选自 SEQ ID NOs ： 2、 16、 30、 44、 58、 72、 86、 100、 114、 128、 142、 156、 170 和 184， 及其保守修饰 ； 所述重链可 变区 CDR3 氨基酸序列选自 SEQ ID NOs ： 3、 17、 31、 45、 59、 73、 87、 101、 115、 129、 143、 157、 171 和 185， 及其保守修饰 ； 所述轻链可变区 CDR1 氨基酸序列选自 SEQ ID NOs ： 4、 18、 32、 46、 60、 74、 88、 102、 116、 130、 144、 158、 172 和 186， 及其保守修饰 ； 所述轻链可变区 CDR2 氨基酸 序列选自 SEQ ID NOs ： 5、 19、 33、 47、 61、 75、 89、 103、 117、 131、 145、 159、 173 和 187， 及其保守 修饰 ； 所述轻链可变区 CDR3 氨基酸序列选自 SEQ ID NOs ： 6、 20、 34、 48、 62、 76、 90、 104、 118、 132、 146、 160、 174 和 188， 及其保守修饰 ； 所述抗体或其抗原结合片段特异性结合 C3b， 并在 如此处所述溶血测定中抑制红细胞溶解。
     在其它实施方案中， 优化用于在哺乳动物细胞中表达的本发明的抗体具有全长重 链序列和全长轻链序列， 其中一个或更多这些序列具有基于此处所述抗体的特定氨基酸序 列或其保守修饰， 并且其中所述抗体保留本发明 C3b 结合抗体的期望功能性质。因此， 本发 明提供优化用于在哺乳动物细胞中表达的分离的单克隆抗体， 其由全长重链和全长轻链组 成， 其中 ： 所述全长重链具有选自 SEQ ID NOs ： 9、 23、 37、 51、 65、 79、 93、 107、 121、 135、 149、 163、 177 和 191 的氨基酸序列， 及其保守修饰 ； 并且所述全长轻链具有选自 SEQ ID NOs ： 10、 24、 38、 52、 66、 80、 94、 108、 122、 136、 150、 164、 178 和 192 的氨基酸序列， 及其保守修饰 ； 所述 抗体特异性结合 C3b( 例如， 人和 / 或猕猴 C3b) ； 并且所述抗体在如此处所述的溶血测定中 抑制红细胞溶解。在特定实施方案中， 当使用用 100pM 人 C5 重构的人 C5 耗尽的血清时， 此 类抗体在 10％人或猕猴血清的溶血测定中具有低于 50nM 的 IC50 值。
     结合相同表位的抗体
     本发明提供与表 1 所述 C3b 结合抗体结合相同表位的抗体。 因此可基于它们在 C3b结合测定中与本发明其它抗体交叉竞争 ( 例如以统计学上显著的方式竞争性抑制结合 ) 的 能力鉴定额外的抗体。测试抗体抑制本发明抗体与 C3b 蛋白质 ( 例如， 人和 / 或猕猴 C3b) 结合的能力显示所述测试抗体可与该抗体竞争结合 C3b ； 根据非限制性理论， 该抗体和与 其竞争的抗体结合 C3b 上相同或相关 ( 例如， 结构上相似或空间上接近 ) 的表位。在某一 实施方案中， 与本发明抗体结合 C3b 上相同表位的抗体是人单克隆抗体。可如此处所述制 备并分离这种人单克隆抗体。 如此处所用， 当竞争抗体浓度高于竞争抗体的 106xKD， 竞争抗 体抑制本发明抗体结合 C3b 高于 50％时， 抗体 “竞争” 结合。
     改造和修饰的抗体
     还可使用具有一个或更多此处所示 VH 和 / 或 VL 序列的抗体作为起始材料制备本 发明的抗体， 以改造修饰的抗体， 所述修饰的抗体可以具有从起始抗体改变的性质。 可通过 修饰一个或两个可变区 ( 即， VH 和 / 或 VL)， 例如一个或更多 CDR 区和 / 或一个或更多构架 区内的一个或更多残基来改造抗体。此外或备选地， 可通过在恒定区内修饰残基来改造抗 体， 例如来改变所述抗体的效应功能。
     可以进行的一种类型的可变区改造是 CDR 移植。抗体主要通过定位在六个重链和 轻链互补决定区 (CDRs) 中的氨基酸残基与靶抗原相互作用。为此， CDRs 内的氨基酸序列 在各抗体之间比 CDRs 外的序列更多样化。因为 CDR 序列负责多数抗体 - 抗原相互作用， 所以通过构建表达载体来表达模拟特定天然发生抗体的性质的重组抗体是可能的， 所述表 达载体包括移植到具有不同性质的不同抗体的构架序列上的来自特定天然发生抗体的 CDR 序列 ( 参阅例如， Riechmann， L. 等， 1998 Nature 332 ： 323-327 ； Jones， P. 等， 1986 Nature 321 ： 522-525 ； Queen， C. 等， 1989Proc.Natl.Acad.， U.S.A.86 ： 10029-10033 ； Winter 的 美 国 专 利 号 5,225,539， 和 Queen 等 的 美 国 专 利 号 5,530,101 ； 5,585,089 ； 5,693,762 和 6,180,370)。
     因此， 本发明的另一实施方案涉及分离的单克隆抗体， 或其抗原结合片段， 其包含 重链可变区， 所述重链可变区分别包含具有选自 SEQ ID NOs ： 1、 15、 29、 43、 57、 71、 85、 99、 113、 127、 141、 155、 169 和 183 的氨基酸序列的 CDR1 序列 ； 具有选自 SEQ ID NOs ： 2、 16、 30、 44、 58、 72、 86、 100、 114、 128、 142、 156、 170 和 184 的氨基酸序列的 CDR2 序列 ； 具有选自 SEQ ID NOs ： 3、 17、 31、 45、 59、 73、 87、 101、 115、 129、 143、 157、 171 和 185 的氨基酸序列的 CDR3 序 列； 和轻链可变区， 所述轻链可变区分别包含具有选自 SEQ ID NOs ： SEQ ID NOs ： 4、 18、 32、 46、 60、 74、 88、 102、 116、 130、 144、 158、 172 和 186 的氨基酸序列的 CDR1 序列 ； 具有选自 SEQ ID NOs ： SEQ ID NOs ： 5、 19、 33、 47、 61、 75、 89、 103、 117、 131、 145、 159、 173 和 187 的氨基酸序 列的 CDR2 序列 ； 具有选自 SEQ ID NOs ： 6、 20、 34、 48、 62、 76、 90、 104、 118、 132、 146、 160、 174 和 188 的氨基酸序列的 CDR3 序列。因此， 此类抗体含有单克隆抗体的 VH 和 VL CDR， 但仍然 含有来自这些抗体的不同构架序列。
     可从公共 DNA 数据库或包括种系抗体基因序列的出版的参考文献中获得此类 构架序列。例如， 人重链和轻链可变区基因的种系 DNA 序列可见于 “VBase” 人种系序列 数 据 库 ( 可 在 互 联 网 www.mrc-cpe.cam.ac.uk/vbase 上 获 得 )， 以 及 Kabat， E.A.， 等， 1991 Sequences ofProteins of Immunological Interest，第 五 版， U.S.Department of Healthand Human Services， NIH 公开号 91-3242 ； Tomlinson， I.M.， 等， 1992 J.fol. Biol.227 ： 776-798 ； 和 Cox， J.P.L. 等， 1994 Eur.J Immunol.24 ： 827-836 ； 各自内容此处明确引入作为参考。
     用于本发明抗体的构架序列的实例是与本发明所选抗体使用的构架序列， 例如本 发明单克隆抗体使用的共有序列和 / 或构架序列在结构上相似的那些构架序列。VH CDR1、 2 和 3 序列， 以及 VL CDR1、 2 和 3 序列可移植到与见于构架序列来源的种系免疫球蛋白基 因中的序列具有相同序列的构架区上， 或者所述 CDR 序列可移植到与种系序列相比含有一 个或更多突变的构架区上。例如， 已经发现有利的是在某些情况下在构架区内突变残基以 维持或增强抗体的抗原结合力 ( 参阅例如， Queen 等的美国专利号 5,530,101 ； 5,585,089 ； 5,693,762 和 6,180,370)。可用作其上构建此处所述抗体和抗原结合片段的支架的构架包 括， 但不限于 VH1A、 VH1B、 VH3、 Vk1、 Vl2 和 Vk2。额外的构架为本领域所知， 并可见于例如万 维网 vbase.mrc-cpe.cam.ac.uk/index.php ？ &MMN_position ＝ 1:1 上的 vBase 数据库。
     另一类型的可变区修饰是在 VH 和 / 或 VL CDR1、 CDR2 和 / 或 CDR3 区内突变氨基 酸残基， 由此改善目的抗体的一种或更多结合性质 ( 例如， 亲和力 )， 称为 “亲和力成熟” 。 可 进行定点诱变或 PCR 介导的诱变引入突变， 并在如此处所述以及实施例中提供的体外或体 内测定中评估对抗体结合或其它目的功能性质的影响。可引入保守修饰 ( 如上文讨论 )。 所述突变可以是氨基酸替换、 添加或缺失。此外， 通常改变 CDR 区内不超过 1、 2、 3、 4或5个 残基。
     因此， 在另一实施方案中， 本发明提供分离的 C3b 结合单克隆抗体， 或其抗原结合 片段， 其由重链可变区组成， 所述重链可变区具有 ： 由选自 SEQ ID NOs ： 1、 15、 29、 43、 57、 71、 85、 99、 113、 127、 141、 155、 169 和 183 的氨基酸序列， 或与 SEQ ID NOs ： 1、 15、 29、 43、 57、 71、 85、 99、 113、 127、 141、 155、 169 和 183 相比具有 1、 2、 3、 4 或 5 个氨基酸替换、 缺失或添加的 氨基酸序列组成的 VH CDR1 区 ； 具有选自 SEQ IDNOs ： 2、 16、 30、 44、 58、 72、 86、 100、 114、 128、 142、 156、 170 和 184 的氨基酸序列， 或与 SEQ ID NOs ： 2、 16、 30、 44、 58、 72、 86、 100、 114、 128、 142、 156、 170 和 184 相比具有 1、 2、 3、 4 或 5 个氨基酸替换、 缺失或添加的氨基酸序列的 VH CDR2 区 ； 具有选自 SEQ ID NOs ： 3、 17、 31、 45、 59、 73、 87、 101、 115、 129、 143、 157、 171 和 185 的氨基酸序列， 或与 SEQ ID NOs ： 3、 17、 31、 45、 59、 73、 87、 101、 115、 129、 143、 157、 171 和 185 相比具有 1、 2、 3、 4 或 5 个氨基酸替换、 缺失或添加的氨基酸序列的 VH CDR3 区 ； 具有选自 SEQ ID NOs ： 4、 18、 32、 46、 60、 74、 88、 102、 116、 130、 144、 158、 172 和 186 的氨基酸序列， 或与 SEQID NOs ： 4、 18、 32、 46、 60、 74、 88、 102、 116、 130、 144、 158、 172 和 186 相比具有 1、 2、 3、 4或 5 个氨基酸替换、 缺失或添加的氨基酸序列的 VL CDR1 区 ； 具有选自 SEQ ID NOs ： 5、 19、 33、 47、 61、 75、 89、 103、 117、 131、 145、 159、 173 和 187 的氨基酸序列， 或与 SEQ ID NOs ： 5、 19、 33、 47、 61、 75、 89、 103、 117、 131、 145、 159、 173 和 187 相比具有 1、 2、 3、 4 或 5 个氨基酸替换、 缺失 或添加的氨基酸序列的 VL CDR2 区 ； 和具有选自 SEQ ID NOs ： 6、 20、 34、 48、 62、 76、 90、 104、 118、 132、 146、 160、 174 和 188 的氨基酸序列， 或与 SEQ ID NOs ： 6、 20、 34、 48、 62、 76、 90、 104、 118、 132、 146、 160、 174 和 188 相比具有 1、 2、 3、 4 或 5 个氨基酸替换、 缺失或添加的氨基酸序 列的 VL CDR3 区。
     抗原结合域移植到备选构架或支架中
     可使用多种抗体 / 免疫球蛋白构架或支架， 只要所得多肽包括至少一个特异性结 合 C3b 的抗原结合区。此类构架或支架包括人免疫球蛋白或其片段的 5 个主要个体基因 型， 并包括其它动物物种， 优选具有人源化方面的动物物种的免疫球蛋白。单重链抗体， 如在骆驼中鉴定的那些单重链抗体在该方面十分重要。 本领域技术人员不断发现并开发新的 构架、 支架和片段。
     一方面， 本发明涉及使用其上可移植本发明 CDRs 的非免疫球蛋白支架产生基 于非免疫球蛋白的抗体。可以使用已知或未知非免疫球蛋白构架和支架， 只要它们包 含对靶 C3b 蛋白质 ( 例如， 人和 / 或猕猴 C3b) 特异的结合区。已知的非免疫球蛋白构 架 或 支 架 包 括， 但 不 限 于 纤 连 蛋 白 (Compound Therapeutics， Inc.， Waltham， MA)、 锚 蛋 白 (MolecularPartners AG， Zurich， Switzerland)、 结 构 域 抗 体 (Domantis， Ltd.， Cambridge， MA， and Ablynx nv， Zwijnaarde， Belgium)、脂 笼 蛋 白 (PierisProteolab AG， Freising， Germany)、 小 模 块 免 疫 药 物 (TrubionPharmaceuticals Inc.， Seattle， WA)、 maxybodies(Avidia， Inc.， MountainView， CA)、 A 蛋 白 (Affibody AG， Sweden) 和 affilin(γ- 晶体蛋白或泛素 )(Scil Proteins GmbH， Halle， Germany)。
     纤连蛋白支架基于纤连蛋白类型 III 结构域 ( 例如， 纤连蛋白类型 III 的第十个 模块 (10Fn3 结构域 ))。纤连蛋白类型 III 结构域具有在两个 β 折叠之间分布的 7 个或 8 个 β 链， 所述两个 β 折叠自身彼此包装形成蛋白质的核心， 并进一步含有将 β 链彼此连 接且暴露在溶剂中的环 ( 与 CDRs 类似 )。在 β 折叠夹层每一边缘具有至少三个这样的环， 其中所述边缘是与 β 链方向垂直的蛋白质边界 ( 参阅 US 6,818,418)。 这些基于纤连蛋白 的支架不是免疫球蛋白， 尽管总体折叠与最小功能抗体片段、 在骆驼和骆马 IgG 中包含完 整抗原识别单位的重链可变区十分相近。因为该结构， 非免疫球蛋白抗体模拟与自然界中 相似的抗原结合性质以及与抗体的那些亲和力相似的亲和力。 这些支架可用于体外环随机 化和改组策略， 其与体内抗体的亲和力成熟过程相似。这些基于纤连蛋白的分子可用作支 架， 其中使用标准克隆技术用本发明的 CDRs 替换所述分子的环区。
     锚蛋白技术基于使用具有锚蛋白来源的重复模块的蛋白质作为携带可变区的支 架， 所述可变区可用于结合不同靶标。所述锚蛋白重复模块是由两个反向平行的 α 螺旋和 β 转角组成的 33 个氨基酸的多肽。通过使用核糖体展示对可变区的结合进行最大优化。
     Avimers 来自含有如 LRP-1 蛋白质的天然 A 结构域。这些结构域天然地用于蛋白 质 - 蛋白质相互作用， 并且在人中超过 250 个蛋白质在结构上基于 A 结构域。Avimers 由通 过氨基酸接头连接的大量不同的 “A 结构域” 单体 (2-10) 组成。可使用例如美国专利申请 公开号 20040175756 ； 20050053973 ； 20050048512 和 20060008844 中描述的方法产生可以 结合靶抗原的 Avimers。
     Affibody 亲和配体是由基于 A 蛋白一个 IgG 结合域的支架的三螺旋束组成的小的 简单蛋白质。A 蛋白是来自细菌金黄色葡萄球菌 (Staphylococcus aureus) 的表面蛋白。 该支架结构域由 58 个氨基酸组成， 其中 13 个随机化以产生具有大量配体变体的 affibody 文库 ( 参阅例如， US5,831,012)。Affibody 分子模拟抗体， 它们与 150kDa 的抗体分子量相 比具有 6kDa 的分子量。尽管其具有小的尺寸， 但 affibody 分子的结合位点与抗体的结合 位点类似。
     Anticalins 是 Pieris ProteoLab AG 公司开发的产品。 它们衍生自脂笼蛋白， 其为 一大类小且坚固的蛋白质， 一般参与生理运输或储藏化学敏感的或不溶解的化合物。若干 天然脂笼蛋白在人组织或体液中产生。蛋白质结构表明为免疫球蛋白， 在刚性构架上面具 有高变环。然而， 与抗体或它们的重组片段相比， 脂笼蛋白由具有 160 到 180 个氨基酸残基的单条多肽链组成， 仅比单个免疫球蛋白结构域稍大。构成结合口袋的四环组显示明显的 结构可塑性并耐受多种侧链。因此结合位点在专有方法中可重塑， 以识别具有高亲和力和 特异性的不同形状的规定靶分子。 脂笼蛋白家族的一个蛋白质——Pieris Brassicae 的后 胆色素结合蛋白 (BBP) 已经用于通过诱变处理四环组来开发 anticalins。 描述 anticalins 的专利申请的一个实例在 PCT 公开号 WO 199916873 中。
     Affilin 分子是设计用来针对蛋白质和小分子具有特异亲和力的小的非免疫球蛋 白蛋白质。可从两个文库中非常快速地选择新的 affilin 分子， 每一所述文库基于来自不 同人的支架蛋白。 Affilin 分子与免疫球蛋白蛋白质不显示任何结构同源性。 目前， 使用两 个 affilin 支架， 其中一个是 γ 晶体蛋白——人结构晶状体蛋白质， 另一个是 “泛素” 超家 族蛋白质。两个人支架均非常小， 显示高的温度稳定性， 并对 pH 改变和变性剂几乎是有抵 抗力的。该高稳定性主要是因为蛋白质扩展的 β 折叠结构。γ 晶体蛋白来源的蛋白质的 实例描述于 WO200104144 中， 并且 “泛素样” 蛋白质的实例描述于 WO2004106368 中。
     蛋白质表位模拟 (PEM) 是模拟蛋白质 β 发夹二级结构的中等大小、 环形的、 肽样 分子 (MW 1-2kDa)， 所述主要二级结构参与蛋白质 - 蛋白质相互作用。
     人抗体或人源化抗体
     本发明提供特异性结合 C3b 蛋白质 ( 例如， 人和 / 或猕猴 C3b) 的完全人抗体。与 嵌合或人源化抗体相比， 当对人受试者施用时， 本发明的人 C3b 结合抗体具有进一步降低 的抗原性。
     可使用本领域已知的方法产生人 C3b 结合抗体。例如， 人类工程技术用于将非人 抗体转变成改造的人抗体。美国专利公开号 20050008625 描述了用抗体中人可变区替换非 人抗体可变区的体内方法， 同时维持相同或提供比非人抗体的结合性质更好的结合性质。 所述方法依赖于完全人抗体对非人参考抗体可变区的表位引导的替换。 所得人抗体一般在 结构上与参考非人抗体不相关， 但与所述参考抗体结合相同抗原上的相同表位。 简言之， 在 响应测试抗体结合抗原的报告系统存在下， 通过在细胞中 “竞争者” 与参考抗体 (“测试抗 体” ) 多种杂合物的文库之间建立竞争结合有限量的抗原， 使得可以进行连续表位引导的互 补性替换方法。所述竞争者可以是参考抗体或其衍生物， 如单链 Fv 片段。所述竞争者也可 以是天然的或人造的抗原配体， 其与参考抗体结合相同的表位。所述竞争者唯一需要的是 其可以与参考抗体结合相同的表位， 并且其与参考抗体竞争结合抗原。测试抗体具有来自 非人参考抗体的一个共同的抗原结合 V 区， 和从不同来源如人抗体的所有组成成分库中随 机选择的其它 V 区。来自参考抗体的共同 V 区用作引导者， 将所述测试抗体置于抗原上的 相同表位上， 并且在同一方向， 从而选择是偏向于对参考抗体具有最高抗原结合保真度。
     许多类型的报告系统可用于检测测试抗体与抗原之间期望的相互作用。例如， 互 补报告子片段可分别连接抗原和测试抗体， 使得仅当测试抗体结合抗原时发生片段互补的 报告子激活。当测试抗体和抗原报告片段融合物与竞争者共表达时， 报告子激活变得依赖 于所述测试抗体与竞争者竞争的能力， 其与该测试抗体对抗原的亲和力成比例。可使用的 其它报告系统包括如美国专利申请系列号 10/208,730( 公开号 20030198971) 中公布的自 抑制的报告子再激活系统 (RAIR) 的再激活子， 或在美国专利申请系列 10/076,845( 公开号 20030157579) 中公开的竞争激活系统。
     利用连续表位引导的互补替换系统， 进行选择以鉴定表达单个测试抗体与竞争者、 抗原和报告子组分的细胞。 在这些细胞中， 每一测试抗体一对一地与竞争者竞争结合有 限量的抗原。报告子的活性与结合测试抗体的抗原的量成比例， 其又与测试抗体对抗原的 亲和力和测试抗体的稳定性成比例。当表达为测试抗体时， 开始在其相对于参考抗体的活 性基础上选择测试抗体。第一轮选择的结果是一组 “杂合” 抗体， 其中每一抗体包含来自参 考抗体的相同非人 V 区和来自文库的人 V 区， 并且每一抗体与参考抗体结合抗原上的相同 表位。在第一轮中选择的一个或更多杂合抗体对抗原的亲和力与参考抗体相当或更高。
     在第二个 V 区替换步骤中， 使用在第一步骤中选择的人 V 区作为选择同族人 V 区 的多样文库替换剩余非人参考抗体 V 区的指导。第一轮中选择的杂合抗体也可用作第二轮 选择的竞争者。 第二轮选择的结果是一组完全人抗体， 其在结构上不同于参考抗体， 但与参 考抗体竞争结合相同的抗原。一些所选人抗体与参考抗体结合相同抗原上的相同表位。在 这些所选人抗体中， 一个或更多抗体以与参考抗体相当或比其高的亲和力结合相同表位。
     使用上文描述的一种小鼠或嵌合 C3b 结合抗体作为参考抗体， 可容易地使用该方 法来产生以相同结合特异性及相同或更高结合亲和力结合人 C3b 的人抗体。此外， 也可从 通常生产人抗体的公司， 例如 KaloBios， Inc.(Mountain View， CA) 通过商业途径获得此类 人 C3b 结合抗体。
     骆驼 (camelid) 抗体
     从骆驼和单峰骆驼 (Camelus bactrianus 和 Calelus dromaderius) 家族的成员， 包括新世界成员如骆马物种 (Lama paccos、 Lama glama 和 Lamavicugna) 中获得的抗体蛋 白质已经在大小、 结构复杂性和对人受试者的抗原性方面进行了表征。自然界中发现的来 自该哺乳动物家族的某些 IgG 抗体缺少轻链， 并因此在结构上不同于来自其它动物的抗体 的两条重链和两条轻链的典型四链四级结构。参阅 PCT/EP93/02214(1994 年 3 月 3 日公开 的 WO 94/04678)。
     可通过遗传改造获得鉴定为 VHH 的小的单个可变结构域的骆驼抗体的区域， 以产 生对靶标具有高亲和力的小蛋白质， 得到低分子量的抗体来源蛋白质， 称为 “骆驼纳米抗 体” 。参阅 1998 年 6 月 2 日提交的美国专利号 5,759,808 ； 还参阅 Stijlemans， B. 等， 2004J Biol Chem 279 ： 1256-1261 ； Dumoulin， M. 等， 2003 Nature 424 ： 783-788 ； Pleschberger， M. 等 2003Bioconjugate Chem 14 ： 440-448 ； Cortez-Retamozo， V. 等 2002 Int JCancer 89 ： 456-62 ； 和 Lauwereys， M. 等 1998 EMBO J 17 ： 3512-3520。 例 如 从 Ablynx， Ghent， Belgium 通过商业途径获得骆驼抗体和抗体片段的改造库。 如同非人来源的其它抗体一样， 可重组改变骆驼抗体的氨基酸序列， 来获得与人序列更像的序列， 即纳米抗体可以进行 “人 源化” 。因此， 骆驼抗体对人的天然低抗原性可进一步降低。
     骆驼纳米抗体的分子量是人 IgG 分子的大概十分之一， 并且所述蛋白质物理直径 仅几纳米。 小尺寸的一种结果是骆驼纳米抗体能够结合更大抗体蛋白质在功能上看不见的 抗原位点， 即骆驼纳米抗体可用作使用经典免疫技术检测不到的抗原的试剂， 并可能用作 治疗剂。因此， 小尺寸的另一结果是骆驼纳米抗体因此可抑制靶蛋白质的沟或窄缝中特异 位点的结合， 并因而可具有这样的能力， 其比典型抗体更像典型的低分子量药物的功能。
     低分子量和紧密尺寸还导致骆驼纳米抗体极其热稳定， 对极端 pH 和蛋白酶解消 化稳定， 并且抗原性弱。 另一结果是骆驼纳米抗体容易从循环系统转移到组织， 甚至穿过血 脑屏障， 可治疗影响神经组织的病症。纳米抗体可进一步利于药物运输穿过血脑屏障。参阅 2004 年 8 月 19 日公开的美国专利申请 20040161738。这些特征与对人的低抗原性结合 表明巨大的治疗潜能。另外， 这些分子可在原核细胞， 如大肠杆菌 (E.coli) 中完全表达， 并 用噬菌体表达为融合蛋白， 且是有功能的。
     因此， 本发明的特征是对 C3b 具有高亲和力的骆驼抗体或纳米抗体。在此处的某 些实施方案中， 所述骆驼抗体或纳米抗体在骆驼动物中天然产生， 即， 使用此处为其它抗体 描述的技术， 用 C3b 或其肽片段免疫骆驼来产生。或者， 改造， 即如此处实施例中所述使用 C3b 作为靶标的淘选方法， 通过例如从展示适当诱导的骆驼纳米抗体蛋白质的噬菌体文库 中选择产生 C3b 结合的骆驼纳米抗体。可通过遗传改造进一步定制改造的纳米抗体， 以在 受体受试者中具有从 45 分钟到两周的半衰期。在特定实施方案中， 如 PCT/EP93/02214 所 述， 通过将本发明人抗体的重链或轻链的 CDRs 序列移植到纳米抗体或单结构域抗体构架 序列中来获得骆驼抗体或纳米抗体。
     双特异性分子和多价抗体
     另一方面， 本发明描述了包含本发明 C3b 结合抗体或其片段的双特异性或多特异 性分子。本发明的抗体或其抗原结合片段可衍生或连接另一功能分子， 例如另一肽或蛋白 质 ( 例如， 另一抗体或受体的配体 )， 来产生结合至少两种不同结合位点或靶分子的双特异 性分子。本发明的抗体可实际上衍生或连接超过一种其它功能分子， 以产生结合多于两种 不同结合位点和 / 或靶分子的多特异性分子 ； 此处所用的术语 “双特异性分子” 也旨在包括 此类多特异性分子。为了产生本发明的双特异性分子， 本发明的抗体可在功能上连接 ( 例 如， 通过化学偶联、 遗传融合、 非共价结合或其它 ) 一个或更多其它结合分子， 如另一抗体、 抗体片段、 肽或结合模拟物， 以便产生双特异性分子。
     因此， 本发明包括双特异性分子， 其包含对 C3b 的至少第一种结合特异性， 和对第 二个靶表位的第二种结合特异性。例如， 所述第二个靶表位是 C3b 的不同于第一个靶表位 的另一表位。
     此外， 对于其中双特异性分子是多特异性的发明， 除了第一个和第二个靶表位之 外， 所述分子可以还包括第三种结合特异性。
     在一个实施方案中， 本发明的双特异性分子包含作为结合特异性的至少一种抗 体， 或其抗体片段， 包括例如， Fab、 Fab′、 F(ab′ )2、 Fv 或单链 Fv。所述抗体还可以是轻链 或重链二聚体， 或其任何最小片段， 如 Ladner 等美国专利号 4,946,778 中描述的 Fv 或单链 构建体。
     双抗体是二价的双特异性分子， 其中 VH 和 VL 结构域在单条多肽链上表达， 通 过太短以至于不能在同一条链上两个结构域之间配对的接头连接。所述 VH 和 VL 结构 域与另一条链的互补结构域配对， 由此产生两个抗原结合位点 ( 参阅例如， Holliger 等， 1993Proc.Natl.Acad.Sci.USA90 ： 6444-6448 ； Poljak 等， 1994 Structure 2 ： 1121-1123)。 可 通 过 在 同 一 细 胞 中 表 达 具 有 结 构 VHA-VLB 和 VHB-VLA(VH-VL 构 型 )， 或 VLA-VHB 和 VLB-VHA(VL-VH 构型 ) 的两条多肽链来产生双抗体。大多数的双抗体在细菌中以可溶形 式表达。通过连接两条双抗体形成多肽链与大约 15 个氨基酸残基的接头产生单链双抗体 (scDb)( 参 阅 Holliger 和 Winter， 1997 CancerImmunol.Immunother.， 45(3-4) ： 128-30 ； Wu 等， 1996 Immunotechnology， 2(1) ： 21-36)。scDb 在细菌中以可溶的活性单体形式表达 ( 参 阅 Holliger 和 Winter， 1997 Cancer Immunol.Immunother.， 45(34) ： 128-30 ； Wu 等，1996Immunotechnology， 2(1) ： 21-36 ； Pluckthun 和 Pack， 1997Immunotechnology， 3(2) ： 83-105 ； Ridgway 等， 1996 Protein Eng.， 9(7) ： 617-21)。双抗体可融合到 Fc 上， 以产生 “二 - 双抗体” ( 参阅 Lu 等， 2004J.Biol.Chem.， 279(4) ： 2856-65)。
     可用于本发明的双特异性分子中的其它抗体是鼠类、 嵌合和人源化单克隆抗体。
     可使用本领域已知的方法， 通过缀合成分结合特异性来制备本发明的双特异性分 子。例如， 可单独产生双特异性分子的每一结合特异性， 然后相互缀合。当结合特异性是 蛋白质或肽时， 多种偶联或交联剂可用于共价缀合。交联剂的实例包括 A 蛋白、 碳二亚胺、 N- 琥珀酰亚胺基 -S- 乙酰 - 硫代乙酸酯 (SATA)、 5， 5′ - 二硫代双 (2- 硝基苯甲酸 )(DTNB)、 邻 - 亚苯基二马来酰亚胺 (oPDM)、 N- 琥珀酰亚胺基 -3-(2- 吡啶基二硫代 ) 丙酸酯 (SPDP) 和磺基琥珀酰亚胺基 4-(N- 马来酰亚胺基甲基 ) 环己烷 -l- 羧酸酯 ( 磺基 -SMCC)( 参阅例 如， Karpovsky 等， 1984 J.Exp.Med.160 ： 1686 ； Liu， MA 等， 1985 Proc.Natl.Acad.Sci.USA 82 ： 8648)。其它方法包括在 Paulus， 1985Behring Ins.Mitt.No.78， 118-132 ； Brennan 等， 1985 Science 229 ： 81-83 和 Glennie 等， 1987 J.Immunol.139 ： 2367-2375 中描述的那些。 缀合剂是 SATA 和磺基 -SMCC， 两者均可从 Pierce Chemical Co.(Rockford， IL) 获得。
     当结合特异性是抗体时， 它们可通过两条重链的 C 末端铰链区的巯基成键而缀 合。在特定实施方案中， 在缀合之前修饰铰链区以含有奇数个巯基残基， 例如 1 个。
     或者， 两种结合特异性可在相同载体中编码， 并在相同宿主细胞中表达并装配。 其 中双特异性分子是 mAb x mAb、 mAb x Fab、 Fab x F(ab′ )2 或配体 x Fab 融合蛋白质时， 该 方法是特别有用的。本发明的双特异性分子可以单链分子， 其包含一个单链抗体和结合决 定簇， 或包含两个结合决定簇的单链双特异性分子。双特异性分子可包含至少两个单链分 子。 例如在美国专利号 5,260,203 ； 美国专利号 5,455,030 ； 美国专利号 4,881,175 ； 美国专 利号 5,132,405 ； 美国专利号 5,091,513 ； 美国专利号 5,476,786 ； 美国专利号 5,013,653 ； 美国专利号 5,258,498 ； 和美国专利号 5,482,858 中描述了用于制备双特异性分子的方法。
     例如， 通过酶联免疫吸附测定 (ELISA)、 放射免疫测定 (REA)、 FACS 分析、 生物测定 ( 例如生长抑制 )、 或 Western 印迹测定来验证双特异性分子与其特异性靶标的结合。这些 测定法中的每一种一般通过使用对目的复合体特异的标记试剂 ( 例如抗体 ) 检测特别重要 的蛋白质 - 抗体复合物的存在。
     另一方面， 本发明提供多价化合物， 其包含结合 C3b 的本发明抗体的至少两个相 同或不同的抗原结合部分。 所述抗原结合部分可通过蛋白质融合或共价或非共价键而连接 在一起。或者， 已经为双特异性分子描述了连接方法。例如通过交联本发明的抗体与结合 本发明抗体的恒定区， 例如 Fc 或铰链区获得四价化合物。
     例 如 在 Borean 专 利 EP 1 012 280B1 中 描 述 了 三 聚 化 结 构 域。 例 如 在 PCT/ EP97/05897 中描述了五聚化模块。
     具有延长半衰期的抗体
     本发明提供特异性结合 C3b 蛋白质的在体内具有延长半衰期的抗体。
     许多因素可影响蛋白质在体内的半衰期。例如， 肾过滤、 肝中的新陈代谢、 蛋白酶 解酶 ( 蛋白酶 ) 的降解和免疫原性应答 ( 例如， 抗体的蛋白质中和及巨噬细胞和树突状 细胞的吸收 )。多种策略可用于延长本发明抗体的半衰期。例如， 通过化学连接聚乙二醇 (PEG)、 reCODE PEG、 抗体支架、 聚唾液酸 (PSA)、 羟乙基淀粉 (HES)、 白蛋白结合配体、 和糖类保护层 ； 通过遗传融合到结合血清蛋白质的蛋白质， 如白蛋白、 IgG、 FcRn， 和转移 ； 通过偶 联 ( 遗传上或化学上 ) 到其它结合部分， 所述结合部分结合血清蛋白质， 如纳米抗体、 Fabs、 DARPins、 avimers、 affibodies 和 anticalins ； 通过遗传融合 rPEG、 白蛋白、 白蛋白的结构 域、 白蛋白结合蛋白质和 Fc ； 或通过掺入到 nancarriers 中， 减缓释放制剂和医疗设备。
     为了延长抗体在体内的血清循环， 可使用或不使用多功能接头通过 PEG 位点特异 性缀合到抗体 N 或 C 末端或通过赖氨酸残基上存在的 ε 氨基将惰性聚合分子如高分子量 PEG 附着到抗体或其片段上。为了聚乙二醇化抗体， 抗体或其片段通常与聚乙二醇 (PEG)， 如 PEG 的活性酯或醛衍生物在其中一个或更多 PEG 基团变得附着到抗体或其片段的条件下 进行反应。可利用活性 PEG 分子 ( 或类似活性水溶性聚合物 ) 通过酰化反应或烷化反应进 行聚乙二醇化。如此处所用， 术语 “聚乙二醇” 旨在包括任何的 PEG 形式， 其已经用于衍生 其它蛋白质， 如单 (C1-C10) 烷氧基或芳氧基 - 聚乙二醇或聚乙二醇 - 马来酰亚胺。在某些 实施方案中， 待聚乙二醇化的抗体是无糖基化抗体。使用导致生物活性损失最小的线性或 分支聚合物衍生化。可通过 SDS-PAGE 和质谱密切监测缀合的程度， 来保证 PEG 分子与抗体 的正确缀合。可通过大小排排阻或通过离子交换层析从抗体 -PEG 缀合物中分离未反应的 PEG。可使用本领域技术人员熟知的方法， 例如通过此处描述的免疫测定法测试 PEG 衍生抗 体的结合活性以及体内功效。聚乙二醇化蛋白质的方法为本领域所知， 并可应用到本发明 的抗体中。参阅例如， Nishimura 等的 EP 0 154 316 和 Ishikawa 等的 EP 0 401 384。
     其它修改的聚乙二醇化技术包括重建化学正交指导的改造技术 (ReCODE PEG)， 其 将化学上特定的侧链通过包括 tRNA 合成酶和 tRNA 的重建系统掺入到生物合成蛋白质中。 该技术能够在大肠杆菌、 酵母和哺乳动物细胞中将多于 30 个新氨基酸掺入到生物合成蛋 白质中。所述 tRNA 将非天然氨基酸掺入到琥珀密码子定位的任何位置， 使琥珀密码子从终 止密码子转化成信令化学上特定的氨基酸掺入的一个密码子。
     重组聚乙二醇化技术 (rPEG) 也可用于血清半衰期延长。该技术包括将 300-600 个氨基酸未组织的蛋白质尾巴融合到现有的药物蛋白质上。 因为该未组织蛋白质链的表观 分子量比其实际分子量大约 15 倍， 所以极大延长了该蛋白质的血清半衰期。与需要化学缀 合和再纯化的常规聚乙二醇化相反， 该制备方法极其简化并且产品是同质的。
     多唾液酸化是另一种技术， 其使用天然聚合物聚唾液酸 (PSA) 来延长活性生命并 提高治疗肽和蛋白质的稳定性。PSA 是唾液酸的聚合物 ( 糖 )。当用于蛋白质和治疗肽药 物递送时， 聚唾液酸在缀合上提供保护性微环境。这增加了治疗蛋白质在循环中的活性生 命并防止其被免疫系统识别。 PSA 聚合物天然见于人体中。 其被某些细菌采用， 所述细菌进 化了超过数百万年， 用所述 PSA 聚合物包被自身的壁。通过分子拟态， 这些天然多唾液酸化 细菌然后能够挫败身体的防御系统。 PSA 是自然界的最终偷窃技术， 可容易地自此类细菌大 量产生并具有预定的物理特点。甚至当与蛋白质偶联时， 细菌 PSA 也是完全非免疫原性的， 因为它与人体中的 PSA 在化学上相同。
     另一技术包括使用连接抗体的羟乙基淀粉 (“HES” ) 衍生物。HES 是来自蜡状玉 米淀粉的修饰的天然聚合物， 并可通过身体的酶进行新陈代谢。一般施用 HES 溶液来替换 不足的血液体积并改善血液的流变学性质。 抗体的羟乙基化使得能够通过提高分子的稳定 性， 以及降低肾清除率来延长循环半衰期， 产生提高的生物学活性。通过改变不同的参数， 如 HES 的分子量， 可定制广泛的 HES 抗体缀合物。也可通过向 IgG 恒定结构域或其 FcRn 结合片段 ( 优选 Fc 或铰链 Fc 结构域片 段 ) 中引入一个或更多氨基酸修饰 ( 即， 替换、 插入或缺失 ) 产生在体内具有增加的半衰 期的抗体。参阅例如， 国际公开号 WO 98/23289 ； 国际公开号 WO 97/34631 ； 和美国专利号 6,277,375。
     另外， 抗体可缀合到白蛋白 ( 例如， 人血清白蛋白 ； HSA) 上， 以使抗体或抗体片段 在体内更稳定或在体内具有更长的半衰期。技术为本领域所熟知， 参阅例如国际公开号 WO 93/15199、 WO 93/15200 和 WO 01/77137 ； 和欧洲专利号 EP 413,622。此外， 在上文描述的 双特异性抗体的背景中， 可设计抗体的特异性， 以便抗体的一个结合域结合 C3b， 而抗体的 第二个结合域结合血清白蛋白， 优选 HSA。
     提高半衰期的策略特别用于纳米抗体、 基于纤连蛋白的结合子， 和期望提高体内 半衰期的其它抗体或蛋白质。
     抗体缀合物
     本发明提供特异性结合 C3b 蛋白质的抗体或其片段， 其重组融合或化学缀合 ( 包 括共价和非共价缀合 ) 到异源蛋白质或多肽 ( 或其片段， 优选至少 10、 至少 20、 至少 30、 至少 40、 至少 50、 至少 60、 至少 70、 至少 80、 至少 90 或至少 100 个氨基酸的多肽 )， 以产 生融合蛋白质。具体而言， 本发明提供包含此处所述抗体的抗原结合片段 ( 例如， Fab 片 段、 Fd 片段、 Fv 片段、 F(ab)2 片段、 VH 结构域、 VH CDR、 VL 结构域或 VL CDR) 和异源蛋白 质、 多肽或肽的融合蛋白质。用于融合或缀合蛋白质、 多肽或肽到抗体或抗体片段上的方 法为本领域所知。参阅例如美国专利号 5,336,603、 5,622,929、 5,359,046、 5,349,053、 5,447,851 和 5,112,946 ； 欧洲专利号 EP 307,434 和 EP 367,166 ； 国际公开号 WO 96/04388 和 WO91/06570 ； Ashkenazi 等， 1991， Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88 ： 10535-10539 ； Zheng 等， 1995， J.Immunol.154 ： 5590-5600 ； 和 Vil 等， 1992， Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89 ： 11337-11341。
     可通过基因改组、 基序改组、 外显子改组和 / 或密码子改组 ( 共同称为 “DNA 改 组” ) 的技术产生额外的融合蛋白质。可使用 DNA 改组来改变本发明抗体或其片段的 活性 ( 例如， 具有更高亲和力和更低解离速率的抗体或其片段 )。一般参阅美国专利 号 5,605,793、 5,811,238、 5,830,721、 5,834,252 和 5,837,458 ； Patten 等， 1997， Curr. Opinion Biotechnol.8 ： 724-33 ； Harayama， 1998， Trends Biotechnol.16(2) ： 76-82 ； Hansson 等， 1999， J.Mol.Biol.287 ： 265-76 ； 以及 Lorenzo 和 Blasco， 1998， Biotechniques 24(2) ： 308-313( 这些专利和出版物每一文件以其整体引入作为参考 )。 可在重组之前通过 易错 PCR、 随机核苷酸插入或其它方法进行随机诱变来改变抗体或其片段， 或编码的抗体或 其片段。编码特异性结合 C3b 蛋白质的抗体或其片段的多核苷酸可与一种或更多异源分子 的一个或更多组分、 基序、 断片、 部分、 结构域、 片段等重组。
     此外， 抗体或其片段可融合到标记序列上， 如肽， 以利于纯化。在优选的实施 方案中， 标记氨基酸序列是六组氨酸肽， 如 pQE 载体 (QIAGEN， Inc.， 9259 Eton Avenue， Chatsworth， CA， 91311) 中提供的标签， 其中许多可以通过商业途径获得。如 Gentz 等， 1989， Proc.Natl.Acad.Sci.USA86 ： 821-824 中所述， 六组氨酸提供融合蛋白质的便利纯 化。可用于纯化的其它肽标签包括， 但不限于血凝素 ( “HA” ) 标签， 其对应于来自流行性感 冒血凝素蛋白质的表位 (Wilson 等， 1984， Cell 37 ： 767) 和 “flag” 标签。在其它实施方案中， 本发明的抗体或其片段缀合诊断或检测试剂。此类抗体可用 于监测或预后疾病或病症的开始、 发展、 进行和 / 或严重性， 作为临床试验程序的一部分， 如测定特定治疗的功效。可通过将抗体与可检测物质偶联完成此类诊断和检测， 所述可检 测物质包括但不限于多种酶， 如但不限于， 辣根过氧化物酶、 碱性磷酸酶、 β- 半乳糖苷酶、 或乙酰胆碱酯酶 ； 辅基， 如但不限于链霉抗生物素蛋白生物素和抗生物素蛋白 / 生物素 ； 荧 光物质， 如但不限于伞形酮、 荧光素、 异硫氰酸荧光素、 罗丹明、 二氯三嗪基胺荧光素、 丹磺 酰氯或藻红蛋白 ； 发光物质， 如但不限于鲁米诺 ； 生物发光物质， 如但不限于荧光素酶、 荧 光素和水母发光蛋白 ； 放射性物质， 如但不限于碘 (131I、 125I、 123I 和 121I)、 碳 (14C)、 硫 (35S)、 氚 (3H)、 铟 (115In、 113In、 112In 和 111In)、 锝 (99Tc)、 铊 (201Ti)、 镓 (68Ga、 67Ga)、 钯 (103Pd)、钼 (99Mo)、氙 (133Xe)、氟 (18F)、 153Sm、 177Lu、 159Gd、 149Pm、 140La、 175Yb、 166Ho、 90Y、 47Sc、 186Re、 188Re、 142Pr、 105Rh、 97Ru、 68Ge、 57Co、 65Zn、 85Sr、 32P、 153Gd、 169Yb、 51Cr、 54Mn、 75Se、 113Sn 和 117Tin ； 和使用多种正电子发射断层术的正电子发射金 属， 和非放射性顺磁金属离子。
     本发明还包括缀合治疗部分的抗体或其片段的用途。 抗体或其片段可缀合到治疗 部分， 如细胞毒素， 例如细胞生长抑制剂或细胞自杀剂， 治疗剂或放射性金属离子， 例如 α 粒子发射体。细胞毒素或细胞毒性剂包括对细胞有害的任何试剂。
     另外， 抗体或其片段可缀合到修饰给定生物反应的治疗部分或药物部分。治疗部 分或药物部分不解释为限制为典型的化学治疗剂。例如， 药物部分可以是具有想要的生物 学活性的蛋白质、 肽或多肽。此类蛋白质可包括例如， 毒素如相思豆毒蛋白、 蓖麻毒蛋白 A、 假单胞菌外毒素、 霍乱毒素或白喉毒素 ； 蛋白质如肿瘤坏死因子、 α 干扰素、 β 干扰素、 神 经生长因子、 血小板衍生生长因子、 组织纤溶酶原激活物、 细胞凋亡剂、 抗血管生成剂 ； 或生 物反应修饰因子， 例如淋巴因子。
     此外， 抗体可缀合到治疗部分， 如放射性金属离子， 如 α 粒子发射体， 如用于将放 射性金属离子 ( 包括但不限于 131In、 131LU、 131Y、 131Ho、 131Sm) 缀合到多肽上的 213Bi 或大环螯合剂。在某些实施方案中， 所述大环螯合剂是 1， 4， 7， 10- 四氮杂环十二烷 -N， N’ ， N” ， N’ ” - 四乙酸 (DOTA)， 其可通过接头分子附着到抗体上。此类接头分子为本领域所 熟知， 并描述于 Denardo 等， 1998， Clin Cancer Res.4(10) ： 2483-90 ； Peterson 等， 1999， Bioconjug.Chem.10(4) ： 553-7 ； 和 Zimmerman 等， 1999， Nucl.Med.Biol.26(8) ： 943-50， 每 一参考文献以其整体引入作为参考。
     用 于 将 治 疗 部 分 缀 合 到 抗 体 上 的 技 术 是 众 所 周 知 的， 参 阅 例 如 Arnon 等， “Monoclonal Antibodies For Immunotargeting Of Drugs In CancerTherapy” ， Monoclonal Antibodies And Cancer Therapy， Reisfeld 等 ( 编辑 )， 第 243-56 页 (Alan R.Liss， Inc.1985) ； Hellstrom 等， “Antibodies For DrugDelivery” ， Controlled Drug Delivery( 第 2 版 Robinson 等 ( 编 辑 )，第 623-53 页 (Marcel Dekker， Inc.1987) ； Thorpe， “Antibody Carriers Of CytotoxicAgents In Cancer Therapy ： A Review” ， Monoclonal Antibodies 84 ： Biological And Clinical Applications ， Pinchera 等 ( 编 辑 )， 第 475-506 页 (1985) ； “Analysis， Results， And Future Prospective Of The TherapeuticUse Of Radiolabeled Antibody In Cancer Therapy” ， MonoclonalAntibodies For Cancer Detection And Therapy， Baldwin 等 ( 编 辑 )， 第303-16 页 (Academic Press 1985)， 和 Thorpe 等， 1982， Immunol.Rev.62 ： 119-58。
     抗体也可附着到固相支持体上， 所述固相支持体特别用于靶抗原的免疫测定或纯 化。 此类固相支持体包括， 但不限于玻璃、 纤维素、 聚丙烯酰胺、 尼龙、 聚苯乙烯、 聚氯乙烯或 聚丙烯。
     产生本发明抗体的方法
     编码抗体的核酸
     本发明提供基本纯化的核酸分子， 其编码包含上文描述的 C3b 结合抗体链的区段 或结构域的多肽。 本发明的一些核酸包含编码示于 SEQ ID NO ： 7、 21、 35、 49、 63、 77、 91、 105、 119、 133、 147、 161、 175 和 189 的重链可变区的核苷酸序列， 和 / 或编码示于 SEQ ID NO ： 8、 22、 36、 50、 64、 78、 92、 106、 120、 134、 148、 162、 176 的轻链可变区的核苷酸序列。在特定实施 方案中， 核酸分子是在表 1 中鉴定的那些核酸分子。 本发明的一些其它核酸分子包含与表 1 中鉴定的那些核酸分子的核苷酸序列基本相同 ( 例如至少 65、 80％、 95％或 99％ ) 的核苷 酸序列。当从适当表达载体进行表达时， 这些多核苷酸编码的多肽能够显示 C3b 抗原结合 能力。
     本发明还提供的是编码来自上文阐明的 C3b 结合抗体的重链和轻链的至少一个 CDR 区以及一般地所有三个 CDR 区的多核苷酸。一些其它多核苷酸编码上文阐明的 C3b 结 合抗体的重链和 / 或轻链的所有或基本上所有可变区序列。因为密码子的简并性， 多种核 酸序列编码每一种免疫球蛋白氨基酸序列。
     本发明的核酸分子可编码抗体的可变区和恒定区。 一些本发明的核酸序列包含编 码成熟重链序列的核苷酸， 所述成熟重链序列与在 SEQ IDNOs ： 9、 23、 37、 51、 65、 79、 93、 107、 121、 135、 149、 163、 177 和 191 中阐明的成熟重链序列基本相同 ( 例如， 至少 80 ％、 90 ％或 99％ )。一些其它核酸序列包含编码成熟轻链序列的核苷酸， 所述成熟轻链序列与在 SEQID NOs ： 10、 24、 38、 52、 66、 80、 94、 108、 122、 136、 150、 164、 178 和 192 中阐明的成熟轻链序列基 本相同 ( 例如， 至少 80％、 90％或 99％ )。
     可通过从头固相 DNA 合成或通过 PCR 诱变编码 C3b 结合抗体或其结合片段的现有 序列 ( 例如下文实施例中描述的序列 ) 来产生多核苷酸序列。可通过本领域已知的方法， 如 Narang 等， 1979， Meth.Enzymol.68 ∶ 90 的磷酸三酯法 ； Brown 等， Meth.Enzymol.68 ： 109， 1979 的磷酸二酯法 ； Beaucage 等， Tetra.Lett.， 22 ： 1859， 1981 的二乙基亚磷酰胺法 ； 和美国专利号 4,458,066 的固相支持物法完成核酸的直接化学合成。如 PCR Technology ： Principles and Applications for DNA Amplification， H.A.Erlich( 编辑 )， Freeman Press， NY， NY， 1992 ； PCR Protocols ： A Guide to Methods andApplications， Innis 等 ( 编 辑 )， Academic Press， San Diego， CA， 1990 ； Mattila 等， Nucleic Acids Res.19 ： 967， 1991 ； 和 Eckert 等， PCR Methodsand Applications 1 ： 17， 1991 中描述的进行通过 PCR 向多核苷 酸序列中引入突变。
     本发明还提供用于产生上文所述 C3b 结合抗体的表达载体和宿主细胞。可使用 多种表达载体来表达编码 C3b 结合抗体链或结合片段的多核苷酸。基于病毒的表达载体 和非病毒表达载体均可用于在哺乳动物宿主细胞中产生抗体。非病毒载体和系统包括质 粒、 游离型载体， 通常具有用于表达蛋白质或 RNA 的表达盒， 和人工染色体 ( 参阅例如， Harrington 等， NatGenet 15 ： 345， 1997)。例如， 用于在哺乳动物 ( 例如人 ) 细胞中表达C3b 结合多核苷酸和多肽的非病毒载体包括 pThioHis A、 B&C、 pcDNA3.1/His、 pEBVHis A、 B&C(Invitrogen， San Diego， CA)、 MPSV 载体， 和本领域中已知用于表达其它蛋白质的许多 其它载体。 有用的病毒载体包括基于逆转录病毒、 腺病毒、 腺伴随病毒、 疱疹病毒的载体、 基 于 SV40、 乳头瘤病毒、 HBP EB 病毒、 痘苗病毒载体和 Semliki Forest 病毒 (SFV) 的载体。 参 阅， Brent 等， 上文 ； Smith， Annu.Rev.Microbiol.49 ： 807， 1995 ； 和 Rosenfeld 等， Cell 68 ： 143， 1992。
     表达载体的选择依赖于其中待表达所述载体的预期宿主细胞。通常， 所述表达载 体含有有效连接编码 C3b 结合抗体链或片段的多核苷酸的启动子和其它调节序列 ( 例如， 增强子 )。 在一些实施方案中， 使用诱导型启动子来防止插入序列的表达 ( 除了在诱导条件 下之外 )。诱导型启动子包括， 例如阿拉伯糖、 lacZ、 金属硫蛋白启动子或热激启动子。可 在非诱导条件下扩大转化生物的培养， 而不偏向编码序列的群体， 宿主细胞能更好地耐受 所述编码序列的表达产物。除了启动子， 也需要或想要其它调节元件用于 C3b 结合抗体链 或片段的有效表达。这些元件通常包括 ATG 起始密码子和邻近核糖体结合位点或其它序 列。此外， 可通过包括适合于使用中的细胞系统的增强子来增强表达的效率 ( 参阅例如， Scharf 等， Results Probl.Cell Differ.20 ： 125， 1994 ； 和 Bittner 等， Meth.Enzymol.， 153 ： 516， 1987)。例如， SV40 增强子或 CMV 增强子可用于提高哺乳动物宿主细胞中的表达。
     表达载体也可提供分泌信号序列位置， 以与插入的 C3b 结合抗体序列编码的多肽 形成融合蛋白质。更经常地， 所述插入的 C3b 结合抗体序列在包括在载体中之前连接信号 序列。待用于接受编码 C3b 结合的抗体轻链和重链可变结构域的序列的载体有时候也编码 恒定区或其部分。此类载体允许可变区表达为与恒定区的融合蛋白质， 由此导致完整抗体 或其片段的产生。通常， 此类恒定区是人的恒定区。
     用于携带并表达 C3b 结合抗体链的宿主细胞可以是原核细胞或真核细胞。大肠杆 菌是用于克隆并表达本发明多核苷酸的一种原核宿主。 适于使用的其它微生物宿主包括芽 孢杆菌， 如枯草杆菌 (Bacillus subtilis)， 和其它肠杆菌科 (enterobacteriaceae)， 如沙 门氏菌属 (Salmonella)、 沙雷氏菌属 (Serratia) 和多种假单胞菌属 (Pseudomonas) 物种。 在这些原核宿主中， 也可以制备表达载体， 其通常含有与所述宿主细胞相容的表达控制序 列 ( 例如， 复制起点 )。此外， 存在任何数量的多种众所周知的启动子， 如乳糖启动子系统、 色氨酸 (trp) 启动子系统、 β- 内酰胺酶启动子系统， 或来自 λ 噬菌体的启动子系统。所 述启动子通常任选地与操纵子序列控制表达， 并具有核糖体结合位点序列等， 用于起始并 完成转录和翻译。其它微生物， 如酵母也可用于表达本发明的 C3b 结合多肽。也可使用昆 虫细胞与杆状病毒载体组合。
     在一些优选的实施方案中， 哺乳动物宿主细胞用于表达并产生本发明的 C3b 结合 多肽。例如， 它们可以是表达内源免疫球蛋白基因的杂交瘤细胞系 ( 例如， 实施例中描述 的 1D6.C9 骨髓瘤杂交瘤克隆 ) 或携带外源表达载体的哺乳动物细胞系 ( 例如， 下文示例的 SP2/0 骨髓瘤细胞 )。这些包括任何正常致死或正常或非正常永生动物或人细胞。例如， 已 经开发了能够分泌完整免疫球蛋白的大量合适宿主细胞系， 包括 CHO 细胞系、 多种 Cos 细胞 系、 HeLa 细胞、 骨髓瘤细胞系、 转化的 B 细胞和杂交瘤。一般在例如 Winnacker， FROM GENES TO CLONES， VCH Publishers， N.Y.， N.Y.， 1987 中讨论了哺乳动物组织细胞培养物表达多 肽的用途。 用于哺乳动物宿主细胞的表达载体可包括表达控制序列， 如复制起点、 启动子和增强子 ( 参阅例如， Queen 等， Immunol.Rev.89 ： 49-68， 1986)、 和必要的加工信息位点， 如 核糖体结合位点、 RNA 剪接位点、 多腺苷酸化位点和转录终止子序列。这些表达载体一般含 有来自哺乳动物基因或来自哺乳动物病毒的启动子。合适的启动子可以是组成型的、 细胞 类型特异的、 阶段特异的、 和 / 或可调整的或可调节的。有用的启动子包括， 但不限于金属 硫蛋白启动子、 组成型腺病毒主要晚期启动子、 地塞米松诱导型 MMTV 启动子、 SV40 启动子、 MRP polIII 启动子、 组成型 MPSV 启动子、 四环素诱导型 CMV 启动子 ( 如人立即早期 CMV 启 动子 )、 组成型 CMV 启动子和本领域已知的启动子 - 增强子组合。
     用于引入含有目的多核苷酸序列的表达载体的方法根据细胞宿主的类型变化。 例 如， 氯化钙转染通常用于原核细胞， 而磷酸钙处理或电穿孔可用于其它细胞宿主。( 一般参 阅 Sambrook， 等， 上文 )。其它方法包括， 例如电穿孔、 磷酸钙处理、 脂质体介导的转化、 注射 和显微注射、 生物射弹方法、 病毒体、 免疫脂质体、 聚阳离子 ： 核酸缀合物、 裸 DNA、 人工病毒 体、 与疱疹病毒结构蛋白 VP22 的融合物 (Elliot 和 O′ Hare， Cell 88 ： 223， 1997)、 DNA 的 试剂增强的吸收和离体转导。对于重组蛋白质的长期、 高产量生产， 通常想要稳定表达。例 如， 可使用含有病毒复制起点或内源表达元件和选择标记基因的本发明的表达载体制备稳 定表达 C3b 结合抗体链或结合片段的细胞系。引入载体后， 可以允许细胞在富集培养基中 生长 1-2 天后转换到选择性培养基。选择标记的目的是赋予选择抗性， 并且其存在允许成 功表达所引入序列的细胞在选择性培养基中生长。 使用对细胞类型合适的组织培养技术增 殖具有抗性的稳定转染的细胞。
     本发明单克隆抗体的产生
     可 通 过 多 种 技 术， 包 括 常 规 单 克 隆 抗 体 方 法， 例 如 Kohler 和 Milstein， 1975 Nature 256 ： 495 的标准体细胞杂交技术来产生单克隆抗体 (mAbs)。可使用产生单克隆抗 体的许多技术， 例如， 病毒转化或 B 淋巴细胞的致癌性转化。
     用于制备杂交瘤的动物系统是鼠类系统。小鼠中杂交瘤的产生是良好建立的程 序。分离免疫的脾细胞用于融合的免疫方案和技术为本领域所知。融合配偶体 ( 例如鼠类 骨髓瘤细胞 ) 和融合步骤也是已知的。
     可在如上文描述制备的鼠类单克隆抗体的序列基础上制备本发明的嵌合或人源 化抗体。 可使用标准分子生物学技术从目的鼠类杂交瘤中获得编码重链和轻链免疫球蛋白 的 DNA， 并进行改造以含有非鼠类 ( 例如， 人 ) 免疫球蛋白序列。 例如， 为了产生嵌合抗体， 可 使用本领域已知的方法将鼠类可变区连接到人恒定区 ( 参阅例如， Cabilly 等的美国专利 号 4,816,567)。为了产生人源化抗体， 可使用本领域已知的方法将鼠类 CDR 区插入人构架 中。 参阅例如， Winter 的美国专利号 5225539， 和 Queen 等的美国专利号 5530101 ； 5585089 ； 5693762 和 6180370。
     在某一实施方案中， 本发明抗体是人单克隆抗体。可使用携带人免疫系统的部分 而非小鼠系统的转基因或转染色体小鼠产生针对 C3b 的此类人单克隆抗体。这些转基因和 转染色体小鼠包括此处分别称为 HuMAb 小鼠和 KM 小鼠的小鼠， 并在此处统称为 “人 Ig 小 鼠” 。
     HuMAb 小鼠 (Medarex， Inc.) 含有编码未重排人重链 (μ 和 γ) 和 K 轻链免 疫球蛋白序列的人免疫球蛋白基因小基因座 (miniloci)， 以及失活内源 μ 和 K 链基因 座的靶向突变 ( 参阅例如， Lonberg， 等， 1994Nature368(6474) ： 856-859)。因此， 小鼠显示降低表达的小鼠 IgM 或 K， 并且响应免疫时， 引入的人重链和轻链转基因经历类别转 换和体细胞突变， 产生高亲和力人 IgGK 单克隆抗体 (Lonberg， N. 等， 1994 上文 ； 综述见 于 Lonberg， N.， 1994 Handbook of Experimental Pharmacology 113 ： 49-101 ； Lonberg， N. 和 Huszar， D.， 1995 Intern.Rev.Immunol.13 ： 65-93， 以及 Harding， F. 和 Lonberg， N.， 1995 Ann.N.Y.Acad.Sci.764 ： 536-546)。HuMAb 小鼠的制备和用途以及该小鼠携带的基因 组修饰进一步描述于 Taylor， L. 等， 1992Nucleic Acids Research 20 ： 6287-6295 ； Chen， J. 等， 1993 InternationalImmunology 5 ： 647-656 ； Tuaillon 等， 1993Proc.Natl.Acad. Sci.USA94 ： 3720-3724 ； Choi 等， 1993Nature Genetics 4 ： 117-123 ； Chen， J. 等， 1993EMBO J.12 ： 821-830 ； Tuaillon 等， 1994 J.Immunol.152 ： 2912-2920 ； Taylor ， L. 等， 1994 International Immunology 579-591 ； 和 Fishwild， D. 等， 1996 Nature Biotechnology 14 ： 845-851， 所有参考文献的内容以其整体明确引入作为参考。进一步参阅均为 Lonberg 和 Kay 的 美 国 专 利 号 5,545,806 ； 5,569,825 ； 5,625,126 ； 5,633,425 ； 5,789,650 ； 5,877,397 ； 5,661,016 ； 5,814,318 ； 5,874,299 和 5,770,429 Surani 等 的 美 国 专 利 号 5,545,807 ； 均为 Lonberg 和 Kay 的 PCT 公开号 WO 92103918、 WO 93/12227、 WO 94/25585、 WO97113852、 WO 98/24884 和 WO 99/45962 ； 和 Korman 等的 PCT 公开号 WO 01/14424。
     在另一实施方案中， 可使用在转基因和转染色体上携带人免疫球蛋白序列的小 鼠， 如携带人重链转基因和人轻链转染色体的小鼠产生本发明的人抗体。在 Ishida 等的 PCT 公开 WO 02/43478 中详细描述了此处称为 “KM 小鼠” 的这种小鼠。
     进一步， 表达人免疫球蛋白基因的备选转基因动物系统可在本领域中获得， 并可 用于产生本发明的 C3b 结合抗体。例如， 可使用称为 Xenomouse(Abgenix， Inc.) 的备选 转基因系统。在例如 Kucherlapati 等的美国专利号 5,939,598 ； 6,075,181 ； 6,114,598 ； 6,150,584 和 6,162,963 中描述了此类小鼠。
     此外， 表达人免疫球蛋白基因的备选转染色体动物系统可在本领域中获得， 并可 用于产生本发明的 C3b 结合抗体。例如， 可使用称为 “TC 小鼠” 的携带人重链转染色体和人 轻链转染色体的小鼠 ； 在 Tomizuka 等， 2000Proc.Natl.Acad.Sci.USA 97 ： 722-727 中描述 了这种小鼠。另外， 携带人重链和轻链转染色体的奶牛已经描述于本领域中 (Kuroiwa 等， 2002 NatureBiotechnology 20 ： 889-894)， 并可用于产生本发明的 C3b 结合抗体。
     也可使用噬菌体展示方法制备本发明的人单克隆抗体， 用于筛选人免疫球蛋白基 因文库。在本领域中建立或在下文实施例中描述了用于分离人抗体的此类噬菌体展示方 法。 参阅例如 ： Ladner 等的美国专利号 5,223,409 ； 5,403,484 ； 和 5,571,698 ； Dower 等的美 国专利号 5,427,908 和 5,580,717 ； McCafferty 等的美国专利号 5,969,108 和 6,172,197 ； 和 Griffiths 等的美国专利号 5,885,793 ； 6,521,404 ； 6,544,731 ； 6,555,313 ； 6,582,915 和 6,593,081。
     也可使用 SCID 小鼠制备本发明的人单克隆抗体， 在所述 SCID 小鼠中已经重建了 人免疫细胞， 使得在免疫后产生人抗体应答。例如在 Wilson 等的美国专利号 5,476,996 和 5,698,767 中描述了此类小鼠。
     构架或 Fc 改造
     本发明的改造抗体包括其中 VH 和 / 或 VL 内构架残基已经进行了修饰， 例如以改 善抗体性质的那些抗体。通常进行这些构架修饰以降低抗体的免疫原性。例如， 一种方法是将一个或更多构架残基 “回复突变” 成相应的种系序列。更特别地， 已经经历体细胞突变 的抗体含有不同于抗体来源种系序列的构架残基。 可通过比较抗体构架序列与抗体来源的 种系序列来鉴定此类残基。为了将构架区序列恢复成它们的种系构型， 例如通过定点诱变 可以将体细胞突变 “回复突变” 到种系序列中。此类 “回复突变的” 抗体也旨在包括在本发 明内。
     另一类型的构架修饰包括突变构架区， 或甚至一个或更多 CDR 区内的一个或更多 残基， 来去除 T 细胞表位， 由此降低抗体的潜在免疫原性。该方法也称为 “去免疫化” ， 并进 一步详细描述于 Carr 等的美国专利公开号 20030153043 中。
     除了在构架或 CDR 区内进行修饰外或作为备选， 可改造本发明的抗体以包括 Fc 区 内的修饰， 通常用来改变抗体的一种或更多功能性质， 如血清半衰期、 补体结合、 Fc 受体结 合， 和 / 或抗原依赖性细胞毒性。 另外， 可化学修饰 ( 例如， 一个或更多化学部分可附着到抗 体上 ) 或修饰本发明的抗体以改变其糖基化， 再次用于改变抗体的一种或更多功能性质。 在下文中进一步详细描述了这些实施方案中每一个实施方案。Fc 区中残基的编号是 Kabat 的 EU 指数的编号。
     在一个实施方案中， 修饰 CH1 的铰链区， 使得改变， 例如增加或减少铰链区中半胱 氨酸残基的数量。在 Bodmer 等的美国专利号 5,677,425 中进一步描述了该方法。改变 CH1 的铰链区中半胱氨酸残基的数量， 例如用来便于轻链和重链装配， 或提高或降低抗体的稳 定性。
     在另一实施方案中， 突变抗体的 Fc 铰链区， 以降低抗体的生物半衰期。更特别地， 向 Fc 铰链片段的 CH2-CH3 结构域界面区引入一个或更多氨基酸突变， 使得抗体相对于天然 的 Fc 铰链结构域 SpA 结合具有受损的葡萄球菌蛋白 A(SpA) 结合。在 Ward 等的美国专利 号 6,165,745 中进一步描述了该方法。
     在另一实施方案中， 修饰抗体以增加其生物半衰期。多种方法是可能的。例如， 可 引入一个或更多以下突变 ： T252L、 T254S、 T256F， 如 Ward 的美国专利号 6,277,375 中所述。 或者， 为了增加生物学半衰期， 可在 CH1 或 CL 区内改变抗体， 以含有取自 IgG 的 Fc 区的 CH2 结构域的两个环的挽救受体结合表位， 如 Presta 等的美国专利号 5,869,046 和 6,121,022 所述。
     在其它实施方案中， 通过用不同氨基酸残基替换至少一个氨基酸残基来改变 Fc 区域， 以改变抗体的效应功能。例如， 可用不同氨基酸残基替换一个或更多氨基酸， 使得所 述抗体对效应配体具有改变的亲和力， 但保留亲本抗体的抗原结合能力。对其亲和力改变 的效应配体可以是例如， Fc 受体或补体的 C1 组分。在 Winter 等的美国专利号 5,624,821 和 5,648,260 中进一步详细描述了该方法。
     在另一实施方案中， 可用不同氨基酸残基替换选自氨基酸残基的一个或更多氨 基酸， 使得抗体具有改变的 C1q 结合 / 或降低的或消除的补体依赖性细胞毒性 (CDC)。在 Idusogie 等的美国专利号 6,194,551 中进一步详细描述了该方法。
     在另一实施方案中， 改变一个或更多氨基酸残基， 由此改变抗体固定补体的能力。 在 Bodmer 等的 PCT 公开 WO 94/29351 中进一步详细描述了该方法。
     在再一实施方案中， 修饰 Fc 区以提高抗体介导抗体依赖性细胞毒性 (ADCC) 的 能力和 / 或通过修饰一个或更多氨基酸来增加抗体对 Fcγ 受体的亲和力。在 Presta 的PCT 公开 WO 00/42072 中进一步详细了描述该方法。此外， 已经在人 IgG1 上对 FcγRl、 FcγRII、 FcγRIII 和 FcRn 的结合位点进行作图， 并且已经描述了具有提高结合的变体 ( 参 阅 Shields， R.L. 等， 2001 J.Biol.Chen.276 ： 6591-6604)。
     在再一实施方案中， 修饰抗体的糖基化。例如， 可制备无糖基化抗体 ( 即， 所述抗 体缺少糖基化 )。可改变糖基化， 例如用来增加抗体对 “抗原” 的亲和力。可通过例如改变 抗体序列中一个或更多糖基化位点来完成此类糖类修饰。例如， 可进行一个或更多氨基酸 替换， 由此去除该位点上的糖基化， 所述氨基酸替换导致一个或更多可变区构架糖基化位 点的去除。这种无糖基化可增加抗体对抗原的亲和力。在 Co 等的美国专利号 5,714,350 和 6,350,861 中进一步详细了描述该方法。
     此外或备选地， 可以制备具有改变类型糖基化的抗体， 如具有减少量的岩藻糖残 基的低岩藻糖化抗体或具有增加的二等分 GlcNac 结构的抗体。已经显示此类改变的糖基 化模式提高抗体的 ADCC 能力。例如通过在具有改变的糖基化机器的宿主细胞中表达抗体 来完成此类糖类修饰。已经在本领域中描述了具有改变糖基化机器的细胞， 并且其可用作 宿主细胞， 在其中表达本发明重组抗体， 由此产生具有改变的糖基化的抗体。例如， Hang 等 的 EP 1,176,195 描述了具有功能破坏的 FUT8 基因的细胞系， 该基因编码岩藻糖转移酶， 使 得在这种细胞系中表达的抗体显示低岩藻糖化。Presta 的 PCT 公开 WO 03/035835 描述了 变体 CHO 细胞系 Lecl3 细胞， 其将岩藻糖附着到 Asn(297)- 连接的糖类上的能力降低， 也 导致在该宿主细胞中表达的抗体的低岩藻糖化 ( 也参阅 Shields， R.L. 等， 2002 J.Biol. Chem.277 ： 26733-26740)。 Umana 等的 PCT 公开 WO 99/54342 描述了经改造以表达糖蛋白修 饰糖基转移酶 ( 例如， β(1， 4)-N 乙酰葡糖氨基转移酶 III(GnTIII))， 使得在改造的细胞系 中表达的抗体显示增加的二等分 GlcNac 结构， 其导致抗体的 ADCC 活性提高 ( 也参阅 Umana 等， 1999 Nat.Biotech.17 ： 176-180)。
     改造改变的抗体的方法
     如上讨论， 此处显示的具有 VH 和 VL 序列或全长重链和轻链序列的 C3b 结合抗体 可用于通过修饰全长重链和 / 或轻链序列、 VH 和 / 或 VL 序列、 或附着到其上的恒定区产生 新的 C3b 结合抗体。因此， 在本发明的另一方面， 本发明 C3b 结合抗体的结构特征用于产生 结构上相关的 C3b 结合抗体， 其保留了本发明抗体的至少一种功能性质， 如结合人 C3b， 以 及抑制 C3b 的一种或更多功能性质 ( 例如， 在溶血测定中抑制红细胞溶解 )。
     例如， 本发明抗体的一个或更多 CDR 区或其突变可与已知的构架区和 / 或其它 CDRs 重组组合以产生本发明额外的重组改造的 C3b 结合抗体， 如上讨论。其它类型的修饰 包括在先前部分中描述的那些。用于改造方法的起始材料是此处提供的一个或更多 VH 和 / 或 VL 序列， 或其一个或更多 CDR 区。为了产生改造的抗体， 不必实际制备 ( 即， 表达为蛋 白质 ) 具有此处提供的一个或更多 VH 和 / 或 VL 序列， 或其一个或更多 CDR 区的抗体。而 是， 序列中包含的信息用作起始材料， 来产生来自初始序列的 “第二代” 序列， 然后制备所述 “第二代” 序列并将其表达为蛋白质。
     因此， 在另一实施方案中， 本发明提供用于制备 C3b 结合抗体 ； 改变重链可变区抗 体序列和 / 或轻链可变区抗体序列内的至少一个氨基酸残基来产生至少一个改变的抗体 序列 ； 并将所述改变的抗体序列表达为蛋白质的方法， 所述 C3b 结合抗体由以下组成 ： 具有 选自 SEQ ID NOs ： 1、 15、 29、 43、 57、 71、 85、 99、 113、 127、 141、 155、 169 和 183 的 CDR1 序列、 选自 SEQ ID NOs ： 2、 16、 30、 44、 58、 72、 86、 100、 114、 128、 142、 156、 170 和 184 序列， 和 / 或选自 SEQ ID NOs ： 3、 17、 31、 45、 59、 73、 87、 101、 115、 129、 143、 157、 171 和 185 的 CDR3 序列的重链 可变区抗体序列 ； 和具有选自 SEQ ID NOs ： 4、 18、 32、 46、 60、 74、 88、 102、 116、 130、 144、 158、 172 和 186 的 CDR1 序列、 选自 SEQ ID NOs ： SEQ ID NOs ： 5、 19、 33、 47、 61、 75、 89、 103、 117、 131、 145、 159、 173 和 187 的 CDR2 序列， 和 / 或选自 SEQ ID NOs ： 6、 20、 34、 48、 62、 76、 90、 104、 118、 132、 146、 160、 174 和 188 的 CDR3 序列的轻链可变区抗体序列。
     因此， 在另一实施方案中， 本发明提供用于制备经过优化以在哺乳动物细胞中表 达的 C3b 结合抗体 ； 改变全长重链抗体序列和 / 或全长轻链抗体序列内的至少一个氨基酸 残基来产生至少一个改变的抗体序列 ； 并将所述改变的抗体序列表达为蛋白质的方法， 所 述 C3b 结合抗体由以下组成 ： 具有选自 SEQ ID NOs ： 9、 23、 37、 51、 65、 79、 93、 107、 121、 135、 149、 163、 177 和 191 的序列的全长重链抗体序列 ； 和具有选自 SEQ ID NOs ： 10、 24、 38、 52、 66、 80、 94、 108、 122、 136、 150、 164、 178 和 192 的序列的全长轻链抗体序列。
     也 可 通 过 筛 选 抗 体 文 库 制 备 改 变 的 抗 体 序 列， 所述抗体文库具有如 US20050255552 中描述的固定的 CDR3 序列或最小基本结合决定簇以及 CDR1 和 CDR2 序列上 的多样性。可根据适合于从抗体文库中筛选抗体的任何筛选技术， 如噬菌体展示技术进行 筛选。
     标准分子生物学技术可用于制备和表达改变的抗体序列。 所述改变的抗体序列编 码的抗体是保留此处所述 C3b 结合抗体的一种、 一些或所有功能性质的抗体， 所述功能性 质包括， 但不限于与人和 / 或猕猴 C3b 的特异性结合 ； 和所述抗体在溶血测定中抑制红细胞 溶解。
     可使用本领域中可得的标准测定法， 如在实施例中阐明的那些测定法 ( 例如， ELISA) 评估经改变的抗体的功能性质。
     在本发明改造抗体的方法的某些实施方案中， 可沿全部或部分 C3b 结合抗体编码 序列随机或选择性引入突变， 并且可如此处描述的筛选所得的经修饰 C3b 结合抗体的结合 活性和 / 或其它功能性质。已经在本领域中描述了突变方法。例如， Short 的 PCT 公开 WO 02/092780 描述了使用饱和诱变、 合成连接装配或其组合用于产生并筛选抗体突变的方法。 或者， Lazar 等的 PCT 公开 WO 03/074679 描述了使用计算筛选方法来优化抗体理化性质的 方法。
     本发明抗体的表征
     可通过多种功能测定表征本发明的抗体。例如， 它们可通过它们在溶血测定中抑 制红细胞溶解的能力、 与 C3b 蛋白质 ( 例如， 人和 / 或猕猴 C3b) 的亲和力、 它们抑制 C3a 或 C5a 产生的能力、 它们抑制 C3b 沉积的能力、 表位装箱 (binning)、 它们对蛋白酶解的抗性、 及阻断补体级联的能力， 例如它们抑制 MAC 形成的能力来表征。
     多种方法可用于测定补体途径分子的存在和补体系统的激活 ( 参阅例如， 美国专 利号 6,087,120 ； 和 Newell 等， J Lab Clin Med， 100 ： 437-44， 1982)。例如， 可通过 (i) 测 定红细胞的补体介导的溶解 ( 溶血 ) 的抑制 ； (ii) 测定抑制 C3 或 C5 切割的能力 ； 和 (iii) 旁路途径介导的溶血的抑制来监测补体活性。
     两种最常用的技术是溶血测定 ( 参阅例如 Baatrup 等， Ann Rheum Dis， 51 ： 892-7， 1992) 和免疫学测定 ( 参阅例如 Auda 等， Rheumatol Int， 10 ： 185-9， 1990)。所述溶血技术测量经典或旁路途径中完整序列的功能能力。 免疫学技术测量特定补体组分或裂解产物的 蛋白质浓度。在本发明方法中可用于检测补体激活或测定补体组分活性的其它测定法包 括， 例如 T 细胞增殖测定 (Chain 等， J Immunol Methods， 99 ： 221-8， 1987) 和迟发型超敏反 应 (DTH) 测定 (Forstrom 等， 1983， Nature 303 ： 627-629 ； Halliday 等， 1982， Assessment of Immune Status by the Leukocyte Adherence Inhibition Test， Academic， New York 第 1-26 页 ； Koppi 等， 1982， Cell.Immunol.66 ： 394-406 ； 和美国专利号 5,843,449)。
     在溶血技术中， 所有的补体组分必须存在且具有功能。因此， 溶血技术可筛选功 能完整性和补体系统的不足 ( 参阅例如 Dijk 等， J ImmunolMethods 36 ： 29-39， 1980 ； Minh 等， Clin Lab Haematol.5 ： 23-341983 ； 和 Tanaka 等， J Immunol 86 ： 161-170， 1986)。为了 测定经典途径的功能能力， 用溶血素包被的羊红细胞 ( 针对绵羊红细胞的兔 IgG) 或用兔抗 鸡抗体致敏的鸡红细胞用作靶细胞 ( 致敏细胞 )。 这些 Ag-Ab 复合体激活了经典途径， 并当 所述组分有功能且以足够浓度存在时导致靶细胞的溶解。为了确定旁路途径的功能能力， 兔红细胞用作靶细胞 ( 参阅例如美国专利号 6,087,120)。
     为了测试抗体抑制 MAC( 膜攻击复合体 ) 形成的能力， 可进行 MAC 沉积测定。简言 之， 酵母多糖可用于激活旁路途径， 并且 IgM 可用于激活经典途径。用人血清预温育 Fabs， 并将其加到用酵母多糖或 IgM 包被的平板中。 可计算每一样品的 MAC 沉积相对于基线 (EDTA 处理的人血清 ) 和阳性对照 ( 人血清 ) 的百分比抑制。
     为了测试本发明抗体在替代途径中抑制补体蛋白 C3 的能力， 测定在酵母多糖上 沉积的 C3 分解产物 C3b 的产生。在下文实施例中详细描述了用于测定 C3b 沉积的特定方 法。
     可 通 过 例 如 使 用 特 异 性 抗 C5a 抗 体， 如 从 US Biologics 获 得 的 小 鼠 抗 人 C5a-des-Arg 抗体的 ELISA 测定法抗体抑制测定 C5 分解产物 C5a 的产生的能力。
     可通过直接标记目的抗体检测抗体结合 C3b 的能力， 或不标记抗体并使用本领域 中已知的多种夹层测定法间接检测结合。
     在一些实施方案中， 本发明的 C3b 结合抗体阻断或竞争参考 C3b 结合抗体与 C3b 多肽的结合。这些可以是上文描述的完全人 C3b 结合抗体。它们也可以是其它小鼠、 嵌合 或人源化 C3b 结合抗体， 其与参考抗体结合相同的表位。阻断或竞争参考抗体结合的能力 表明测试中的 C3b 结合抗体结合参考抗体定义的相同或相似表位， 或与参考 C3b 结合抗体 结合的表位足够接近的表位。此类抗体尤其可能具有为参考抗体鉴定到的有利性质。可通 过例如竞争结合测定法来确定阻断参考抗体或与其竞争的能力。利用竞争结合测定法， 检 测测试中的抗体抑制参考抗体特异结合共同抗原， 如 C3b 多肽的能力。如果过量的测试抗 体基本抑制参考抗体的结合， 那么测试抗体与参考抗体竞争对抗原的特异性结合。基本抑 制表示测试抗体降低参考抗体的特异结合通常至少 10％、 25％、 50％、 75％或 90％。
     有许多已知的竞争结合测定法， 其可用于评估 C3b 结合抗体与参考 C3b 结合抗体 竞争结合 C3b 蛋白质。这些测定法包括， 例如固相直接或间接放射免疫测定 (RIA)、 固相 直接或间接酶免疫测定 (EIA)、 夹层竞争测定 ( 参阅 Stahli 等， Methods in Enzymology 9： 242-253， 1983) ； 固 相 直 接 生 物 素 - 亲 和 素 EIA( 参 阅 Kirkland 等， J.Immunol.137 ： 3614-3619， 1986) ； 固相直接标记测定、 固相直接标记夹层测定 ( 参阅 Harlow&Lane， 上文 ) ； 使 用 I-125 标 记 的 固 相 直 接 标 记 RIA( 参 阅 Morel 等， Molec.Immunol.25 ： 7-15， 1988) ；固相直接生物素 - 亲和素 EIA(Cheung 等， Virology 176 ： 546-552， 1990) ； 和直接标记的 RIA(Moldenhauer 等， Scand.J.Immunol.32 ： 77-82， 1990)。通常， 这种测定包括使用结合到 固体表面或细胞的纯化抗原， 所述固体表面或细胞携带未标记的测试 C3b 结合抗体和标记 的参考抗体中任何一种。 通过测定在测试抗体存在下结合到固体表面或细胞上的标记的量 来测定竞争抑制。所述测试抗体一般过量存在。通过竞争测定鉴定的抗体 ( 竞争抗体 ) 包 括与参考抗体结合相同表位的抗体和结合邻近表位的抗体， 所述临近表位与参考抗体结合 的表位足够接近以发生位阻。
     为了测定所选的 C3b 结合单克隆抗体是否结合唯一的表位， 可使用市售试剂 ( 例 如， 来自 Pierce， Rockford， IL 的试剂 ) 将每一抗体生物素化。 可使用 C3b 多肽包被的 ELISA 平板， 使用未标记单克隆抗体和生物素化单克隆抗体进行竞争研究。可利用链霉抗生物素 蛋白 - 亲和素 - 碱性磷酸酶探针检测生物素化的 MAb 结合。为了测定纯化的 C3b 结合抗体 的同种型， 可进行同种型 ELISA。例如， 可用 1μg/ml 抗人 IgG 在 4℃下过夜包被微量滴定 板的孔。用 1％ BSA 封闭后， 平板与 1μg/ml 或更少的单克隆 C3b 结合抗体或纯化的同种型 对照在室温下反应 1 到 2 小时。所述孔然后与人 IgGl 或人 IgM 特异性碱性磷酸酶缀合的 探针反应。然后将平板显影， 并对其进行分析， 以便测定纯化抗体的同种型。
     为了证明单克隆 C3b 结合抗体与表达 C3b 多肽的肝细胞的结合， 可使用流式细胞 术。简言之， 表达 C3b 的细胞系 ( 在标准生长条件下生长 ) 可与含 0.1％ BSA 和 10％胎牛 血清的 PBS 中多种浓度的 C3b 结合抗体混和， 并在 37℃下温育 1 小时。洗涤后， 细胞与萤光 素标记的抗人 IgG 抗体在与一级抗体染色相同的条件下反应。可通过 FACScan 仪器使用光 和侧向散射性质门控单个细胞来分析样品。 ( 除了或者替代 ) 流式细胞术测定外， 还可使用 利用荧光显微术的备选测定法。 可如上所述将细胞染色， 并通过荧光显微术检测所述细胞。 该方法允许显示单个细胞， 但根据抗原的密度具有降低的灵敏度。
     可通过蛋白质印迹进一步测试本发明的 C3b 结合抗体与 C3b 多肽或抗原片段的反 应性。 简言之， 可制备纯化的 C3b 多肽或融合蛋白质， 或来自表达 C3b 的细胞的细胞提取物， 并进行十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳。电泳后， 将分离的抗原转移到硝基纤维素膜 上， 用 10％胎牛血清封闭， 并用待测试的单克隆抗体探测。 可使用抗人 IgG 碱性磷酸酶检测 人 IgG 结合， 并用 BCIP/NBT 底物片剂 (Sigma Chem.Co.， St.Louis， MO) 显色。
     在下文实施例部分也描述了功能测定的实例。
     预防和治疗用途
     本发明提供了通过向需要治疗的受试者施用有效量的本发明抗体治疗与提高的 补体活性相关的疾病或病症的方法。在特定实施方案中， 本发明提供了通过向需要治疗的 受试者施用有效量的本发明抗体治疗年龄相关性黄斑变性 (AMD) 的方法。
     尤其可使用本发明的抗体来预防干性 AMD 向湿性 AMD 的发展、 减慢和 / 或防止地 图样萎缩的发展、 治疗或预防黄斑水肿、 和改善因干性 AMD 发展引起的视力丧失。其也可以 与抗 VEGF 治疗组合使用来治疗湿性 AMD 患者。
     在一些实施方案中， 本发明提供通过向需要治疗的受试者施用有效量的本发明抗 体治疗补体相关疾病或病症的方法。 已知补体相关疾病或病症的实例包括 ： 神经障碍、 多发 性硬化、 中风、 吉 - 巴综合征、 外伤性脑损伤、 帕金森病、 不恰当或不想要补体激活的疾病、 血液透析并发症、 超急性同种异体移植物排斥、 异种移植物排斥、 IL-2 治疗过程中白细胞介素 2 诱导的毒性、 炎性疾病、 自身免疫病炎症、 克隆病、 成人呼吸道窘迫综合征、 包括烧伤或 冻伤的热伤、 局部缺血后再灌注状况、 心肌梗塞、 气囊血管成形术、 心肺转流术或肾脏转流 术中的泵后综合征、 血液透析、 肾缺血、 表面重建后肠系膜动脉再灌注、 传染病或脓毒、 免疫 复合物病症和自身免疫性疾病、 类风湿性关节炎、 系统性红斑狼疮 (SLE)、 SLE 肾炎、 增殖性 肾炎、 溶血性贫血、 和重症肌无力。 此外， 其它已知补体相关疾病是肺部疾病和病症， 如呼吸 困难、 咯血、 ARDS、 哮喘、 慢性阻塞性肺疾病 (COPD)、 肺气肿、 肺栓塞和梗塞、 肺炎、 致纤维化 粉尘疾病、 惰性粉尘和矿物质 ( 例如， 硅、 煤炭粉末、 铍和石棉 )、 肺纤维化、 有机粉尘疾病、 化学损伤 ( 因刺激性气体和化学物质， 例如氯、 光气、 二氧化硫、 硫化氢、 二氧化氮、 铵和盐 酸 )、 烟雾损伤、 热损伤 ( 例如， 烧伤、 冻伤 )、 哮喘、 变态反应、 支气管收缩、 超敏感性肺炎、 寄 生虫病、 肺出血肾炎综合征、 肺血管炎和免疫复合物相关的炎症。
     在特定实施方案中， 本发明提供通过向需要治疗的受试者施用有效量的本发明抗 体治疗补体相关疾病或病症的方法， 其中所述疾病或病症是哮喘、 关节炎 ( 例如， 类风湿性 关节炎 )、 自身免疫性心脏病、 多发性硬化、 炎性肠病、 缺血 - 再灌注损伤、 巴 - 西综合征、 血 液透析、 系统性红斑狼疮、 红斑狼疮、 牛皮癣、 多发性硬化、 移植、 中枢神经系统疾病如阿尔 茨海默氏病和其它神经变性状况、 aHUS、 肾小球肾炎、 大疱性类天疱疮或 MPGNII。
     在特定实施方案中， 本发明提供通过向需要治疗的受试者施用有效量的包含本发 明抗体的组合物来治疗肾小球肾炎的方法。 肾小球肾炎的症状包括， 但不限于蛋白尿 ； 降低 的肾小球滤过率 (GFR) ； 血清电解质改变， 包括氮质血症 ( 尿毒症、 过度血尿氮 -BUN) 和盐 滞留， 致使水滞留， 导致高血压和水肿 ； 血尿和异常尿沉淀， 包括红细胞管型 ； 低白蛋白血 症； 高脂血症 ； 和脂肪尿。在特定实施方案中， 本发明提供通过向需要治疗的受试者施用有 效量的包含本发明抗体的组合物来治疗阵发性夜间血红蛋白尿 (PNH) 的方法。
     在特定实施方案中， 本发明提供通过向需要治疗的受试者施用有效量的包含本发 明抗体的组合物来减少与体外循环相关的免疫和止血系统功能异常的方法。 本发明的抗体 可用于任何方法中， 所述方法涉及使患者血管中血液循环穿过导管， 并回流到患者血管中， 所述导管具有网眼表面， 所述网眼表面包含能够引起补体激活、 血小板激活、 白细胞激活或 血小板 - 白细胞粘着至少一种的材料。此类方法包括， 但不限于所有形式的 ECC， 以及涉及 向患者血液循环中引入人工或外源器官、 组织或血管的方法。
     也可利用治疗与黄斑变性相关状况的已知方法， 如在美国专利号 6,218,368 中描 述的抗生素治疗向待用本发明治疗剂治疗的受试者施用其它治疗剂。在其它治疗中， 免疫 抑制剂如环孢菌素是能够抑制免疫应答的治疗剂。这些治疗剂包括细胞毒性药物、 皮质类 固醇、 非类固醇抗炎药物 (NSAIDs)、 特异的 T 淋巴细胞免疫抑制剂， 和抗体或其片段 ( 参阅 Physicians′ Desk Reference， 第 53 版， Medical Economics Company Inc.， Montvale， N.J.(1999))。通常以一周、 一个月、 三个月、 六个月或一年的间隔继续免疫抑制治疗。在一 些患者中， 在患者余生中施用治疗。
     当本发明的治疗剂与另一治疗剂一起施用时， 可以任何顺序连续施用或同时施用 两种治疗剂。在一些方面， 本发明的抗体向也接受第二种治疗剂 ( 例如维替泊芬 ) 治疗的 受试者施用。另一方面， 结合分子与外科治疗结合施用。
     与 C3b 结合抗体组合治疗的合适治疗剂包括本领域中已知的治疗剂， 其能够调节 补体组分的活性 ( 参阅例如， 美国专利号 5,808,109)。已经报道其它治疗剂降低补体介导的活性。此类治疗剂包括 ： 氨基酸 (Takada， Y. 等 Immunology 1978， 34， 509) ； 膦酸酯 (Becker， L.Biochem.Biophy.Acta 1967， 147， 289)、 聚阴离子物质 (Conrow， R.B. 等 J.Med. Chem.1980， 23， 242) ； 磺酰氟 (Hansch， C. ； Yoshimoto， M.J.Med.Chem.1974， 17， 1160， 和其 中引用的参考文献 ) ； 多核苷酸 (DeClercq， P.F. 等 Biochem.Biophys.Res.Commun.1975， 67， 255) ；海 松 酸 (Glovsky， M.M. 等 J.Immunol.1969， 102， 1) ；卟 吩 (Lapidus， M. 和 Tomasco， J.Immunopharmacol.1981， 3， 137) ； 一些抗炎药 (Burge， J.J. 等 J.Immunol.1978， 120， 1625) ； 酚 类 (Muller-Eberhard， H.J.1978， Molecular Basis of Biological DegradativeProcesses， Berlin， R.D. 等， 编辑 Academic Press， New York， 第 65 页 ) ； 和苄 脒类 (Vogt， W. 等 Immunology 1979， 36， 138)。这些治疗剂中的一些治疗剂通过一般性抑 制蛋白酶和酯酶起作用。其它治疗剂对补体途径中任何特定中间步骤并不是特异的， 但是 却抑制补体激活的一个以上的步骤。后面化合物的实例包括苄脒类， 其阻断 C1、 C4 和 C3b 的利用 ( 参阅例如 Vogt 等 Immunol.1979， 36， 138)。
     可抑制补体组分活性的本领域已知的额外治疗剂包括来自葡萄穗霉属 (Stachybotrys) 的真菌代谢物 K-76(Corey 等， J.Amer.Chem.Soc.104 ： 5551， 1982)。 已经显 示 K-76 和 K-76COOH 主要在 C3b 步抑制补体 (Hong 等， J.Immunol.122 ： 2418， 1979 ； Miyazaki 等， Microbiol.Immunol.24 ： 1091， 1980)， 并防止从正常人补体中产生趋化因子 (Bumpers 等， Lab.Clinc.Med.102 ： 421， 1983)。在高浓度的 K-76 或 K-76COOH 中， 显示了对 C2、 C3、 C6、 C7 和 C9 与其各自先前媒介物的反应的一定抑制。也已经报道了 K-76 或 K-76COOH 抑 制补体的 C3b 激活系统 (Hong 等， J.Immunol.127 ： 104-108， 1981)。用于实践本发明方法 的其它合适治疗剂包括灰黄霉素 (griseofulvin)(Weinberg， Principles of Medicinal Chemistry， 第 2 版， Foye， W.O.， 编辑， Lea&Febiger， Philadelphia， Pa.， 第 813 页， 1981)、 isopannarin(Djura 等， Aust.J.Chem.36 ： 1057， 1983) 和 Siphonodictyoncoralli-phagum 的代谢物 (Sullivan 等， Tetrahedron 37 ： 979， 1981)。
     组合治疗方案可以是累加的， 或其可以产生协同结果 ( 例如， 补体途径活性的减 少超出组合使用两种治疗剂的预期 )。 在一些实施方案中， 本发明提供使用本发明的 C3b 结 合抗体和抗血管发生剂， 如抗 VEGF 治疗剂来预防和 / 或治疗 AMD 或如上所述另一补体相关 疾病的组合治疗。
     诊断用途
     一方面， 本发明包括用于在生物学样品 ( 例如， 血液、 血清、 细胞、 组织 ) 的背景中 或遭受疾病或病症、 或处于发生与 AMD 相关病症的风险的个体中测定 C3b 蛋白质和 / 或核 酸表达以及 C3b 蛋白质功能的诊断测定法。
     诊断测定法， 如竞争性测定法依赖于标记的类似物 (“示踪物” ) 与测试样品分析 物竞争共同结合配偶体上有限数量的结合位点的能力。 结合配偶体一般在竞争前或竞争后 不溶解， 然后结合到结合配偶体上的示踪物和分析物与未结合的示踪物和分析物分离。通 过倾析 ( 其中结合配偶体预先不溶解 ) 或通过离心 ( 其中竞争反应后结合配偶体沉淀 ) 完 成该分离。 如通过标记物质的量测定， 测试样品分析物的量与结合的示踪物的量成反比。 制 备已知量的分析物的剂量反应曲线， 并与测试结果进行比较， 以定量测定测试样品中存在 的分析物的量。当酶用作检测标记时， 这些测定称为 ELISA 系统。在该形式的测定中， 抗体 与 C3b 结合抗体之间的竞争性结合导致结合的 C3b 蛋白质， 优选本发明的 C3b 表位成为血清样品中抗体的量度， 最特别的是中和血清样品中的抗体。
     测定的显著优势是直接对中和抗体 ( 即， 干扰与 C3b 蛋白质， 尤其是表位结合的那 些抗体 ) 进行测定。这种测定， 特别是 ELISA 测试形式在临床环境和常规血液筛查中具有 相当多的应用。
     免疫学技术使用针对多种补体组分 ( 例如 C3、 C4、 C5) 的不同表位的多克隆或单 克隆抗体来检测例如， 补体组分的裂解产物 ( 参阅例如， Hugli 等， Immunoassays Clinical Laboratory Techniques 443-460， 1980 ； Gorski 等， JImmunol Meth 47 ： 61-73， 1981 ； Linder 等， J Immunol Meth 47 ： 49-59， 1981 ；和 Burger 等， J Immunol 141 ： 553-558， 1988)。然后可测定抗体与所述裂解产物和已知浓度的标记裂解产物的竞争结合。可获得 多种测定， 如放射免疫测定、 ELISA′ s 和放射扩散测定来检测补体裂解产物。
     免疫学技术提供高灵敏度来检测补体激活， 因为它们允许测定来自患有或不患有 黄斑变性相关病症的测试受试者和对照受试者的血液中裂解产物的形成。因此， 在本发明 的一些实施方案中， 通过测试受试者的血浆中补体组分的可溶性裂解产物的定量来测定 异常补体激活以获得对眼病症相关病症的诊断。如在 Chenoweth 等， N Engl J Med 304 ： 497-502， 1981 ； 和 Bhakdi 等， Biochim Biophys Acta 737 ： 343-372， 1983 中描述进行测定。 优选地， 仅测定体内形成的补体激活。这可通过在含有补体系统的抑制剂的培养基中收集 来自受试者的生物学样品 ( 例如血清 )， 随后在所述样品中测定补体激活 ( 例如裂解产物的 定量 ) 来完成。
     在患有眼疾病或病症相关病症的患者的临床诊断或监测中， 补体蛋白质的检测与 来自正常受试者的相应生物学样品中的水平的比较表明患者患有与黄斑变性相关的病症。
     在 US2006/0067935 中描述了体内诊断或成像。简言之， 这些方法一般包括向患者 施用或引入诊断有效量的 C3b 结合分子， 其有效附着到通过非创性方法可检测的标记或标 签上。允许抗体 - 标记缀合物足够时间定位并结合眼睛内的补体蛋白质。然后将所述患者 暴露在检测设备下来鉴定可检测标记， 因此在患者眼睛中形成 C3b 结合分子的定位图像。 通过检测抗体 - 标记是否结合眼睛的组分来检测 C3b 结合抗体或其抗原结合片段的存在。 与未患有 AMD 疾病的正常个体相比， 所选补体蛋白质或蛋白质组合增加水平的检测表明与 黄斑变性相关的病症的倾向性和 / 或发作。也优选本发明的这些方面用于眼睛成像方法以 及组合的血管发生诊断和治疗方法。
     本发明还涉及预测医学领域， 其中诊断测定、 预后测定、 药物基因组学和监测临床 试验用于预后 ( 预测 ) 目的， 由此预防性治疗个体。
     本发明还提供用于测定个体是否具有发生与补体途径活性失调相关病症的风险 的预后 ( 或预测 ) 测定法。例如， 可测定生物学样品中 C3b 基因中的突变。此类测定法可 用于预后或预测目的， 由此在病症发作之前预防性治疗个体， 所述病症的特征在于 C3b 蛋 白质、 核酸表达或活性或与其相关。
     本发明的另一方面提供用于在个体中测定 C3b 核酸表达或 C3b 蛋白质活性的方 法， 由此为该个体选择适当的治疗剂或预防剂 ( 此处称为 “药物基因组学” )。药物基因组学 允许基于个体的基因型来选择治疗剂 ( 例如， 药物 ) 用于个体的治疗性或预防性治疗 ( 例 如， 检查个体的基因型以测定所述个体对特定治疗剂应答的能力 )。
     本发明的另一方面涉及在临床试验中监测治疗剂 ( 例如， 药物 ) 对 C3b 蛋白质的表达或活性的影响。
     药物组合物
     本发明提供包含与药学上可接受的载体一起配制的 C3b 结合抗体 ( 完整的或结合 片段 ) 的药物组合物。所述组合物可额外地含有适合于治疗或预防补体相关疾病 ( 例如 AMD) 的一种或更多其它治疗剂。药学上可接受的载体增强或稳定组合物， 或者可用于利于 组合物的制备。 药学上可接受的载体包括， 生理上相容的溶剂、 分散介质、 包衣、 抗细菌和抗 真菌剂、 等渗剂和吸收延迟剂等。
     可通过本领域已知的多种方法施用本发明的药物组合物。施用的途径和 / 或方式 根据想要的结果而变化。优选静脉、 肌内、 腹膜内、 或皮下施用、 或在靶位点附近施用。在特 定实施方案中， 配制本发明的抗体， 使得它们可经玻璃体内向眼睛施用。 药学上可接受的载 体应适合于静脉内、 肌内、 皮下、 肠胃外、 脊柱或表皮施用 ( 例如通过注射或输注 )。根据施 用途径， 可以材料包衣活性化合物， 即抗体， 双特异和多特异分子， 以保护所述化合物免于 酸和可能失活所述化合物的其它自然条件的作用。
     组合物应该是无菌且是流体的。 可使用包衣， 如卵磷脂， 在分散情况下维持需要的 颗粒大小并使用表面活性剂来维持适当的流动性。在许多情况下， 优选在组合物中包括等 渗剂， 例如， 糖、 多元醇如甘露醇或山梨醇、 和氯化钠。 可通过在组合物中引入延迟吸收的物 质 ( 例如单硬脂酸铝或明胶 ) 产生可注射组合物的长期吸收。
     可根据本领域所熟知的且常规实践的方法制备本发明的药物组合物。参阅例如， Remington ： The Science and Practice of Pharmacy， MackPublishing Co.， 第 20 版， 2000 ； 和 Sustained and Controlled Release DrugDelivery Systems， J.R.Robinson， 编 辑， Marcel Dekker， Inc.， New York， 1978。优选在 GMP 条件下制备药物组合物。通常， 在 本发明的药物组合物中使用治疗有效剂量或有效剂量的 C3b 结合抗体。通过本领域技术人 员已知的常规方法将 C3b 结合抗体配制成药学上可接受的剂量形式。调整剂量方案来提供 最想要的应答 ( 例如， 治疗应答 )。 例如， 可施用快速灌注， 可随时间施用若干分份剂量或根 据治疗情形的紧急性指示按比例减少或增加剂量。 以剂量单位形式配制肠胃外组合物尤其 利于容易施用和剂量的均一性。 此处所用的剂量单位形式指适合作为待治疗的受试者的单 一剂量的物理分离单位 ； 每一单位含有预定量的活性化合物， 其经计算以产生与需要的药 学载体相关的想要的治疗效果。
     可改变本发明药物组合物中活性成份的实际剂量水平， 以获得活性成份的量， 其 对特定患者、 组合物和施用方式有效实现想要的治疗应答， 而对所述患者无毒。 所选剂量水 平依赖于多种药物代谢动力学因素， 包括所用本发明具体组合物或其酯、 盐或酰胺的活性、 施用途径、 施用时间、 所用特定化合物的排泄速率、 治疗的持续时间、 与所用特定组合物组 合使用的其它药物、 化合物和 / 或物质、 年龄、 性别、 体重、 状况、 一般健康和待治疗患者的 先前医疗史等因素。
     医师或兽医可以比需要达到想要的治疗效果更低的水平开始施用药物组合物中 所用本发明抗体的剂量， 并逐渐增加剂量， 直至达到想要的效果。一般地， 用于治疗此处描 述的变应性炎性病症的本发明组合物的有效剂量根据许多不同因素而变化， 所述因素包括 施用手段、 靶位点、 患者的生理状态、 患者是人还是动物、 施用的其它药剂、 以及治疗是预防 性的还是治疗性的。 需要滴定治疗剂量以使安全性和效力达到最佳。 对于抗体的全身施用，剂量范围在约 0.0001 到 100mg/kg 宿主体重， 并更一般在 0.01 到 15mg/kg 宿主体重之间。 示例性治疗方案使得每两周一次或每月一次或每 3 到 6 个月一次进行全身施用。对于抗体 的玻璃体内施用， 剂量范围在约 0.0001 到约 10mg 之间。示例性治疗方案使得每两周一次 或每月一次或每 3 到 6 个月一次进行全身施用。
     一般在多种情况下施用抗体。单次剂量的间隔可以是每周一次、 每月一次或每年 一次。如通过测定患者中 C3b 结合抗体的血液水平指示， 间隔也可以是不规则的。在全身 施用的一些方法中， 调整剂量以达到 1-1000μg/ml 的血浆抗体浓度， 在一些方法中达到 25-500μg/ml。或者， 抗体可作为持续释放制剂施用， 在所述情况下需要更不频繁的施用。 剂量和频率根据抗体在患者体内的半衰期而变化。一般地， 人源化抗体比嵌合抗体和非人 抗体显示更长的半衰期。施用的剂量和频率可根据治疗是预防性的还是治疗性的而变化。 在预防性应用中， 在长时间段内以相对不频繁的间隔施用相对低的剂量。一些患者在其余 生继续接受治疗。 在治疗性应用中， 有时候需要在相对短间隔内相对高的剂量， 直至疾病的 发展减慢或终止， 并优选直至所述患者显示疾病症状部分或彻底改善。 此后， 可对患者施用 预防性方案。 实施例 提供以下实施例来进一步阐明本发明， 但不限制其范围。本发明的其它变型对本 领域的普通技术人员而言是显而易见的并包括在所附权利要求中。
     实施例 1 ： 抗原的产生和质量控制
     生物素化 C3b 的产生
     使用来自的 Pierce 标记试剂， 以 20 倍摩尔过量的生物素化试剂生物化纯化的 C3b。在室温下进行生物素化， 并使用 0.5ml Zeba Spin 脱盐柱分离未缀合的生物素。使用 EZ-Link NHS-LC-LC- 生物素标记 C3b 的赖氨酸残基， 并使用 EZ-Link Maleimide-PEG2- 生 物素标记半胱氨酸残基。使用 HABA 测定和 LC-MS/MS 定量生物素化的程度。通过 LC-MS/MS 验证参与 C3 上硫酯键形成的单个半胱氨酸的生物素化。
     结合琼脂糖珠子的 C3b 的产生
     使 用 来 自 Amersham Biosciences(17-0851-01) 的 PD-10 脱 盐 柱 将 纯 化 的 C3b(Quidel A413， lot 903726) 缓冲液交换成偶联缓冲液 (50mM Tris， 5mM EDTA-Na， pH 8.5)。SulfoLink 偶联凝胶 (Pierce 20401) 和所有其它试剂均平衡至室温。以 4 凝胶床 体积的偶联缓冲液平衡 SulfoLink 偶联凝胶， 并离心， 去除上清液。然后将缓冲液交换的 C3b 蛋白溶液加入到离心平衡的 SulfoLink 偶联凝胶 (SulfoLink Coupling Gel) 中。混 合物在室温下摇动 15 分钟， 然后在不混合的情况下保持静止 30 分钟。然后用 3 凝胶床体 积的偶联缓冲液洗涤缀合的 C3b 偶联凝胶。然后， 向 C3b 偶联凝胶中加入 1 凝胶床体积的 Quenching Reagent( 偶联缓冲液中 50mM L- 半胱氨酸 -HCL(44889))， 并在室温下保持摇动 15 分钟。15 分钟后， 缀合的 C3b 偶联凝胶在室温下不混合的情况下保持 30 分钟。用至少 6 凝胶床体积的洗涤溶液 (1M NaCl) 洗涤缀合的 C3b 偶联凝胶， 然后用 2 凝胶床体积的除气 StorageBuffer( 含有 0.05％叠氮化纳的磷酸盐缓冲盐水 ) 进行洗涤。最后的步骤是向凝 胶床体积中加入 1 凝胶床体积的 Storage Buffer 至估计 1mg/ml 的蛋白质。
     C3b-SulfoLink 偶联凝胶蛋白浓度测定
     以下量的 C3b 在还原条件下 4-12％变性蛋白质凝胶上运行 ： 2μg、 1.5μg、 1μg、 0.75μg、 0.5μg 和 0.25μg。在这些泳道后， 还将 2μl、 4μl 和 8μl 的 50 ％珠子悬浮液 (C3b 偶联凝胶 ) 在还原性条件下上样。 由于 α 链与珠子共价连接， 它在蛋白质凝胶上将不 会出现， 因此通过比较 β 链来测定蛋白质浓度。估计 1μl 的偶联凝胶有约 1μg 的 C3b， 因 此可获得大于 90％的偶联效率。
     计算在 SulfoLink 偶联凝胶上活性 C3b 百分比
     用在 4 种不同浓度 (0.122μM、 0.244μM、 0.367μM 和 0.489μM) 的因子 B、 固定 浓度的可溶性 C3b( 所有 4 种浓度均为 0.294μM) 和固定浓度的因子 D( 所有 4 种浓度均为 0.47μM) 设置四种对照。从这些对照反应中省略因子 P。反应在 37℃下温育 15 分钟。此 时将所有对照样品立即加入到 4X 的样品缓冲液中并放于 95℃ 10 分钟， 以稍后在 4-12％ Bis-Tris 蛋白质凝胶上电泳。 C3b 偶联的珠子浓度为每 1mg 柱床体积约 1mg C3b。 以下 7 个 反应由 0.294μM 固定浓度的偶联 C3b 的珠子、 2.68μM 固定浓度的因子 P 和 0.95μM 固定浓 度的因子 D 组成。因子 B 的浓度如下 ： 0.367μM、 0.489μM、 0.978μM、 1.467μM、 1.955μM、 2.933μM 和 3.910μM。对于这 7 个反应， 除因子 D 外均在 37℃下温育 30 分钟。经 30 分钟 温育后， 加入 0.95uM 的因子 D 并将反应温育 2 分钟。此时将所有样品立即加入到 4X 样品 缓冲液中并在还原性条件下在 4-12％ Bis-Tris 凝胶上电泳。 当分析数据时， 在所有泳道中 比较 Bb 条带。
     珠子 -C3b 稳定性
     在 C3b-SulfoLink 偶联凝胶缀合后， 将珠子离心并在 100％甘油 ( 使甘油终浓度为 50％ ) 中轻轻重悬浮。随后将珠子置于 -80℃进行几次冻融 ( 检测了高达 3 次 )。随后在冰 上解冻珠子并转移至 15ml 锥形管中。加入 5 柱体积的 1XPBS 来重悬浮珠子。将其在 850g 离心 5 分钟。完成用 10 柱体积的 1XPBS 进行的两次额外洗涤。最终步骤是用 1XPBS 重悬 浮珠子获得终浓度 50％的浆料溶液。每次冻融检测 Bb 产生 ： 与 3μM 因子 B、 0.5μM 因子 D、 1μM 的 C3b 珠子和 5mM 的 MgCl 温育 1 小时并寻找完全的 Bb 产生。除此之外， 在 -80℃ 储存几周后经 Bb 产生检测冰冻的珠子。
     Cyno C3 的纯化和 Cyno C3b 的产生
     Cyno 血浆购自 Alphagenesis(Yemassee， SC)。用 PBS、 10mM EDTA 和 2 份完全的混 和抑制剂片剂 (Roche) 将 50ml 血浆稀释到 200ml。缓慢将 40％的 PEG6000 加入到溶液中 至终浓度为 4％， 并在 4 度轻轻搅拌额外 30 分钟。通过在 17,500rpm 下离心 20 分钟去除沉 淀。再次将 PEG6000 加入到上清液中至终浓度为 12.5％并在 4 度搅拌 30 分钟。17,500rpm 下离心 20 分钟后去除上清液。在 50ml 1XPBS、 10mM EDTA 缓冲液中再次溶解沉淀， 并将含 C3 的溶液通过 15ml 的蛋白质 G(GE) 柱子两次以去除 CynoIgG。用 4L 20mM Tris pH 8.0、 10mM EDTA 对来自蛋白质 G 柱子的流出液透析过夜。同时， 用 0.5M NaOH 将 20ml MonoQ 柱 (GE) 清洗， 并随后用水和大量体积的 20mM Tris pH8.0 和 10mM EDTA 清洗直至柱基线清楚 且平衡。随后将透析的溶液装载至 ATKA 100(GE) 的 MonoQ 柱中， 流速为 0.8ml/ 分钟。装 载后， 用 10 柱体积的 20mM Tris pH 8.0 和 10mM EDTA 洗涤柱子或直至基线达到稳定。用 20 柱体积的从 0 至 500mM 的 NaCl 线性梯度将所述蛋白质从柱子上洗脱下来并以 4ml/ 管收 集级分。在非还原和还原性条件下经 SDS-PAGE 凝胶鉴定级分中的 C3 蛋白峰。进一步经蛋 白质印迹和 MS 肽谱分析验证 C3。随后将纯度为 85％的 C3 级分混合并用 PBS 缓冲液通过2660sephacryl 300 凝胶过滤柱 (GE) 进一步纯化。同样经 SDS-PAGE 和 MS 分析证实 C3 峰 级分。混合纯的级分并用 millipore 浓缩器浓缩至约 1mg/ml， 等份分装并保存在 -80 度冰 箱用于后续使用。
     在 PBS 缓冲液中将 Cyno C3 稀释至 500ug/ml。通过在 PBS 缓冲液中加入 0.4μM fB(Comptech)、 0.05μM fD(CompTech) 和 5mM MgCl2 将 C3 完全转化为 C3b， 并在室温温育 30 分钟。随后通过 2660sephacryl 300 凝胶过滤柱将所述 C3b 进一步纯化。混合含 C3b 的 峰组分， 其由 millipore 浓缩器浓缩。在 C3 转化酶测定中检测 cyno C3b 的活性。所述蛋 白质显示出与人 C3b(CompTech) 相当的 Bb 产生活性。
     通过补体因子和商品化抗体结合进行 C3b 试剂的质量控制
     酶联免疫吸附测定 (ELISA) 结合 ( 表位保守性 )
     在 ELISA 中比较生物素化的 C3b 分子和非生物素化的 C3b， 来评估由市售抗体识别 的 C3b 表位的保守性。
     用包被缓冲液 ( 碳酸氢盐 pH 9.5-9.8) 中 2μg/ml 的 100μl/ 孔市售抗 C3 或抗 C3b 抗体包被 Maxisorp 板， 并将其在 4℃温育过夜。用 PBST 洗涤 3 次后， 用 300μl/ 孔稀 释剂 (Synblock， AbD Serotec) 在室温下封闭所述板 2 小时。抽出封闭溶液后， 在稀释剂 中稀释的 100μl C3b(+/- 生物素 ) 样品在室温下温育 1 小时。加入在稀释剂 ( 多聚 HRP 稀释剂 ) 中 1 ∶ 5000 稀释的 100μl/ 孔 Strep-HRP( 聚 HRP 链霉抗生物素蛋白 ) 或 HRP 缀 合的抗 C3Ab 30 分钟。用 PBST 洗涤 4 次后， 加入 100μl/ 孔 TMB 底物 (Ultra TMB 底物溶 液 )5-10 分钟。 通过 50μl/ 孔的终止液 (2N H2SO4) 来终止反应。 读取吸光度 (A450-A570) 并使用 SoftMax Pro 分析数据。
     通过补体因子和商业化 Abs 的结合
     检测琼脂糖珠子上固定的 C3b 其结合商业化抗体和补体因子蛋白的能力。
     向各管中加入 4μl 的 C3b 珠子浆料 ( 对应于～ 1μg 的 C3b)。将珠子重悬浮于 100μl 稀释剂中。然后利用稀释剂 +Ab 或补体因子蛋白使管中的总体积达到 200μl。在 室温下摇动管 1 小时， 然后用稀释剂洗涤 1 次。向小柱中应用珠子浆料， 并再洗涤 2 次。快 速甩出剩余的液体 (1,200G， 1 分钟 )。塞紧柱子， 然后加入稀释剂中 500μl 的二级抗体或 抗补体因子 Ab(1 ∶ 5000)。在室温下温育 1 小时， 然后用稀释剂洗涤 4 次。[ 对于补体因 子， 利用二级 Ab 重复上述步骤 ]。快速甩出剩余的液体 (1,200G， 1 分钟 )。填充柱子， 然 后加入 100μl 的 TMB 底物。将液体快速甩入 (1,200G， 1 分钟 ) 新鲜管中。转移溶液到 96 孔板中。用 50μl/ 孔终止溶液 (2N H2SO4) 终止反应。读取吸光度 (A450-A570)， 并使用 SoftMax Pro 分析数据。
     实施例 2 ： 从 HuCAL 文库中产生 C3b 特异性抗体
     使用市售噬菌体展示文库 Morphosys HuCAL 文库作为抗体变体蛋白 质来源， 通过选择具有高结合亲和力的克隆产生抗 C3b 抗体。HuCAL 文库是 Fab 文库 (Knappik 等， 2000)， 其中所有六个 CDR 均因适当突变而变得多样化， 并且其使用 CysDisplay TM 技术将 Fab 连接到噬菌体表面 ( 例如见 WO01/05950)。
     HuCAL 噬菌体 - 抗体提供为 12 个单独的子库 ： VH1κ、 VH1λ、 VH2κ、 VH2λ、 VH3κ、 VH3λ、 VH4κ、 VH4λ、 VH5κ、 VH5λ、 VH6κ、 VH6λ。根据特定实验需要， 可以 任何组合混合 12 个子库。对于结合 C3b 的抗体的选择， 应用三种不同的淘选策略 ：a) 利用生物素化的人 C3b 的溶液淘选， 其中通过链霉抗生物素蛋白磁珠捕获噬菌 体 - 抗原复合体，
     b) 基于珠子的淘选， 其中 C3b 结合到琼脂糖珠子上， 和
     c) 差异肽淘选， 其中偶联到载体蛋白的肽上的选择循环与全长 C3b( 结合琼脂糖 珠子的生物素化 ) 上的选择循环交替进行。
     噬菌粒复苏、 噬菌体扩增和纯化
     在 含 有 34μg/ml 氯 霉 素 和 1 ％ 葡 萄 糖 的 2xYT 培 养 基 (2xYT-CG) 中 扩 增 HuCAL 文库。在用 OD600nm 为 0.5 的 VCSM13 辅助噬菌体感染后 (37℃下不摇动， 30 分钟 ； 37℃下 250rpm 摇动 30 分钟 )， 将细胞离心 (4120g ； 5 分钟 ； 4℃ )， 在 2xYT/34μg/ ml 氯霉素 /50μg/ml 卡那霉素 /0.25mM IPTG 中重悬浮， 并在 22℃下培养过夜。从上清液 中 PEG 沉淀噬菌体， 将其在 PBS/20％甘油中重悬浮并储存在 -80℃。 如下进行两个淘选循环 之间的噬菌体扩增 ： 用洗脱的噬菌体感染对数中期大肠杆菌 TG1 细胞并接种到补充有 1％ 葡萄糖和 34μg/ml 氯霉素的 LB 琼脂 (LB-CG 平板 ) 上。在 30℃下过夜温育后， 从琼脂平板 上刮去所述 TG1 菌落， 并将其用于接种 2xYT-CG， 直至达到 0.5 的 OD600nm。如上所述加入 VCSM13 辅助噬菌体用于感染。
     溶液淘选
     用于该淘选策略中的抗原是生物素化的 C3b。存在生物素化 C3b 的两种不同生物 素化的变体。 在一种变体中， 生物素通过附着到 C3b 上半胱氨酸残基的马来酰亚胺 -PEG- 接 头连接 C3b。该变体在下文中称为 C3b- 半胱氨酸 - 生物素。在另一变体中， 生物素通过附 着到 C3b 上的 3 个不同赖氨酸残基的磺基 -NHS-LCLC- 接头连接 C3b。该变体在下文中称为 C3b- 赖氨酸 - 生物素。在选择循环中交替进行两种不同变体上的选择， 以不选择结合接头 分子的噬菌体。
     用 PBS 洗 涤 链 霉 抗 生 物 素 蛋 白 磁 珠 (Dynabeads M-280 ； Dynal) 一 次， 并用 Chemiblocker 在室温下封闭 2 小时。还在旋转器上利用 Chemiblocker 在室温下封闭 PBS 洗脱的噬菌体 1-2 小时。封闭的噬菌体针对封闭的链霉抗生物素蛋白磁珠预吸附两次 30 分钟。将噬菌体上清液转移到新封闭的 2ml 反应管中， 加入人生物素化的 C3b， 并将混合物 在室温下旋转器上温育 1-2 小时。向各淘选库中加入 100μl 封闭的链霉抗生物素蛋白磁 珠， 并在旋转器上温育 20 分钟。用颗粒分离器 (Dynal MPC-E) 收集珠子大概 2.5 分钟， 并 小心地去除溶液。
     然后使用旋转器在 PBST 中洗涤珠子 7 次， 随后用 PBS 再洗涤 3 次。向各管中加 入 10mM Tris/HCl pH 8 中的 200μl 20mM DTT 从 Dynabeads 上洗脱噬菌体， 并温育 10 分 钟。通过磁性颗粒分离器去除 Dynabeads， 并向生长至 OD600nm 为 0.6-0.8 的 14ml 大肠杆 菌 TG-1 培养物中加入上清液。为了噬菌体感染， 在 37℃下 50ml 塑料管中不摇动情况下温 育所述培养物 45 分钟。4120xg 离心 5 分钟后， 细菌沉淀物各自在 800μl 2xYT 培养基中重 悬浮， 接种到 3xYT-CG 琼脂平板上， 并在 37℃下温育过夜。从所述平板上刮去菌落， 如上所 述复苏噬菌体并进行扩增。以与第一轮选择相同的方式进行第二轮和第三轮选择。
     为了选择 C3b 特异性噬菌体， 在多个子库中应用利用 C3 蛋白质的几种不同封闭方 法。一般地， 当用 Chemiblocker 封闭噬菌体时， 加入纯化的 C3 或含有 C3 的血清， 并在旋转 器上温育 1-2 小时。因此， 当与 C3b 接触时， 可能的 C3b/C3 交叉反应性噬菌体应该已结合到抗原上并应仅选择 C3b 特异性噬菌体。对于淘选 1812.1， 以 10 倍摩尔过量加入纯化的 C3( 仅在第一轮过程中 )。对淘选 1889 的子库 1-6 不应用封闭。对于子库 7-12， 在所有三 轮选择中应用使用人血清的多种封闭条件。对于子库 7 和 8， 加入未稀释的人血清， 产生超 过 C3b 大约 70 倍摩尔过量的 C3。因为我们担心血清因子可能降解 C3b， 所以加入蛋白酶抑 制剂 (Pefabloc SC， Roche， 终浓度 4mM)。对于子库 9-12， 加入稀释的人血清， 产生超过 C3b 大约 2 倍摩尔过量的 C3。子库 9 和 10 含有蛋白质抑制剂， 对于库 11 和 12 不加入抑制剂。
     基于珠子的淘选
     用于基于珠子淘选的抗原是偶联 sulfolink 琼脂糖珠子的 C3b。通过 MorphoSys 利用半胱氨酸 ( 来自 SulfoLink Immobilization Trial Kit) 处理琼脂糖珠子 (SulfoLink Coupling Gel) 产生用于将噬菌体预吸附到封闭的柱子上的珠子， 所述半胱氨酸封闭珠子 上所有可能的结合位点。
     在旋转器上室温下， 用 Chemiblocker 封闭 PBS 稀释的噬菌体 1-2 小时。封闭的噬 菌体预吸附封闭的琼脂糖珠子两次， 30 分钟。将噬菌体上清液转移到新的封闭的 2ml 反应 管中， 加入偶联人 C3b 的琼脂糖珠子， 并在旋转器上室温下温育混合物 1-2 小时。通过在台 式离心机中离心 (1000g， 1 分钟 ) 收集琼脂糖珠子， 并去除上清液。通过在 1ml 洗涤缓冲液 中温和重悬浮、 在洗涤缓冲液中温育并通过离心收集来反复洗涤沉淀物。
     通过向各管中加入 10mM Tris/HCl pH 8 中的 200μl 20mM DTT， 并温育 10 分钟从 琼脂糖珠子上洗脱噬菌体。通过离心沉淀珠子， 并向生长至 OD600nm 为 0.6-0.8 的 14ml 大 肠杆菌 TG-1 培养物中加入上清液。为了噬菌体感染， 在 37℃下 50ml 塑料管中不摇动情况 下温育所述培养物 45 分钟。4120xg 下离心 5 分钟后， 细菌沉淀物各自在 800μl 2xYT 培养 基中重悬浮， 接种到 3xYT-CG 琼脂平板上， 并在 37℃下温育过夜。从平板上刮去菌落， 如此 处所述复苏噬菌体并进行扩增。以与第一轮选择相同的方式进行第二和第三轮选择。
     琼脂糖珠子的沉淀物难以看得见， 并且容易溶解在上清液中。因此， 决定使用至 少 25μl 珠子， 以能够看得见沉淀物。这导致相对高的抗原浓度， 其对于第一轮对于所有子 库是不同的， 因为使用了不同的体积。第一轮子库中 C3b 的浓度大约如下 ： 子库 1820.1 中 为 189nM、 子库 1820.2 中为 128nM、 子库 1820.3 中为 257nM、 子库 1820.4 中为 98nM、 子库 1820.5 和 1820.6 中为 66nM。在第二轮选择中， C3b 浓度是， 子库 1820.1-3 中为 112nM， 子 库 1820.4-6 中为 57nM。在第三轮选择中， C3b 的浓度在所有子库中为 57nM。
     通过加入纯化的 C3 至大约 475nM 的终浓度将利用 C3 的封闭应用到子库 1820.4-6 的第一轮选择中。
     差异肽淘选
     用于差异肽淘选的抗原是代表 C3b 上不同表位的肽。这些肽在蛋白质结构分析中 已经鉴定为 C3b 特异的， 所述分析比较 C3b 相比于 C3 上表面暴露的残基。通过上文描述的 MorphoSys 进行与两种不同载体蛋白 BSA 和转铁蛋白的偶联。在选择循环中必须交替两种 不同的载体蛋白， 以不选择结合载体蛋白的噬菌体。此外， 在肽上的选择循环与在全长 C3b 上的选择循环交替进行， 以保证所选的噬菌体结合到正确折叠的全长 C3b 上。
     肽淘选中的实际淘选步骤是使用肽偶联载体蛋白作为结合 Maxisorp 平板的抗原 的固相淘选。用 PBS 中浓度为 50μg/ml 的偶联肽的 300μl 载体蛋白包被 Maxisorp 平板 (F96 Nunc-Immunoplate) 一定数量的孔 ( 取决于预封闭噬菌体的体积 )。密封平板并在4℃温育过夜。
     用 400μl PBS 洗 涤 包 被 的 孔 两 次， 并 在 微 量 滴 定 板 摇 床 上 室 温 下 用 350μl PBS/5％奶粉封闭 2 小时。在旋转器上室温下用 PBST/5％奶粉和终浓度为 0.5％ (v/v) 的 未偶联载体蛋白封闭噬菌体 2 小时。在封闭程序后用 400μl PBS 洗涤包被的孔两次。向 各包被孔中加入 300μl 预封闭的噬菌体， 并在摇床上室温下温育 2 小时。通过加入七次 400μl PBST 进行洗涤， 然后用 PBS 洗涤七次 ( 细节见表 8 和 10)。
     以每孔 10mM Tris/HCl pH8 中的 300μl 20mM DTT 从平板上洗脱噬菌体 10 分钟。 向在 37℃下 2YT 培养基中生长至 OD600 为 0.6-0.8 的 14ml 大肠杆菌 TG-1 中加入 DTT 噬菌 体洗脱液， 并为了噬菌体感染， 在 37℃下 50ml 塑料管中不摇动情况下温育 45 分钟。 4120xg 离心 5 分钟后， 细菌沉淀物各自在 600μl 2xYT 培养基中重悬浮， 接种到 3xYT-CG 琼脂平板 上， 并在 37℃下温育过夜。从所述平板上刮去菌落， 如此处所述复苏噬菌体并进行扩增。
     对于淘选 1849， 第一轮和第三轮选择是如上所述进行的肽淘选。第二轮是如此处 所述在结合琼脂糖珠子的 C3b 上的选择， 稍微做了以下修改 ： 已经使用奶粉而非半胱氨酸 封闭了用于噬菌体预吸附的琼脂糖珠子上的结合位点， 还如上所述在 PBST/5％奶粉中预封 闭所述噬菌体。对于淘选 1883， 第一轮和第三轮选择是使用如此处所述进行的生物素化 C3b 的溶液淘选。第二轮是如上所述的肽淘选 ( 该部分 )。
     淘选结果
     三轮淘选后选择的克隆已经亚克隆到表达载体中， 然后筛选与用于选择中的 C3b 或肽的结合。认为显示高于背景水平至少 2 倍的结合信号的克隆为初级命中。
     第一轮溶液淘选 1812 的输出是筛选在 Neutravidin 平板上与生物素化的 C3b 的 结合， 产生 531 个初级命中。以 C3b 筛选鉴定的 78 个克隆平行进行在生物素化的 C3 上的 筛选， 其在 C3b 上比在 C3 上显示更强的信号。78 个克隆的序列分析揭示了 27 条独特序列， 其中 19 条是结合并纯化的。仅小比例的这些克隆在捕获 ELISA 中显示与 cyno C3b 的交叉 反应性。鉴定 cyno 交叉反应性 C3bneo 抗体为本发明抗体的期望性状， 并特异选择 C3bneo 结合子的 cyno 交叉反应性。从 Cyno 猴血浆中纯化 Cyno C3b 蛋白， 并且在筛选过程中纯的 cyno C3b 作为抗原与人 C3b 一起使用。猕猴是极好的非人灵长类安全 / 毒性物种。期望 C3bneo 抗体与 cyno 的潜力和亲和力在人的 5-10 倍以内。选择该标准， 以实现对 cyno 中 C3b 浓度的显著抑制， 因此允许评估显著抑制 C3b 浓度引起的可能毒性。在筛选期， 因为没 有或有弱 cyno 交叉反应性， 必须丢弃许多克隆。为了鉴定更多的 cyno 交叉反应性克隆， 进 行淘选 1812 的再筛选。为了再筛选， 选择 178 个克隆， 其已经在 Neutravidin 平板上显示 了与 C3b 的显著结合 ( 高于背景至少 5 倍 ) 并且之前并未测序过。178 个克隆中的 38 个显 示与 cyno C3b 的结合， 并进一步进行 C3 反筛 (counter screen)。38 个克隆中的 10 个进 行反筛， 产生纯化的 1 个新的独特克隆。
     使用巯基平板的 ELISA 用于筛选基于珠子的淘选 1820。79 个初级命中， 49 个在 C3b 上比在 C3 上显示更强的信号。将这些测序， 产生 13 条独特序列， 其中 7 条是结合且纯 化的。
     筛选来自不同肽淘选 1849 的微表达 Fabs 与用于各选择的肽的结合。偶联肽的载 体蛋白用作 ELISA 中的直接包被抗原。 鉴定了 2944 中的 566 个初级命中， 但仅 22 个初级命 中显示高于背景至少 5 倍的信号。这 22 个克隆和 32 个额外克隆 ( 其显示接近背景 5 倍的信号 ) 进一步进行筛选， 以检查与全长 C3b 的结合。54 个克隆中没有一个显示与全长 C3b 的结合。
     与先前的差异肽淘选相反， 在差异肽淘选 1883 中进行全长 C3b 上的两轮选择和肽 上的仅一轮选择。淘选 1883 的结果是在捕获 ELISA 中筛选与 C3b 的结合。4416 个克隆的 筛选产生了 497 个初级命中。已经显示高于背景至少 5 倍信号的 275 个初级命中进一步进 行反筛。将经过反筛的 183 个克隆测序， 产生 9 个独特克隆。7 个独特克隆是结合且纯化 的。
     第二轮溶液筛选 1889 的结果是在捕获 ELISA 中筛选与 C3b 的结合， 产生 4416 个初 级命中的 2878 个。大多数初级命中 (2469/2878) 显示高于背景至少 5 倍的结合信号。决 定挑选 396 个代表性克隆进行反筛， 其来自不同淘选子库并具有不同的信号强度。 396 个克 隆中的 158 个通过反筛， 并进行测序， 产生 14 条独特序列和最终 11 个纯化的 Fabs。为了 不丢失任何感兴趣的克隆， 检测对 C3b 具有高于背景至少 5 倍结合信号的剩余克隆与 cyno C3b 的结合， 所述剩余克隆 (2073/2469) 未曾进行反筛选。筛选所得的 129 个 cyno 交叉反 应性克隆对 C3b 相比于 C3 的特异性。25 个克隆显示优于 C3 结合的 C3b 选择性， 最后产生 4 条新的独特序列。4 个克隆中的 3 个是结合且纯化的。
     表位装箱 (Epitope bining)
     根据制造商说明， 使用试剂盒 (ECL Protein biotinylation Module， GE) 生物素 化纯化的 Fabs。通过使其流过 Zeba Desalt Spin Column(Pierce) 从未结合的生物素上 清洗生物素化的 Fab。检测与生物素化的 Fab 的人 C3b 的结合活性， 在捕获 ELISA( 此处所 述 ) 中直接与其未生物素化的前体 (progenitor) 比较。仅挑选其结合活性未受生物素化 影响的 Fabs 继续研究。
     通过竞争 ELISA 进行表位装箱。所用的捕获抗体是指向 C3b 蛋白质兔多克隆抗人 C3d Ab， Abcam 的抗体， 其是 C3b 的亚结构域。用在 PBS 中稀释到 2μg/ml 的捕获抗体填充 Maxisorp 平板的孔。密封平板并在 4℃下温育过夜。
     第二天， 通过加入 PBST/5％奶粉封闭平板上剩余的结合位点。平板在室温下温育 1 小时， 然后用 PBST 洗涤 2 次。以在 PBST/5％奶粉中稀释的终浓度为 2.5μg/ml 加入 C3b。 平板在室温下温育 1 小时， 然后用 PBST 洗涤 2 次。
     同时， 均在 PBS 中稀释的终浓度 2.5μg/ml 的 C3b、 生物素化的 Fab 和未生物素化 的 Fab( 高于生物素化的 Fab 100 倍摩尔过量 ) 加入到孔中。平板在室温下温育 1 小时， 然 后用 PBST 洗涤 2 次。
     为了检测生物素化的 Fabs， 加入 AP 缀合的链霉抗生素蛋白 (Zymed)， 平板在室温 下温育 1 小时， 然后用 TBST 洗涤 5 次。根据制造商的说明书使用荧光底物 AttoPhos。在 Tecan GENios Pro 平板读出器上测量荧光。
     通过如上所述的竞争 ELISA 进行表位装箱。向人 C3b 中加入生物素化的 Fab 和未 生物素化的 Fab(100 倍过量 ) 的混合物。检测生物素标记。阴性对照 Fab MOR03207 获得 的信号设置为 100％值。与 100％信号相比评定抑制。
     鉴定了 6 个表位组 ( 在下文表中进行了概述 )。组 B 和 C， 以及组 D 和 E 共有部分 重叠的表位。
     表2： 表位组的概述
    实施例 3. 亲和力成熟和优化
     产生亲和力成熟文库
     为了增加所选抗体片段的亲和力和生物活性， 使用三核苷酸定向诱变通过盒诱变 平行地优化 L-CDR3 和 H-CDR2 区 ( 等， 1994)， 而构架区保持不变。在克隆用于
    亲和力成熟之前， 所有亲本 Fab 片段从相应的表达载体 (108x9_MH) 经过 XbaI/CN 102459334 A说明书23_LHC 产生105/123 页EcoRI 转移到 CysDisplayTM 载体 个 BssHII 位点从 HuCAL 展示载体25_LHC 中。通过去除干扰文库克隆的一 25_LHC， 用于 H-CDR2 优化。
     为了优化亲本 Fabs 的 L-CDR3， 通过 BpiI/SphI 去除轻链 (405bp) 的 L-CDR3、 构架 4 和恒定区， 并用多样化 L-CDR3 与构架 4 和所述恒定域的所有组成成分替换。大约 1.5μg 的 Fab 载体片段与 3 到 5 倍摩尔过量的携带多样化 L-CDR3s 的插入片段连接。在第二个文 库组中， 使 H-CDR2(XhoI/BssHII) 多样化， 而连接构架区保持不变。为了监测克隆效率， 在 将多样化 H-CDR2 盒克隆之前用模拟物替换亲本 H-CDR2。
     在 4ml 大肠杆菌 TOP10F 细胞 (Invitrogen， Carlsbad， CA， USA) 中将文库的连接 混合物电穿孔， 产生 108 到 109 个独立克隆。该文库大小保证覆盖理论多样性。如此处所 述进行文库的扩增。对于质量控制， 随机挑取单个克隆并进行测序。
     制备噬菌体用于亲和力成熟淘选
     在 含 有 34μg/ml 氯 霉 素 和 1 ％ 葡 萄 糖 (2xYT-CG) 的 2xYT 培 养 基 中 扩 增 成熟文库。用 OD600nm 为 0.5 的 VCSM13 辅助噬菌体感染后 ( 在 37℃， 不摇动 30 分钟 ； 在 37℃， 250rpm 摇动 30 分钟 )， 收集细胞 (4120xg ； 5 分钟 ； 4℃ )， 在 2xYT/34μg/ ml 氯霉素 /50μg/ml 卡那霉素 /0.25mMIPTG 中重悬浮并在 22℃下培养过夜。从上清液中 PEG 沉淀噬菌体两次， 在 PBS 中重悬浮并如下所述用于成熟淘选。
     (a) 成熟淘选
     用于成熟中的选择方法是如上文所述的溶液淘选。 为了增加淘选的严格性并选择 提高的解离速率， 降低抗原浓度并应用延长的洗涤条件 ( 高达 24 小时 )。在 4℃下进行过 夜洗涤步骤， 所有其他洗涤步骤在室温下进行。
     选择亲和力成熟的候选物
     已经在多种测定中表征了来自初次淘选的 Fabs。 根据以下标准将它们分级并分组 成可能的成熟候选物 ：
     ●结合 C3b 相比于结合 C3 的选择性
     ●溶血测定中的潜力
     ● C3b 和 MAC 沉积测定中的潜力
     ●作用方式
     ●表位箱
     ●亲和力
     8 个一级抗体进行成熟， 其因此在下文中称为 “亲本” 抗体。
     亲本抗体 MOR08035、 8598 和 8599 属于初次淘选后发现的最大一组 Fabs。它们是 表位箱 D 的成员， 在功能测定中展示活性， 并抑制 C3 和 C5 转化酶。这些抗体强烈抑制因子 B 与 C3b 的结合， 抑制因子 H 结合的程度较低。
     亲本抗体 MOR08552 展示相同的特征， 只是其具有稍微不同的表位 ( 箱 C)。
     MOR08672 和 MOR08675 均属于表位箱 D。它们非常好地抑制因子 H 的结合， 但仅显 示对其它因子结合的弱抑制。它们可能通过与上文抗体不同的机制起作用。同样， 缺少其 它因子的竞争可以导致以较低亲和力实现相同潜力。这种论点尤其用于 MOR08675， 其显示 适当的潜力， 尽管与 C3b 的亲和力实际上是低的。MOR08555 是表位组 C 的成员， 其与 MOR08305 组具有相似的特征， 但不抑制 C5 转化酶。 MOR08653 属于表位箱 B， 其与箱 C 部分重叠。其在功能测定中的存在导致对所检 测的所有机制的抑制 ： 因子 P、 因子 B 和因子 H 的结合、 C3b 二聚体形成的抑制以及 C3 和 C5 转化酶的抑制。
     分别构建来自各亲本的成熟文库， 以能够在淘选库的组成中维持灵活性。在稍晚 时间点上编辑库。对于各亲本抗体， 根据抗体发挥的主要抑制机制定义靶 KD 值。在 2 个库 的各库中编辑 MOR08598 和 MOR08653， 还有 MOR08555 和 MOR08599。在每各库中， 抗体展示 对抗原的相似亲和力， 很好地表达， 具有相同的靶 KD， 并且不共有重叠表位。
     用于亲和力成熟的文库
     通过 LCDR3 和 HCDR2 盒的平行交换进行亲和力成熟。通过三核苷酸定向盒诱变
    优化 CDR 序列。将来自表达载体 25 中。
    x9_Fab_MH 的 Fab 片段克隆到噬菌粒载体通过标准克隆方法产生 16 个不同的亲和力成熟文库 ( 对于各亲本抗体， 一个 LCDR3 和一个 HCDR3 文库 ) 并将多样化的克隆转化到电感受态大肠杆菌 TOP10F ′细胞 (Invitrogen) 中。文库大小合适， 在 5x108-4x109 范围内。对随机挑取的克隆测序显示 100％的多样性。在挑取的克隆中没有发现亲本结合子。最后， 分别制备了所有 16 个文库 的噬菌体。
     用于亲和力成熟的淘选策略
     在选择过程中分别保存 HCDR2 和 LCDR3 文库。8 个亲本中的 4 个处理为前导 ； 其 余 4 个亲本在 2 个库中各自排列。从所产生的亲和力成熟文库中复苏的约 1012 个噬菌体 进行成熟淘选。
     使用生物素化的抗原进行使用各噬菌体库的溶液淘选， 在人和 cynoC3b 之间交 替。为了增加淘选严格性并选择提高的解离速率， 降低抗原浓度并应用延长的洗涤条件 ( 高达 24 小时 )。在上文中概述了淘选和洗涤条件。成熟淘选后， 将富集的噬菌粒库亚克 隆到
    x9_MH 表达载体中。亲和力筛选和成熟淘选结果
     从所有淘选中筛选了共 2464 个克隆作为在人 C3b 上具有提高亲和力的细菌裂解 物。通过溶液平衡滴定 (SET) 评估初步的亲和力。认为估计与其亲本克隆相比亲和力提高 的克隆是初级命中。 从各淘选子库中获得初级命中， 并对所有初级命中测序， 8305-LCDR3 文库除外， 其 中对 65 个初级命中最好的 17 个测序。在 261 个初级命中中鉴定了共 173 条独特序列。可 鉴定来自所有亲本 Fabs( 除了 MOR08598) 的衍生物。从亲本 MOR08552 和 MOR08599 中没有 鉴定到 HCDR2 成熟的衍生物。
     选择亲和力优化的 Fabs 用于蛋白质纯化
     将独特的初级命中挑取到微孔培养板中， 并用于微量表达 Fab。Fab 裂解物用于第 二轮筛选中， 在捕获 ELISA 中检测与人 C3b、 cyno C3b 的结合、 在捕获 ELISA 中检查与对抗 靶标 C3d 和 C5 的交叉反应性， 并进行反筛。通过筛选的克隆继续用于研究。目的是从各亲 本中大规模表达并纯化大约 12 种衍生物。在多于 12 种衍生物通过第二轮筛选的情况下，
     用于蛋白质纯化的选择基于序列变异性。以下段落详细描述了各淘选子库的选择方法。
     已经从亲本 MOR08305 中鉴定了在 HCDR2 中成熟的 23 个独特克隆， 和在 LCDR3 中成 熟的 11 个克隆。 21/23HCDR2 成熟的克隆通过了反筛， 并且 18/21 与人 C3b 很好地结合。 但仅 1/18 克隆与 cyno C3b 显示很好的结合。选择该克隆 (MOR09124) 用于大规模纯化。根据序 列变异性选择额外的 5 个克隆用于大规模纯化。纯化对 MOR09122 不起作用。3/11LCDR3 成 熟的克隆不经过反筛， 但 2/3 包括在大规模纯化中 (MOR09130 和 9131)， 因为它们在人 C3b 上的高结合信号暗示了低亲和力， 其反过来可导致在血清上的残余结合。纯化对 MOR09132 不起作用。
     已经从亲本 8552 中鉴定了 16 个 LCDR3 成熟的衍生物。根据上文描述的相似标准 选择 7/16 的衍生物用于大规模纯化。但对于它们全部， 纯化均失败了。因此， 所有剩余 9 种衍生物进行大规模纯化。纯化仅对 2/9(MOR09308 和 9313) 起作用。
     已经从亲本 MOR08555 中鉴定到了在 HCDR2 中成熟的 1 个独特克隆， 和在 LCDR3 中 成熟的 3 个独特克隆。因为总共仅有 4 种衍生物， 决定全部纯化它们， 不管它们在第二轮筛 选中的行为。
     已经从亲本 MOR08599 中鉴定到了在 LCDR3 中成熟的 25 个独特克隆。它们中的大 多数在第二轮筛选过程中进行的所有测试中表现良好。 用于大规模纯化的克隆的选择基于 序列变异性。
     已经从亲本 MOR08653 中鉴定到了在 HCDR2 中成熟的 25 个独特克隆， 和在 LCDR3 中 成熟的 10 个独特克隆。各亚组中仅 1 个在反筛中表现良好。这些克隆 (MOR09198 和 9202) 继续用于研究。其它克隆的选择基于序列变异性。
     已经从亲本 MOR08672 中鉴定到了在 HCDR2 中成熟的 5 个独特克隆， 和在 LCDR3 中 成熟的 29 个独特克隆。仅 1/5HCDR2 成熟的克隆通过反筛， 并继续用于研究 (MOR09139)。 选择了 2 个额外的 HCDR2 成熟的克隆。纯化仅对 MOR09137 起作用。大多数 LCDR3 成熟的 克隆在第二轮筛选中表现良好。这些克隆的选择基于序列变异性。
     已经从亲本 MOR08675 中鉴定到了在 HCDR2 中成熟的 7 个独特克隆， 和在 LCDR3 中 成熟的 17 个独特克隆。1/7HCDR2 成熟的克隆显示仅与人和 cyno C3b 的弱结合， 并且被排 除在外。在剩余的 6 个克隆中， 仅 3 个不含有潜在的糖基化位点， 并进行大规模纯化。在选 择中包括含有潜在的糖基化位点的 2 个额外克隆。大多数 LCDR3 成熟的克隆在第二轮筛选 中表现良好。这些克隆的选择基于序列变异性。
     选择亲和力优化的 Fabs 继续研究
     考虑了先前部分中给出的所有可用数据， 包括未显示的与亲和力优化的 Fabs 的 表征相关的数据 ( 例如， 结合亲和力、 溶血的抑制、 C3b 沉积的抑制 ) 后， 选择最佳 Fabs 继续 研究。选择由 22 个成熟的 Fabs 组成， 其来自 4 种不同的亲本抗体。表 5 概述了所选 Fabs 的关键特征。
     表5： 被选择用于继续研究的 22 个成熟的 Fabs 的关键特征
    优化的 Fabs 的 IgG 转化以及在 IgG 水平上的杂交克隆
     将所有 8 个亲本 Fabs、 几个成熟的 Fabs 和具有期望谱的几个成熟修复 ( 去除潜在 糖基化位点的 )Fabs 亚克隆到人 IgG 形式中。
     通过用轻链和重链构建体的组合转染细胞完成 IgG 水平上的杂交克隆。因为 MOR09124 是鉴定到的唯一 HCDR2 成熟的克隆， 所以杂交克隆仅对各家族 (MOR08305 衍生 物 ) 是可能的， 其中 MOR09121 的重链与其它成熟家族成员的轻链组合。为杂交克隆给出了 新的 MOR 号， 其概述于表 8 中。
     表8： 杂交克隆抗体的 MOR 号。
    
     MOR0 9395 9396 9397 9398 9399 9400
     类型 杂交克隆 杂交克隆 杂交克隆 杂交克隆 杂交克隆 杂交克隆 MOR0 的重链 9124 9124 9124 9124 9124 9124 MOR0 的轻链 9128 9129 9130 9131 9255 9256在上述亲和力成熟的 Fabs、 修复的 Fabs( 去除糖基化位点的 )， 和杂交克隆的 Fabs 中， 根据此处描述的方法测定 Fabs 9124、 9397、 9398、 9136、 9141、 9373 和 9423 的结合特征。表 9 概述了这些 Fabs 的结合亲和力、 功能潜能和补体因子结合的抑制。
    在下文详细描述了用于测定在表 8 中概述的 Fabs 的结合亲和力和功能性质的方法。如从表 8 中的数据可以看出， 本发明的 Fab 片段能够以低于或等于 100pM， 在许多情况 下以低于或等于 10pM 的亲和力结合人和猕猴 C3b。此外， Fab 片段以低于或等于 100nM， 在 大多数情况下低于或等于 50nM 的 IC50 显示对人和猕猴 C3b 的功能潜能。
     实施例 4IgG 形式的 C3b 结合子的产生和表征
     IgGs 的种系化
     通过 Geneart(Geneart AG， Regensburg， Germany) 将编码轻链和重链的免疫球蛋 白可变区的 pM2 表达载体中的区域种系化并进行优化， 以匹配种系化序列， 避免不适合在 哺乳动物细胞中表达的密码子， 并避免隐藏的剪接位点。 将所有重链的 N 末端 QVQ 变成 EVQ， 因为末端 Q 可能形成 pyroglutamine。选择来自各亲本家族的抗体， 用于种系化 / 优化。简 言之， 如下在 IgG 形式中种系化并表达抗体。
     转化成 IgG
     为了表达全长免疫球蛋白， 将 Fab 重链 (VH) 和轻链 (VL) 的可变结构域片段从 Fab 表达载体亚克隆到 IgG1 表达载体中。限制酶 MfeI 和 BlpI 用于将 VH 结构域片段亚克隆到 2_h_IgG1AA 中， 其中 234 和 235 位上的亮氨酸突变成丙氨酸来消除 FcRγ 结 合并减弱效应功能。经 EcoRV 和 BsiWI 位点将 VL 结构域片段亚克隆至 Igκ 中， 而使用 EcoRV 和 HpaI 完成亚克隆到
    2_h_2_h_Igλ2 中。人 IgG 的瞬时表达和纯化
     用 1 ∶ 1 的比例的 IgG 重链和轻链表达载体 DNA 转染真核 HKB11 和 HEK293 细胞。 在转染后 3 天或 7 天收集细胞培养物上清液， 并进行标准的 A 蛋白亲和层析 (MabSelect SURE， GE Healthcare)。除非另有说明， 缓冲液交换成 1x Dulbcecco ′ s PBS(pH 7.2， Invitrogen) 并无菌过滤样品 (0.2μm)。 在 SDS-PAGE 中或通过使用 Agilent BioAnalyzer 分析变性的还原和非还原条件下的 IgG 的纯度， 并通过 HP-SEC 分析天然状态中 IgG 的纯 度。
     为种系化的抗体给出了新的 MOR 号， 如表 10 中所示。
     表 10 ： 种系化的抗体的 MOR 号。
     种系化抗体的 MOR0 9555 9556 9609 9610 9611 9612 祖先抗体的 MOR0 9140 9124 9136 9141 9397 9398114CN 102459334 A 9613 9674 9675
    说明书9314 9373 9423111/123 页当然， 进一步表征了种系化抗体 9556、 9611、 9612、 9609、 9610、 9674 和 9675。
     亲和力测定
     C3bneo 抗体通过结合 C3b 分子上的新表位阻断补体激活。C3b 上的新表位也是血 浆中其它丰富补体蛋白的结合位点， 例如因子 H、 因子 B 和因子 P， 其通过旁路途径调节补体 激活。C3bneo 抗体因此应该具有高的亲和力， 以与这些丰富补体蛋白竞争， 来通过阻断这 些补体蛋白结合 C3b 而有效阻断补体激活。高亲和力为实现低治疗剂量所需。例如， 血浆 中因子 H 的浓度在 3μM 左右， 因子 H 与 C3b 的结合亲和力 (Kd) 是～ 30nM ； 因子 H 浓度比 其 Kd 高 100 倍。当 C3bneo 抗体与因子 H 竞争结合 C3b 时， 其需要 10pM Kd C3bneo 抗体的 1nM 浓度 ( 高于其 Kd100 倍抗体浓度 ) 来抑制因子 H 结合 C3b 的 50％。等于或低于 10pM Kd C3bneo 抗体因此会以适当的治疗抗体剂量实现旁路途径补体激活的有效阻断。因此， 选择的本发明的抗体分子具有低于或等于 65pM， 优选低于或等于 10pM 范围的高结合亲和 力。例如， 选择本发明的抗体分子以对 C3b 具有 9、 8、 7、 6、 5、 4、 3 或 2pM 或更低的结合亲和 力 ( 即， 低于 2pM 的更高亲和力 )。
     如下通过 Biacore 和溶液平衡滴定 (SET) 测定种系化的 IgG 抗体结合 C3b 的亲和 力。
     Biacore 测定
     使用 CM5 传感器芯片 (GE Healthcare， BR-1005-30) 在 25℃下以 BIAcore T100(GE Healthcare) 完 成 Biacore 动 力 学 实 验。 运 行 缓 冲 液 是 HBS-EP(+)(GE Healthcare， BR-1001-88)。简言之， 进行以下步骤以测定结合亲和力。
     ●制备抗 C3d IgG 固定化的传感器芯片 ： 根据供应商的说明书 (GEHealthcare， BR-1000-50)， 通过使用氨基偶联方法， 以 10ul/ 分钟的流速在 CM5 芯片上将兔抗 C3d 多 克隆抗体 (Abcam， ab-15981)( 在乙酸盐 pH5.0 偶联缓冲液中 50ug/ml(GE Healthcare， BR-1003-51)) 偶联到两个不同的流动池 (Fc1 和 2) 上 600 秒。最终固定化的水平将＞ 7000RU。
     ●在第二个流动池上捕获 C3b ： 在第二个流动池上以 10ul/ 分钟注射运行缓冲液 中的 1ug/ml 的 C3b， 以对 Fab 而言达到～ 70RU 的捕获水平， 或对 IgG 动力学分析而言达到～ 20RU 的水平。
     ●在两个流动池上注射不同浓度的抗 C3b Fab 或 IgG ： 在两个流动池 (Fc1 和 2) 上 以 60ul/ 分钟注射抗 C3b 溶液 ( 在运行缓冲液中 0.3125nM ～ 10nM ； 1 ∶ 2 系列稀释 )240 秒。
     ●解离 ： 在两个流动池上以 60ul/ 分钟注射 HBS-EP(+) 运行缓冲液， 以监测 C3b 与 抗 C3b Fab/IgG 之间的解离。对于 5nM 和 2.5M Fab/IgG 浓度， 解离时间设置为 2400 秒， 而 对于包括另一 5nM Fab/IgG 浓度的所有其它浓度设置为 300 秒。
     ●再生 ： 在两个流动池上以甘氨酸 -HCl pH1.6( 从甘氨酸 -HCl pH1.5 和甘氨酸pH2.0， GE Healthcare 制备 )+0.05％ P20 表面活性剂 (GEHealthcare， BR-1000-54)， 60ul/ 分钟的流速在各循环结束时进行再生 40 秒， 两次。
     ●动力学分析 ： 以 BIAevaluation 1.1 软件通过应用 1 ∶ 1 结合模型获得动力学 速率常数， 其中局部拟合 Rmax 值。
     在下文表 11 中显示了 Biacore 结合动力学测定的结果。如所示， 此处所述的抗体 对人 C3b 显示高亲和力结合， KD 值通常低于或等于 10pM， 并在许多情况下低于或等于 5pM。 这些抗体对 cyno C3b 也显示非常高的亲和力 ( 低于 200pM 的结合亲和力 )。
     表 11
    SET 测定
     对于通过溶液平衡滴定 (SET) 对 KD 的测定， 使用抗体蛋白质的单体级分 ( 至少 90％的单体含量， 通过分析 SEC 分析 ； Superdex75(AmershamPharmacia) 用于 Fab 或 Tosoh G3000SWXL(Tosoh Bioscience) 用于 IgG)。
     基本如参考文献中所述进行溶液中的亲和力测定 (Friguet 等 305-19)。 为了提高 SET 方法的灵敏度和准确度， 从经典 ELISA 转换成基于 ECL 的技术 (Haenel 等， 2005)。 TM
     根据制造商的说明书利用 MSD Sulfo-TAG NHS-Ester(Meso ScaleDiscovery， Gaithersburg， MD， USA) 标记 1mg/ml 山羊抗人 (Fab)2 片段特异性抗体 (Dianova)。
     在聚丙烯微量滴定板中进行实验并以含有 0.5％ BSA 和 0.02％ Tween20 的 PBS pH 7.4 作为测定缓冲液。以比预期 KD 高至少 10 倍的浓度开始， 以 2n 系列稀释未标记的人 C3b 或 cyno C3b。没有抗原的孔用于测定 Bmax 值 ； 具有测定缓冲液的孔用作测定背景。加入 例如 10pM Fab(60μL 终体积中的终浓度 ) 后， 在室温下过夜温育混合物。所应用的 Fab 浓 度与预期 KD 相似或低于预期 KD。
     用 PBS 中 0.05μg/ml 人 C3b(30μL/ 孔 ) 过夜包被标准 MSD 平板， 并用 PBS 中的 3％ BSA 封闭 1 小时。用测定缓冲液洗涤平板后， 将平衡的样品转移到那些平板中 ( 每孔 30μL) 并温育 20 分钟。洗涤后， 向 MSD 平板中加入 30μL/ 孔最终稀释 1 ∶ 1500 的 MSD 磺
     基 - 标签标记的检测抗体 ( 山羊抗人 (Fab)2)， 并在室温下 Eppendorf 摇床上 (700rpm) 温 育 30 分钟。
     洗涤平板并加入含表面活性剂的 30μL/ 孔 MSD Read 缓冲液 T 后， 使用 Sector 成 像仪 6000(Meso Scale Discovery， Gaithersburg， MD， USA) 检测电化学发光信号。
     用 XLfit(IDBS) 软件， 应用定制的拟合模型评估数据。对于 Fab 分子的 KD 测定， 使用以下拟合模型 ( 根据 Haenel 等， 2005， 根据 Abraham 等改进 ) ：
    [Fab]t ： 应用的总 Fab 浓度
     X： 应用的总可溶性抗原浓度 ( 结合位点 )
     Bmax ： 没有抗原的 Fab 的最大信号
     KD ： 亲和力
     原则上， 应用相同的方案来测定 IgG 分子的 KD 值， 除以下不同 ： 向稀释系列的抗原 中加入完整 IgG 分子， 而不是 Fab 分子， 并且在室温下平衡过夜。随后， 如上所述处理样品。
     对于数据评估， 即 IgG 分子的 KD 测定， 使用 IgG 的以下拟合模型 ( 根据 Piehler 等， 1997 改进 ) ：
    [IgG] ： 应用的总 IgG 浓度
     x： 应用的总可溶性抗原浓度 ( 结合位点 )
     Bmax ： 没有抗原的 IgG 的最大信号
     KD ： 亲和力
     尽管没有特定地显示， SET 数据验证了此处所述的抗体是人 C3b 的高亲和力结合 子， 其结合亲和力在低于或等于 10pM， 在许多情况下低于或等于 5pM 的范围内。同样地， 此 处描述的抗体以高亲和力结合猕猴 C3b， 通常以低于或等于 200pM 的 KD 结合猕猴 C3b。
     C3b 抗体显示对 C3 的显著结合选择性
     检查 C3b 抗体， 以测定它们对 C3b 的结合相对于 C3b 前体 C3 是否是选择性的。简 言之， 通过进行以下步骤测定对 C3b 的结合选择性。用碳酸盐缓冲液中 2μg/ml 的抗 C3d 兔单克隆抗体 (abcam 17453) 以 100μl/ 孔包被 Maxisorp 平板 Nunc(442404)。密封平 板并在 4 ℃下温育过夜。抽干平板并用 PBS/0.5 ％ Tween 20 洗涤 3 次。用稀释剂 (PBS， 4％ BSA Fraction V(Fisher ICN16006980)， 0.1％ Tween 20(Sigma P1379)， 0.1％ Triton X-100(Sigma P234729)) 封闭平板， 并在室温下温育 2 小时或在 4℃下温育过夜。然后用 PBS/0.5％ Tween 20 洗涤平板一次。 在稀释剂中以 1μg/ml 稀释纯化的 C3b( 补体技术 A114 lot 21) 和 C3( 补体技术 A113c)， 并在每孔中接种 100μl。在室温下温育 1 小时。然后用 PBS/0.5％ Tween 20 洗涤 3 次。以 100nM 稀释 Fabs， 随后在稀释剂中稀释 ( 或更高浓度 )， 并在每孔中接种 100μl。在室温下温育 1 小时。用 PBS/0.5％ Tween 20 洗涤平板 3 次。在
     稀释剂中加入 100μl/ 孔的 1 ∶ 400 的抗组氨酸 HRP 单克隆检测抗体， 并在室温下温育 1 小时。然后用 PBS/0.5％ Tween 20 洗涤 4 次。加入 100μl 的 TMB 底物 (Pierce 34028)， 并在室温下温育高达 5 分钟。向各孔中加入 50μl 的终止溶液 (2N 硫酸 )， 并在 450nm 处读 取平板， 并在 570nm 处校正塑料读数。
     如图 1 所示， C3b 抗体对 C3 结合具有选择性。抗体实现了相对于 C3 结合高 1000 倍的 C3b 结合选择性。尽管图 1 显示了对抗体 9556 的结合选择性的实例， 1000 倍的结合选 择性是此处公开的七种 IgG C3b 抗体具有的性质。
     C3b 抗体抑制备选补体途径
     为了证明抗 C3b 抗体抑制备选补体途径， 进行以下测定。
     溶血测定
     溶血测定是基本的功能测定， 其检测补体激活并已经用于评估抗人 C3b mAbs 和 Fab 分 子 阻 断 红 细 胞 (RBCs) 通 过 补 体 途 径 溶 解 的 能 力 (Evanset al.(1995).In vitro and in vivo inhibition of complement activity by asingle-chain Fv fragment recognizing human C5.Mol Immunol 32， 1183-1195 ； Thomas et al.(1996). Inhibition of complement activity byhumanized anti-C5 antibody and single-chain Fv.Mol Immunol 33， 1389-1401 ； Rinder et al.(1995).Blockade of C5a and C5b-9 generationinhibits leukocyte and platelet activation during extracorporeal circulation.J Clin Invest 96， 1564-1572)。简言之， 对于经典途径测定， 敏化的红细胞 用作通过血清中存在的补体蛋白质进行溶解的靶标。该测定对于高亲和力抗人 C3b mAbs 的表征和筛选是重要的。
     从 Rinder 等， (1995) 和 Thomas 等， (1996) 改进该方法。
     试剂 ：
     兔红细胞 (Rb RBCs)-Lampire， Cat#7246408
     人血清 -Novartis Blood Research Program ； 或 Cyno 血清 -AlphaGenesis
     明胶佛罗那缓冲液 (GVB)-Boston BioProducts， Cat#IBB-300
     EGTA-Boston BioProducts， Cat#BM-151
     MgCl2
     U 型底 96- 孔板 -Corning， Cat#3795
     平底 96 孔板 -Corning， Cat#3370
     NP-40-Sigma， Cat#74385
     方案 ：
     1. 洗涤 Rb RBCs 并在 GVB/EGTA/Mg++ 中调整至 8.33e7 细胞 /ml
     2. 向 96 孔圆底平板的孔中加入在 GVB 中稀释的 50μl Ab ； Ab 的浓度应该是期望 终浓度的 2 倍。
     3. 加入在含有 EGTA 和 Mg++ 的 GVB 中稀释的 50μl 血清。
     a. 制备对照孔 ： 血清 +0nM Ab， 0％溶解对照 ( 仅缓冲液 )、 100％溶解对照 (0.1％ NP-40)， 和血清、 缓冲液， 和 NP-40 对照。
     b. 如果对 10％血清检测 Ab， 使用 10mM EGTA 和 5mM Mg++( 最终 ) ； 如果对 50％血 清检测 Ab， 使用 15-30mM EGTA， 5mM Mg++( 最终 )。4. 在室温下温育 30 分钟。
     5. 向样品和对照孔中加入 30μl Rb RBCs ； 向空白孔中加入 30μl 缓冲液。 在 37℃ 下温育 30 分钟。
     6. 在 2000rpm 下离心平板 5 分钟。
     7. 收集上清液， 转移至平底平板中。
     8. 读取 OD415 和 OD570。计算％溶血 ：
    图 2 显示了抗 C3b 抗体在 10％人或猕猴血清中抑制溶血的能力的实例。 此处所述 的各 C3b 抗体以低于或等于 50nM 的 IC50 抑制溶血。
     相反， 当使用敏化的红细胞进行测定时， 为了检查经典补体途径的激活， 发现此处 所述的抗 C3b 抗体不激活经典补体途径 ( 数据未显示 )。
     C3b 沉积测定
     测定在旁路途径中补体 C3 的抑制剂活性的一种方法是测定其沉积在酵母多糖上 的分解产物 C3b。根据以下步骤进行这种基于 ELISA 的测定 ： 在 4℃下 Maxisorp 384- 孔 ELISA 平板 (Nunc 464718) 中用碳酸盐缓冲液， pH 9.6(Pierce Cat#28382) 中 25μl 的 1mg/ml Zymosan A(Sigma Z4250) 包被过夜。第二天， 抽吸酵母多糖包被的平板并用每孔 100μl 的 ELISA 封闭缓冲液， Synblock(AbD Serotec BUFO34C) 在室温下封闭 2 小时。在
    各反应中， 向补充 MgCl2 和 EGTA( 最终总的反应浓度为 1mM MgCl2 和 10mMEGTA) 的 10％血 清中加入在明胶佛罗那缓冲液 (Boston BioproductsIBB320-10mM Barbital， 145mM NaCl， 0.1％明胶， 0.5mM MgCl2， 10mMEGTA) 中系列稀释的抑制剂。 阳性对照不含有抑制剂， 而阴性 对照含有 25mM EDTA。通过在室温下温育 30 分钟允许混合物达到平衡。为了去除封闭缓冲 液， 抽吸平板并用 TBS/0.05％ Tween-20 洗涤一次。 向平板中加入每孔 25μl 含有抑制剂的 10％血清或对照， 并在 37℃下温育 30 分钟 ( 先前通过时间过程测定在酵母多糖上的 C3b 沉 积的线性范围内 )。30 分钟温育后， 用 TBS/0.05％ Tween-20 洗涤平板 3 次。为了检测酵母 多糖上的 C3b 沉积， 向平板中加入在含有 2％ BSA Fraction V(Fisher Cat# ICN16006980)、 0.1％ Tween20(Sigma Cat#P1379) 和 0.1％ TritonX-100(SigmaCat#P234729) 的 PBS 中根 据制造商稀释的鸡抗人 C3-HRP 缀合的多克隆抗体 (Immunology Consultants Laboratory， Inc.Cat#CC3-80P-1)， 并在室温下温育 1 小时。然后， 用 TBS/0.05％ Tween-20 洗涤平板 3 次， 然后加入 25μl 的 Ultra TMB 底物溶液 (Pierce Cat#34028.)。当孔中的溶液变蓝时， 用 15μl 的 2N 硫酸终止反应。使用 Spectromax 在 450nm 读取平板 (OD450-570nm 读数 )， 在 570nm 处为塑料平板进行校正。使用以下公式计算在酵母多糖上 C3b 沉积的百分比 ：
    图 3 显示了 C3b 抗体抑制 C3 产生为 C3b 的分解产物的能力的实例。显示各检测 抗体以至少低于或等于 10nM 的 IC50 抑制 C3b 沉积。
     MAC 沉积测定
     测定 C3b 抗体抑制备选补体途径的功能能力的另一种测定是测定抗体抑制产生 膜攻击复合体 (MAC) 的能力， 其位于 C3b 加工的下游。简言之， 以碳酸盐缓冲液， pH 9.5 中 1mg/ml 在平板上包被 Zymosan A(Sigma) 来激活旁路途径。Fabs 或 IgGs 各自与血清 (2％ 血清， 5mM MgCl2， 10mMEDTA) 预温育， 然后加入到平板中并在室温下温育过夜。 用 TBST 洗涤 平板 3 次后， 通过与抗 C5b-9-ALP(Diatec) 温育 1 小时， 然后用 TBST 洗涤 3 次， 并与补充有 2mM MgCl2 的 4- 甲基伞形酮磷酸酯 (Fisher) 温育 30 分钟来检测 MAC。用 0.2M EDTA 终止 反应， 并在 ex ＝ 355nm， em ＝ 460nm 处读取平板。计算各样品相对于基线 (EDTA 处理的人 血清 ) 和阳性对照 ( 人血清 ) 的 MAC 沉积的抑制， 并利用 PRISM 来产生 IC50 曲线。
     图 4 显示了示例性数据， 其证明 C3b 抗体抑制 MAC 沉积的能力， 因此表明抗体抑制 补体旁路。尤其是， 抗体以低于或等于 5nM 的 IC50 抑制 MAC 沉积。
     C3a 和 C5a 产生的抑制
     可用于测定 C3b 抗体抑制补体旁路的能力的另一种测定是测量 C3a 和 C5a 的产 生， 两者是旁路途径中 C3b 下游的激活产物。
     简言之， 由申请人开发了 C5a-des-Arg ELISA 来测定溶血过程中 C5a 的产生以证 实溶血测定中抑制性的抗体也抑制 C5 切割成 C5a 和 C5b。
     用 包 被 缓 冲 液 ( 碳 酸 氢 盐 pH 9.5-9.8) 中 1μg/ml 的 100μl/ 孔 小 鼠 抗 人 C5a-des-Arg(US Biologics) 包被 Maxisorp 平板， 并将其在 4℃温育过夜。用 PBST 洗涤 3 次后， 用 300μl/ 孔稀释剂 (Synblock， AbD Serotec) 在室温下封闭所述平板 2 小时。抽 出封闭溶液后， 以稀释剂稀释的 100μl 样品或标准品在室温下温育 1 小时。如下制备标准 品： 以 20ng/ml 标准品 (rC5a-des-Arg) 开始， 制备 1 ∶ 4 连续稀释液用于 7 点曲线。在稀 释液剂中以 1 ∶ 5 稀释溶血测定的样品 ( 溶血测定上清液应该储存在 -80℃， 直至用于 C5a ELISA)。中间用 PBST 洗涤平板 3 次。
     加入稀释剂中稀释的 100μl/ 孔的 0.4μg/ml 检测抗体 ( 生物素 - 山羊抗人 c5a， R&D Systems)， 并且在室温下温育 1 小时后， 加入 HRP 稀释剂 ( 聚 -HRP 稀释剂 ) 中 1 ∶ 5000 稀释的 100μl/ 孔 Strep-HRP( 聚 -HRP 链霉抗生物素蛋白 )30 分钟。用 PBST 洗涤 4 次 后， 加入 100μl/ 孔 TMB 底物 (UltraTMB 底物溶液 )5-10 分钟。用 50μl/ 孔终止溶液 (2N H2SO4) 终止反应。读取吸光度 (A450-A570) 并使用 SoftMax Pro 分析数据。
     同样地， 由申请人开发了 C3a-des-Arg ELISA 来测定溶血过程中的 C3a 产生， 以验 证在溶血测定中抑制性的抗体也抑制 C3 切割成 C3a 和 C3b。
     用 包 被 缓 冲 液 ( 碳 酸 氢 盐 pH 9.5-9.8) 中 1μg/ml 的 100μl/ 孔 小 鼠 抗 人 C3a-des-Arg neo(US Biologics) 包被 Maxisorp 平板， 并将其在 4℃温育过夜。用 PBST 洗 涤 3 次后， 用 300μl/ 孔稀释剂 (Synblock， AbD Serotec) 在室温下封闭所述平板 2 小时。 抽出封闭溶液后， 以稀释剂稀释的 100μl 样品或标准品在室温下温育 1 小时。如下制备标 准品 ： 以 1μg/ml 标准品 (rC3a-des-Arg) 开始， 制备 1 ∶ 3 连续稀释液用于 8 点曲线。在 稀释液剂以 1 ∶ 5 稀释溶血测定的样品 ( 溶血测定上清液应该储存在 -80℃， 直至用于 C5a ELISA)。中间用 PBST 洗涤平板 3 次。
     加入稀释剂中稀释的 100μl/ 孔的 10μg/ml 检测抗体 ( 生物素 - 小鼠抗人 c3a， Chemicon 和内部生物素化的 )， 并且在室温下温育 1 小时后， 加入 HRP 稀释剂 ( 聚 -HRP 稀释剂 ) 中 1 ∶ 5000 稀释的 100μl/ 孔 Strep-HRP( 聚 -HRP 链霉抗生物素蛋白 )30 分钟。用 PBST 洗涤 4 次后， 加入 100μl/ 孔 TMB 底物 (Ultra TMB 底物溶液 )5-10 分钟。用 50μl/ 孔终止溶液 (2NH2SO4) 终止反应。 读取吸光度 (A450-A570) 并使用 SoftMax Pro 分析数据。
     如图 5 所示， C3b 抗体能够通过抑制产生 C3a 和 C5a 阻断旁路途径驱动的补体激 活。更尤其是， 此处所述的 C3b 抗体如抑制 C3a 和 C5a 产生所测定以低于或等于 50nM 的 IC50 抑制旁路途径。
     C3b 抗体抑制体外 C3 转化酶活性
     基于 C3 水空转 (Tick-over) 转化酶凝胶的测定
     在该测定中， Fabs/IgGs 与 10％的含 C3- 水的 C3 预温育， 以便当加入因子 D 和因 子 B 时， 可以测量通过 C3 水空转的转化酶活性。以以下终浓度使用蛋白质试剂 ： 天然因子 B(100nM)、 因子 D(40nM)、 C3(400nM)、 MgCl(5mM) 和 Fab/IgG 1000nM， 随后进行稀释。在 96 孔聚丙烯平板中， 加入多种稀释度的 Fabs/IgGs( 包括 PBS 对照样品 )。为此， 加入 C3 并在 室温下温育 1 小时。然后将因子 B、 因子 D 和 MgCl 的储存混合物加入到 1XPBS 中。1 小时 温育后， 将适当量的反应混合物加入到每孔 Fab/IgG-C3 中。立即取 0 时间点， 加入 4X 样品 缓冲液， 并放置在 95℃。允许转化酶反应在室温下温育 15 分钟。然后取最后的时间点， 加 入 4X 样品缓冲液， 并放置在 95℃。在还原条件下 4-12％ Bis-Tris 凝胶上为各样品运行总 体积 ( 也可在省略因子 D 的单独反应中产生 0 时间点 )。
     基于 C3b 凝胶的转化酶测定
     设计该测定， 以便 Fabs/IgGs 与 C3b 预温育。 温育后， 将其加入到 C3 反应混合物中 以检测转化酶活性。以以下终浓度使用蛋白质试剂 ： 天然 C3b(32nM)、 天然因子 B(100nM)、 因子 D(40nM)、 C3(400nM)、 MgCl(5mM) 和 Fab/IgG 1000nM， 随后进行稀释。在 96 孔聚丙烯 平板中， 加入适当体积的多种稀释度的 Fabs/IgGs( 包括 PBS 对照样品 )。为此， 每孔加入 适当量的 C3。在 37℃下温育 1 小时。然后将因子 B、 因子 D 和 MgCl 的储存混合物加入到 1XPBS 中。1 小时温育后， 向储存混合物中加入 C3， 并将适当量的反应混合物立即加入到各 孔 Fab/IgG-C3 中。立即取 0 时间点， 加入 4X 样品缓冲液， 并放置在 95℃。允许转化酶反应 在室温下温育 15 分钟。然后取最后的时间点， 加入 4X 样品缓冲液， 并放置在 95℃。在还原 条件下 4-12％ Bis-Tris 凝胶上为各样品运行总体积 ( 也可在省略因子 D 的单独反应中产 生 0 时间点 )。
     进行基于 C3 转化酶凝胶的测定
     设计该测定， 以便使用 C3b、 因子 B 突变体和因子 D 产生稳定的转化酶。 为此， 加入 Fabs/IgGs 并允许温育。 然后加入 C3， 并取样品进行分析。 C3 不能形成转化酶。 以以下终浓 度使用蛋白质试剂 ： 天然 C3b(32nM)、 天然因子 B 突变体 (16nM)、 因子 D(40nM)、 C3(400nM)、 MgCl(5mM) 和 Fab/IgG 1000nM， 随后进行稀释。在 96 孔聚丙烯平板中， 加入 c3b、 因子 B、 因 子 D 和 MgCl， 并在 37℃下温育 10 分钟。然后加入适当稀释的 fabs/IgGs(PBS 对照 ) 并在 37℃下温育 20 分钟。然后加入 C3 并在室温下温育 15 分钟。立即取 0 时间点， 加入 4X 样 品缓冲液， 并放置在 95℃。允许转化酶反应在室温下温育 15 分钟。然后取最后的时间点， 加入 4X 样品缓冲液， 并放置在 95℃。在还原条件下 4-12％ Bis-Tris 凝胶上运行各样品的 总体积 ( 也可在省略因子 D 的单独反应中产生 0 时间点 )。
     如图 6 中所示， C3b 抗体抑制旁路途径体外 C3 转化酶活性。 图 6A 显示了 SDS-PAGE凝胶， 其显示了空转转化酶活性的抑制。图 6B 显示了 6A 凝胶中对 C3b 产生的抑制的定量。 图 6C 显示了抗 C3b 抗体抑制预形成的 C3 转化酶活性。
     C3b 抗体体外抑制 C5 转化酶活性
     为了进一步表征抗 C3b 抗体抑制补体旁路的能力， 检查抗体抑制 C5 转化酶激活 的能力。简言之， 通过与纯化的 C3 和胰蛋白酶 (Sigma) 在室温下温育 10 分钟在 Zymosan A(Sigma) 上沉积 C3b。将酵母多糖离心并去除上清液， 通过加入纯化的 C3、 fB、 fD 和 NiCl2 扩增 C3b。重复扩增步骤， 直至在酵母多糖上达到想要密度的 C3b。
     Fabs/IgGs 与 Zymosan-C3b 在 室 温 下 预 温 育 45 分 钟。 加 入 纯 化 的 蛋 白 质 (Complement Tech) ： C5(100nM)、 C6(100nM)、 fB(500nM)、 fD(160nM) 和 5mM NiCl2。反应在 37℃下温育 5 中， 并通过 1 ∶ 10 稀释到冰冷的 GVB+10mM EDTA 中来终止反应。使用溶血测 定， 通过向 chRBCs(8E7/ml) 和 2％人血清中加入反应产物， 并在 37 ℃下温育 30 分钟来定 量 C5bC6 水平。在 2000rpm 下将细胞离心 5 分钟， 并在 A415/A570 处读取上清液。纯化的 C5bC6 蛋白质 (Complement Tech) 用作标准曲线。
     如图 7 所示， C3b 抗体抑制旁路途径体外 C5 转化酶活性。
     通过 C3b 抗体阻断补体因子结合 C3b
     进行以下实验， 以测定抗 C3b 抗体抑制 C3b 与补体旁路其它成员之间相互作用的 能力， 并因此证明了抗体抑制补体旁路的可能机制。简言之， 在室温下 48 小时温育期间使 用 AminoLink Reductant(Pierce) 将纯化的 C3b 和 fP 缀合到未缀合的受体或供体珠子 (PerkinElmer) 上。使用羧甲基胺半盐酸盐 (Aldrich) 淬灭珠子， 通过在 13000rpm 下离 心并用 0.1M TBST 洗涤三次进行纯化。在室温下使用 20 倍摩尔过量的 NHS 生色的生物素 (Pierce) 在 30 分钟温育期间生物素化纯化的 fB(D24G/N260D) 和 fH， 并使用 Zeba 0.5ml 脱盐柱 (Pierce) 进行纯化。
     对于 C3b-C3b 和 C3b-fP 的近似性， Fabs 或 IgGs 分别与 C3b 受体珠子 (20μg/ml) 在室温下预温育 60 分钟。然后加入 C3b- 供体珠子或 fP- 供体珠子 (20μg/ml)， 并在读数 前在室温下温育平板过夜。 对于 C3b-fB 和 C3b-fH 的近似性， 抗体与 C3b- 受体珠子 (20μg/ ml) 在室温下预温育 60 分钟。然后加入生物素化的 fB(D24G/N260D) 或 fH， 并在室温下温 育 60 分钟。然后加入 SA- 供体珠子 (20μg/ml)， 并在读数前在室温下过夜温育平板钟。在 BMGPherastar 上读取平板 (ex ＝ 680， em ＝ 520-620)。
     如图 8 所示， C3b 抗体阻断了几种补体因子与 C3b 的结合。如图中所见， 抗 C3b 抗 体利用不同的作用机制来阻断补体旁路。图 8A 显示了通过 C3b 抗体抑制因子 B 结合 C3b。 图 8B 显示了通过 C3b 抗体抑制因子 P 结合 C3b。图 8C 显示了通过 C3b 抗体抑制因子 H 结 合 C3b。图 8D 显示了通过 C3b 抗体抑制 C3b-C3b 二聚体形成。
     C3b 抗体不与人 C3d 或人 C5 交叉反应
     检测抗 C3b 抗体与人 C3d 和 C5 的交叉反应性。
     用于检测与人 C3b、 人 C3d 或 cyno C3b 的结合的 EILSAs 中的捕获抗体是针对 C3d 蛋白质兔多克隆抗人 C3d Ab， Abcam) 的抗体， 其为 C3b 的亚结构域。用在 PBS 中稀释至 2μg/ml 的捕获抗体填充 Maxisorp 平板的孔。密封平板并在 4℃下温育过夜。为了检测 Fabs 与 C5 的结合， 捕获抗体是以 5μg/ml 的终浓度使用的抗 C5 抗体 (US Biologicals)。
     第二天， 通过加入 PBST/5％奶粉封闭平板上剩余的结合位点。平板在室温下温育1 小时， 然后用 PBST 洗涤 2 次。以在 PBST/5％奶粉中稀释的 2.5μg/ml 的终浓度加入 C3b。 平板在室温下温育 1 小时， 然后用 PBST 洗涤 3 次。制备 Fabs 的系列稀释， 然后加入到封闭 的平板中。平板在室温下温育 1-2 小时， 然后用 PBST 洗涤 3 次。
     对于 Fabs 的检测， 加入抗 HIS AP- 缀合的抗体 (Invitrogen， 46-0284)， 平板在室 温下温育 1 小时， 然后用 PBST 洗涤 5 次。根据制造商的说明书使用荧光底物 AttoPhos。在 Tecan GENios Pro 平板读数器上测定荧光。
     分别在图 9 和 10 中显示了来自这些实验的 C3d 和 C5 的结果。如所示， C3b 抗体 不结合 C3d 或 C5。
     C3b 抗体等同地识别 iC3b 和 C3c
     为了测定此处所述的抗 C3b 抗体是否可以结合补体途径组分 iC3b 和 C3c， 进行 以下步骤 ： 直接向 Coat Maxisorp 平板 Nunc(442404) 以每孔 100μl 加入碳酸盐缓冲液中 的 2μg/ml iC3b( 补体技术 A115)、 C3d( 补体技术 A117) 或 C3c( 补体技术 A116)。密封 平板并在 4℃下温育过夜。抽吸平板并用 PBS/0.5％ Tween 20 洗涤 3 次。以稀释剂 (PBS， 4％ BSA Fraction V(Fisher ICN16006980)， 0.1％ Tween 20(Sigma P1379)， 0.1％ Triton X-100(Sigma P234729)) 封闭平板， 并在室温下温育 2 小时或在 4℃下温育过夜。然后用 PBS/0.5％ Tween 20 洗涤平板 1 次。以 100nM 稀释 Fabs， 随后在稀释液中稀释 ( 或如果需 要， 更高浓度 )， 并在每孔中接种 100μl。在室温下温育 1 小时。用 PBS/0.5％ Tween 20 洗涤平板 3 次。在稀释液中加入 100μl/ 孔的 1 ∶ 400 的抗组氨酸 HRP 单克隆检测抗体， 并在室温下温育 1 小时。然后用 PBS/0.5％ Tween 20 洗涤 4 次。加入 100μl 的 TMB 底物 (Pierce 34028)， 并在室温下温育高达 5 分钟。 向各孔中加入 50μl 的终止溶液 (2N 硫酸 )， 并在 450nm 处读取平板， 并在 570nm 处校正塑料平板读数。
     如图 11 中所示， C3b 抗体与 iC3b 和 C3c 交叉反应。
     物种交叉反应性
     为了测定除了人和猕猴， 此处所述的抗 C3b 抗体是否结合来自其它物种的 C3b， 如 上文所述进行溶血测定。用于各物种的血清浓度如下 ： 10％大鼠血清 ； 20％兔血清 ； 10％猪 血清 ； 20％小鼠血清 ； 10％豚鼠血清 ； 和 10％狗血清。如图 12 中所示， C3b 抗体能够与几种 物种交叉反应， 所述物种包括大鼠、 兔、 猪、 小鼠和豚鼠。
     Fab 形式的 C3bneo 结合子
     除了上文描述的全长 IgG 形式的抗 C3b 抗体， 相同的可变域用于构建 Fab 形式的 抗原结合片段。评估抗 C3b Fabs， 以根据上文描述的方法测定其结合特征。表 11 概述了亚 组 Fabs 的补体因子结合的结合亲和力、 功能潜能和抑制。
    
    本发明的实施方案 本发明包括， 但不限于以下实施方案 ：1. 分离的抗体或其抗原结合片段， 其特异性结合人或猕猴补体 C3b 蛋白， 其中所 述抗体以低于或等于 100pM 的 KD 结合人 C3b。
     2. 前述段落中的分离的抗体或其抗原结合片段， 其中所述抗体或其抗原结合片段 也以低于或等于 250pM 的 KD 结合猕猴 C3b。
     3. 任何前述段落中的分离的抗体或其抗原结合片段， 其中所述抗体或其抗原结合 片段以低于或等于 10pM 的 KD 结合人 C3b。
     4. 任何前述段落中的分离的抗体或其抗原结合片段， 其中所述抗体或其抗原结合 片段以低于或等于 2pM 的 KD 结合人 C3b。
     5. 任何前述段落中的分离的抗体， 其中所述抗体如通过体外溶血测定法所测定以 低于或等于 65nM 的 IC50 抑制人补体旁路。
     6. 任何前述段落中的分离的抗体， 其中所述抗体如通过体外 C3b 沉积所测定以低 于或等于 50nM 的 IC50 抑制人补体旁路。
     7. 任何前述段落中的分离的抗体， 其中所述抗体如通过补体膜攻击复合体的沉积 所测定以低于或等于 5nM 的 IC50 抑制人补体旁路。
     8. 任何前述段落中的分离的抗体， 其中所述抗体如通过产生 C3a 和 C5a 所测定以 低于或等于 100nM 的 IC50 抑制补体旁路。
     9. 任何前述段落中的分离的抗体或其抗原结合片段， 其中所述抗体或其抗原结合 片段特异性结合人或猕猴的补体 C3b 蛋白， 并与表 1 中描述的抗体交叉竞争。
     10. 任何前述段落中的分离的抗体， 其中所述抗体是单克隆抗体。
     11. 任何前述段落中的分离的抗体， 其中所述抗体是人或人源化抗体。
     12. 任何前述段落中的分离的抗体， 其中所述抗体是嵌合抗体。
     13. 任何前述段落中的分离的抗体， 其中所述抗体是单链抗体。
     14. 任何前述段落中的分离的抗体， 其中所述抗体是 Fab 片段或 ScFv 片段。
     15. 任何前述段落中的分离的抗体， 其中所述抗体是 IgG 同种型。
     16. 任何前述段落中的分离的抗体， 其中所述抗体包括这样的构架， 其中氨基酸已 经替换到来自各人 VH 或 VL 种系序列的抗体构架。
     17. 任何前述段落中的分离的抗体， 其中所述抗体以比所述抗体结合 C3 的亲和力 高至少 1000 倍的亲和力结合 C3b。
     18. 任何前述段落中的分离的抗体或其抗原结合片段， 其中所述抗体或其抗原结 合片段包含选自 SEQ ID NOs ： 1、 15、 29、 43、 57、 71、 85、 99、 113、 127、 141、 155、 169 和 183 的重 链 CDR1 ； 选自 SEQ ID NOs ： 2、 16、 30、 44、 58、 72、 86、 100、 114、 128、 142、 156、 170 和 184 的重 链 CDR2 ； 和选自 SEQ ID NOs ： 3、 17、 31、 45、 59、 73、 87、 101、 115、 129、 143、 157、 171 和 185 的 重链 CDR3， 其中所述分离的抗体或其抗原结合片段结合补体蛋白 C3b。
     19. 任何前述段落中的分离的抗体或其抗原结合片段， 其中所述抗体或其抗原结 合片段包含选自 SEQ ID NOs ： 4、 18、 32、 46、 60、 74、 88、 102、 116、 130、 144、 158、 172 和 186 的 轻链 CDR1 ； 选自 SEQ ID NOs ： 5、 19、 33、 47、 61、 75、 89、 103、 117、 131、 145、 159、 173 和 187 的 轻链 CDR2 ； 和选自 SEQ ID NOs ： 6、 20、 34、 48、 62、 76、 90、 104、 118、 132、 146、 160、 174 和 188 的轻链 CDR3， 其中所述分离的单克隆抗体或其抗原结合片段结合补体蛋白 C3b。
     20. 任何前述段落中的分离的抗体或其抗原结合片段， 其中所述单克隆抗体还包含选自 SEQ ID NOs ： 4、 18、 32、 46、 60、 74、 88、 102、 116、 130、 144、 158、 172 和 186 的轻链 CDR1 ； 选自 SEQ ID NOs ： 5、 19、 33、 47、 61、 75、 89、 103、 117、 131、 145、 159、 173 和 187 的轻链 CDR2 ； 和 选自 SEQ ID NOs ： 6、 20、 34、 48、 62、 76、 90、 104、 118、 132、 146、 160、 174 和 188 的轻链 CDR3。
     21. 任何前述段落中的分离的抗体或其抗原结合片段， 其中所述抗体或抗原结合 片段包含选自 SEQ ID NOs ： 7、 21、 35、 49、 63、 77、 91、 105、 119、 133、 147、 161、 175 和 189 的重 链可变域序列， 还包括选自 SEQ IDNOs ： 8、 22、 36、 50、 64、 78、 92、 106、 120、 134、 148、 162、 176 和 190 的轻链可变域序列， 其中所述分离的抗体或其抗原结合片段结合补体蛋白 C3b。
     22. 任何前述段落中的分离的抗体或其抗原结合片段， 其中所述抗体或其抗原结 合片段包含与选自 SEQ ID NOs ： 7、 21、 35、 49、 63、 77、 91、 105、 119、 133、 147、 161、 175 和 189 的序列具有至少 95％序列同一性的重链可变域， 其中所述抗体结合 C3b。
     23. 任何前述段落中的分离的抗体或其抗原结合片段， 其中所述抗体或其抗原结 合片段包含与选自 SEQ ID NOs 8、 22、 36、 50、 64、 78、 92、 106、 120、 134、 148、 162、 176 和 190 的序列具有至少 95％序列同一性的轻链可变域， 其中所述抗体结合 C3b。
     24. 任何前述段落中的抗体或其抗原结合片段， 其中所述抗体或其抗原结合片段 还包含与选自 SEQ ID NOs 8、 22、 36、 50、 64、 78、 92、 106、 120、 134、 148、 162、 176 和 190 的序 列具有至少 95％序列同一性的轻链可变域。
     25. 任何前述段落中的分离的抗体或其抗原结合片段， 其中所述抗体或其抗原结 合片段包含选自 SEQ ID NOs 9、 23、 37、 51、 65、 79、 93、 107、 121、 135、 149、 163、 177 和 191 的 序列具有至少 95％序列同一性的重链， 其中所述抗体结合 C3b。
     26. 任何前述段落中的分离的抗体或其抗原结合片段， 其中所述抗体或其抗原结 合片段包含与选自 SEQ ID NOs 10、 24、 38、 52、 66、 80、 94、 108、 122、 136、 150、 164、 178 和 192 的序列具有至少 95％序列同一性的轻链， 其中所述抗体结合 C3b。
     27. 任何前述段落中的分离的抗体或其抗原结合片段， 其还包含与选自 SEQ ID NOs 10、 24、 38、 52、 66、 80、 94、 108、 122、 136、 150、 164、 178 和 192 的序列具有至少 95％序列 同一性的轻链。
     28. 药物组合物， 其包含任何前述段落的抗体或其抗原结合片段和药学上可接受 的载体。
     29. 分离的核酸， 其包含编码这样的多肽的序列， 所述多肽包含与选自 SEQ ID NOs ： 7、 21、 35、 49、 63、 77、 91、 105、 119、 133、 147、 161、 175 和 189 的序列具有至少 95％序列同 一性的重链可变域。
     30. 分离的核酸， 其包含编码这样的多肽的序列， 所述多肽包含与选自 SEQ ID NOs 8、 22、 36、 50、 64、 78、 92、 106、 120、 134、 148、 162、 176 和 190 的序列具有至少 95％序列同一性 的轻链可变域。
     31. 载体， 其包括前述段落的核酸。
     32. 分离的宿主细胞， 其包含编码任何前述段落的抗体或其抗原结合片段的重链 的重组 DNA 序列， 和编码任何前述段落的抗体或其抗原结合片段的轻链的第二条重组 DNA 序列， 其中所述 DNA 序列有效连接启动子， 并能够在宿主细胞中表达。
     33. 前述段落的分离的宿主细胞， 其中所述抗体是人单克隆抗体。
     34. 先前两段中的分离的宿主细胞， 其中所述宿主细胞是非人哺乳动物细胞。35. 治疗年龄相关性黄斑变性的方法， 其包括向需要治疗的受试者施用有效量的 包含前述段落的抗体或其抗原结合片段的组合物。
     36. 前述段落的方法， 其中所述受试者是人。
     37. 在受试者中抑制补体旁路的方法， 其包括向需要抑制的受试者施用有效量的 包含前述段落的抗体或其抗原结合片段的组合物。
     38. 前述段落的方法， 其中所述受试者是人。
     此处引用的所有专利、 专利申请和出版的参考文献以其整体引入作为参考。尽管 参考本发明的优选实施方案特别显示并描述了本发明， 但本领域技术人员应该理解的是， 其中可在形式和细节上进行多种改变， 但不背离所附权利要求包括的本发明的范围。127CN 102459334 A
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