治疗慢性肾病的方法相关专利
本申请要求2009年6月8日提交的美国临时专利申请No.61/184937
和2009年8月20日提交的61/235381的优先权；两者全部通过引用的方
式并入本文。
本申请引用了很多专利和出版物。为了更充分地描述本发明所涉及领
域的情况，这些文件的公开内容全部通过引用的方式并入本申请。
技术领域
本发明涉及用于治疗慢性肾病(CKD)的方法，包括用于预防或者延迟
CKD发作的方法和预防CKD的恶化和发展的方法。在特定的实施方案中，
本发明提供用于治疗处于正在发展的CKD风险之中的受试者的方法，该
方法包括向受试者施用组合物，该组合物包含：a)治疗有效量的至少一种抑
制与肾病有关的人类靶基因表达的寡核苷酸化合物；和b)药学上可接受的
赋形剂或载体、或其混合物，从而在受试者中降低CKD风险。
背景技术
慢性肾病
慢性肾病(CKD)是世界范围内的公共健康问题，并被认为是和上升的
心血管疾病和晚期肾疾病(ESRD)的风险有关的普遍病症。
国家肾基金(NKF)肾脏病预后质量指导(K/DOQI)将慢性肾病定义为持
续三个或更多月的肾损坏或下降的肾小球滤过率(GFR)。其他CKD的标志
也是已知的并用于诊断。通常，带有不可逆的硬化和肾单位减少的肾质量
功能丧失导致渐进性GFR下降并最终导致ESRD。
最近，K/DOQI出版了CKD阶段分类的指标，如下所述：
阶段1：GFR正常或降低的肾损坏(＞90mL/min/1.73m2)
阶段2：GFR轻微降低(60-89mL/min/1.73m2)
阶段3：GFR中度降低(30-59mL/min/1.73m2)
阶段4：GFR严重降低(15-29mL/min/1.73m2)
阶段5：肾衰竭(GFR＜15mL/min/1.73m2或透析)
在CKD阶段1和2，GFR不能单独确定诊断。还依赖其他肾损坏的
指标，包括在血液或尿液组成成分中的异常或在影像测试中的异常。
CKD病理生理学
每个肾脏有大约1百万肾单位，每个单位都对总GFR有贡献。不考虑
肾脏损伤病原学，利用剩余健康肾单位的超滤和代偿性肥大，处于渐进性
肾单位功能丧失的肾能够维持GFR。当肾储备耗尽时，这种肾单位适应性
为继续正常的血浆溶质清除留出了余地，因此仅在总GFR降低到50％后
才开始出现尿素和肌酸酐在血浆中的水平显著上升。当GFR下降50％时，
血浆肌酸酐值将翻倍。因此，病人体内的血浆肌酸酐从基准值0.6mg/dL翻
倍到1.2mg/dL意味着损失了50％的有功能的肾单位量。
虽然对所述的原因有益处，但是剩余肾单位超滤和肥大是引起渐进性
肾功能障碍的主要原因。这种情况发生的原因在于上升的肾小球毛细血管
压力，其能破坏毛细血管并最初导致病灶和部分肾小球硬化症，并最终导
致肾小球硬化症。这个假设是基于对5/6肾切除大鼠的研究，这些大鼠中
发展处的病变类似于在人类中观察到的CKD。
引起慢性肾病最普遍的原因是糖尿病和高血压。其他因素包括来自肾
毒素(包含放射性对比剂)的急性损害或灌注降低(局部贫血)；败血症；
蛋白尿；带有间质损伤的肾脏氨生成上升；高血脂；有磷酸钙累积的高磷
血症；氧化亚氮和烟气水平降低。
在美国，这对健康体系来说是花费高、预后差的CKD的发病率和流
行率都在上升。肾病是美国的第九致死原因。高死亡率导致联邦公共卫生
署署长为美国公民要求健康国民2010计划为CKD保留一定的章节。这些
章节的目的在于阐明目标并提供降低美国慢性肾病发病率、疾病率、死亡
率和医疗成本的战略。多项指标可以评估慢性肾病的负担，所有指标都强
调需要改善临床检查、治疗和监护和经济效益。降低肾衰竭将需要更多的
公共卫生努力，包括有效地预防策略和慢性肾病的早期检查和治疗。
自从1989年以来，国际间晚期肾病的发病率(ESRD)也在稳步增长。
美国的ESRD发病率最高，其次是日本。日本有最高的每百万人口流行率，
其次是美国。
和血液透析有关的死亡率是惊人的，并且说明进入血液透析阶段的病
人的生命预期明显缩短。在同一个年龄层，当与非透析的病人和没有肾病
的个体相比，做透析的ESRD病人的死亡率显著升高。在60岁，健康人
预期再活20年，然而60岁开始做血液透析的病人只能期望4年。(Aurora
and Verelli，May 21，2009.Chronic Renal Failure：Treatment & Medication.
Emedicine.http://emedicine.medscape.com/article/239798-治疗).
转让给本发明的受让人之一的国际专利公开No.WO 2006/035434、
WO 2008/104978、WO 2008/106102和WO 2009/001359涉及治疗急性肾
病(包括心脏手术后的急性肾衰竭)的方法。
用于治疗CKD和减弱CKD发展的方法和组合物应该具有很好的治疗
价值。
发明概述
根据一个方面，本发明提供在受试者中治疗或预防肾损坏的方法，该
受试者处于和暴露于肾脏损害复发有关的慢性肾病CKD的风险之中，该
方法包括向受试者施用治疗有效剂量的抑制和肾损害有关的靶基因的化
合物，其中在肾脏损害的24小时之内将寡核苷酸化合物施用于受试者。
在一些实施方案中，该化合物是寡核苷酸化合物。在一些实施方案中，寡
核苷酸化合物抑制靶基因的表达。
根据另一个方面，本发明提供了在受试者中减弱慢性肾病(CKD)发展
的方法，该受试者处于由暴露于肾脏损害复发而导致的CKD发展的风险
之中，该方法包括向受试者施用治疗有效剂量的寡核苷酸化合物(其下调
与肾损伤有关的靶基因的表达)，其中在每次肾脏损害24小时之内，将寡
核苷酸化合物施用于受试者。在一些实施方案中，肾损害导致急包括急性
肾损伤(AKI)的性肾脏损害。
在各种实施方案中，处于慢性肾病(CKD)或CKD发展风险的受试者，
该受试者患有一种或多种I型或II型糖尿病、高血压(hypertension)、高胆
固醇、心脏病、肝病、淀粉状蛋白病、镰状细胞病、系统性红斑狼疮、肾
小球肾炎、多囊性肾病、动脉粥样硬化、血管疾病(例如动脉炎、血管炎、
或纤维发育异常)，或该受试者即将接受放射照相检查(即放射性对比剂的
施用)，或该受试者使用肾毒药物，包括但不仅限于，镇痛剂例如醋氨酚
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和非-类固醇抗炎症药物(NSAID)(例如布洛芬
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)，当长时间有规律地服用时这些药物能引起止痛药肾病
变。
在另一个方面本发明涉及减弱肾损坏(由在患有慢性肾病(CKD)的受
试者中的肾脏损害而导致)严重性的方法，该方法包括向受试者施用治疗
有效剂量的寡核苷酸化合物(其抑制与肾局部贫血有关的靶基因表达)，
从而减弱肾损坏。在一些实施方案中肾损坏是AKI。
在其它的实施方案中，提供了预防由在患有CKD的受试者中的急性
肾损伤或损害导致的CKD发展的方法，该方法包括向受试者施用治疗有
效剂量的寡核苷酸化合物(其抑制与肾局部贫血有关的靶基因表达)，从
而预防CKD发展。
在一些本发明方法的实施方案中，肾脏损害选自手术(包括心血管手
术)、暴露于放射性对比剂、肌红蛋白尿、局部贫血/再灌注性损伤、尿路
梗阻接触肾毒素，该毒素包括含放射性对比剂的对比试剂；灌注降低；蛋
白尿；带有间质损伤的肾脏氨生成上升；高血脂；有磷酸钙累积的高磷血
症。在一些实施方案中，肾脏损害选自局部贫血/再灌注、败血症和暴露于
放射性对比剂。
在某些实施方案中，在心血管手术或心肺手术期间或之后发生局部贫
血/再灌注性损伤。肌红蛋白尿由作为导致直接近端小管细胞(PTC)损伤和
肾脏血管收缩内源肾毒素肌红蛋白导致。复发或多种肾脏损害是指2、3、
4、5或更多同一种或多种肾脏损害。
在一些实施方案中将寡核苷酸施用于受试者在72小时之内(即之前、
同时地或之后)，在48小时之内、在24小时之内、在16小时之内、在8
小时之内、在肾脏损害4小时之内、之前或之后，优选地和在约肾脏损害
72小时之前到约肾脏损害后8小时之间。在一些实施方案中，在肾脏损害
后0到4小时，施用寡核苷酸。在一些实施方案中，在肾脏损害前后将寡
核苷酸施用于受试者。前后是指肾脏损害1小时之内、在50、45、40、35、
30、25、20、15、10、5、4、3、2分钟之内或肾脏损害后1分钟。
在各种实施方案中寡核苷酸化合物选自包含下列物质的组未修饰的
或化学修饰的siRNA、shRNA、适体、反义分子、miRNA和核酶。在最优
选的实施方案中，抑制剂化学修饰的siRNA。
在一些实施方案中，靶基因是人类基因，其表达在肾脏损害后被调高。
一些实施方案中，与肾损伤、肾损坏、肾局部贫血有关的靶基因选自具有
在下面表1中阐述的mRNA序列的基因。靶基因非限制性示例包含p53、
肿瘤蛋白p53结合蛋白2(TP53BP2)；富含亮氨酸重复基因和含(LRDD)的
死亡结构域；细胞色素b-245、α多肽(CYBA、p22phox)；活化转录因子
3(ATF3)；半胱天冬酶2、细胞凋亡-相关的半胱氨酸肽酶(CASP2)；NADPH
氧化酶3(NOX3)；harakiri、BCL2相互作用蛋白(HRK、BID3)；补体成分
1、q亚成分结合蛋白(C1QBP)；BCL2/腺病毒E1B 19kDa相互作用蛋白
3(BNIP3)；分裂素激活蛋白激酶8(MAPK8、JNK1)；分裂素激活蛋白激酶
14(MAPK14、p38)；ras-相关的C3肉毒杆菌毒素底物1(rho族、小GTP结
合蛋白RAC1)；糖原合成酶激酶3β(GSK3B)；嘌呤能受体P2X、配体门控
离子通道、7(P2RX7)；瞬时感受器电位通道、亚族M、成员2(TRPM2)；
聚(ADP-核糖)多糖水解酶(PARG)；CD38分子(CD38)；STEAP族成员
4(STEAP4)；骨形成蛋白2(BMP2)；间隙连接蛋白、α1、
43kDa(connexin43，GJA1)；TYRO蛋白酪氨酸激酶结合蛋白(TYROBP)；结
缔组织生长因子(CTGF)；分泌磷蛋白1(骨桥蛋白、SPP1)；ras同源基因族、
成员A(RHOA)；双氧化酶1(DUOX1)、NOX1、NOX2(gp91phox、CYBB)、
NOX4、NOX5、DUOX2和相关的蛋白、NOXO1、NOXO2(p47phox、NCF1)
NOXA1、NOXA2(p67phox、NCF2)和p40phox(NCF4)、ASPP1、CTDS、
CAPNS1、REDD1、REDD2、HTRA2、KEAP1、SHC1、ZNHIT1、LGALS3、
HI95、TGFb-1、ACE、MCP-1、CDK、MIF、ECE-1、ET-1、TSA、Smad2、
Smad3、ALK5、STAT3、PTGDS、TLR2。在一些实施方案中靶基因选自
p53核CASP2。不受理论束缚，任何一种或多种上述的基因可因肾脏损害
而被上调，并且在肾脏中抑制一种或多种这些基因的上调可以保护肾脏细
胞免受损坏(包括局部缺血损伤)。
在另一个方面，本发明提供了预防在受试者中慢性肾病(CKD)发展的
方法，该受试者处于正在发展的由暴露于多种肾脏损害而导致的CKD的
风险之中，该方法包括向受试者施用治疗有效剂量的寡核苷酸化合物(其
抑制和肾局部贫血有关的基因地表达)，其中在肾脏损害16小时之内将寡
核苷酸化合物施用于受试者。
在又一个方面，本发明提供了预防在受试者中发生慢性肾病(CKD)
的方法，该受试者可以处于正在发展的由暴露于多种肾脏损害而导致的
CKD的风险之中(或受试者倾向于这种CKD)，该方法包括向受试者施用
治疗有效剂量的寡核苷酸化合物(其抑制和肾局部贫血有关的基因地表
达)，其中在肾脏损害16小时之内将寡核苷酸化合物施用于受试者。方法
包括用于局部或系统递送的持续的递送和可控的递送，该递送包括siRNA
递送使用例如递送媒介物(包含泵、缓慢的或持续的释放的组合物或含有
siRNA贮存的植入物)。递送媒介物包含自然的和合成的物质或自然的和合
成的物质的联合物。
也提供了用于治疗或预防慢性肾病(CKD)的试剂盒。在一些实施方案
中，本发明提供了用于治疗或预防与暴露于放射性对比剂有关的慢性肾病
(CKD)的试剂盒。在一些实施方案中，试剂盒包含含有治疗有效剂量的寡
核苷酸化合物(抑制和肾损害有关的基因的表达)的组件，该组件的量有
效于预防放射性对比剂导致的肾损坏，且该放射性对比剂的量可以有效完
成一次放射照相检查。在某些实施方案中，包含作为单独个体制剂寡核苷
酸化合物和作为单独个体制剂放射性对比剂。在一些实施方案中，寡核苷
酸化合物和放射性对比剂被合并为一种组合物。在一些实施方案中，寡核
苷酸化合物制剂和放射性对比剂制剂以不同的形式提供(例如一种制剂是
液体而另一种制剂是冻干制剂)。在一些实施方案中，试剂盒进一步包含使
用说明书。
在各种实施方案中，本发明提供了使用双链寡核糖核苷酸化合物的方
法，该化合物能抑制与AKI和CKD发展有关的靶基因的表达。在各种实
施方案中，靶基因是和局部贫血/再灌注性损伤(IRI)有关的基因。在某些优
选的实施方案中，靶基因选自列于如下文阐述的表1的基因。在特定的实
施方案中，双链寡核糖核苷酸化合物是化学修饰的siRNA。
在一些实施方案中，根据以下结构对siRNA化合物进行化学修饰：
5’(N)x-Z 3’(反义链)
3’Z’-(N’)y-z”5’(正义链)
其中每个N和N’是核糖核苷酸，该核糖核苷酸可以是未修饰的或修
饰的，或非常规部分；
其中每一个(N)x和(N’)y是寡核苷酸，在其中每一个连续的N或N’
通过共价键连接于下一个N或N’；
其中Z和Z’可以存在或不存在，但如果存在的话是独立地共价地连接
于它所在链的3’末端的1-5个连续的核苷酸；
其中z”可以存在或不存在，但如果存在的话是共价地连接到(N’)y的5’
末端的封端部分；
x和y各独立地是18到40的整数；
其中(N’)y的序列和(N)x的序列是充分互补的；其中(N)x包含与约18
到约40个连续的核糖核苷酸充分互补的反义序列，这些核糖核苷酸存在
于如表1所示的mRNA中，该表1阐述了任一SEQ ID NO：1-115。
在一些实施方案中，连接每个连续的N或N’的共价键是磷酸二酯键。
在各种实施方案中所有的共价键都是磷酸二酯键。
在各种实施方案中，化合物包含核糖核苷酸，其中x＝y并且每个x和
y是19、20、21、22或23。在一些实施方案中x＝y＝23。在其它的实施方
案中x＝y＝19。
在一些实施方案中化合物是钝末端的，例如其中Z和Z’都不存在。在
可选地实施方案中，化合物包含至少1个3’垂悬，其中至少Z和Z’两者之
一是存在的。Z和Z’可以独立地包含一种或多种共价地连接的已修饰的或
非-修饰的核苷酸，例如反向dT或dA；dT、LNA，镜像核苷酸等等。在一
些实施方案中，每个Z和Z’是独立地选自dT和dTdT。
在一些实施方案中，每个(N)x和(N’)y包含未修饰的核苷酸。
在一些实施方案中，在一种或多种核糖核苷酸的糖残基中，N或N’
包含修饰结构。在其它的实施方案中，化合物包含至少一个在糖残基修饰
的核糖核苷酸。在一些实施方案中，化合物包含糖残基的2’位的修饰结构。
在一些实施方案中，在2’位的修饰结构包含氨基、氟、烷氧基或烷基部分。
在某些实施方案中，2’修饰结构包含甲基氧部分(也通称2’-O-甲基；
2’-O-Me；2’-O-CH3)。在一些实施方案中，在每个(N)x和(N’)y中核糖核苷
酸在修饰的核糖核苷酸和未修饰的核糖核苷酸之间交替，每个已修饰的核
糖核苷酸是被修饰过的，由此在它的糖上具有2’-O-甲基，并且位于(N)x
中间位置的核糖核苷酸是未修饰过的且位于(N’)y中间位置的核糖核苷酸
是已修饰的。在一些实施方案中，优选的化合物是I5，其靶基因是p53。
在一些实施方案中，在反义链和正义链的一条或两条中，siRNA化合
物包含已修饰的交替的核糖核苷酸。在其它的实施方案中，仅在反义链(N)x
中，化合物包含已修饰的交替的核糖核苷酸。在某些实施方案中，反义链
的中间核糖核苷酸是未修饰的；例如核糖核苷酸在19-节链的第10位或在
23-节链的第12位。
在其他的实施方案中，化合物在交替的位置中包含已修饰的核糖核苷
酸，其中每个在(N)x5’和3’末端的N的糖残基是被修饰过的，和每个在
(N’)y5’和3’末端的N’的糖残基是未被修饰过的。在一些实施方案中，(N)x
和(N’)y的3’和5’末端都未被磷酸化。在其它的实施方案中，(N)x和(N’)y
之一或两者的3’末端被磷酸化。
在一些实施方案中，(N)x包含已修饰的和未修饰的核糖核苷酸，每个
已修饰的核糖核苷酸在它的糖上具有2’-O-甲基，其中在(N)x的3’末端的N
是已修饰的核糖核苷酸，(N)x包含至少5个在3’末端起始的交替的已修饰
的核糖核苷酸和至少总共9个已修饰的核糖核苷酸，而且每个剩余的N是
未修饰的核糖核苷酸。在一些实施方案中，(N)x包含在第2、4、6、8、11、
13、15、17和19位的2’O Me修饰的核糖核苷酸。在其它的实施方案中，
(N)x包含在第1、3、5、7、9、11、13、15、17和19位的2’O Me修饰的
核糖核苷酸。
在一些实施方案中，非常规部分选自镜像核苷酸(mirror nucleotide)和
通过2’-5’核苷酸间磷酸键连接到邻近核苷酸的核苷酸。在一些实施方案
中，镜像核苷酸选自L-核糖核苷酸(L-RNA)和L-脱氧核糖核苷酸(L-DNA)。
在一些实施方案中(N’)y包含至少1个非常规部分。
在一个上述结构的实施方案中，化合物在(N’)y的一个或两个末端包
含至少一个镜像核苷酸。在各种实施方案中，化合物包含2个连续的镜像
核苷酸，一个在(N’)y3’倒数第二位且另一个在(N’)y3’末端。在一个优选的
实施方案中，x＝y＝19而且在(N’)y第18位包含L-DNA。
在一些实施方案中，x＝y＝19和(N’)y，包含在第1-17和19位的未修饰
的核糖核苷酸和1个在3’倒数第二位(第18位)的L-DNA。在其它的实施
方案中，x＝y＝19并且(N’)y包含在第1-16和19位的未修饰的核糖核苷酸
和2个在3’倒数第二位的连续的L-DNA(第17和18位)。
在另外一个上述结构的实施方案中，(N’)y进一步包含一种或多种核
苷酸(在1个或2个末端含有内-糖桥联)。
附图简述
图1提供了在ESRD发展过程中的建议的AKI和CKD之间互相加强
的恶性循环(来自：B.Molitoris(2008)“Contrast nephropathy：are short-term
outcome measures adequate for quantification of long-term renal risk”，Nat
Clin Pract Nephrol.20084：594-5.)。
图2提供了如下文实施例2所描述的研究设计大纲。
图3显示了在反复性局部缺血损伤之后，p53 siRNA在肾功能上的作
用。
图4显示了siP53保护GFR和减少蛋白尿。
图5在5个月的局部缺血损伤的循环之后，siP53(12mg/kg)在组织学
上的作用。
图6提供了为了通过肾切除术和以双月间隔诱导多发性AKI建立
CKD模型的研究设计。通过使大鼠暴露于全肾切除术和多发性AKI(7-8月
期间3-4次)诱导CKD，并用高盐(Na，钠)食物喂养。
图7显示了以高或低Na食物喂养7-8月后，处理前的肾功能参数。
血清肌酸酐、GFR和尿液蛋白在仅用QM5 siRNA或载体处理的大鼠中是
相似的。高Na食物导致更快速的CKD发展，GFR(而非蛋白尿)下降。
图8显示了在CKD诱导的动物中。QM5(siP53)用于预防AKI的效果。
图9A-9H显示了在CKD研究(如图6概括的和如实施例2.2所述)
最结束时的组织病理学评估。图9A-9C涉及急性损伤参数：肾小管坏死
(9A)、肾小管膨胀(9B)和管型(9C)。图9D-9H涉及慢性损伤参数：肾小球
损坏(9D)，间质细胞渗透(9E)；间质纤维化(9F)肾小管萎缩或膨胀(9G)和血
管病(9H)。
图10显示了在结束时的组织病理学评估结果，并记录了在处理过和
未处理过的组中的平均急性和慢性损伤评分。
发明详述
本发明基本上涉及在受试者中减弱慢性肾病发展或预防CKD发展恶
化，该受试者处于其风险之中。该方法通常使用能调低急性肾损伤和特别
是局部缺血再灌注性损伤有关的各种靶基因的表达的化合物。该方法使用
化学修饰的小干扰RNA寡核苷酸(siRNA)，其具有结构和修饰结构，当与
未修饰的化合物做比较时，修饰结构能提高活性、提高稳定性和或减少毒
性、降低靶向作用或降低先天免疫应答。
下面的表1为靶基因非限制性示例，用NCBI登陆码标记了基因识别
号(gi)。该表为相应地mRNA，阐述了各个mRNA序列、gi号(基因识别号)
和序列识别号(SEQ ID NO)。
表1：非限制性靶基因列表
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定义
为了方便起见，本文描述了某些使用于说明书、实施例和权利要求中
的术语。
应该注意，除非有特别清楚的说明，如本文所用单数形式“a”、“an”和
“the”包括复数形式。
当本发明的各方面或实施方案就马库什组或其它替换物组描述时，本
领域熟练的技术人员应该意识到本发明也是由此描述该组任一种体成员
或成员分组。
“抑制剂”是化合物，其使基因的表达或该基因产物的活性降低(部分地
或全部地)或调低到足够的程度，以达到所需的生物或生理效应。术语″抑
制剂″如本文所用是指一种或多种寡核苷酸抑制剂，其包含siRNA、shRNA、
合成shRNA；miRNA、反义RNA和DNA和核酶。
“siRNA抑制剂”是化合物，其使基因的表达或该基因产物的活性降低
(部分地或全部地)或调低到足够的程度，以达到所需的生物或生理效应。
如本文所用，术语″siRNA抑制剂″是指一种或多种siRNA、shRNA、合成
shRNA；miRNA。抑制也可以指下调或RNAi沉默。
如本文所用，术语″抑制″或“下调”是指，使基因的表达或该基因产物
的活性降低到足够的程度以达到所需的生物或生理效应。抑制或调低可以
是完全的或部分的。
如本文所用，术语靶基因的“抑制”或“下调”，是指降低基因的表达(转
录或翻译)或基因的多肽活性，该基因选自由任一SEQ ID NO：1-115或
SNP(单核苷酸多态性)或其另外的变异体组成的组。靶基因的mRNA gi号
如表1所阐述。靶mRNA序列的多核苷酸序列是指本文所阐述的mRNA
序列，或任一其同源序列，该序列与任一本文所述的mRNA优选地具有至
少70％一致性、更优选地80％一致性、还更优选地90％或95％一致性。因
此，本发明包含多核苷酸，其已暴露于如本文所述的突变、改变或修饰。
术语“mRNA多核苷酸序列”和“mRNA”可交换地使用。
如本文所用，可交换地使用的术语“多核苷酸”和“核酸”是指包含脱氧
核糖核酸(DNA)和核糖核酸(RNA)的核苷酸序列。术语也应该被理解为包
括由核苷酸类似物产生的RNA或DNA的等价物、类似物。在本申请始终，
所述mRNA序列代表相应的基因。
“寡核苷酸”或“寡聚物”是指从约2到约50个核苷酸的脱氧核糖核苷酸
或核糖核苷酸序列。每种DNA或RNA核苷酸可以是独立地天然的或合成
的，和或已修饰的或未修饰的。修饰包括发生在糖部分、碱基部分和/或在
寡核苷酸中的核苷酸间的连接上的改变。本发明的化合物包括分子，其含
有脱氧核糖核苷酸、核糖核苷酸、已修饰的脱氧核糖核苷酸、已修饰的核
糖核苷酸及其联合物。
“核苷酸”是指包含脱氧核糖核苷酸和核糖核苷酸，可以是天然的或合
成的，和/或已修饰的或未修饰的。修饰包括发生在糖部分、碱基部分和/
或在寡核苷酸中的核苷酸间的连接上的改变。如本文所用，术语“核糖核苷
酸”包含自然的和合成的、未修饰的和已修饰的核糖核苷酸。修饰包括发生
在糖部分、碱基部分和/或在寡核苷酸中的核苷酸间的连接上的改变。
核苷酸/寡核苷酸的类似物或修饰优选地用于本发明，所提供的所述类
似物或修饰不会显著地不利地影响核苷酸/寡核苷酸的功能。在一些实施方
案中，化学修饰导致提高活性或稳定性或降低脱-靶向作用、或诱导先天免
疫应答。可接受的修饰包括糖部分修饰、碱基部分修饰、在核苷酸间键合
和其联合物中的修饰。
核苷酸可选自自然地存在的或合成修饰的碱基。自然地存在的碱基包
含腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶、胸腺嘧啶和尿嘧啶。已修饰的核苷酸碱基包
含肌苷、黄嘌呤、次黄嘌呤、2-氨基腺嘌呤、6-甲基、2-丙基和其它烷基
腺嘌呤、5-卤基尿嘧啶、5-卤基胞嘧啶、6-氮杂胞嘧啶和6-氮杂胸腺嘧啶、
伪尿嘧啶、4-硫代尿嘧啶、8-卤基腺嘌呤、8-氨基腺嘌呤、8-硫醇腺嘌呤、
8-硫醇烷基腺嘌呤、8-羟基腺嘌呤和其它8-取代的腺嘌呤、8-卤基鸟嘌呤、
8-氨基鸟嘌呤、8-硫醇鸟嘌呤、8-硫代烷基鸟嘌呤、8-羟基鸟嘌呤和其它取
代的鸟嘌呤、其它氮杂和去氮腺嘌呤、其它氮杂和去氮鸟嘌呤、5-三氟甲
基尿嘧啶和5-三氟胞嘧啶。
另外，可以制备包含核苷酸类似物的化合物，其中一种或多种核苷酸
的结构被根本地改变并且更适合作为治疗或实验试剂。核苷酸类似物的一
个示例是缩氨酸核酸(PNA)，其中DNA(或RNA)中的脱氧核糖(或核糖)
磷酸基骨架被聚酰胺骨架(和在缩氨酸中所发现的类似)取代。已经发现
PNA类似物能抵抗酶促降解并且扩大存活范围至体内和体外。
对于糖残基的可以的修饰结构是多样的，并且包含2’-O烷基、锁核酸
(LNA)、乙二醇核酸(GNA)、苏糖核酸(TNA)、阿拉伯糖苷、阿卓糖醇(ANA)
和其他，包含吗啉代和环己基的6-元糖。
LNA化合物见诸于国际专利公开No.WO 00/47599、WO 99/14226和
WO 98/39352。包含LNA核苷酸的siRNA化合物的示例见诸于Elmen et al.，
(NAR 2005.33(1)：439-447)和国际专利公开No.WO 2004/083430。
骨架修饰结构，例如乙基(导致二氧磷基-乙基三酯)；丙基(导致二氧磷
基-丙基三酯)；和丁基(导致二氧磷基-丁基三酯)也是可以的。其他骨架修
饰结构包含聚合体骨架、环状骨架、无环骨架、硫代磷酸基-D-核糖骨架、
酰胺基、磷酰基乙酸基衍生物。某些结构包含具有一个或多个2’-5’核苷酸
间键合(桥联或骨架)的siRNA化合物。
由本发明分子表示的其他修饰结构包含核苷修饰结构，例如人工核
酸、缩氨酸核酸(PNA)、吗啉代和锁核酸(LNA)、乙二醇核酸(GNA)、苏糖
核酸(TNA)、阿拉伯糖苷和镜像核苷(例如β-L-脱氧核苷而不是β-D-脱氧核
苷)。进一步说，所述分子可以还在糖部分包含修饰结构，例如2’-烷基、2’-
氟、2’-脱氧-2’-氟、2’O-烯丙基、2’-胺和2’-烷氧基。其他糖修饰结构如本
文所述。
另外，本发明抑制性核酸分子可包含一种或多种缝隙和/或一种或多种
缺口和/或一种或多种错配。不希望受理论束缚，缝隙、缺口和错配有利于
核酸/siRNA部分去稳定化，因此内源细胞结构，例如DICER、DROSHA
或RISC可以更容易地将它加工成抑制性成分。
就本发明来说，在核酸中的缝隙是指在一条链中缺乏一个或多个内在
核苷酸，同时在核酸中的缺口是指在一条链中缺乏在邻近的核苷酸之间的
核苷酸间键合。任一本发明的分子可含有一种或多种缝隙和/或一种或多种
缺口。
siRNA和RNA干扰
RNA干扰(RNAi)涉及双链(ds)RNA-依赖基因的特定后转录沉默现象。
起初，试图研究这一现象并实验地操纵哺乳动物细胞，但是能活性的、非
特异性的抗病毒防御机制(被针对长dsRNA分子的应答所激活)挫败了
这种努力(Gil et al.Apoptosis，2000.5：107-114)。后来发现在哺乳动物细胞
中，21种核苷酸RNA的合成双链能调节基因特异性RNAi，同时不刺激
基因抗病毒防御机制(参见Elbashir et al.Nature 2001，411：494-498 and
Caplen et al.PNAS USA 2001，98：9742-9747)。因此，在试图理解基因功能
的研究中，短双链的小干扰RNA(siRNA)成为很有用的工具。这样的RNA
干扰(RNAi)是指，在哺乳动物中小干扰RNA(siRNA)或微RNA调节的序列
-特异性后转录基因沉默受的过程(Fire et al，Nature 1998.391，806)
(miRNA；Ambros，Nature 2004 431：7006，350-55；和Bartel，Cell.2004。116(2)：
281-97)。在植物中，相应的过程通常是指特异性后转录基因沉默或RNA
沉默，并且优选地不包括真菌。
siRNA是双链RNA分子，其能抑制(部分地或全部地)或下调基因
或者内源的、对应细胞、外源基因(例如病毒核酸)的基因/mRNA的表达。
RNA干扰的机制在下文详述。
很多研究表明siRNA治疗在哺乳动物和人类体内是有效的。Bitko等
人指出，当以鼻内施用的特定siRNA分子在治疗小鼠中是有效的，该siRNA
分子能直接对抗呼吸道合胞病毒(RSV)壳包核酸N基因(Bitko et al.，Nat.
Med.2005，11(1)：50-55)。最近，siRNA被成功地用于灵长类中的抑制
(Tolentino et al.，Retina 2004.24(1)：132-138)。使用siRNA作为疗法的综述，
参见例如Barik(J.Mol.Med.2005.83：764-773)或Dykxhoorn et al(2006.
Gene Ther.13：541-552)。
siRNA结构
对应已知基因的siRNA的选择和合成被广泛地报道；(参见例如Ui-Tei
et al.，J Biomed Biotech.2006；2006：65052；Chalk et al.，BBRC.2004，319(1)：
264-74；Sioud & Leirdal，Met.Mol Biol.；2004，252：457-69；Levenkova et al.，
Bioinform.2004，20(3)：430-2；Ui-Tei et al.，NAR.2004，32(3)：936-48).
例如，已修饰的siRNA的制备和用途参见，例如Braasch et al.，Biochem.
2003，42(26)：7967-75；Chiu et al.，RNA，2003，9(9)：1034-48；PCT公开WO
2004/015107(atugen AG)和WO 02/44321(Tuschl et al)。美国专利No.
5,898,031和6,107,094，教导了化学修饰的寡聚物。美国专利公开
No.2005/0080246和2005/0042647分别地涉及具有改变的基元的寡聚化合
物和具有化学修饰核苷间键合的dsRNA化合物。
其它修饰结构也被公开了。5′-磷酸基部分的修饰显示能提高在果蝇胚
胎中的siRNA活性(Boutla，et al.，Curr.Biol.2001，11：1776-1780)，并且这对
在人类HeLa细胞中的siRNA功能也是需要的(Schwarz et al.，Mol.Cell，
2002，10：537-48).Amarzguioui et al.，(NAR，2003，31(2)：589-95)说明了依
赖2’-O-甲基修饰结构定位siRNA活性。Holen et al(NAR.2003，31(9)：
2401-07)报告了相对天然型，具有少量2’-O-甲基修饰的核苷的siRNA具有
良好的活性，但是随着2’-O-甲基修饰的核苷数量增加活性降低。Chiu和
Rana(RNA.2003，9：1034-48)教导了相对于未修饰的siRNA，在正义或反义
链(全部修饰的链)中引入2’-O-甲基修饰的核苷，将严重降低siRNA活性。
有报告称，在反义链的5’-末端2’-O-甲基基团的取将代严重限制活性，然
而在反义链的3’-末端和在正义链的两个末端的这种取代却是耐受的
(Czauderna et al.，NAR.2003，31(11)：2705-16；WO 2004/015107)。本发明的
分子的优点是非毒性的并且可以作为药物组合物制备，用于治疗多种疾
病。
国际专利公开No.WO 2008/050329(转让给本发明)涉及siRNA化
合物、包含其的组合物和用其治疗与凋亡前基因表达相关的疾病和疾患的
方法，并且将该专利全部地并入本文。US Ser.No.11/655610涉及通过抑
制一般的或p53特定的凋亡前基因，而治疗听觉受损的方法。
寡核苷酸
本发明提供了使用包含双链寡核苷酸(例如siRNA)的寡核苷酸抑制剂
的方法，该抑制剂可以调低所需基因的表达。siRNA是双链寡核糖核苷酸，
其中正义链来源自所需基因的mRNA序列，并且反义链与正义链充分互
补。通常，在不损失siRNA活性的前提下，一些靶向mRNA序列的偏差
是允许的(参见例如Czauderna et al.，NAR.2003，31(11)：2705-2716)。不受
理论束缚，本发明siRNA在以后转录水平抑制基因表达的同时，可以会或
不会破坏mRNA；siRNA可以靶向mRNA以完成特定裂解和降解和/或可
抑制靶向信息的翻译。
在各种实施方案中，siRNA包含含有第一链和第二链的RNA双链，
因此第一链包含核糖核苷酸序列，其至少部分地与靶向核酸(转录自靶基
因的mRNA)的约18到约40个连续的核苷酸互补，并且第二链包含的核
糖核苷酸序列至少部分地与第一链互补，并且其中所述第一链和/或所述第
二链包含一种或多种化学修饰的核糖核苷酸和/或非常规部分。
在一个实施方案中，siRNA化合物包含至少一种在糖部分上包含2’修
饰结构的核糖核苷酸(2’糖修饰结构)。在某些实施方案中，化合物包含2’O-
烷基或2’-氟或2’O-烯丙基或任一其它2’修饰结构，可选地在不同的位置。
其它稳定的修饰结构也是可以的(例如末端修饰结构)。在一些实施方案中，
优选的2’O-烷基是2’O-甲基(甲基氧、2’OMe)糖修饰结构。
在一些实施方案中，寡核苷酸的骨架是被修饰过的，并且包含磷酸基
-D-核糖实体，而且也包含硫代磷酸基-D-核糖实体、三酯、硫代酯、2’-5’
桥联骨架(也可以表示为5’-2’)、PACE等。
如本文所用，术语“非配对核苷酸类似物”是指核苷酸类似物其包含非-
碱基配对部分包括但不限于：6脱氨基腺苷(水粉蕈素)、4-Me-吲哚、3-硝
基吡咯、5-硝基吲哚、Ds、Pa、N3-Me riboU、N3-Me riboT、N3-Me-dC、
N3-Me-dT、N1-Me-dG、N1-Me-dA、N3-乙基-dC、N3-Me-dC。在一些实
施方案中，非-碱基配对核苷酸类似物是核糖核苷酸。在其它的实施方案中
它是脱氧核糖核苷酸。另外，可以制备多核苷酸的类似物，其中一种或多
种核苷酸的结构被根本地改变，并且更适合作为治疗或实验试剂。核苷酸
类似物的一个示例是缩氨酸核酸(PNA)其中DNA(或RNA)中的脱氧核糖
(或核糖)磷酸基骨架被聚酰胺骨架(和在缩氨酸中所发现的类似)取代。
已经发现PNA类似物能抵抗酶促降解并且在体内和体外提高了稳定性。
其它有用的修饰结构包含聚合体骨架、环状骨架、无环骨架、硫代磷酸基
-D-核糖骨架、三酯骨架、硫代脂骨架、2’-5’桥联骨架、人工核酸、吗啉代
核酸、乙二醇核酸(GNA)、苏糖核酸(TNA)、阿拉伯糖苷、和镜像核苷(例
如β-L-脱氧核糖核苷而不是β-D-脱氧核糖核苷)。一种或多种反向核苷酸，
例如反向胸苷或反向腺嘌呤能用来来合成本发明的化合物(参见，例如
Takei，et al.，2002，JBC 277(26)：23800-06)。
其它的修饰结构包含末端修饰结构在寡核苷酸地5’和/或3’部分，而且
也通称封端部分。这样的末端修饰结构选自核苷酸、已修饰的核苷酸、脂
质、缩氨酸、糖和反向脱碱基部分。
在本发明中有时提到的″脱碱基核苷酸″或″脱碱基核苷酸类似物″，更
恰当地说是指伪-核苷酸或非常规部分。核苷酸是核酸单体单元，包含核糖
或脱氧核糖、磷酸基、和碱基(在DNA中的腺嘌呤、鸟嘌呤、胸腺嘧啶、
或胞嘧啶；在RNA中的腺嘌呤、鸟嘌呤、尿嘧啶或胞嘧啶)。已修饰的核
苷酸包含在糖、磷酸基和/或碱基中的一种或多种的修饰结构。脱碱基伪-
核苷酸没有碱基，并且严格地说这样不是核苷酸。
术语“非常规部分”如本文所用是指脱碱基核糖部分、脱碱基脱氧核糖
部分、脱氧核糖核苷酸、已修饰的脱氧核糖核苷酸、镜像核苷酸、非-碱基
配对核苷酸类似物和通过2’-5’核苷酸间磷酸键连接到邻近核苷酸的核苷
酸；桥联核酸(包括LNA和亚乙基桥联核酸)。在一些本发明的实施方案
中，优选的非常规部分是脱碱基核糖部分、脱碱基脱氧核糖部分、脱氧核
糖核苷酸、镜像核苷酸和通过2’-5’核苷酸间磷酸键连接到邻近核苷酸的核
苷酸。
脱碱基脱氧核糖部分包含例如脱碱基脱氧核糖-3’-磷酸基；1，2-双脱氧
-D-呋喃核糖-3-磷酸基；1，4-无水-2-脱氧-D-核糖醇-3-磷酸基。反向脱碱基
脱氧核糖部分包含反向脱碱基脱氧核糖；3’，5’反向脱氧脱碱基5’-磷酸基。
相对于自然地存在的或通常使用的核苷酸，“镜像”核苷酸是有相反手
性的核苷酸，即自然地存在的(D-核苷酸)的镜像(L-核苷酸)，就镜像核糖核
苷酸来说也是指L-RNA，和“镜像异构体”。核苷酸，可以是核糖核苷酸或脱
氧核糖核苷酸，并且可以进一步包含至少1个糖、碱基和/或骨架修饰结构。
参见美国专利No.6,586,238和美国专利No.6,602,858，公布了包含至少一
种L-核苷酸取代的核酸催化剂。镜像核苷酸包含例如L-DNA(L-脱氧核糖
腺苷酸-3’-磷酸基(镜像dA)；L-脱氧核糖胞啶-3’-磷酸基(镜像dC)；L-脱氧
核糖鸟苷-3’-磷酸基(镜像dG)；L-脱氧核糖胸苷-3’-磷酸基(镜像dT))和
L-RNA(L-核糖腺苷酸-3’-磷酸基(镜像rA)；L-核糖胞啶-3’-磷酸基(镜像rC)；
L-核糖鸟苷-3’-磷酸基(镜像rG)；L-核糖尿嘧啶-3’-磷酸基(镜像dU))。术语
“封端部分”如本文所用包含脱碱基核糖部分、脱碱基脱氧核糖部分、包含
2’O烷基修饰结构的脱碱基核糖和脱碱基脱氧核糖部分的修饰结构；反向
脱碱基核糖和脱碱基脱氧核糖部分和其修饰结构；C6-亚氨基-Pi；包含
L-DNA和L-RNA镜像核苷酸；5’O-Me核苷酸；和包含4’，5’-亚甲基核苷
酸的核苷酸类似物；1-(β-D-赤呋喃糖基)核苷酸；4′-硫核苷酸、碳环核苷酸；
5′-氨基-烷基磷酸基；1，3-二氨基酸-2-丙基磷酸基、3-氨丙基磷酸基；6-氨
己基磷酸基；12-氨基十二烷基磷酸基；羟丙基磷酸基；1，5-脱水己糖醇核
苷酸；α-核苷酸；苏-戊糖基核苷酸；无环3′，4′-seco nucleotide；3，4-二羟基
丁基核苷酸；3，5-二羟基戊基核苷酸、′-5′-反向脱碱基部分；1，4-丁二醇磷
酸基；5′-氨基；和桥联的或非桥联的甲基磷酸基和5′-巯基部分。
某些优选的封端部分是脱碱基核糖或脱碱基脱氧核糖部分；反向脱碱
基核糖或脱碱基脱氧核糖部分；C6-氨基-Pi；包含L-DNA和L-RNA镜像
核苷酸。
进一步的末端修饰结构是生物素基团。这样的生物素基团可优选地连
接于第一和/或第二链的最5’端或最3’端之一或者两端的核苷酸。在更优选
的实施方案中，生物素基团链接于多肽或蛋白。本发明的范围包含多肽或
蛋白链接到任一其它上述的末端修饰结构。
根据本发明，如本文公布的各种末端修饰结构优选地位于核酸的核苷
酸的核糖部分。更特定地，如果这样修饰的核苷酸是末端核苷酸，末端修
饰结构可连接于或取代任一核糖部分的OH-基团(包括但不限于2’OH、
3’OH和5’OH)。反向脱碱基或脱碱基是核苷酸，不具有核碱基部分的脱
氧核糖核苷酸或核糖核苷酸(例如参见Sternberger，et al.，(2002).Antisense
nucleic acid drugs Dev，12，131-43)。
已修饰的脱氧核糖核苷酸包含，例如可以用作为在5’末位(第1位)的
核苷酸的5’OMe DNA(5-甲基-脱氧核糖鸟苷-3′-磷酸基)；PACE(脱氧核糖
腺嘌呤3′磷酰基乙酸基、脱氧核糖胞啶3′磷酰基乙酸基、脱氧核糖鸟苷3′
磷酰基乙酸基、脱氧核糖胸苷3′磷酰基乙酸基。
桥联核酸包含LNA(2′-O，4′-C-亚甲基桥联核酸腺苷3′单磷酸基、
2′-O，4′-C-亚甲基桥联核酸5-甲基-胞啶3′单磷酸基、2′-O，4′-C-亚甲基桥联核
酸鸟苷3′单磷酸基、5-甲基-尿苷(或胸苷)3′单磷酸基)；和ENA(2′-O，4′-C-
亚乙基桥联核酸腺苷3′单磷酸基、2′-O，4′-C-亚乙基桥联核酸5-甲基-胞啶
3′单磷酸基、2′-O，4′-C-亚乙基桥联核酸鸟苷3′单磷酸基、5-甲基-尿苷(或胸
苷)3′单磷酸基)。
在某些实施方案中，在所述第一链和靶向核酸之间的互补性是完美
的。在一些实施方案中，链是充分互补的，即在所述第一链和靶向核酸之
间有1、3或最多3个错配。充分互补的是指对另一个序列有超过84％的
互补性。例如在包含19碱基对的双链区域中，1个错配导致94.7％互补性、
2个错配导致约89.5％互补性和3个错配导致约84.2％互补性，这使得双链
区域是充分互补的。相应地显著地一致性是指对另一个序列有超过84％的
互补性。
在一些实施方案中，化合物的第一链和第二链通过环状结构连接，该
结构包含非-核酸聚合体例如尤其地是聚乙二醇。可选地，该环状结构包含
核酸(包含已修饰的和未-修饰的核糖核苷酸以及已修饰的和未-修饰的脱
氧核糖核苷酸)。
在进一步的实施方案中，siRNA第一链的5′-末端连接于第二链的3′-
末端，或第一链的3′-末端连接于第二链的5′-末端，所述连接是通过核酸
接头完成的，该接头通常具有长度在2-100之间的核碱基，优选地约2到
约30个核碱基。
在优选的实施方案中，本发明的方法使用具有改变的核糖核苷酸的寡
核苷酸化合物，其中核糖核苷酸在至少化合物的反义和正义链之一中被修
饰过，对于19节链和23节链寡聚物，在反义链的5’和3’末端的核糖核苷
酸的糖残基是已修饰的，并且在正义链的5’和3’末端的核糖核苷酸的糖残
基是未修饰的。对于21节链寡聚物，在正义链的5’和3’末端的核糖核苷
酸的糖残基是已修饰的，在反义链的5’和3’末端的核糖核苷酸的糖残基是
未修饰的，或在3’末端可以有可选的其他的修饰结构。如上面所提到的，
优选的情况是反义链的中间核苷酸是未被修饰的。
根据一个本发明的优选的实施方案，寡核苷酸/siRNA的反义链和正义
链在3’-末端而不在5’-末端磷酸化。根据另一个优选的本发明的实施方案，
反义链和正义链是非-磷酸化的。根据还另一个优选的本发明的实施方案，
在正义链中的最5′端核糖核苷酸是已修饰的，以消除在体内5′-磷酸化的任
何可以性。
可以制备具有任一本文公开的修饰结构/结构的任一siRNA序列。同
时含有序列和结构的化合物可以用于治疗本文公布的病症。
结构基序
在一些本发明的实施方案中，根据任一在结构(A)-(P)中阐述的修饰结
构或作为串联siRNA或RNAtar，寡核苷酸抑制剂是化学修饰的siRNA。
在一个方面，本发明提供了如结构(A)阐述的化合物：
(A)5’(N)x-Z 3’ (反义链)
3’ Z’-(N’)y 5’(正义链)
其中每个N和N’是核苷酸选自未修饰的核糖核苷酸，已修饰的核糖
核苷酸，未修饰的脱氧核糖核苷酸和已修饰的脱氧核糖核苷酸；
其中每一个(N)x和(N’)y是寡核苷酸，在其中每一个连续的N或N’通
过共价键连接于下一个N或N’；
其中x和y各是18到40的整数；
其中每个Z和Z’可以存在或不存在，但如果存在的话是共价地连接于
它所在链的3’末端的1-5个连续的核苷酸；
其中(N’)y序列是与(N)x充分互补的序列；并且其中(N)x的序列包含与
约18到约40个连续的核糖核苷酸充分互补的反义序列，这些核糖核苷酸
存在于和急性肾损伤有关的靶基因的mRNA中。
在某些实施方案中，本发明提供了具有结构(B)的化合物
(B)5’(N)x-Z 3’(反义链)
3’Z’-(N’)y 5’(正义链)
其中每一个(N)x和(N’)y是寡聚物，在该寡聚物中连续的N或N’是通
过共价键连接于下一个N或N’的未修饰的核糖核苷酸或已修饰的核糖核
苷酸；
其中每个Z和Z’可以存在或不存在，但如果存在的话是共价地连接于
它所在链的3’末端的1-5个连续的核苷酸；
其中每个x和y＝19、21或23，并且(N)x和(N‘)y是完全互补的。
其中交替的核糖核苷酸在每个(N)x和(N’)y中是已修饰的，这导致了在
核糖核苷酸的糖残基上的2’-O-甲基修饰结构；
其中(N’)y序列是与(N)x充分互补的序列；并且其中(N)x的序列包含与
约约18到约40个连续的核糖核苷酸充分互补的反义序列，这些核糖核苷
酸存在于和急性肾损伤有关的靶基因的mRNA中。
在一些实施方案中，在3’和5’末端每个(N)x和(N’)y是独立地磷酸化或
非-磷酸化。
在某些实施方案中，其中每个x和y＝19或23，在(N)x的5’和3’末端
的每个N是已修饰的；而且在(N’)y的5’和3’末端的每个N’是未修饰的。
在某些实施方案中，其中每个x和y＝21，在(N)x的5’和3’末端的每
个N是未修饰的；而且在(N’)y的5’和3’末端的每个N’是已修饰的。
在特定的实施方案中，当x和y＝19时，siRNA是已修饰的，使得2’-O-
甲基(2’-OMe)基团存在于反义链(N)x的第1、第3、第5、第7、第9、第
11、第13、第15、第17和第19位核苷酸，而且由此同样的修饰结构，即
2’-OMe基团，存在于正义链(N’)y的第2、第4、第6、第8、第10、第12、
第14、第16和第18核苷酸。在各种实施方案中，这些特定的siRNA化
合物在两个末端被钝末端化。
在一些实施方案中，本发明提供了具有结构(C)的化合物：
(C)5’(N)x-Z3’反义链
3’Z’-(N’)y 5’正义链
其中每个N和N’是独立地选自未修饰的核糖核苷酸、已修饰的核糖
核苷酸、未修饰的脱氧核糖核苷酸和已修饰的脱氧核糖核苷酸的核苷酸；
其中每一个(N)x和(N’)y是寡聚物，在该寡聚物中通过共价键每一个
连续的核苷酸连接于下一个核苷酸，并且x和y各是18到40的整数；
其中在(N)x中核苷酸是未修饰的或(N)x包含交替的已修饰的核糖核
苷酸和未修饰的核糖核苷酸；每个已修饰的核糖核苷酸是被修饰过的，由
此在它的糖上具有2’-O-甲基并且位于(N)x中间位置的核糖核苷酸是已修
饰的或未修饰的，优选地是未修饰的；
其中(N’)y包含未修饰的核糖核苷酸，并在末端或倒数第二位进一步
包含1个已修饰的核苷酸，其中已修饰的核苷酸选自由下列物质组成的组：
镜像核苷酸、二环核苷酸、2’-糖修饰的核苷酸、阿卓糖醇核苷酸，或通过
核苷酸间键合(选自2’-5’磷酸二酯键、P-烷氧基连接或PACE连接)连接到
邻近核苷酸的核苷酸。
其中如果在(N’)y中不止1个核苷酸是已修饰的，已修饰的核苷酸可
以是连续的；
其中每个Z和Z’可以存在或不存在，但如果存在的话是共价地连接于
任一其所连接的寡聚物的3’末端的1-5个脱氧核糖核苷酸；
其中(N’)y的序列包含与(N)x充分互补的序列；其中(N)x包含与约18
到约40个连续的核糖核苷酸充分互补的反义序列，这些核糖核苷酸存在
于和急性肾损伤有关的靶基因的mRNA中。
在特定的实施方案中，x＝y＝19并且自(N)中每个已修饰的核糖核苷酸
是修饰过的，使得在它的糖上具有2’-O-甲基，而且位于(N)x中间的核糖
核苷酸是未修饰的。相应地，在化合物中，其中x＝19，(N)x包含在第1、
3、5、7、9、11、13、15、17和19位2’-O-甲基糖修饰的核糖核苷酸。在
其它的实施方案中，(N)x包含在第2、4、6、8、11、13、15、17和19位
的2’O Me修饰的核糖核苷酸，并且可以进一步包含至少1个脱碱基或反
向脱碱基非常规部分，例如在第5位。在其它的实施方案中，(N)x包含在
第2、4、8、11、13、15、17和19位的2’O Me修饰的核糖核苷酸，并且
可以进一步包含至少1个脱碱基或反向脱碱基非常规部分，例如在第6位。
在其它的实施方案中，(N)x包含在第2、4、6、8、11、13、17和19位的
2’O Me修饰的核糖核苷酸，并且可以进一步包含至少1个脱碱基或反向
脱碱基非常规部分，例如在第15位。在其它的实施方案中，(N)x包含在
第2、4、6、8、11、13、15、17和19位的2’O Me修饰的核糖核苷酸，
并且可以进一步包含至少1个脱碱基或反向脱碱基非常规部分，例如在第
14位。在其它的实施方案中，(N)x包含在第1、2、3、7、9、11、13、15、
17和19位的2’O Me修饰的核糖核苷酸，并且可以进一步包含至少1个脱
碱基或反向脱碱基非常规部分，例如在第5位。在其它的实施方案中，(N)x
包含在第1、2、3、5、7、9、11、13、15、17和19位的2’O Me修饰的
核糖核苷酸，并且可以进一步包含至少1个脱碱基或反向脱碱基非常规部
分，例如在第6位。在其它的实施方案中，(N)x包含在第1、2、3、5、7、
9、11、13、17和19位的2’O Me修饰的核糖核苷酸，并且可以进一步包
含至少1个脱碱基或反向脱碱基非常规部分，例如在第15位。在其它的
实施方案中，(N)x包含在第1、2、3、5、7、9、11、13、15、17和19位
的2’O Me修饰的核糖核苷酸，并且可以进一步包含至少1个脱碱基或反
向脱碱基非常规部分，例如在第14位。在其它的实施方案中，(N)x包含
在第2、4、6、7、9、11、13、15、17和19位的2’OMe修饰的核糖核苷
酸，并且可以进一步包含至少1个脱碱基或反向脱碱基非常规部分，例如
在第5位。在其它的实施方案中，(N)x包含在第1、2、4、6、7、9、11、
13、15、17和19位的2’OMe修饰的核糖核苷酸，并且可以进一步包含至
少1个脱碱基或反向脱碱基非常规部分，例如在第5位。在其它的实施方
案中，(N)x包含在第2、4、6、8、11、13、14、16、17和19位的2’O Me
修饰的核糖核苷酸，并且可以进一步包含至少1个脱碱基或反向脱碱基非
常规部分，例如在第15位。在其它的实施方案中，(N)x包含在第1、2、3、
5、7、9、11、13、14、16、17和19位的2’OMe修饰的核糖核苷酸，并
且可以进一步包含至少1个脱碱基或反向脱碱基非常规部分，例如在第15
位。在其它的实施方案中，(N)x包含在第2、4、6、8、11、13、15、17
和19位的2’OMe修饰的核糖核苷酸，并且可以进一步包含至少1个脱碱
基或反向脱碱基非常规部分，例如在第7位。在其它的实施方案中，(N)x
包含在第2、4、6、11、13、15、17和19位的2’OMe修饰的核糖核苷酸，
并且可以进一步包含至少1个脱碱基或反向脱碱基非常规部分，例如在第
8位。
在另外其他的实施方案中，相对于任一基因(N)x包含至少1个核苷酸
错配。在某些优选的实施方案中，在第5、6或14位上(N)x包含1个单核
苷酸错配。在一个结构(C)的实施方案中，在(N’)y5’和3’之一或2个的末端，
至少2个核苷酸通过2’-5’磷酸二酯键连接。在某些优选的实施方案中，
x＝y＝19或x＝y＝23；在(N)x中核苷酸在已修饰的核糖核苷酸和未修饰的核
糖核苷酸之间交替，每个已修饰的核糖核苷酸是被修饰过的，由此在它的
糖上具有2’-O-甲基，并且位于(N)x中间的核糖核苷酸是未修饰的；而且
通过2个2’-5’磷酸二酯键在(N’)y3’末端的3个核苷酸连接在一起(如本文
所述的结构I)。在其它优选的实施方案中，x＝y＝19或x＝y＝23；在(N)x中
核苷酸在已修饰的核糖核苷酸和未修饰的核糖核苷酸之间交替，每个已修
饰的核糖核苷酸是被修饰过的，由此在它的糖上具有2’-O-甲基，而且位于
(N)x中间的核糖核苷酸是未修饰的；并且4个在(N’)y5’末端的连续的核苷
酸通过3个2’-5’磷酸二酯键连接起来。在进一步的实施方案中，用2’-O-
甲基修饰另外1个位于(N)y的之间位置的核苷酸的糖部分。在另一个优选
的实施方案中，在(N)x中，核苷酸在2’-O-甲基修饰的核糖核苷酸和未修
饰的核糖核苷酸之间交替，4个在(N’)y5’末端的连续的核苷酸通过3个
2’-5’磷酸二酯键连接起来，而且5’末端核苷酸或者在5’末端的2个或3个
连续的核苷酸包含3’-O-甲基修饰结构。
在某些优选的结构C的实施方案中，x＝y＝19，而且在(N’)y中，核苷
酸至少在一个位置上包含镜像核苷酸、脱氧核糖核苷酸，和通过2’-5’核苷
酸间键与邻近的核苷酸连接的核苷酸；
在某些优选的结构C的实施方案中，x＝y＝19而且(N’)y包含镜像核苷
酸。在各种实施方案中，镜像核苷酸是L-DNA核苷酸。在某些实施方案
中，L-DNA是L-脱氧核糖胞啶。在一些实施方案中，(N’)y在第18位包
含L-DNA。在其它的实施方案中，(N’)y在第17和18位包含L-DNA。在
某些实施方案中，(N’)y包含在第2位以及在第17和18位中的一位或两位
取代的L-DNA。在某些实施方案中，(N’)y进一步包含5’末端封端核苷酸，
例如作为垂悬的5’-O-甲基DNA或脱碱基或反向脱碱基部分。
在另外其他的实施方案中，(N’)y在第15位包含DNA以及在第17和
18位中的一位或两位包含L-DNA。在这种结构中，第2位可以进一步包
含L-DNA或脱碱基非常规部分。
设想的其它结构C的实施方案，其中x＝y＝21或其中x＝y＝23；在这些
实施方案中，如上所述(N’)y的修饰结构是在21节链的第17、18、19、20
位和23节链的第19、20、21、22位上，而不是在第15、16、17、18位；
相似地，在第17和18位中的一位或两位上的修饰结构是在21节链的第
19和20位中的一位或两位上以及在23节链的第21和22位中的一位或两
位上。根据21和23节链，所有的在19节链中的修饰结构做类似的调整。
根据各种结构(C)的实施方案，在(N’)y中，在3末端的2、3、4、5、
6、7、8、9、10、11、12、13或14个连续的核糖核苷酸通过2’-5’核苷酸
间键合连接。在一个优选的实施方案中，4个在(N’)y3’末端的连续的核苷
酸通过3个2’-5’磷酸二酯键连接起来，其中一种或多种形成2’-5’磷酸二
酯键的2’-5’核苷酸进一步包含3’-O-甲基糖修饰结构。优选地，(N’)y的3’
末端核苷酸包含2’-O-甲基糖修饰结构。在某些优选的结构C的实施方案
中，x＝y＝19，并且在(N’)y中，2个或多个在第15、16、17、18和19位的
连续的核苷酸包含通过2’-5’核苷酸间键与邻近的核苷酸连接的核苷酸。在
各种实施方案中，形成2’-5’核苷酸间键的核苷酸包含3’脱氧核糖核苷酸或
3’甲基氧核苷酸。在一些实施方案中，在(N’)y第17和18位的核苷酸通过
2’-5’核苷酸间键连接在一起。在其它的实施方案中，在(N’)y第16、17、
18、16-17、17-18或16-18位的核苷酸通过2’-5’核苷酸间键连接在一起。
在某些实施方案中，(N’)y包含在第2位的L-DNA和在第16-17、17-18
或16-18位的2’-5’核苷酸间键。在某些实施方案中，(N’)y包含在第16-17、
17-18或16-18位的2’-5’核苷酸间键和5’末端封端核苷酸。
根据各种结构(C)的实施方案，在(N’)y中，在每个末端的2、3、4、5、
6、7、8、9、10、11、12、13或14个连续的核苷酸或在每个5’和3’末端
的2-8个已修饰的核苷酸独立地是镜像核苷酸。在一些实施方案中，镜像
核苷酸是L-核糖核苷酸。在其它的实施方案中，镜像核苷酸是L-脱氧核糖
核苷酸。镜像核苷酸可在糖或碱基部分或在核苷酸间键合上，被进一步修
饰的。
在一个优选的结构(C)的实施方案中，3’末端的核苷酸或者在(N’)y的
3’末端的2个或3个连续的核苷酸是L-脱氧核糖核苷酸。
在其它的结构(C)的实施方案中，在(N’)y地末端之一的2、3、4、5、
6、7、8、9、10、11、12、13或14个连续的核糖核苷酸或在每个5’和3’
末端的2-8个已修饰的核苷酸独立地是2’糖修饰的核苷酸。在一些实施方
案中，2’糖修饰结构包含氨基、氟、烷氧基或烷基部分。在某些实施方案
中，2’糖修饰结构包含甲基氧部分(2’-OMe)。在一系列优选的实施方案中，
在(N’)y5’末端的3、4或5个连续的核苷酸包含2’-OMe修饰结构。在另一
个优选的实施方案中，在(N’)y3’末端的3个连续的核苷酸包含2’-O-甲基
修饰结构。
在一些结构(C)的实施方案中，在(N’)y中，在5’和3’末端之一的2、3、
4、5、6、7、8、9、10、11、12、13或14个连续的核糖核苷酸或在每个5’
和3’末端的2-8个已修饰的核苷酸独立地是二环核苷酸。在各种实施方案
中，二环核苷酸是锁核酸(LNA)。2′-O，4′-C-亚乙基-桥联核酸(ENA)是1
种LNA(参见下文)。
在各种实施方案中，(N’)y5’末端或在3’和5’两末端包含已修饰的核
苷酸在。
在一些结构(C)的实施方案中，在(N’)y5’和3’之一或2个末端中的至
少2个核苷酸通过P-乙氧基骨架修饰结构相连。在某些优选的实施方案中，
x＝y＝19或x＝y＝23；在(N)x中核苷酸在已修饰的核糖核苷酸和未修饰的核
糖核苷酸之间交替，每个已修饰的核糖核苷酸是被修饰过的，由此在它的
糖上具有2’-O-甲基，并且位于(N)x中间位置的核糖核苷酸是未修饰的；
而且在(N’)y3’末端或5’末端的4个连续的核苷酸通过3个P-乙氧基骨架修
饰结构连接。在另一个优选的实施方案中，在(N’)y3’末端或5’末端的3个
连续的核苷酸通过2个P-乙氧基骨架修饰结构连接。
在一些结构(C)的实施方案中，在(N’)y中，在每个5’和3’末端的2、3、
4、5、6、7或8个连续的核糖核苷酸独立地是镜像核苷酸、通过2’-5’磷
酸二酯键连接核苷酸、2’糖修饰的核苷酸或二环核苷酸。在一个实施方案
中，在(N’)y的5’和3’末端的修饰结构是相同的。在一个优选的实施方案
中，4个在(N’)y5’末端的连续的核苷酸通过3个2’-5’磷酸二酯键连接起来，
而且在(N’)y 3’末端的3个连续的核苷酸通过2个2’-5’磷酸二酯键连接在
一起。在另外一个实施方案中，在(N’)y5’末端的修饰结构与在(N’)y3’末端
的修饰结构是不同的。在一个特定的实施方案中，在(N’)y 5’末端的已修饰
的核苷酸是镜像核苷酸，而且在(N’)y3’末端的已修饰的核苷酸通过2’-5’
磷酸二酯键连接。在另外一个特定的实施方案中，在(N’)y 5’末端的3个连
续的核苷酸是LNA核苷酸，而且通过2个2’-5’磷酸二酯键在(N’)y 3’末端
的3个连续的核苷酸连接在一起。在(N)x中核苷酸在已修饰的核糖核苷酸
和未修饰的核糖核苷酸之间交替，每个已修饰的核糖核苷酸是被修饰过
的，由此在它的糖上具有2’-O-甲基，并且位于(N)x中间的核糖核苷酸是
未修饰的，或在(N)x中的核糖核苷酸是未修饰过的。
在另外一个结构(C)的实施方案中，本发明提供了化合物其中x＝y＝19
或x＝y＝23；在(N)x中核苷酸在已修饰的核糖核苷酸和未修饰的核糖核苷
酸之间交替，每个已修饰的核糖核苷酸是被修饰过的，由此在它的糖上具
有2’-O-甲基，而且位于(N)x中间的核糖核苷酸是未修饰的；通过2个2’-5’
磷酸二酯键在(N’)y 3’末端的3个核苷酸连接在一起在(N’)y 5’末端的3个
核苷酸是LNA，例如ENA。
在另外一个结构(C)的实施方案中，在(N’)y 5’末端的5个连续的核苷
酸包含2’-O-甲基糖修饰结构，而且在(N’)y3’末端的连续的核苷酸是
L-DNA。
在又一个实施方案中，本发明提供了化合物其中x＝y＝19或x＝y＝23；
(N)x包含未修饰的核糖核苷酸；通过2个2’-5’磷酸二酯键在(N’)y3’末端的
3个连续的核苷酸连接在一起，而且在(N’)y5’末端的3个连续的核苷酸是
LNA，例如ENA。
根据其它结构(C)的实施方案，在(N’)y中，5’或3’末端的核苷酸，或
在5’和3’末端的之一的2、3、4、5或6连续的核苷酸或在每个5’和3’末
端的1-4个已修饰的核苷酸独立地是磷酰羧酸酯或磷基羧酸酯核苷酸
(PACE核苷酸)。在一些实施方案中，PACE核苷酸是脱氧核糖核苷酸。在
一些优选的实施方案中，在(N’)y中，在每个5’和3’末端的1或2连续的
核苷酸是PACE核苷酸。
在一些实施方案中，本发明提供了具有结构(D)的化合物：
(D)5’(N)x-Z 3’反义链
3’Z’-(N’)y 5’正义链
其中每个N和N’是选自未修饰的核糖核苷酸、已修饰的核糖核苷酸、
未修饰的脱氧核糖核苷酸或已修饰的脱氧核糖核苷酸的核苷酸；
其中每一个(N)x和(N’)y是寡聚物，在该寡聚物中通过共价键每一个
连续的核苷酸连接于下一个核苷酸，并且x和y各是18到40的整数；
其中(N)x包含未修饰的核糖核苷酸，并在3’最末端或倒数第二位进一
步包含1个已修饰的核苷酸，其中已修饰的核苷酸选自由下列物质组成的
组：二环核苷酸、2’糖修饰的核苷酸、镜像核苷酸、阿卓糖醇核苷酸或通
过核苷酸间键合(选自2’-5’磷酸二酯键、P-烷氧基连接或PACE连接)连接
到邻近核苷酸的核苷酸。
其中(N’)y包含未修饰的核糖核苷酸，并在5’末端或倒数第二位进一
步包含1个已修饰的核苷酸，其中已修饰的核苷酸选自由下列物质组成的
组：二环核苷酸、2’糖修饰的核苷酸、镜像核苷酸、阿卓糖醇核苷酸或通
过核苷酸间键合(选自2’-5’磷酸二酯键、P-烷氧基连接或PACE连接)连接
到邻近核苷酸的核苷酸。
其中在每个(N)x和(N’)y中已修饰的和未修饰的核苷酸不是交替的；
其中每个Z和Z’可以存在或不存在，但如果存在的话是共价地连接于
任一其所连接的寡聚物的3’末端的1-5个脱氧核糖核苷酸；
其中(N’)y序列是与(N)x充分互补的序列；其中(N)x包含与约18到约
40个连续的核糖核苷酸充分互补的反义序列，这些核糖核苷酸存在于和急
性肾损伤有关的靶基因的mRNA中。
在一个结构(D)的实施方案中，x＝y＝19或x＝y＝23；(N)x包含未修饰的
核糖核苷酸，在其中在3’末端的2个连续的核苷酸通过1个2′-5′核苷酸间
键合连接；而且(N’)y包含未修饰的核糖核苷酸，在其中在5’末端的2个
连续的核苷酸通过1个2′-5′核苷酸间键合连接。
在一些实施方案中，x＝y＝19或x＝y＝23；(N)x包含未修饰的核糖核苷
酸，在其中在3’末端的3个连续的核苷酸通过2个2′-5′磷酸二酯键连接在
一起；而且(N’)y包含未修饰的核糖核苷酸，在其中在5’末端的4个连续
的核苷酸通过3个2′-5′磷酸二酯键连接在一起(如本文所述的结构II)。
根据各种结构(D)的实施方案，在(N)x3’末端最末位或倒数第二位起始
的2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13或14个连续的核糖核苷酸
和在(N’)y5’末端最末位或倒数第二位起始的2、3、4、5、6、7、8、9、10、
11、12、13或14个连续的核糖核苷酸通过2’-5’核苷酸间键合连接。
根据一个优选的结构(D)的实施方案，4个在(N’)y 5’末端的连续的核苷
酸通过3个2’-5’磷酸二酯键连接起来，而且通过2个2’-5’磷酸二酯键在
(N’)x 3’末端的3个连续的核苷酸连接在一起。在(N’)y 5’末端的3个核苷
酸和在(N’)x 3’末端的2个核苷酸也可包含3’-O-甲基修饰结构。
根据各种结构(D)的实施方案，在(N)x3’末端最末位或倒数第二位起始
的2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13或14个连续的核苷酸以及
在(N’)y5’末端最末位或倒数第二位起始的2、3、4、5、6、7、8、9、10、
11、12、13或14个连续的核糖核苷酸独立地是镜像核苷酸。在一些实施
方案中，镜像核糖核苷酸是L-核糖核苷酸。在其它的实施方案中，镜像核
苷酸是L-脱氧核糖核苷酸。
在其它的结构(D)的实施方案中，在(N)x3’末端最末位或倒数第二位起
始的2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13或14个连续的核糖核苷
酸以及在(N’)y5’末端最末位或倒数第二位起始的2、3、4、5、6、7、8、9、
10、11、12、13或14个连续的核糖核苷酸，独立地是2’糖修饰的核苷酸。
在一些实施方案中，2’糖修饰结构包含氨基、氟、烷氧基或烷基部分。在
某些实施方案中，2’糖修饰结构包含甲基氧部分(2’-OMe)。
在一个优选的结构(D)的实施方案中，在(N’)y 5’末端的5个连续的核
苷酸包含2’OMe糖修饰结构，而且在(N’)x3’末端的5个连续的核苷酸包含
2’OMe糖修饰结构。在另一个优选的结构(D)的实施方案中，在(N’)y 5’末
端的10个连续的核苷酸包含2’OMe糖修饰结构而且在(N’)x3’末端的5个
连续的核苷酸包含2’OMe糖修饰结构。在另一个优选的结构(D)的实施方
案中，在(N’)y 5’末端的13个连续的核苷酸包含2’OMe糖修饰结构，而且
在(N’)x3’末端的5个连续的核苷酸包含2’-O-甲基修饰结构。
在一些结构(D)的实施方案中，在(N’)y中，在(N)x3’末端最末位或倒
数第二位起始的2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13或14个连续
的核糖核苷酸，以及在(N’)y5’末端最末位或倒数第二位起始的2、3、4、5、
6、7、8、9、10、11、12、13或14个连续的核糖核苷酸，独立地是二环
核苷酸。在各种实施方案中，二环核苷酸是锁核酸(LNA)，例如2′-O，4′-C-
亚乙基-桥联核酸(ENA)。
在各种结构(D)的实施方案中，(N’)y包含已修饰的核苷酸，其选自二
环核苷酸、2’糖修饰的核苷酸、镜像核苷酸、阿卓糖醇核苷酸或通过核苷
酸间键合(选自2’-5’磷酸二酯键、P-烷氧基连接或PACE连接)连接到邻近
核苷酸的核苷酸。
在各种结构(D)的实施方案中，(N)x包含已修饰的核苷酸，其选自二
环核苷酸、2’糖修饰的核苷酸、镜像核苷酸、阿卓糖醇核苷酸或通过核苷
酸间键合(选自2’-5’磷酸二酯键、P-烷氧基连接或PACE连接)连接到邻近
核苷酸的核苷酸。
在实施方案中，其中相同链的每一个3’和5’末端包含已修饰的核苷酸，
在5’和3’末端的修饰结构是相同的。在另外一个实施方案中，在5’末端的
修饰结构与在同一链3’末端的修饰结构是不同的。在一个特定的实施方案
中，在5’末端的已修饰的核苷酸是镜像核苷酸，而且在同一链3’末端的已
修饰的核苷酸通过2’-5’磷酸二酯键连接。
在一个特定的结构(D)的实施方案中，在(N’)y 5’末端的5个连续的核
苷酸包含2’OMe糖修饰结构，而且在(N’)y3’末端的2个连续的核苷酸是
L-DNA。另外，化合物可进一步包含5个连续的2’OMe糖修饰的核苷酸
在(N’)x3’末端。
在各种结构(D)的实施方案中，在(N)x中的已修饰的核苷酸与在(N’)y
中的已修饰的核苷酸是不同的。例如，在(N)x中的已修饰的核苷酸是2’
糖修饰的核苷酸，而在(N)y中的已修饰的核苷酸是通过2’-5’核苷酸间键合
连接的核苷酸。在另一个示例中，在(N)x中的已修饰的核苷酸是镜像核苷
酸，而在(N)y中的已修饰的核苷酸是通过2’-5’核苷酸间键合连接的核苷
酸。在另一个示例中，在(N)x中的已修饰的核苷酸是通过2’-5’核苷酸间键
合连接的核苷酸，而在(N’)y中已修饰的核苷酸是镜像核苷酸。
在其他的实施方案中，本发明提供了具有结构(E)的化合物：
(E)5’(N)x-Z 3’反义链
3’Z’-(N’)y 5’正义链
其中每个N和N’是选自未修饰的核糖核苷酸、已修饰的核糖核苷酸、
未修饰的脱氧核糖核苷酸或已修饰的脱氧核糖核苷酸的核苷酸；
其中每一个(N)x和(N’)y是寡聚物，在该寡聚物中通过共价键每一个
连续的核苷酸连接于下一个核苷酸，并且x和y各是18到40的整数；
其中(N)x包含未修饰的核糖核苷酸，并在5’末端或倒数第二位进一步
包含1个已修饰的核苷酸，其中已修饰的核苷酸选自由下列物质组成的组：
二环核苷酸、2’糖修饰的核苷酸、镜像核苷酸、阿卓糖醇核苷酸，或通过
核苷酸间键合(选自2’-5’磷酸二酯键、P-烷氧基连接或PACE连接)连接到
邻近核苷酸的核苷酸。
其中(N’)y包含未修饰的核糖核苷酸，并在3’最末端或倒数第二位进
一步包含1个已修饰的核苷酸，其中已修饰的核苷酸选自由下列物质组成
的组：二环核苷酸、2’糖修饰的核苷酸、镜像核苷酸、阿卓糖醇核苷酸，
或通过核苷酸间键合(选自2’-5’磷酸二酯键、P-烷氧基连接或PACE连接)
连接到邻近核苷酸的核苷酸。
其中在每个(N)x和(N’)y中已修饰的和未修饰的核苷酸不是交替的；
其中每个Z和Z’可以存在或不存在，但如果存在的话是共价地连接于
任一其所连接的寡聚物的3’末端的1-5个脱氧核糖核苷酸；
其中(N’)y序列是与(N)x充分互补的序列；并且其中(N)x的序列包含
与约18到约40个连续的核糖核苷酸充分互补的反义序列，这些核糖核苷
酸存在于和急性肾损伤有关的靶基因的mRNA中。
在某些优选的实施方案中，在(N)x5’末端最末位的核苷酸是未修饰的。
根据各种结构(E)的实施方案，在(N)x5’末端的最末位或倒数第二位
(优选地在5’倒数第二位)起始的2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、
13或14个连续的核糖核苷酸，和在(N’)y3’末端的最末位或倒数第二位起
始的2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13或14个连续的核糖核苷
酸通过2’-5’核苷酸间键合连接。
根据各种结构(E)的实施方案，在(N)x5’末端的最末位或倒数第二位
(优选地在5’倒数第二位)起始的2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、
13或14个连续的核苷酸，和在(N’)y3’末端的最末位或倒数第二位起始的
2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13或14个连续的核苷酸独立地
是镜像核苷酸。在一些实施方案中，镜像核苷酸是L-核糖核苷酸。在其它
的实施方案中，镜像核苷酸是L-脱氧核糖核苷酸。
在其它结构(E)的实施方案中，在(N)x5’末端的最末位或倒数第二位
(优选地在5’倒数第二位)起始的2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、
13或14个连续的核糖核苷酸，和在(N’)y3’末端的最末位或倒数第二位起
始的2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13或14个连续的核糖核苷
酸独立地是2’糖修饰的核苷酸。在一些实施方案中，2’糖修饰结构包含氨
基、氟、烷氧基或烷基部分。在某些实施方案中，2’糖修饰结构包含甲基
氧部分(2’-OMe)。
在一些结构(E)的实施方案中，在(N’)y中，在(N)x5’末端的最末位或
倒数第二位(优选地在5’倒数第二位)起始的2、3、4、5、6、7、8、9、
10、11、12、13或14个连续的核糖核苷酸，和在(N’)y3’末端的最末位或
倒数第二位起始的2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13或14个连
续的核糖核苷酸独立地是二环核苷酸。在各种实施方案中二环核苷酸是锁
核酸(LNA)，例如2′-O，4′-C-亚乙基-桥联核酸(ENA)。
在各种结构(E)的实施方案中，(N’)y包含的已修饰的核苷酸选自二环
核苷酸、2’糖修饰的核苷酸、镜像核苷酸、阿卓糖醇核苷酸、通过P-烷氧
基骨架修饰结构连接于邻近核苷酸的核苷酸，或通过核苷酸间键合(选自
2’-5’磷酸二酯键、P-烷氧基连接或在3’末端或在3’和5’末端之一的PACE
连接)连接到邻近核苷酸的核苷酸。
在各种结构(E)的实施方案中，(N)x包含的已修饰的核苷酸选自二环核
苷酸、2’糖修饰的核苷酸、镜像核苷酸、阿卓糖醇核苷酸，或通过核苷酸
间键合(选自2’-5’磷酸二酯键、P-烷氧基连接或在5’末端或在3’和5’末端
之一的PACE连接)连接到邻近核苷酸的核苷酸。
在一个实施方案中，其中同一链的3’和5’两个末端包含已修饰的核苷
酸，在5’和3’末端的修饰结构是相同的。在另外一个实施方案中，在5’
末端的修饰结构与在同一链3’末端的修饰结构是不同的。在一个特定的实
施方案中，在5’末端的已修饰的核苷酸是镜像核苷酸，而且在同一链3’
末端的已修饰的核苷酸通过2’-5’磷酸二酯键连接。
在各种结构(E)的实施方案中，在(N)x中的已修饰的核苷酸与在(N’)y
中的已修饰的核苷酸是不同的。例如，在(N)x中的已修饰的核苷酸是2’
糖修饰的核苷酸，而在(N)y中的已修饰的核苷酸是通过2’-5’核苷酸间键合
连接的核苷酸。在另一个示例中，在(N)x中的已修饰的核苷酸是镜像核苷
酸，而在(N)y中的已修饰的核苷酸是通过2’-5’核苷酸间键合连接的核苷
酸。在另一个示例中，在(N)x中的已修饰的核苷酸是通过2’-5’核苷酸间键
合连接的核苷酸，而在(N’)y中已修饰的核苷酸是镜像核苷酸。
在其他的实施方案中，本发明提供了具有结构(F)的化合物：
(F)5’(N)x-Z 3’反义链
3’Z’-(N’)y 5’正义链
其中每个N和N’是选自未修饰的核糖核苷酸、已修饰的核糖核苷酸、
未修饰的脱氧核糖核苷酸或修饰的脱氧核糖核苷酸的核苷酸；
其中每一个(N)x和(N’)y是寡聚物，在该寡聚物中通过共价键每一个
连续的核苷酸连接于下一个核苷酸，并且x和y各是18到40的整数；
其中每个(N)x和(N’)y包含未修饰的核糖核苷酸，在其中每个(N)x和
(N’)y在3’最末端或倒数第二位独立地包含1个已修饰的核苷酸，其中已
修饰的核苷酸选自由下列物质组成的组：二环核苷酸、2’糖修饰的核苷酸、
镜像核苷酸、通过P-烷氧基骨架修饰结构连接于邻近核苷酸的核苷酸或通
过2’-5’磷酸二酯键连接与邻近的核苷酸的核苷酸；
其中在每个(N)x和(N’)y中已修饰的和未修饰的核苷酸不是交替的；
其中每个Z和Z’可以存在或不存在，但如果存在的话是共价地连接于
任一其所连接的寡聚物的3’末端的1-5个脱氧核糖核苷酸；
其中(N’)y序列是与(N)x充分互补的序列；并且其中(N)x的序列包含
与约18到约40个连续的核糖核苷酸充分互补的反义序列，这些核糖核苷
酸存在于和急性肾损伤有关的靶基因的mRNA中。
在一些结构(F)的实施方案中，x＝y＝19或x＝y＝23；(N’)y包含未修饰的
核糖核苷酸，其中在3’末端的2个连续的核苷酸包含2个连续的镜像脱氧
核糖核苷酸；而且(N)x包含未修饰的核糖核苷酸，其中在3’末端的1个核
苷酸包含镜像脱氧核糖核苷酸(如所述的结构III)。
根据各种结构(F)的实施方案，在(N)x和(N’)y的3’末端的最末或倒数
第二位独立地起始的2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13或14个
连续的核糖核苷酸通过2’-5’核苷酸间键合连接。
根据一个优选的结构(F)实施方案，通过2个2’-5’磷酸二酯键在(N’)y 3’
末端的3个连续的核苷酸连接在一起，而且通过2个2’-5’磷酸二酯键在
(N’)x 3’末端的3个连续的核苷酸连接在一起。
根据各种结构(F)的实施方案，在(N)x和(N’)y的3’末端的最末或倒数
第二位独立地起始的2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13或14个
连续的核苷酸独立地是镜像核苷酸。在一些实施方案中镜像核苷酸是L-
核糖核苷酸。在其它的实施方案中，镜像核苷酸是L-脱氧核糖核苷酸。
在其它的结构(F)的实施方案中，在(N)x和(N’)y的3’末端的最末或倒
数第二位独立地起始的2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13或14
个连续的核糖核苷酸独立地是2’糖修饰的核苷酸。在一些实施方案中，2’
糖修饰结构包含氨基、氟、烷氧基或烷基部分。在某些实施方案中，2’糖
修饰结构包含甲基氧部分(2’-OMe)。
在一些结构(F)的实施方案中，在(N)x和(N’)y的3’末端的最末或倒数
第二位独立地起始的2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13或14个
连续的核糖核苷酸，独立地是二环核苷酸。在各种实施方案中二环核苷酸
是锁核酸(LNA)例如2′-O，4′-C-亚乙基-桥联核酸(ENA)。
在各种结构(F)的实施方案中，(N’)y包含已修饰的核苷酸，其选自二
环核苷酸、2’糖修饰的核苷酸、镜像核苷酸、阿卓糖醇核苷酸，或通过核
苷酸间键合(选自2’-5’磷酸二酯键、P-烷氧基连接或在3’末端或在3’和5’
两者末端的PACE连接)连接到邻近核苷酸的核苷酸。
在各种结构(F)的实施方案中，(N)x包含的已修饰的核苷酸选自二环核
苷酸、2’糖修饰的核苷酸、镜像核苷酸、阿卓糖醇核苷酸，或通过核苷酸
间键合(选自2’-5’磷酸二酯键、P-烷氧基连接或在3’末端或在3’和5’末端
之一的PACE连接)连接到邻近核苷酸的核苷酸。
在一个实施方案中，其中每个同一链的3’和5’末端包含已修饰的核苷
酸，在5’和3’末端的修饰结构是相同的。在另外一个实施方案中，在5’
末端的修饰结构与在同一链3’末端的修饰结构是不同的。在一个特定的实
施方案中，在5’末端的已修饰的核苷酸是镜像核苷酸，而且在同一链3’
末端的已修饰的核苷酸通过2’-5’磷酸二酯键连接。
在各种结构(F)的实施方案中，在(N)x中的已修饰的核苷酸与在(N’)y
中的已修饰的核苷酸是不同的。例如，在(N)x中的已修饰的核苷酸是2’
糖修饰的核苷酸，而在(N)y中的已修饰的核苷酸是通过2’-5’核苷酸间键合
连接的核苷酸。在另一个示例中，在(N)x中的已修饰的核苷酸是镜像核苷
酸，而在(N)y中的已修饰的核苷酸是通过2’-5’核苷酸间键合连接的核苷
酸。在另一个示例中，在(N)x中的已修饰的核苷酸是通过2’-5’核苷酸间键
合连接的核苷酸，而在(N’)y中已修饰的核苷酸是镜像核苷酸。
在其他的实施方案中，本发明提供了具有结构(G)的化合物：
(G)5’(N)x-Z 3’反义链
3’Z’-(N’)y 5’正义链
其中每个N和N’是选自未修饰的核糖核苷酸、已修饰的核糖核苷酸、
未修饰的脱氧核糖核苷酸或修饰的脱氧核糖核苷酸的核苷酸；
其中每一个(N)x和(N’)y是寡聚物，在该寡聚物中通过共价键每一个
连续的核苷酸连接于下一个核苷酸，并且x和y各是18到40的整数；
其中每个(N)x和(N’)y包含未修饰的核糖核苷酸，其中每个(N)x和
(N’)y在5’末端或倒数第二位独立地包含1个已修饰的核苷酸，其中已修
饰的核苷酸选自由下列物质组成的组：二环核苷酸、2’糖修饰的核苷酸、
镜像核苷酸、通过P-烷氧基骨架修饰结构连接于邻近核苷酸的核苷酸或通
过2’-5’磷酸二酯键连接与邻近的核苷酸的核苷酸；
其中(N)x的已修饰的核苷酸优选地是在5’末端倒数第二位；
其中在每个(N)x和(N’)y中已修饰的和未修饰的核苷酸不是交替的；
其中每个Z和Z’可以存在或不存在，但如果存在的话是共价地连接于
任一其所连接的寡聚物的3’末端的1-5个脱氧核糖核苷酸；
其中(N’)y序列是与(N)x充分互补的序列；并且其中(N)x的序列包含
与约18到约40个连续的核糖核苷酸充分互补的反义序列，这些核糖核苷
酸存在于和急性肾损伤有关的靶基因的mRNA中。
在一些结构(G)的实施方案中，x＝y＝19或x＝y＝23.
根据各种结构(G)的实施方案，在(N)x和(N’)y的5’末端的最末或倒数
第二位独立地起始的2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13或14个
连续的核糖核苷酸通过2’-5’核苷酸间键合连接。对于(N)x修饰的核苷酸优
选地在5’末端倒数第二位开始。
根据各种结构(G)的实施方案，在(N)x和(N’)y的5’末端的最末或倒数
第二位独立地起始的2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13或14个
连续的核苷酸独立地是镜像核苷酸。在一些实施方案中镜像核苷酸是L-
核糖核苷酸。在其它的实施方案中，镜像核苷酸是L-脱氧核糖核苷酸。对
于(N)x修饰的核苷酸优选地在5’末端倒数第二位开始。
在其它的结构(G)的实施方案中，在(N)x和(N’)y的5’末端的最末或倒
数第二位独立地起始的2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13或14
个连续的核糖核苷酸独立地是2’糖修饰的核苷酸。在一些实施方案中，2’
糖修饰结构包含氨基、氟、烷氧基或烷基部分。在某些实施方案中，2’糖
修饰结构包含甲基氧部分(2’-OMe)。在一些优选的实施方案中，连续的已
修饰的核苷酸优选地在(N)x5’末端的倒数第二位开始。
在一个优选的结构(G)的实施方案中，在(N’)y5’末端的5个连续的核糖
核苷酸包含2’OMe糖修饰结构，而且在(N’)x 5’倒数第二位的1个核糖核
苷酸包含2’OMe糖修饰结构。在另一个优选的结构(G)的实施方案中，在
(N’)y 5’末端的5个连续的核糖核苷酸包含2’OMe糖修饰结构，而且在
(N’)x5’末位的2个连续的核糖核苷酸包含2’OMe糖修饰结构。
在一些结构(G)的实施方案中，在(N)x和(N’)y的5’末端的最末或倒数
第二位独立地起始的2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13或14个
连续的核糖核苷酸是二环核苷酸。在各种实施方案中，二环核苷酸是锁核
酸(LNA)，例如2′-O，4′-C-亚乙基-桥联核酸(ENA)。在一些优选的实施方
案中，连续的已修饰的核苷酸优选地在(N)x5’末端的倒数第二位开始。
在各种结构(G)的实施方案中，(N’)y包含已修饰的核苷酸，其选自二
环核苷酸、2’糖修饰的核苷酸、镜像核苷酸、阿卓糖醇核苷酸，或通过核
苷酸间键合(选自2’-5’磷酸二酯键、P-烷氧基连接或在5’末端或在3’和5’
末端之一的PACE连接)连接到邻近核苷酸的核苷酸。
在各种结构(G)的实施方案中，(N)x包含的已修饰的核苷酸选自二环
核苷酸、2’糖修饰的核苷酸、镜像核苷酸、阿卓糖醇核苷酸，或通过核苷
酸间键合(选自2’-5’磷酸二酯键、P-烷氧基连接或在5’末端或在3’和5’
末端之一的PACE连接)连接到邻近核苷酸的核苷酸。
在一个实施方案中，其中每个同一链的3’和5’末端包含已修饰的核苷
酸，在5’和3’末端的修饰结构是相同的。在另外一个实施方案中，在5’
末端的修饰结构与在同一链3’末端的修饰结构是不同的。在一个特定的实
施方案中，在5’末端的已修饰的核苷酸是镜像核苷酸，而且在同一链3’
末端的已修饰的核苷酸通过2’-5’磷酸二酯键连接。在各种结构(G)的实施
方案中，在(N)x中的已修饰的核苷酸与在(N’)y中的已修饰的核苷酸是不
同的。例如，在(N)x中的已修饰的核苷酸是2’糖修饰的核苷酸，而在(N)y
中的已修饰的核苷酸是通过2’-5’核苷酸间键合连接的核苷酸。在另一个示
例中，在(N)x中的已修饰的核苷酸是镜像核苷酸，而在(N)y中的已修饰的
核苷酸是通过2’-5’核苷酸间键合连接的核苷酸。在另一个示例中，在(N)x
中的已修饰的核苷酸是通过2’-5’核苷酸间键合连接的核苷酸，而在(N’)y
中已修饰的核苷酸是镜像核苷酸。
在其他的实施方案中，本发明提供了具有结构(H)的化合物：
(H)5’(N)x-Z 3’反义链
3’Z’-(N’)y 5’正义链
其中每个N和N’是选自未修饰的核糖核苷酸、已修饰的核糖核苷酸、
未修饰的脱氧核糖核苷酸或已修饰的脱氧核糖核苷酸的核苷酸；
其中每一个(N)x和(N’)y是寡聚物，在该寡聚物中通过共价键每一个
连续的核苷酸连接于下一个核苷酸，并且x和y各是18到40的整数；
其中(N)x包含未修饰的核糖核苷酸，并在3’最末端或倒数第二位或5’
末端或倒数第二位进一步包含1个已修饰的核苷酸，其中已修饰的核苷酸
选自由下列物质组成的组：二环核苷酸、2’糖修饰的核苷酸、镜像核苷酸、
阿卓糖醇核苷酸，或通过核苷酸间键合(选自2’-5’磷酸二酯键、P-烷氧基连
接或PACE连接)连接到邻近核苷酸的核苷酸。
其中(N’)y包含未修饰的核糖核苷酸，并在内部位置进一步包含1个
已修饰的核苷酸，其中已修饰的核苷酸选自由下列物质组成的组：二环核
苷酸、2’糖修饰的核苷酸、镜像核苷酸、阿卓糖醇核苷酸，或通过核苷酸
间键合(选自2’-5’磷酸二酯键、P-烷氧基连接或PACE连接)连接到邻近核
苷酸的核苷酸。
其中在每个(N)x和(N’)y中已修饰的和未修饰的核苷酸不是交替的；
其中每个Z和Z’可以存在或不存在，但如果存在的话是共价地连接于
任一其所连接的寡聚物的3’末端的1-5个脱氧核糖核苷酸；
其中(N’)y序列是与(N)x充分互补的序列；并且其中(N)x的序列包含
与约18到约40个连续的核糖核苷酸充分互补的反义序列，这些核糖核苷
酸存在于和急性肾损伤有关的靶基因的mRNA中。
在一个结构(H)的实施方案中，在(N)x的3’最末端或3’末端倒数第二
位或5’末端或两个末端独立地起始的2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、
12、13或14个连续的核糖核苷酸独立地是2’糖修饰的核苷酸、二环核苷
酸、镜像核苷酸、阿卓糖醇核苷酸或通过2’-5’磷酸二酯键连接与邻近的核
苷酸的核苷酸，而且在(N’)y中的2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、
13或14个连续的内部核糖核苷酸，独立地是2’糖修饰的核苷酸、二环核
苷酸、镜像核苷酸、阿卓糖醇核苷酸或通过2’-5’磷酸二酯键连接与邻近的
核苷酸的核苷酸。在一些实施方案中，2’糖修饰结构包含氨基、氟、烷氧
基或烷基部分。在某些实施方案中，2’糖修饰结构包含甲基氧部分
(2’-OMe)。
在另外一个结构(H)的实施方案中，在(N’)y的3’最末端或3’末端倒数
第二位或5’末端的独立地起始的2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、
13或14个连续的核糖核苷酸，或者在(N’)y的每个5’和3’末端的2-8个连
续的核苷酸，独立地是2’糖修饰的核苷酸、二环核苷酸、镜像核苷酸、阿
卓糖醇核苷酸或通过2’-5’磷酸二酯键连接与邻近的核苷酸的核苷酸，并且
在(N)x中的2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13或14个连续的内
部核糖核苷酸独立地是2’糖修饰的核苷酸、二环核苷酸、镜像核苷酸、阿
卓糖醇核苷酸或通过2’-5’磷酸二酯键连接与邻近的核苷酸的核苷酸。
在一个实施方案中，其中每个同一链的3’和5’末端包含已修饰的核苷
酸，在5’和3’末端的修饰结构是相同的。在另外一个实施方案中，在5’
末端的修饰结构与在同一链3’末端的修饰结构是不同的。在一个特定的实
施方案中，在5’末端的已修饰的核苷酸是镜像核苷酸，而且在同一链3’
末端的已修饰的核苷酸通过2’-5’磷酸二酯键连接。
在各种结构(H)的实施方案中，在(N)x中已修饰的核苷酸与在(N’)y中
已修饰的核苷酸是不同的。例如，在(N)x中的已修饰的核苷酸是2’糖修饰
的核苷酸，而在(N)y中的已修饰的核苷酸是通过2’-5’核苷酸间键合连接的
核苷酸。在另一个示例中，在(N)x中的已修饰的核苷酸是镜像核苷酸，而
在(N)y中的已修饰的核苷酸是通过2’-5’核苷酸间键合连接的核苷酸。在另
一个示例中，在(N)x中的已修饰的核苷酸是通过2’-5’核苷酸间键合连接的
核苷酸，而且在(N’)y中的已修饰的核苷酸是镜像核苷酸。
在一个优选的结构(H)的实施方案中，x＝y＝19；在(N’)y第9-11位的3
个连续的核糖核苷酸包含2’OMe糖修饰结构，而且在(N’)x 3’末位的5个
连续的核糖核苷酸包含2’OMe糖修饰结构。
对于所有上述的结构(A)-(H)，在各种实施方案中x＝y并且每个x和y
是19、20、21、22或23。在某些实施方案中，x＝y＝19。在另外其他的实
施方案中，x＝y＝23。在其他的实施方案中，化合物在交替的位置包含已修
饰的核糖核苷酸，其中每个在(N)x5’和3’末端的N的糖残基是被修饰过的
而且中间核糖核苷酸是未修饰的，例如核糖核苷酸在19-节链的第10位，
在21-节链的第11位以及在23-节链的第12位。
在一些实施方案中，其中x＝y＝21或x＝y＝23，在反义链的中间核苷酸
优选地是未修饰的前提下，为21和23节链，调整19节链中的修饰结构
的位置。
在一些实施方案中，(N)x和(N’)y的3’和5’末端都未被磷酸化。在其
它的实施方案中，(N)x和(N’)y之一或两者的3’末端被磷酸化。在又一个
实施方案中，(N)x和(N’)y之一或两者的3’末端被以不可裂解的磷酸基基
团磷酸化。在又一个实施方案中，用可裂解的或不可裂解的磷酸基基团，
使(N)x和(N’)y的之一或两者的2’最末端位置磷酸化。也可将这些特定
siRNA化合物的末端钝化和非-磷酸化；然而，比较性实验显示，与非-磷
酸化化合物相比，在1个或2个3’-末端的磷酸化的siRNA化合物在体内
具有相似活性。
在某些实施方案中，对于所有上文提到的结构，化合物是钝末端的，
例如其中Z和Z’都不存在。在可选地实施方案中，化合物包含至少1个3’
垂悬，其中至少Z和Z’两者之一是存在的。Z和Z’独立地包含一种或多种
共价地连接的已修饰的或非-修饰的核苷酸，例如反向dT或dA；dT、LNA、
镜像核苷酸等。在一些实施方案中，每个Z和Z’是独立地选自dT和dTdT。
Z和/或Z’存在的siRNA和Z和/或Z’不存在的siRNA具有相似的活性和稳
定性。
在某些实施方案中，对于所有上文提到的结构，化合物包含一种或多
种膦酰基羧酸酯和/或磷基羧酸酯核苷酸(PACE核苷酸)。在一些实施方案
中PACE核苷酸是脱氧核糖核苷酸而且磷基羧酸酯核苷酸是磷基醋酸核苷
酸。PACE核苷酸和类似物的示例见诸于美国专利No.6,693,187和
7,067,641，两者都通过引用的方式并入本文。
在某些实施方案中，对于所有上文提到的结构，化合物包含一种或多
种锁核酸(LNA)(也被定义为桥联核酸或二环核苷酸)。优选的锁核酸是
2′-O，4′-C-亚乙基核苷(ENA)或2′-O，4′-C-亚甲基核苷。其它LNA和ENA
核苷酸的示例见诸于WO 98/39352，WO 00/47599和WO 99/14226，都通过
引用的方式并入本文。
在某些实施方案中，对于所有上文提到的结构，化合物包含一种或多
种阿卓糖醇单体(核苷酸)，也被定义为1，5无水-2-脱氧-D-altrito-己糖醇
(参见例如，Allart，et al.，1998.nucleotide & ribonucleotide 17：1523-1526；
Herdewijn et al.，1999.nucleotide & ribonucleotide 18：1371-1376；Fisher et
al.，2007，NAR 35(4)：1064-1074；都通过引用的方式并入本文)。
本发明明确地排除每个N和/或N’是脱氧核糖核苷酸(D-A、D-C、D-G、
D-T)的化合物。在某些实施方案中，(N)x和(N’)y可独立地包含1、2、3、
4、5、6、7、8、9或更多个脱氧核糖核苷酸。在某些实施方案中，本发明
提供了化合物，其中每个N是未修饰的核糖核苷酸而且3’末端核苷酸或在
(N’)y3’末端的2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13或14个连续的
核苷酸是脱氧核糖核苷酸。在另外其他的实施方案中，每个N是未修饰的
核糖核苷酸，而且5’末端核苷酸或在(N’)y5’末端的2、3、4、5、6、7、8、
9、10、11、12、13或14个连续的核苷酸是脱氧核糖核苷酸。在进一步的
实施方案中，5’末端核苷酸或在5’末端的2、3、4、5、6、7、8、或9个
连续的核苷酸，以及在(N)x3’末端的1、2、3、4、5或6个连续的核苷酸
是脱氧核糖核苷酸，并且每个N’是未修饰的核糖核苷酸。在更进一步实施
方案中，(N)x包含未修饰的核糖核苷酸，和独立地在每个5’和3’末端的1
或2、3或4个连续的脱氧核糖核苷酸，和在内部位置的1或2、3、4、5
或6连续的脱氧核糖核苷酸；而且每个N’是未修饰的核糖核苷酸。在某些
实施方案中，3’末端核苷酸或在(N’)y3’末端的2、3、4、5、6、7、8、9、
10、11、12、13或14个连续的核苷酸，以及末端5’核苷酸或(N)x5’末端
的2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13或14个连续的核苷酸在是
脱氧核糖核苷酸。本发明排除每个N和/或N’是脱氧核糖核苷酸的化合物。
在一些实施方案中，5’末端的N的核苷酸或2或3个连续的N和1、2，或
3个N’是脱氧核糖核苷酸。有活性的DNA/RNA siRNA嵌合体的某些示例
见诸于美国专利公开2005/0004064，和Ui-Tei，2008(NAR 36(7)：2136-2151)
全部通过引用的方式并入本文。
除非另有说明，在本文所述结构的优选的实施方案中，在每个连续的
N或N’之间的共价键是磷酸二酯键。
另外一个本发明提供的新分子是包含连续的核苷酸的寡核苷酸，其中
这种核苷酸的第一片段编码第一抑制性RNA分子，这种核苷酸的第二片
段编码第二抑制性RNA分子，而且这种核苷酸的第三片段编码第三抑制
性RNA分子。每个第一、第二和第三片段可包含双链RNA的1条链，而
且第一、第二和第三片段可通过接头连接到一起。进一步说，寡核苷酸可
包含通过一种或多种接头结合的3个双链片段。
由此，本发明提供的1个分子是包含连续的核苷酸的寡核苷酸，其编
码3种抑制性RNA分子；所述寡核苷酸可具有三链结构，以致3个双链
臂通过一种或多种接头(例如任一如上文所述的接头)连接到一起。这种
分子形成“星”-样结构，并且在本文中也可以被定义为RNAstar。这样的结
构见诸于PCT专利公开WO 2007/091269(转让给本发明的受让人)，并且
全部通过引用的方式并入本文。
共价键是指将1个核苷酸单体连接于邻近的核苷酸单体的核苷酸间键
合。共价键包含例如磷酸二酯键、二氧硫代磷酸酯键、P-烷氧基键、P-羰
基键等。RNA和DNA的常规核苷间键合是3′到5′磷酸二酯连接。在某些
优选的实施方案中，共价键是磷酸二酯键。共价键包含非含磷核苷间键合，
例如尤其公布于WO2004/041924的那些例子。除非另有说明，在优选的本
文所述结构实施方案中，在每个连续的N或N’之间的共价键是磷酸二酯
键。
对于所有上述结构，在一些实施方案中，(N)x寡核苷酸序列与(N′)y
寡核苷酸序列是完全互补的。在其它的实施方案中，(N)x和(N’)y是充分
互补的。在某些实施方案中，(N)x与靶向序列是完全互补的。在其它的实
施方案中，(N)x与靶向序列是充分互补的
在一些实施方案中，(N)x和(N’)y的3’和5’末端都未被磷酸化。在其
它的实施方案中，(N)x和(N’)y之一或两者的3’末端被磷酸化(3′Pi)。在又
一个实施方案中，(N)x和(N’)y之一或两者的3’末端被不可裂解的磷酸基
基团磷酸化。在又一个实施方案中，(N)x和(N’)y的之一或两者的2’末端
末位，被可裂解的或不可裂解的磷酸基基团磷酸化。进一步说，本发明抑
制性核酸分子可包含一种或多种缝隙和/或一种或多种缺口和/或一种或多
种错配。不希望受理论束缚，缝隙、缺口和错配有利于部分地使核酸/siRNA
去稳定化，因此内源细胞结构，例如DICER、DROSHA或RISC可以更容
易地将它加工成抑制性成分。
就本发明来说，在核酸中的缝隙是指在一条链中缺乏一个或多个内在
核苷酸，同时在核酸中的缺口是指在一条链中缺乏在邻近的核苷酸之间的
核苷酸间键合。任一本发明的分子可含有一种或多种缝隙和/或一种或多种
缺口。在一个方面本发明提供了具有结构(I)的化合物：
(I)5’(N)x-Z 3’(反义链)
3’Z’-(N’)y-z”5’(正义链)
其中每个N和N’是核糖核苷酸，该核糖核苷酸可以是未修饰的或已
修饰的，或非常规部分；
其中每一个(N)x和(N’)y是寡核苷酸，在其中每一个连续的N或N’
通过共价键连接于下一个N或N’；
其中Z和Z’可以存在或不存在，但如果存在的话，独立地是共价地连
接于它所在链的3’末端的1-5个连续的核苷酸或非-核苷酸部分；
其中z”可以存在或不存在，但如果存在的话是共价地连接到(N’)y的5’
末端的封端部分；
其中x＝18到27；
其中y＝18到27；
其中(N)x包含已修饰的和未修饰的核糖核苷酸，每个已修饰的核糖核
苷酸在它的糖上具有2’-O-甲基，其中在(N)x的3’末端的N是已修饰的核
糖核苷酸，(N)x包含至少5个在3’末端起始的交替的已修饰的核糖核苷酸，
和至少总共9个已修饰的核糖核苷酸，而且每个剩余的N是未修饰的核糖
核苷酸；
其中在(N’)y中，至少1种非常规部分是存在的，其中非常规部分可
以是脱碱基核糖部分、脱碱基脱氧核糖部分、已修饰的或未修饰的脱氧核
糖核苷酸、镜像核苷酸，和通过2’-5’核苷酸间磷酸键连接到邻近核苷酸的
核苷酸；和
其中(N’)y的序列是与(N)x有互补性的序列；并且其中(N)x的序列包
含与约18到约27个连续的核糖核苷酸有互补性的反义序列，这些核糖核
苷酸存在于和急性肾损伤有关的靶基因的mRNA中。
在一些实施方案中x＝y＝19。在其它的实施方案中x＝y＝23。在一些实
施方案中，至少1个非常规部分存在于(N’)y的第15、16、17或18位。在
一些实施方案中，非常规部分选自镜像核苷酸、脱碱基核糖部分和脱碱基
脱氧核糖部分。在一些优选的实施方案中，非常规部分是镜像核苷酸，优
选地是L-DNA部分。在一些实施方案中L-DNA部分存在于第17位、第
18位或第17和18位。
在其它的实施方案中，非常规部分是脱碱基部分。在各种实施方案中，
(N’)y包含至少5个脱碱基核糖部分或脱碱基脱氧核糖部分。
在另外其他的实施方案中，(N’)y包含至少5个脱碱基核糖部分或脱
碱基脱氧核糖部分和至少1个N’是LNA。
在一些实施方案中，(N)x包含9个交替的已修饰的核糖核苷酸。在其
它的结构(I)的实施方案中，(N)x包含9个交替的已修饰的核糖核苷酸(进
一步在第2位包含2’O修饰的核苷酸)。在一些实施方案中，(N)x在第1、
3、5、7、9、11、13、15、17、19位的奇数位置包含2’O Me修饰的核糖
核苷酸。在其它的实施方案中，(N)x进一步在第2和18位中的一位或两
位包含2’O Me修饰的核糖核苷酸。在另外其他的实施方案中，(N)x在第
2、4、6、8、11、13、15、17、19位包含2’O Me修饰的核糖核苷酸。
在各种实施方案中，z”是存在的并选自脱碱基核糖部分、脱氧核糖部
分；反向脱碱基核糖部分、脱氧核糖部分；C6-氨基-Pi；镜像核苷酸。
在另一个方面本发明提供了具有如下阐述的结构(J)的化合物：
(J)5’(N)x-Z 3’(反义链)
3’Z’-(N’)y-z”5’(正义链)
其中每个N和N’是核糖核苷酸，该核糖核苷酸可以是未修饰的或已
修饰的，或非常规部分；
其中每一个(N)x和(N’)y是寡核苷酸，在其中每一个连续的N或N’
通过共价键连接于下一个N或N’；
其中Z和Z’可以存在或不存在，但如果存在的话是独立地1-5个连续
的核苷酸共价地连接于它所在链的3’末端；
其中z”可以存在也可以不存在，但如果存在的话是共价地连接到(N’)y
的5’末端的封端部分；
其中x＝18到27；
其中y＝18到27；
其中(N)x包含已修饰的或未修饰的核糖核苷酸，可选地和至少1个非
常规部分；
其中在(N’)y中，至少1种非常规部分是存在的，其中非常规部分可
是脱碱基核糖部分、脱碱基脱氧核糖部分、已修饰的或未修饰的脱氧核糖
核苷酸、镜像核苷酸、非-碱基配对核苷酸类似物或通过2’-5’核苷酸间磷
酸键连接到邻近核苷酸的核苷酸；而且
其中(N’)y的序列是与(N)x有互补性的序列；并且其中(N)x的序列包
含与约18到约27个连续的核糖核苷酸有互补性的反义序列，这些核糖核
苷酸存在于和急性肾损伤有关的靶基因的mRNA中。
在一些实施方案中x＝y＝19。在其它的实施方案中x＝y＝23。在一些优
选的实施方案中，(N)x包含已修饰的和未修饰的核糖核苷酸，和至少一种
非常规部分。
在一些实施方案中，在(N)x中，在3′末端的N是已修饰的核糖核苷酸，
而且(N)x包含至少8个已修饰的核糖核苷酸。在其它的实施方案中，至少
8个已修饰的核糖核苷酸中的至少在3′末端起始的5个是交替的。在一些
实施方案中，(N)x在第5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15位中
的一个位置包含脱碱基部分。
在一些实施方案中，至少1个非常规部分存在于(N’)y的第15、16、
17或18位。在一些实施方案中，非常规部分选自镜像核苷酸、脱碱基核
糖部分和脱碱基脱氧核糖部分。在一些优选的实施方案中，非常规部分是
镜像核苷酸，优选地是L-DNA部分。在一些实施方案中，L-DNA部分存
在于第17位、第18位或第17和18位。在其它的实施方案中，至少1个
在(N′)y中的非常规部分是脱碱基核糖部分或脱碱基脱氧核糖部分。
在又一个方面本发明提供了具有如下阐述的结构(K)的化合物：
(K)5’(N)x-Z 3’(反义链)
3’Z’-(N’)y-z”5’(正义链)
其中每个N和N’是核糖核苷酸，该核糖核苷酸可以是未修饰的或已
修饰的，或非常规部分；
其中每一个(N)x和(N’)y是寡核苷酸，在其中每一个连续的N或N’
通过共价键连接于下一个N或N’；
其中Z和Z’可以存在或不存在，但如果存在的话是独立地共价地连接
于它所在链的3’末端的1-5个连续的核苷酸；
其中z”可以存在也可以不存在，但如果存在的话是共价地连接到(N’)y
的5’末端的封端部分；
其中x＝18到27；
其中y＝18到27；
其中(N)x共同包含已修饰的或未修饰的核糖核苷酸和非常规部分，任
一已修饰的核糖核苷酸在糖上具有2’-O-甲基；
其中(N′)y包含已修饰的或未修饰的核糖核苷酸，可选地和非常规部
分，任一已修饰的核糖核苷酸在糖上具有2’-OME；
其中(N’)y的序列是与(N)x有互补性的序列；并且其中(N)x的序列包
含与约18到约27个连续的核糖核苷酸有互补性的反义序列，这些核糖核
苷酸存在于和急性肾损伤有关的靶基因的mRNA中。
在一些实施方案中x＝y＝19。在其它的实施方案中x＝y＝23。在一些优
选的实施方案中，至少1个非常规部分存在于(N)x并且是脱碱基核糖部分
或脱碱基脱氧核糖部分。在其它的实施方案中，至少1个非常规部分存在
于(N)x并且是非-碱基配对核苷酸类似物。在各种实施方案中，(N’)y包含
未修饰的核糖核苷酸。在一些实施方案中，(N)x包含至少5个脱碱基核糖
部分或脱碱基脱氧核糖部分或其联合物。在某些实施方案中，(N)x和/或
(N’)y包含已修饰的核糖核苷酸，其与在(N’)y和/或(N)x中的相应的已修饰
的或未修饰的核糖核苷酸，不能碱基配对。
在各种实施方案中本发明提供了如结构(L)所阐释的siRNA：
(L)5’(N)x-Z 3’(反义链)
3’Z’-(N’)y 5’(正义链)
其中每个N和N’是核苷酸选自未修饰的核糖核苷酸、已修饰的核糖
核苷酸、未修饰的脱氧核糖核苷酸和已修饰的脱氧核糖核苷酸；
其中每一个(N)x和(N’)y是寡核苷酸，在其中每一个连续的N或N’
通过共价键连接于下一个N或N’；
其中Z和Z’是不存在的；
其中x＝y＝19；
其中在(N’)y中，至少在第15、16、17、18和19位中的一位的核苷
酸包含核苷酸，其选自脱碱基非常规部分、镜像核苷酸、脱氧核糖核苷酸，
和通过2’-5’核苷酸间键与邻近的核苷酸连接的核苷酸；
其中(N)x包含交替的2’OMe糖修饰的核糖核苷酸和未修饰的核糖核
苷酸，从而在(N)x的中间位置具有2’OMe糖修饰的核糖核苷酸；而且
其中(N’)y的序列是与(N)x有互补性的序列；并且其中(N)x的序列包
含与约18到约40连续的核糖核苷酸互补的反义链，这些核糖核苷酸存在
于和急性肾损伤有关的靶基因的mRNA中。
在一些结构(L)的实施方案中，在(N’)y中在第17和18位中的一位或
两位的核苷酸包含已修饰的核苷酸，其选自脱碱基非常规部分、镜像核苷
酸和通过2’-5’核苷酸间键与邻近的核苷酸连接的核苷酸。在一些实施方案
中镜像核苷酸选自L-DNA和L-RNA。在各种实施方案中镜像核苷酸是
L-DNA。
在各种实施方案中，(N’)y在第15位包含已修饰的核苷酸，其中已修
饰的核苷酸选自镜像核苷酸和脱氧核糖核苷酸。
在某些实施方案中，(N’)y在第2位进一步包含已修饰的核苷酸或伪
核苷酸，其中伪核苷酸可是脱碱基非常规部分和已修饰的核苷酸可选地是
镜像核苷酸。
在各种实施方案中，反义链(N)x在奇数位置(5’到3’；在第1、3、5、
7、9、11、13、15、17、19位)包含2’O-Me修饰的核糖核苷酸。在一些实
施方案中，(N)x在第2和18位中的一位或两位，进一步包含2’O-Me修饰
的核糖核苷酸。在其它的实施方案中，(N)x在第2、4、6、8、11、13、15、
17、19位包含2’O Me修饰的核糖核苷酸。
其他设想的结构(L)的实施方案，其中x＝y＝21或其中x＝y＝23；在这些
实施方案中，上文所述的(N’)y的修饰结构不是在第17和18位，而是在
21-节链寡核苷酸的第19和20位以及在23-节链寡核苷酸的第21和22位
上；相似地，在第15、16、17、18或19位的修饰结构，是在21-节链寡
核苷酸的第17、18、19、20或21位以及在23-节链寡核苷酸的第19、20、
21、22或23位上。在反义链上的2’O Me修饰结构也做相似地调整。在
一些实施方案中，(N)x在奇数位置包含2’O Me修饰的核糖核苷酸，该在
奇数位置(5’到3’)是指：21-节链寡核苷酸[在第11位的核苷酸是未修饰的]
的第1、3、5、7、9、12、14、16、18、20位，以及23-节链寡核苷酸[在
第12位的核苷酸是未修饰的]的第1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、
21、23位。在其它的实施方案中，(N)x在21-节链寡核苷酸[在第11位的
核苷酸是未修饰的]的第2、4、6、8、10、12、14、16、18、20位包含2’OMe
修饰的核糖核苷酸，以及在23-节链寡核苷酸[在第12位的核苷酸是未修饰
的]的第2、4、6、8、10、13、15、17、19、21、23位包含2’OMe修饰的
核糖核苷酸。
在一些实施方案中，(N’)y进一步包含5’末端封端核苷酸。在各种实
施方案中末端封端部分选自脱碱基非常规部分、反向脱碱基非常规部分、
L-DNA核苷酸和C6-亚胺磷酸基(在末端的C6氨基接头和磷酸基)。
在其它的实施方案中，本发明提供了具有如下阐述的结构(M)的化
合物：
(M)5’(N)x-Z 3’(反义链)
3’Z’-(N’)y 5’(正义链)
其中每个N和N’选自伪-核苷酸和核苷酸；
其中每个核苷酸选自未修饰的核糖核苷酸、已修饰的核糖核苷酸、未
修饰的脱氧核糖核苷酸和已修饰的脱氧核糖核苷酸；
其中每一个(N)x和(N’)y是寡核苷酸，在其中每一个连续的N或N’
通过共价键连接于下一个N或N’；
其中Z和Z’是不存在的；
其中x＝18到27；
其中y＝18到27；
其中(N’)y的序列是与(N)x有互补性的序列；并且其中(N)x的序列包
含与约18到约27个连续的核糖核苷酸有互补性的反义序列，这些核糖核
苷酸存在于和急性肾损伤有关的靶基因的mRNA中。
在其它的实施方案中本发明提供了具有如下所述的结构(N)的双链化
合物：
(N)5’(N)x-Z 3’(反义链)
3’Z’-(N’)y 5’(正义链)
其中每个N和N’是核苷酸选自未修饰的核糖核苷酸、已修饰的核糖
核苷酸、未修饰的脱氧核糖核苷酸和已修饰的脱氧核糖核苷酸；
其中每一个(N)x和(N’)y是寡核苷酸，在其中每一个连续的N或N’
通过共价键连接于下一个N或N’；
其中Z和Z’是不存在的；
其中x和y各是18到40的整数；
其中(N’)y的序列是与(N)x有互补性的序列；并且其中(N)x的序列包
含与约18到约40个连续的核糖核苷酸有互补性的反义序列，这些核糖核
苷酸存在于和急性肾损伤有关的靶基因的mRNA的反义序列中；
其中(N)x，(N’)y或(N)x和(N’)y包含非碱基-配对已修饰的核苷酸，以
致在双链化合物中(N)x和(N’)y形成了不到15个碱基对。
在其它的实施方案中，本发明提供了具有如下阐述的结构(O)的化
合物：
(O)5’(N)x-Z 3’(反义链)
3’Z’-(N’)y 5’(正义链)
其中每个N是核苷酸选自未修饰的核糖核苷酸、已修饰的核糖核苷
酸、未修饰的脱氧核糖核苷酸和已修饰的脱氧核糖核苷酸；
其中每个N’是选自6元糖核苷酸、7元糖核苷酸、吗啉代部分、缩氨
酸核酸和其联合物的核苷酸类似物；
其中每一个(N)x和(N’)y是寡核苷酸，在其中每一个连续的N或N’
通过共价键连接于下一个N或N’；
其中Z和Z’是不存在的；
其中x和y各是18到40的整数；
其中(N’)y的序列是与(N)x有互补性的序列；并且其中(N)x的序列包
含与约18到约40个连续的核糖核苷酸有互补性的反义序列，这些核糖核
苷酸存在于和急性肾损伤有关的靶基因的mRNA中。
在其它的实施方案中本发明提供了具有如下阐述的结构(P)的化合
物：
(P)5’(N)x-Z 3’(反义链)
3’Z’-(N’)y 5’(正义链)
其中每个N和N’是核苷酸选，其自未修饰的核糖核苷酸、已修饰的
核糖核苷酸、未修饰的脱氧核糖核苷酸和已修饰的脱氧核糖核苷酸；
其中每一个(N)x和(N’)y是寡核苷酸，在其中每一个连续的N或N’
通过共价键连接于下一个N或N’；
其中Z和Z’是不存在的；
其中x和y各是18到40的整数；
其中在(N)x或(N’)y的内部位置的N或N’之一，或在(N)x或(N’)y末
位的一个或多个N或N’包含脱碱基部分或2’修饰的核苷酸；
其中(N’)y的序列是与(N)x有互补性的序列；并且其中(N)x的序列包
含与约18到约40个连续的核糖核苷酸有互补性的反义序列，这些核糖核
苷酸存在于和急性肾损伤有关的靶基因的mRNA中。
在各种实施方案中，(N’)y在第15位包含已修饰的核苷酸其中，该已
修饰的核苷酸选自镜像核苷酸和脱氧核糖核苷酸。
在某些实施方案中，(N’)y在第2位进一步包含已修饰的核苷酸，其
中已修饰的核苷酸选自镜像核苷酸和脱碱基非常规部分。
在各种实施方案中，反义链(N)x在奇数位置(5’到3’；第1、3、5、7、
9、11、13、15、17、19位)包含2’O-Me修饰的核糖核苷酸。在一些实施
方案中，(N)X在第2和18位之一或两位上，进一步包含2’O-Me修饰的核
糖核苷酸。在其它的实施方案中，(N)x在第2、4、6、8、11、13、15、17、
19位包含2’O Me修饰的核糖核苷酸。
另外一个本发明提供的新分子是包含连续的核苷酸的寡核苷酸，其中
这种核苷酸的第一片段编码第一抑制性RNA分子，这种核苷酸的第二片
段编码第二抑制性RNA分子，而且这种核苷酸的第三片段编码第三抑制
性RNA分子。每个第一、第二和第三片段可包含双链RNA的1条链，而
且第一、第二和第三片段可通过接头连接到一起。进一步说，寡核苷酸可
包含通过一种或多种接头结合的3个双链片段。
由此，本发明提供的1个分子是包含连续的核苷酸的寡核苷酸，其编
码3种抑制性RNA分子；所述寡核苷酸可具有三链结构，以致3个双链
臂通过一种或多种接头(例如任一如上文所述的接头)连接到一起。这种
分子形成“星”-样结构，并且在本文中也可以被定义为RNAtar，并且诸于
PCT专利公开WO 2007/091269(转让给本发明的受让人)。
所述三链寡核苷酸可是具有通用结构的寡核糖核苷酸：
5’寡聚物1(正义)接头A 寡聚物2(正义)3’
3’寡聚物1(反义)接头B 寡聚物3(正义)5’
3’寡聚物3(反义)接头C 寡聚物2(反义)5’
或
5’寡聚物1(正义)接头A 寡聚物2(反义)3’
3’寡聚物1(反义)接头B 寡聚物3(正义)5’
3’寡聚物3(反义)接头C 寡聚物2(正义)5’
或
5’寡聚物1(正义)接头A 寡聚物3(反义)3’
3’寡聚物1(反义)接头B 寡聚物2(正义)5’
5’寡聚物3(正义)接头C 寡聚物2(反义)3’
其中一种或多种接头A、接头B或接头C是存在的；只要链的极性和
分子的通用结构还继续存在，任一2个或多个寡核苷酸和接头A-C的一种
或多种的联合物是可以的。进一步说，如果接头A-C的2个或多个是存在
的，它们可以相同或不同。
因此，形成了三臂结构，其中每个臂包含正义链和互补的反义链(即反
义寡聚物1碱基与正义寡聚物1配对等)。三臂结构可以是三链化的，从而
每个臂具有碱基配对。
进一步说，上述三链结构在一条或多条链中，可以具有缝隙却没有接
头。这样的具有1个缝隙的分子技术上说是四链化的而不是三链化的；插
入额外的缝隙或缺口将导致分子具有额外的链。本发明的发明人得到的初
步结果显示，在抑制某些靶基因时，所述有缝隙的分子比相似的无缝隙的
分子更具有活性。这也是有缺口分子的情况。
根据一个本发明的优选的实施方案，siRNA的反义链和正义链仅在3’-
末端而不在5’-末端磷酸化。根据另一个优选的本发明的实施方案，反义链
和正义链是非-磷酸化的。根据还另一个优选的本发明的实施方案，在正义
链的最5′端核糖核苷酸是已修饰的，以排除任何在体内5′-磷酸化的可以性。
本发明进一步提供了在细胞中能表达任一上述的寡核糖核苷酸的载
体，表达之后可以产生了适当的修饰结构。在优选的实施方案中，细胞是
哺乳动物细胞，优选地是人类细胞。
治疗方法
在一个实施方案中，本发明涉及治疗受试者的方法，该受试者需要治
疗以减弱CKD(与一种或多种表1靶基因的表达有关)发展，该方法包括
包含向受试者使用一定量的寡核苷酸抑制剂，其可以降低、下调或抑制一
种或多种那些基因的表达或上调。
很多病症可以引起肾脏的永久损坏和/或影响肾功能并导致CKD。引
起成人CKD的最常见原因如下：
a)糖尿病，糖尿病肾病(DN)是常见糖尿病的并发症；
b)高血压，未治疗或治疗不善的高血压是引起CKD的主因；
c)肾脏老化，表现出和年龄有关的肾功能衰退；
d)急性或慢性肾局部贫血(这是我们用于大鼠的模型，也是你们用于人
类的模型)；
e)败血症。
其它能导致CKD的比较不普遍的病症包含：肾小球疾病、例如肾小球
肾炎(在肾脏中的肾小球炎症)；肾脏动脉狭窄(窄化)、溶血性尿毒综合症、
多囊性肾病、排尿障碍、药物和毒素-导致的肾损坏、和复发性肾感染。
在一些实施方案中，本发明涉及治疗受试者的方法，该受试者需要治
治疗慢性肾病(CKD)(与一种或多种上文表1靶基因的表达有关)，该方法
包括向受试者使用一定量的寡核苷酸抑制剂，其可以在受试者的肾中预防
一种或多种那些基因的上调或超表达。在某些实施方案中，一种或多种靶
基因的上调或超表达是对肾脏损害或损伤的应答。在一些实施方案中，肾
脏损害是包含急性肾损伤(AKI)的急性肾脏损害。在各种本发明的实施方案
中，治疗包括预防或者延迟CKD发作，以及预防CKD的恶化和发展。
在优选的实施方案中，接受治疗的受试者是热血动物，和尤其是包含
非-人类灵长类和人类的哺乳动物。
本发明的方法包括向受试者施用一种或多种治疗有效剂量的抑制性
化合物，其可以调低表1靶基因的表达；特别是和siRNA，从而治疗受试
者。
在各种实施方案中，抑制剂选自包含下列物质的组：siRNA、shRNA、
适体、反义分子、miRNA和核酶。在最近的优选的实施方案中，抑制剂是
siRNA。在优选的实施方案中，siRNA是化学合成的、已修饰的化合物。
术语“治疗”是指关于治病的治疗和预防疾病的或预防性方法，其目的
是预防或者延迟CKD发作，减弱、预防或减慢上面所列的CKD或CKD
的发展或严重性。需要治疗的对象包括那些正在患有疾病或病症、有CKD
倾向，和需要预防CKD的对象；例如在暴露于反复性肾脏损害的受试者
中，该肾脏损害包含因肾毒药物引起的肾脏损害或局部贫血-再灌注性损伤
(IRI)，肾毒药物例如但不仅限于抗生素(例如氨基苷类)、化疗的药物(例如
顺氯氨铂)、免疫抑制剂药物(例如Cyclosporin A，Tacrolimus(也称为FK-506
或Fujimycin))和放射性对比剂。根据多种本发明的实施方案，在暴露于肾
脏损害之前、期间和之后，优选地在损害之后施用寡核苷酸抑制剂。在一
些实施方案中，寡核苷酸抑制剂是siRNA化合物。在各种实施方案中，在
肾脏损害后约4小时，向受试者施用siRNA。如果治疗是以预防为目的，
那么本发明涉及延缓CKD发作或防止CKD发展的方法。在一些实施方案
中，CKD的发展是因为对包含反复性急性肾损伤(AKI)的反复性肾脏损害
产生的应答。
急性肾衰竭(ARF)，也通称急性肾损伤(AKI)，是迅速地肾脏功能的损
失，其原因是肾损坏而导致在血液中滞留含氮的(尿素和肌酸酐)和非-含氮
的废物。根据肾功能障碍严重性和持续性，这种累积也伴随着代谢障碍，
例如代谢酸中毒(血液酸化)和高钾血症(升高的血清钾水平)、体内液体平衡
的改变，和在其它器官系统上的影响。它的特征在于少尿症或无尿症(尿液
产生的降低或中止)。
肾小球滤过率“GFR”是指经过肾小球过滤液体的流率。GFR评估是最
常用的肾脏功能测试方式。在一些实施方案中，相对于未受治疗的受试者，
在受治疗的受试者中的GFR提高了约5％、10％、20％、30％、40％或更多，
GFR可以用来评估减弱发展CKD或预防CKD恶化的方法。
肌酐清除率(CCr，mL/min/1.73m2)是在单位时间内已清除肌酸酐的血
浆的体积，它可以用来测量真实GFR的近似值。
SCr(mg/dL)涉及血清肌酸酐水平。在一些实施方案中，相对于未受治
疗的受试者，在受治疗的受试者中的SCr降低了约5％、10％、20％、30％、
40％或更多，SCr可以用来评估减弱发展CKD或预防CKD恶化的方法。
在一些实施方案中，本发明的方法涉及治疗CKD的方法，该CKD是
由反复性急性肾损伤(AKI)损害导致的，尤其是因外科术后病人局部贫血引
起的急性肾衰竭、因化疗疗，例如施用顺氯氨铂引起的急性肾衰竭、败血
症-相关的急性肾衰竭、肾毒素导致的AKI(包含放射性对比剂导致的
AKI)。造影剂导致的AKI(CIAKI)(也通称造影剂肾病)是指，例如在暴露于
心血管造影术和特定冠状动脉心血管造影术的病人中静脉施用含碘造影
剂导致的AKI。在另外一个实施方案中，本发明的方法是指在暴露于主心
脏手术或血管手术的高-危病人中预防CKD。病人处于正发展的急性肾衰
竭(在某些情况下向CKD发展)的风险之中。可以使用多种计分方法来
鉴定这些病人，例如由US Academic Hospitals(QMMI)和Veterans′
Administration(CICSS)研发的Cleveland临床算法。
在另一个优选的实施方案中，本发明的方法涉及治疗或预防在受试者
中的CKD，通过肾毒素处理诱导该受试者，所用肾毒素包含利尿药、β-
阻断剂、利尿剂、血管扩张剂、ACE抑制剂、免疫抑制剂(例如环孢素)、
氨基苷抗生素(例如庆大霉素)、抗真菌(例如两性霉素乙)、化疗试剂(例
如顺铂)、造影剂、抗体(例如免疫球蛋白)、甘露醇、非甾体抗炎药(例
如阿司匹林、布洛芬、双氯芬酸)、环磷酰胺、甲氨蝶呤、阿昔洛韦、聚
乙二醇、β-内酰胺抗生素、万古霉素、利福平、环丙沙星、磺胺类药物、
雷尼替丁、西咪替丁、速尿、噻嗪类、苯妥英、青霉胺、锂盐、氟化物、
去甲金霉素、膦、马兜铃酸、抗氧化剂、钙通道阻滞剂、血管活性物质、
生长因子、抗炎剂以及更多。
在多数就医的ARF病人中，ARF是由急性肾小管坏死(ATN)引起，而
ATN是由局部缺血、败血性和/或肾毒损害导致的。血量减少性、心脏性和
败血性休克和施用引起血管收缩的药物或肾血管损伤都可以引起肾脏灌
注不足。肾毒素包含外源毒素，例如放射性对比剂、氨基苷类和顺氯氨铂
和顺氯氨铂-样化合物，也包含内源毒素，例如肌红蛋白。不希望受理论束
缚，最近的研究支持以下理论：就ARF而言，在肾脏组织中的细胞凋亡在
大多数人类中是显著地。凋亡性细胞死亡的主要位置是末端肾单位。在局
部缺血损伤的初始阶段，肌动蛋白细胞骨架的完整性丧失导致上皮扁平化
(同时刷毛缘丧失、病灶细胞接触减少)和随后细胞从基底的脱离。有人
认为细胞凋亡性小管细胞死亡比坏死性细胞死亡更能预报功能改变
(Komarov et al.，Science 1999，10；285(5434)：1733-7)；Supavekin et al.，
Kidney Int.2003，63(5)：1714-24)。
如本文所用，″造影剂″是指用于提高内部身体结构在影像中的可见度
的化合物，例如X-光影像或扫描影像(例如，CAT(Computerized Axial
Tomography)扫描、MRI(Magnetic Resonance Imaging)扫描)。术语造影剂在
本文中也是指放射性对比剂。造影剂用于多种诊断(例如栓塞；心导管插入
术)和治疗过程。造影剂的使用仍是造影剂导致的肾病(CIN)主要风险因素。
已患有肾衰竭和糖尿病的病人尤其高风险。此外，CIN是与显著住院的和
长期的疾病率和死亡率有关的。
其他的机制也可促使AKI的发展：局部贫血、血管收缩、与选定的内
源物质(例如在由挤压损伤和严重钝伤引起的横纹肌溶解中的肌红蛋白)有
关的毒性损伤、放射性对比剂(用于包含CT心血管造影术、心脏动脉造影
术的放射学检查的含碘的和IV造影剂)、磷酸盐(某些肾病由使用磷酸钠
的为结肠镜检查而做的肠道准备工作引起)、肾毒药物(例如，NSAID、氨
基苷抗生素、庆大霉素、青霉素，两性霉素B)、微循环改变、如观察到的
败血症和其它炎症状态、溶血、诊断心导管术，特别是在高龄或糖尿病病
人中的股动脉造影、经由皮肤的冠状动脉介入(PCI)、冠状动脉旁路术
(CABG)、败血症、胸腹部主动脉手术、主动脉动脉瘤修复例如forinfra-肾
脏主动脉腹部手术或胸或胸腹部主动脉手术。
冠状动脉疾病(CAD)、心脏衰竭、糖尿病、血管并发症(例如动脉粥样
化疾病和肾脏静脉血栓形成)、HIV-感染的病人、性别、高龄(＞60)、已经
存在的慢性肾病或潜在的肾脏机能不做、血容不足、肝炎协同感染、肝病、
肝肾综合症、癌症病人、患有严重水和电解质代谢障碍的病人、患有血液
和非血液系统恶性肿瘤的病人、肝硬化、COPD、严重烧伤、心包炎和胰
腺炎等已存在的病症可预测AKI病人的严重性和长期预后。
对肾脏的内在损坏：
毒素或药物(例如一些NSAID、氨基苷类抗生素、含碘造影剂、锂、
磷酸盐，某些肾病由使用磷酸钠的为结肠镜检查而做的肠道准备工作引起)
横纹肌溶解(肌肉组织的破坏)-由此导致的在血液中的肌红蛋白释放
影响肾脏；它可以是由损伤(尤其是挤压损伤和严重钝伤)、抑制素、刺激
物和其它药物引起的。
溶血作用(血红细胞的破坏)-血红蛋白损坏小管；其由多种病症(例如
镰刀-细胞疾病和红斑狼疮)引起。
多发性骨髓瘤，归因于高钙血或″管型肾病″(多发性骨髓瘤通过不同机
制也能引起慢性肾衰竭)
急性肾小球肾炎其可归因于多种起因，例如抗肾小球基底膜疾病
/Goodpasture′s综合症、Wegener′s肉芽肿病或含系统性红斑狼疮的急性狼
疮性肾。
后-肾脏(在尿路中的梗阻原因)归因于干扰膀胱正常排空的药物(例如
抗胆碱能类)、良性前列腺肥大或前列腺癌、肾结石、腹部恶性肿瘤(例如
卵巢癌、结肠直肠癌)、阻塞的尿道管、能引起晶尿症的药物和能导致肌红
蛋白尿和膀胱炎的药物。
总之，目前没有令人满意的用于预防和/或治疗由复发性肾急性损害导
致的CKD的治疗方式，由此为了这个目的需要研发新的化合物。
药物组合物
本发明的化合物可以作为化学原料来施用，优选地以药物组合物呈
现。相应地，本发明提供了施用包含一种或多种本发明寡核苷酸化合物的
药物组合物方法；和药学上可接受的载体。这种组合物可包含2种或多种
不同siRNA化合物的混合物。
在一些实施方案中，药物组合物包含至少一种共价地或非-共价地结合
于一种或多种本发明siRNA化合物的本发明siRNA化合物，它的量可以
有效地抑制本发明的靶基因；和药学上可接受的载体。通过内源细胞复合
体可在细胞内产生该化合物，从而制备本发明一种或多种寡核糖核苷酸。
本发明进一步提供了包含药学上可接受的载体和一种或多种本发明
化合物的药物组合物，它的量可以有效抑制在细胞中本发明人类靶基因的
表达，包含序列(N)x的化合物与靶向核酸序列是充分互补的。
“具有互补性”或“充分互补的”是指对另一个序列有超过84％的互补
性。例如在包含19碱基对的双链区域中，1个错配导致94.7％互补性、2
个错配导致约89.5％互补性和3个错配导致约84.2％互补性，这使得双链
区域是充分互补的。相应地显著地一致性是指对另一个序列有超过84％的
互补性。
另外，与包含使本发明靶基因的mRNA转录物和一种或多种本发明化
合物接触的对照相比，本发明提供了抑制本发明靶基因表达的方法，抑制
率至少40％，优选地是50％、60％或70％，更优选地是75％、80％或90％。
在一个实施方案中，寡核糖核苷酸抑制一种或多种本发明靶基因，由
此这种抑制选自包含抑制基因功能、抑制多肽和抑制mRNA表达的组。
在一个实施方案中，化合物抑制靶向多肽，由此该抑制选自下面的组：
抑制功能(可以通过酶法检测或用内源基因/尤其是多肽的已知交互子
(interactor)的结合法检测来检验)、抑制蛋白(可以通过Western印迹法，尤
其是ELISA或免疫沉淀法来检验)和抑制mRNA表达(可以通过Northern
印迹法、量化RT-PCR、尤其是原位杂交或微阵杂交来检验)。
另外，本发明提供了治疗或预防在受试者中肾损坏的方法，该受试者
处于和一种或多种本发明靶基因的激活或上调或超表达有关的CKD的风
险之中，该方法包括向受试者施用治疗有效剂量的本发明的化合物，从而
在受试者中治疗或预防肾损坏。
在其他的实施方案中，本发明提供了治疗受试者的方法，该受试者处
于CKD(伴随于或有关于或起因于一种或多种本发明靶基因的水平升高)
发展的风险之中，该方法包括向受试者施用治疗有效剂量的本发明的化合
物，从而降低在受试者中CKD发展的风险。
递送
将用于本发明方法的SiRNA化合物作为化合物本身(即作为无修饰的
siRNA)或作为药学上可接受的盐施用，也可以单独地或作为有效成分结合
一种或多种药学上可接受的载体、溶剂、稀释剂、赋形剂、助剂和媒介物
施用。在一些实施方案中，通过直接施用以载体或稀释剂制备的裸分子，
将用于本发明方法的siRNA分子输送到靶向组织。
术语″裸siRNA″是指siRNA分子不含任一递送媒介物，包含病毒序列、
病毒微粒、脂质体制剂、脂转染物或沉淀剂等的媒介物可以协助、提升或
促进进入细胞。例如，在PBS中的siRNA是″裸siRNA″。
然而，在一些实施方案中，本发明的siRNA分子可以在脂质体制剂和
脂转染制剂等中输送，并且通过该领域熟练技术人员熟知的方法来制备。
这样的方法见诸于，例如，在美国专利No.5,593,972、5,589,466，和5,580,859，
(以引用的方式并入本文)中。
已经研发出尤其旨在提高和改善siRNA递送进入哺乳动物细胞的递
送系统(参见例如Shen et al.，FEBS Let.2003，539：111-115；Xia et al.，Nat.
Biotech.2002，20：1006-1010；Reich et al.，Mol.Vision 2003，9：210-216；
Sorensen et al.，J.Mol.Biol.2003.327：761-766；Lewis et al.，Nat.Gen.2002，
32：107-108和Simeoni et al.，NAR 2003，31，11：2717-2724)。最近，siRNA
已经全部成功地用于抑制在灵长类中的基因表达(参见例如Tolentino et al.，
Retina 24(4)：660)。
药学上可接受的载体、溶剂、稀释剂、赋形剂、助剂和媒介物，也包
含植入物载体(通常是指惰性的、非毒性的固体或液体填充物)、稀释剂
或胶囊材料(不与本发明有效成分反应)，以及脂质体和微球体等等。用
于本发明的递送系统的示例包含美国专利No.5,225,182；5,169,383；
5,167,616；4,959,217；4,925,678；4,487,603；4,486,194；4,447,233；4,447,224；
4,439,196和4,475,196。其它类似的植入物、递送系统和组件对本领域的
熟练技术人员是熟知的。依照良好医疗实践，考量个体受试者的临床病症、
所需治疗的疾病、施用的部位和方法、施用安排、病人年龄、性别、体重
和执业医师所知的其它因素，来施用本发明的SiRNA或药物组合物和确定
剂量。
本文所用的“治疗有效剂量″由那些该领域已知的因素来确定。该剂量
必须有效达到改善之目的，所谓改善包括但不限于提高存活率或更快恢
复，或改善或消除症状和其它选自由该领域熟练的技术人员做的恰当检测
的指标。
通常，在每次肾脏损害24之内施用单剂或多剂(例如或2剂或3剂
或更多剂)的方案中，用于人类的化合物的有效剂量在1ng/kg到约20-100
mg/kg体重每天之间，优选地是约0.01mg到约2-10mg/kg体重每天。通
过任一常规施用方式，可施用用于本发明方法的SiRNA化合物。可以口服、
皮下或胃肠外(包含静脉、动脉、肌肉、腹腔内)施用该化合物，以及鼻
内和稍内施用，也可以使用灌注技术。化合物植入物也是可用的。为注射
制备液体形式，该术语包含皮下、透皮、静脉、肌肉、稍内和其它胃肠外
施用途径。液体组合物包含水性溶液，含有和不含有有机共-溶剂、水性或
油悬浮液、含可食用油乳化液，以及相似的药物媒介物。在特定的实施方
案中，该施用包含静脉施用。
能以每日一次、每日四次、每日三次、每日两次、QD，或以医学上恰
当的任一间隔和持续时间，施用包含本文公布的核酸分子的药物组合物。
然而，也可以以剂量单位施用组合物，该剂量单位包含2、3、4、5、6或
更多个亚-剂量(以在整天内的合理间隔施用)。
在一些实施方案中，将剂量单位复合为数天内使用的单剂，例如，使
用常规持续释放的制剂，该制剂可以在数天之内提供持续的和一致的
dsRNA释放。持续的释放制剂在该技术领域是熟知的。在某些实施方案中，
本发明的方法包括以持续的或可控的递送为目的，向受试者施用一种或多
种siRNA化合物。本发明的方法主要依赖肠胃外施用途径，更特定地使用
植入积存或积存注射，其可以延长生物试剂释放进入循环系统。用于肠胃
外递送系统的设备包括非-可注射的和可注射的设备。非-可注射的设备包
括植入物，例如siRNA积存植入物，或相似设备。已知的积存植入物包括
但不仅限于，合成的和自然的包含固体可生物降解的和非-可生物降解的聚
合体材料的物质，该聚合体材料包含泡沫、胶、基质等(含有一种或多种
葡聚糖、纤维蛋白、透明质酸、壳聚糖等)，而且泵和微泵系统在该领域
也是已知的。可注射的设备包括推注(化合物在注射后释放和消散在)，和
贮藏性或积存注射，其可以在注射部位提供储藏库或积存，使得生物试剂
得到超时的持续的释放。
本发明也提供了制备用于本发明方法的药物组合物的方法，其包含：
提供一种或多种双链的本发明化合物；和
使所述化合物与药学上可接受的载体混合。
本发明也提供了制备用于本发明方法的药物组合物的方法，其包含使
一种或多种本发明的siRNA化合物与药学上可接受的载体混合。
在优选的实施方案中，将用于制备药物组合物(用于本发明的方法)
的药学上有效剂量的siRNA化合物与载体混合。在特定的实施方案中，用
于本发明方法的siRNA化合物共轭地连接于类固醇、维生素或脂质或其他
合适的分子(例如胆固醇)。
下文用实施例来详细阐述本发明，但这不能被理解为是限制性的。
本文任一资料的引用不是旨在承认这些资料是相关的先进技术，或认
为这些材料涉及任何本申请或权利要求的专利性。关于任一资料的内容和
日期的任何申明，都是基于本申请人在提交时可以得到的信息，并不意味
着承认任何这些申明的正确性。
实施例
在分子生物学中的常见方法
在业内是已知的并且不做特别说明的标准分子生物学技术基本上依
据以下文献，Sambrook et al.，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，Cold
Spring Harbor Laboratory Press，New York(1989)、和Ausubel et al.，Current
Protocols in Molecular Biology，John Wiley and Sons，Baltimore，Maryland
(1989)and as in Perbal，A Practical Guide to Molecular Cloning，John Wiley &
Sons，New York(1988)、和Watson et al.，Recombinant DNA，Scientific
American Books，New York和Birren et al(eds)Genome Analysis：A
Laboratory Manual Series，Vols.1-4 Cold Spring Harbor Laboratory Press，
New York(1998)，以及如在美国专利4,666,828；4,683,202；4,801,531；
5,192,659和5,272,057中阐释的方法，并且通过引用的方式并入本文。聚
合酶链式反应(PCR)的操作是根据PCR标准：A Guide To Methods And
Applications，Academic Press，San Diego，CA(1990)。与Flow Cytometry结
合的原位(在细胞中)PCR能用于检测包含特定DNA和mRNA序列的细胞
(Testoni et al.，1996，Blood 87：3822.)，完成RT-PCR的方法在该技术领域是
熟知的。
实施例1：针对靶向基因的有效siRNA化合物序列的产生和siRNA制备
使用独有算法和已知靶基因序列，产生很多潜在siRNA序列。除了算
法以外，通过19-节链序列的5’和/或3’延长可以产生一些23-节链寡聚物
序列。这种方法产生的序列与相应的mRNA序列是完全互补的。
序列表：已经以序列表文件(标题为“209-PCT1_ST25.txt”创建于
2010-06-07，459kb)电子提交了本申请序列表(SEQ ID NO：1-SEQ ID NO：
119)。申请人通过引用序列表将其并入本说明书。
实施例2：在体外测试siRNA化合物
1.总体情况
约1.5-2x105将测试细胞(用于靶向人类基因的siRNA的HEPG2或PC3
细胞)接种到6孔板的每一个孔(70-80％汇合)。
24h后，使用最终浓度为500pM、5nM、20nM或40nM的
LipofectamineTM 2000试剂(Invitrogene)，以siRNA寡聚物转染细胞。在CO2
孵育器中，以37℃孵育细胞72h。
将使用以PTEN-Cy3标记的siRNA寡聚物的细胞转染作为阳性对照。
将使用以GFP标记的siRNA寡聚物的细胞转染作为阴性对照。
转染后约72h，获得细胞并从细胞提取RNA。通过荧光显微检查测试
转染效率。
使用qPCR分析在细胞中表达内源基因的靶基因，测定使用特定
siRNA对基因表达抑制百分率。
本发明化合物对靶基因的抑制性活性，或结合的本发明多种化合物对
靶基因的抑制性活性可以用来测定其它化合物与靶向多肽的互相作用，例
如，如果其它化合物为抑制靶基因与本发明寡核苷酸竞争，或如果其它化
合物促进所述抑制。通过多种方式测试所述抑制或激活，尤其地例如靶向
多肽活性产物检测，或在放射性或荧光竞争测定法中，结合化合物从靶向
多肽的取代。
实施例3：siP53化合物
QM5是化学修饰的靶向大鼠和小鼠p53的siRNA化合物，并被公开
于国际专利公开WO 2006/035434(转让给本发明的受让人之一)。QM5化
合物具有2条独立的链，分别是正义(SEN；乘客)和反义(AS；向导)链，
每条链包含在两条链上交替的未修饰的核糖核苷酸(大写字母)和2’-甲基氧
(2’-O-Me；2’-O-CH3)糖修饰的核糖核苷酸(小写字母)，这两条链形成如下
文所示的特殊形式：
正义(乘客)序列5’GaAgAaAaUuUcCgCaAaA 3’(SEQ ID NO：116
反义(向导)序列3’cUuCuUuUaAaGgCgUuUu 5’(SEQ ID NO：117)
I5化合物是19-节链钝化末端的双链核酸，它靶向人类p53基因(在
在应激反应细胞凋亡途径中发挥重要作用)。化合物具有两条独立的链，
分别是正义(SEN)和反义(AS)链，每条链包含在两条链上交替的未修饰的
核糖核苷酸(大写字母)和2’-甲基氧(2’-O-Me)糖修饰的核糖核苷酸(小写字
母)，这两条链形成如下文所示的特殊形式：
正义(乘客)序列5’GaGaAuAuUuCaCcCuUcA 3’(SEQ ID NO：118)
反义(向导)序列3’cUcUuAuAaAgUgGgAaGu 5’(SEQ ID NO：119)
为在人类受试者(处于和暴露于肾脏损害复发有关的慢性肾病CKD
的风险之中)中治疗或预防肾损坏，在每次肾脏损害24小时之内，将治
疗有效剂量的I5施用于受试者，从而治疗CKD。I5是WO 2006/035434
(转让给本发明的受让人之一)的主题。
实施例4：CKD模型系统
执行下列动物模型以支持本发明的方法。
(1)预防受试者中的CKD发展，该受试者在处于由多发性肾脏损害
引起的CKD的风险之中(由实施例4-1支持；
(2)预防CKD发展加速/发展，该CKD发展是由在有CKD背景的
受试者中的AKI急性发作导致的(由实施例4-2支持)；和
(3)减弱AKI(有CKD背景的)的严重性(由实施例4-2支持).
实施例4-1双侧肾动脉止血钳CKD模型
这种动物模型可用来评估用于预防CKD或减弱CKD发展的测试化合
物，该CKD由反复性AKI/ARF损害导致。
反复性AKI/ARF损害经常导致慢性肾病(CKD)恶化，CKD发展或
CKD发展(参见图1)。ARF是临床综合症，其特征在于在数天之内发生肾
脏功迅速恶化。不受理论束缚，急性肾损伤可归因于肾局部贫血-再灌注性
损伤，例如在正暴露于大手术(例如大心脏手术)的病人中的肾局部贫血
-再灌注性损伤。ARF的主要特征是肾小球滤过率(GFR)急剧下降，导致在
血液中含氮的废物(尿素、肌酸酐)滞留。最近的研究支持以下理论：就ARF
而言，在肾脏组织中的细胞凋亡在大多数人类中是显著地。凋亡细胞死亡
的主要位置是末端肾单位。在局部缺血损伤的初始阶段，肌动蛋白细胞骨
架的完整性丧失导致上皮扁平化(同时刷毛缘丧失、病灶细胞接触减少)
和随后细胞从基底的脱离。
如下所述并如图2所示，CKD大鼠模型包含反复性(5次)局部贫血-再
灌注-导致的ARF：
夹住双侧肾动脉止血钳45分钟并随后释放止血钳，给予24小时再灌
注之后，便可导致局部贫血-再灌注性损伤。在钳后4小时，将PBS或
QM5(大鼠siP53)(12mg/kg)静脉注射进入个体实验动物。通过在手术之前
(基准)和24小时、2天和7天之后检测血清肌酸酐(SCr)水平，监测ARF
发展。再重复做四个循环(30-天间隔)的处理(I/R损伤、QM5、SCr检测)，
前后总共五个循环。第5个循环后，测试7天24小时肌酸酐清除(CrCl)代
谢笼和尿液蛋白。代谢笼2天后外科摘除右肾(第5个循环后第10天)，并
且针对CKD在组织学生分析该肾脏。在右肾切除术3周后摘除左肾，并
利用活体双-光子显微检查在体内研究该肾(针对Cy3-siRNa摄取和滞留)。
结果
年龄一致的未处理的大鼠具有更均一的Cy3标记的siRNA的摄入和分
布。在初次注射24小时后，在细胞中siRNA水平的下降是明显的。而且
肾小管内腔基本上更舒张，只能观察到少量萎陷的内腔。
生理盐水处理的CKD大鼠具有更不均一的siRNA的分布(不调和)和
摄入。可观察到小管薄上皮和内腔显著扩张。在肾小管细胞中确实有摄入，
但比具有更正常形态的肾小管细胞周边摄入的水平低。在24小时，在这
些大鼠中的残余荧光比在年龄一致的未处理大鼠中的更多，也就是说标记
的siRNA的降解表现地比较低。
QM5处理的CKD大鼠所显示的摄入和分布的特征是处于龄一致的未
处理的组对照和生理盐水处理的CKD组对照之间。就个别领域来说，总
摄入是更均一的。囊性小管任然偶尔出现。QM5有助于Cy3-标记的siRNA
均一地递送到肾小管上皮，这种效果在大鼠#4中更明显。24小时siRNA
新陈代谢也处于年龄一致的未处理的大鼠和生理盐水处理的局部缺血大
鼠之间。在生理条件下，静脉注射后，在年龄一致的未处理的大鼠中Cy3-
标记的siRNA迅速地从肾小球滤过，并被近端小管细胞(PTC)选择性地摄
取。利用临界分析，量化在近端小管细胞中的总细胞和胞质累积，在120
分钟使出现最大值并在下一个四小时内迅速衰退。siRNA生物活性与荧光
半排出期密切相关。
图3显示了反复性局部缺血损伤后，p53siRNA对于肾功能的作用。
在用PBS或siP53(QM5)(12mg/kg)(在每次局部贫血AKI后4小时静脉施
用)处理的大鼠中，在每次局部贫血(AKI)循环之前，以及在每次局部贫血
循环后的第1、2和7天的血清肌酸酐水平。数据表示平均数+SD(n＝10/组)。
图4显示了siP53保护GFR和减少蛋白尿。PBS治疗的动物的测量结
果以阴影柱显示，同时QM5治疗的动物的测量结果以实心柱显示。
下文中的表2显示了，在5个月的局部缺血损伤循环之后，siP53对
肾功能的作用：siP53保护肾小球滤过率和减少蛋白尿。在最后1个(第5
个)AKI循环后7天内，通过24小时尿液收集和尾部血液收集，测定肾小
球滤过率(GFR)和蛋白尿(Uprot)。组：PBS-在每次局部缺血损伤后4小时，
对大鼠静脉施用PBS；QM5-在每次局部缺血损伤后4小时静脉施用
siP53(12mg/kg)。数据代表平均数+SD(n＝10/组)
表2：
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图5显示了在第5个AKI循环后10天所得到的右肾组织病理学评分。
在最后(第5次)一次局部缺血损伤后，对大鼠(每月局部缺血损伤后4小以
PBS或siP53处理时)进行右肾切除术。由受广泛认可的病理学者对得到的
右肾切片进行摸索性的分析。至少分析每只大鼠的2个典型的肾切片。分
析急性(肾小管坏死、肾小管膨胀、管型)和慢性(肾小球损坏、间质细胞渗
透、间质纤维化、肾小管状态和血管病)损坏参数。总体急性和总体慢性损
伤评分是所有各自的慢性或急性损坏参数的和。总体病理学评分是每只大
鼠的急性和慢性损伤评分的和。根据下面的评分系统，对病理学上的改变
进行评级：
级别0-无病理学上的改变；级别1-特征在于包含1到10％的范围(轻
微和病灶)；级别2-特征在于包含10到25％的范围(中等和多病灶)；级别
3-特征在于包含25到75％的范围(弥漫但没有正常结构损坏)；级别4-特
征在于包含多于75％的范围(弥漫并且有正常肾结构的显著损坏)。数据代
表平均数+SD(n＝10/组)。
实施例4-2全肾切除术和高盐食物
这种动物模型用于评估用于减低/减弱有CKD背景的AKI/ARF的测试
化合物，从而为预防CKD(由在CKD病人中的复发性AKI/ARF损害引起)
的恶化或发展提供模型，以及为在遭受CKD痛苦的病人中减弱AKI严重
性(他暴露于可以引起AKI的过程或事件)提供模型。
图6显示了用于建立CKD的研究设计。总地来说，在3或4个反复
性AKI月循环(直到SCr和GFR值处于CKD水平)之前，对SD大鼠进行
右肾切除术。第一个AKI循环包含用左蒂钳钳住45分钟，而下面的所有
AKI包含钳住30分钟。整个周期始终，用高盐食物喂养大鼠。3或4个循
环后，得到升高的肾功能参数：血清肌酸酐(SCr)、GFR和尿液蛋白。
当血清肌酸酐(SCr)水平是高于0.8mg/ml且肾小球滤过率(GFR)是少于
0.60ml/min/100gr时，可以认为该动物患有中等到严重的CKD。另外，3
只大鼠被切除全肾并且以常规食物喂养相同的如上面的总时间段(7-8月)。
在该时间段末期，他们的SCr、GFR和Uprot是升高的。结果如下文表3
所示：
表3
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*Zaladek-Gil et al(1999)，Braz J Med Biol Res，32：107-113；Chamberlain et al，
(2007)Exp Physiol，92：251-262
图7显示了在分组得动物中的肾功能参数(在AKI/ARF损害和siP53
治疗之前)。经过测试SCr、GFR和尿液蛋白(Uprot)水平，结果显示，相比
全肾切除的接受正常食物的动物，全肾切除的接受高盐食物的动物表现出
更严重的CKD。在最后一次AKI损害后4小时，通过静脉注射，对CKD
和对照动物施用siP53或siGFP(12mg/kg)或媒介物。图8显示了在患有CKD
的动物中，siP53(QM5)对于预防AKI损害的效果。
图9A-9H显示了急性损伤(9A-9C)和慢性损伤(9D-9H)的组织病理学参
数。组织病理学的评分系统如下所示：0：无；1：轻微和病灶；2：中等和多
病灶；3：弥漫但没有正常结构损坏；4：弥漫且有显著的正常结构损坏。
在siP53处理的动物中，所有急性参数肾小管坏死、肾小管膨胀和尿管型
得到改善。在处理的动物中，慢性损伤参数肾小球损坏、间质细胞渗透、
间质纤维化和肾小管萎缩得到降低。
在处理的和未处理的动物中，急性和慢性损伤的平均组织病理学评分
如图10所示。
虽然已经图解和描述了某些本发明的实施方案，但是明显的是本发明
不限于这些本文所述的实施方案。在不偏离所附权利要求所述的本发明的
范围的条件下，本领域熟练的技术人员意识到修饰、改变、变化、代替和
等同形式。
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