技术领域
本发明涉及一种组织填充剂及其制备方法，更具体地说，涉及一种用于皮肤缺损的修 复剂及其制备方法。
背景技术
人体软组织填充是作为修复软组织在损伤后的主要治疗方法。十九世纪就已经开始使 用石蜡、硅氧烷进行填充。上个世纪八十年代之后又出现了明胶粉末材料，但其均有疗效 不确定，毒副作用大等问题。
1997年之后，Isolagen采用自体成纤维细胞作为组织填充材料，有了一定的疗效，但 存在显效慢，疗效不显著等问题。
中国专利03155833.X中公开了一种除皱祛疤的注射剂，应用了自体皮肤，经体外分离、 培养和扩增，制成于葡萄糖液中的一种注射剂，治疗疤痕和祛除皱纹。由于该技术使用的 生物材料取自患者自体，无排斥反应，效果持久，但该技术的不足之处是，注射剂中能立 即发挥人体软组织的填充和修复功能的胶原蛋白含量较低，导致注射到疤痕和皱纹处后见 效较慢，一般要4-6个月；另外，使用动物血清作为培养液的成分也可能存在安全性方面 的问题。
发明内容
本发明的目的是克服现有技术的不足，提供一种起效快、疗效持久、受术者满意度高的 用于皮肤缺损的修复剂。
本发明的第二个目的是提供一种用于皮肤缺损的修复剂的制备方法。
本发明的第三个目的是提供一种用于皮肤缺损的修复剂的用途。
本发明的技术方案概述如下：
一种用于皮肤缺损的修复剂，所述修复剂是每毫升液体中含1000-5000万个细胞；所 述细胞是用新生儿切除的包皮皮肤经体外低血清原代培养和传代扩增后收集到真皮成纤维 干细胞、成纤维前体细胞和成纤维细胞，所述液体是将体积比为1∶0.5-2的氨基酸注射液 和5％的葡萄糖注射液混合制成。
一种用于皮肤缺损的修复剂的制备方法，包括以下步骤：
(1)采用新生儿切除的包皮皮肤(包括表皮和真皮，例如，1-30平方毫米的皮肤)在 含有生长因子、活性材料和质量浓度为0.5％～5％的胎牛血清的基础培养液中采用组织块培 养法进行原代培养；(而传统培养基通常加入约10％的新生牛血清)，上述培养基对于细胞生 长、增殖、形态、活性和功能的影响有所改善；
(2)在含有生长因子和活性材料的基础培养液中进行传代扩增；
(3)将收集到的真皮成纤维干细胞、成纤维前体细胞、成纤维细胞中加入体积比为 1∶0.5-2的氨基酸注射液和质量浓度为5％的葡萄糖注射液，制成每毫升液体中含1000-5000 万个细胞的用于皮肤缺损的修复剂。
所述生长因子为上皮生长因子和成纤维生长因子；所述上皮生长因子在基础培养液中 的含量为1-5纳克/毫升；所述成纤维生长因子在基础培养液中的含量为2-20纳克/毫升。
优选的是所述上皮生长因子在基础培养液中的含量为3纳克/毫升；所述成纤维生长因 子在基础培养液中的含量为10纳克/毫升。
所述活性材料为氢化可的松和肝素；所述氢化可的松在基础培养液中的含量为0.2-2 微克/毫升；所述肝素在基础培养液中的含量为2-20微克/毫升。
优选的是所述氢化可的松在基础培养液中的含量为1微克/毫升；所述肝素在基础培养 液中的含量为10微克/毫升。
上述用于皮肤缺损的修复剂在治疗皮肤缺损中的应用。
与现有技术相比，本发明的用于皮肤缺损的修复剂更具有细胞活性、扩增性，在外用部 位与自体皮肤组织产生共同作用且不排异，能产生快速填充和修复皮肤缺损的效果；随后， 用于皮肤缺损的修复剂中含有的细胞成分能不断地分泌出胶原蛋白，保持填充和修复的效 果，可广泛用于凹陷性疤痕的修复。外用后一周可出现明显的填充和修复效果，且疗效持久， 治疗程序简便。
附图说明
图1是实施例5培养成功的传代真皮成纤维干细胞在100倍光学显微镜下形态学照片；
图2是本发明实施例5的一个患者具体治疗凹陷性疤痕前后的对比照片。
具体实施方式
下面通过具体实施例对本发明作进一步的说明，此说明只是为了使本领域的技术人员 能够更好地理解本发明，但并不对本发明进行任何限制。
本发明所采用的基础培养液是本领域常用的基础培养液，可以参见《细胞实验指南》 (2001年，科学出版社出版，主编：D.L.斯佩克特，黄培唐翻译)。
实施例1
一种用于皮肤缺损的修复剂，所述修复剂是每毫升液体中含3000万个细胞；所述细胞 是用新生儿切除的包皮皮肤经体外低血清原代培养和传代扩增后收集到的真皮成纤维干细 胞、成纤维前体细胞和成纤维细胞，所述液体是将体积比为1∶1的氨基酸注射液和5％的葡 萄糖注射液混合制成。
实施例2
一种用于皮肤缺损的修复剂，所述修复剂是每毫升液体中含2000万个细胞；所述细胞 是用新生儿切除的包皮皮肤经体外低血清原代培养和传代扩增后收集到的真皮成纤维干细 胞和成纤维前体细胞，所述液体是将体积比为1∶0.5的氨基酸注射液和5％的葡萄糖注射液 混合制成。
实施例3
一种用于皮肤缺损的修复剂，所述修复剂是每毫升液体中含1000万个细胞；所述细胞 是用新生儿切除的包皮皮肤经体外低血清原代培养和传代扩增后收集到的真皮成纤维干细 胞和成纤维细胞，所述液体是将体积比为1∶2的氨基酸注射液和5％的葡萄糖注射液混合制 成。
实施例4
一种用于皮肤缺损的修复剂，所述修复剂是每毫升液体中含5000万个细胞；所述细胞 是用新生儿切除的包皮皮肤经体外低血清原代培养和传代扩增后收集到的成纤维前体细胞， 所述液体是将体积比为1∶1.5的氨基酸注射液和质量浓度为5％的葡萄糖注射液混合制成。
实施例5
一种用于皮肤缺损的修复剂的制备方法，包括以下步骤：
(1)皮肤取材：用酒精消毒新生儿切除的包皮；用手术剪刀将表皮和真皮组织取下，放入 组织保存液中；
(2)皮肤组织培养前处理：将皮肤组织块放置于培养皿中清洗，去除皮下组织和脂肪，取 20平方毫米的包括表皮和真皮的包皮皮肤剪碎为0.1-0.5平方毫米的碎片，平铺于培养皿的 底面；
(3)在已平铺皮肤碎片的培养皿中加入含有生长因子、活性材料和质量浓度为3％的胎牛 血清的基础培养液中采用组织块培养法进行原代培养，使细胞扩增到80％的培养皿底面；
(4)在含有生长因子和活性材料的基础培养液中进行传代扩增，培养4周；
(5)将培养的细胞用胰蛋白酶进行消化处理，使其脱离培养皿底面，再使用无外源性蛋 白的DMEM清洗3次，去除外源性生长因子和活性物质，再将收集到的真皮成纤维干细胞、 成纤维前体细胞、成纤维细胞，加入体积比为1∶1的氨基酸注射液和5％的葡萄糖注射液， 制成每毫升液体中含3000万个细胞的用于皮肤缺损的修复剂。
在步骤(3)和(4)生长因子为上皮生长因子和成纤维生长因子，上皮生长因子在培 养液中的含量为3纳克/毫升；成纤维生长因子在培养液中的含量为10纳克/毫升；
活性材料为氢化可的松和肝素；氢化可的松在基础培养液中的含量为1微克/毫升； 肝素在基础培养液中的含量为10微克/毫升。
实施例6
一种用于皮肤缺损的修复剂的制备方法，包括以下步骤：
(1)皮肤取材：用酒精消毒新生儿切除的包皮；用手术剪刀将表皮和真皮组织取下，放入 组织保存液中；
(2)皮肤组织培养前处理：将皮肤组织块放置于培养皿中清洗，去除皮下组织和脂肪，取 10平方毫米的包括表皮和真皮的包皮皮肤剪碎为0.1-0.5平方毫米的碎片，平铺于培养皿的 底面；
(3)在已平铺皮肤碎片的培养皿中加入含有生长因子、活性材料和质量浓度为3％的胎牛 血清的基础培养液中采用组织块培养法进行原代培养，使细胞扩增到80％的培养皿底面；
(4)在含有生长因子和活性材料的基础培养液中进行传代扩增，培养4周；
(5)将培养的细胞用胰蛋白酶进行消化处理，使其脱离培养皿底面，再使用无外源性蛋 白的DMEM清洗3次，去除外源性生长因子和活性物质，再将收集到的真皮成纤维干细胞、 成纤维前体细胞、成纤维细胞中加入体积比为1∶0.5的氨基酸注射液和5％的葡萄糖注射液， 制成每毫升液体中含2000万个细胞的用于皮肤缺损的修复剂。
在步骤(3)和(4)生长因子为上皮生长因子和成纤维生长因子；上皮生长因子在基 础培养液中的含量为1纳克/毫升；成纤维生长因子在培养液中的含量为20纳克/毫升；
活性材料为氢化可的松和肝素；氢化可的松在基础培养液中的含量为0.2微克/毫升； 肝素在基础培养液中的含量为20微克/毫升。
实施例7
一种用于皮肤缺损的修复剂的制备方法，包括以下步骤：
(1)皮肤取材：用酒精消毒新生儿切除的包皮；用手术剪刀将表皮和真皮组织取下，放入 组织保存液中；
(2)皮肤组织培养前处理：将皮肤组织块放置于培养皿中清洗，去除皮下组织和脂肪，取 30平方毫米的包括表皮和真皮的包皮皮肤剪碎为0.1-0.5平方毫米的碎片，平铺于培养皿的 底面；
(3)在已平铺皮肤碎片的培养皿中加入含有上皮生长因子、活性材料和质量浓度为5％的 胎牛血清的基础培养液中采用组织块培养法进行原代培养，使细胞扩增到75％的培养皿底 面；
(4)在含有上皮生长因子、活性材料的基础培养液中进行传代扩增，培养4周；
(5)将培养的细胞用胰蛋白酶进行消化处理，使其脱离培养皿底面，再使用无外源性蛋 白的DMEM清洗3次，去除外源性生长因子和活性物质，再将收集到的真皮成纤维干细胞、 成纤维前体细胞、成纤维细胞中加入体积比为1∶2的氨基酸注射液和5％的葡萄糖注射液， 制成每毫升液体中含1000万个细胞的用于皮肤缺损的修复剂。
在步骤(3)和(4)生长因子为上皮生长因子和成纤维生长因子；上皮生长因子在基 础培养液中的含量为5纳克/毫升；成纤维生长因子在培养液中的含量为10纳克/毫升；
活性材料为氢化可的松和肝素；氢化可的松在基础培养液中的含量为2微克/毫升；肝 素在基础培养液中的含量为20微克/毫升。
实施例8
一种用于皮肤缺损的修复剂的制备方法，包括以下步骤：
(1)皮肤取材：用酒精消毒新生儿切除的包皮；用手术剪刀将表皮和真皮组织取下，放入 组织保存液中；
(2)皮肤组织培养前处理：将皮肤组织块放置于培养皿中清洗，去除皮下组织和脂肪，取 10平方毫米的包括表皮和真皮的包皮皮肤剪碎为0.1-0.5平方毫米的碎片，平铺于培养皿的 底面；
(3)在已平铺皮肤碎片的培养皿中加入含有上皮生长因子、活性材料和质量浓度为0.5％ 的胎牛血清的基础培养液中采用组织块培养法进行原代培养，使细胞扩增到80％的培养皿 底面；
(4)在含有上皮生长因子、活性材料的基础培养液中进行传代扩增，培养4周；
(5)将培养的细胞用胰蛋白酶进行消化处理，使其脱离培养皿底面，再使用无外源性蛋白 的DMEM清洗3次，去除外源性生长因子和活性物质，再将收集到的真皮成纤维干细胞、成 纤维前体细胞、成纤维细胞中加入体积比为1∶1.5的氨基酸注射液和质量浓度为5％的葡萄 糖注射液，制成每毫升液体中含5000万个细胞的用于皮肤缺损的修复剂。
在步骤(3)和(4)生长因子为上皮生长因子和成纤维生长因子；上皮生长因子在基 础培养液中的含量为5纳克/毫升；成纤维生长因子在培养液中的含量为2纳克/毫升；
活性材料为氢化可的松和肝素；氢化可的松在基础培养液中的含量为2微克/毫升；肝 素在基础培养液中的含量为2微克/毫升。
实施例9
对各实施例1-8中的原料及培养细胞进行病毒检测：包皮皮肤组织和培养4周后的细 胞进行HIV和肝炎病毒的检验，确定为无病毒细胞。
免疫反应测试：将培养第4周的细胞制成0.1ml细胞注射液(溶剂∶体积比为1∶1的 氨基酸注射液和5％的葡萄糖注射液)对受术者进行皮试(同青霉素皮试方法)，无免疫反 应。
成品检测：
1)外观：细胞与血小板注射液为浅黄色混悬液。
2)本品中细胞分类检定：
真皮成纤维干细胞：采用Brdu抗体测定(黄晖，赖西南，王正国，王丽丽，“创伤愈合 中物质对表皮干细胞迁移及受体表达的作用”；《中华创伤杂志》2004年；20(3)142-145。 利用核标记物)，产品中有10％的成纤维干细胞。
成纤维前体细胞：采用细胞形态学方法观察(在100倍光学显微镜下做形态学观察， 其标准形态为细小长索状)，产品中有70％的成纤维前体细胞。
成纤维细胞：采用细胞形态学方法观察(在100倍光学显微镜下做形态学观察，其 标准形态为呈多触突的长索形细胞)，产品中有20％的成纤维细胞。
3)无菌试验：按《中国生物制品规程》(2000版)通则《生物制品无菌试验规程》A/B 项进行，结果符合无菌要求。
实施例10
治疗：用于凹陷性疤痕；共32例，采用实施例5-8制备的一种用于皮肤缺损的修复剂进行 治疗，每个实施例治疗8例。
1.治疗者术前检查(其中：男21例，女11例，年龄在16-25岁)，各项指标均正常， 包括：血尿便常规、心电图、肝肾功能、HIV、HbsAg。
2.将耳后部位皮肤用70％的酒精消毒，局部注射1％的利多卡因麻醉，取3*7mm2的全层 皮肤组织，伤口做三针缝合。
3.将自体皮肤组织剪碎后与本发明的一种用于皮肤缺损的修复剂混匀后备用。
4.将皮肤缺损部位用微晶进行磨削，至出血为止，将步骤3获得的混合物敷在缺损表 面，盖上敷料，用胶布固定。
5.每天向敷料内注入一种用于皮肤缺损的修复剂1ml，一周后去掉敷料，治疗过程完 成。
术后观察、调护：
1.观察局部及全身的情况：一切正常。
2.每天二次口服维生素C(每次200mg，每天共400mg)，服用6个月。
3.术后一个月内防曝晒及慎用刺激性化妆品。
效果描述：疤痕在敷料去除一个月后，32例病人凹陷性疤痕基本填平，效果良好。注射前 后的效果对比见图2(实施例5)。