胆汁酸结合剂、 血清胆固醇量降低剂以及使血清胆固醇量 降低的方法 技术领域 本发明涉及以具有胆汁酸结合能力的来源于蜂王浆的蛋白质作为有效成分的胆 汁酸结合剂以及血清胆固醇量降低剂， 还涉及使用该蛋白质降低血清胆固醇量的方法。
背景技术 据世界卫生组织 (WHO) 统计， 世界上排在第一位的死因是动脉硬化症等心血管疾 病。认为血液中的 LDL- 胆固醇浓度过高是动脉硬化症的主要原因， 为了改善胆固醇代谢， 急需研发出更有效的医药品以及功能性食品。
近年来， 有报道称 ： 通过摄取蜂王浆， 可以改善高胆固醇血症 ( 例如， 参考非专利 文献 1 ～ 4)。此外， 还有报道称 ： 蜂王浆中除了含有 12 ～ 15％的一般性成分粗蛋白质以 外， 还含有特殊成分 10- 羟基癸烯酸和蜂王浆抗菌蛋白 (royalisin)， 所述 10- 羟基癸烯酸 可以使高脂血症大鼠血液中的甘油三酯、 总胆固醇的量减少 ( 例如， 参考非专利文献 5)。
另一方面， 公开了如下方法 ： 使用填充了结合有胆酸的载体的柱子作为胆汁酸结 合型亲和色谱柱 ( 用于具有胆汁酸结合能力的成分的亲和色谱柱 )， 将血清白蛋白分离的 方法 ( 例如， 参考非专利文献 6) ； 使用胆汁酸结合型亲和色谱柱， 从大豆蛋白质中分离并鉴 定具有胆汁酸结合能力的蛋白质的方法 ( 例如， 参考非专利文献 7 和 8) 等。
现有技术文献
非专利文献
非专利文献 1 ： Nakajin， 其他 4 人， 生药学杂志， 1982 年， 第 36 卷， 第 65-69 页。
非专利文献 2 ： Vittek， Experientia， 1995 年， 第 51 卷， 第 927-935 页。
非 专 利 文 献 3： Guo，其 他 6 人， Journal of Nutritional Science and Vitaminology， 2007 年， 第 53 卷， 第 345-348 页。
非专利文献 4 ： Kamakura， 其他 2 人， Journal of pharmacy and pharmacology， 2006 年， 第 58 卷， 第 1683-1689 页。
非专利文献 5 ： Xu， 其他 2 人， Zhong Yao Cai(Journal of Chinese medicinal materials)， 2002 年， 第 25 卷， 第 346-347 页。
非专利文献 6 ： Pattinson， 其他 2 人， Journal of Chromatography， 1980 年， 第 187 卷， 第 409-412 页。
非专利文献 7 ： Makino， 其他 4 人， Agricultural and Biological Chemistry， 1988 年， 第 52 卷， 第 803-809 页。
非专利文献 8 ： Minami， 其他 3 人， Agricultural and Biological Chemistry， 1990 年， 第 54 卷， 第 511-517 页。
发明内容
发明要解决的问题此外， 蜂王浆 ( 以下称作 RJ) 是从工蜂的下咽头腺和大颚腺分泌的乳白色胶状营 养物质。蜂王浆是女王蜂幼虫的唯一食粮， 含有各种维生素类、 矿物质、 糖类、 氨基酸、 蛋白 质成分， 营养价值非常高。 此外， 虽然未经科学证明， 但一直以来被认为具有疲劳恢复作用、 抗过敏作用、 抗癌作用、 增强免疫力作用等多种药理作用， 被广泛用作营养补品、 医药品原 料等。因此， 通过将 RJ 来源的成分作为有效成分， 期待能够研发出用于预防 / 改善高胆固 醇血症的安全的新食品、 医药品。
RJ 中含有各种成分， 因此， 为了研发新的医药品、 功能性食品， RJ 中有效成分的确 定是不可或缺的。然而， 在非专利文献 1 ～ 4 中， 可以明确 RJ 本身对胆固醇血症具有改善 效果， 但对于其有效成分却完全不明确， 其作用机制也是未知的。
本发明的目的在于提供一种以 RJ 中含有的特定成分作为有效成分的胆汁酸结合 剂以及使用该特定成分使血清胆固醇量降低的方法， 所述特定成分具备胆汁酸结合能力、 高胆固醇血症改善能力。
解决问题的方法
为了解决上述问题， 本发明人等进行了深入的研究， 使用胆汁酸结合型亲和色谱 柱从 RJ 中确定了多个具有胆汁酸结合能力的成分， 并对这些成分的胆汁酸结合能力、 对血 清胆固醇的影响进行了研究， 从而完成了本发明。
即， 本发明提供 ：
(1) 一种胆汁酸结合剂， 其特征在于， 以选自 MRJP1、 MRJP2 和 MRJP3 中的一种以上 作为有效成分。
(2) 一种血清胆固醇量降低剂， 其特征在于， 以 MRJP1 作为有效成分。 (3) 一种胆固醇胶束的溶解抑制剂， 其特征在于， 以 MRJP1 作为有效成分。
(4) 一种使血清胆固醇量降低的方法， 其特征在于， 口服摄取 MRJP1。
发明的效果
对于本发明的胆汁酸结合剂、 使血清胆固醇量降低的方法， 可以通过口服 RJ 来源 的胆汁酸结合剂， 安全地使血清胆固醇量降低。因此， 期待本发明的胆汁酸结合剂等， 对于 血清中胆固醇量增加引起的疾病， 特别是高胆固醇血症、 动脉硬化症等具有预防 / 治疗效 果。
附图说明 图 1 为图表， 表示的是 ： 在参考例 1 中， 通过使用了胆汁酸结合型亲和色谱柱的柱 色谱对 BSA 溶液和卵清蛋白 (Ovalbumin) 溶液进行分级时， 各级分的迁移率和 280nm 的吸 光度之间的关系。
图 2 为图表， 表示的是 ： 在实施例 1 中， 通过使用了胆汁酸结合型亲和色谱柱的柱 色谱对 RJ 蛋白质溶液进行分级时， 各级分的迁移率和 280nm 的吸光度之间的关系。
图 3 表示的是 ： 在实施例 1 中， 通过使用了胆汁酸结合型亲和色谱柱的柱色谱对 RJ 蛋白质溶液进行分级， 并将所得各级分进行 10％的 SDS-PAGE 后得到的 CBB 染色图像。
图 4 为图表， 表示的是 ： 在实施例 2 中， 通过凝胶过滤色谱对 RJ 蛋白质溶液进行分 级时， 各级分的迁移率和 280nm 的吸光度之间的关系。
图 5 表示的是 ： 在实施例 2 中， 由标准品的迁移率和分子量得到的校正曲线的图。
图 6 表示的是 ： 在实施例 2 中， 通过将分子量约为 290kDa 的级分进行 15 ％的 SDS-PAGE 后得到的 CBB 染色图像。
图 7 表示的是 ： 在 实 施 例 2 中， 通 过 将 分 子 量 约 为 51kDa 的 级 分 进 行 15 ％ 的 SDS-PAGE 后得到的 CBB 染色像图。
图 8 为图表， 表示的是 ： 在实施例 2 中， 通过阴离子色谱对分子量约为 51kDa 的级 分进行分级时， 各级分的迁移率和 280nm 的吸光度之间的关系。
图 9 表示的是 ： 在实施例 2 中， 对通过阴离子色谱得到的峰 1 ～ 4 进行 15 ％的 SDS-PAGE 后得到的 CBB 染色图像。
图 10 表示的是 ： 在实施例 2 中， 通过胆汁酸结合能力试验计算出的与各分子结合 的胆汁酸的比例。
图 11 表示的是 ： 在实施例 3 中， 胆固醇在胶束中的溶解比例。
图 12 表示的是 ： 在实施例 4 中， 向大鼠口服给药 MRJP1 的试验概要图。
图 13 表示的是 ： 在实施例 4 中， 向大鼠口服给药 MRJP1 的试验中， 各大鼠组的体重 变化图。
图 14 表示的是 ： 在实施例 4 中， 向大鼠口服给药 MRJP1 的试验中， 各大鼠组每日摄 食量的图。 图 15 表示的是 ： 在实施例 4 中， 向大鼠口服给药 MRJP1 的试验中， 各大鼠组的肝脏 重量的图。
图 16 表示的是 ： 在实施例 4 中， 向大鼠口服给药 MRJP1 的试验中， 各大鼠组的血清 总胆固醇量的图。
图 17 表示的是 ： 在实施例 5 中， 向大鼠口服给药 MRJP1 的试验中， 各大鼠组的体重 变化的图。
图 18 表示的是 ： 在实施例 5 中， 向大鼠口服给药 MRJP1 的试验中， 各大鼠组每日摄 食量的图。
图 19 表示的是 ： 在实施例 5 中， 向大鼠口服给药 MRJP1 的试验中， 各大鼠组的肝脏 重量的图。
图 20 表示的是 ： 在实施例 5 中， 向大鼠口服给药 MRJP1 的试验中， 各大鼠组的血清 总胆固醇量的图。
具体实施方式
本发明的胆汁酸结合剂以选自 MRJP1(Major royal jelly protein 1)、 MRJP2 和 MRJP3 中的一种以上作为有效成分。如后文实施例所示， MRJP1、 MRJP2 和 MRJP3 是通过使用 胆汁酸结合型亲和色谱柱， 从 RJ 中首次分离 / 鉴定的胆汁酸结合蛋白质。使用了胆汁酸结 合亲和色谱的胆汁酸结合蛋白质的分离 / 鉴定法， 是本发明人首次应用于 RJ 的。
MRJP1 是占 RJ 中所含全部蛋白质的约 39.4％的蛋白质， MRJP2 是占 RJ 中所含全部 蛋白质的约 21.5％的蛋白质， MRJP3 是占 RJ 中所含全部蛋白质的约 21.2％的蛋白质 ( 泉 宏树、 米仓政实著。 「ロ一ヤルゼリ一タンパク質のプロテオ一ム解析」 (“蜂王浆蛋白质 的蛋白质组解析” ) 社团法人全国蜂王浆公平交易协会、 平成 20 年度报告书 (2008 年 )、 第 21 页 )。公知 MRJP1 是由 432 个氨基酸形成的蛋白质， 通常在 SDS-PAGE 中， 其分子量约为 55kDa(J.Schmitozova et.al， Cell.Mol.Life Sci.， vol54， p1020-1030(1998))。 此外， 在美利坚合众国的 NCBI( 国立生物工学信息中心 ) 的序列数据库中， MRJP1 注册 为 Accession 编号 NP_001011579。公知 MRJP2 是由 452 个氨基酸形成的蛋白质， 通常在 SDS-PAGE 中， 其分子量约为 49kDa(J.Schmitozova et.al， Cell.Mol.Life Sci.， vol54， p1020-1030(1998))。此外， MRJP2 在 NCBI 的 Accession 编号为 NP_001011580。MRJP3 是由 544 个氨基酸形成的蛋白质， 通常在 SDS-PAGE 中， 其分子量为 60 ～ 70kDa(J.Schmitozova et.al， Cell.Mol.Life Sci.， vol54， p1020-1030(1998))。 此外， MRJP3 在 NCBI 的 Accession 编号为 NP_001011601。
以下， 将上述蛋白质统称为 “本发明的 RJ 来源的胆汁酸结合蛋白质” 。
进一步地， 在本发明中， 只要不损害 MRJP1、 MRJP2 或 MRJP3 所具有的胆汁酸结合能 力， MRJP1、 MRJP2 或 MRJP3 中的 1 ～数个氨基酸可以缺失、 被取代或被加成。上述氨基酸被 加成等的蛋白质， 也可以作为本发明胆汁酸结合剂的有效成分。例如， 可以在 MRJP1、 MRJP2 或 MRJP3 的 N 末端、 C 末端分别加成 1 ～ 10 个， 优选 1 ～ 5 个氨基酸。作为加成于本发明 的 RJ 来源的胆汁酸结合蛋白质的 N 末端、 C 末端的氨基酸序列， 可以列举 His-Tag 等常规 的用于生成重组蛋白的 Tag 序列等。
在本发明的 RJ 来源的胆汁酸结合蛋白质中， MRJP1 除了具有胆汁酸结合能力以 外， 还具有降低对胆固醇胶束的溶解作用， 和降低血清胆固醇量的作用。即， 本发明的 RJ 来 源的胆汁酸结合蛋白质适合用作胆固醇胶束的溶解抑制剂和血清胆固醇量的降低剂的有 效成分。需要说明的是， 由 MRJP1 中 1 ～数个氨基酸缺失、 被取代或被加成的氨基酸序列形 成且具有胆固醇胶束的溶解抑制能力、 血清胆固醇量降低能力的蛋白质， 与 MRJP1 相同， 也 适合用作胆固醇胶束的溶解抑制剂和血清胆固醇量的降低剂的有效成分。
食物来源的胆固醇， 与卵磷脂、 脂肪酸、 胆汁酸等形成胶束， 变为水溶性的， 通过非 搅拌水层 (UWL) 被小肠吸收。由所述胆固醇在小肠中的吸收机制， 推测本发明的 RJ 来源的 胆汁酸结合蛋白质通过在小肠内与胆汁酸结合， 可以抑制胆固醇胶束的形成， 其结果， 抑制 胆固醇的吸收。
作为本发明的胆汁酸结合剂、 胆固醇胶束的溶解抑制剂以及血清胆固醇量降低剂 ( 以下， 胆汁酸结合剂等 ) 的有效成分的 RJ 来源的胆汁酸结合蛋白质， 可以是由 RJ 纯化的 物质， 也可以是通过基因重组技术在公知的表达体系中合成的重组蛋白， 还可以是通过肽 合成得到的合成品。例如， 通过胆汁酸结合型亲和色谱对 RJ 蛋白质溶液进行分级时， 回收 含有 RJ 来源的胆汁酸结合蛋白质的级分。可以将上述回收的级分作为本发明的胆汁酸结 合剂等有效成分。此外， 通过凝胶过滤色谱对 RJ 蛋白质溶液进行分级时， 回收含有 MRJP1、 MRJP2 或 MRJP3 的级分。 可以将上述回收的级分作为本发明的胆汁酸结合剂等的有效成分。
本发明的胆汁酸结合剂等， 可以作为医药品、 补充剂等饮食品单独摄入， 也可以像 其他的饮食用组合物、 医药用组合物那样， 作为饮食品、 医药品的添加剂使用。
本发明的胆汁酸结合剂等的剂型， 没有特别的限定。 可以是例如软胶囊剂、 硬胶囊 剂、 片剂、 颗粒剂、 散剂、 液剂、 软膏剂、 乳膏剂、 凝胶剂等。用于细胞培养等时， 优选干燥粉 末、 溶解在水、 缓冲液等适当溶液中形成的液剂。 另一方面， 用于生物个体时， 优选适于口服 给药的剂型， 进一步优选肠溶剂。
本发明的胆汁酸结合剂等中含有的 RJ 来源的胆汁酸结合蛋白质， 可以仅是 1 种，也可以是 2 种以上的组合。此外， 上述胆汁酸结合剂等中含有的 RJ 来源的胆汁酸结合蛋白 质的量， 只要是能够发挥出 ： 该 RJ 来源的胆汁酸结合蛋白质的胆汁酸结合能力、 胆固醇胶 束溶解抑制能力或者血清胆固醇降低能力即可， 并无特别限定， 可以考虑 RJ 来源的胆汁酸 结合蛋白质的种类、 剂型等适当进行决定。
本发明的胆汁酸结合剂等， 可以仅由本发明的 RJ 来源的胆汁酸结合蛋白质形成， 也可以含有其他成分。作为其他成分， 只要不损害本发明的 RJ 来源的胆汁酸结合蛋白质的 活性即可， 可以是任何成分， 例如， 可以含有除本发明 RJ 来源胆汁酸结合蛋白质以外的 RJ 来源的成分， 也可以含有具备胆汁酸结合能力、 血清胆固醇降低能力的功能性肽。此外， 本 发明的胆汁酸结合剂等可以含有医药品、 饮食品中可添加的成分， 例如赋形剂、 粘合剂、 表 面活性剂、 抗氧化剂、 pH 调节剂、 崩解剂、 润滑剂、 防腐剂、 杀菌剂、 着色剂、 矫味矫臭剂等。
例如， 以选自 MRJP1、 MRJP2 和 MRJP3 的 1 种以上作为有效成分的血清胆固醇量降 低剂， 优选进一步含有 10- 羟基癸烯酸作为有效成分。其中， 优选以 MRJP1 和 10- 羟基癸烯 酸作为有效成分的血清胆固醇量降低剂。 如上所述， 10- 羟基癸烯酸具有降低高脂血症大鼠 血液中的甘油三酯、 总胆固醇的效果， 通过与 MRJP1 等组合使用， 可以实现更加显著地降低 血清胆固醇的作用。对于血清胆固醇量降低剂中的 MRJP1 和 10- 羟基癸烯酸的含量， 只要 两者是能够各自发挥降低血清胆固醇作用的量即可， 没有特别的限定， 可以根据一天的摄 取量等来确定。 本发明的胆汁酸结合剂等的制造方法， 只要是不损害含有的本发明的 RJ 来源的 胆汁酸结合蛋白质活性即可， 没有特别的限定， 通常， 可以使用在制造含有功能性蛋白质的 饮食用组合物或医药用组合物时所使用的方法。
本发明的胆汁酸结合剂等的给药量， 只要可以发挥出 RJ 来源的胆汁酸结合蛋白 质的胆汁酸结合等活性即可， 没有特别的限定， 可以考虑 RJ 来源的胆汁酸结合蛋白质的种 类、 对象细胞的种类及状态、 剂型、 给药方法等适当进行确定。 例如， 用于培养细胞等生物个 体外的细胞时， 可以向培养液中添加本发明的胆汁酸结合剂或胆固醇胶束溶解抑制剂， 使 得培养液中的 RJ 来源的胆汁酸结合蛋白质含量为 10mg ～ 100mg/mL。
在生物个体摄取时， 本发明的胆汁酸结合剂等的摄取量， 只要是可以发挥出该 RJ 来源的胆汁酸结合蛋白质的胆汁酸结合等活性的量即可， 没有特别限定， 可以根据摄取的 人、 动物的体重、 年龄、 性别、 剂型等适当进行确定。例如， 优选分为 1 次或数次来摄取， 使得 RJ 来源的胆汁酸结合蛋白质每天的摄取量为 300mg ～ 1g/kg。
通过口服摄取， 本发明的胆汁酸结合剂等在生物体内与胆汁酸结合， 进一步地使 摄取的饮食中的胆固醇胶束溶解性降低， 其结果， 使血清胆固醇的量降低。因此， 本发明的 胆汁酸结合剂等， 适宜对高胆固醇血症、 动脉硬化症等由于血清的胆固醇量过剩等原因造 成的疾病进行治疗、 预防。
本发明的降低血清胆固醇量的方法 ( 以下叫做血清胆固醇量的降低方法 )， 其特 征在于通过口服摄取选自 MRJP1、 MRJP2 和 MRJP3 中的 1 种以上。口服摄取 RJ 来源的胆汁 酸结合蛋白质的生物， 只要是具有小肠、 胆管等组织的动物即可， 可以是人， 也可以是小鼠、 大鼠、 狗、 猫、 猿、 牛等的除人以外的动物。
实施例
下文将通过实施例等对本发明进行更加详细的说明， 本发明并不限定于以下的实
施例。 参考例 1
< 胆汁酸结合型亲和色谱柱的制造 >
胆汁酸结合型亲和色谱柱， 是以碳二亚胺作为间隔臂， 将胆酸结合在作为柱载体 的 EAH-Sepharose 4B 上来制造的。胆汁酸结合型亲和色谱柱的制造方法， 按照 Pattinson 等的方法 ( 非专利文献 6) 进行。
具 体 而 言， 首 先， 使 625mL 的 胆 汁 酸 溶 液 ( 含 作 为 间 隔 臂 的 33.4mM 的 1- 乙 基 -3-(3- 二甲基氨基丙基 ) 碳二亚胺盐酸盐 (1-Ethyl-3-(3 ′ -dimethylaminopropyl) carbodiimide HCl) 和 3.7mM 的胆酸的 50％乙醇溶液 ) 在 pH6.4 条件下相对于容量为 50mL 的 EAH-Sepharose 4B 载体反应 16 小时， 使胆酸结合在载体上。然后， 将用含有 0.5MNaCl 的 50％乙醇对未吸附的过量的胆酸溶液进行洗涤后得到的物质填充至色谱柱内， 制造胆汁 酸结合型亲和色谱柱 ( 色谱柱的柱床容量 ： 50mL)。 需要说明的是， 使用前， 使用 0.02％ NaN3 溶液对色谱柱进行平衡化。
< 通过胆汁酸结合型亲和色谱柱进行分级 >
接着， 通过使用 BSA 和卵清蛋白来确认制造的色谱柱对于具有胆汁酸结合能的化 合物是否实际具备亲和性。从色谱柱洗脱的条件， 按照マキノ等的方法 ( 非专利文献 7) 进 行。
首先， 将 1.5mg/mL 的 BSA 溶液和卵清蛋白溶液应用于制造的胆汁酸结合型亲和色 谱柱上。接着， 使第 1 次洗涤液 (0.5M NaCl、 10mM Tris-HCl、 pH 8.0) 通过该色谱柱， 洗涤 除去未吸附在该柱中的载体上的物质。 接着， 使洗脱液 (0.5％脱氧胆酸钠、 10mM Tris-HCl、 pH8.0) 通过该柱， 将与胆酸结合的蛋白质即具有胆汁酸结合能力的蛋白质洗脱。 最后， 使第 2 次洗涤液 (8M 尿素、 10mM Tris-HCl、 pH8.0) 通过该色谱柱， 将非特异性地结合于该色谱柱 上的物质洗脱。
各级分的迁移率和 280nm 的吸光度之间的关系如图 1 所示。在图 1 中， “(1)” 为 第 1 次洗涤液的级分， “(2)” 为洗脱液的级分， “(3)” 为第 2 次洗涤液的级分。其结果， 卵清 蛋白在第 1 次洗涤液级分中被洗脱， BSA 在洗脱液的级分中被洗脱。由上述结果可知， 制造 的胆汁酸结合型亲和色谱柱与非专利文献 7 中记载的胆汁酸结合型亲和色谱柱相同， 不吸 附卵清蛋白， 吸附 BSA。
[ 实施例 1]
< 通过胆汁酸结合型亲和色谱柱对 RJ 蛋白质进行分级 >
使用参考例 1 中制造的胆汁酸结合型亲和色谱柱， 对 RJ 蛋白质进行分级时， 对具 有胆汁酸结合能力的蛋白质进行分离、 纯化。关于使用该胆汁酸结合型亲和色谱柱对 RJ 来 源的胆汁酸结合蛋白质的分离纯化， 目前为止还没有报道， 其是一种非常高效的纯化方法。
首先， 制备 RJ 蛋白质溶液。具体而言， 使用孔径为 10kDa 的透析膜， 对向 RJ( 中 国产 ) 中加入纯水得到的悬浊物通过纯水透析 72 小时。回收透析膜内液体， 冷冻干燥 后， 再将其悬浊于含有 NaN3 的 Tris 缓冲液 (0.2％ NaN3、 10mM Tris-HCl(pH8.0)) 中， 制备 117mg/25mL 的 RJ 蛋白质溶液 (RJ 的截断值为 10kDa)。
接着， 将 RJ 蛋白质溶液应用于参考例 1 中制造的胆汁酸结合型亲和色谱柱上以 后， 按照与参考例 1 相同的方式， 依次使第 1 次洗涤液、 洗脱液、 第 2 次洗涤液通过该色谱
柱。各级分的迁移率和 280nm 的吸光度之间的关系如图 2 所示。在图 2 中， “(1)” 、 “(2)” 和 “(3)” 与图 1 相同。
进一步地， 回收由洗脱液洗脱的级分 ( 图 2 中的 “A” ， 以下称作 “级分 A” )。
< 通过胆汁酸结合型亲和色谱柱分离、 纯化的 RJ 来源的胆汁酸结合蛋白质的鉴定 >
对通过胆汁酸结合型亲和色谱柱分离、 纯化的 RJ 来源的胆汁酸结合蛋白质进行 鉴定。
首先， 使用孔径为 10kDa 的透析膜， 在 4℃条件下， 以纯水对级分 A 进行透析、 脱盐 72 小时。回收透析膜内的液体， 通过冷冻干燥， 制备脱盐级分 A。
接着， 将脱盐级分 A 提供至 10％的 SDS-PAGE， 分离出其中含有的蛋白质。 SDS-PAGE 的结果如图 3 所示。在图 3 中， “std” 意指分子量标准， “A” 意指脱盐级分 A， 上述为分别使 用的物质。在该结果的 A 栏中， 在约 49 ～ 75kDa 范围内检测到 3 个条带 ( 图 3 中 (1) ～ (3))。由该结果可知， 脱盐级分 A 溶液中含有与胆汁酸结合的 3 种 RJ 来源的蛋白质。
从 SDS-PAGE 的凝胶上将各条带切下来， 还原烷基化以后， 通过胰蛋白酶处理进行 蛋白胶内酶解 (In-gel digestion)。然后， 对通过凝胶提取的肽片段进行脱盐纯化， 使用 MALDI-TOF/MS 进行质量分析。由该结果可以鉴定 ： 在图 3 中， 条带 (1) 为 MRJP3， 条带 (2) 为 MRJP1， 条带 (3) 为 MRJP2。对得到的 SDS-PAGE 的结果中的 CBB 染色图像进行图像解析 (Image J 分析 ) 时， 上述 3 种蛋白质的比例为 ： MRJP1 为 76％， MRJP2 为 22％， MRJP3 为 2％。 [ 实施例 2]
测定由 RJ 分离纯化的 MRJP1 和 MRJP2 的胆汁酸结合能力。
< 将 MRJP1 从 RJ 分离纯化 >
首先， 使用凝胶过滤色谱法从 RJ 中对 MRJP1 进行分离纯化。 具体而言， 首先， 将 5mL 的按照与实施例 1 相同方式制备的 23.5mg/5mL 的 RJ 蛋白质溶液 (RJ 的截断值为 10kDa) 应用于 HiLoad superdex 200p.g(GEhealthcare 公司制造 ) 上。然后， 将洗脱液 (20mM Na2HPO4.20mM NaH2PO4150mM NaCl、 pH7.5) 以洗脱速度 1.5mL/min 通过该色谱柱， 以每 5mL 为 一个级分进行回收。各级分的迁移率和 280nm 的吸光度的关系如图 4 所示。此外， 使用 RJ 蛋白质溶液的同时， 将 36mg/ml 的凝胶过滤标准品 (Gel Filtration Standard)(BIO-RAD 公司制造 ) 应用至该色谱柱上， 研究迁移率 ( 从洗脱开始的总洗脱量 ) 和该级分中含有的 分子的大小之间的关系， 制作校正曲线。制作的校正曲线如图 5 所示。
本发明人对从上述的胆汁酸结合型亲和色谱柱洗脱的复合体进行凝胶解析时发 现， 含量最多的是 MRJP1 级分。由图 5 中所示标准品的迁移率和分子量得到的校正曲线可 知， 图 4 中所示的凝胶过滤色谱中的级分 B( 级分 B ： 图 4 中的虚线所包围的级分 ) 的分子量 接近于约 290kDa。将该级分提供至 15％的 SDS-PAGE， 如图 6 所示， 在约 55kDa 的位置检测 出单一的条带。此外， 使用 MALDI-TOF/MS 对该级分中含有的分子进行质量分析， 可以判定 其为含有 MRJP1 的级分。由上述结果可以确认 ： MRJP1 约为 55kDa， RJ 中存在 5 ～ 6 聚体。 以下将该级分称作 MRJP1 级分。
需要说明的是， 通过定量可知 ： 在该 MRJP1 级分中不含有非专利文献 5 中所报道的 可以降低高血脂症大鼠的血液中的甘油三酯、 总胆固醇的 10- 羟基癸烯酸。
< 将 MRJP2 从 RJ 分离纯化 >
本发明人对从上述的胆汁酸结合型亲和色谱柱洗脱的复合体进行凝胶解析时发 现， 其含量仅次于含量最多的 MRJP1 级分的级分是 MRJP2 级分。 对图 4 中所示的凝胶过滤色 谱中的级分 E( 级分 E ： 图 4 中的点虚线所包围的级分 ) 中所含有的蛋白质进行研究。 由图 5 中所示标准品的迁移率和分子量得到的校正曲线可知， 该级分 E 的分子量接近于约 51kDa。 将该级分 E 提供至 15％的 SDS-PAGE 时， 如图 7 所示， 在约 46 ～ 66kDa 的位置检测出 2 条条 带。
此外， 将该级分 E 提供至阴离子色谱， 对单一的蛋白质进行纯化。具体而言， 使用 结合用溶液 (20mM Tris-HCl、 pH8.0) 将级分 E 稀释为 125mg/5mL， 然后将 5mL 应用于 HiPrep Q FF(GE Healthcare 公司制造 )。接着， 使用洗脱液 (20mM Tris-HCl、 0.5M NaCl、 pH8.0)， 以图 8 中虚线所示的流动相中氯化钠浓度为 0 ～ 0.5M 范围的梯度浓度施加流动相， 使蛋白 质洗脱。需要说明的是， 流动相的流动速度为 1.5mL/min。
各级分的迁移率和 280nm 的吸光度之间的关系如图 8 所示。将图 8 中所示的峰 1 ～ 4 分别提供至 15％的 SDS-PAGE 时， 如图 9 所示， 检测出峰 1 至峰 2 为单一的条带。因 此， 将峰 1 和峰 2 合并回收， 使用 MALDI-TOF/MS 对该级分中含有的分子进行质量分析， 可以 判定其为含有 MRJP2 的级分。以下将该级分称作 MRJP2 级分。
< 利用透析法进行胆汁酸结合试验 >
通过透析法对上述纯化了的 MRJP1 和 MRJP2 的胆汁酸结合能力进行评价。分别使 用抗高胆固醇剂消胆胺作为阳性对照， 使用酪蛋白作为阴性对照。
具体而言， 向含有牛磺胆酸的磷酸缓冲液 (50mM 牛磺胆酸、 100mM 磷酸缓冲液、 pH7.4) 中分别添加消胆胺、 酪蛋白、 MRJP1 级分、 MRJP2 级分、 或者将未经处理的 RJ( 生 RJ) 冷冻干燥得到的物质， 使其浓度分别为 100mg/mL， 将其作为反应溶液。将这些反应溶液于 37℃培养 2 小时后， 在室温下透析 72 小时。通过测定透析膜外液中含有的总胆汁酸量， 可 以计算出透析膜内液体中含有 ( 即， 与各分子结合 ) 的胆汁酸的比例。
计算出的与各分子结合的胆汁酸的比例如图 10 所示。图 10 中的 “IntactRJ” 是 添加了将未经处理的 RJ 冷冻干燥后得到的物质的反应溶液的结果。其结果为 ： 与阴性对 照组的酪蛋白 (33％ ) 相比， MRJP1 的胆汁酸结合能力为 46％， MRJP2 的胆汁酸结合能力为 37％。即， MRJP1 显示出比 MRJP2 更高的胆汁酸结合能力。
[ 实施例 3]
< 胆固醇胶束溶解性试验 >
测定由 RJ 分离纯化的 MRJP1 和 MRJP2 对胆固醇胶束溶解的抑制能力。MRJP1 和 MRJP2 分别使用实施例 2 中制备的 MRJP1 级分和 MRJP2 级分。此外， 使用酪蛋白作为阴性对 照。
首先， 在 20mL 的玻璃管内取以下级分 ： [4-14C] 胆固醇 / 氯仿 (Perkin Elmer Life Science 公司制造 ) 并使其最终浓度为 3.7kBq/mL(2.1Gbq/mmol， NEN)， 胆固醇 ( 片山化学 工业公司制造 )/ 氯仿并使其最终浓度为 2μM， 油酸 (SIGMA 公司制造 )/ 氯仿并使其最终 浓度为 20μM， 单油酰反式甘油 (MONO OLEOYL-RAC GLYCEROL)(SIGMA 公司制造 )/ 氯仿并 使其最终浓度为 5μM， L-α- 卵磷脂 (SIGMA 公司制造 )/ 氯仿并使其最终浓度为 0.6mM， 将 其充分混合后， 吹入氮气使其干燥。然后， 将得到的干燥固体物溶解在含有 6.6mM 的牛磺胆 酸 (SIGMA 公司制造 ) 和 132mM 的 NaCl 的 15mM 磷酸缓冲液 (pH7.4) 中。使用旋涡混合器(vortex mixer) 搅拌 2 分钟后， 进行超声波处理 (25W， 输出功率 6， 3 分钟 )， 然后在 37℃一 14 边振荡一边进行培养 24 小时， 制备 [ C] 胆固醇胶束溶液。
在胆固醇胶束溶解性试验中， 具体而言， 向 [14C] 胆固醇胶束溶液中添加酪蛋白、 MRJP1、 或 MRJP2 使其最终浓度为 10mg/mL， 并将其作为反应溶液。 使用旋涡混合器对各反应 溶液搅拌 2 分钟后， 进行超声波处理 (25W， 输出功率 6， 3 分钟 )， 然后在 37℃培养 1 小时， 接 着， 在 37℃、 100,000×g 条件下， 对 380μL 溶液进行离心分离 1 小时， 并回收上清液。向回 收的 50μL 上清液中加入 10mL 乳化闪烁剂 ( 乳化シンチレ一タ一 )， 通过液体闪烁计数器 14 测定上清液中的 [ C] 胆固醇。上清液中存在着在水溶液中稳定溶解的胆固醇胶束。因此， 通过上清液中的 [14C] 胆固醇量占反应溶液中预先添加的 [14C] 胆固醇量的比例， 可以计算 出在水溶液中稳定溶解的胆固醇胶束的比例。
胆固醇在胶束中的溶解比例如图 11 中所示。 通过 Duncan 多范围检验， 以 p ＜ 0.05 对各试验区域进行统计学上的显著性差异检验处理。 与阴性对照组的酪蛋白 (79％ ) 相比， MRJP1 为 46％， 显著降低。与其相比， MRJP2 为 93％， 显著增加。即， 可以明确 MRJP1 具有胆 固醇胶束溶解抑制能力。
[ 实施例 4] < 大鼠口服给药试验 >
对作为高脂血症模型的摄取 1％胆固醇的大鼠， 口服给药从 RJ 分离纯化的 MRJP1， 研究其对血清胆固醇带来的影响。MRJP1 使用实施例 2 中制备的 MRJP1 级分。此外， 使用酪 蛋白作为阴性对照。
如图 12 所示， 在试验的 3 天时间里， 向摄取含有胆固醇的食物的大鼠一天一次地 口服给药 MRJP1 或酪蛋白。在第三次给药开始经过 24 小时后， 禁食 4 小时， 然后通过心脏 采血将大鼠处死。使用采集的血液， 测定血清胆固醇。进一步解剖， 测定肝脏重量。其他的 具体试验条件如下所示。
试验组 ： 4 周龄的 Wistar 系雄性大鼠 (70g)
试验组数 ： n＝9
开始给药时间 ： AM8:00
试验饲养时间 ： 3 天 ( 预饲养 3 天 )
禁食时间 ： 4 小时
试验样品 ： 酪蛋白钠 (CS) 或 MRJP1(MR)
给药量 ： 300mg/kg(B.W.)/ 天或 600mg/kg(B.W.)/ 天
食物组成 ： 20％酪蛋白 +1％胆固醇
通过在 3000rpm 条件下进行离心分离 15 分钟来制备血清。使用酶法， 具体而言使 用市售的试剂盒 ( 胆固醇 E-test worker ； 和光纯药工业公司制造 ) 对血清胆固醇进行定 量测定。同样地， 使用 HDL- 胆固醇 E-test worker( 和光纯药工业公司制造 ) 测定 HDL- 胆 固醇。通过计算求出 LDL+VLDL- 胆固醇。
各种测定结果等如图 13 ～ 16 所示。需要说明的是， 各数值为 1 组 9 只的平均值 ± 标准偏差， 在试验结果的统计学分析中， 使用 Duncan 多范围检验和 Student’ s t 检验。
分别将各试验组的体重变化示于图 13 中， 将每天的食物摄取量示于图 14 中， 将肝 脏重量示于图 15 中。其结果， 在各组中， 酪蛋白钠 (CS) 给药组和 MRJP1(MR) 给药组之间并
未发现有显著性差异。
另一方面， 如图 16 所示， 在 300mg/kg(B.W.)/ 天的给药组和 600mg/kg(B.W.)/ 天 的给药组的任意给药组中， 与酪蛋白钠 (CS) 给药组相比， MRJP1(MR) 给药组观察到了血清 总胆固醇量降低的倾向。特别是 600mg/kg(B.W.)/ 天的给药组， 与酪蛋白钠 (CS) 给药组相 比， MRJP1(MR) 给药组的血清总胆固醇量显著 (Duncan 多范围检验和 Student’ s t 检验两 者中的 p ＜ 0.05) 降低。
由上述结果可知， 通过口服给药分离纯化的 MRJP1， 可以使血清总胆固醇量降低。
[ 实施例 5]
< 大鼠口服给药试验 >
除了将试验组数设定为 10 只 (n ＝ 10)、 试验饲养时间设定为 7 天 ( 预饲养 3 天 )、 给药量设定为 600mg/kg(B.W.)/ 天以外， 其它和实施例 4 相同， 向高胆固醇血症的模型， 即 摄取 1％胆固醇的大鼠口服给药从 MR 分离纯化的 MRJP1 持续 7 天。研究对其血清胆固醇带 来的影响。
分别将各试验组的体重变化示于图 17 中， 将每天的食物摄取量示于图 18 中， 将肝 脏重量示于图 19 中， 将血清总胆固醇量示于图 20 中。需要说明的是， 各数值为 1 组 10 只 的平均值 ± 标准偏差， 在试验结果的统计学分析中， 使用 Student’ s t 检验。 其结果， 在体重的变化、 每天的食物摄取量、 以及肝脏重量方面， 酪蛋白钠 (CS) 给 药组和 MRJP1(MR) 给药组未见明显差异。
另一方面， 与酪蛋白钠 (CS) 给药组相比， MRJP1(MR) 给药组的血清总胆固醇量显 著 ( 约 26％ ) 降低 (Student’ s t 检验中， p ＜ 0.05)。特别是血清 LDL 胆固醇和血清 VLDL 胆固醇的总量显著降低。
由上述结果可知， 通过口服给药分离纯化的 MRJP1 持续 7 天， 可以使血清总胆固醇 量降低。
工业实用性
降低本发明的胆汁酸结合剂、 血清胆固醇量的方法， 可通过口服给药 RJ 来源的胆 汁酸结合剂， 使血清胆固醇的量安全地降低。因此， 本发明的胆汁酸结合剂等， 可以作为治 疗、 预防特别是高胆固醇血症、 动脉硬化症的医药、 功能性食品等的有效成分。