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1、(10)申请公布号 CN 102784413 A (43)申请公布日 2012.11.21 CN 102784413 A *CN102784413A* (21)申请号 201210240513.0 (22)申请日 2012.07.12 A61L 27/40(2006.01) A61L 27/20(2006.01) A61L 27/02(2006.01) A61L 27/54(2006.01) (71)申请人 禹华旭 地址 410219 湖南省长沙市望城区长沙医学 院省级重点建设学科 申请人 赵娟 (72)发明人 禹华旭 赵娟 (74)专利代理机构 长沙新裕知识产权代理有限 公司 43210 代。
2、理人 冯彦 (54) 发明名称 一种复合生物神经导管的制备方法 (57) 摘要 本发明公开了一种复合生物神经导管的制 备方法， 包括下述步骤 ： a、 芯层溶液的制备 ： 将神 经营养因子， 如神经生长因子、 层粘连蛋白用磷 酸缓冲液配成一定浓度的芯层溶液 ； b、 壳层溶液 的制备 ： 分别制备壳聚糖溶液和碳纳米溶液， 按 比例混合， 超声 （功率 300-360w） 处理， 使均匀分 布， 得壳层溶液 ； c、 壳聚糖 - 碳纳米管膜的制备 ： 采用静电纺丝技术， 将壳层和芯层溶液纺织成管 膜， 工艺条件 ： 喷丝头与高速旋转滚筒的距离为 10-18cm， 纺丝电压为 7-12kv， 旋转。
3、滚筒转速为 3000-4500rpm， 制得管膜 ； d、 将管膜缝合， 制成复 合生物神经导管。 具有良好的导电性和机械性能， 对神经损伤的修复有很好的促进作用， 且制备方 法简单易行， 成本低廉。 (51)Int.Cl. 权利要求书 1 页 说明书 5 页 附图 1 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书 1 页 说明书 5 页 附图 1 页 1/1 页 2 1. 一种复合生物神经导管的制备方法， 其特征是 ： 包括下述步骤 ： a、 芯层溶液的制备 ： 将神经营养因子， 如神经生长因子、 层粘连蛋白用磷酸缓冲液 （pH7.4） 配成一定浓度的溶液 ； 。
4、或将雪旺氏细胞、 神经干细胞、 脂肪干细胞用磷酸缓冲液 (pH7.4) 配成一定细胞密度的细胞悬液， 即为芯层溶液 ； b、 壳层溶液的制备 ： 分别制备壳聚糖溶液和碳纳米溶液， 将两种溶液按比例混合后， 采 用超声 （功率 300-360w） 处理， 使碳纳米管与壳聚糖充分混合， 并均匀分布， 得到壳聚糖 / 碳 纳米壳层溶液 ； c、 多孔型壳聚糖 - 碳纳米管膜的制备 ： 采用同轴静电纺丝技术， 将壳层和芯层溶液纺 织成多孔型壳聚糖-碳纳米管膜， 调节壳层和芯层给液速度， 制得多孔型壳聚糖-碳纳米管 膜 ； d、 将制备的多孔型壳聚糖-碳纳米管膜用8-0显微缝线缝合， 制成复合生物神经导。
5、管。 2. 根据专利要求 1 所述的复合生物神经导管的制备方法， 其特征是所述的壳层溶液中 碳纳米管的含量达 3-5 wt%。 3. 根据权利要求 1 所述的复合生物神经导管的制备方法， 其特征是所述的壳层给液速 率为 1.0-1.3mL/h。 4. 根据权利要求 1 所述的复合生物神经导管的制备方法， 其特征是所述的芯层给液速 率为 0.1-0.3mL/h 左右。 权 利 要 求 书 CN 102784413 A 2 1/5 页 3 一种复合生物神经导管的制备方法 技术领域 0001 本发明涉及生物医用材料领域， 具体指一种复合生物神经导管的制备方法。 背景技术 0002 对于周围神经缺损，。
6、 自体神经移植仍是目前修复的 “金标准” 。但其存在再生速度 慢、 自体神经取材来源有限、 供体与受体神经直径不匹配等缺点， 因此， 制备理想的神经导 管促进神经再生成为神经修复的关键。 0003 生物体内普遍存在的生物电活动在维持正常生理功能方面必不可少， 如神经系 统的信号传导、 肌肉收缩以及伤口愈合等。周围神经并非单纯的组织学结构， 它除了输 送神经营养物质， 还传递电生理信号。神经修复后虽然有大量再生神经纤维， 但功能恢 复欠佳， 这与运动终板等靶器官因失去电刺激而萎缩， 进而失去再生功能有关。因此， 神 经损伤修复过程中， 材料的导电性是决定神经修复效果的重要因素之一。具有导电性的 。
7、生物材料可调节神经细胞的粘附， 增殖和分化。Brett 等 （Brett RM,Mahrokh D,Jonas B,et al.Development of electically conductive oligo(polyethylene glycol) fumarate-poly pyrrole hydrogels for nerve regeneration.Biomacromolecules.2010 ,11(11):2845-2853.） 研究发现， 电刺激培养在聚吡咯酸 （一种导电性生物材料） 上的 PC-12 细胞与未经过电刺激培养的对照组相比， 其神经伸长程度大大增加， 较对照。
8、组增加达 90%。 0004 目前， 现有的神经导管虽然能促使损伤在一定程度的神经自行修复， 但由于神经 导管缺乏导电性， 其再生纤维的形态及功能修复的效果都不甚理想。 发明内容 0005 本发明的目的是提供是提供一种多孔型壳聚糖 - 碳纳米管神经的制备方法， 该方 法制备神经导管具有良好的导电性和机械性能， 对神经损伤的修复有很好的促进作 用， 且 制备方法简单易行， 成本低廉。 0006 本发明是这样实现的， 该复合生物神经导管的制备方法， 包括下述步骤 ： 0007 a、 芯层溶液的制备 ： 将神经营养因子， 如神经生长因子、 层粘连蛋白用磷酸缓冲 液 （pH7.4） 配成一定浓度的溶液。
9、 ； 或将雪旺氏细胞、 神经干细胞、 脂肪干细胞用磷酸缓冲液 (pH7.4) 配成一定细胞密度的细胞悬液， 即为芯层溶液 ； 0008 b、 壳层溶液的制备 ： 分别制备壳聚糖溶液和碳纳米溶液， 将两种溶液按比例混合 后， 采用超声 （功率 300-360w） 处理， 使碳纳米管与壳聚糖充分混合， 并均匀分布， 得到壳聚 糖 / 碳纳米壳层溶液 ； 0009 c、 多孔型壳聚糖 - 碳纳米管膜的制备 ： 采用同轴静电纺丝技术， 将壳层和芯层溶 液纺织成多孔型壳聚糖-碳纳米管膜， 调节壳层和芯层给液速度， 即得多孔型壳聚糖-碳纳 米管膜 ； 0010 d、 将制备的多孔型壳聚糖 - 碳纳米管膜用。
10、 8-0 显微缝线缝合， 制成复合生物神经 导管。 说 明 书 CN 102784413 A 3 2/5 页 4 0011 所述的壳层溶液中碳纳米管的含量达 3-5wt%。 0012 由于壳聚糖具有良好的可降解性和促细胞黏附性， 碳纳米管具有良好的导电性和 机械性能， 壳聚糖和碳纳米管都是具有良好的生物相容性， 分别制备壳聚糖溶液和碳纳米 溶液， 将两种溶液按比例混合后， 采用超声 （功率 300-360w） 处理， 使碳纳米管与壳聚糖充分 混合， 并均匀分布， 在碳纳米管的一定浓度下， 两者制成的复合材料， 既能提高材料的生物 相容性也能提高材料的导电性和机械性能同时又具有生物降解性， 当电。
11、刺激并匹配有导电 性纳米纤维时神经生长长度大大增加， 表明电刺激与导电性纳米生物材料有协同作用， 将 生物导电可降解神经导管与神经营养因子有机结合， 可导电的支架材料和相关神经营养因 子 （细胞） 的共同作用下， 具有良好的导电性和机械性能， 对神经损伤的修复有很好的促进 作用， 且制备方法简单易行， 成本低廉。在修复神经的结构的同时还修复其感觉和运动功 能。 0013 表 1 超声波功率、 纳米管浓度与皮层溶液电导率实验数据 0014 0015 从表1看出， 当壳聚糖-碳纳米管的混合液中， 碳纳米管的含量为3wt%、 4wt%、 5wt% 时， 用不同功率的超声波处理溶液， 其电导率有明显差。
12、异， 其中， 在 300-360w 的功率范围 内， 其电导率较高。 0016 表 2 电导率与形态、 运动功能、 感觉功能修复对照表 0017 说 明 书 CN 102784413 A 4 3/5 页 5 0018 从表2中可以看出， 神经损伤修复时， 材料的导电性为0时， 损伤神经的形态、 运动 和感觉功能的修复水平都相对较低， 但随着材料导电性能的增加， 其修复水平逐渐升高， 当 材料的导电性达到 10-3s/cm 时， 其修复水平显著的高于无导电性的材 料。 附图说明 ： 0019 图 1 为电导率与碳纳米管的浓度含量关系图 具体实施方式 0020 参见图 1， 电导率与碳纳米管与壳聚。
13、糖混合均匀分布程度及碳纳米管的浓度含量 有关， 电导率用 BD-86A 型四探针式电导率测试仪在室温下测定。 0021 该复合生物神经导管的制备方法， 包括下述步骤 ： 0022 a、 芯层溶液的制备 ： 将神经营养因子， 如神经生长因子、 层粘连蛋白用磷酸缓冲 液 （pH7.4） 配成一定浓度的溶液 ； 或将雪旺氏细胞、 神经干细胞、 脂肪干细胞用磷酸缓冲液 (pH7.4) 配成一定细胞密度的细胞悬液， 即为芯层溶液 ； 0023 b、 壳层溶液的制备 ： 分别制备壳聚糖溶液和碳纳米溶液， 将两种溶液按比例混合 后， 采用超声 （功率 300-360w） 处理， 使碳纳米管与壳聚糖充分混合，。
14、 并均匀分布， 得到壳聚 糖 / 碳纳米壳层溶液 ； 0024 c、 多孔型壳聚糖 - 碳纳米管膜的制备 ： 采用同轴静电纺丝技术， 将壳层和芯层溶 液纺织成多孔型壳聚糖 - 碳纳米管膜， 同轴静电纺丝工艺条件 ： 喷丝头与高速旋转滚筒接 收装置的距离为 10-18cm， 纺丝电压为 7-12kv， 旋转滚筒的转速为 3000-4500rpm， 调节壳层 和芯层给液速度， 制得多孔型壳聚糖 - 碳纳米管膜 ； 0025 d、 将制备的多孔型壳聚糖 - 碳纳米管膜用 8-0 显微缝线缝合， 制成复合生物神经 导管。 0026 所述的壳层溶液中碳纳米管的含量达 3-5wt%。 0027 所述的壳层。
15、给液速率为 1.0-1.3mL/h。 0028 所述的芯层给液速率为 0.1-0.3mL/h 左右。 0029 实施例 1 0030 将 0.1mg 层粘连蛋白溶于 10ml 磷酸缓冲液 （0.05mol/L,pH7.4） 中， 配成 10g/ 说 明 书 CN 102784413 A 5 4/5 页 6 ml 的神经营养因子芯层溶液。将 2g 碳纳米管加入 120mL 混酸溶液中 ( 浓 H2SO4 与浓 HNO3 体积比为 3 1)， 超声 （300w） 分散 2 3h， 然后在室温磁力搅拌 120h， 进行氧化。通过 0.22Ixm 的聚碳酸酯滤纸真空抽滤混合物， 再由去离子水洗涤至 p。
16、H 值为 7。处理后的碳纳 米在 80真空干燥 24h。所得样品研磨过筛后备用。将 700mg 壳聚糖溶解于 10mL 的稀醋 酸溶液(pH2)中， 然后加入300mg纯化后的碳纳米管， 将混合液超声分散2h， 然后加入聚 乙烯醇 (PVA) 的 2w/v% 冰酸溶液并充分搅拌， 得到碳纳米管浓度为 3wt% 的皮层溶液。同轴 静电纺丝条件 ： 设定芯层溶液的给液速率 0.3mL/h， 喷丝头直径为 0.6mm， 壳层溶液给液速 率为 1.0mL/h， 喷丝头直径为 1.1mm ； 电压为 10kv， 接收距离为 17cm ； 高速旋转滚筒的接受 速率为 4000rpm， 得到卷曲的多孔型壳聚。
17、糖 - 碳纳米管膜。 0031 将制备的卷曲的多孔型壳聚糖 - 碳纳米管膜用 8-0 显微缝线缝合， 制成多孔型壳 聚糖-碳纳米神经导管。 神经导管的长度为1.7cm,内径为1.2mm， 管壁厚0.5mm。 用BD-86A 型四探针式电导率测试仪在室温下测定其电导率为 10-8s/cm。 0032 实施例 2 0033 将 0.01mg 神经生长因子 （NGF） 和 0.01mg 层粘连蛋白 （LN） 溶于 10ml 磷酸缓冲液 （0.05mol/L,pH7.4） 中， 制成的神经营养因子芯层溶液。将 2g 碳纳米管加入 120mL 混酸溶 液中 ( 浓 H2SO4 与浓 HNO3 体积比为 。
18、3 1)， 超声 （325w） 分散 2 3h， 然后在室温磁力搅 拌 120h， 进行氧化。通过 0.22Ixm 的聚碳酸酯滤纸真空抽滤混合物， 再由去离子水洗涤至 pH 值为 7。处理后的碳纳米在 80真空干燥 24h。所得样品研磨过筛后备用。将 600mg 壳 聚糖溶解于 10mL 的稀醋酸溶液 (pH 2) 中， 然后加入 400mg 纯化后的碳纳米管， 将混合液 超声分散 2h， 然后加入聚乙烯醇 (PVA) 的 2w/v% 冰乙酸溶液并充分搅拌， 得到碳纳米管浓 度为 4wt% 的皮层溶液。同轴静电纺丝条件 ： 设定芯层溶液的给液速率 0.3mL/h， 喷丝头直 径为 0.7mm，。
19、 壳层溶液给液速率为 1.3mL/h， 喷丝头直径为 1.5mm ； 电压为 10kv， 接收距离为 15cm ； 高速旋转滚筒的接受速率为 4000rpm， 得到卷曲的多孔型壳聚糖 - 碳纳米管膜。 0034 将制备的卷曲的多孔型壳聚糖 - 碳纳米管膜用 8-0 显微缝线缝合， 制成多孔型壳 聚糖-碳纳米神经导管。 神经导管的长度为1.5cm,内径为1.4mm， 管壁厚0.8mm。 用BD-86A 型四探针式电导率测试仪在室温下测定其电导率为 10-5s/cm。 0035 实施例 3 0036 将 0.01mg 成纤维细胞生长因子 （FGF） 溶于 10ml 磷酸缓冲液 （0.05mol/L。
20、,pH7.4） 中， 配成神经营养因子芯层溶液。将 2g 碳纳米管加入 120mL 混酸溶液中 ( 浓 H2SO4 与浓 HNO3 体积比为 3 1)， 超声 （350w） 分散 2 3h， 然后在室温磁力搅拌 120h， 进行氧化。通 过 0.22Ixm 的聚碳酸酯滤纸真空抽滤混合物， 再由去离子水洗涤至 pH 值为 7。处理后的碳 纳米在 80真空干燥 24h。所得样品研磨过筛后备用。将 700mg 壳聚糖溶解于 10mL 的稀 醋酸溶液(pH2)中， 然后加入500mg纯化后的碳纳米管， 将混合液超声分散2h， 然后加入 聚乙烯醇 (PVA) 的 2w/v% 冰乙酸溶液并充分搅拌， 得到。
21、碳纳米管浓度为 5wt% 的皮层溶液。 同轴静电纺丝条件 ： 设定芯层溶液的给液速率 0.3mL/h， 喷丝头直径为 0.6mm， 壳层溶液给 液速率为 1.0mL/h， 喷丝头直径为 1.1mm ； 电压为 10kv， 接收距离为 17cm ； 高速旋转滚筒的 接受速率为 4000rpm， 得到卷曲的多孔型壳聚糖 - 碳纳米管膜。 0037 将制备的卷曲的多孔型壳聚糖 - 碳纳米管膜用 8-0 显微缝线缝合， 制成多孔型壳 聚糖-碳纳米神经导管。 神经导管的长度为1.7cm,内径为1.2mm， 管壁厚0.5mm。 用BD-86A 说 明 书 CN 102784413 A 6 5/5 页 7 型四探针式电导率测试仪在室温下测定其电导率为 10-3s/cm。 说 明 书 CN 102784413 A 7 1/1 页 8 图 1 说 明 书 附 图 CN 102784413 A 8 。