源自低等光合真核生物的质体转运肽及其方法 对相关申请的交叉引用
本申请要求第 61/227,100 号美国临时申请 ( 于 2009 年 7 月 21 日提交 ) 的权益。 上述申请通过引用的方式而构成本文的一部分。
发明领域 本发明涉及植物的基因修饰， 特别是所关注多肽至植物质体的转运。
发明背景
本发明所述质体包含其自身的基因组。然而， 许多质体基因在进化过程中被转移 至核基因组中。因此， 形成了核编码的质体蛋白转运回该质体的机制。在这种方式下， 这些 核编码的质体基因的蛋白产物在细胞核内表达后被转移回该质体中。 这些蛋白通过运用定 位于转运蛋白 N- 末端的转运肽序列而得以转运。这些肽能够介导蛋白至质体上， 其后往往 由特定的蛋白酶水解去除。
细胞生物学的根本问题是， 由细胞质核糖体合成的蛋白质向其相应细胞内定位的 精确和高效的靶向作用。 对于转基因高等植物而言， 这是特别真实的， 其转基因产物需要在 合适的细胞器或隔室内产生。本发明提供了一种质体靶向肽， 它能够有效地将外源性多肽 转运至转基因高等植物的叶绿体中。
发明概述
本发明提供了叶绿体靶向肽的组成和方法。组成包括转运肽以及编码转运肽 ( 即 质体靶向肽或转运肽 ) 及其变体的核苷酸序列。组成还包括由核苷酸序列所组成的 DNA 构 建体， 该核苷酸序列可编码转运肽， 后者能够有效地连接至编码所关注多肽的核苷酸序列 上。这些 DNA 构建体证实了在外源多肽向质体表达和定位方面的用途。组成还包括表达 盒、 载体、 转化植株、 转化植物细胞， 以及稳定转化的植物种子， 其中所关注多肽经本发明的 质体靶向肽被定位至叶绿体上。
发明详细说明
低等光合真核生物包括绿藻门 ( 绿藻类， 如衣藻和杜氏藻 )、 红藻门 ( 红藻 )、 灰色 藻门 ( 如蓝载藻 )、 裸藻门 ( 如眼虫 )、 褐藻门、 不等鞭毛类、 定鞭藻类、 隐藻门和甲藻门的主 要谱系。低等光合真核生物中不包括蓝藻门。然而， 细菌域的蓝藻门 ( 蓝细菌， 如聚球藻 和集胞藻 ) 具有光合作用的机制。因此， 本文纳入了这些光合细菌作为基本的光合机制来 源。低等光合真核生物的特点是含有光合作用的细胞器， 该细胞器是从蓝细菌衍生发展而 来的。环绕光合作用细胞器的膜的数目在低等光合真核生物的成员中各有不同。光合作用 的细胞器可以是一级质体或二级 ( 或三级 ) 质体。
一级质体或单一质体， 可在绿藻门、 红藻门和灰色藻门中发现， 且经鉴定具有双 层结合膜。这些包含一级质体的生物被认为是蓝细菌原始内共生伙伴关系的唯一后裔 (Harper 和 Keeling， 分子生物学与进化 20(10) ： 1730-1735(2003)。含有有机体的一级 质体已被归纳为单一的超群， 被称为原始色素体生物 (Maruyama 等， BMC 进化生物学 8 ： 151(2008))。
二级 ( 和三级 ) 或复合质体是由三或四层膜围绕的， 它们被认为是由二级内共生 所派生的， 其中由生物体吞噬了藻类而生成。二级和三级质体的系统进化分析表明， 这些 质体是由几起不同的内共生事件而衍生的， 这几起事件发生在进化期间 (Bhattacharya 和 Medlin， 植物生理学 116 ： 9-15(1998))。裸藻和甲藻是有二级或复合质体的生物体的实例。 参见 Bhattacharya 和 Medlin 的综述， 植物生理学 116 ： 9-15(1998)。裸藻和褐藻有绿藻的 二级质体， 而不等鞭毛类、 定鞭藻类、 隐藻和甲藻则全部拥有红藻的二级内共生体 (Harper 和 Keeling， 分子生物学与进化 20(10) ： 1730-1735(2003))。
本发明的质体靶向肽或转运肽能够有效地介导连接多肽向质体的靶向、 定位或转 运。质体是在植物和藻类中存在的细胞器。质体负责进行光合作用、 储存诸如淀粉类产物， 并负责完成诸如脂肪酸、 萜类等许多种分子的合成及细胞构成模块所需的其他分子的合 成。质体依据其在细胞内的作用而具有分化或再分化成几种形式的能力。未分化的前质体 有可能发育成以下任何质体， 包括叶绿体、 色质体、 白色体、 淀粉形成体、 耳石、 油质体和蛋 白质体。
“叶绿体转运肽” 或 “质体运输肽” 或 “质体转运肽” 或 “转运肽” 是必要的， 也是足 以促进蛋白质输入其原生宿主细胞的。 这种质体可以是一级、 二级或三级质体。 质体可能就 是叶绿体。转运肽定位于输入质体的蛋白质的 N 末端。转运肽能够有效促进使多肽连接至 质体内的共翻译或翻译后转运。这些转运肽一般含有 40 至 100 个氨基酸。研究表明， 转运 肽包含共同的特点。 这些特点包括 ： 它们几乎没有带负电荷的氨基酸， 如天冬氨酸、 谷氨酸、 天门酰胺或谷氨酰胺 ； 其 N- 末端区域为没有带电荷的氨基酸， 也没有诸如甘氨酸或脯氨酸 之类的氨基酸 ； 它们的中央区域包含非常高比例的碱性或羟基氨基酸， 如丝氨酸或苏氨酸 ； 并且其 C- 末端区域富含精氨酸， 且具有形成兼性 β- 折叠二级结构的能力。输入后， 可通 过质体内的特异性蛋白酶将转运肽有效地从连接多肽上剪切去除。
根据一本有权威性的著作 (Cline 和 Henry， 细胞和发育生物学年鉴 12 ： 1-26(1996 年 ))， 高等植物的叶绿体转运肽共同享有以下几个特点 ： (1) 它们表面上具有线粒体转运 肽的类似特征， 即它们富含羟化残基且缺少酸性残基 ； (2) 它们具有 30-120 残基的长度 ； (3) 其 N- 末端 10-15 氨基酸缺乏甘氨酸、 脯氨酸和带电荷的残基 ； (4) 可变的中央区域富含 丝氨酸、 苏氨酸、 赖氨酸和精氨酸 ； (5) 其 C- 末端区域包含进行蛋白水解加工的松散保守序 列 (Ile/Val-x-Ala/Cys*Ala) ； (6) 没有延伸序列保守性或保守的二级结构基元， 以及 (7) 它们从理论上说主要采用无规则卷曲构象。
存在着几种计算方法， 其使用了上述功能以预测高等植物的叶绿体前导序列。计 算 工 具 包 括 PSORT(Nakai 和 Kanehisa， 蛋 白 质 11(2) ： 95-110(1991 年 ) ； Horton 等， 第 四届亚太生物信息学大会 APBC06( 台北， 台湾 ) 的会议录 39-48 页 (2006 年 ) ； http:// www.psort.org)、 ChloroP(Emanuelsson 等， 分 子 生 物 学 杂 志 300 ： 1005-1016(1999 年 ) ； http://www.cbs.dtu.dk/services/ChloroP/) 或 TargetP(Nielsen 等， 蛋 白 质 工 程 10 ： 1-6(1997 年 ) ； Emanuelsson 等， 分子生物学杂志 300 ： 1005-1016(2000 年 ) ； http://www. cbs.dtu.dk/services/TargetP/)。
与高等植物相反， 比较诸如莱氏衣藻这样的生物体的转运肽形成了以下特性 ： (1) 它们具有短的、 不带电荷的 N- 末端区域 ； (2) 它们的中央区域富含精氨酸、 丙氨酸、 缬氨酸 和丝氨酸， 因而具有形成兼性 α- 螺旋的较高倾向， 以及 (3) 它们具有可能形成兼性 β- 片层结构的 C- 末端区域 (Franzen 等， FEBS 通讯 260(2) ： 165-168(1990 年 ))。
在本发明的一个实施例中， 这种转运肽是从低等光合真核生物中得到的， 其能够 有效地连接至外源蛋白上并在转基因高等植物中进行表达， 它能够将该外源蛋白定位至叶 绿体上。低等光合真核生物是从类群中选择得到的， 该类群包括绿藻门 ( 绿藻类， 如衣藻和 杜氏藻 )、 红藻门 ( 红藻类 )、 灰色藻门 ( 如蓝载藻 )、 裸藻门 ( 如眼虫 )、 褐藻门、 不等鞭毛 类、 定鞭藻类、 隐藻门和甲藻门。 在另一个实施例中， 转运肽是从衣藻中得到的。 在另一个实 施例中， 转运肽是从莱氏衣藻中得到的。在另一个实施例中， 转运肽是从杜氏藻中得到的。 在另一个实施例中， 转运肽是从杜氏盐藻中得到的。
本发明的另一个实施例是一种将外源蛋白定位至转基因高等植物的叶绿体上的 方法， 其中由几个步骤组成， 即有效地将转运肽从低等光合真核生物连接至外源蛋白上， 从 而产生含有外源蛋白的转基因植物， 其中外源蛋白可在转基因植物的叶绿体中检测得到。 转基因植物可能是一种高等转基因植物。低等光合真核生物是从类群中选择得到的， 该类 群包括绿藻门 ( 绿藻类， 如衣藻和杜氏藻 )、 红藻门 ( 红藻类 )、 灰色藻门 ( 如蓝载藻 )、 裸藻 门 ( 如眼虫 )、 褐藻门、 不等鞭毛类、 定鞭藻类、 隐藻门和甲藻门。 在另一个实施例中， 转运肽 是从衣藻中得到的。在另一个实施例中， 转运肽是从莱氏衣藻中得到的。在另一个实施例 中， 转运肽是从杜氏藻中得到的。在另一个实施例中， 转运肽是从杜氏盐藻中得到的。
在本发明的一个实施例中， 这种转运肽是从低等光合原核生物中得到的， 其能够 有效地连接至外源蛋白上并在转基因高等植物中进行表达， 它能够将该外源蛋白定位至叶 绿体上。低等光合原核生物是从蓝藻 ( 前身为 “蓝绿藻” 之称的蓝绿细菌 ) 所组成的类群 中选择得到的。在另一个实施例中， 转运肽是从聚球藻中得到的。在另一个实施例中， 转运 肽是从聚球藻属 PCC 7002 中得到的。在另一个实施例中， 转运肽是从集胞藻中得到的。在 另一个实施例中， 转运肽是从集胞藻属 PCC 6803 中得到的。
本发明的另一个实施例是一种将外源蛋白定位至转基因高等植物的叶绿体上的 方法， 其中由几个步骤组成， 即有效地将转运肽从低等光合原核生物连接至外源蛋白上， 从 而产生含有外源蛋白的转基因植物， 其中外源蛋白可在转基因植物的叶绿体中检测得到。 转基因植物可能是一种高等转基因植物。低等光合原核生物是从蓝藻 ( 前身为 “蓝绿藻” 之 称的蓝绿细菌 ) 所组成的类群中选择得到的。在另一个实施例中， 转运肽是从聚球藻中得 到的。 在另一个实施例中， 转运肽是从聚球藻属 PCC 7002 中得到的。 在另一个实施例中， 转 运肽是从集胞藻中得到的。在另一个实施例中， 转运肽是从集胞藻属 PCC 6803 中得到的。
这些组成包括编码转运肽及其变体的核苷酸序列。在一个实施例中， 转运肽包括 SEQ ID NO ： 2、 4、 6、 8、 10、 12、 14、 16、 18 和 20 所述的氨基酸序列或片段及其变体， 以及 SEQ ID NO ： 1、 3、 5、 7、 9、 11、 13、 15、 17 和 19 所述的核苷酸序列或片段及其变体。组成还包括由 核苷酸序列所组成的 DNA 构建体， 该核苷酸序列可编码转运肽， 后者能够有效地连接至编 码外源多肽的核苷酸序列上。这些 DNA 构建体证实了在外源多肽向质体表达和定位方面的 用途。组成还包括表达盒、 载体、 转化植株、 转化植物细胞， 以及稳定转化的植物种子， 其中 外源多肽经本发明的转运肽被定位至叶绿体上。
在本发明的另一个实施例中， 这种转运肽是从低等光合真核生物中得到的， 其能 够有效地连接至外源蛋白上并在转基因高等植物中进行表达， 它能够将该外源蛋白定位至 叶绿体上。 转运肽来自编码蛋白质的核苷酸序列， 其能够被定位至有光合作用的细胞器上。转运肽已证实位于在宿主细胞的细胞核内编码、 但翻译后定位于宿主细胞光合细胞器的基 因上， 并可从以下类群选择得到， 包括 ： 铁氧还蛋白 -NADP+- 氧化还原酶、 核酮糖二磷酸羧化 酶 / 氧化酶、 5 烯醇式丙酮基莽草酸 -3- 磷酸合成酶、 乙酰乳酸合成酶、 叶绿体核糖体蛋白 CS17、 CS 蛋白、 铁氧还蛋白、 质体蓝素、 二磷酸核酮糖羧化酶激活酶、 色氨酸合成酶、 酰基载 体蛋白、 质体监控蛋白 -60、 细胞色素 C552、 22-kDa 热休克蛋白、 33-kDa 氧进化增强子蛋白 1、 ATP 合酶 γ 亚基 (ATP 酶 γ)、 ATP 合酶 ω 亚基、 叶绿素 -a/b- 结合蛋白 II-1、 氧进化增 强子蛋白 2、 氧进化增强子蛋白 3、 光系统 I P21、 光系统 I P28、 光系统 I P30、 光系统 I P35、 光系统 I P37、 甘油 -3- 磷酸乙酰转移酶、 叶绿素 a/b 结合蛋白、 CAB2 蛋白、 羟甲基胆色烷合 酶， 丙酮酸磷酸盐二激酶、 CAB3 蛋白、 质体铁蛋白、 铁蛋白、 早期光诱导蛋白， 谷氨酸 -1- 半 醛转氨酶、 原叶绿素酸酯还原酶、 淀粉粒结合淀粉合成酶、 光系统 II 捕光叶绿素 a/b 结合蛋 白、 主要花粉变应原 Lol p 5a、 质体 ClpB ATP 依赖性蛋白酶、 超氧化物歧化酶、 铁氧还蛋白 NADP 氧化还原酶、 28-kDa 核糖核蛋白、 31-kDa 核糖核蛋白、 33-kDa 核糖核蛋白、 乙酰乳酸合 成酶、 ATP 合酶 CF0 亚基 1、 2、 3或4； 细胞色素 f、 细胞色素 c、 ADP 葡萄糖焦磷酸化酶、 谷氨 酰胺合成酶、 谷氨酰胺合成酶 2、 碳酸酐酶、 GapA 蛋白、 热休克蛋白 hsp 21、 磷酸转运蛋白、 质体 CIpA ATP 依赖性蛋白酶、 质体核糖体蛋白 CL24、 质体核糖体蛋白 CL9、 质体核糖体蛋白 PsCL18、 质体核糖体蛋白 PsCL25、 DAHP 合成酶、 淀粉磷酸化酶、 根酰基载体蛋白 11、 甜菜醛 脱氢酶、 GapB 蛋白、 谷氨酰胺合成酶 2、 磷酸核酮糖激酶、 亚硝酸盐还原酶、 核糖体蛋白 L12、 核糖体蛋白 L13、 核糖体蛋白 L21、 核糖体蛋白 L35、 核糖体蛋白 L40、 丙糖磷酸 -3- 磷酸甘油 酸磷酸转运蛋白、 铁氧还蛋白依赖性谷氨酸合酶、 3- 磷酸甘油醛脱氢酶、 NADP 依赖性苹果 酸酶和 NADP 苹果酸脱氢酶。表 1 列出了额外的含有质体靶向序列的核编码基因。在本发 明的一个实施例中， 转运肽是从莱氏衣藻中得到的， 特别是从莱氏衣藻光系统 I p28 中得到 的， 并构成了 SEQ ID NO ： 2 中所述的氨基酸序列。 在本发明的一个实施例中， 转运肽是从莱 氏衣藻中得到的， 特别是从莱氏衣藻光系统 I p30 中得到的， 并构成了 SEQ ID NO ： 4 中所 述的氨基酸序列。 在本发明的一个实施例中， 转运肽是从莱氏衣藻中得到的， 特别是从莱氏 衣藻光系统 I p35 中得到的， 并构成了 SEQ ID NO ： 6 中所述的氨基酸序列。在本发明的一 个实施例中， 转运肽是从莱氏衣藻 ( 中得到的， 特别是从莱氏衣藻光系统 I p37 中得到的， 并构成了 SEQ ID NO ： 8 中所述的氨基酸序列。在本发明的一个实施例中， 转运肽是从莱氏 衣藻中得到的， 特别是从莱氏衣藻 ssRubisco 中得到的， 并构成了 SEQ ID NO ： 10 中所述的 氨基酸序列。 在本发明的一个实施例中， 转运肽是从莱氏衣藻中得到的， 特别是从莱氏衣藻 γ-ATP 酶中得到的， 并构成了 SEQ ID NO ： 12 中所述的氨基酸序列。在另一个实施例中， 转 运肽是从蓝细菌中得到的， 特别是从聚球藻属 PCC 7002 细胞色素 c550 中得到的， 并包含 SEQ ID NO ： 14 中所述的氨基酸序列。在另一个实施例中， 转运肽是从蓝细菌中得到的， 特 别是从聚球藻属 PCC 6803 细胞色素 c553 中得到的， 并包含 SEQ ID NO ： 16 中所述的氨基酸 序列。在另一个实施例中， 转运肽是从蓝细菌中得到的， 特别是从聚球藻属 PCC 6803 psaF 中得到的， 并包含 SEQ ID NO ： 18 中所述的氨基酸序列。在本发明的另一个实施例中， 转运 肽是从杜氏衣藻中得到的， 特别是从杜氏盐藻 EPSPS 中得到的， 并构成了 SEQ ID NO ： 20 中 所述的氨基酸序列。
表1： 编码定位至质体的蛋白的核编码基因。参考文献以其整体通过引用而成为 本文中的部分。
本发明的前导序列包括变体或修饰序列。这样的序列能够改变氨基酸序列， 但保 留了将所连接多肽转运至质体内的能力。虽然取代多肽序列氨基酸残基的方法是已知的， 但人们公认， 与整个叶绿体靶蛋白相比， 丝氨酸和苏氨酸已被确定为转运肽中所富含的氨 基酸。据报道， 在转运肽中， 天门冬氨酸和谷氨酸代表为数低于适当比例的氨基酸组分。当 构建变体转运肽时， 可将这些顾虑以及上面讨论的内容加以考虑。然而， 详列如下， 本技术 技能之一是能够检测是否一种变体转运肽可在质体内存在有效连接多肽的情况下有能力 转运有效连接多肽。就发明目的而言， 本发明的叶绿体转运肽序列变体还包括片段或该序 列的片段。本文中所使用的术语 “核酸分子” 旨在包括 DNA 分子 ( 例如， cDNA 或基因组 DNA) 和 RNA 分子 ( 例如， mRNA) 及采用核苷酸类似物生成的 DNA 或 RNA 类似物。核酸分子可为 单链或双链， 但优选为双链 DNA。
由 “作物” 或 “高等植物” 意指出于生产植物材料的目的而栽培的、 之后由人类销售 的， 用于口头消费或用于工业、 医药或商业过程中利用的任何植物。 本发明可应用于多种植 物中的任意一种， 包括但不仅限于 ： 玉米、 小麦、 水稻、 大麦、 大豆、 棉花、 高粱、 燕麦、 烟草、 芒 草、 柳枝稷、 树、 一般豆类、 油菜 / 芸苔、 紫花苜蓿、 亚麻、 向日葵、 红花、 小米、 黑麦、 甘蔗、 甜 菜、 可可、 茶叶、 甘蓝、 棉花、 咖啡、 甘薯、 亚麻、 花生、 三叶草 ； 蔬菜类， 如生菜、 西红柿、 葫芦、 木薯、 土豆、 胡萝卜、 萝卜、 豌豆、 扁豆、 白菜、 花椰菜、 绿花椰菜、 包子甘蓝、 辣椒、 菠萝 ； 乔木 水果， 如柑橘、 苹果、 梨、 桃、 杏、 核桃、 鳄梨、 香蕉和椰子， 以及鲜花， 如兰花、 康乃馨、 玫瑰和 类似植物。
本文中所使用的术语 “植物部分” 或 “植物组织” 包括植物细胞、 植物原生质体、 来 自可再生植物的植物细胞组织培养物、 植物愈伤组织、 植物团块， 以及在植物或类似胚胎、 花粉、 胚珠、 种子、 叶、 花、 枝、 果实、 内核、 穗、 穗轴、 外壳、 茎、 根、 根尖、 花药等的植物部分中 是完好的植物细胞。 此处使用的冠词 “a” 和 “an” 指一个或多个 ( 即至少有一个 ) 冠词的语法对象。举 例来说， “一个元素 (an element)” 是指一个或多个元素。整个说明书中， 其用词 “组成” 或 诸如 “包括” 或 “构成” 在内的变更体应被理解为意味着包含一定的元素、 整体或步骤， 或元 素、 整体或步骤组， 但不排除任何其他元素、 整体或步骤， 或任何其他元素、 整体或步骤组。
转运肽组成
如上所述， 本发明的组成包括能够将有效连接多肽运送至质体内的转运肽。术语 “多肽” 一词广义上指的是氨基酸链， 它包括天然存在的氨基酸、 合成氨基酸、 基因编码的氨 基酸、 非基因编码的氨基酸及其组合。多肽可包含 L 型和 D 型氨基酸。
代表性的非转基因编码的氨基酸， 包括但不限于 2- 氨基己二酸、 3- 氨基己二酸、 β- 氨基丙酸、 2- 氨基丁酸、 4- 氨基丁酸、 6- 氨基己酸、 2- 氨基庚酸、 2- 氨基异丁酸、 3- 氨 基异丁酸、 2- 氨基庚二酸、 2， 4- 二氨基丁酸、 锁链素、 2， 2′ - 二氨基庚二酸、 2， 3- 二氨基丙 酸、 N- 乙基甘氨酸、 N- 乙基天冬酰胺、 羟赖氨酸、 别羟赖氨酸、 3- 羟脯氨酸、 4- 羟脯氨酸、 异 锁链赖氨素、 别异亮氨酸、 N- 甲基甘氨酸 ( 肌氨酸 )、 N- 甲基异亮氨酸、 N- 甲基缬氨酸、 正 缬氨酸、 正亮氨酸和鸟氨酸。
例如， 代表性的衍生氨基酸包括那些其游离氨基已经衍生化而形成胺盐酸盐、 p- 甲苯磺酰基、 苄氧羰基、 t- 叔丁氧羟基、 氯乙酰氯基或甲酰基的分子。游离羧基可衍生 化而形成盐、 甲酯和乙酯或其他类型的酯类或酰肼类。游离羟基可衍生化而形成 O- 酰基或 O- 烷基衍生物。组氨酸的咪唑氮可以衍生化而形成 N- 亚氨基 - 苄基组氨酸。
质体转运肽一般以 N- 末端而被融合至多肽， 从而被转运至质体中。公认的是， 额 外的氨基酸残基可以是质体转运肽的 N- 末端。质体转运肽一般在定位至质体上后被从所 关注多肽上切断。切断位置可以在植物物种之间略有不同。
本发明的转运肽包括从衣藻 P28 中得到的转运肽， 特别是从莱氏衣藻光系统 I P28 中得到的转运肽， 更具体的是在 SEQ ID NO ： 2 中所述的氨基酸序列。本发明的转运肽 包括从衣藻 P30 中得到的转运肽， 特别是从莱氏衣藻光系统 I P30 中得到的转运肽， 更具体
的是在 SEQ ID NO ： 4 中所述的氨基酸序列。本发明的转运肽包括从衣藻 P35 中得到的转运 肽， 特别是从莱氏衣藻光系统 I P35 中得到的转运肽， 更具体的是在 SEQ ID NO ： 6 中所述的 氨基酸序列。 本发明的转运肽包括从衣藻 P37 中得到的转运肽， 特别是从莱氏衣藻光系统 I P37 中得到的转运肽， 更具体的是在 SEQ ID NO ： 8 中所述的氨基酸序列。本发明的转运肽 包括从衣藻 ssRubisco 中得到的转运肽， 特别是从莱氏衣藻 ssRubisco 中得到的转运肽， 更 具体的是在 SEQ ID NO ： 10 中所述的氨基酸序列。本发明的转运肽包括从衣藻 ATP 酶中得 到的转运肽， 特别是从莱氏衣藻 ATP 酶中得到的转运肽， 更具体的是在 SEQ ID NO ： 12 中所 述的氨基酸序列。本发明的转运肽包括从蓝细菌细胞色素 c550 中得到的转运肽， 特别是从 聚球藻属 PCC 7002 细胞色素 c550 中得到的转运肽， 更具体的是在 SEQ ID NO ： 14 中所述的 氨基酸序列。本发明的转运肽包括从蓝细菌细胞色素 c553 中得到的转运肽， 特别是从聚球 藻属 PCC 6803 细胞色素 c553 中得到的转运肽， 更具体的是在 SEQ ID NO ： 16 中所述的氨基 酸序列。 本发明的转运肽包括从集胞藻中得到的转运肽， 特别是从集胞藻属 PCC 6803 psaF 中得到的转运肽， 更具体的是在 SEQ ID NO ： 18 中所述的氨基酸序列。 本发明的转运肽包括 从杜氏藻中得到的转运肽， 特别是从杜氏盐藻 EPSPS 中得到的转运肽， 更具体的是在 SEQ ID NO ： 20 中所述的氨基酸序列。本发明也包括该多肽的生物活性变体。这些变体应保留将有 效连接多肽转运至细胞质体内的能力。较为可取的是， 该变体至少拥有与天然分子相同的 活性。 这种将多肽转运至质体内的能力可以通过本技术领域的方法进行测量。 例如， 可以将 编码转运肽的核苷酸序列链接至报告基因如 β- 葡萄糖醛酸酶 (GUS) 或 AmCyan 上， 从而引 入植物内。 GUS 和 AmCyan 在转化植物亚细胞组分中的活性分析表明了转运肽是否能够将报 告蛋白导向至质体上。例如， 参见 Silva-Filho 等 (1997)， 生物化学杂志 272 ： 15264-15269 和美国专利申请号 20080168580。
适合的生物活性变体可为片段和衍生物。由 “片段” 一词， 意指仅包含部分完整的 转运肽序列和结构， 且可为在 C- 和 N- 末端两侧氨基酸的 C- 末端缺失或 N- 末端缺失。由 “衍生物” 一词， 意指只要转运活性仍保留条件下的任何适当修饰的转运肽或多肽片段， 其 中包括氨基酸残基的任何改变。
多肽变体一般应有至少 70％， 优选至少有 80％， 更优选约 90％至 95％或以上， 约 96％， 约 97％， 且最好约 98％， 约 99％或更多的与参照多肽分子氨基酸序列同源的氨基酸 序列。变体可能会只相差 5、 4、 3、 2 甚至 1 个氨基酸残基。在本技术领域内， 测定序列间同 源性的方法是众所周知的。例如， “ALIGN” 程序 (Dayhoff， 1978)， 参见蛋白质序列和结构图 集5 ： 增刊 3( 国家生物医学研究基金会， 华盛顿特区 ) 和威斯康星州序列分析软件包第 8 版 ( 遗传学计算机组提供， 麦迪逊， 威斯康星州 ) 程序， 例如， GAP 程序。出于两个序列最佳对 齐的目的， 变体氨基酸序列的连续段可能有相对参照分子的氨基酸序列而言额外的氨基酸 残基或已缺失的氨基酸残基。用来与参照氨基酸序列进行比较的连续段应包括至少 20 个 连续核苷酸， 也可为约 3、 4、 5、 6、 7、 8、 9、 10、 11、 12、 15、 20、 25、 30、 40 或更多个核苷酸。可通 过指定空位罚分来进行与变体氨基酸序列内包含空位相关的增加序列同源性的校正。 在本 技术领域内， 序列比对的方法是众所周知的。
当考虑氨基酸序列同源性的百分比时， 由于保守氨基酸取代， 一些氨基酸残基的 位置可能会有所不同， 但这并不会影响蛋白质功能的特性。 在这些情况下， 序列同源性百分 比可能会向上调整， 以补偿保守取代的氨基酸的相似性。 在本技术领域内， 这种调整是众所周知的。例如， Myers 和 Miller(1988)， 生物科学计算机应用 4 ： 11-17。
举例来说， 优先进行保守氨基酸取代。 “不必要的” 氨基酸残基是可以不改变生物 活性而被改变的残基， 而 “必要的” 氨基酸残基则是生物活性所必需的残基。 “保守氨基酸取 代” 是其中氨基酸残基被具有相似侧链的氨基酸残基所取代的取代方式。 在本技术领域内， 已定义了具有相似侧链的氨基酸残基家族。这些家族包括具有基本侧链 ( 如赖氨酸、 精氨 酸、 组氨酸 )、 酸性侧链 ( 如天门冬氨酸、 谷氨酸 )、 不带电荷的极性侧链 ( 如甘氨酸、 天门冬 酰胺、 谷氨酰胺、 丝氨酸、 苏氨酸、 酪氨酸、 半胱氨酸 )、 非极性侧链 ( 如丙氨酸、 缬氨酸、 亮氨 酸、 异亮氨酸、 脯氨酸、 苯丙氨酸、 甲硫氨酸、 色氨酸 )、 带有 β- 分枝的侧链 ( 如苏氨酸、 缬氨 酸、 异亮氨酸 ) 和芳香侧链 ( 如酪氨酸、 苯丙氨酸、 色氨酸、 组氨酸 )。例如， 参见 Sambrook J.， 和 Russell， D.W.(2001)， 分子克隆实验指南 ( 冷泉港实验室出版社， 冷泉港， 纽约 ) 和 Innis， 等 (1990)， PCR 实验方法与应用指南 ( 学术出版社， 纽约州 )。
本发明的多肽可受各种变化、 取代、 插入和缺失的影响， 其中这些变化在其应用中 提供了一定的优势。因此， “多肽” 包括各种多肽衍生物的任意一种， 例如包括酰胺类、 蛋白 结合物、 cyclone 肽、 聚合肽、 保守取代的变体、 类似物、 片段、 化学修饰肽以及多肽类似物。 在本发明的实践中， 可以使用具有所需转运特征的任意多肽。 由 “转运” 、 “靶向” 或 “转移” ， 意指本发明的转运肽能够转运、 转移或携带在细胞 核内表达而进入细胞质体的多肽。在一些实施例中， 本发明的转运肽能够转运至少 100％、 90％、 80％、 70％、 60％、 50％的有效链接至质体的多肽。
本发明的一个方面涉及到组成编码转运肽或其生物活性部分的核苷酸序列的单 独核酸分子。本文中所使用的术语 “核酸分子” 旨在包括 DNA 分子 ( 例如， cDNA 或基因组 DNA) 和 RNA 分子 ( 例如， mRNA) 及采用核苷酸类似物生成的 DNA 或 RNA 类似物。核酸分子 可为单链或双链， 但优选为双链 DNA。
本发明也包括成为编码核苷酸序列的这些转运肽片段的核酸分子。由 “片段” ， 意 指编码转运肽的核苷酸序列的一部分。 成为转运肽核苷酸序列片段的核酸分子至少包括约 15、 20、 50、 75、 100、 125、 150、 175、 180、 185、 190、 195 个连续核苷酸。由 “连续的” 核苷酸， 意 指直接彼此相邻的核苷酸残基。
本技术人员应进一步理解， 可通过向本发明的核苷酸序列引入突变， 从而可不经 转运变化， 而导致编码转运肽的氨基酸序列发生改变。 因此， 可通过向此处显示的相应核苷 酸序列引入一个或更多核苷酸取代、 增加或缺失而创造变异的单个核酸分子， 从而将一个 或多个氨基酸取代、 增加或缺失引入至编码多肽中。可通过标准技术， 如定点突变和 PCR 介 导的诱变而引入突变。本发明也包括这些变异的核苷酸序列。
本发明的成分可以用来从其他生物体中识别和分离出相应的转运肽。 在第一种方 法的杂交检测中， 可使用此序列以证实本发明具有重大同源性的序列。由此处使用的术语 “杂交” ， 用于参照互补多核苷酸链 ( 包括正如上面所讨论的部分互补的 ) 的配对。在本技 术领域内， 众所周知的是杂交和杂交强度 ( 即多核苷酸链之间的关联强度 ) 受多种因素影 响， 其中包括 ： 多核苷酸之间的互补程度 ； 涉及的受盐浓度这些条件影响的严格条件 ； 形成 杂合子的熔融温度 (Tm) ； 含有的其他成分 ； 杂交链的摩尔浓度 ； 以及多核苷酸链的 G:C 含 量。
因此， 本发明涉及能够将多肽转运至质体内且在严格条件下杂交至此处披露的
序列， 或杂交至其片段的单独序列。这些序列应至少与所披露序列约有 40％至 50％的同 源性， 约 60％、 65％或 70％的同源性， 甚至至少应约有 75％、 80％、 85％、 90％、 91％、 92％、 93％、 94％、 95％、 96％、 97％、 98％、 99％或更多的同源性。也就是说， 序列的序列同源性可 以归类， 共享至少约 40％至 50％、 约 60％、 65％或 70％， 甚至至少约 75％、 80％、 85％、 90％、 91％、 92％、 93％、 94％、 95％、 96％、 97％、 98％、 99％或更多的序列同源性。
鉴于此处使用的， “Tm” 和 “熔融温度” 为可互换的术语， 它是 50％的双链核苷酸 分子群体开始离解成单链时的温度。在本技术领域内， 多核苷酸 Tm 的计算公式是众所周知 的。例如， Tm 可由下列公式计算 ： Tm ＝ 69.3+0.41 x(G+C)％ -650/L， 其中 L 是核苷酸探针 的长度。同时， 也可应用 1M 盐的杂交实验所采用的、 通常用于计算 PCR 引物的 Tm 的公式评 估杂交多核苷酸的 Tm ： 例如， [(A+T 数 )x 2℃ +(G+C 数 )x 4℃ ]， 参见 Newton 等 (1997)， 第 2 版 PCR(Springer-Verlag， 纽约 )。本技术领域存在着其他更复杂的计算结果， 其中对 于 Tm 的计算考虑到了结构以及序列特征。计算好的 Tm 仅仅是估计值 ； 最佳温度通常是凭 经验而确定的。
通常情况下， 严格的条件应是那些盐浓度小于 1.5M 的钠离子， 通常在 pH 为 7.0 至 8.3， 同时短探针 ( 即 10 至 50 个核苷酸 ) 的温度至少约为 30℃， 而长探针 ( 如大于 50 个核 苷酸 ) 的温度至少约为 60℃ ( 例如， 大于 50 个核苷酸 ) 时约为 0.01 至 1.0M 的钠离子浓 度 ( 或其他盐类 )。采用添加诸如甲酰胺之类的去稳定剂的情况下， 也可达到严格的条件。 模范的低严紧度条件包括采用 37℃时 30％至 35％的甲酰胺、 1M 氯化钠、 1％ SDS( 十二烷基 硫酸钠 ) 缓冲溶液的杂交和 50 至 55℃时 1X 至 2X SSC(20X SSC ＝ 3.0M 氯化钠 /0.3M 柠 檬酸钠 ) 的清洗。模范的中等严紧度条件包括采用 37℃时 50％的甲酰胺、 1M 氯化钠、 1％ SDS( 十二烷基硫酸钠 ) 缓冲溶液的杂交和 55 至 60℃时的 0.5X 至 1X SSC 的清洗。模范的 高严紧度条件包括在 37℃、 50％的甲酰胺、 1M 氯化钠、 1％ SDS 中的杂交和 60 至 65℃时的 0.1X SSC 中的清洗。或者， 清洗缓冲液可包括约 0.1％至 1％的 SDS。杂交持续时间一般少 于 24 小时左右， 通常约为 4 至 12 小时。洗涤持续时间至少应有足够的长度， 以达到平衡。
也可以通过 PCR 反应来确定相应序列。 参见 Sambrook 等 (1989)， 分子克隆实验室 手册 ( 第 2 版， 冷泉港实验室出版社， 冷泉港， 纽约 )。？也可参见 Innis 等 (1990)， PCR 检 测方法及应用指南 ( 学术出版社， 纽约 ) ； Innis 和 Gelfand 编著 (1995)， PCR 策略 ( 学术出 版社， 纽约 ) ； 以及 Innis 和 Gelfand 编著 (1999)， PCR 方法手册 ( 学术出版社， 纽约 )。本 发明的引物可以采用本技术领域内已知的技巧制备， 包括但不限于适当序列的克隆和消化 以及直接化学合。
可用于制备本发明引物的化学合成方法包括但不仅限于 ： Narang 等在酶学方法 68 ： 90(1979) 中所述的磷酸三酯法， Brown 等在酶学方法 68 ： 109(1979) 中披露的磷酸二酯 法， Beaucage 等在四面体快报 22 ： 1859(1981) 中披露的二乙基氨基磷酸酯方法， 以及美国 专利 4,458,066 中所述固体载体法。此处也构思了采用自动化的寡核苷酸合成器来制备本 发明的合成寡核苷酸引物。 此外， 如果需要的话， 该引物可以采用本技术领域的已知技术来 标记， 并描述如下。
植物表达盒
如前所述， 靶向有效链接至所关注多肽上的本发明的质体前导肽可将所链接的多 肽转运至质体上。因此， 当前导肽组装成 DNA 构建体并用于转化植物时， 它可在表达后介导所关注多肽至转化植物细胞、 植物和种子的质体上。 因此， 本发明的组成还包括转化和表达 的核酸序列及目标多肽在所关注植物细胞质体内的累积。核酸序列可能存在于 DNA 构建体 或表达盒内。此处使用的 “表达盒” 是指能够介导特定核苷酸序列在适当宿主细胞内表达 的核酸分子， 其中包括有效链接至所关注核苷酸序列 ( 即编码所关注多肽的核苷酸序列 ) 的引物， 它可有效链接至终端信号上。通常它还包括核苷酸序列适当翻译所需的序列。组 成所关注核苷酸序列的表达盒可以是嵌合体， 这意味着， 至少它的组件之一与至少一个其 他组件是异源的。 表达盒也可以是自然存在的， 但已可以得到其易于异源表达的重组形式。 然而， 通常情况下， 表达盒是与其宿主呈异源性的， 即特定的表达盒 DNA 序列不会在宿主细 胞中天然出现， 而必须通过转化事件而被引入至宿主细胞或宿主细胞前身内。只有当宿主 细胞暴露在某些特定的外部刺激下时， 表达盒中核苷酸序列的表达才可在启动转录的诱导 型启动子的组成启动子的控制下进行。此外， 该启动子还可以具体到某一特定的组织或器 官或其发育阶段。
本发明包括具有能够介导所关注多肽在植物细胞质体中表达和累积的表达盒的 转化植物。表达盒应包括 5′ -3′方向的转录、 转录和翻译起始区域 ( 即启动子 )、 编码质 体前导肽的多核苷酸和编码所关注多肽的多核苷酸。或者， 表达盒还可以包括在植物中发 挥功能的转录和翻译终止区域 ( 即终止区 )。 除了编码质体前导肽的多核苷酸序列以外， 该构建体可进一步包括额外的调控元 件， 以促进所关注多肽的转录、 翻译或转运。 表达构建体的调控序列可有效地与所关注的多 核苷酸相链接。由 “有效链接” 是指在一个调控元件与第二个序列之间的功能性链接， 其中 调控元件启动和 / 或介导 DNA 序列的转录、 翻译或易位。一般来说， 术语 “有效链接” 意指 链接至连续或彼此相邻的核苷酸序列。调控元件包括启动子、 增强子以及有益于靶向细胞 质合成的蛋白质至植物细胞质体的信号序列。在一个实施例中， 该构建体包括 5′至 3′方 向的转录、 转录和翻译起始区域 ( 即启动子 )、 编码质体前导肽的多核苷酸和编码所关注多 肽的多核苷酸。
本发明的实施中， 可使用能够驱动所关注植物表达的任何启动子。启动子可以是 天然的或与植物宿主异质或异源的类似物。此处使用的术语 “异源的” 和 “外源的” 指核酸 序列 ( 如 DNA 或 RNA 序列 ) 或基因， 指来源于特定宿主细胞外源的序列， 如果指相同来源， 则为原始形式的修饰序列。因此， 宿主细胞的异源基因包括特定宿主细胞内生但经过修饰 的基因， 如利用 DNA 改组 (DNA shuffling) 修饰的基因。这些术语也包括天然存在 DNA 序 列的非天然发生的多拷贝。因此， 这些术语指细胞外源或异源的 DNA 片段， 或与细胞同源但 在宿主细胞核酸内其中该元件通常不会出现的位置的 DNA 片段。可通过外源 DNA 片段的表 达而产生外源性多肽。
“同源的” 核酸 ( 如 DNA) 序列是与接受导入的宿主细胞天然相关的核酸 ( 如 DNA 或 RNA) 序列。
纳入启动子的选择取决于多种因素， 包括但不限于效率、 可选择性、 诱导性、 所需 的表达水平以及细胞或组织优选的表达。 作为本技术领域一种常规的技能方式是通过适当 选择和定位启动子和其他相对于其序列的调节区域来调节序列的表达。
一些合适的启动子只启动转录， 或主要在某些类型的细胞中启动转录。因此， 此处使用的细胞类型或组织类型的启动子是优先驱动目标组织表达， 但也导致一些其他
细胞类型或组织类型表达的启动子。例如， 在以下参考文献中所述的鉴定和表征植物基 因组 DNA 启动区的方法 ： Jordano 等， 植物细胞 1 ： 855-866(1989 年 ) ； Bustos 等， 植物细 胞1： 839-854(1989) ； Green 等， EMBO 杂 志 7， 4035-4044(1988) ； Meier 等， 植 物 细 胞 3， 309-316(1991) ； 以及 Zhang 等， 植物生理学 110 ： 1069-1079(1996)。
为了驱动绿色组织， 如叶和茎中的转录， 在光合成组织中活跃的启动子是本发明 特别感兴趣的对象。最适合的是仅或主要在这些组织中驱动表达的启动子。启动子可以在 整个植物内组成性地协调表达， 或相对于绿色组织进行差异表达， 或在发生表达的绿色组 织的不同发育阶段进行差异表达， 或适应外部刺激而进行差异表达。
这些启动子的实例包括核酮糖 -1， 5- 二磷酸羧化酶 (RbcS) 启动子， 如来自东部 落叶松 (Larix laricina) 的 RbcS 启动子， 松树 cab6 启动子 (Yamamoto 等 (1994)， 植物和 细胞生理学 35 ： 773-778)， 来自小麦 (Fejes 等 (1990)， 植物分子生物学 15 ： 921-932) 的 Cab-1 基因启动子， 来自菠菜的 CAB-1 启动子 (Lubberstedt 等 (1994)， 植物生理学 104 ： 997-1006)， 来自大米 (Luan 等 (1992)， 植物细胞 4 ： 971-981) 的 cab1R 启动子， 来自玉米 (Matsuoka 等 (1993)PNAS USA 90 ： 9586-9590) 的丙酮酸正磷酸二激酶 (PPDK) 启动子， 烟草 Lhcb1*2 启动子 (Cerdan 等 (1997)， 植物分子生物学 33 ： 245-255)， 拟南芥 SUC2 蔗糖 -H+ 共 转运体启动子 (Truernit 等 (1995)， 植物 196 ： 564-570) 和来自菠菜的类囊体膜蛋白菠菜 启动子 (psaD、 psaF、 psaE、 PC、 FNR、 atpC、 atpD、 cab、 rbcS)。美国专利申请号 2007/0006346 中说明了驱动茎、 叶和绿色组织转录的其他启动子， 此处以其整体引用的方式构成本文的 部分。
Hudspeth 和 Grula( 植物分子生物学 12 ： 579-589， 1989) 已对编码磷酸烯醇式羧 化酶的玉米基因 (PEPC) 进行了说明。应用标准分子生物学技术， 该基因的启动子可以绿色 组织的特异方式用于驱动转基因植物中任何基因的表达。
在本发明的一些其他实施例中， 诱导型启动子可能是理想的选择。诱导型启动子 可适应诸如化学物质或环境刺激在内的外部刺激而驱动转录。例如， 诱导型启动子可以适 应诸如赤霉素或乙烯之类的激素或适应光或干燥而协调转录。
多种转录终止子可用于表达盒。这些对于转基因和校正 mRNA 多聚腺苷酸化之外 的转录终止是责任重大的。 终止区可以是天然的转录起始区， 可以是所关注的有效链接 DNA 序列， 可以是天然的植物宿主， 或可以是其他来源 ( 即外源或异源启动子、 所关注的 DNA 序 列、 植物宿主或其任何组合 )。适当的转录终止子是那些植物中已知的功能终止子， 且包括 CAMV 35S 终止子、 tml 终止子、 胭脂碱合成酶终止子和豌豆 rbcs E9 终止子。这些可用于单 子叶植物和双子叶植物。此外， 可采用基因的天然转录终止子。
在一些实施例中， 表达盒应包括用于转化细胞选择的选择标记基因。利用选择标 记基因进行转化细胞或组织的选择。
人们已经证实了为数众多的序列能够提高转录单元内的基因表达， 而这些序列可 以结合本发明的基因用来增加其在转基因植物中的表达。
已证实， 各种内含子序列能够增强表达， 特别是单子叶植物细胞中的表达。例如， 经证实， 玉米 Adhl 基因的内含子当被导入玉米细胞中时， 能够显著增强其相应启动子条件 下野生型基因的表达。据证实， 内含子 1 是特别有效的， 并能够增强氯霉素乙酰转移酶基因 融合构建体的表达 (Callis 等， 基因与发育 1 ： 1183-1200(1987))。在相同的实验系统中，玉米青铜色 1 基因的内含子在增强表达过程中有相似的效果。内含子序列已定期整合入植 物转化载体中， 通常是在非翻译的前导序列内。
已知许多来自病毒的非翻译前导序列也能够增强表达， 而这些在双子叶细胞中 特别有效。具体来说， 来自烟草花叶病毒的前导序列 (TMV， “W- 序列” )， 玉米枯黄斑点病 毒 (MCMV) 和苜蓿花叶病毒 (AMV) 的前导序列已被证明能够有效地增强表达 ( 如 Gallie 等， 核酸研究 15 ： 8693-8711(1987) ； Skuzeski 等， 植物分子生物学 15 ： 65-79(1990))。本 技术领域已知的其他前导序列包括但不限于 ： 例如， 小 RNA 病毒前导序列、 EMCV 前导序 列 ( 脑心肌炎 5′非编码区 )(Elroy-Stein， O.， Fuerst， T.R.， 和 Moss， B.PNAS USA 86 ： 6126-6130(1989)) ； 马 铃 薯 Y 病 毒 组 前 导 序 列， 例 如 TEV 前 导 序 列 ( 烟 草 蚀 纹 病 毒 ) (Allison 等， 1986) ； MDMV 前导序列 ( 玉米矮花叶病毒 ) ； 病毒学 154 ： 9-20) ； 人免疫球蛋白 重链结合蛋白 (BiP) 前导序列 (Macejak， D.G.， 和 Samow， P.， 自然 353 ： 90-94(1991))， 苜 蓿花叶病毒外壳蛋白 mRNA(AMV RNA 4) 未翻译的前导序列 (Jobling， S.A. 和 Gehrke， L.， 自然 325 ： 622-625(1987)) ； 烟草花叶病毒 (TMV) 前导序列 (Gallie， D.R. 等， RNA 分子生物 学， 第 237-256 页 (1989) ； 以及玉米枯黄斑点病毒 (MCMV) 前导序列 (Lommel， S.A. 等， 病毒 学 81 ： 382-385(1991)。同时也参见 Della-Cioppa 等， 植物生理学 84 ： 965-968(1987)。
正如所述， 质体转运肽能够有效链接至可转运入质体内的多肽上。所关注的多肽 特性包括最初使种子公司、 种植者或谷物加工者受益的农艺学特性， 例如， 除草剂抗性、 抗 病毒、 抗细菌病原体、 昆虫抗性、 线虫抗性和真菌抗性。例如， 参见美国专利号 ： 5,569,823 ； 5,304,730 ； 5,495,071 ； 6,329,504 和 6,337,431。所关注的特性也可以是能够增加植物 活力或产量 ( 包括使植物在不同温度、 土壤条件及日光强度和降水程度的条件下生长的特 性 )， 或允许鉴定表现出所关注特性的植物的特性 ( 例如， 选择标记基因、 种皮颜色等 )。在 本技术领域内可获得有助于生成具有所需的二次特性的过多基因。
所关注的抗除草剂基因包括那些编码乙酰乳酸合成酶 (ALS) 前体， 例如， 参见美 国专利号 5,013,659 ； 突变的乙酰乳酸合成酶 ； 3- 烯醇式丙酮酰莽草酸 -5- 磷酸合成酶 (EPSP 合成酶 )， 例如， 参见美国专利号 4,971,908 和 6,225,114 ； 质体中发生的包括光合作 用在内的生理过程的修饰酶 ； 脂肪酸， 氨基酸， 油、 类胡萝卜素、 萜类和淀粉等的基因。其他 所关注的基因包括但不限于那些编码玉米黄质环氧化酶、 胆碱单加氧酶、 亚铁螯合酶、 ω-3 脂肪酸去饱和酶、 谷氨酰胺合成酶、 淀粉修饰酶、 人体必需氨基酸、 维生素 A 原、 激素、 Bt 毒 蛋白等的基因。可获得本技术领域内这些多肽的核苷酸序列。
植物
本发明的有用植物包括至少编码一种所关注质体前导肽的多核苷酸的转基因植 物。 这些植物应包括能够编码有效链接至编码所关注多肽的多核苷酸上的前导肽的多核苷 酸。 本技术领域的技能之一应认识到所关注的多肽序列可能与一个或多个感兴趣的次要特 性相关或促成这些次要特性。这些多肽是细胞质表达的， 并定位至质体上。
选择的植物类型取决于多种因素， 例如， 包括收获植物材料的下游应用、 植物物种 的顺从改造以及在植物的栽培、 收获和 / 或加工条件。本技术领域的技能之一应进一步认 识到， 本发明的应用选择适当植物品种的其他因素包括高产潜力、 良好的秸秆强度、 抵抗特 定疾病、 耐旱、 快速干燥以及以最小损失足以完成市场存储和运输的粮食质量。
进一步设想的是， 本发明的构建体可以引入特定下游应用的适合或最佳性能改进的植物品种中。本发明的有用植物包括但不仅限于 ： 单子叶和双子叶植物， 尤其是农作 物如玉米、 大豆、 小麦、 水稻、 芸苔等。所关注植物物种的例子包括但不仅限于 ： 玉米 (Zea mays) ； 芸苔 ( 如甘蓝型油菜 B.napus， 白菜 B.rapa， 芥菜 B.juncea)， 尤其是适用于种籽油 来源的甘蓝 ； 紫花苜蓿 (Medicago sativa)， 水稻 (Oryza sativa)， 黑麦 (Secale cereale)， 高 粱 (Sorghum bicolor， Sorghum vulgare)， 粟 ( 如 珍 珠 粟 (Pennisetum glaucum)， 黍 子 (Panicum miliaceum)， 谷 子 (Setaria italica)， 穇 子 (Eleusine coracana))， 向日 葵 (Helianthus annuus)， 红 花 (Carthamus tinctorius)， 小 麦 (Triticum aestivum)， 大豆 (Glycine max)， 烟草 (Nicotiana tabacum)， 土豆 (Solanum tuberosum)， 棉花 ( 海 岛 棉 Gossypium barbadense， 陆 地 棉 Gossypium hirsutum)， 甘 薯 (Ipomoea batatus)， 木薯 (Manihot esculenta)， 咖啡 (Coffea spp.)， 椰子 (Cocos nucifera)， 菠萝 (Ananas comosus)， 柑桔 (Citrus spp.)， 可可 (Theobroma cacao)， 山茶 (Camellia sinensis)， 香 蕉 (Musa spp.)， 鳄梨 (Persea americana)， 榕属 (Ficus casicacasica)， 番石榴 (Psidium guajava)， 芒果 (Mangifera indica)， 橄榄 (Olea europaea)， 番木瓜 (Carica papaya)， 腰 果 (Anacardium occidentale)， 夏 威 夷 果 (Macadamia integrifolia)， 杏 仁 (Prunus amygdalus)， 甜菜 (Beta vulgaris)， 甘蔗 (Saccharum spp.)， 燕麦， 大麦， 蔬菜， 观赏植物和 针叶树。 蔬菜包括番茄 (Lycopersicon esculentum)， 莴苣 ( 如山莴苣 Lactuca sativa)， 四季豆 (Phaseolus vulgaris)， 扁白豆 (Phaseolus limensis)， 豌豆 (Lathyrus spp.)， 如 香瓜属成员， 如黄瓜 (C.sativus 黄瓜 )， 哈密瓜 (C.cantalupensis) 和甜瓜 (C.melo)。观 赏植物包括杜鹃花 (Rhododendron spp.)， 绣球 (Macrophylla hydrangea)， 芙蓉 (Hibiscus rosasanensis)， 玫瑰 (Rosa spp.)， 郁金香 (Tulipa spp.)， 水仙 (Narcissus spp.)， 矮牵牛 (Petunia hybrida)， 康乃馨 (Dianthus caryophyllus)， 一品红 (Euphorbia pulcherrima) 和菊花。
所关注的植物包括花椰菜 (Brassica oleracea)、 朝鲜蓟 (Cynara scolvmus) 和 红花 ( 如 Carthamus tinctorius) ； 水果如苹果 ( 如 Malus， e.g.domesticus)， 香蕉 ( 如 Musa acuminata)， 浆果 ( 如醋栗， 红穗状醋栗 Ribes rubrum)， 樱桃 ( 如甜樱桃， 欧洲甜 樱桃 Prunus avium)， 黄瓜 ( 如 Cucumis sativus)， 葡萄 ( 如 Vitis vinifera)， 柠檬 ( 洋 柠檬 Citrus limon)， 甜瓜 (Cucumis melo)， 坚果 ( 如核桃 Juglans regia， 花生 Arachis hypoaeae)， 柑橘 (Citrus maxima)， 桃 ( 如 Prunus persica)， 梨 ( 如 Pyra communis)， 胡 椒 (Solanum capsicum)， 李子 ( 如洋李 Prunus domestica)， 草莓 ( 如麝香草莓 Fragaria moschata)， 番 茄 ( 如 Lycopersicon esculentum) ； 叶 子， 如 紫 花 苜 蓿 ( 如 Medicago sativa)， 甘蔗 (Saccharum)， 卷心菜 ( 如硬花甘蓝 Brassica oleracea)， 菊苣 ( 如 Cichoreum endivia)， 韭 菜 ( 如 Allium porrum)， 莴 苣 ( 如 Lactuca sativa)， 菠 菜 ( 如 Spinacia oleraceae)， 烟草 ( 如 Nicotiana tabacum) ； 根， 如竹芋 ( 如 Maranta arundinacea)， 甜菜 ( 如 Beta vulgaris)， 胡萝卜 ( 如 Daucus carota)， 木薯 (Manihot esculenta)， 芜菁 ( 如 Brassica rapa)， 萝 卜 ( 如 Raphanus sativus) 甘 薯 ( 如 Dioscorea esculenta)， 蕃薯 (Ipomoea batatas) ； 种子， 如豆 ( 如菜豆 Phaseolus vulgaris)， 豌豆 ( 如 Pisum sativum)， 大豆 ( 如 Glycine max)， 小麦 ( 如 Triticum aestivum)， 大麦 ( 如 Hordeum vulgare)， 玉 米 ( 如 Zea mays)， 水稻 ( 如 Oryza sativa) ； 禾本科植物， 如芒草 ( 如巨芒 Miscanthus
giganteus) 和柳枝稷 ( 如 Panicum virgatum) ； 树木， 如白杨 ( 如 Populus tremula)， 松 树 (Pinus) ； 灌木， 如棉花 ( 如 Gossypium hirsutum) ； 以及根茎类， 如大头菜 ( 如 Brassica oleraceae)， 土豆 ( 如 Solanum tuberosum)， 等等。
植物转化
可以通过许多技术认可的方式将本文所述的表达构建体引入植物细胞中。 在多核 苷酸 ( 例如， 所关注的核苷酸构建体 ) 的情况下， “导入” 一词旨在表示以多核苷酸得以进 入植物细胞内部这样的方式将其呈递至植物。凡导入一个以上核苷酸的情况下， 这些多核 苷酸可被装配成单核苷酸构建体的一部分， 或装配成单独的核苷酸构建体， 且可位于相同 或不同的转化载体上。 相应地， 这些多核苷酸可在植物内单一的转化事件中， 单独的转化事 件中， 或者作为育种规程的一部分而被引入所关注的宿主细胞。本发明的方法不依赖于植 物引入一个或多个多核苷酸的特定方法， 而只取决于多核苷酸至少得以进入一个植物细胞 的内部。 本技术中， 植物导入多核苷酸的方法， 已知包括但不仅限于， 瞬间转化法、 稳定转化 法， 以及病毒介导法。
在多核苷酸的情况下， “瞬间转化” 旨在表示多核苷酸被导入植物， 而并不会被整 合至植物基因组中。 在导入植物的多核苷酸的情况下， 由 “稳定导入” 或 “稳定导入后的” 意指导入的 多核苷酸是稳定包含在植物基因组中的， 因而该植物可与此多核苷酸一起被稳定转化。
“稳定转化” 或 “稳定转化后的” 旨在表示被导入植物中的多核苷酸 ( 如本文所述 的核苷酸构建体 ) 整合至植物基因组内， 并能够由其后代遗传， 更具体地说， 能够由多个连 续后代遗传。
在这些植物转化的技术中， 对于那些普通技能而言， 许多可用于植物转化的转化 载体是众所周知的， 并且本发明的有关基因可与任何此类载体一起使用。载体的选择将取 决于首选的转化技术和转化的目标物种。对于某些目标物种， 可以首选不同的抗生素或除 草剂的选择性标记。转化过程中常规使用的选择性标记包括 nptll 基因， 它赋予了对卡那 霉素和相关抗生素的耐药性 (Messing 和 Vierra， 基因 19 ： 259-268(1982) ； Bevan 等， 自然 304 ： 184-187(1983)) ； bar 基因， 它赋予了对除草剂膦的耐受性 (White 等， 核酸研究 18 ： 1062(1990)， Spencer 等， 理论与应用遗传学 79 ： 625-631(1990)) ； hph 基因， 它赋予了对抗 生素潮霉素的耐药性 (Blochinger 和 Diggelmann， 分子和细胞生物学 4 ： 2929-2931) ； 以 及 dhfr 基因， 它赋予了对甲氨蝶呤的抗性 (Bourouis 等， EMBO 杂志 2(7) ： 1099-1104(1983 年 )) ； EPSPS 基因， 它赋予了对草甘膦的抗性 ( 美国专利号 4,940,935 和 5,188,642)， 以 及甘露糖 -6- 磷酸异构酶基因， 它提供了代谢甘露糖的能力 ( 美国专利号 5,767,378 和 5,994,629)。
在本技术中， 植株再生的方法也是众所周知的。例如， Ti 质粒载体已被用于传递 外源 DNA， 以及 DNA 直接摄取， 脂质体， 电穿孔， 显微注射以及基因枪微弹。此外， 农杆菌属 (Agrobacterium) 细菌可被用于转化植物细胞。以下是双子叶植物和单子叶植物转化的代 表性技术以及代表性的质体转化技术的说明。
许多载体都可采用根癌农杆菌 (Agrobacterium tumefaciens) 进行转化。这 些载体通常至少携带一个 T-DNA 边界序列， 并包括诸如 pBIN19 这类的载体 (Bevan， 核 酸研究 (1984))。对于农杆菌转化的有益载体构建体， 例如， 参见美国专利申请公布号
2006/0260011， 均通过引用的方式而构成本文的一部分。
未使用根癌农杆菌的转化规避了选定转化载体中对 T-DNA 序列的要求， 因此除了 诸如上述包含 T-DNA 序列的载体以外， 还可利用缺乏这些序列的载体。不依赖农杆菌的转 化技术包括通过粒子轰击、 原生质体摄取 ( 如 PEG 和电穿孔 ) 以及显微注射而进行的转化。 载体选择在很大程度上取决于被转化物种的优先选择。
在本技术中， 双子叶植物的转化技术是众所周知的， 并且包括基于农杆菌的技术 和不需农杆菌的技术。非农杆菌技术涉及直接由原生质体或细胞直接摄取外源遗传物质。 这可以通过 PEG 或电穿孔介导的摄取、 粒子轰击介导的传递， 或显微注射而实现。这些技 术的例子如 Paszkowski 等， EMBO 杂志 3 ： 2717-2722(1984)， Potrykus 等， 分子遗传学和基 因组学 199 ： 169-177(1985)， Reich 等， 生物技术 4 ： 1001-1004(1986) 以及 Klein 等， 自然 327 ： 70-73(1987) 所述。在每种情况下， 转化细胞均采用本技术中已知的标准技术再生成 全植物。
农杆菌介导的转化为双子叶植物转化的首选技术， 这是由于其高效率的转化及 许多不同物种的广泛应用。农杆菌转化通常涉及的携带所关注外源 DNA( 如 pCIB200 或 pCIB2001) 的二元载体向适当农杆菌菌株的转移， 其宿主农杆菌菌株所携带的 vir 基因的 补充可能取决于共驻存的 Ti 质粒或染色体 ( 如 pCIB200 和 pCIB2001 的 CIB542 菌株 (Uknes 等， 植物细胞 5 ： 159-169(1993))。重组二元载体向农杆菌的转移是采用携带着重组二元载 体的大肠杆菌 ( 一种携带着诸如 pRK2013 质粒且能够将重组二元载体移动至目标农杆菌菌 株上的辅助大肠杆菌 ) 通过三亲株的交配程序而完成的。另外， 重组二元载体可通过 DNA 转化而被转移至农杆菌上 (Hofgen 和 Willmitzer， 核酸研究 16 ： 9877(1988))。
重组农杆菌介导的目标植物物种的转化通常涉及农杆菌与植物外植体的协同培 养， 并遵循本技术中众所周知的规程而进行。转化组织在携带着存在于二元质粒 T-DNA 边 界之间的抗生素或除草剂抗性标记的选择性培养基上再生。
携带基因的植物细胞转化的另一种方法涉及推动植物组织和细胞的惰性或生物 活性粒子。Sanford 等的美国专利 4,945,050 号， 5,036,006 号和 5,100,792 号均披露了这 种技术。一般来说， 这种方法涉及在有效渗透至细胞外表面并提供了其内部整合的条件下 推动惰性或生物活性粒子。当利用惰性粒子时， 载体可以通过包被携带有含所需基因载体 的粒子而被引入至细胞内。 另外， 目标细胞可被载体包围， 以致于载体能够通过粒子尾流而 得以进入细胞。生物活性粒子 ( 例如， 干酵母细胞， 干细菌或噬菌体， 每种均含有试图引入 的 DNA) 也可以被推入植物细胞组织中。
大多数单子叶植物的物种转化目前也已成为常规程序。优先考虑的技术包括采 用 PEG 或电穿孔技术的原生质体直接基因转移以及粒子轰击至愈伤组织内。转化可以采 用单个 DNA 物种或多个 DNA 物种 ( 即共转化 ) 进行， 且两种技术均适合用于本发明。共转 化可能具有避免完全型载体构建体及产生具有所关注基因的非伴性基因座和选择性标记 的转基因植株， 能够在后代中去除选择性标记的优势， 这应该被视为可取的。然而， 共转化 应用的缺点是单独 DNA 物种被整合至基因组的频率低于 100％ (Schocher 等， 生物技术 4 ： 1093-1096(1986))。
专利申请 EP 0 292 435、 EP 0 392 225 和 WO 93/07278 描述了采用 PEG 或电 穿孔法制备原种纯系玉米的愈伤组织和原生质体， 及转化原生质体玉米植株的再生技术。Gordon-Kamm 等 ( 植物细胞 2 ： 603-618(1990)) 和 Fromm 等 ( 生物技术 8 ： 833-839(1990)) 已发表了采用粒子轰击法转化 A188 衍生的玉米株的技术。 此外， WO 93/07278 和 Koziel 等 ( 生物技术 11 ： 194-200(1993)) 描述了采用粒子轰击法转化原种纯系玉米的技术。这种技 术利用从玉米授粉后 14-15 天的玉米穗切断的 1.5-2.5mm 长的玉米幼胚和 PDS-1000He 的 生物弹轰击设备。
水稻转化也可以采用直接基因转移技术利用原生质体或粒子轰击法进行。已对 粳型和籼型原生质体介导的转化进行了描述 (Zhang 等， 植物细胞报告 7 ： 379-384(1988) ； Shimamoto 等， 自然 338 ： 274-277(1989) ； Datta 等， 生物技术 8 ： 736-740(1990))。 这两种类 型也经常可采用粒子轰击法 (Christou 等， 生物技术 9 ： 957-962(1991)) 进行转化。此外， WO 93/21335 描述了通过电穿孔而转化水稻的技术。
专利申请 EP 0 332 581 描述了早熟禾亚科原生质体产生、 转化和再生的技术。这 些技术允许鸭茅和小麦的转化。此外， Vasil 等 ( 生物技术 10 ： 667-674(1992)) 已采用粒 子轰击进入 C 型长期再生愈伤组织的细胞描述了小麦转化， 而且 Vasil 等 ( 生物技术 11 ： 1553-1558(1993)) 和 Weeks 等 ( 植物生理学 102 ： 1077-1084(1993)) 也已采用粒子轰击幼 胚和幼胚来源的愈伤组织而对此进行了描述。然而， 小麦转化的首选技术涉及通过粒子轰 击而进行的小麦幼胚转化， 也包括基因传递之前的高蔗糖或高麦芽糖步骤。 在轰击之前， 将 任何数目的胚胎 (0.75-1 长 ) 涂布至含 3％蔗糖和 3mg/L 2， 4-D 的 MS 培养基上 (Murashiga 和 Skoog， Physiologia Plantarum 15 ： 473-497(1962)) 以诱导体细胞胚， 这是允许在黑暗 中进行的。在选定的轰击当天， 从诱导培养基取胚胎， 并置于渗压剂 ( 即按照一般为 15％ 的所需浓度添加的蔗糖或麦芽糖诱导培养基 ) 上。允许这些胚胎完成胞质皱缩达 2-3 小 时， 然后对其进行轰击。虽然不是很关键， 但每块目标平板的 20 个胚胎是典型的。可采 用标准方法将合适的携带基因的质粒沉淀至微米大小的金颗粒上。每板胚胎均用 DuPont BIOLISTICS 氦设备采用约 1000psi 的标准 80 筛网的爆破压力进行射击。轰击后， 这些胚 胎被放置回黑暗处以恢复约 24 小时， 仍置于渗透性培养基上。24 小时后， 从渗压剂中取出 这些胚胎， 并放置回诱导培养基上， 再生前在该处维持大约 1 个月。约一个月后， 携带发育 型胚胎形成的愈伤组织的胚胎外植体被转移至再生培养基上 (MS+1mg/L 的 NAA， 5mg/LGA)， 进一步包含适当的选择性试剂。约一个月后， 发育的芽被转移至称为 “GA7s “的大型无菌容 器中， 其中含有半浓度 MS， 2％蔗糖， 以及相同浓度的选择性试剂。
采用农杆菌对单子叶植物的转化也进行了描述。参见 WO 94/00977 及美国专利号 5,591,616 和 Negrotto 等， 植物细胞报告 19 ： 798-803(2000)。
例如， 水稻 (Oryza sativa) 可用于产生转基因植物。也可使用各种水稻品种 (Hiei 等， 1994 年， 植物学报 6 ： 271-282 ； Dong 等， 1996 年， 分子育种 2 ： 267-276 ； Hiei 等， 1997 年， 植物分子生物学， 35 ： 205-218)。此外， 下文所述的各种培养基组分可能是有不同 的数量差异或各种取代的。胚胎发生反应得以开始， 和 / 或通过在 MS-CIM 培养基 (MS 基础 盐， 4.3g/L ； B5 维生素 (200X)， 5ml/L ； 蔗糖， 30g/L ； 脯氨酸， 500mg/L ； 谷氨酰胺， 500mg/L ； 酪蛋白水解物， 300mg/L ； 2， 4-D(1mg/mL)， 2mL/L， 用 1N KOH 将 pH 值调整至 5.8 ； 植物凝胶， 3g/L) 上的培养而建立了成熟胚培养物。无论是在培养物反应初始阶段的成熟胚还是已构 建的培养呼吸品系均给予接种， 并与包含所需载体构建体的根癌农杆菌菌株 LBA4404( 农 杆菌 ) 进行共培养。将农杆菌从固体 YPC 培养基 (100mg/L 的壮观霉素和任何其他适当的抗生素 ) 的甘油储备液中于 28℃培养 2 天。将农杆菌在液肽 MS-CIM 培养基中重悬。将此 农杆菌培养液稀释至 0.2-0.3 的 OD600 值， 并且添加乙酰丁香酮至 200uM 的终浓度。在将 该溶液与水稻培养物混合之前， 添加乙酰丁香酮以诱导农杆菌 DNA 向植物细胞的转移。对 接种而言， 将植物培养物浸入菌悬液中。 取液体菌悬液， 将接种后的培养物置于共培养培养 基上， 并于 22℃孵育两天。然后， 将此培养物转移至含有替卡西林 (400mg/L) 的 MS-CIM 培 养基上， 以抑制农杆菌的生长。对于利用 PMI 选择性标记基因 (Reed 等， 体外细胞与发育生 物学 - 植物 37 ： 127-132) 的构建体， 7 天后将培养物转移至含有甘露糖作为碳水化合物来 源的选择性培养基中 ( 含有 2％甘露糖， 300mg/L 替卡西林的 MS)， 并在暗处培养 3-4 周。然 后， 将抗性菌落转移至再生诱导培养基 ( 不含 2， 4-D， 0.5mg/L IAA， 1mg/L 玉米素， 200mg/L 特美汀， 2％甘露糖和 3％山梨醇的 MS) 上， 并于暗处生长 14 天。然后， 将增殖菌落转移至 新一轮的再生诱导培养基上， 并移动至光源生长室内。将再生芽转移至含有 GA7-1 培养基 ( 不含激素和 2％山梨醇的 MS) 的 GA7 容器中达 2 周， 然后当它们足够大且有足够根时， 将 其移至温室。将植物移植至温室内的土壤中 (T0 代 ) 生长成熟， 然后收获 T1 种子。
通过转化获得的具有本发明核酸序列的植物可以是任何种类繁多的植物物种， 其 中包括单子叶植物和双子叶植物中的物种， 但是， 本发明方法中使用的植物系优先从上述 提及的农艺学重要目标作物列表中选择得到的。 本发明的基因表达可与其他生产和质量的 重要特点相结合而得以通过育种被整合至植物株内。 育种方法和技术在本技术领域内是众 所周知的。 例如， 参见 Welsh J.R.， 植物遗传学与育种原理， John Wiley 和 Sons， NY(1981) ； 作物育种， Wood D.R.(Ed.) 美国麦迪逊农学院， 威斯康星州 (1983) ； Mayo O.， 植物育种理 论， 第二版， Clarendon 出版社， 牛津城 (1987) ； Singh， D.P.， 抗病虫害育种， 施普林格出版 社， 纽约州 (1986) ； Wricke 和 Weber， 数量遗传学与选择性植物育种， Walter de Gruyter 和 Co， 柏林 (1986)。
对于质体转化而言， 基本上如所述 (Svab， Z. 和 Maliga， P.(1993)PNAS USA 90， 913-917)， 在 T 琼脂培养基的 1″圆阵内每盘使 7 个 Nicotiana tabacum c.v. “Xanthienc” 的种子发芽， 并在以涂有 pPH143 和 pPH145 质粒 DNA 的 1 微米钨粒 (M10， Biorad， Hercules， 加利福尼亚州 ) 播种后将其轰击 12-14 天。将轰击后的幼苗在 T 培养基上孵育两天后， 切 断其叶子， 并将其背面一侧向上置于含有 500μg/mL 盐酸壮观霉素 (Sigma， 圣路易斯， 密 苏里州 ) 的 RMOP 培养基 (Svab， Z.， Hajdukiewicz， P. 和 Maliga， P.(1990)PNAS USA 87， 2 8526-8530) 平板的明亮光线 (350-500umol photons/m /s) 中， 。. 将轰击后 3 至 8 周漂 白叶下方出现的抗性芽亚克隆至相同的选择性培养基上， 以允许其形成愈伤组织， 并分离 和亚克隆二次芽。独立亚克隆的完全分离的转化质体基因组拷贝 ( 同质 ) 是通过 DNA 印 迹法的标准技术 (Sambrook 等， (1989 年 ) 分子克隆 ： 实验室手册， 冷泉港实验室， 冷泉港 ) 进行评估的。在 1％ Tris- 硼酸 (TBE) 琼脂糖凝胶电泳上， 对 BamHI/EcoRI 消化的全细胞 DNA(Mettler， I.J.(1987) 植物分子生物学报道基因 5， 346349) 进行了分离， 转移至尼龙 膜 (Amersham 公司 )， 并用从相应的包含质体前导序列部分的 PC8 所获得的 0.7kbBamHI/ HindIII DNA 片段的 32P 标记的随机引物 DNA 序列探针进行了探查。同质芽在无菌条件下 含壮观霉素的 MS/IBA 培养基 (McBride， K.E 等， (1994)PNAS USA 91， 7301-7305) 上生根， 并转移至温室。
以上所述设计好的转基因种子和植物的遗传特性是通过有性繁殖或营养生长来传代的， 因此可在后代植物中持续培养。 一般情况下， 维护和繁殖利用已知的建立好的农作 方法， 以适合特定用途， 如耕作、 播种或收割。
根据本发明， 转基因植物和种子的有利遗传特性的应用可以进一步在植物育种中 进行。根据所需的特性， 采取不同的育种措施。在本技术领域内， 相关技术是众所周知的， 包括但不仅限于 ： 杂交、 同系繁殖、 回交育种、 多品系育种、 品种混合、 种间杂交、 非整倍体技 术等。 因此， 根据本发明， 转基因种子和植物可用于改良植物品系的育种， 例如， 增加如除草 剂或杀虫剂处理的传统方法的有效性或因其改进的遗传特性而允许其以上述方法实施。
虽然在上述说明书中， 本发明已就其确定的首选实施例进行了描述， 且出于例证 的目的， 已经提到了很多细节， 但对本技术领域内熟练的那些人而言， 很明显本发明易于受 其他实施例的影响， 而本文所述的某些细节从本发明的基本原则出发， 可能有很大差别。
以下例子是通过例证的方式， 而不是通过限制的方式提供的。
实验
在本技术领域内， 此处使用的标准重组 DNA 和分子克隆技术是众所周知的， 并 由 J.Sambrook、 E.F.Fritsch 和 T.Maniatis， 分子克隆 ： 实验室手册， 冷泉港实验室， 冷泉 港， 纽约 (1989) 与 T.J.Silhavy、 M.L.Berman 和 L.W.Enquist， 基因融合实验， 冷泉港实 验室， 冷泉港， 纽约 (1984) 以及 Ausubel， F.M. 等， 分子生物学最新规程， 格林出版协会和 Wiley-Interscience 出版 (1987) 进行了描述。
例1： 生化定义的靶向质体间质的莱氏衣藻转运肽 (
来自高等植物的转运肽不是唯一能够在稳定的转化植株质体间质中介导外源蛋 白的分子。这是以质体蛋白导入的生物保守性为基础的。导致质体的内共生事件产生于单 细胞和多细胞光能营养生物分裂很久以前。在此期间， 内共生基因从叶绿体向核基因组的 转移导致通过导入基因获得了转运肽， 及质体内蛋白导入装备的发育。很明显， 高等植物 拥有独特的蛋白导入的特点。然而， 体外数据表明， 核编码的灰胞藻， 如褐藻 (Cyanophora paradoxa)(Steiner 和 Luffelhardt， 2005) 或 单 细 胞 藻 类 莱 氏 衣 藻 (Chlamydomonas reinhardtii)(Mishkind 等， 1985 和 Yu 等， 1988) 来源的质体蛋白可以通过来源于诸如菠菜 和豌豆等高等植物的质体而导入。
本发明包括来自低等光合生物的转运肽。 这些转运肽的基础是它们是通过从质体 中纯化得到的蛋白的 N- 末端测序而确定的。根据本发明， 为了定义转运肽和列出裂解位 点， 将纯化后蛋白的 N- 末端与基因序列进行了比较。转运肽是开放阅读框架的 5′段， 从 翻译起始密码子至该质体纯化蛋白的 N- 末端。其中一些已在莱氏衣藻 ( 中得以确定， 并由 Franzen 等 (1990) 在综述中进行了总结。
本发明包括来源于莱氏衣藻 PSI P28、 PSI P30、 PSI P35、 PSI P37、 核酮糖二磷酸羟 化酶 SS 和 ATPase- 亚基基因的转运肽， 其功能是将外源蛋白定位于转基因玉米的质体上。 本发明还包括来源于蓝细菌细胞色素 c550、 细胞色素 c553 和 psaF 亚基基因的转运肽， 其功 能是将外源蛋白定位于转基因玉米的质体上。转运肽来源于杜氏盐藻 ( 的 EPSPS 基因， 其 功能是将外源蛋白定位于转基因玉米的质体上。本发明的转运肽如表 2 所示。
表2： 来源于莱氏衣藻 (、 蓝细菌和杜氏盐藻 ( 的转运肽及其相应的 SEQ ID NO。
21CN 102471778 A说SEQ ID NO ： 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20明书基因名称 ： PSI P28 PSI P30 PSI P35 PSI P37 ssRubisco ATPase-γ 细胞色素 c550 细胞色素 c553 psaF D.salina EPSPS19/25 页每种转运肽应采用玉米编码序列表， 例如， 来自 Vector NTI 的软件而反向翻译成 玉米最优化的。除非另有说明， 每种转运肽的编码序列是由两个部分互补的寡核苷酸引物 的退火和延伸而组装得到的。叶绿体转运肽应与玉米优化的 AmCyan 蛋白编码序列， SEQ ID NO ： 32 相连接。这种蛋白质应被用来作为本文转运肽表征的报道基因。转运肽和属性蛋白 编码序列应由重叠延伸 PCR(SOE-PCR) 的剪接作用而相融合。应采用适当的限制性内切酶 消化此 PCR 产物， 并使其插入表达盒。应将完整的表达盒， SEQ ID NO ： 21 外加插入片段克 隆至含有 FMV 34S-CaMV 35S 二元增强复合体的根癌农杆菌二元载体中。应将每种二元载 体转化成玉米。
例2： 创建与 AmCyan 融合的转运肽
2A ： 创建 P28、 P30、 P35、 P37、 ssRubisco、 ATPase、 c550、 c553 和 psaF
以下引物从 Sigma 或 IDT 购买得到， 并用作正向 PCR 引物 (“AmCyan rev” 被用作 PCR 反应的反向引物 )， 以将转运肽融合至玉米优化的 AmCyan， SEQ ID NO ： 32 中。表 3 所示 的为引物序列及相应的 SEQ ID NOs。AmCyan 反向引物， SEQ ID NO ： 31， 被用于在 PCR 中融 合各种 CTP 至 AmCyan 序列的反向引物。
表3： 叶绿体转运肽引物序列
该引物被用于下列 PCR 混合物 ：
0.5μl pDNA 模板 (AmCyan- 个别叶绿体转运肽 ： 下面提供额外的细节 )、 1.0μl 正 向引物 (20μM)、 1.0μl 反向引物 (20μM)、 5.0μl Extensor green 缓冲液、 2.0μl Quik TM 液 、 1.0μl dNTPs(10mM)、 0.5μl PFU Turbo 聚合酶、 0.5μl 延伸聚合酶混合物、 38.5μl d2H2O。
采用以下热循环程序 ：
95℃保持 5 分钟 ( 变性 )， 95℃运行 10 次循环， 维持 1 分钟， 30℃保持 30 秒， 68℃ 保持 4 分钟， 随后 95℃运行 20 次循环， 保持 30 秒， 45℃保持 1 分钟， 以及 68℃保持 4 分钟， 并以 68℃条件用于延伸， 保持 15 分钟。
按照如下所述， 将产物进行凝胶纯化， 并用 SacI 或 NcoI/SacI 剪切， 绑定于适当
剪切的骨架载体 pSYN15460， SEQ ID NO ： 21 内。将 pSYN15460， SEQ ID NO ： 21 用 NcoI/ SacI 剪切， 以备用于插入以下序列 ： p28-AmCyan、 ssRUBISCO-AmCyan 和 ATPase-AmCyan。 将 pSYN15460， SEQ ID NO ： 21 用 NcoI 剪切， 采用 T4 DNA 聚合酶注入， 然后用 SacI 剪切， 以创建 blunt/SacI 片段用于插入以下序列 ： c550-AmCyan、 c553-AmCyan、 psaF-AmCyan、 p30-AmCyan、 p35-AmCyan 和 p37-AmCyan。
2B ： 杜氏盐藻 EPSPS 的创建
以下引物从 IDT 购买得到， 并用作正向和反向 PCR 引物， 以将转运肽融合至玉米 优化的 AmCyan， SEQ ID NO ： 32 中。将 pSYN15460， SEQ ID NO ： 21 骨架载体用 NcoI 剪切， 采用 T4 DNA 聚合酶注入， 然后用 SacI 剪切， 以创建 blunt/SacI 片段用于插入杜氏盐藻 EPSPS-AmCyan 报道基因。 通过 PCR 技术采用引物 SEQ ID NO ： 31 和 34 向 AmCyan 加入 EPSPS 重叠序列。表 4 所示的为引物序列及相应的 SEQ ID NOs。
表4： 叶绿体转运肽引物序列
该引物被用于下列混合物 ：
1.0μl pDNA 模板 (AmCyan-EPSPS)、 1.0μl 正向引物 (20μM)、 1.0μl 反向引物 (20μM)、 2.5μl Pfu( 菌落形成单位 ) 缓冲液、 1.0μl dNTPs(25mM)、 1.0μl PFU Turbo 聚 合酶、 17.5μl d2H2O。
采用以下热循环程序 ：
95℃保持 2 分钟 ( 变性 )， 95℃运行 30 次循环， 维持 1 分钟， 45℃保持 1 分钟， 68℃ 保持 4 分钟， 以 68℃条件用于最终延伸， 保持 15 分钟。
此 PCR 产物经凝胶纯化， 并与杜氏盐藻 EPSPS 的转运肽序列以摩尔浓度相结合。 按 照以下条件， 将下列引物， SEQ ID NO ： 31 和 34 用于 PCR 混合物中。
该引物被用于下列混合物 ：
1.0μl pDNA 模板 (AmCyan w/EPSPS 重叠序列 )、 1.0μl dsDNA 模板 (EPSPS 转 运肽 )， 1.0μl 正向引物 (20μM)、 1.0μl 反向引物 (20μM)、 2.5μl Pfu 缓冲液、 1.0μl dNTPs(25mM)、 1.0μl PFU Turbo 聚合酶、 16.5ml d2H2O。
采用以下热循环程序 ：
95℃保持 2 分钟 ( 变性 )， 95℃运行 30 次循环， 维持 1 分钟， 45℃保持 1 分钟， 68℃ 保持 4 分钟， 以 68℃条件用于最终延伸， 保持 15 分钟。
凝胶纯化此 PCR 产物， 用 SacI 剪切， 并与 pSYN15460 骨架， SEQ ID NO ： 21 相连接。
例 2A 和 2B 包括插入序列在内的完全型载体被分别转化至 DH5 感受态细胞内。 然后， 将转化后的 DH5 细胞用于制备适于长期储存的甘油储备液。应用这些细胞进行接 种， 并用于培养适合于 DNA 提取的液体培养液。从该甘油储备液中得到的 DNA 提取液是随 后克隆至根癌农杆菌二元载体内的基础。
例3： 叶绿体分离
从处于 V2-V3 阶段的玉米植株中分离玉米叶绿体。分离系根据 Asakura 等 ( 植物 细胞 16(1) ： 201-214 2004) 而调整的。分离前， 将植株置于温室土壤中生长， 然后， 将其放 置于暗处达 3-5 小时， 以减少光合作用， 从而在制备过程中除去淀粉。取下叶子， 并从叶子 上去除中脉。所有后续步骤均在冰浴上完成。将叶子剪成小碎片， 通常各总计 15g 的重量。 将切下的植物碎片置于冰冷的碾磨缓冲液中， 其中含有 50mM HEPES， pH 7.6， 0.33M 山梨醇， 1mM MgCl2， 2mM ETDA 和 1 ∶ 4(w ∶ v) 比例的 1％ (w ∶ v)BSA。将植物于冰浴上聚丙烯管 内的冷缓冲液中或者通过混合器或者用锋利的刀片手工轻轻匀浆成精细的切碎物， 以释放 其中的叶绿体， 并尽力减少叶绿体的破碎。匀浆后， 将此匀浆液经两层 Miracloth 滤膜在冰 浴上过滤进烧杯内。然后， 将此滤液经 4 层以上的 Miracloth 滤膜过滤一次。将该滤液置 于 50mL 的聚碳酸酯管内， 并于 4℃、 4000x g 条件下离心 8 分钟， 弃去上清液。将沉淀物重 新悬浮于 1-2mL 的再悬浮 (RB) 缓冲液 (50mM HEPES， pH 7.6， 0.33M 山梨醇， 1mM DTT) 中， 并 在含有 50mM HEPES， pH 7.6， 0.33M 山梨醇和 5mM DTT 的 12.5mL 30％ (v ∶ v) 的 percoll 梯度下分层。然后， 将此梯度于 1350x g、 4℃条件下在临床离心机摇摆桶附件的 50mL 聚碳 酸酯管中离心 12 分钟。该沉淀包含叶绿体， 将含有破碎叶绿体材料的上清液弃去， 将该沉 淀于 0.5mL RB 中重新悬浮。采用 Bradford( 分析生物化学 72 ： 248-254 1976) 法完成再悬 浮沉淀的蛋白质定量。同时在 40 和 100X Leica DMLB 光镜下观察一小等分的再悬浮沉淀， 以检查叶绿体的完整性。
烟草分离株是基于 Spencer 和 Wildman( 生物化学 3(7) ： 954-959， 1964) 规程而得 到的。烟草是从土壤中生长的、 有 4-5 小叶子的幼苗中分离得到的。通常植物以每批 4-5g 而分离得到。将叶子切成小碎片， 然后置于冰冷的碾磨缓冲液中， 其中含有 50mM HEPES， pH 7.6， 0.33M 山梨醇， 1mM MgCl2， 2mM ETDA 和 1 ∶ 4(w ∶ v) 比例的 1％ (w ∶ v)BSA。将植物 于冰浴上聚丙烯管内的冷缓冲液中或者通过混合器或者用锋利的刀片手工匀浆成精细的 切碎物， 以尽力减少叶绿体的破碎。将此匀浆液经两层 Miracloth 滤膜在冰浴上过滤进烧 杯内。再次将此滤液经 4 层以上的 Miracloth 滤膜过滤一次。将该滤液置于 50mL 的聚碳 酸酯管内， 并于 4℃、 1000x g 条件下离心 15 分钟。弃去上清液， 并将含有叶绿体的沉淀于 0.5mL RB 中重新悬浮。采用 Bradford( 分析生物化学 72 ： 248-254 1976) 法完成再悬浮沉 淀的蛋白质定量。同时在 40 和 100X Leica DMLB 光镜下观察一小等分的再悬浮沉淀， 以检 查叶绿体的完整性。
例4： 烟草瞬态分析
如要确定是否由多肽构建体编码的外源蛋白能够在瞬态系统中整合入叶绿体内，将该多肽构建体转化进入农杆菌 (LBA4404 菌株 ) 中。将包含所关注多肽构建体的农杆菌 于 28℃的 YP 培养基内培养过液， 然后在 5000rpm 条件下离心 10 分钟。将沉淀于 MS 诱导 培养基 (0.44％ (w ∶ v) 的 MS 基础盐混合物， 2％蔗糖 (w ∶ v)) 中重新悬浮， 并允许在室 温下诱导 2 小时。然后， 通过采用平头注射器注射在叶子的底面而将土壤中生长的烟草幼 苗 ( 只有 3-4 片叶子 ) 浸润在诱导的农杆菌内。随着液体渗入叶子内， 浸润作用可用肉眼 观察得到。 浸润后， 在收获组织用于叶绿体分离之前， 允许浸润的植物在正常的温室条件下 生长 3-4 天。
如上所述， 用嗜热菌蛋白酶处理玉米叶绿体体外重组多肽 -AmCyan 导入研究的反 应物， 然后将其在 RB 中重悬。将小等分反应液 (10μL) 置于 Zeiss 共聚焦显微镜下， 其滤 片应用在 486 和 594nm 以分别观察 AmCyan 和叶绿体的自发荧光。完成重叠序列， 以确定是 否该蛋白被导入至叶绿体内。
这些多肽、 P28、 P35、 P37、 ATPase 和 ssRubisco 系来自莱氏衣藻序列， 且根据本发 明， 能够将外源蛋白导入叶绿体中。在这些 AmCyan 的融合多肽中， 全部五种多肽均在体外 叶绿体输入分析中允许将 AmCyan 运输进入叶绿体中。其余的例子均在实验进展中。因此， 以下多肽、 P30、 细胞色素 c550、 细胞色素 c553、 psaF 和杜氏盐藻 EPSPS 的相应位置为 N/A， 意即不适用。这些结果如表 5 所示。
表5： 瞬态分析结果
转运肽 P28 P30 P35 P37 ssRubisco ATPase 细胞色素 c550 细胞色素 c553 psaF 杜氏盐藻 EPSPS
AmCyan 阳性 不适用 阳性 阳性 阳性 阳性 不适用 不适用 不适用 不适用表6： 包括 P28、 P35、 P37、 SSR、 ATPase 转运肽的数据， 证实阳性的叶绿体定位如表 5 所示， 还包括其余转运肽 C553、 C550、 P30、 PSAF、 EPSPS、 PSAF 的数据。
所有烟草构建体均在 T0 阶段进行了分析。. 除了 SSR 和 EPSPS 以外， 所有玉米构 建体均在 T1 阶段进行了分析， 而前两者是在 T0 阶段进行分析的。所有定位能力估计均基 于叶绿体组分的共聚焦显微镜观察， 其中完成了 AmCyan 报道基因蛋白表达的可视化。
例5： 确定转基因植物中叶绿体定位的方法
5.A. 玉米转化 ：
基本上， 玉米幼胚的转化应如 Negrotto 等 ( 植物细胞报告 19 ： 798-803(2000)) 所 述的方法来进行。其中所述的各种培养基成分均可以取代。
将含有植物转化质粒的农杆菌菌株 LBA4404(Invitrogen 公司 ) 于 28℃的 YEP( 酵 母提取物 (5g/L)， 蛋白胨 (10g/L)， 氯化钠 (5g/L)， 15g/L 琼脂， pH 6.8) 固体培养基上培 9 养 2 至 4 天。将约 0.8×10 个重组质粒转化脓杆菌悬浮于含 100μM 乙酰丁香酮 (As) 的 LS-inf 培养基中 (LSAs 培养基 )(Negrotto 等， 植物细胞报告 19 ： 798-803(2000))。将细菌 在此培养基中预诱导 30-60 分钟。
从 8-12 日龄的穗上切断来自玉米品系 A188 或其他适合的玉米基因型的幼胚， 置 于 LS-inf+100μM As(LSAs) 液体培养基内。将胚胎振荡 5 秒， 并用新鲜的感染培养液冲洗 一次。去除感染培养液， 然后添加农杆菌溶液， 将胚胎振荡 30 秒， 并允许与该细胞静置 5 分 钟。然后， 将这些胚胎胚鳞侧向上转移至 LSAs 培养基上， 并于暗处培养两至三天。随后， 将 每皿平板介于 20 和 25 个之间的胚胎转移至补充了头孢噻肟 (250mg/L) 和硝酸银 (1.6mg/ L) 的 LSDc 培养基中 (Negrotto 等， 植物细胞报告 19 ： 798-803(2000))， 并于 28℃暗处培养 10 天。
将生成胚性愈伤组织的幼胚转移至 LSD1M0.5S 培养基 ( 以 0.5mg/L 的 2， 4-D 取代 麦草畏， 10g/L 甘露糖， 5g/L 蔗糖且不含硝酸银的 LSDc)。 在此培养基上筛选 6 周该培养物， 其中第 3 周含传代培养的步骤。将残存的愈伤组织或者转移至待累积的 LSD1M0.5S 培养基 上， 或者转移至 Reg1 培养基上， 如 Negrotto 等 ( 植物细胞报告 19 ： 798-803(2000)) 所述的 方法来进行。在光照下培养 (16 小时光下 /8 小时暗处严格控制 ) 后， 将绿色组织转移至不 含生长调节剂的 Reg2 培养基中， 如 Negrotto 等 ( 植物细胞报告 19 ： 798-803(2000)) 所述， 并孵育 1-2 周。将小植株转移至 含 Reg3 培养基的 Magenta GA-7 盒 (Magenta 公司， 芝加
哥， 伊利诺伊州 ) 中， 如 Negrotto 等 (2000) 所述， 并于光照下培养。将任何表达盒组分 PCR 检测阳性的植物转移至土壤中， 并于温室下培养。通过 +/-PCR 检测法或 Taqman 拷贝数检 测法测定是否含有任何表达盒的组分。
作为单子叶植物作物品种的一个例子， 本技术领域的熟练技术人员应能够识别玉 米转化。本实验的结果可作为扩展至其他单子叶植物品种， 如水稻、 小麦、 大麦和甘蔗等的 例子而发挥作用。
5.B. 烟草转化 ：
含 有 转 化 载 体 并 包 含 表 达 盒 的 根 癌 农 杆 菌 ( 菌 株 LBA4404 应 被 用 于 感 染 Nicotiana tabacum c.v.Petit Havana(SR1) 的叶外植体。 最初， 将烟叶切成 1-2mm 宽的片 层， 在农杆菌中暴露 5 分钟， 并放置于无菌纸上， 以印迹去除多余的液体， 然后在共培养培 养基上放置 3 天。将叶片移动至含有适当筛选试剂的筛选 / 再生培养基中。将筛选试剂耐 受芽移植至土壤中。将这些植物自交或与非转基因 SR1 植物的花粉异交从而产生种子。通 过 +/-PCR 检测法或 Taqman 拷贝数检测法测定是否含有任何表达盒的组分。
作为双子叶植物作物品种的一个例子， 本技术领域的熟练技术人员应能够识别烟 草转化。本实验的结果可作为扩展至其他双子叶植物品种， 如大豆、 甜菜、 番茄和向日葵等 的例子而发挥作用。 本说明书中提到的所有出版物和专利申请均表明了本技术领域那些本发明涉及 的熟练技术人员的水平。虽然为了便于清晰了解的目的， 上述发明已通过图解和例子的方 式在一些细节中进行了说明， 但很明显， 仍可能需要在附加的权利要求书范围内进行一定 的变更和修改。
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