肿瘤细胞的选择性杀伤方法及用于该方法的装置 【技术领域】
本发明涉及使用特定的 UV 脉冲闪光来选择性地杀伤肿瘤细胞的方法及装置。背景技术 以往， 作为破坏癌细胞的方法， 已知放射线、 γ 射线和重粒子射线放射法等。 但是， 这些方法存在难以进行存在于机体深部的肿瘤癌组织的定位治疗 ( ピンポイント治療 )、 对肿瘤细胞以外的正常组织也会造成损伤的弊端。
另外， 众所周知紫外线具有杀菌效果， 以往长期使用低压汞灯 (UV 灯 ) 作为杀菌 灯， 但近年来， 逐渐开始采用使用氙闪光灯的 “光脉冲杀菌” ( 参照例如专利文献 1)。氙闪光 灯能以微秒级的间隔 ( 每 1 秒钟数次～数十次 ) 瞬间发出具有被认为杀菌效果好的 200 ～ 300nm 范围内的波长谱的光， 每次的能量也可达 UV 灯 ( 相当于 65W) 的数万倍。上述使用氙 闪光灯的光脉冲杀菌是能在极短的时间 (1 秒以下或数秒左右 ) 里对普通细菌、 霉菌、 芽胞 菌等发挥出高杀菌力的方法， 在食品等领域内已开始实用化。
但是， 关于由该氙闪光灯等产生的脉冲光能用于选择性地杀伤肿瘤细胞这一点尚 无报道。
现有技术文献
专利文献
专利文献 1 ： 日本专利特开 2000-107262 号公报
发明内容 发明所要解决的技术问题
本发明的目的是提供一种能选择性地杀伤肿瘤细胞的方法和装置。
解决技术问题所采用的技术方案
本发明人发现， 对肿瘤细胞和非肿瘤细胞照射由氙闪光灯等发出的脉冲光时， 可 以只选择性地杀伤肿瘤细胞以至其细胞死亡， 而使非肿瘤细胞存活， 从而完成了本发明。
即， 本发明的一个侧面是提供一种肿瘤细胞的选择性杀伤方法， 其特征在于， 包括 在人或人以外的动物的体外或者人以外的动物体内对肿瘤细胞照射至少在 230 ～ 270nm 范 围内具有连续的发射光谱的脉冲光的步骤 ； 以下将所述脉冲光称为 “UV 脉冲闪光” 。以下也 将该肿瘤细胞的选择性杀伤方法简称为 “本发明的方法” 。
较好是根据作为对象的肿瘤细胞的不同， 所述 UV 脉冲闪光在距光源 8cm 处具有例 如以累计输出计为 90 ～ 7100J、 90 ～ 14200J 或 180 ～ 14200J 的累计单位面积照射量。换 言之， 较好是所述 UV 脉冲闪光以来自 UVC 波长的能量计具有例如 6 ～ 480J/cm2、 6 ～ 960J/ 2 2 cm 或 12 ～ 960J/cm 的累计单位面积照射量。较好是照射所述 UV 脉冲闪光的步骤例如在 1 分钟以内。该 UV 脉冲闪光较好是由氙闪光灯发出的光。
此外， 本发明的一个侧面是提供一种能实施所述肿瘤细胞的选择性杀伤方法的医 疗用装置， 即一种肿瘤组织治疗用装置， 其特征在于， 包括脉冲光、 即 UV 脉冲闪光的光源，
所述脉冲光至少在 230 ～ 270nm 范围内具有连续的发射光谱。以下也将该装置简称为 “本 发明的装置” 。
作为所述肿瘤组织治疗用装置， 可例举例如内窥镜、 激光显微镜或体表肿瘤组织 照射装置。作为该装置所具有的光源， 较好是氙闪光灯。
发明效果
利用本发明的方法和装置， 能简便地在短时间内在不导致非肿瘤细胞的细胞死亡 的情况下仅杀灭肿瘤细胞。 可期待上述本发明在针对存在于机体内的肿瘤癌组织的定位治 疗等中的应用。
附图的简单说明
图 1 是由氙闪光灯 (BHX-200， 彗星株式会社 ( コメツト株式会社 )) 发出的 UV 脉冲 闪光的光源、 透过普通 ( 非石英玻璃 ) 玻璃 ( 厚 0.17mm) 后、 以及透过塑料制盘 (FluoroDish FD-35， 厚 1.25mm) 后的 (a)UV 区域 (200 ～ 400nm) 的光谱和 (b)UV 区域、 可见区域、 红外区 域 (200 ～ 950nm) 的光谱。
图 2 是实施例 1 中的 MCF-7( 肿瘤细胞的 SEM 观察图像。[a] 照射次数 0( 对照 )。 细胞膜表面平滑。[b] 照射次数 56(1 秒， 179.2J)。细胞质萎缩。[c] 照射次数 280(5 秒， 896J)。可见细胞质萎缩和膜变性。[d] 照射次数 560(10 秒， 1792J)。无法确认独立的细胞 形态。因膜变性而导致细胞表面呈突起状。[e] 照射次数 1120(20 秒， 3584J)。细胞解体加 剧， 有一部分已不成形。[f] 照射次数 2240(40 秒， 7168J)。仅可见核结构， 细胞解体逐渐加 剧。[g] 照射次数 2240(40 秒， 7168J)UV-C 隔离。如果除去 UV-C， 则与对照同样可观察到平 滑的细胞膜表面。
图 3 是实施例 1 的细胞存活率的测定中的 Cos7( 非肿瘤细胞 ) 和 MCF-7( 肿瘤细 胞 ) 的激光显微镜 (LSM510-META) 观察图像。用 PI( 碘化丙啶 ) 判定细胞的死活 ： 活细胞 由于膜结构牢固， 因此 PI 无法渗透至细胞内， 不被染成红色 ； 死细胞的膜结构被破坏， PI 渗 透至细胞内与 DNA 反应， 呈红色。[a]Cos7/ 无照射 ( 对照 )24 小时后。可观察到大而扁平 的细胞质。未见死细胞。[b]Cos7/560 次照射 (10 秒， 1792J)24 小时后。虽然可见细胞萎 缩， 但未见死细胞。[c]MCF-7/ 无照射 ( 对照 )24 小时后。呈 MCF-7 特有的圆形细胞形态。 [d]MCF-7/560 次照射 (10 秒， 1792J)24 小时后。可见细胞质的萎缩， 所有细胞已被杀死。
图 4 是表示实施例 1 中的 UV 脉冲闪光照射 ( 照射次数 ： 0， 14， 28， 56， 560)24 小时 后的细胞存活率 ( 对于各细胞将照射次数为 0 时作为 1.00) 的图。
图 5 是表示实施例 1 中的除去了 UV-C 的 UV 脉冲闪光照射 ( 照射次数 ： 0， 14， 28， 56， 560)24 小时后的细胞存活率 ( 对于各细胞将照射次数为 0 时作为 100％ ) 的图。
图 6 是表示实施例 2 中的人白血病细胞株的 UV 脉冲闪光照射 ( 照射次数 ： 0， 14， 56， 560， 2240)24 小时后的细胞存活率 ( 对于各细胞将照射次数为 0 时作为 100％ ) 的图。
图 7 是表示实施例 2 中的因 DNA 损伤而发生了早期凋亡的细胞的比例的图。
图 8 是表示实施例 3 中的人肿瘤细胞株 ( 纤维肉瘤、 前列腺癌、 恶性绒毛膜上皮 癌 ) 的 UV 脉冲闪光照射 ( 照射次数 ： 0， 14， 56， 560， 2240)24 小时后的细胞存活率 ( 对于各 细胞将照射次数为 0 时作为 100％ ) 的图。
图 9 是表示实施例 4 中的小鼠淋巴瘤细胞株的 UV 脉冲闪光照射 ( 照射次数 ： 0， 14， 56， 560， 2240)24 小时后的细胞存活率 ( 对于各细胞将照射次数为 0 时作为 100％ ) 的图。 图 10 是表示实施例 5 中所用的体表肿瘤组织照射装置 10 的图。(a) 整体示意图 ； (b) 探针 4 部分的放大图 ； (c) 探针 4 前端的放大图 ； (d) 探针 4 前端的剖视图， 着色部是照 射角 75 度的范围。
图 11 是表示实施例 5 中使探针的前端抵接于荷瘤小鼠的癌症部位来照射 UV 脉冲 闪光的模样的照片。
图 12 是表示实施例 5 中的 ACHN 荷瘤小鼠的肿瘤体积的转变的图 ( 箭头为照射 日 )。
图 13 是参考例中的照射量测定方法的示意图 ( 图中各构件的详细说明参照参考 例的记载 )。
实施发明的方式
- 方法
本发明的一个侧面是提供一种肿瘤细胞的选择性杀伤方法， 其包括通过如下所述 的方式对肿瘤细胞照射 UV 脉冲闪光的步骤。
作为本发明的方法的适用对象的肿瘤细胞无特别限定， 包括癌瘤 ( 来源于上皮组 织的恶性肿瘤 )、 肉瘤 ( 来源于非上皮组织的恶性肿瘤 )、 白血病、 恶性淋巴瘤和良性肿瘤的
细胞， 以及来源于这些细胞的细胞株。 另一方面， 非肿瘤细胞是指上述肿瘤细胞以外的正常 细胞。本发明的方法可应用于上述肿瘤细胞和非肿瘤细胞混合存在的部位。
对于人和人以外的哺乳类及其它动物 ( 实验动物、 宠物等 ) 的肿瘤细胞， 本发明的 方法不仅可在体外使用 ( 针对经采集、 培养的肿瘤细胞 )， 还可在体内使用。 即， 本发明的一 个侧面还能提供一种在人和人以外的哺乳类的体内选择性地杀伤肿瘤细胞的治疗方法和 辅助手术方法。
本发明的方法中所用的 UV 脉冲闪光在相当于 UV-C 的紫外线波长区域内， 至少在 包括约 265nm 的 DNA 吸收波长在内的 230 ～ 270nm 的范围内具有连续的发射光谱， 还可以 在更大的范围内具有连续的发射光谱。
UV 脉冲闪光的单次的单位面积照射量 [(J/cm2)/ 次 ] 和照射次数 [ 次 ]、 即作为 2 它们的累计值的累计单位面积照射量 [J/cm ] 可根据肿瘤细胞和非肿瘤细胞的种类等， 在 能选择性地杀伤肿瘤细胞的范围内调节。即， 通过将累计单位面积照射量调节至规定范围 内， 可以实质上仅杀伤肿瘤细胞而不杀伤非肿瘤细胞 ( 即使对非肿瘤细胞造成伤害， 也控 制在能修复的范围内， 不会导致细胞死亡 )。如果累计单位面积照射量不足， 则无法充分杀 灭肿瘤细胞， 反之， 如果累计单位面积照射量过量， 则不仅是肿瘤细胞， 连非肿瘤细胞也会 大量杀伤或杀灭， 因此可适当调整以期能达到与肿瘤细胞存活率和肿瘤体积等有关的目标 效果。
上述累计单位面积照射量 [J/cm2] 是 UV 脉冲闪光的光源的单次照射的输出 [J/ 次 ] 和照射次数 [ 次 ]、 即作为它们的累计值的累计输出 [J] 以及该 UV 脉冲闪光的照射面 2 积 [cm ] 的函数， 而且如果将光源视作点光源， 则 UV 脉冲闪光的累计单位面积照射量 [J/ 2 cm ] 与到光源的距离的平方成反比。
例如下述实施例 1 所示， 使用氙闪光灯 (BHX-200， 彗星株式会社 ) 作为 UV 脉冲闪 光的光源、 该氙闪光灯到照射部位的距离为 8cm 时， 如果累计输出在 45J 以上， 则能杀伤某些肿瘤细胞 ( 人乳腺癌培养细胞株和人子宫颈癌细胞株 ) 的半数以上的细胞 (44.8J(14 次 ) 照射 24 小时后的肿瘤细胞的存活率在 50％以下 ) ； 如果在 90J 以上， 则能杀伤该肿瘤 细胞的大部分的细胞 (89.6J(28 次 ) 照射 24 小时后的肿瘤细胞的存活率在 20 ～ 40％左 右)； 如果在 900J 以上， 则能几乎完全杀灭该肿瘤细胞。此外， 在上述条件下， 如果累计输 出在 20000J 以下， 则非肿瘤细胞的杀伤程度低， 如果在 7100J 以下， 则非肿瘤细胞几乎完全 存活 (7168J(2240 次 ) 照射 24 小时后的非肿瘤细胞的存活率将近 100％ )。因此， 例如以 人乳腺癌细胞和人子宫颈癌细胞等肿瘤细胞作为对照时， 在使非肿瘤细胞几乎完全存活的 同时能杀伤这些肿瘤细胞的大部分的细胞的 90 ～ 7100J 的范围可以例举作为上述条件下 的 UV 脉冲闪光的累计输出的优选范围。
以人乳腺癌细胞和人子宫颈癌细胞以外的肿瘤细胞作为适用对象时， 在考虑效果 的同时， 如果需要， 也可以采用上述范围内的较高范围的累计输出， 或者也可以改变上述 范围的上限和 / 或下限， 将所得的不同的范围作为该肿瘤细胞的优选范围。例如， 以与人 乳腺癌细胞和人子宫颈癌细胞相比更难杀伤的肿瘤细胞作为对象时， 较好是将上限提高 至 14200J 或将下限提高至 180J， 将 UV 脉冲闪光的累计输出调整至 90 ～ 14200J 的范围或 180 ～ 14200J 的范围。
此外， 关于本发明的方法中使用上述氙闪光灯时的累计输出和距离的相关条件， 可以改变并采用不同的光源、 累计输出和距离的条件， 只要累计单位面积照射量达到与之 相当的值即可。即， 例如关于 “累计输出 90 ～ 7100J 的距光源 8cm 处的累计单位面积照射 量” ， 只要是与之相当的值， 则也可以通过不同的累计输出和到光源的距离来实现。
上述氙闪光灯 (BHX-200) 的累计输出的值是如实施例 1 所述根据电容器容量和 电压算出的理论值， 表示该氙闪光灯所发出的光的整个波长范围 ( 例如 200 ～ 1000nm) 内 的能量。如下述参考例所示， 来自 UV-C(200 ～ 300nm) 或 230 ～ 270nm 的波长的能量本身 是整个上述波长范围内的能量、 即上述累计输出的一部分。 此外， 根据下述参考例所示的对 比， 氙闪光灯 (BHX-200) 的发光管的光能、 即上述累计输出可以换算成距该氙闪光灯 8cm 处 的累计单位面积照射量。因此， 例如关于上述 “累计输出 90 ～ 7100J 的距光源 8cm 处的累 计单位面积照射量” ， 如果是整个波长范围 (200 ～ 1000nm) 内的能量 ( 总累计单位面积照 射量 )， 则可换算成约 70 ～ 5700J/cm2， 如果是来自 UV-C(200 ～ 300nm) 的波长的能量 (UVC 累计单位面积照射量 )， 则可换算成约 6 ～ 480J/cm2。此外， 累计输出 180 和 14200J 的距 光源 8cm 处的累计单位面积照射量分别可换算成约 140 和 11400J/cm2 的总累计单位面积 照射量、 以及约 12 和 960J/cm2 的 UVC 累计单位面积照射量。
UV 脉冲闪光的单位时间的照射次数和处理时间 ( 它们的累计值即为上述照射次 数 ) 可以在考虑到上述累计单位面积照射量或累计输出的条件及光源的性能等的同时在 合适的范围内调节。例如， 通过使用每 1 秒钟能照射数次～数十次的 1J/ 次以上的 UV 脉冲 闪光的光源， 可将照射步骤的时间控制在数分钟以内， 较好是 1 分钟、 更好是 30 秒以内。
UV 脉冲闪光的能量在透过玻璃 ( 载玻片、 盖玻片、 聚光透镜等 ) 或塑料 ( 盘等 ) 等 后有时会显著衰减。因此， UV 脉冲闪光理想的是直接对肿瘤细胞照射， 但采用聚光透镜等 时， 不得不使用可期待 UV-C 透过的石英玻璃原材料， 应当考虑能量的衰减来调节输出。例 如下述参考例所示， 用石英透镜使氙闪光灯 (BHX-200) 的照射光会聚， 然后经由石英光纤 从包埋有蓝宝石珠的探针的前端部进行照射时， 非照射部的累计单位面积照射量会有一定程度的衰减。
UV 脉冲闪光只要能满足上述条件， 则从任何光源发出的光均可， 例如优选从氙闪 光灯发出的脉冲光。氙闪光灯能瞬间以较高的峰输出在 1 秒钟内连续发出数次至数十次的 闪光， 该闪光在紫外区域 ( 参照图 1) 到红外区域的范围内具有基于氙气的较高的连续光 谱。 也可将食品领域等内所用的具备氙闪光灯的光脉冲杀菌用的照射装置 ( 例如 BHX-200， 彗星株式会社 ) 或其改良产品用于本发明的方法。
现有的低压汞灯具有仅在 254nm 等特定的波长处具有强峰的发射光谱， 不具有 230 ～ 270nm 范围内的连续的发射光谱， UV 的能量不足。如果要使用低压汞灯以上述的累 计单位面积照射量照射 UV 光， 则需要长时间的照射， 因此不仅对肿瘤细胞、 对非肿瘤细胞 也会造成显著伤害， 无法选择性地杀伤肿瘤细胞。
- 装置
本发明的一个侧面是提供一种能实施本发明的方法的医疗用装置， 更具体而言是 提供一种肿瘤组织治疗用装置。
上述本发明的装置具备至少在 230 ～ 270nm 范围内具有连续的发射光谱的脉冲光 (UV 脉冲闪光 ) 的光源， 作为该光源， 对本发明的方法而言， 如上所述优选氙闪光灯。 作为本发明的装置， 可例举例如内窥镜、 激光显微镜或体表肿瘤组织照射装置等。 这些装置具备用于从光源照射 UV 脉冲闪光的结构 ( 理想的是将可调整光源的输出的设定 计数器安装于电源部等 )， 对于其它结构， 如果需要， 可以在适当改变的基础上采用现有的 内窥镜、 激光显微镜、 体表肿瘤组织照射装置等的结构。
如果是内窥镜， 则例如用光纤引导照明用光以外的、 由位于体外的控制装置侧的 光源发出的 UV 脉冲闪光， 从前端部向治疗部位照射。此时， 为了在不使 UV 光衰减的情况下 导入体内， 光纤的原材料优选石英玻璃或内部具有镜面结构的材料。 此外， 也希望开发出在 内窥镜前端内藏有小型 UV 脉冲光发射部的装置。
如果是激光显微镜， 则例如以单个细胞的水平向观察部位和治疗部位照射作为光 源的激光以外的 UV 脉冲闪光。此时， 如果要与观察用途共用透镜光学系统， 则由于透镜为 石英玻璃原材料， 可推测价格相当高， 因此较好是设定与观察光路不同的 UV 专用光路并切 换使用。
如果是体表肿瘤组织照射装置， 则例如用具有光源的可动式单元或石英光纤照射 装置 ( 一种探针， 其通过石英透镜聚光， 经由石英光纤， 前端安装有具有积分球功能的石英 或蓝宝石珠 ) 引导 UV 脉冲闪光向治疗部位照射。或者在开颅、 开腹手术时， 也可以在施行 外科肿瘤摘除术后对摘除部位照射以杀灭残存肿瘤。 也可以采用在探针的前端具有刀的功 能 ( 与注射针的前端同样 )、 能插入体内的装置。
[ 实施例 ]
[ 实施例 1]
材料和方法
UV 脉冲闪光光源 ( 使用氙闪光灯 ) ： BHX-200( 彗星株式会社 )
共聚焦激光扫描显微镜 ： LSM510-META( 卡 尔 蔡 司 显 微 成 像 公 司 (Carl Zeiss MicroImaging)， 德国耶拿 )肿瘤细胞 ：
1.MCF-7( 来源于人乳腺癌的细胞株 )
2.BT474( 来源于人乳腺癌的细胞株 )
3.Hella( 来源于人子宫颈癌的细胞株 )
非肿瘤细胞 ：
1.Cos7( 来源于非洲绿猴肾脏的细胞株 )
2.MDCK( 来源于犬肾脏肾小管上皮细胞的细胞株 )
首先利用细胞的自发荧光获取形态信息， 接着对各细胞用 Lipfectamine2000( 英 杰 公 司 (Invitrogen)) 转 染 MBL Azami-Green(phmAGl-MCl)DNA，观 察 其 荧 光。 在 5 ％ CO2、 37 ℃ 的 环 境 下 用 LSM510-META 获 取 三 维 图 像 后， 将 BHX-200 设 置 在 细 胞 正 上 方 8cm 的 位 置，进 行 1、 5、 10、 14、 28、 56、 560、 1120、 2240、 3360、 6720 次 的 UV 脉 冲 闪 光 的 照 射 后， 再 次 获 取 三 维 图 像。 单 次 的 发 光 能 量 ( 输 出 ) 为 3.2J 每 1 秒钟的发光次数为 56 次。 同时， 在细胞中添加碘化丙啶， 确认细胞的死活。此外， 照射 UV 脉冲闪光后继续培养 24 小 时， 再次观察， 求出死活的比例。
结果
基 于 LSM510-META 的 指 纹 法 (Finger Printing) 的 自 发 荧 光 观 察 以 及 Azami-Green 荧光观察 ( 参照图 3) 的结果是， 所有进行了实验的细胞中， 都自 1 次照射起观 察到细胞萎缩。照射 56 次时， 呈可见细胞表面的膜结构的变化的形态， 细胞萎缩显著。用 扫描电镜观察 ( 参照图 2)， 也同样可见细胞萎缩和细胞膜结构的变化。
关于细胞的照射 24 小时后的存活率， 非肿瘤细胞直至照射 560 次为止仍为 100％， 而肿瘤细胞在照射 14 次时下降至约 40 ％， 在照射 28 次时除 Hella 细胞 (40 ％ ) 外下降 至 20％， 在 560 次时几乎达到 0％ ( 参照图 4)。即， 以距光源 8cm 的距离照射 1.792kJ( ＝ (3.2J)/ 次 ×560 次 ) 的 UV 脉冲闪光时， 非肿瘤细胞 100％存活， 而相对地， 肿瘤细胞被杀 灭。根据核的形状来判断， 还诱发了凋亡。照射 120 秒 (6720 次 ) 时， 非肿瘤细胞也有膜结 构的变化， 还部分观察到细胞死亡。
另一方面， 在观察光路中插入盘状的塑料覆盖片 (1.25m 厚 ) 和激光显微镜的 CO2 培养箱塑料覆盖片 (1.2mm 厚 ) 而除去了 UV-C(290nm 以下 )( 参照图 1) 的实验组中， 肿瘤 细胞和非肿瘤细胞的存活率未见显著差异 ( 参照图 4)。
考察
根据本次的除去了 UV-C 的脉冲光照射的结果， 可见光和近红外光与本现象无关， 这就强烈地提示了与 UV-C 有关。推测通过照射 UV 脉冲闪光， 肿瘤细胞在短时间内发生了 明显的细胞形态变化 ( 萎缩 ) 和细胞膜的破坏， 细胞质内物质被释放至细胞外， 发生细胞死 亡， 未立即死亡的肿瘤细胞也因 DNA 嘧啶二聚体的形成而诱发了凋亡， 最终细胞死亡。
此外， 通过形态观察， 如果考虑到细胞死亡的状态， 则与非肿瘤细胞相比， 肿瘤细 胞的 UV-C 区域的紫外线敏感性明显较高， 因此可见细胞解体。即， 在低紫外线暴露量下， 仅 肿瘤细胞发生细胞死亡， 非肿瘤细胞不发生细胞死亡。推测其理由在于肿瘤细胞存在特异 性的紫外线受体 ( 吸收体 )， 提示了提高紫外线敏感性的可能性。 推测该受体根据肿瘤细胞 而不同， 但其伴随着细胞的癌化、 恶性化， 与糖脂、 糖蛋白糖链的组成变化有关。[ 实施例 2] 肿瘤细胞株 4. 人白血病细胞株 MOLT/S 5. 人白血病细胞株 MOLT/TMQ 200( 三甲曲沙 Trimetrexate(TMQ) 抗癌剂 200 倍抗性株 ) 6. 人白血病细胞株 K562/S1
7. 人白血病细胞株 K562/S2
8. 人白血病细胞株 K562/ARA-C( 阿糖胞苷 Cytarabine 抗癌剂抗性株 )
方法
在上述各细胞中添加碘化丙啶 (PI)， 与实施例 1 同样， 首先利用细胞的自发荧光 获取形态信息， 在 5％ CO2、 37℃的环境下用 LSM510-META 获取三维图像后， 将 BHX-200 设置 在细胞正上方 8cm 的位置， 进行 0、 14、 56、 560、 2240 次的 UV 脉冲闪光的照射后， 再次获取三 维图像。通过 PI 反应确认细胞的死活。此外， 照射 UV 脉冲闪光后继续培养 24 小时， 再次 观察， 求出死活的比例。然后， 通过流式细胞仪分析 (FACS Aria， 日本碧迪株式会社 ( ベク 5 トン·デイツキンソン株式会社 )。细胞数＝ 5×10 个， n ＝ 3) 求出细胞的死活比例。结 果示于图 6。
如上所述， 可知不仅能应对实体癌， 还能应对血液癌， 考虑临床应用时， 可认为其 应用范围极为广泛。例如， 根据肾脏透析的原理， 可以通过将人的血液导入外部 UV 脉冲闪 光装置、 在 UV 照射后返回体内的方法而制成血液癌的治疗器。
此外还可知， MOLT/TMQ 200 和 K562/ARA-C 虽然均为呈抗癌剂抗性、 无法期待抗癌 剂治疗效果的癌， 但由于本发明的作用机理并非药理性损伤， 而是物理性损伤， 因此对于这 些癌也能与其它癌同样地发挥出非常大的效果。 即， 即使对于难以治疗的癌， 基于新作用机 理的本方法也可期待其效果， 可期待成为患者的福音。
此外， 对于各细胞， 也验证了与上述同样地照射规定次数的 UV 脉冲闪光时对早期 凋亡 (DNA 损伤 ) 的影响。采用 Annexin V 作为标记物， 与上述的细胞死活同样地通过流 式细胞仪分析早期凋亡。在凋亡的初期阶段， 位于细胞膜内侧的某些磷脂酰丝氨酸 (PS ： phosphatidylserine) 暴露至细胞膜外侧， 和与 PS 的亲和性高的 Annexin V 结合。 Annexin V 是 35-36kDa 的依赖于 Ca++ 而与磷脂结合的蛋白质。 在 PS 暴露至细胞膜外侧后， 失去正常 的细胞膜结构， 开始发生 DNA 的片段化和染色质的凝集。利用该原理， 通过检测与 Annexin V 的结合， 可确认早期凋亡细胞。此外， 另行准备被检测物作为无处理对照 (non treat cultured control)， 在实验 24 小时前进行流式细胞仪分析。结果示于图 7。凋亡的诱导率 约为 10％以下， 因此可以认为本发明的作用机理与凋亡的相关性低。
[ 实施例 3]
肿瘤细胞株
9. 人纤维肉瘤细胞株 HT-1080
10. 人前列腺癌细胞株 DU145
11. 人前列腺癌细胞株 PC3
12. 人恶性绒毛膜上皮癌细胞株 BeWo
方法
在上述各细胞中添加碘化丙啶， 与实施例 1 同样， 首先利用细胞的自发荧光获取 形态信息， 在 5％ CO2、 37℃的环境下用 LSM510-META 获取三维图像后， 将 BHX-200 设置在细 胞正上方 8cm 的位置， 进行 0、 14、 56、 560、 2240 次的 UV 脉冲闪光的照射后， 再次获取三维图 像。通过 PI 反应确认细胞的死活。此外， 照射 UV 脉冲闪光后继续培养 24 小时， 再次观察， 求出死活的比例。然后， 通过流式细胞仪分析 (FACS Aria， 日本碧迪株式会社。细胞数＝ 5 5×10 个， n ＝ 3) 求出细胞的死活比例。结果示于图 8。
这些细胞是被分类为所谓恶性的肉瘤或癌， 认为通过施加比普通癌细胞更大量的 2 UVC 暴露量 (965J/cm ) 可以杀灭。该值低于被认为会对正常细胞产生影响的 UVC 暴露量 (1447J/cm2)。
[ 实施例 4]
肿瘤细胞株
13. 小鼠淋巴瘤 EL-4
14. 小鼠淋巴瘤 A20
15. 小鼠淋巴瘤 RL male 1
方法
在上述各细胞中添加碘化丙啶， 与实施例 1 同样， 首先利用细胞的自发荧光获取 形态信息， 在 5％ CO2、 37℃的环境下用 LSM510-META 获取三维图像后， 将 BHX-200 设置在细 胞正上方 8cm 的位置， 进行 0、 14、 56、 560、 2240 次的 UV 脉冲闪光的照射后， 再次获取三维图 像。通过 PI 反应确认细胞的死活。此外， 照射 UV 脉冲闪光后继续培养 24 小时， 再次观察， 求出死活的比例。然后， 通过流式细胞仪分析 (FACS Aria， 日本碧迪株式会社。细胞数＝ 5 5×10 个， n ＝ 3) 求出细胞的死活比例。结果示于图 9。
与人白血病细胞同样， 对于小鼠淋巴瘤细胞也得到了同样的结果， 这提示了不仅 对于人、 对于其它动物中的液性癌也能应对。
[ 实施例 5]
体表肿瘤组织照射装置
准备图 10 所示的体表肿瘤组织照射装置 10。 将来自 UV 脉冲光源 1(QS0-7016UVSP、 BHX-200 中使用的 UVC 发射管 ) 的 UV 脉冲闪光用石英透镜 2( 前侧焦距 26mm， 后侧焦距 25mm) 采集、 会聚， 在其焦点面设置直径 1.0mmφ 的石英光纤 3 的采光口， 可以用长 1200mm 的石英光纤 3 引导至探针 4 的前端进行照射。在探针 4 的前端包埋 1.5mm 的蓝宝石珠 5， 确 保照射角为 75 度。
荷瘤小鼠
BALB/cA-nu/nu ♀。自出生后 6 周起皮下移植 ACHN( 人肾癌细胞株 )， 开始荷瘤。
方法
上述荷瘤小鼠的肿瘤直径肿大至 20 ～ 30mm 后， 用上述体表肿瘤组织照射装置开 始照射实验。在第 0、 6、 18、 29 和 33 天， 分别将探针的前端抵接于癌症部位， 照射 120 秒钟 的 UV 脉冲闪光 ( 参照图 11)。 与此同时， 作为对照， 对非肿瘤部位皮肤进行相同暴露量的照 射。荷瘤小鼠的肿瘤肿瘤体积的转变示于图 12。箭头表示照射日。如图 11 所示， 荷瘤的 3 3 肿瘤尺寸为 942mm 、 1308.33mm ， 是相当大的肿瘤块， 体重为 25.8g。体积自照射后 1 天起减 小， 4 天后记录到最初的低值， 自次日起转而有增加的趋势， 因此在第 6 天进行第 2 次照射。在确认体积的转变的同时进行照射， 直至第 5 次照射为止， 通过手术摘除肿瘤块 ( 残骸 )。 与此同时， 制作福尔马林石蜡标本、 电子显微镜标本， 实施形态学考察。 其结果是， 肿瘤细胞 坏死、 溶解、 消失， 纤维组织围绕而包住其周围。认为体积比减少了约 80％后就不再变化的 原因在于， 肿瘤细胞被消灭， 取而代之的是在修复过程中出现的纤维组织。 纤维组织是正常 细胞， 因此即使受到 UV 脉冲闪光照射也不会受到影响。此外， 体重几乎没有变化而维持初 始体重的原因可以解释为 ： 由于肿瘤细胞被杀灭， 因此被肿瘤榨取的养分被转而用于原本 的机体维持， 因而得以维持体重。作为对照的正常皮肤照射组中， 未能确认到形态变化。
[ 参考例 ]
照射量测定条件
[1] 脉冲光源 QSO-70106UVSP(BHX-200)
频闪灯电源部 ( ストロボ電源部 ) 相当于 HD-200 的机器
[2] 聚光透镜
[3]1200mm 长、 1mmφ 的石英光纤
[4] 蓝宝石珠
[20] 测 定 器 受 光 部 浜 松 光 电 公 司 ( 浜 松 ホ ト ニ ク ス ) 制 UV 模 块 H8496-11φ8mm 计测部 京立电机公司 ( 京立電機 ) 制 DEF-2100
光具座 X型 1000mm 长
(1) 算出实施例 1 ～ 5 中所用的 UV 脉冲闪光光源 “QSO-70106UVSP” (BHX-200， 彗 星株式会社。56Hz/s 发光 ) 的发光管的发光能量。结果示于表 1。以下所有表中， 1 次＝ 1 个脉冲。每 1 次的 “总能量 (All energy)” 是通过算式 ： 1/2× 电容器容量 (C)× 电压 (V)2 求得的值， 每 1 次的 “UVC 能量 (UVCenergy)” 是由波长的成分分析基于该 “总能量” 求得的 值。
[ 表 1]
发光管的发光能量 单位 ： J
(2) 如图 13(a) 所示， 测定距发光管 80mm 处的被照射量 ( 相当于实施例 1 ～ 4 中 的细胞暴露射线量 )。结果示于表 2。
[ 表 2]
距发光管 80mm 处的被照射量 单位 ： J/cm2
(3) 如图 13(b) 所示， 测定 1200mm 长、 1mmφ 石英光纤照射口部的照射能量。照射 口与传感器之间的距离为 4mm。结果示于表 3。
[ 表 3]
1200mm 长、 1mmφ 石英光纤照射口部的照射能量 单位 ： J/cm2
(4) 如图 13(c) 所示， 测定 1200mm 长、 1mmφ 石英光纤 + 蓝宝石珠探针的照射能量 ( 相当于实施例 5 中的肿瘤暴露射线量 )。照射口与传感器之间的距离为 4mm。结果示于表 4。
[ 表 4]
1200mm 长、 1mmφ 石英光纤 + 蓝宝石珠探针
照射能量 单位 ： J/cm2
符号的说明 1： UV 脉冲光源 2： 石英透镜 3： 石英光纤 4： 探针 5： 蓝宝石珠 6： 滤光器导向件 10 ： 体表肿瘤组织照射装置 20 ： 照射量测定器