一种三尖杉内生真菌次生代谢产物中的新化合物及其制备方法和用途.pdf

摘要
申请专利号：	CN201010541585.X	申请日：	2010.11.11
公开号：	CN102464634A	公开日：	2012.05.23
当前法律状态：	撤回	有效性：	无权
法律详情：	发明专利申请公布后的视为撤回IPC(主分类):C07D 307/00申请公布日:20120523\|\|\|实质审查的生效IPC(主分类):C07D 307/00申请日:20101111\|\|\|公开
IPC分类号：	C07D307/00; C12P17/06; A61K31/343; A61P31/10; A61P31/12; A61P35/00; A61P35/02; A61P31/22; C12R1/885(2006.01)N	主分类号：	C07D307/00
申请人：	阅微生物技术（上海）有限公司
发明人：	郑承剑; 孙培欣; 韩婷; 马文辉; 孙慧
地址：	201203 上海市浦东新区蔡伦路720弄1号楼519室
优先权：
专利代理机构：	上海浦一知识产权代理有限公司 31211	代理人：	潘诗孟
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内容摘要

本发明公开了一种以一株三尖杉内生真菌深绿木霉Trichoderma?atroviride为来源分离制备的具有下述结构式的化合物Trichodermanin?B，其分子式为C15H28O3，分子量为256。本发明还公开了该化合物的制备方法，并通过体外实验发现其具有一定的抗真菌、抗病毒和抗肿瘤活性。本发明为新的活性药物开发打下了基础。

权利要求书

1：具有下述结构式的化合物，其分子式为 C15H28O3，分子量为 256。
2：权利要求 1 所述的化合物的制备方法，以深绿木霉 Trichoderma atrovirid 为发酵菌种，先后采用液体发酵、溶剂萃取和硅胶色谱柱分离方法分离得到，包括如下步骤： (1) 菌种的准备使用 PDA 培养基，高温灭菌，制成斜面，置于常温状态下，无杂菌生长时，接种深绿木霉 Trichoderma atrovirid 菌丝体，于常温下培养，作为菌种； (2) 发酵种子液制备在多个锥形瓶中分别装入液体培养基；于高温灭菌后，进行接种 Trichoderma atrovirid 菌种，常温下振荡培养，将该培养物作为种子； (3) 接种准备发酵瓶，发酵培养基适量，培养基组成与种子培养基相同，高温灭菌，接种，常温下震荡培养，真菌即可发酵成熟； (4) 萃取待真菌发酵成熟后，分别收集发酵液和菌丝体： ①发酵液的处理方法：待真菌发酵成熟后，过滤去菌丝体，对发酵成熟的滤液层进行乙酸乙酯部位的萃取，将乙酸乙酯部位合并、浓缩；烘干菌丝体，用乙醇浸泡，再以乙醇为溶剂超声辅助萃取多次， ②菌丝体的处理方法：合并、浓缩乙醇； (5) 单体分离纯化将发酵物萃取浓缩后的浸膏，用硅胶色谱柱分离，洗脱液的极性为石油醚∶丙酮＝ 15 ∶ 1，以 10ml 为单位收集洗脱液，将第 15 管收集液重结晶，即可得到新化合物 TrichodermaninB。
3：根据权利要求 2 所述的制备方法，其特征是， (2) 发酵种子液制备中，常温下振荡培养是指 28℃、 180r·min-1、培养 48h。
4：根据权利要求 2 所述的制备方法，其特征是， (3) 接种中，常温下震荡培养是指 28℃、 -1 180r·min ，培养 6-7 天。
5：根据权利要求 2 所述的制备方法，其特征是，菌丝体的处理方法包括如下步骤：将菌丝体于 30-70℃下烘干，用乙醇浸泡 12-48 小时，再以乙醇为溶剂超声辅助萃取 1-5 次，每次 10-50 分钟，合并、浓缩乙醇。 2
6：根据权利要求 5 所述的制备方法，其特征是，将菌丝体于 50℃烘干，用乙醇浸泡 24 小时，再以乙醇为溶剂超声辅助萃取 3 次，每次 30 分钟。
7：权利要求 1 所述的化合物在制备抗真菌的药物中的应用。
8：权利要求 1 所述的化合物在制备抗病毒的药物中的应用。
9：权利要求 1 所述的化合物在制备抗肿瘤的药物中的应用。

说明书

一种三尖杉内生真菌次生代谢产物中的新化合物及其制备方法和用途
    【技术领域】
     本发明涉及医药技术领域，具体地说是涉及一种三尖杉 (Cephalotaxus fortunei) 内生真菌发酵产物中的新化合物，即一种木霉属内生真菌深绿木霉 Trichoderma atroviride 发酵产物中新化合物 Trichodermanin B ；此外，本发明还涉及该化合物的的制备方法，以及 Trichodermanin B 的用途。背景技术
     内生真菌 (Endophytic fungi) 是指在生活史中某一阶段或整个阶段存在于健康植物组织内部，对植物组织没有引起明显病症或对宿主没有造成明显伤害的真菌。全世界已经研究过内生真菌的植物约有 400 种。自从 1993 年短叶红豆杉 Taxus brevifolia 的韧皮部分离到一株产抗癌物质紫杉醇的内生真菌。近二十年来发表的关于植物内生真菌的研究中涉及到的药用植物有 47 科 110 余种，并且研究多集中在内生真菌对植物影响的生理生化机制，生物转化，次生代谢物中的活性物质分离提取，以及活性此生代谢产物的产量调控等方面。这些都充分说明内生真菌可以作为生物活性代谢产物的潜在资源库，具有很大的深入研究的价值。
     三尖杉 Cephalotaxus fortune Hook.f. 又名榧子、血榧、石榧，为三尖杉科三尖杉属，是我国亚热带特有的重要药源植物，其木材坚实，有弹性，具有多种用途，种子榨油可供制皂及油漆，果实入药有润肺、止咳，消积之效，其叶、枝，种子及根等可提取多种植物碱 ( 三尖杉碱，三尖杉酯碱，高三尖杉酯碱等 )，可治疗癌症 ( 其中主要用于提炼高三尖杉酯碱用于治疗急性粒细胞性白血病 )，所以三尖杉是一种具有多种用途的重要野生经济植物，具有多方面的保护价值。由于其良好的抗癌活性，目前三尖杉植物资源被过度利用，资源数量急剧减少，处于渐危状态。若不加以保护有可能进一步陷入濒危境地。因此，寻找与之相关的活性产物新来源，是十分需要和迫切的。而内生真菌正是其中一个很好的可以深入研究的活性代谢产物的来源。发明内容
     本发明所要解决的技术问题是提供一种三尖杉内生真菌发酵产物中的新化合物，并提供该化合物的制备方法和用途。
     发明人在对三尖杉内生真菌的研究中，发现了一株木霉属内生真菌，即深绿木霉 Trichoderma atroviride，具有较好的抗稻瘟霉活性，发明人对其发酵产物在提取、分离和纯化方面进行了系统的研究，得到一种新化合物 Trichodermanin B。进一步研究还发现该分子量为 256。化合物的结构如下述结构式所示，其分子式为 C15H28O3，
     Trichodermanin B 的制备方法为：从采集的样本三尖杉植物中分离纯化出内生真菌，并对这些菌株进行鉴定和活性筛选，之后选取活性最好的菌株进行大量发酵，并对发酵产物进行系统的分离纯化，得到 Trichodermanin B 的单体之后，通过波谱方法对其进行结构鉴定，并通过体外实验得到活性数据，为新的活性药物开发打下基础。
     以下对本发明新化合物 Trichodermanin B 的制备过程以及体外活性实验进行详细说明。
     1. 三尖杉样本采集
     三尖衫 Cephalotaxus fortunei， 2009 年 5 月采集于中国，浙江，建德郊区。
     2. 本菌株制备方法包括如下步骤：
     (1) 三尖杉树皮，洗净晾干，消毒；
     (2) 干燥后，切块接种于培养基上，恒温培养箱培养；
     (3) 待菌丝长出时，把真菌转移到新的培养基上继续培养、转接；
     (4) 待纯化后，再转移到 PDA 培养基斜面试管中，即得到该真菌菌株，对其编号为 S361，备用。
     所述的消毒方法优选：在无菌操作台中用乙醇、 NaClO 溶液漂洗，无菌水冲洗；其中所述的乙醇优选质量百分浓度为 75 ％的乙醇，所述的 NaClO 溶液优选质量百分浓度为 5％的 NaClO 溶液。
     进一步优选的消毒方法包括如下步骤：
     ①在无菌操作台中用 75％乙醇漂洗 10-60 秒；
     ②无菌水冲洗 2-6 次；
     ③ 5％ NaClO 溶液漂洗 3-10 分钟；
     ④无菌水冲洗 2-6 次；
     ⑤ 75％乙醇漂洗 10-60 秒；
     ⑥无菌水冲洗 2-6 次。
     最优选的消毒方法包括如下具体操作步骤：
     ①在无菌操作台中用 75％乙醇漂洗 20-30 秒；
     ②无菌水冲洗 4 次；
     ③ 5％ NaClO 溶液漂洗 5 分钟；
     ④无菌水冲洗 4 次；
     ⑤ 75％乙醇漂洗 20-30 秒；
     ⑥无菌水冲洗 4 次。
     菌株鉴定：在 PDA 培养基上培养 3 天以后，刮取菌丝 ( 白色，低矮，绒状 )，通过 CTAB 法提取 DNA。再利用 ITS 序列对其 DNA 进行 PCR 扩增以及分子鉴定，鉴定结果为深绿木霉 Trichoderma atroviride， DNA 数据上传至 Genbank，序列号为 HQ449987。
     3. 发酵产物的制备方法
     以深绿木霉 Trichoderma atrovirid( 编号为 S361) 为发酵菌种，先后采用液体发酵、溶剂萃取和硅胶色谱柱分离方法，分离得到本发明上述新化合物。采用质谱、核磁共振氢谱和碳谱等方法，确定了该化合物的结构。
     本发明先对深绿木霉 Trichoderma atrovirid S361 进行发酵，再分别收集发酵液和菌丝体：
     (1) 菌种的准备
     使用 PDA 培养基，高温灭菌，制成斜面，置于常温状态下，无杂菌生长时，接种深绿木霉 Trichoderma atrovirid S361 菌丝体，于 28℃培养，作为菌种。
     例如，于 250ml 的三角瓶中加入 80ml 液体培养基，接种 Trichoderma atrovirid S361 菌种，于常温下培养。
     (2) 发酵种子液制备
     在多个锥形瓶中分别装入液体培养基；于高温灭菌后，进行接种 Trichoderma atrovirid S361 菌种，常温下振荡培养，优选 28℃、 180r· min-1、培养 48h，将该培养物作为种子。
     (3) 接种
     准备发酵瓶，发酵培养基装量适量，培养基组成与种子培养基相同，高温灭菌，接 -1 种，常温下震荡培养，优选 28℃、 180r·min ，优选培养 6-7 天，真菌即可发酵成熟。
     (4) 萃取
     待真菌发酵成熟后，分别收集发酵液和菌丝体：
     ①发酵液的处理方法：待真菌发酵成熟后，过滤去菌丝体，对发酵成熟的滤液层进行乙酸乙酯部位的萃取，将乙酸乙酯部位合并、浓缩。
     优选的方法是：滤液用乙酸乙酯萃取 3 次，合并、浓缩。
     ②菌丝体的处理方法：烘干菌丝体，用乙醇浸泡，再以乙醇为溶剂超声辅助萃取多次，合并、浓缩乙醇。
     优选的方法是：菌丝体 30-70℃烘干，优选 50℃，用乙醇浸泡 12-48 小时，优选 24 小时，再以乙醇为溶剂超声辅助萃取 1-5 次，优选 3 次，每次 10-50 分钟，优选 30 分钟，合并、浓缩乙醇。
     (5) 单体分离纯化
     将发酵物萃取浓缩后的浸膏，用硅胶色谱柱分离，洗脱液的极性为石油醚∶丙酮＝ 15 ∶ 1，以 10ml 为单位收集洗脱液。将第 15 管收集液重结晶，即可得到新化合物 Trichodermanin B。
     (6) 结构鉴定 1
     本发明综合应用质谱 ( 简称： MS)、核磁共振氢谱 ( 简称： H-NMR)、核磁共振碳13 谱 ( 简称： C-NMR) 以及核磁共振二维谱 ( 简称： 2D-NMR) 等分析技术对发酵产物中的 Trichodermanin B 进行结构鉴定。
     本发明上述的内生真菌的分离、纯化、发酵方法为本领域公知的常规使用的方法，在需要进一步确证的时候，很容易从有关的教材和相关的技术文献等查阅到包括技术细节在内的所有技术资料。。
     本发明上述对 Trichodermanin B 分离和结构鉴定方法是本领域的常规方法。
     本发明上述的有机溶剂分离制备法所使用的有机溶剂是本领域的常规有机溶剂，包括乙醇、乙醇水溶液、甲醇等中的一种或多种，优选乙醇或不同浓度的乙醇水溶液等中的一种或多种，进一步优选不同浓度的乙醇水溶液。
     4. 单体化合物 Trichodermanin B 的体外药理活性
     本发明对单体化合物 Trichodermanin B 在抗真菌、抗肿瘤、抗病毒等方面的活性也进行了多方面的试验。
     下面将选择发明人的抗真菌、抗肿瘤等方面的部分实验研究实例，通过对本发明发酵产物 Trichodermanin B 进行进一步的详细阐述，以突出和证明本发明上述新化合物在制备抗真菌、抗肿瘤和抗病毒的药物中的应用。一 .Trichodermanin B 抗真菌的实验研究。
     取处于指数生长期后期的新生隐球菌、白色念珠菌菌液至 1ml YEPD 培养液中，于 35℃， 250 次 /min 振荡培养，活化 16h 后，用血细胞计数板计数，以 RPMI 1640 培养液调整菌 3 3 液浓度至 1×10 -5×10 /ml。
     将熏烟曲霉菌、红色毛癣菌接种至 SDA 斜面，于 30℃，熏烟曲霉菌培养 1 周，红色毛癣菌培养 2 周。以上 2 种菌按本方法活化 2 次后，加适量 RPMI 1640 培养液于 SDA 斜面，用吸管吹打菌落，使真菌孢子游离于 RPMI 1640 培养液中，然后经四层无菌纱布过滤。培养液经血细胞计数板计数后，加 RPMI 1640 培养液调整孢子浓度至 1×103-5×103/ml。
     受试药物分别用 DMSO 配成 6.4g/L 溶液， -20℃保存。实验前，将药液取出置 35℃ 温箱融化备用。取无菌 96 孔板，于每排 1 号孔加 RPMI 1640 100ul 作空白对照； 3 ～ 12 号孔各加新鲜配制的菌液 120ul ； 2 号孔分别加菌液 160ul 和受试化合物溶液 1.6ul。2 ～ 11 号孔 10 级 4 倍稀释，使各孔中的药物终浓度分别为 64、 16、 4、 1、 0.25 和 0.0625、 0.0156、 0.0039、 0.00097、 0.00024mg/L，各孔中 DMSO 含量均低于 1 ％； 12 号孔不含药物，作阳性对照。各药敏板于 35℃培养。白色念珠菌、新生隐球菌、红色毛癣菌及熏烟曲霉菌的药敏板分别于 35℃培养 24h、 72h、 7d 和 4d 后，用 MK-3 全自动酶标仪测各孔 630nm 光密度 (D) 值，计算 MIC80。
     通过 Trichodermanin B 对白色念珠菌 (Candida albicans)、新生隐球菌 (Cryptococcus neoformans)、红色毛癣菌 (Trichophyton rubrum)、薰烟曲霉菌 (Aspergillus fumigatus) 的活性测试，发现其具有一定的抗真菌活性。抗真菌活性实验结果如表 1 所示。
     表 1. 抗真菌活性实验结果 (MIC80mg·L-1)
     7CN 102464634 A 样品 Trichodermanin B 氟康唑
     白色念珠菌 15 0.25说明书红色毛癣菌＞ 64 4 薰烟曲霉菌＞ 64 ＞ 645/10 页新生隐球菌 32 0.5二 .Trichodermanin B 抗肿瘤的实验研究。
     MTT 法测定 Trichodermanin B 对胃癌细胞 (MKN45)、肠癌细胞 (LOVO)、肝癌细胞 (HepG2) 及白血病细胞 (HL-60) 的生长抑制作用。将单层贴壁且呈对数生长期的胃癌细胞 (MKN45)、肠癌细胞 (LOVO)、肝癌细胞 (HepG2) 及白血病细胞 (HL-60)，用 0.25 ％ Trypsine-0.02％ EDTA 消化液消化后，用含 10％胎牛血清的 RPMI-1640 培养基稀释成单细胞悬液，根据不同细胞生长速率，调细胞浓度 1 ～ 3×104 个 /mL，将上述细胞悬液加入 96 孔细胞培养板中， 100ul/ 孔，将培养板移人 CO2 培养箱中，在 37℃、 5％ CO2 及饱和湿度条件下培养 24h 后加入不同浓度的受试药物 100ul/ 孔，每个浓度设 3 个平行孔，另设空白对照组，分别培养 48h 和 72h 后弃上清液，每孔加入 50ul 新鲜配制的含 0.2mg/mLMTT 无血清培养液， 37℃继续孵育 4h。小心弃上清液，并加入 150ulLDMSO，轻轻震荡使结晶溶解，选择 570nm 波长在酶标仪上测定各孔光密度 (OD) 值。以每组 3 个孔的平均值作为各孔的平均 OD 值，按公式 GIR ＝ (1- 实验组 OD/ 对照组 OD)×100％，计算 Trichodermanin B 对各肿瘤细胞的生长抑制率 (GIR)，并由 Origin 软件求出半数抑制浓度 (IC50)。抗肿瘤实验筛选结果如表 2 所示。
     样品 Trichodermanin B 阿霉素
     胃癌细胞 26 0.0622 肠癌细胞 17 0.0125 肝癌细胞＞ 100 0.0350 白血病细胞 78 ＜ 0.001表 2. 抗肿瘤实验筛选结果 (IC50mg·L-1)表 2 的实验结果显示， Trichodermanin B 抗肿瘤活性显著，其对胃癌细胞 (MKN45) 及肠癌细胞 (LOVO) 的活性有一定的研究意义。
     三 .Trichodermanin B 抗病毒的实验研究。 1. 病毒毒力测定。
     选用 Hep-2 细胞，加入 10 倍稀释 7 个浓度的各病毒液，每稀释度加 4 孔， 37℃、 5％ CO2 培养 3d，观察细胞病变 (CPE)，以 Reed-Muench 法计算病毒半数感染剂量 (TCID50)。
     2.CPE 程度的判断。
     “一” ：表示细胞生长基本正常，未出现病变； “1” 表示细胞病变约占整个单层细胞＜ 25％； “2” 表示细胞病变约占整个单层细胞的 25％～ 50％； “3” 表示细胞病变约占整个单层细胞的 50％～ 75％； “4” 表示细胞病变约占整个单层细胞的 75％～ 100％。根椐以上细胞病变 5 级标准判断，若 CPE 为 “1” 及其以下 “一” ，则视为阴性，其余的 “2” 及其以上各级，均视为阳性，利用 Reed-Muench 法计算 TCID50。
     3. 化合物毒性测定。
     用 Hep-2 细胞板，加人 7 个两倍连续稀释的不同浓度的化合物溶液，每稀释度加 4 孔， 37℃、 5％ CO2 中培养 3d，观察化合物对细胞的毒性，以 Reed-Muench 法计算半数中毒浓度 (TC50) 和最大无毒浓度 (TC0)。
     4. 毒性试验结果判断标准。
     以下结果中的数字表示化合物对细胞的毒性程度分级： (1)“一” ：表示细胞生长基本正常，未出现中毒现象； “1” 表示中毒细胞发生率＜ 25 ％； “2” 表示中毒细胞发生率在 25％～ 50％； “3” 表示中毒细胞发生率在 50％～ 75％； “4” 表示中毒细胞发生率＞ 75％。(2) 若毒性为 “1” 及其以下 “一” ，则视为阴性，可认为此浓度样品对细胞无中毒现象，其余的 “2” 及其以上各级，均视为阳性，即所试样品在此浓度对细胞有中毒作用，利用 Reed-Muench 法计算 50 ％中毒浓度 (TC50)。通过将上述毒性试验结果经 Reed-Mueneh 法计算，得出 Trichodermanin B 对 Hep-2 细胞的 50％毒性浓度为 TC50 ＝ 4.46mg/ml， TC0 ＝ 3.12mg/ml ；阳性酞丁安软膏的 50％的毒性浓度为 TC50 ＝ 2.24mg/ml， TC0 ＝ 1.56mg/ml。
     5. 抗病毒试验。
     倒去 96 孔已长成单层的 Hep-2 细胞板中培养液，加入 100TCID50 的各病毒液，吸附 1h，倾去病毒液，用从最大无毒浓度 (TC0) 起 2 倍稀释 5 个浓度的化合物样品，每浓度加 3 孔，设细胞对照和病毒对照。37℃、 5％ CO2 中培养 3d，观察 CPE。以 Reed-Muench 法计算 50％有效浓度 (EC50) 及治疗指数 TI ＝ TC50/EC50。抗病毒实验筛选结果如表 3 所示。
     表 3.Trichodermanin B 对单纯疱疹病毒 I 和 II 型的影响
     表 3 的实验数据表明， Trichodermanin B 对单纯疱疹病毒 I 型和 II 型致细胞病变有明显抑制作用。附图说明
     图 1 是本发明化合物的核磁共振二维谱图。具体实施方式
     下面结合附图和具体实施例，进一步阐述本发明。这些实施例应理解为仅用于说明本发明而不用于限制本发明的保护范围。在阅读了本发明记载的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等效变化和修饰同样落入本发明权利要求所限定的范围。
     本发明下述优选实施例研究三尖杉内生真菌深绿木霉 Trichoderma atrovirid S361 及其发酵产物中分离到的新化合物 Trichodermanin B 以及其的药理作用，提供了一种能够用于制备抗真菌、抗病毒、抗肿瘤产品的原料，为新的活性药物开发打下了基础。
     ( 一 ) 真菌及其发酵产物的制备方法为进一步阐述新化合物 Trichodermanin B 的制备方法，下面通过举例来说明具体的操作步骤和方法。
     (1) 挑选新鲜、健康三尖杉树皮，将其表面洗净、晾干水分，消毒；
     所述的消毒方法的具体操作步骤是：
     ①在无菌操作台中用 75％乙醇漂洗 20-30 秒；
     ②无菌水冲洗 4 次；
     ③ 5％ NaClO 溶液漂洗 5 分钟；
     ④无菌水冲洗 4 次；
     ⑤ 75％乙醇漂洗 20-30 秒；
     ⑥无菌水冲洗 4 次。
     (2) 无菌滤纸片吸干水分，分别切成 5mm×5mm×1mm 的小块接种于培养基上，每个培养皿中接 4 块，置 28℃恒温培养箱中培养 3-30 天；
     (3) 观察到培养基上从各植物组织块内部向周围长出菌丝时，采用尖端菌丝挑取法把真菌转移到新的培养基上继续培养、转接；
     (4) 待纯化后，再转移到 PDA 培养基 ( 最常用的真菌培养基，广泛用于保存菌种 ) 斜面试管中，即得到该真菌菌株，对其编号为 S361，备用。
     例如，本实施例所述发酵产物的制备方法可以为：先对深绿木霉 Trichoderma atrovirid S361 进行发酵，再分别收集发酵液和菌丝体：
     (1) 培养基准备
     使用 PDA 培养基，高温灭菌，制成斜面，置于常温状态下，无杂菌生长时，接种以上方法制备得到的深绿木霉 Trichoderma atrovirid S361 菌丝体，于常温下培养。
     (2) 发酵种子液制备
     在多个锥形瓶中分别装入液体培养基。于高温灭菌后，进行接种，常温下震荡培养，将该培养物作为种子。
     (3) 接种
     准备发酵瓶，发酵培养基装量适量，培养基组成与种子培养基相同，高温灭菌，接种，常温下震荡培养。
     ①液体发酵：于 250mL 的三角瓶中加入 80mL 液体培养基，接种深绿木霉 -1 Trichoderma atrovirid S361 菌种菌丝体，摇床 (28℃、 180r·min ) 振荡培养 3 天左右，作为发酵种子液。将种子液接种在培养液中，摇床 (28℃、 180r·min-1) 振荡培养 6-7d，真菌即可发酵成熟。
     (4) 萃取
     分别收集发酵液和菌丝体：
     ②发酵液的处理方法：待真菌发酵成熟后，过滤去菌丝体，对发酵成熟的液层进行乙酸乙酯部位的萃取，滤液用乙酸乙酯萃取 3 次，合并、浓缩。
     ③菌丝体的处理方法：菌丝体 50℃烘干，用乙醇浸泡 24 小时，再以乙醇为溶剂超声辅助萃取 3 次，每次 30 分钟，合并、浓缩乙醇。
     (5) 单体分离纯化
     将发酵物萃取浓缩后的浸膏 4g，用硅胶色谱柱分离，洗脱液的极性为石油醚∶丙酮＝ 15 ∶ 1，以 10ml 为单位收集洗脱液。将第 15 管收集液重结晶，即可得到单体化合物 Trichodermanin B
     ( 二 ) 发酵产物的鉴定方法 1
     本实施例综合应用质谱 ( 简称： MS)、核磁共振氢谱 ( 简称： H-NMR)、核磁共振 13 碳谱 ( 简称：C-NMR) 以及核磁共振二维谱 ( 简称： 2D-NMR) 等分析技术对发酵产物中的 Trichodermanin B 进行结构鉴定。
     Trichodermanin B 具有如下理化性质：
     该化合物为无色结晶，分子式 C15H28O3， MW ： 256 ；易溶于甲醇、乙醇等极性较大的溶剂，微溶于水； mp.188-190℃；； ESIMS m/z[2M+Na]+535.2 ；核磁共振氢谱、核磁共振碳谱数据如表 4 所示：
     表 4.Trichodermanin B 的核磁共振氢谱、核磁共振碳谱数据
     11
     δC 81.2s 40.4t 25.3t 54.3d 85.8s 34.7t 26.2t 86.7d 15 14 13 12 1.29(3H， s) 1.20(3H， s) 1.23(3H， s) 1.11(3H， s) 11 10 1.60(1H， m) 1.04(3H， d， J ＝ 6.5) 9 Positions. δH(J) δC 70.2s 45.1d 13.7q 26.0q 26.9q 27.8q 24.0qofCN 102464634 APositions.δH(J)121.61(1H， m)， 1.70(1H， m)31.40(2H， m)说42.03(1H， m)明核磁共振二维谱数据如图 1 所示 (Key HMBC( → )and 1H-1H COSY(-)correlations Trichodermanin B)。125书61.71(1H， m)， 1.89(1H， m)71.80(1H， m)， 1.90(1H， m)83.68(1H， dd， J ＝ 10.0， 5.0)9/10 页CN 102464634 A
     说明书10/10 页综上， Trichodermanin B 的分子式为 C15H28O3，分子量为 256，结构式为：

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1、10申请公布号CN102464634A43申请公布日20120523CN102464634ACN102464634A21申请号201010541585X22申请日20101111C07D307/00200601C12P17/06200601A61K31/343200601A61P31/10200601A61P31/12200601A61P35/00200601A61P35/02200601A61P31/22200601C12R1/88520060171申请人阅微生物技术（上海）有限公司地址201203上海市浦东新区蔡伦路720弄1号楼519室72发明人郑承剑孙培欣韩婷马文辉孙慧74专利代理机构。

2、上海浦一知识产权代理有限公司31211代理人潘诗孟54发明名称一种三尖杉内生真菌次生代谢产物中的新化合物及其制备方法和用途57摘要本发明公开了一种以一株三尖杉内生真菌深绿木霉TRICHODERMAATROVIRIDE为来源分离制备的具有下述结构式的化合物TRICHODERMANINB，其分子式为C15H28O3，分子量为256。本发明还公开了该化合物的制备方法，并通过体外实验发现其具有一定的抗真菌、抗病毒和抗肿瘤活性。本发明为新的活性药物开发打下了基础。51INTCL权利要求书2页说明书10页附图1页19中华人民共和国国家知识产权局12发明专利申请权利要求书2页说明书10页附图1页1/2页21。

3、具有下述结构式的化合物，其分子式为C15H28O3，分子量为256。2权利要求1所述的化合物的制备方法，以深绿木霉TRICHODERMAATROVIRID为发酵菌种，先后采用液体发酵、溶剂萃取和硅胶色谱柱分离方法分离得到，包括如下步骤1菌种的准备使用PDA培养基，高温灭菌，制成斜面，置于常温状态下，无杂菌生长时，接种深绿木霉TRICHODERMAATROVIRID菌丝体，于常温下培养，作为菌种；2发酵种子液制备在多个锥形瓶中分别装入液体培养基；于高温灭菌后，进行接种TRICHODERMAATROVIRID菌种，常温下振荡培养，将该培养物作为种子；3接种准备发酵瓶，发酵培养基适量，培养基组成与种。

4、子培养基相同，高温灭菌，接种，常温下震荡培养，真菌即可发酵成熟；4萃取待真菌发酵成熟后，分别收集发酵液和菌丝体发酵液的处理方法待真菌发酵成熟后，过滤去菌丝体，对发酵成熟的滤液层进行乙酸乙酯部位的萃取，将乙酸乙酯部位合并、浓缩；菌丝体的处理方法烘干菌丝体，用乙醇浸泡，再以乙醇为溶剂超声辅助萃取多次，合并、浓缩乙醇；5单体分离纯化将发酵物萃取浓缩后的浸膏，用硅胶色谱柱分离，洗脱液的极性为石油醚丙酮151，以10ML为单位收集洗脱液，将第15管收集液重结晶，即可得到新化合物TRICHODERMANINB。3根据权利要求2所述的制备方法，其特征是，2发酵种子液制备中，常温下振荡培养是指28、180RM。

5、IN1、培养48H。4根据权利要求2所述的制备方法，其特征是，3接种中，常温下震荡培养是指28、180RMIN1，培养67天。5根据权利要求2所述的制备方法，其特征是，菌丝体的处理方法包括如下步骤将菌丝体于3070下烘干，用乙醇浸泡1248小时，再以乙醇为溶剂超声辅助萃取15次，每次1050分钟，合并、浓缩乙醇。权利要求书CN102464634A2/2页36根据权利要求5所述的制备方法，其特征是，将菌丝体于50烘干，用乙醇浸泡24小时，再以乙醇为溶剂超声辅助萃取3次，每次30分钟。7权利要求1所述的化合物在制备抗真菌的药物中的应用。8权利要求1所述的化合物在制备抗病毒的药物中的应用。9权利要求。

6、1所述的化合物在制备抗肿瘤的药物中的应用。权利要求书CN102464634A1/10页4一种三尖杉内生真菌次生代谢产物中的新化合物及其制备方法和用途技术领域0001本发明涉及医药技术领域，具体地说是涉及一种三尖杉CEPHALOTAXUSFORTUNEI内生真菌发酵产物中的新化合物，即一种木霉属内生真菌深绿木霉TRICHODERMAATROVIRIDE发酵产物中新化合物TRICHODERMANINB；此外，本发明还涉及该化合物的的制备方法，以及TRICHODERMANINB的用途。背景技术0002内生真菌ENDOPHYTICFUNGI是指在生活史中某一阶段或整个阶段存在于健康植物组织内部，对植物。

7、组织没有引起明显病症或对宿主没有造成明显伤害的真菌。全世界已经研究过内生真菌的植物约有400种。自从1993年短叶红豆杉TAXUSBREVIFOLIA的韧皮部分离到一株产抗癌物质紫杉醇的内生真菌。近二十年来发表的关于植物内生真菌的研究中涉及到的药用植物有47科110余种，并且研究多集中在内生真菌对植物影响的生理生化机制，生物转化，次生代谢物中的活性物质分离提取，以及活性此生代谢产物的产量调控等方面。这些都充分说明内生真菌可以作为生物活性代谢产物的潜在资源库，具有很大的深入研究的价值。0003三尖杉CEPHALOTAXUSFORTUNEHOOKF又名榧子、血榧、石榧，为三尖杉科三尖杉属，是我国亚。

8、热带特有的重要药源植物，其木材坚实，有弹性，具有多种用途，种子榨油可供制皂及油漆，果实入药有润肺、止咳，消积之效，其叶、枝，种子及根等可提取多种植物碱三尖杉碱，三尖杉酯碱，高三尖杉酯碱等，可治疗癌症其中主要用于提炼高三尖杉酯碱用于治疗急性粒细胞性白血病，所以三尖杉是一种具有多种用途的重要野生经济植物，具有多方面的保护价值。由于其良好的抗癌活性，目前三尖杉植物资源被过度利用，资源数量急剧减少，处于渐危状态。若不加以保护有可能进一步陷入濒危境地。因此，寻找与之相关的活性产物新来源，是十分需要和迫切的。而内生真菌正是其中一个很好的可以深入研究的活性代谢产物的来源。发明内容0004本发明所要解决的技术。

9、问题是提供一种三尖杉内生真菌发酵产物中的新化合物，并提供该化合物的制备方法和用途。0005发明人在对三尖杉内生真菌的研究中，发现了一株木霉属内生真菌，即深绿木霉TRICHODERMAATROVIRIDE，具有较好的抗稻瘟霉活性，发明人对其发酵产物在提取、分离和纯化方面进行了系统的研究，得到一种新化合物TRICHODERMANINB。进一步研究还发现该化合物的结构如下述结构式所示，其分子式为C15H28O3，分子量为256。0006说明书CN102464634A2/10页50007TRICHODERMANINB的制备方法为从采集的样本三尖杉植物中分离纯化出内生真菌，并对这些菌株进行鉴定和活性筛选。

10、，之后选取活性最好的菌株进行大量发酵，并对发酵产物进行系统的分离纯化，得到TRICHODERMANINB的单体之后，通过波谱方法对其进行结构鉴定，并通过体外实验得到活性数据，为新的活性药物开发打下基础。0008以下对本发明新化合物TRICHODERMANINB的制备过程以及体外活性实验进行详细说明。00091三尖杉样本采集0010三尖衫CEPHALOTAXUSFORTUNEI，2009年5月采集于中国，浙江，建德郊区。00112本菌株制备方法包括如下步骤00121三尖杉树皮，洗净晾干，消毒；00132干燥后，切块接种于培养基上，恒温培养箱培养；00143待菌丝长出时，把真菌转移到新的培养基上继。

11、续培养、转接；00154待纯化后，再转移到PDA培养基斜面试管中，即得到该真菌菌株，对其编号为S361，备用。0016所述的消毒方法优选在无菌操作台中用乙醇、NACLO溶液漂洗，无菌水冲洗；其中所述的乙醇优选质量百分浓度为75的乙醇，所述的NACLO溶液优选质量百分浓度为5的NACLO溶液。0017进一步优选的消毒方法包括如下步骤0018在无菌操作台中用75乙醇漂洗1060秒；0019无菌水冲洗26次；00205NACLO溶液漂洗310分钟；0021无菌水冲洗26次；002275乙醇漂洗1060秒；0023无菌水冲洗26次。0024最优选的消毒方法包括如下具体操作步骤0025在无菌操作台中用7。

12、5乙醇漂洗2030秒；0026无菌水冲洗4次；00275NACLO溶液漂洗5分钟；0028无菌水冲洗4次；说明书CN102464634A3/10页6002975乙醇漂洗2030秒；0030无菌水冲洗4次。0031菌株鉴定在PDA培养基上培养3天以后，刮取菌丝白色，低矮，绒状，通过CTAB法提取DNA。再利用ITS序列对其DNA进行PCR扩增以及分子鉴定，鉴定结果为深绿木霉TRICHODERMAATROVIRIDE，DNA数据上传至GENBANK，序列号为HQ449987。00323发酵产物的制备方法0033以深绿木霉TRICHODERMAATROVIRID编号为S361为发酵菌种，先后采用液体。

13、发酵、溶剂萃取和硅胶色谱柱分离方法，分离得到本发明上述新化合物。采用质谱、核磁共振氢谱和碳谱等方法，确定了该化合物的结构。0034本发明先对深绿木霉TRICHODERMAATROVIRIDS361进行发酵，再分别收集发酵液和菌丝体00351菌种的准备0036使用PDA培养基，高温灭菌，制成斜面，置于常温状态下，无杂菌生长时，接种深绿木霉TRICHODERMAATROVIRIDS361菌丝体，于28培养，作为菌种。0037例如，于250ML的三角瓶中加入80ML液体培养基，接种TRICHODERMAATROVIRIDS361菌种，于常温下培养。00382发酵种子液制备0039在多个锥形瓶中分别装。

14、入液体培养基；于高温灭菌后，进行接种TRICHODERMAATROVIRIDS361菌种，常温下振荡培养，优选28、180RMIN1、培养48H，将该培养物作为种子。00403接种0041准备发酵瓶，发酵培养基装量适量，培养基组成与种子培养基相同，高温灭菌，接种，常温下震荡培养，优选28、180RMIN1，优选培养67天，真菌即可发酵成熟。00424萃取0043待真菌发酵成熟后，分别收集发酵液和菌丝体0044发酵液的处理方法待真菌发酵成熟后，过滤去菌丝体，对发酵成熟的滤液层进行乙酸乙酯部位的萃取，将乙酸乙酯部位合并、浓缩。0045优选的方法是滤液用乙酸乙酯萃取3次，合并、浓缩。0046菌丝体的。

15、处理方法烘干菌丝体，用乙醇浸泡，再以乙醇为溶剂超声辅助萃取多次，合并、浓缩乙醇。0047优选的方法是菌丝体3070烘干，优选50，用乙醇浸泡1248小时，优选24小时，再以乙醇为溶剂超声辅助萃取15次，优选3次，每次1050分钟，优选30分钟，合并、浓缩乙醇。00485单体分离纯化0049将发酵物萃取浓缩后的浸膏，用硅胶色谱柱分离，洗脱液的极性为石油醚丙酮151，以10ML为单位收集洗脱液。将第15管收集液重结晶，即可得到新化合物TRICHODERMANINB。00506结构鉴定0051本发明综合应用质谱简称MS、核磁共振氢谱简称1HNMR、核磁共振碳说明书CN102464634A4/10页7。

16、谱简称13CNMR以及核磁共振二维谱简称2DNMR等分析技术对发酵产物中的TRICHODERMANINB进行结构鉴定。0052本发明上述的内生真菌的分离、纯化、发酵方法为本领域公知的常规使用的方法，在需要进一步确证的时候，很容易从有关的教材和相关的技术文献等查阅到包括技术细节在内的所有技术资料。0053本发明上述对TRICHODERMANINB分离和结构鉴定方法是本领域的常规方法。0054本发明上述的有机溶剂分离制备法所使用的有机溶剂是本领域的常规有机溶剂，包括乙醇、乙醇水溶液、甲醇等中的一种或多种，优选乙醇或不同浓度的乙醇水溶液等中的一种或多种，进一步优选不同浓度的乙醇水溶液。00554单体。

17、化合物TRICHODERMANINB的体外药理活性0056本发明对单体化合物TRICHODERMANINB在抗真菌、抗肿瘤、抗病毒等方面的活性也进行了多方面的试验。0057下面将选择发明人的抗真菌、抗肿瘤等方面的部分实验研究实例，通过对本发明发酵产物TRICHODERMANINB进行进一步的详细阐述，以突出和证明本发明上述新化合物在制备抗真菌、抗肿瘤和抗病毒的药物中的应用。0058一TRICHODERMANINB抗真菌的实验研究。0059取处于指数生长期后期的新生隐球菌、白色念珠菌菌液至1MLYEPD培养液中，于35，250次/MIN振荡培养，活化16H后，用血细胞计数板计数，以RPMI164。

18、0培养液调整菌液浓度至11035103/ML。0060将熏烟曲霉菌、红色毛癣菌接种至SDA斜面，于30，熏烟曲霉菌培养1周，红色毛癣菌培养2周。以上2种菌按本方法活化2次后，加适量RPMI1640培养液于SDA斜面，用吸管吹打菌落，使真菌孢子游离于RPMI1640培养液中，然后经四层无菌纱布过滤。培养液经血细胞计数板计数后，加RPMI1640培养液调整孢子浓度至11035103/ML。0061受试药物分别用DMSO配成64G/L溶液，20保存。实验前，将药液取出置35温箱融化备用。取无菌96孔板，于每排1号孔加RPMI1640100UL作空白对照；312号孔各加新鲜配制的菌液120UL；2号孔。

19、分别加菌液160UL和受试化合物溶液16UL。211号孔10级4倍稀释，使各孔中的药物终浓度分别为64、16、4、1、025和00625、00156、00039、000097、000024MG/L，各孔中DMSO含量均低于1；12号孔不含药物，作阳性对照。各药敏板于35培养。白色念珠菌、新生隐球菌、红色毛癣菌及熏烟曲霉菌的药敏板分别于35培养24H、72H、7D和4D后，用MK3全自动酶标仪测各孔630NM光密度D值，计算MIC80。0062通过TRICHODERMANINB对白色念珠菌CANDIDAALBICANS、新生隐球菌CRYPTOCOCCUSNEOFORMANS、红色毛癣菌TRICH。

20、OPHYTONRUBRUM、薰烟曲霉菌ASPERGILLUSFUMIGATUS的活性测试，发现其具有一定的抗真菌活性。抗真菌活性实验结果如表1所示。0063表1抗真菌活性实验结果MIC80MGL10064说明书CN102464634A5/10页8TRICHODERMANINB15326464氟康唑025054640065二TRICHODERMANINB抗肿瘤的实验研究。0066MTT法测定TRICHODERMANINB对胃癌细胞MKN45、肠癌细胞LOVO、肝癌细胞HEPG2及白血病细胞HL60的生长抑制作用。将单层贴壁且呈对数生长期的胃癌细胞MKN45、肠癌细胞LOVO、肝癌细胞HEPG2及。

21、白血病细胞HL60，用025TRYPSINE002EDTA消化液消化后，用含10胎牛血清的RPMI1640培养基稀释成单细胞悬液，根据不同细胞生长速率，调细胞浓度13104个/ML，将上述细胞悬液加入96孔细胞培养板中，100UL/孔，将培养板移人CO2培养箱中，在37、5CO2及饱和湿度条件下培养24H后加入不同浓度的受试药物100UL/孔，每个浓度设3个平行孔，另设空白对照组，分别培养48H和72H后弃上清液，每孔加入50UL新鲜配制的含02MG/MLMTT无血清培养液，37继续孵育4H。小心弃上清液，并加入150ULLDMSO，轻轻震荡使结晶溶解，选择570NM波长在酶标仪上测定各孔光密。

22、度OD值。以每组3个孔的平均值作为各孔的平均OD值，按公式GIR1实验组OD/对照组OD100，计算TRICHODERMANINB对各肿瘤细胞的生长抑制率GIR，并由ORIGIN软件求出半数抑制浓度IC50。抗肿瘤实验筛选结果如表2所示。0067表2抗肿瘤实验筛选结果IC50MGL10068样品胃癌细胞肠癌细胞肝癌细胞白血病细胞TRICHODERMANINB261710078阿霉素00622001250035000010069表2的实验结果显示，TRICHODERMANINB抗肿瘤活性显著，其对胃癌细胞MKN45及肠癌细胞LOVO的活性有一定的研究意义。0070三TRICHODERMANINB。

23、抗病毒的实验研究。00711病毒毒力测定。0072选用HEP2细胞，加入10倍稀释7个浓度的各病毒液，每稀释度加4孔，37、5CO2培养3D，观察细胞病变CPE，以REEDMUENCH法计算病毒半数感染剂量TCID50。00732CPE程度的判断。0074“一”表示细胞生长基本正常，未出现病变；“1”表示细胞病变约占整个单层细胞25；“2”表示细胞病变约占整个单层细胞的2550；“3”表示细胞病变约占整个单层细胞的5075；“4”表示细胞病变约占整个单层细胞的75100。根椐以上细胞病变5级标准判断，若CPE为“1”及其以下“一”，则视为阴性，其余的“2”及其以上各级，均视为阳性，利用REED。

24、MUENCH法计算TCID50。00753化合物毒性测定。样品白色念珠菌新生隐球菌红色毛癣菌薰烟曲霉菌说明书CN102464634A6/10页90076用HEP2细胞板，加人7个两倍连续稀释的不同浓度的化合物溶液，每稀释度加4孔，37、5CO2中培养3D，观察化合物对细胞的毒性，以REEDMUENCH法计算半数中毒浓度TC50和最大无毒浓度TC0。00774毒性试验结果判断标准。0078以下结果中的数字表示化合物对细胞的毒性程度分级1“一”表示细胞生长基本正常，未出现中毒现象；“1”表示中毒细胞发生率25；“2”表示中毒细胞发生率在2550；“3”表示中毒细胞发生率在5075；“4”表示中毒细。

25、胞发生率75。2若毒性为“1”及其以下“一”，则视为阴性，可认为此浓度样品对细胞无中毒现象，其余的“2”及其以上各级，均视为阳性，即所试样品在此浓度对细胞有中毒作用，利用REEDMUENCH法计算50中毒浓度TC50。通过将上述毒性试验结果经REEDMUENEH法计算，得出TRICHODERMANINB对HEP2细胞的50毒性浓度为TC50446MG/ML，TC0312MG/ML；阳性酞丁安软膏的50的毒性浓度为TC50224MG/ML，TC0156MG/ML。00795抗病毒试验。0080倒去96孔已长成单层的HEP2细胞板中培养液，加入100TCID50的各病毒液，吸附1H，倾去病毒液，用。

26、从最大无毒浓度TC0起2倍稀释5个浓度的化合物样品，每浓度加3孔，设细胞对照和病毒对照。37、5CO2中培养3D，观察CPE。以REEDMUENCH法计算50有效浓度EC50及治疗指数TITC50/EC50。抗病毒实验筛选结果如表3所示。0081表3TRICHODERMANINB对单纯疱疹病毒I和II型的影响00820083表3的实验数据表明，TRICHODERMANINB对单纯疱疹病毒I型和II型致细胞病变有明显抑制作用。附图说明0084图1是本发明化合物的核磁共振二维谱图。具体实施方式0085下面结合附图和具体实施例，进一步阐述本发明。这些实施例应理解为仅用于说明本发明而不用于限制本发明的。

27、保护范围。在阅读了本发明记载的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等效变化和修饰同样落入本发明权利要求所限定的范围。0086本发明下述优选实施例研究三尖杉内生真菌深绿木霉TRICHODERMAATROVIRIDS361及其发酵产物中分离到的新化合物TRICHODERMANINB以及其的药理作用，提供了一种能够用于制备抗真菌、抗病毒、抗肿瘤产品的原料，为新的活性药物开发打下了基础。0087一真菌及其发酵产物的制备方法说明书CN102464634A7/10页100088为进一步阐述新化合物TRICHODERMANINB的制备方法，下面通过举例来说明具体的操作步骤和方法。008。

28、91挑选新鲜、健康三尖杉树皮，将其表面洗净、晾干水分，消毒；0090所述的消毒方法的具体操作步骤是0091在无菌操作台中用75乙醇漂洗2030秒；0092无菌水冲洗4次；00935NACLO溶液漂洗5分钟；0094无菌水冲洗4次；009575乙醇漂洗2030秒；0096无菌水冲洗4次。00972无菌滤纸片吸干水分，分别切成5MM5MM1MM的小块接种于培养基上，每个培养皿中接4块，置28恒温培养箱中培养330天；00983观察到培养基上从各植物组织块内部向周围长出菌丝时，采用尖端菌丝挑取法把真菌转移到新的培养基上继续培养、转接；00994待纯化后，再转移到PDA培养基最常用的真菌培养基，广泛用。

29、于保存菌种斜面试管中，即得到该真菌菌株，对其编号为S361，备用。0100例如，本实施例所述发酵产物的制备方法可以为先对深绿木霉TRICHODERMAATROVIRIDS361进行发酵，再分别收集发酵液和菌丝体01011培养基准备0102使用PDA培养基，高温灭菌，制成斜面，置于常温状态下，无杂菌生长时，接种以上方法制备得到的深绿木霉TRICHODERMAATROVIRIDS361菌丝体，于常温下培养。01032发酵种子液制备0104在多个锥形瓶中分别装入液体培养基。于高温灭菌后，进行接种，常温下震荡培养，将该培养物作为种子。01053接种0106准备发酵瓶，发酵培养基装量适量，培养基组成与种。

30、子培养基相同，高温灭菌，接种，常温下震荡培养。0107液体发酵于250ML的三角瓶中加入80ML液体培养基，接种深绿木霉TRICHODERMAATROVIRIDS361菌种菌丝体，摇床28、180RMIN1振荡培养3天左右，作为发酵种子液。将种子液接种在培养液中，摇床28、180RMIN1振荡培养67D，真菌即可发酵成熟。01084萃取0109分别收集发酵液和菌丝体0110发酵液的处理方法待真菌发酵成熟后，过滤去菌丝体，对发酵成熟的液层进行乙酸乙酯部位的萃取，滤液用乙酸乙酯萃取3次，合并、浓缩。0111菌丝体的处理方法菌丝体50烘干，用乙醇浸泡24小时，再以乙醇为溶剂超声辅助萃取3次，每次30。

31、分钟，合并、浓缩乙醇。01125单体分离纯化0113将发酵物萃取浓缩后的浸膏4G，用硅胶色谱柱分离，洗脱液的极性为石油醚丙说明书CN102464634A108/10页11酮151，以10ML为单位收集洗脱液。将第15管收集液重结晶，即可得到单体化合物TRICHODERMANINB0114二发酵产物的鉴定方法0115本实施例综合应用质谱简称MS、核磁共振氢谱简称1HNMR、核磁共振碳谱简称13CNMR以及核磁共振二维谱简称2DNMR等分析技术对发酵产物中的TRICHODERMANINB进行结构鉴定。0116TRICHODERMANINB具有如下理化性质0117该化合物为无色结晶，分子式C15H2。

32、8O3，MW256；易溶于甲醇、乙醇等极性较大的溶剂，微溶于水；MP188190；ESIMSM/Z2MNA5352；核磁共振氢谱、核磁共振碳谱数据如表4所示0118表4TRICHODERMANINB的核磁共振氢谱、核磁共振碳谱数据0119说明书CN102464634A119/10页12POSITIONSHJCPOSITIONSHJC1812S9702S21611H，M，1701H，M404T101601H，M451D31402H，M253T111043H，D，J65137Q42031H，M543D121293H，S260Q5858S131203H，S269Q61711H，M，1891H，M347T141233H，S278Q71801H，M，1901H，M262T151113H，S240Q83681H，DD，J100，50867D0120核磁共振二维谱数据如图1所示KEYHMBCAND1H1HCOSYCORRELATIONSOFTRICHODERMANINB。说明书CN102464634A1210/10页130121综上，TRICHODERMANINB的分子式为C15H28O3，分子量为256，结构式为0122说明书CN102464634A131/1页14图1说明书附图CN102464634A14。

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