抗 -CD100 抗体和其使用方法 发明背景
CD100， 也称为脑信号蛋白 4D(SEMA4D)， 是属于脑信号蛋白基因家族的跨膜蛋白 ( 如 SEQ ID NO ： 1( 人 ) ； SEQ ID NO ： 2( 鼠 ))。CD100 在细胞表面上以同源二聚体的形式 表达， 但细胞活化后， CD100 可通过蛋白水解切割从细胞表面上释放， 产生活性该蛋白的可 溶 形 式 sCD100。 参 见 Suzuki 等， Nature Rev.Immunol.3 ： 159-167(2003) ； Kukutani 等， Nature Immunol.9 ： 17-23(2008)。
最初， 通过产生对抗活化人 T 细胞克隆的两种小鼠单克隆抗体 BD16 和 BB18 鉴定 CD100(Herold 等， Int.Immunol.7 ： 1-8(1994))。CD100 是免疫系统所表达脑信号蛋白中的 首例。CD100 在静息 T 细胞表面上表达丰富， 在静息 B 细胞、 单核细胞和专性抗原提呈细胞 如树突细胞 (DC) 上表达较弱。 细胞活化可刺激上调 CD100 在 B 细胞和树突细胞表面上的表 达， 以及 sCD100 的产生。认为 CD100 既可用作受体通过其胞质结构域传递信号、 又可用作 配体 (Hall 等， PNAS 93 ： 11780-11785(1996))。已鉴定的 CD100 的受体之一是丛蛋白 -B1。 丛蛋白 -B1 在非淋巴样组织中表达， 是 CD100 的高亲和 (1nM) 受体 (Tamagnone 等， Cell 99 ： 71-80(1999))。
CD100 是 T 细胞和 B 细胞活化的重要介导物。CD100 敲除 (CD100-/-) 小鼠对 T 依 赖性抗原的抗体应答降低， 并且 T 细胞初敏受损。这两项功能在给予 sCD100 后得到恢复 (Shi 等， Immunity 13 ： 633-642(2000))。
除了已证明的 CD100 对免疫细胞的作用外， CD100 也显示在神经炎性疾病中观 察到的脱髓鞘和轴突变性中起到直接作用。炎性脱髓鞘疾病， 如 MS 的发病机理包括涉及 免疫细胞的炎性期和选择性脱髓鞘和神经变性的时期。CD100 在中枢神经系统 (CNS) 少 突胶质细胞中表达， 是轴突变性的抑制剂。CD100 表达在脊髓损伤外周的少突胶质细胞 中上调 (Moreau-Fauvarque 等， J.Neuroscience 23 ： 9229-9239(2003))。将表达 sCD100 的长期活化 T 细胞与人多能神经前体或来自大鼠脑的原代少突胶质细胞一起培养能诱 导凋亡和突起伸长破坏 (process extension collapse)(Giraudon 等， J.Immunol.172 ： 1246-1255(2004) ； Giraudon 等， NeuroMolecular Med.7 ： 207-216(2005))。BD16 抗 -CD100 抗体可抑制 CD100 诱导的神经前体凋亡。
CD100 敲除小鼠能抵抗实验性变应性脑脊髓炎 (EAE)， 这是人多发性硬化 (MS) 的 小鼠模型 (Kumanogoh 等， J.Immulol.169 ： 1175-1181(2002))。
其它多项研究已证明， CD100 能诱导神经元的生长锥破坏， 且据报道在 HTLV-1 相 关脊髓病 / 热带痉挛性轻截瘫 (HAM/TSP) 患者的脑脊液 (CSF) 中 sCD100 水平急剧升高， 进一步支持 CD100 在神经炎症中的功能相关性。因此， sCD100 对少突胶质细胞和神经前体 完整性具有直接有害作用， 并且 CD100 可能在脱髓鞘中起致病作用。作为炎症反应和直接 脱髓鞘的重要介导物， 本领域需要用于治疗炎性疾病和脱髓鞘疾病的 CD100 中和分子， 如 抗 -CD100 抗体。
CD100 也是有效的促血管新生分子。通过 CD100 结合激活丛蛋白 -B1 可在体内和 体外反式激活 c-Met、 促进肿瘤细胞的侵袭能力、 还能促进血管新生。在较大肿瘤样本中的
CD100 免疫组化分析揭示出 CD100 过度表达是头颈癌、 前列腺癌、 结肠癌、 乳腺癌和肺癌中 非常常见的事件。
CD100/ 丛 蛋 白 B1 信 号 转 导 也 能 诱 导 内 皮 细 胞 迁 移， 并促进肿瘤细胞迁移 (Conrotto 等， Blood 105 ： 4321-4329(2005) ； Giordano 等， Nature Cell Biology4 ： 720-724(2002))。通过 CD100- 阻断抗体和 CD100 敲减， 可防止 CD100 诱导的内皮细胞 迁移。植入裸小鼠之前， 用 CD100 短发夹 RNA(shRNA) 敲减头颈鳞状细胞癌 (HNSCC) 细 胞的 CD100 表达导致肿瘤血管化程度和肿瘤生长水平显著降低 (Basile 等， PNAS 103 ： 9017-9022(2006))。近期的报道指出肿瘤基质的炎性浸润和高血管化等级之间紧密相关。 CD100 由肿瘤微环境中存在的炎性细胞产生。在缺少 CD100 的环境中， 小鼠乳腺癌细胞 产生肿瘤体和转移灶的能力被严重削弱， CD100 的来源是肿瘤相关巨噬细胞 (Sierra 等， JEM205 ： 1673-1685(2008))。因此， 本领域还需要用于治疗 CD100 癌症的 CD100 中和分子， 如抗 -CD100 抗体。 发明领域
本发明涉及 CD100 中和抗体， 如人源化单克隆抗体， 所述抗体的使用方法， 和治疗 CD100 表达细胞相关病症和疾病的方法。 发明概述
提供治疗 CD100 相关疾病的组合物和方法， 包括某些类型的自身免疫病、 炎性疾 病、 癌症和侵袭性血管新生。具体说， 已经开发了抗 -CD100 单克隆抗体来中和 CD100。小 鼠 MAb67 在体外显示出阻断 CD100 活性的能力， 并在小鼠模型中减轻实验性变应性脑脊髓 炎 (EAE)、 胶原诱导性关节炎 (CIA) 和癌症的临床征象的严重性。 MAb 2503 是人源化的 MAb 67， 已证明它与人和鼠 CD100 的亲和力提高， 并且与 MAb 67 具有相似的 CD100 阻断活性。
在一个实施方式中， 本发明提供分离的结合分子， 其与选自 2503、 67 或 76 的参比 单克隆抗体相同的 CD100 表位特异性结合。
在另一实施方式中， 本发明提供特异性结合 CD100 的分离的结合分子， 所述结合 分子竞争性抑制选自 2503、 67 或 76 的参比单克隆抗体特异性结合 CD100。
在另一实施方式中， 本发明提供特异性结合 CD100 的分离的抗体或其抗原结合片 段， 所述抗体或其片段是单克隆抗体 2503、 67 或 76。
在某些实施方式中， 本发明所述特异性结合 CD100 的分离的抗体或其抗原结合片 段包含重链可变区 (VH)， 该重链可变区的氨基酸序列与 SEQ ID NO ： 9、 SEQ ID NO ： 10 或 SEQ ID NO ： 25 至少 90％相同。在本发明的另一方面， 所述抗体或其片段的 VH 包含除 20 个或更 少保守性氨基酸取代外， 与 SEQ IDNO ： 9、 SEQ ID NO ： 10 或 SEQ ID NO ： 25 相同的氨基酸序 列。在本发明的另一方面， 所述抗体或其片段的 VH 包含氨基酸序列 SEQ ID NO ： 9、 SEQ ID NO ： 10 或 SEQ ID NO ： 25， 或由其组成。
在某些实施方式中， 本发明所述特异性结合 CD100 的分离的抗体或其抗原结合片 段包含轻链可变区 (VL)， 该轻链可变区的氨基酸序列与 SEQ ID NO ： 17、 SEQ ID NO ： 18 或 SEQ ID NO ： 29 至少 90％相同。在本发明的另一方面， 所述抗体或其片段的 VL 包含除 20 个 或更少保守性氨基酸取代外， 与 SEQ IDNO ： 17、 SEQ ID NO ： 18 或 SEQ ID NO ： 29 相同的氨基 酸序列。 在本发明的另一方面， 所述抗体或其片段的 VL 包含氨基酸序列 SEQ ID NO ： 17、 SEQ
ID NO ： 18 或 SEQ ID NO ： 29， 或由其组成。
在另一实施方式中， 本发明提供特异性结合 CD100 的分离的抗体或其抗原结合 片段， 其中所述抗体或其片段的 VH 包含以下 CDR 中至少一个 ： 除 2 个或更少氨基酸取代 外， 与 SEQ ID NO ： 6 相同的 Chothia-Kabat 重链互补决定区 -1(VH-CDR1) 氨基酸序列 ； 除 4 个或更少氨基酸取代外， 与 SEQ ID NO ： 7 相同的 Kabat 重链互补决定区 -2(VH-CDR2) 氨 基酸序列 ； 或者除 2 个或更少氨基酸取代外， 与 SEQ ID NO ： 8 相同的 Kabat 重链互补决定 区 -3(VH-CDR3) 氨基酸序列。
在另一实施方式中， 本发明提供特异性结合 CD100 的分离的抗体或其抗原结合片 段， 其中所述抗体或其片段的 VL 包含以下 CDR 中至少一个 ： 除 4 个或更少氨基酸取代外， 与 SEQ ID NO ： 14 相同的 Kabat 轻链互补决定区 -1(VL-CDR1) 氨基酸序列 ； 除 2 个或更少氨基 酸取代外， 与 SEQ ID NO ： 15 相同的 Kabat 轻链互补决定区 -2(VL-CDR2) 氨基酸序列 ； 或者 除 2 个或更少氨基酸取代外， 与 SEQ ID NO ： 16 相同的 Kabat 轻链互补决定区 -3(VL-CDR3) 氨基酸序列。
在另一方面， 本发明抗体或其片段的 VH 包含 VH-CDR1、 VH-CDR2 和 VH-CDR3 氨基酸 序列， 在一个或多个所述 VH-CDR 中， 除 2 个或更少氨基酸取代外， 它们分别包含 SEQ ID NO ： 6、 7 和 8。另一方面， 所述 VH-CDR1、 VH-CDR2 和 VH-CDR3 氨基酸序列分别是 SEQ ID NO ： 6、 7 和 8。 在另一方面， 本发明抗体或其片段的 VL 包含 VL-CDR1、 VL-CDR2 和 VL-CDR3 氨基酸 序列， 在一个或多个所述 VL-CDR 中， 除 2 个或更少保守性氨基酸取代外， 它们分别包含 SEQ ID NO ： 14、 15 和 16。另一方面， 所述 VL-CDR1、 VL-CDR2 和 VL-CDR3 氨基酸序列分别是 SEQ ID NO ： 14、 15 和 16。
在另一实施方式中， 本发明提供特异性结合 CD100 的分离的抗体或其抗原结合片 段， 其中所述抗体或其片段的 VH 包含以下 CDR 中至少一个 ： 除 2 个或更少氨基酸取代外， 与 SEQ ID NO ： 26 相同的 Kabat 重链互补决定区 -1(VH-CDR1) 氨基酸序列 ； 除 4 个或更少氨基 酸取代外， 与 SEQ ID NO ： 27 相同的 Kabat 重链互补决定区 -2(VH-CDR2) 氨基酸序列 ； 或者 除 2 个或更少氨基酸取代外， 与 SEQ ID NO ： 28 相同的 Kabat 重链互补决定区 -3(VH-CDR3) 氨基酸序列。
在另一实施方式中， 本发明提供特异性结合 CD100 的分离的抗体或其抗原结合片 段， 其中所述抗体或其片段的 VL 包含以下 CDR 中至少一个 ： 除 4 个或更少氨基酸取代外， 与 SEQ ID NO ： 30 相同的 Kabat 轻链互补决定区 -1(VL-CDR1) 氨基酸序列 ； 除 2 个或更少氨基 酸取代外， 与 SEQ ID NO ： 31 相同的 Kabat 轻链互补决定区 -2(VL-CDR2) 氨基酸序列 ； 或者 除 2 个或更少氨基酸取代外， 与 SEQ ID NO ： 32 相同的 Kabat 轻链互补决定区 -3(VL-CDR3) 氨基酸序列。
在另一方面， 本发明抗体或其片段的 VH 包含 VH-CDR1、 VH-CDR2 和 VH-CDR3 氨基酸 序列， 在一个或多个所述 VH-CDR 中， 除 4 个或更少氨基酸取代外， 它们分别包含 SEQ ID NO ： 26、 27 和 28。另一方面， 所述 VH-CDR1、 VH-CDR2 和 VH-CDR3 氨基酸序列分别是 SEQ ID NO ： 26、 27 和 28。
在另一方面， 本发明抗体或其片段的 VL 包含 VL-CDR1、 VL-CDR2 和 VL-CDR3 氨基酸 序列， 在一个或多个所述 VL-CDR 中， 除 4 个或更少氨基酸取代外， 它们分别包含 SEQ ID NO ：
30、 31 和 32。另一方面， 所述 VL-CDR1、 VL-CDR2 和 VL-CDR3 氨基酸序列分别是 SEQ ID NO ： 30、 31 和 32。
在另一方面， 本发明抗体或其片段结合人和鼠 CD100。在另一方面， 本发明抗体或 其片段特异性结合 CD100 多肽或其片段或者 CD100 变体多肽的亲和力特征是解离常数 (KD) 不 大 于 5x10-2M、 10-2M、 5x10-3M、 10-3M、 5x10-4M、 10-4M、 5x10-5M、 10-5M、 5x10-6M、 10-6M、 5x10-7M、 10-7M、 5x10-8M、 10-8M、 5x10-9M、 10-9M、 5x10-10M、 10-10M、 5x10-11M、 10-11M、 5x10-12M、 5.7x10-12M、 8.4x10-12M、 10-12M、 5x10-13M、 10-13M、 5x10-14M、 10-14M、 5x10-15M 或 10-15M。 在 某 些 方 面， 所述 CD100 多肽或其片段或者 CD100 变体多肽是人或鼠的。在其它方面， CD100 多肽或其片段或 -9 -9 者 CD100 变体多肽是人的， 所述 KD 为约 5x10 M 至 6x10 M。在另一方面， CD100 多肽或其片 -9 -9 段或者 CD100 变体多肽是鼠的， 所述 KD 为约 1x10 M 至 2x10 M。
在另一方面， 本发明抗体或其片段是人源化的、 灵长化的或嵌合的。
在另一实施方式中， 本发明提供包含本发明抗体或其片段以及运载体的组合物。
在另一实施方式中， 本发明提供一种分离的多核苷酸， 其包含编码本发明抗体 VH 或 VL 多肽的核酸。在另一方面， 本发明多核苷酸包含编码本发明抗体或其片段的核酸或者 由其组成。另一方面， 本发明提供包含本发明多核苷酸的载体。在另一方面， 本发明提供包 含本发明载体的宿主细胞。在另一方面， 本发明提供一种产生本发明抗体的方法。
在另一实施方式中， 本发明提供一种在需要治疗的动物中治疗自身免疫病症或炎 性疾病的方法， 所述方法包括给予所述动物一种组合物， 该组合物包含 ： 本发明的分离的抗 体或其片段和药学上可接受的运载体。在其它实施方式中， 所述自身免疫病或炎性疾病是 多发性硬化或关节炎。
在另一实施方式中， 本发明提供一种在需要治疗的动物中治疗癌症的方法， 所述 方法包括给予所述动物一种组合物， 该组合物包含 ： 本发明的分离的抗体或其片段和药学 上可接受的运载体。
在另一实施方式中， 本发明提供一种在需要治疗癌症的动物中抑制血管新生的方 法， 所述方法包括给予所述动物一种组合物， 该组合物包含 ： 本发明的分离的抗体或其片段 和药学上可接受的运载体。
另一方面， 本发明抗体或其片段抑制 CD100 与 CD100 受体的结合。在本发明的另 一方面， 所述 CD100 受体是丛蛋白 -B1。
附图简要说明
图 1.CD100 阻断实验图示。CD100- 组氨酸显示与表达丛蛋白 B1 的稳定细胞系 (293/ 丛蛋白 ) 细胞表面上丛蛋白 B1 的结合。用生物素偶联的抗 - 组氨酸标签特异性单克 隆抗体和链霉亲和素 -APC 检测结合于丛蛋白 B1 的 CD100- 组氨酸。经流式细胞术检测， 能 够阻断 CD100- 组氨酸与丛蛋白 B1 结合的抗 -CD100MAb 产生的与 293/ 丛蛋白细胞相关的 荧光较低。
图 2. 显 示 在 图 1 所 示 的 CD100 阻 断 实 验 中 检 测 兔 抗 - 组 氨 酸 + 链 霉 亲 和 素 -APC(Rb 抗 - 组 氨 酸 +sAPC)、 小 鼠 CD100( 只 有 muCD100)、 小 鼠 CD100+0.625μg/ml MAb(MAb 67、 MAb 76 和 mIgG 同种型 ) 和小鼠 CD100+0.156μg/ml MAb(MAb 67、 MAb 76 和 mIgG 同种型 ) 的流式细胞分析结果。单克隆抗体 67 和 76 阻断小鼠 CD100 与丛蛋白 B1 受 体的结合。图 3.MAb 67(67-2) 和 76(76-1) 的吸光度比同种型对照增加说明， 单克隆抗体 67 和 76 阻断小鼠 CD100 介导的 293/ 丛蛋白 B 细胞从纤连蛋白包被平板上解离。
图 4. 临床评分降低说明， 与小鼠 IgG 对照的治疗相比， 在 SJL 小鼠中用 30mg/kg 抗 -CD100MAb 76(1X/ 周或 2X/ 周 ) 或 MAb 67(1X/ 周或 2X/ 周 ) 治疗能减轻复发缓解型 EAE(4A)。通过各个 MAb 治疗的小组平均分 (GMS) 的降低百分数在第 21 天和研究结束之间 的比较， 进一步说明该结果 (4B)。
图 5. 临床评分降低说明， 与小鼠 IgG 对照的治疗相比， 在 SJL 小鼠中用 30mg/kg 抗 -CD100MAb 76(1X/ 周 ) 或 MAb 67(1X/ 周 ) 治疗能减轻复发缓解型 EAE(5A)。通过两个 MAb 治疗的小组平均分 (GMS) 的降低百分数在第 18 天和研究结束之间， ， 进一步说明该结果 (5B)。
图 6. 临床评分降低说明， 与小鼠 IgG 对照的治疗相比， 在 SJL 小鼠中从免疫后第 7 天开始用 30mg/kg 抗 -CD100MAb 67(1X/ 周 ) 治疗能减轻复发缓解型 EAE。
图 7.ELISA 结果显示由于 MAb 2503、 MAb 67 或 IgG 对照的竞争性结合， 生物素化 的 67 与人 CD100(7A) 或小鼠 CD100(7B) 结合的阻断百分数 (％ )。
图 8. 显示在图 1 所示的 CD100 阻断实验中检测的链霉亲和素 -APC( 只有 sAPC)、 人 CD100(huCD100)、 狨 CD100(marmCD100)、 小鼠 CD100(muCD100)、 1.0μg 同种型和 1.0μg MAb(67 或 2503) 的流式细胞分析结果。MAb 67 和 MAb2503 阻断人 CD100(8A)、 狨 (8B) 或小 鼠 (8C)CD100 与丛蛋白 B1 受体的结合。
图 9. 显示由于 MAb 67、 MAb 2503 和 IgG 对照中和 CD100， CD100 造成吸光度降低 被阻断。抗 -CD100 MAb 67 和 MAb 2503 阻断人 CD100(9A) 和狨 CD100(9B) 介导的 293/ 丛 蛋白细胞从纤连蛋白包被平板上解离。
图 10. 显示将 50,000 个 CT26 结肠肿瘤细胞注射入小鼠腿部肌肉后， 野生型 Balb/ 3 c 小鼠和 CD100-/- 小鼠的肿瘤体积变化 (mm )。
图 11. 显示将 50,000 个 CT26 肿瘤细胞注射入小鼠腿部肌肉后， 用 1mgMAb 67 或 1mg 对照小鼠 IgG 治疗的野生型 Balb/c 小鼠和 CD100-/- 小鼠 (″ KO″ ) 的平均腿体积变 化 (mm3)。
图 12. 胶原诱导型关节炎 (CIA) 总体治疗方案的示意图。
图 13. 显示在 600μg MAb 67 治疗组中， CIA 模型中关节炎疾病发展减缓。 600μg MAb 67 治疗小鼠的关节炎指数 (AI) 与 600μg 阴性对照 (IgG1) 和 600μg 阳性对照依那西 普 治疗小鼠的 AI 在第 20 天开始治疗时的比较 (13A)。在第 20 天或 AI ≥ 3 时开 治疗的关节 始治疗时， 比较 MAb 67 治疗与阴性对照 (IgG1) 和阳性对照依那西普炎指数 (AI) 结果 (13B)。
图 14. 用铝 ( 氢氧化铝 / 氢氧化镁 ) 沉淀的 (4- 羟基 -3- 硝基苯基 ) 乙酰基偶联 的鸡 γ 球蛋白 (″ NP-CGG″ ) 对 Balb/c 小鼠进行初次免疫 (14A) 和二次免疫 (14B) 后， 600μg MAb 67 治疗降低脾脏 (SP) 和淋巴结 (LN) 中生发中心 (GC)B 细胞 (″ B220+CD38 低 PNA+″ ) 的数量。也显示了使用或不用 NP-CGG 免疫的 CD100-/- 小鼠和 Balb/c 小鼠的 结果。
图 15. 显示将 50,000 个 CT26 结肠肿瘤细胞注射入小鼠腿部肌肉后， 野生型 Balb/ c 小鼠的肿瘤体积变化 (mm3)。显示从第 1 天开始每周注射 1mg MAb 67 的小鼠与注射 IgG对照的小鼠相比的结果。该研究进行至肿瘤生长延迟结束。
图 16. 显示将 50,000 个 BCA34 成纤维细胞肿瘤细胞皮下注射到小鼠腹部区域后， 野生型 Balb/c 小鼠和 CD100-/- 小鼠 (″ SEMA4D-/-″ ) 的肿瘤体积变化 (mm3)(16A)。显 示将 50,000 个 BCA34 成纤维细胞肿瘤细胞注射入小鼠腿部肌肉后， 用 1mg MAb 67 或 1mg 3 对照小鼠 IgG 治疗的野生型 Balb/c 小鼠的平均大腿体积变化 (mm )(16B)。
图 17. 显示将 50,000 个 EMT6 小鼠乳腺癌肿瘤细胞注射入小鼠腿部肌肉后， 野生 3 型 Balb/c 小鼠和 CD 100-/- 小鼠 (″ SEMA4D-/-″ ) 的肿瘤体积变化 (mm )。
图 18. 显示在无胸腺裸小鼠中， 向小鼠的胁部肌肉内皮下注射两个 HN12 头颈肿瘤 3 后的肿瘤体积变化 (mm )。显示从移植后第 1 天开始每周注射 1mgMAb 2503 的小鼠与注射 IgG4 对照的小鼠相比的结果。
图 19. 显示在无胸腺裸小鼠中， 向小鼠的腿部肌肉内皮下注射两个 HN6HIF1a 3 mODD 头颈肿瘤后的肿瘤体积变化 (mm )。显示从移植后第 1 天开始每周注射 1mg MAb 2503 的小鼠与注射 IgG4 对照的小鼠相比的结果 (19A)。来自 IgG4 对照和 MAb 2503 治疗的小鼠 的代表性肿瘤照片 (19B)。
图 20. 大鼠中进行的 MAb2503 单次静脉内注射饱和分析的饱和百分数结果。通过 静脉内单次注射将 0、 0.01、 0.1、 1.0、 10 和 100mg/kg 剂量 MAb 2503 给予 Sprague-Dawley 大鼠。对雄性 (20A) 和雌性 (20B) 大鼠在不同时间点的裂解全血进行基于流式细胞术的饱 和实验， 以确定细胞靶点 (SEMA4D) 被 MAb 2503 饱和的百分数。 图 21. 猕猴中进行的 MAb2503 单次静脉内注射饱和分析的饱和百分数结果。通 过单次静脉内注射将 0、 0.01、 0.1、 1.0、 10 和 100mg/kg 剂量的 MAb 2503 给予猕猴。在对 不同时间点的裂解全血进行基于流式细胞术的饱和实验， 以确定细胞靶点 (SEMA4D) 被 MAb 2503 饱和的百分数 ( 雄性和雌性数据合并 )。
发明详述
I. 定义
需要注意， 术语 “一个” 或 “一种” 物质指一种或多种该物质 ； 例如， “一种抗 -CD100 抗体” 应理解为代表一种或多种抗 -CD100 抗体。例如， 术语 “一个” (或 “一种” )、 “一个或 多个” 和 “至少一个” 在本文中可以互换使用。
本文所用术语 “肿瘤” 是指无论恶性或良性的所有成瘤性细胞生长和增殖， 以及所 有的癌和癌前的细胞和组织。
“侵袭性血管新生” 指支持病理状况， 包括恶性和非恶性肿瘤的血管形成以及黄斑 变性中新血管的异常形成。
术语 “癌症” 和 “癌” 是用于描述哺乳动物的生理病症， 其典型特征是细胞生长失 控。癌症的例子包括但不限于癌、 淋巴瘤和白血病。
本文所用术语 “多肽” 包括单数形式和复数形式， 涵盖酰胺键 ( 也称肽键 ) 线性连 接的单体 ( 氨基酸 ) 所组成的分子。术语 “多肽” 指两个或多个氨基酸的任何一条链或多 条链， 而非具体长度的产物。因此， 肽、 二肽、 三肽、 寡肽、 “蛋白质” 、 “氨基酸链” 或其它任何 用于指两个或多个氨基酸的一条或多条链的术语均包含于 “多肽” 的定义内， 术语 “多肽” 可 与这些术语替代或互换使用。术语 “多肽” 还指多肽表达后修饰的产物， 这些修饰包括但不 限于糖基化， 乙酰基化， 磷酸化， 酰胺化， 通过已知保护 / 封闭基团衍生化， 蛋白酶切割或非
天然氨基酸修饰。多肽可能由天然生物来源衍生或由重组技术产生， 但不一定由标明的核 酸序列翻译而来。可以任何方式产生多肽， 包括化学合成。
本发明多肽的大小可以是约 3 个或更多个、 5 个或更多个、 10 个或更多个、 20 个或 更多个、 25 个或更多个、 50 个或更多个、 75 个或更多个、 100 个或更多个、 200 个或更多个、 500 个或更多个、 1,000 个或更多个或者 2,000 个或更多个氨基酸。多肽可具有确定的三维 结构， 但它们不一定具有这种结构。 具有确定三维结构的多肽称为折叠多肽， 不具有确定的 三维结构、 但可采用大量不同构象的多肽称为非折叠多肽。本文所用术语 “糖蛋白” 指偶联 于至少一个糖部分的蛋白质， 所述糖部分通过某些氨基酸残基， 如丝氨酸残基或天冬酰胺 残基的含氧或含氮侧链连接于蛋白质。
“分离的” 多肽或其片段、 变体或衍生物指不在其天然环境中的多肽。不要求特定 的纯化水平。例如， 可从其自然或天然环境中取出分离多肽。根据本发明目的， 在宿主细胞 中表达的重组产生的多肽和蛋白质被认为是分离的， 通过任何合适技术分离、 分级、 部分或 基本上纯化的天然或重组多肽也是如此。
本发明多肽也包括上述多肽的片段、 衍生物、 类似物或变体， 及其任何组合。提到 本发明抗 -CD100 抗体或抗体多肽时， 术语 “片段” 、 “变体” 、 “衍生物” 和 “类似物” 包括保持 相应的本发明抗体或本发明抗体多肽的至少一部分抗原结合特性的任何多肽。 除本文其它 部分讨论的具体抗体片段外， 本发明多肽的片段还包括蛋白酶水解片段， 以及缺失片段。 本 发明抗 -CD100 抗体和抗体多肽的变体包括上述片段， 以及具有因氨基酸取代、 缺失或插入 而改变氨基酸序列的多肽。变体可以是天然产生的或非天然产生的。可使用本领域所知的 诱变技术产生非天然变体。 变体多肽可包含保守的或非保守的氨基酸取代、 缺失或添加。 多 肽变体本文中也称作 “多肽类似物” 。本文所用抗 -CD100 抗体或抗体多肽的 “衍生物” 指具 有由官能性侧链基团反应化学衍生的一个或多个残基的对象多肽。 “衍生物” 还包括那些含 有一个或多个 20 种标准氨基酸的天然氨基酸衍生物的肽。例如， 4- 羟基脯氨酸可取代脯 氨酸 ； 5- 羟基赖氨酸可取代赖氨酸 ； 3- 甲基组氨酸可取代组氨酸 ； 高丝氨酸可取代丝氨酸 ； 鸟氨酸可取代赖氨酸。本发明抗 -CD100 抗体和抗体多肽的衍生物可包括经改变具有本发 明参比抗体或抗体多肽上不存在的额外特征的多肽。
术语 “多核苷酸” 包括单个核酸和多个核酸， 指分离的核酸分子或构建物， 例如信 使 RNA(mRNA) 或质粒 DNA(pDNA)。 多核苷酸可包含常规磷酸二酯键或非常规键 ( 如酰胺键， 如肽核酸 (PNA) 中的酰胺键 )。术语 “核酸” 指多核苷酸中存在的任何一种或多种核酸区 段， 如 DNA 或 RNA 片段。 “分离的” 核酸或多核苷酸指从其天然环境中取出的核酸分子， DNA 或 RNA。例如， 根据本发明目的， 包含在载体中的编码抗 -CD100 结合分子， 如抗体或其抗原 结合片段的重组多核苷酸被认为是分离的。 分离的多核苷酸的其它例子包括保持于异源宿 主细胞的重组多核苷酸或纯化 ( 部分或基本上纯化 ) 在溶液中的多核苷酸。分离的 RNA 分 子包括本发明多核苷酸的体内或体外 RNA 转录物。根据本发明， 分离的多核苷酸或核酸还 包括合成产生的此类分子。此外， 多核苷酸或核酸可以是或可包括调控元件， 如启动子、 核 糖体结合位点或转录终止子。
本文所用术语 “编码区” 指由翻译成氨基酸的密码子组成的核酸部分。虽然 “终止 密码子” (TAG、 TGA 或 TAA) 不翻译成氨基酸， 但它可被认为是编码区的一部分， 而任何侧接 序列， 如启动子、 核糖体结合位点、 转录终止子、 内含子等均不是编码区的一部分。 本发明的两个或多个编码区可安置在同一多核苷酸构建物中， 例如在同一载体上， 或者在单独的多 核苷酸构建物中， 例如在单独 ( 不同 ) 载体上。而且， 任何载体可包含单个编码区， 或者可 包含两个或多个编码区， 例如， 单一载体可单独编码免疫球蛋白重链可变区和免疫球蛋白 轻链可变区。此外， 本发明的载体、 多核苷酸或核酸可编码与抗 -CD100 抗体或其片段、 变体 或衍生物的编码核酸融合或不融合的异源编码区。 异源编码区包括但不限于专用的元件或 基序， 如分泌信号肽或异源功能结构域。
在某些实施方式中， 所述多核苷酸或核酸是 DNA。当指 DNA 时， 包含多肽编码核酸 的多核苷酸通常包含启动子和 / 或其它转录或翻译控制元件， 这些元件与一个或多个编码 区可操作地连接。可操作地连接指， 当基因产物如多肽的编码区与一个或多个调控序列以 此方式连接时， 将使该基因产物的表达受到该调控序列的影响或控制。如果启动子功能的 诱导使编码所需基因产物的 mRNA 转录， 且如果两个 DNA 片段间连接的属性不干扰表达调控 序列指导基因产物表达或不干扰转录 DNA 模板的能力， 则两个 DNA 片段 ( 如多肽编码区及 其相连的启动子 ) “可操作地连接” 。因此， 如果启动子能够影响核酸的转录， 则启动子区域 与多肽编码核酸可操作地连接。启动子可以是仅在预先确定的细胞中指导 DNA 实质转录的 细胞特异性启动子。 启动子以外的其它转录控制元件如增强子、 操纵子、 阻抑物和转录终止 信号， 可与多核苷酸可操作地连接以指导细胞特异性转录。本文公开了合适的启动子和其 它转录控制区。
许多转录控制区是本领域技术人员已知的。它们包括但不限于在脊椎动物细胞 中发挥作用的转录控制区， 例如但不限于， 来自巨细胞病毒 ( 立即早期启动子， 与内含子 -A 联用 )、 猿病毒 40( 早期启动子 ) 和逆转录病毒 ( 如劳氏肉瘤病毒 ) 的启动子和增强子区 段。其它转录控制区包括衍生自脊椎动物基因， 例如肌动蛋白、 热激蛋白、 牛生长激素和兔 β- 珠蛋白的那些， 以及能够在真核细胞中控制基因表达的其它序列。 其它合适的转录控制 区包括组织特异性启动子和增强子， 以及淋巴因子诱导型启动子 ( 如干扰素或白介素诱导 的启动子 )。
类似地， 本领域普通技术人员了解各种翻译控制元件。 它们包括但不限于 ： 核糖体 结合位点、 翻译起始和终止密码子以及衍生自小核糖核酸病毒的元件 ( 特别是内部核糖体 进入位点或 IRES， 也称为 CITE 序列 )。
在其它实施方式中， 本发明多核苷酸是 RNA， 例如， 信使 RNA(mRNA) 形式。
本发明的多核苷酸和核酸编码区可与编码指导本发明多核苷酸编码多肽分泌的 分泌或信号肽的其它编码区联合。根据信号假说， 哺乳动物细胞分泌的蛋白质具有信号肽 或分泌前导序列， 一旦生长的蛋白质链向粗面内质网外的输出过程启动， 就将这些序列从 成熟蛋白质上切掉。本领域普通技术人员了解， 脊椎动物细胞分泌的多肽通常具有融合于 所述多肽 N 末端的信号肽， 它们从完整或 “全长” 多肽上切掉后产生分泌或 “成熟” 形式的多 肽。在某些实施方式中， 使用天然信号肽， 例如免疫球蛋白重链或轻链信号肽， 或者使用仍 然能够指导与其操作性相连的多肽分泌的该序列的功能衍生物。或者， 可采用异源哺乳动 物信号肽或其功能衍生物。例如， 野生型前导序列可以用人组织纤溶酶原激活物 (TPA) 或 小鼠 β- 葡糖醛酸糖苷酶的前导序列代替。
广义来说， 本发明″结合分子″或″抗原结合分子″指特异性结合抗原决定簇的 分子。 在一个实施方式中， 所述结合分子特异性结合 CD100， 如大约 150kDa 的跨膜 CD100 多肽或大约 120kDa 的可溶性 CD100 多肽 ( 通常称为 sCD100)。在另一实施方式中， 本发明结 合分子是抗体或其抗原结合片段。在另一个实施方式中， 本发明结合分子包括抗体分子的 至少一个重链或轻链 CDR。 在另一个实施方式中， 本发明结合分子包括来自一种或多种抗体 分子的至少两个 CDR。 在另一个实施方式中， 本发明结合分子包括来自一种或多种抗体分子 的至少三个 CDR。 在另一个实施方式中， 本发明结合分子包括来自一种或多种抗体分子的至 少四个 CDR。 在另一个实施方式中， 本发明结合分子包括来自一种或多种抗体分子的至少五 个 CDR。在另一个实施方式中， 本发明结合分子包括来自一种或多种抗体分子的至少六个 CDR。
本发明涉及某些抗 -CD100 抗体或其抗原结合片段、 变体或衍生物。除非特别提到 完整大小的抗体， 如天然产生的抗体， 术语 “抗 -CD100 抗体” 包括完整大小的抗体以及这种 抗体的抗原结合片段、 变体、 类似物或衍生物， 例如天然产生的抗体或免疫球蛋白分子， 或 以类似于抗体分子的方式结合抗原的工程改造的抗体分子或片段。
本文所用术语 “人” 或 “完全人” 抗体包括具有人免疫球蛋白的氨基酸序列的抗 体， 包括分离自人免疫球蛋白文库的抗体或不表达内源性免疫球蛋白的一种或多种人免疫 球蛋白的转基因动物， 如下文所述， 例如， Kucherlapati 等的美国专利 5,939,598。 “人” 或 “完全人” 抗体也包括至少包含重链可变区或至少包含重链和轻链可变区的抗体， 其中所述 可变区具有人免疫球蛋白可变区的氨基酸序列。
“人” 或 “完全人” 抗体还包括如上所述包含本文所述抗体分子 ( 如 VH 区和 / 或 VL 区 ) 的变体 ( 包括衍生物 ) 或基本由其组成或由其组成的 “人” 或 “完全人” 抗体， 所述抗体 或其片段免疫学特异性结合于 CD100 多肽或其片段或变体。可利用本领域技术人员已知的 标准技术在编码人抗 -CD100 抗体的核苷酸序列中引入突变， 包括但不限于， 导致氨基酸取 代的定点诱变和 PCR 介导的诱变。优选地， 相对于参比 VH 区、 VHCDR1、 VHCDR2、 VHCDR3、 VL 区、 VLCDR1、 VLCDR2 或 VLCDR3， 该变体 ( 包括衍生物 ) 编码少于 50 个氨基酸取代、 少于 40 个氨基酸取代、 少于 30 个氨基酸取代、 少于 25 个氨基酸取代、 少于 20 个氨基酸取代、 少于 15 个氨基酸取代、 少于 10 个氨基酸取代、 少于 5 个氨基酸取代、 少于 4 个氨基酸取代、 少于 3 个氨基酸取代或少于 2 个氨基酸取代。
在某些实施方式中， 氨基酸取代是保守性氨基酸取代， 如下详述。或者， 也可沿所 有或一部分编码序列随机引入突变， 例如通过饱和诱变引入， 可筛选所得突变体的生物学 活性， 以鉴定保持活性 ( 例如， 结合 CD100 多肽， 如结合人 CD100、 鼠 CD100 或同时结合人和 鼠 CD100 的能力 ) 的突变体。 “人” 或 “完全人” 抗体的这类变体 ( 或其衍生物 ) 也可称为 “优化” 或 “为抗原结合所优化” 的人或完全人抗体， 包括与抗原亲和力提高的抗体。
术语 “抗体” 和 “免疫球蛋白” 在本文中可互换使用。抗体或免疫球蛋白至少包括 重链可变区， 通常至少包括重链和轻链的可变区。脊椎动物系统中的基本免疫球蛋白结构 是众所周知的。参见例如， Harlow 等 (1988)Antibodies ： ALaboratory Manual(《抗体 ： 实 验室手册》 )( 第 2 版 ； 冷泉港实验室出版社 (Cold Spring Harbor Laboratory Press))。
正如下文中详细讨论的， 术语 “免疫球蛋白” 包括可通过生化性质区分的各种类型 的多肽。本领域技术人员应理解， 重链分为 gamma、 mu、 alpha、 delta 或 epsilon(γ， μ， α， δ， ε)， 其中还有一些小类 ( 如 γ1-γ4)。该链的特性决定抗体分 “类” 为 IgG、 IgM、 IgA、 IgG 或 IgE。免疫球蛋白小类 ( 同种型 ) 如 IgG1、 IgG2、 IgG3、 IgG4、 IgA1 等已被良好表征，且已知能产生特殊功能特性。根据本文公开内容， 本领域技术人员不难区分这些类和同种 型的修饰形式， 因此， 它们涵盖在本发明范围内。所有免疫球蛋白类型明显属于本发明范 围， 以下讨论通常论及免疫球蛋白分子的 IgG 类。在 IgG 中， 标准的免疫球蛋白分子包括分 子量约为 23,000 道尔顿的两个相同的轻链多肽和分子量为 53,000-70,000 的两个相同的 重链多肽。这四条链通常通过二硫键结合起来形成 “Y” 构型， 其中轻链从 Y 的口部开始夹 叉重链， 并延续通过可变区。
轻链分类为 kappa 或 lambda(κ、 λ)。各重链类可与 κ 或 λ 轻链结合。通常， 通过杂交瘤、 B 细胞或遗传工程改造的宿主细胞产生免疫球蛋白时， 轻链和重链互相共价结 合， 两条重链的 “尾部” 通过共价二硫键或非共价连接互相结合。在重链中， 氨基酸序列从 Y 构型的分叉末端的 N 末端走向每条链底部的 C 末端。
轻链和重链都可以分成结构和功能同源的区域。术语 “恒定” 和 “可变” 从功能角 度使用。在这方面， 应理解轻链 (VL 或 VK) 和重链 (VH) 部分的可变区决定抗原识别和特异 性。相反， 轻链 (CL) 和重链 (CH1、 CH2 或 CH3) 的恒定区产生重要的生物学特性， 例如分泌、 跨胎盘移动、 Fc 受体结合、 补体结合等。通常， 恒定区结构域的编号越大， 离抗体的抗原结 合位点或氨基末端越远。N- 末端部分是可变区， C- 末端部分是恒定区 ； CH3 和 CL 结构域实 际上分别包括重链和轻链的羧基末端。
如上所述， 可变区允许抗体选择性识别和特异性结合抗原上的表位。 也就是说， 抗 体的 VL 和 VH 结构域、 或这些可变区内的互补决定区 (CDR) 亚组组合形成确定三维抗原结 合位点的可变区。在 Y 的每条臂末端形成的这种四联抗体结构构成抗原结合位点。更具体 说， 所述抗原结合位点由各 VH 和 VL 链带有的三个 CDR 决定。在一些情况下， 例如在衍生自 羊驼或根据羊驼免疫球蛋白工程改造的某些免疫球蛋白分子中， 完整的免疫球蛋白分子可 仅由重链构成而不含轻链。参见例如， Hamers-Casterman 等， Nature 363 ： 446-448(1993)。
在天然产生的抗体中， 每个抗原结合域上出现的六个 “互补决定区” 或 “CDR” 是短 的非毗连氨基酸序列， 随着抗体在水性环境中确定其三维构型时， 它们特别定位以形成抗 原结合域。抗原结合域中的其余氨基酸称为 “构架” 区， 该区域的分子间变化较小。构架区 主要采用 β- 片层构象， CDR 形成环连接 β- 片层结构， 并在某些情况下构成 β- 片层结构 的部分。因此， 构架区通过链间非共价相互作用形成支架为 CDR 提供正确定位。通过定位 的 CDR 形成的抗原结合域能确定与免疫反应性抗原上表位互补的表面。这种互补表面促进 抗体与其关联表位的非共价结合。 本领域普通技术人员不难鉴定任何给定的重链或轻链可 变区中包含 CDR 和构架区的氨基酸， 因为它们已被精确定义 ( 见下 )。
除非另有明确说明， 在本领域使用和 / 或接受某术语的两种或多种定义的情 况下， 本文所用的该术语的定义应包括所有这些含义。具体例子是使用术语 “互补决定 区” (CDR) 描述在重链和轻链多肽的可变区内发现的非毗连抗原结合位点。这一特定 区域的描述可参见通过引用全文纳入本文的 Kabat 等 (1983) 美国健康和公共服务部 (U.S.Dept.of Health and Human Services)， Sequences of Proteins of Immunological Interest(“具 有 免 疫 学 重 要 性 的 蛋 白 质 序 列” )， Chothia 和 Lesk， J.Mol.Biol.196 ： 901-917(1987)()， 互相比较时， 所述定义包括重叠的氨基酸残基或氨基酸残基亚组。尽管 如此， 应用任一定义指代抗体或其变体的 CDR 均应落入本文所定义和使用的术语的范围。 合适氨基酸残基包括上文引用的各参考文献中定义的 CDR， 如下表 1 所示以作比较。 包括特定 CDR 的准确残基编号取决于 CDR 的序列和大小。在给定抗体的可变区氨基酸序列的情况 下， 本领域技术人员可常规确定哪些残基包括哪个具体 CDR。
表 1.CDR 定义 1
Kabat VH CDR1 VH CDR2 VH CDR3 VL CDR1 VL CDR2 VL CDR3
1Chothia 26-32 52-58 95-102 26-32 50-52 91-9631-35 50-65 95-102 24-34 50-56 89-97表 1 中所有 CDR 定义的编号均根据 Kabat 等所述的编号规则 ( 见下 )。
Kabat 等也定义了适用于任何抗体的可变区序列的编号系统。本领域普通技 术人员可毫无疑义地将 “Kabat 编号” 系统应用于任何可变区序列， 而不依赖序列本身外 的任何实验数据。本文所用的 “Kabat 编号” 指 Kabat 等 (1983) 美国健康和公共服务部 (U.S.Dept.of Health and Human Services)， Sequences of Proteins of Immunological Interest(“具免疫学重要性的蛋白质序列” ) 中所述的编号系统。除非另有说明， 提到本 发明抗 -CD100 抗体或其抗原结合片段、 变体或衍生物中具体氨基酸残基的编号时， 均指按 照 Kabat 编号系统的编号。
本发明的抗体或抗原结合片段、 变体、 或其衍生物包括但不限于 ： 多克隆、 单克 隆、 多特异性、 人、 人源化、 灵长化或嵌合抗体， 单链抗体， 表位结合片段如 Fab、 Fab ′和 F(ab′ )2、 Fd、 Fv、 单链 Fv(scFv)、 二硫键连接的 Fv(sdFv)、 包含 VL 或 VH 结构域的片段、 Fab 表达文库产生的片段和抗 - 独特型 ( 抗 -Id) 抗体 ( 包括例如， 本文所述抗 -CD100 抗体的 抗 -Id 抗体 )。ScFv 分子是本领域已知的， 参见例如， 美国专利号 5,892,019。本发明抗体 可以是任何类型 ( 如 IgG、 IgE、 IgM、 IgD、 IgA 和 IgY)、 类 ( 如 IgG1、 IgG2、 IgG3、 IgG4、 IgA1 和 IgA2 等 ) 或小类的免疫球蛋白分子。
本文所用术语 “重链部分” 包括衍生自免疫球蛋白重链的氨基酸序列。包含重链 部分的多肽包括下组中的至少一个 ： CH1 结构域、 铰链 ( 如上部、 中部和 / 或下部绞链区 ) 结 构域、 CH2 结构域、 CH3 结构域或者其变体或片段。例如， 本发明所用的结合多肽可包括含 有 CH1 结构域的多肽链 ； 含有 CH1 结构域、 绞链区的至少一部分和 CH2 结构域的多肽链 ； 含 有 CH1 结构域和 CH3 结构域的多肽链 ； 含有 CH1 结构域、 绞链区的至少一部分和 CH3 结构域 的多肽链， 或者含有 CH1 结构域、 绞链区的至少一部分、 CH2 结构域和 CH3 结构域的多肽链。 在另一实施方式中， 本发明多肽包括含有 CH3 结构域的多肽链。另外， 本发明所用的结合多 肽可能缺少 CH2 结构域的至少一部分 ( 例如， 所有 CH2 结构域或其部分 )。如上所述， 本领 域技术人员应理解， 可修饰这些结构域 ( 例如重链部分 )， 以使它们的氨基酸序列不同于天然产生的免疫球蛋白分子。
在本文公开的某些抗 -CD100 抗体， 或其抗原结合片段、 变体或衍生物中， 多聚体 的一条多肽链的重链部分与该多聚体的第二条多肽链的相同。或者， 本发明含有重链部分 的单体不同。例如， 各单体可包含不同的靶结合位点， 形成， 例如， 双特异性抗体。
本文公开的诊断和治疗方法中所用结合分子的重链部分可衍生自不同的免疫球 蛋白分子。例如， 多肽的重链部分可包含衍生自 IgG1 分子的 CH1 结构域和衍生自 IgG3 分子 的绞链区。在另一个实例中， 重链部分可包含部分衍生自 IgG1 分子、 部分衍生自 IgG3 分子 的绞链区。在另一个实例中， 重链部分可包含部分衍生自 IgG1 分子、 部分衍生自 IgG4 分子 的嵌合铰链。
本文所用术语 “轻链部分” 包括衍生自免疫球蛋白轻链， 如 κ 或 λ 轻链的氨基酸 序列。优选地， 所述轻链部分包含 VL 或 CL 结构域中的至少一个。
本文所述的抗 -CD100 抗体， 或其抗原结合片段、 变体或衍生物可根据它们识别或 特异性结合的抗原如本文所述的靶多肽 ( 如 CD100) 的表位或部分进行描述或说明。靶多 肽与抗体的抗原结合域特异性相互作用的部分是 “表位” 或 “抗原决定簇” 。靶多肽可包含 单个表位， 但通常包含至少两个表位， 并可包括任意数量的表位， 这取决于抗原的大小、 构 象和类型。而且， 应该注意到， 靶多肽上的 “表位” 可以是或可包括非多肽元件， 例如表位可 包括糖侧链。
据信， 抗体的肽或多肽表位最小大约是 4-5 个氨基酸。肽或多肽表位优选包含至 少七个， 更优选至少九个， 最优选至少约 15 个至 30 个氨基酸。由于 CDR 能以三联形式识 别抗原性肽或多肽， 所以包含表位的氨基酸不一定是毗连的， 在某些情况下甚至不一定在 同一肽链上。本发明抗 -CD100 抗体识别的肽或多肽表位可包含 CD100 中至少 4 个、 至少 5 个、 至少 6 个、 至少 7 个、 更优选至少 8 个、 至少 9 个、 至少 10 个、 至少 15 个、 至少 20 个、 至 少 25 个、 或约 15 至 30 个毗连或非毗连的氨基酸的序列。
“特异性结合” 通常指该抗体通过其抗原结合域结合于表位， 并且该结合必然伴随 着抗原结合域和表位之间的某种程度的互补。按照这一定义， 抗体通过其抗原结合域与表 位的结合易于与随机无关表位的结合时， 称该抗体 “特异性结合” 该表位。本文术语 “特异 性” 用于定性分析某种抗体与某种表位结合的相对亲和力。例如， 可认为抗体 “A” 对某给定 表位的特异性高于抗体 “B” ， 或者可以说抗体 “A” 结合表位 “C” 的特异性高于它对相关表位 “D” 的特异性。
“优先结合” 指与结合相关的、 相似的、 同源的或类似的表位相比， 该抗体更容易特 异性结合某表位。因此， 与相关表位相比， “优先结合” 给定表位的抗体更可能结合该表位， 即便这种抗体可能与相关表位发生交叉反应。
作为非限制性示例， 如果抗体与第一表位结合的解离常数 (KD) 低于抗体与第二表 位的 KD， 则可认为抗体优先结合第一表位。 在另一个非限制性例子中， 如果抗体与第一表位 结合的亲和力使 KD 比抗体与第二表位的 KD 低至少一个数量级， 则可认为抗体优先结合第一 抗原。在另一个非限制性例子中， 如果抗体与第一表位结合的亲和力使 KD 比抗体与第二表 位的 KD 低至少两个数量级， 则可认为抗体优先结合第一表位。
在另一个非限制性例子中， 如果抗体与第一表位结合的解离速率 (k(off)) 比抗 体与第二表位的 k(off) 低， 则可认为抗体优先结合第一表位。在另一个非限制性例子中，如果抗体与第一表位结合的亲和力使 k(off) 比抗体与第二表位的 k(off) 低至少一个数量 级， 则可认为抗体优先结合第一表位。 在另一个非限制性例子中， 如果抗体与第一表位结合 的亲和力使 k(off) 比抗体与第二表位的 k(off) 低至少两个数量级， 则可认为抗体优先结 合第一表位。 可以说， 本文所述的抗体或其抗原结合片段、 变体或衍生物结合本文公开的靶 多肽 ( 如 CD100， 如人、 鼠或者人和鼠的 CD100) 或其片段或变体， 其解离速率 (k(off)) 低于 -2 -1 -2 -1 -3 -1 -3 -1 或等于 5X10 s 、 10 s 、 5X10 s 或 10 s 。 更优选地， 可以说， 本发明抗体结合本文所述的 靶多肽 ( 如 CD100， 如人、 鼠、 或者人和鼠的 CD100) 或其片段或变体， 其解离速率 (k(off)) -4 -1 -4 -1 -5 -1 -5 -1 -6 -1 -6 -1 低于或等于 5X10 s 、 10 s 、 5X10 s 、 或 10 s 、 5X10 s 、 10 s 、 5X10-7s-1 或 10-7s-1。
可以说， 本文所述的抗体或其抗原结合片段、 变体或衍生物结合本文公开的靶多 肽 ( 如 CD100， 如人、 鼠或者人和鼠 CD100) 或其片段或变体， 其结合速率 (k(on)) 高于或等 3 -1 -1 3 -1 -1 4 -1 -1 4 -1 -1 于 10 M s 、 5X10 M s 、 10 M s 或 5X10 M s 。 更优选地， 可以说， 本发明抗体结合本文公开 的靶多肽 ( 如 CD100， 如人、 鼠或者人和鼠的 CD100) 或其片段或变体， 其结合速率 (k(on)) 5 -1 -1 5 -1 -1 6 -1 -1 6 -1 -1 7 -1 -1 高于或等于 10 M s 、 5X10 M s 、 10 M s 或 5X10 M s 或 10 M s 。
如果抗体优先结合给定表位以至于在某种程度上阻断参比抗体与该表位的结合， 则称该抗体能竞争性抑制参比抗体与给定表位的结合。 竞争性抑制可通过本领域已知的任 何方法确定， 例如竞争 ELISA 实验。可以说， 抗体将参比抗体与给定表位的结合竞争性抑制 至少 90％、 至少 80％、 至少 70％、 至少 60％或至少 50％。 本文所用术语 “亲和力” 是单独表位与免疫球蛋白分子的 CDR 结合强度的衡量。参 见例如， Harlow 等 (1988)Antibodies ： A Laboratory Manual(《抗体 ： 实验室手册》 )( 冷泉 港实验室出版社 (Cold Spring Harbor Laboratory Press)， 第 2 版 )， 第 27-28 页。本文 所用术语 “亲合力” 指免疫球蛋白群体和抗原间复合物的总体稳定性， 即免疫球蛋白混合物 与抗原的功能性结合强度。参见例如， Harlow， 第 29-34 页。亲合力既与群体中单独免疫球 蛋白分子与特定表位的亲和力相关， 也与免疫球蛋白分子和抗原的价态相关。 例如， 二价单 克隆抗体和具有高度重复表位结构的抗原， 例如多聚体之间的相互作用是高亲合力的一个 例子。
本发明的抗 -CD100 抗体或其抗原结合片段、 变体或其衍生物也可按照其交叉反 应性进行描述或说明。本文所用术语 “交叉反应性” 指对某一种抗原具有特异性的抗体与 第二种抗原发生反应的能力 ； 它是两种不同抗原性物质之间相关性的衡量。 因此， 如果抗体 结合于诱导其形成的表位以外的其他表位， 则它具有交叉反应性。交叉反应性表位通常含 有许多与诱导表位相同的互补结构特征， 在某些情况下甚至比原始表位更适用。
例如， 某些抗体具有一定程度的交叉反应性， 因为它们结合相关但不相同的表位， 例如， 与参比表位至少 95％、 至少 90％、 至少 85％、 至少 80％、 至少 75％、 至少 70％、 至少 65％、 至少 60％、 至少 55％和至少 50％相同 ( 按照本领域已知方法和本文所述方法计算 ) 的表位。 如果抗体不结合与参比表位少于 95％、 少于 90％、 少于 85％、 少于 80％、 少于 75％、 少于 70％、 少于 65％、 少于 60％、 少于 55％和少于 50％相同 ( 按照本领域已知方法和本文 所述方法计算 ) 的表位， 则可以说该抗体具有很小的交叉反应性或不具有交叉反应性。如 果某抗体不结合某表位的任何其它类似物、 直向同源物或同源物， 则可认为该抗体对该表 位 “高度特异” 。
本发明的抗 -CD100 结合分子， 如抗体或其抗原结合片段、 变体或衍生物可根据
与本发明多肽， 例如， CD100， 如人、 鼠或者人和鼠的 CD100 的结合亲和力进行描述或说明。 优选的结合亲和力包括解离常数或 Kd 低于 5x10-2M、 10-2M、 5x10-3M、 10-3M、 5x10-4M、 10-4M、 5x10-5M、 10-5M、 5x10-6M、 10-6M、 5x10-7M、 10-7M、 5x10-8M、 10-8M、 5x10-9M、 10-9M、 5x10-10M、 10-10M、 5x10-11M、 10-11M、 5x10-12M、 10-12M、 5x10-13M、 10-13M、 5x10-14M、 10-14M、 5x10-15M 或 10-15M 的那些。 在 某些实施方式中， 本发明的抗 -CD100 结合分子， 如抗体或其抗原结合片段结合人 CD100 的 -9 -9 Kd 约为 5x10 至 6x10 。在另一实施方式中， 本发明的抗 -CD100 结合分子， 如抗体或其抗 -9 -9 原结合片段结合鼠 CD100 的 Kd 约为 1x10 至 2x10 。
本发明的抗 -CD100 抗体或其抗原结合片段、 变体或衍生物可能是 “多特异性” 的， 例如是双特异性、 三特异性或更多特异性的， 这意味着它能同时识别和结合一种或多种不 同抗原 ( 如蛋白质 ) 上出现的两种或更多种不同表位。因此， 抗 -CD100 抗体是 “单特异性” 还是 “多特异性” 如 “双特异性” ， 是指结合多肽发生反应的不同表位的数量。多特异性抗体 可以是对本文所述的靶多肽的不同表位有特异性， 或是对靶多肽以及异源表位， 例如异源 多肽或固体支持材料有特异性。
本文所用术语 “价态” 指结合多肽或 CD100 结合分子， 如抗体或其抗原结合片段中 存在的潜在结合域， 如抗原结合域的数量。各结合域特异性结合一种表位。当结合多肽或 CD100 结合分子包含一个以上结合域时， 对具有两个结合域的抗体来说各结合域可特异性 结合同一表位时， 称为 “二价单特异性” ， 或对具有两个结合域的抗体来说特异性结合不同 表位时， 称为 “二价双特异性” 。 抗体或其抗原结合片段也可以是双特异性， 每种特异性有二 价 ( 称为 “双特异性四价抗体” )。在另一实施方式中， 可制备四价小抗体或结构域缺失抗 体。
双 特 异 性 二 价 抗 体 及 其 制 备 方 法 可 参 见 例 如， 美 国 专 利 号 5,731,168 ； 5,807,706 ； 5,821,333 ； 以及美国专利申请公开号 2003/020734 和 2002/0155537， 通过引 用将其全部内容纳入本文。双特异性四价抗体及其制备方法可参见例如， WO 02/096948 和 WO 00/44788， 通过引用将其全部内容纳入本文。总地参见， 国际公开号 WO 93/17715、 WO 92/08802、 WO 91/00360、 WO 92/05793 ； Tutt 等， J.Immunol.147 ： 60-69(1991) ； 美国 专 利 号 4,474,893、 4,714,681、 4,925,648、 5,573,920 和 5,601,819 ； 以 及 Kostelny 等， J.Immunol.148 ： 1547-1553(1992)。
如前所述， 各种免疫球蛋白类的恒定区的亚基结构和三维构型是众所周知的。本 文所用术语 “VH 结构域” 包括免疫球蛋白重链的氨基末端可变区， 术语 “CH1 结构域” 包括 免疫球蛋白重链的第一 ( 最靠氨基末端 ) 恒定区结构域。CH1 结构域邻近 VH 结构域， 并且 位于免疫球蛋白重链分子的绞链区的氨基末端。
本文所用术语 “CH2 结构域” 包括用常规编号方案大概从抗体的残基 244 延伸至残 基 360 的重链分子部分 ( 残基 244 至 360， Kabat 编号系统 ； 和残基 231-340， EU 编号系统 ； 参见 Kabat EA 等 )。CH2 结构域是独特的， 因为它与其它结构域不是紧密配对的。恰恰相 反， 两个 N- 连接的分支糖链间插在完整天然 IgG 分子的两个 CH2 结构域之间。CH3 结构域 已有很多记载， 它从 IgG 分子的 CH2 结构域向 C 末端延伸， 并包含大约 108 个残基。
本文所用术语 “绞链区” 包括连接 CH1 结构域和 CH2 结构域的重链分子部分。该绞 链区包括约 25 个残基并具有挠性， 因此使两个 N- 末端抗原结合区能独立移动。绞链区可 细分成三个不同结构域 ： 上部、 中部和下部绞链区 (Roux 等， J.Immunol.161 ： 4083(1998))。本文所用术语 “二硫键” 包括在两个硫原子之间形成的共价键。氨基酸半胱氨酸 包括可形成二硫键或与第二个巯基桥接的巯基。在大部分天然产生的 IgG 分子中， CH1 和 CL 区域通过二硫键相连， 两条重链通过对应于 Kabat 编号系统 239 和 242 位 (EU 编号系统 是 226 或 229 位 ) 的两个二硫键相连。
本文所用术语 “嵌合抗体” 指免疫反应性区域或位点获自或衍生自第一物种， 而恒 定区 ( 根据本发明， 可能是完整的、 一部分或修饰的 ) 获自第二物种的任何抗体。在优选实 施方式中， 靶结合区域或位点来自非人来源 ( 如小鼠或灵长动物 ) 而恒定区是人的 ( 例如， 本文所述的单克隆抗体 (MAb)2368)。
本文所用术语 “工程抗体” 指如果必要， 通过部分构架区置换和序列改变至少部 分置换来自已知特异性抗体的一个或多个 CDR， 以改变重链或轻链或二者中的可变区的抗 体。虽然 CDR 可衍生自与产生构架区的抗体属于同一类或亚类的抗体， 但考虑到 CDR 衍生 自不同类的抗体， 优选衍生自不同物种的抗体。 将已知特异性的非人抗体的一个或多个 “供 体” CDR 移植到人重链或轻链构架区内形成的工程抗体在本文中称为 “人源化抗体” 。可能 不一定需要用来自供体可变区的完整 CDR 代替所有 CDR 就能将一种可变区的抗原结合能力 转移给另一可变区。相反， 可能只需要转移维持靶结合活性所必需的那些残基。
进一步认识到， 人源化抗体的重链或轻链或二者中可变区内的构架区可仅包含 人来源的残基， 在这种情况下人源化抗体的这些构架区称为 “完全人构架区” ( 例如， MAb 2503)。或者， 如果需要， 可以在人源化抗体的重链或轻链或二者的可变区的人构架区的相 应位置内工程改造供体可变区的构架区的一个或多个残基， 以维持适当的结合或提高与 CD100 抗原的结合。因此， 以此方式工程改造的人构架区包含人和供体构架区残基的混合 物， 在本文中称为 “部分人构架区” 。
例如， 抗 -CD100 抗体的人源化过程可基本按照 Winter 和同事所述方法进行 (Jones 等， Nature 321 ： 522-525(1986) ； Riechmann 等， Nature 332 ： 323-327(1988) ； Verhoeyen 等， Science 239 ： 1534-1536(1988))， 即用啮齿动物或突变型啮齿动物 CDR 或 CDR 序列代替人抗 -CD100 抗体的相应序列。也参见美国专利号 5,225,539 ； 5,585,089 ； 5,693,761 ； 5,693,762 ； 5,859,205 ； 通过引用纳入本文。所得的人源化抗 -CD100 抗体将 在人源化抗体的重链和 / 或轻链的可变区的完全人构架区内， 包含至少一个啮齿动物或突 变型啮齿动物 CDR。在一些情况下， 人源化抗 -CD100 抗体的一个或多个可变区的构架区 内的残基被相应非人人 ( 例如， 啮齿动物 ) 残基代替 ( 参见例如， 美国专利号 5,585,089 ； 5,693,761 ； 5,693,762 ； 和 6,180,370)， 在这种情况下所得的人源化抗 -CD100 抗体将在重 链和 / 或轻链的可变区内包含部分人构架区。
而且， 人源化抗体可包含在受体抗体或供体抗体中没有的残基。 进行这些修饰， 以 进一步改善抗体性能 ( 例如， 获得所需亲和力 )。 通常， 人源化抗体将基本上包含至少一个、 通常两个可变区的全部， 其中全部或基本上全部的 CDR 对应于非人免疫球蛋白的 CDR， 全部 或基本上全部的构架区是人免疫球蛋白序列的构架区。 人源化抗体还任选包含至少一部分 免疫球蛋白恒定区 (Fc)， 一般是人免疫球蛋白的 Fc。更多的细节参见 Jones 等， Nature， 331 ： 522-525(1986) ； Riechmann 等， Nature， 332 ： 323-329(1988) ； 和 Presta， Curr. Op.Struct.Biol.， 2： 593-596(1992)， 通过引用全文纳入本文。因此， 这类 “人源化” 抗体可 包括其中明显小于完整的人可变区被来自非人物种的相应序列所取代的抗体。实践中， 人源化抗体通常是一些 CDR 残基和可能的一些构架残基被啮齿动物抗体中相似位点的残基 所取代的人抗体。参见例如， 美国专利号 5,225,539 ； 5,585,089 ； 5,693,761 ； 5,693,762 ； 5,859,205。也参见美国专利号 6,180,370 和国际公开号 WO 01/27160， 其中公开了人源化 抗体和用于产生对预定抗原亲和力提高的人源化抗体的技术。
本文所用术语 “连接” 、 “融合的” 和 “融合” 可以互换使用。这些术语指通过某些 方式如化学偶联或重组将两个或更多的元件或组件结合在一起。 “框内融合” 指以维持原有 ORF 正确翻译读框的方式， 将两个或多个多核苷酸开放阅读框 (ORF) 连接形成连续的较长 ORF。因此， 重组融合蛋白是包含两个或多个片段的单一蛋白质， 所述片段对应原始 ORF 编 码的多肽 ( 这些片段在自然条件下通常不如此连接 )。 尽管阅读框为连续的融合片段， 但片 段仍可被物理或空间分割， 如框内接头序列。例如， 编码免疫球蛋白可变区 CDR 的多核苷酸 可框内融合， 但用编码至少一个免疫球蛋白构架区或额外 CDR 区的多核苷酸间隔开， 只要 “融合的” CDR 作为连续多肽的一部分共同翻译。
在多肽的情况下， “线性序列” 或 “序列” 是多肽中从氨基到羧基的方向上氨基酸的 顺序， 在序列中相邻的残基是多肽一级结构中的毗连残基。
本文所用术语 “表达” 指基因产生生化物质如多肽的过程。 该过程包括在细胞内基 因的任何功能表现， 包括但不限于， 基因敲除以及瞬时表达和稳定表达。它包括但不限于， 基因转录成信使 RNA(mRNA) 和这类 mRNA 翻译成多肽。若最终期望产物是生化物质， 则表达 包括产生该生化物质和任何前体。基因表达产生 “基因产物” 。本文所用的基因产物可以是 核酸， 如基因转录产生的信使 RNA， 或由转录物翻译得到的多肽。本文所述的基因产物还包 括具有转录后修饰， 例如聚腺苷酸化的核酸， 或具有翻译后修饰， 如甲基化、 糖基化、 加入脂 质、 连接其它蛋白质亚基、 经蛋白酶水解切割等的多肽。
本文所用术语 “治疗” 和 “治疗处理” 都指治疗性处理和预防性或预防方法， 其目的 是防止或减缓 ( 缓解 ) 不期望的生理改变或病症， 例如多发性硬化、 关节炎或癌症的进展。 有益或所需的临床结果包括但不限于可检测或不可检测地 ： 缓解症状、 减轻疾病程度、 疾病 状态稳定 ( 即不恶化 )、 延迟或减缓疾病进展、 改善或减轻疾病状态和缓解 ( 部分或完全 )。 “治疗” 也可以指与不接受治疗的预计生存期相比延长生存期。需要治疗的人包括已经患有 病症或失调的人， 以及倾向于患有病症或失调的人或需预防病症或失调的人。
“对象” 或 “个体” 或 “动物” 或 “患者” 或 “哺乳动物” 指需要诊断、 预防或治疗的任 何对象， 特别是哺乳动物对象。 哺乳动物对象包括人、 饲养动物、 家畜和动物园动物、 运动动 物或宠物， 如犬、 猫、 豚鼠、 兔、 大鼠、 小鼠、 马、 牛、 奶牛等等。
本文所用术语 “给予抗 -CD100 抗体时能够获益的对象” 和 “需要治疗的动物” 包括 能够从给予抗 -CD100 抗体和 / 或从抗 -CD100 抗体治疗， 即减轻或预防疾病的治疗中获益 的对象， 如哺乳动物对象， 该抗体可用于 ( 例如 ) 检测抗 -CD100 多肽 ( 如用于诊断方法 )。 如本文更详细描述的， 抗 -CD100 抗体可以非偶联形式使用， 或者可偶联于 ( 例如 ) 药物、 前 药或同位素。
II. 靶多肽描述
本文所用术语 “CD100” 和 “CD100 多肽” 可互换使用。在某些实施方式中， CD100 在细胞表面表达或由细胞分泌。在另一实施方式中， CD100 结合于膜。在另一实施方式中， CD100 是可溶的， 如， sCD100。在其它实施方式中， CD100 可包括全长 CD100 或其片段， 或者CD100 变体多肽， 其中 CD100 的片段或 CD100 变体多肽保持全长 CD100 的一些或全部功能特 性。
全长人 CD100 蛋白是由两条 150kDa 的多肽链组成的同源二聚跨膜蛋白。 CD100 属 于细胞表面受体的脑信号蛋白家族， 也称为 SEMA4D。 人和小鼠 Sema4D/CD100 都可以由其跨 膜形式经蛋白水解切割形成 120-kDa 可溶形式， 表明存在两种 Sema4D 同种型 (Kumanogoh 等， J.Cell Science 116(7) ： 3464(2003))。脑信号蛋白由可溶性和膜结合的蛋白质组 成， 这些蛋白质最初定义为轴突 - 导向因子， 它在建立神经元和其合适靶点之间的准确联 系中起到重要作用。结构上视为 IV 类脑信号蛋白的 CD100 由氨基末端的信号序列， 后接 特征性 ‘Sema’ 结构域构成， 其包含 17 个保守的半胱氨酸残基、 Ig- 样结构域、 富赖氨酸臂 (stretch)、 疏水性跨膜区和胞质尾。
CD100 的各多肽链包括约 13 个氨基酸的信号序列， 后接约 512 个氨基酸的脑信号 蛋白结构域、 约 65 个氨基酸的免疫球蛋白 - 样 (Ig- 样 ) 结构域、 104 个氨基酸的富赖氨酸 臂、 约 19 个氨基酸的疏水性跨膜区和 110 个氨基酸的胞质尾。胞质尾中酪氨酸磷酸化的共 有位点支持预测的 CD100 与酪氨酸激酶的结合 (Schlossman 等编 (1995)Leucocyte Typing V(《白细胞分型 V》 )( 牛津的牛津大学出版社 (Oxford University Press， Oxford))。
已经鉴定了 CD100 的两类受体。一种受体 -- 丛蛋白 -B1 在非淋巴样组织中表达， 是 CD100 的高亲和 (1nM) 受体 (Tamagnone 等， Cell 99 ： 71-80(1999))。已证明， CD100 刺 激丛蛋白 B1 信号转导能诱导神经元的生长锥破坏， 并诱导少突胶质细胞的突起延伸破坏 (process extension collapse) 和凋亡 (Giraudon 等， J.Immunol.172 ： 1246-1255(2004) ； Giraudon 等， NeuroMolecular Med.7 ： 207-216(2005))。 与 CD100 结 合 后， 丛 蛋 白 B1 信 号转导介导 R-Ras 的失活， 导致整联蛋白介导的与胞外基质的附连降低， 以及 Rho 激活， 导 致 细 胞 骨 架 重 排 造 成 的 细 胞 破 坏。 参 见 Kruger 等， Nature Rev.Mol.Cell Biol.6 ： 789-800(2005) ； Pasterkamp， TRENDS in Cell Biology 15 ： 61-64(2005))。
在淋巴组织中， CD72 用作低亲和 (300nM)CD 100 受体 (Kumanogoh 等， Immunity 13 ： 621-631(2000))。 B 细胞和 APC 表达 CD72， 抗 -CD72 抗体具有与 sCD100 相同的许多作用， 如增强 CD40 诱导的 B 细胞应答和 B 细胞排出 CD23。认为 CD72 可通过征集能结合很多抑制 性受体的酪氨酸磷酸酶 SHP-1 用作 B 细胞应答的负调节物。CD100 与 CD72 的相互作用导致 SHP-1 的解离， 从而丢失该负激活信号。 已证明， CD100 能在体外促进 T 细胞刺激以及 B 细胞 的聚集和存活。 加入表达 CD100 的细胞或 sCD100 能在体外增强 CD40 诱导的 B 细胞增殖和免 疫球蛋白产量， 并在体内加速抗体应答 (Ishida 等， Inter.Immunol.15 ： 1027-1034(2003) ； Kumanogoh 和 H.Kukutani， Trends in Immunol.22 ： 670-676(2001))。sCD100 增 强 CD40 诱导的 DC 成熟， 包括上调共同刺激分子和增加 IL-12 分泌。此外， sCD100 可抑制免疫 细胞迁移， 这种抑制作用可通过加入阻断性抗 -CD100 小鼠抗体得以逆转 (Elhabazi 等， J.Immunol.166 ： 4341-4347(2001) ； Delaire 等， J.Immunol.166 ： 4348-4354(2001))。
Sema4D 在淋巴器官和非淋巴器官中高水平表达， 所述淋巴器官包括脾脏、 胸腺和 淋巴结， 所述非淋巴器官包括例如， 脑、 心和肾。在淋巴器官中， Sema4D 在静息 T 细胞上大 量表达， 但在静息 B 细胞和抗原提呈细胞 (APC)， 如树突细胞 (DC) 上表达很弱。
细胞活化能提高 CD100 的表面表达， 以及可溶性 CD100(sCD100) 的产生。CD100 的表达模式提示， 它在免疫系统中起到重要的生理学和病理学作用。已证明， CD100 能促进B 细胞活化、 聚集和存活 ； 增加 CD40 诱导的增殖和抗体产生 ； 增强对 T 细胞依赖性抗原的 抗体应答 ； 增加 T 细胞增殖 ； 增强树突细胞的成熟和刺激 T 细胞的能力 ； 并且与脱髓鞘和轴 突变性直接相关联 (Shi 等， Immunity 13 ： 633-642(2000) ； Kumanogoh 等， J Immunol 169 ： 1175-1181(2002) ； 和 Watanabe 等， J Immunol 167 ： 4321-4328(2001))。
CD100 敲除 (CD100-/- 小鼠已提供额外证据证明 CD100 在体液免疫和细胞免疫应 答中均起到重要作用。 尚不了解 CD100-/- 小鼠中非淋巴组织的任何异常。 来自 CD100-/- 小 鼠的树突细胞 (DC) 具有较差的同种异体刺激 (allostimulatory) 能力， 并显示共同刺激 分子的表达有缺陷， 该缺陷可通过加入 sCD100 加以挽救。CD100 缺陷小鼠 (CD100-/-) 无 法产生髓磷脂少突胶质细胞糖蛋白肽诱导的实验性自身免疫性脑脊髓炎， 因为在不存在 CD100 时不产生髓磷脂少突胶质细胞糖蛋白 - 特异性 T 细胞 (Kumanogoh 等， J Immunol169 ： 1175-1181(2002))。还在易生自身免疫病的 MRL/lpr 小鼠 ( 全身性自身免疫病如 SLE 的模 型 ) 的血清中检测到显著量的可溶性 CD100， 但在正常小鼠中检测不到。另外， sCD100 水平 与自身抗体水平相关， 并随年龄增加 (Wang 等， Blood 97 ： 3498-3504(2001))。还证明， 可 溶性 CD100 能在脱髓鞘疾病患者的脑脊液和血清中累积， 而 sCD100 能诱导人全能神经前体 (Dev 细胞 ) 凋亡， 二者在体外都抑制突起延伸并诱导大鼠少突胶质细胞的凋亡 (Giraudon 等， JImmunol 172(2) ： 1246-1255(2004))。此种凋亡被抗 -CD100MAb 阻断。 III. 抗 -CD100 抗体
本领域记载了结合 CD100 的抗体。参见例如， 美国公开号 2008/0219971A1， 国际 专利申请 WO 93/14125 和 Herold 等， Int.Immunol.7(1) ： 1-8(1995)， 通过引用全文纳入本 文。
本发明抗体包含结合于 CD100 的抗 -CD100 抗体或其抗原结合片段、 变体或衍生 物， 如 MAb 2503、 MAb 67 和 MAb 76。在某些实施方式中， 抗 -CD100 抗体结合人、 鼠或者人 和鼠的 CD100。在其它实施方式中， 抗 -CD100 抗体阻断 CD100 结合其受体如丛蛋白 -B。
在一个实施方式中， 本发明提供分离的结合分子， 如抗体或其抗原结合片段， 它们 特异性结合的 CD100 表位与单克隆抗体 2503、 67 或 76 相同。在另一个实施方式中， 本发明 提供分离的结合分子， 如抗体或其抗原结合片段， 它们特异性结合 CD100 并竞争性抑制单 克隆抗体 2503、 67 或 76 特异性结合 CD100 如人、 鼠或者人和鼠的 CD100。
在某些实施方式中， 本发明结合分子的氨基酸序列与参比抗 -CD100 抗体分子的 氨基酸序列的序列相同性至少约 80％、 约 85％、 约 88％、 约 89％、 约 90％、 约 91％、 约 92％、 约 93％、 约 94％或约 95％。在另一个实施方式中， 所述结合分子与参比抗体的序列相同性 为至少约 96％、 约 97％、 约 98％、 约 99％或 100％。
在另一实施方式中， 本发明提供分离的抗体或其抗原结合片段， 它包含免疫球蛋 白重链可变区 (VH 结构域 )、 基本由其组成或由其组成， 其中所述 VH 结构域的至少一个 CDR 具有与 SEQ ID NO ： 9 或 10 的 CDR1、 CDR2 或 CDR3 至少约 80％、 约 85％、 约 90％、 约 95％、 约 96％、 约 97％、 约 98％、 约 99％相同或完全相同的氨基酸序列。
在另一实施方式中， 本发明提供分离的抗体或其抗原结合片段， 它包含免疫球蛋 白重链可变区 (VH 结构域 )、 基本由其组成或由其组成， 其中所述 VH 结构域的至少一个 CDR 具有与 SEQ ID NO ： 6、 SEQ ID NO ： 7 或 SEQ ID NO ： 8 至少约 80％、 约 85％、 约 90％、 约 95％、 约 96％、 约 97％、 约 98％、 约 99％相同或完全相同的氨基酸序列。
在另一实施方式中， 本发明提供分离的抗体或其抗原结合片段， 它包含免疫球蛋 白重链可变区 (VH 结构域 )、 基本由其组成或由其组成， 其中所述 VH 结构域的至少一个 CDR 具有除 1、 2、 3、 4 或 5 个保守氨基酸取代外， 与 SEQID NO ： 6、 SEQ ID NO ： 7 或 SEQ ID NO ： 8 相同的氨基酸序列。
在另一实施方式中， 本发明提供分离的抗体或其抗原结合片段， 它包含 VH 结构 域、 基本由其组成或由其组成， 该 VH 结构域具有与 SEQ ID NO ： 9 或 SEQ ID NO ： 10 至少 约 80％、 约 85％、 约 90％、 约 91％、 约 92％、 约 93％、 约 94％、 约 95％、 约 96％、 约 97％、 约 98％、 约 99％或 100％相同的氨基酸序列， 其中包含编码的 VH 结构域的抗 -CD100 抗体特异 性或优先结合 CD100。
在另一实施方式中， 本发明提供分离的抗体或其抗原结合片段， 它包含免疫球蛋 白轻链可变区 (VL 结构域 )、 基本由其组成或由其组成， 其中所述 VL 结构域的至少一个 CDR 具有与 SEQ ID NO ： 17 或 18 的 CDR1、 CDR2 或 CDR3 至少约 80％、 约 85％、 约 90％、 约 95％、 约 96％、 约 97％、 约 98％、 约 99％相同或完全相同的氨基酸序列。
在另一实施方式中， 本发明提供分离的抗体或其抗原结合片段， 它包含免疫球蛋 白轻链可变区 (VL 结构域 )、 基本由其组成或由其组成， 其中所述 VL 结构域的至少一个 CDR 具有与 SEQ ID NO ： 14、 SEQ ID NO ： 15 或 SEQ ID NO ： 16 至少约 80％、 约 85％、 约 90％、 约 95％、 约 96％、 约 97％、 约 98％、 约 99％相同或完全相同的氨基酸序列。
在另一实施方式中， 本发明提供分离的抗体或其抗原结合片段， 它包含免疫球蛋 白轻链可变区 (VL 结构域 )、 基本由其组成或由其组成， 其中所述 VL 结构域的至少一个 CDR 具有除 1、 2、 3、 4 或 5 个保守氨基酸取代外， 与 SEQ IDNO ： 14、 SEQ ID NO ： 15 或 SEQ ID NO ： 16 相同的氨基酸序列。
在另一实施方式中， 本发明包括分离的抗体或其抗原结合片段， 它包含 VL 结构 域、 基本由其组成或由其组成， 该 VL 结构域具有与 SEQ ID NO ： 17 或 SEQ ID NO ： 18 至少 约 80％、 约 85％、 约 90％、 约 91％、 约 92％、 约 93％、 约 94％、 约 95％、 约 96％、 约 97％、 约 98％、 约 99％或 100％相同的氨基酸序列， 其中包含编码的 VL 结构域的抗 -CD100 抗体特异 性或优先结合 CD100。
本发明抗 -CD100 抗体的合适的生物活性变体可用于本发明方法。这种变体将保 持母体抗 -CD100 抗体的所需结合性质。制备抗体变体的方法是本领域通常可获得的。
诱 变 和 改 变 核 苷 酸 序 列 的 方 法 是 本 领 域 众 所 周 知 的。 参 见 例 如， Walker 和 Gaastra 编 (1983)Techniques in Molecular Biology(《分子生物学技术》 )( 纽约麦克米 兰出版公司 (MacMillan Publishing Company)) ； Kunkel， Proc.Natl.Acad.Sci.USA 82 ： 488-492(1985) ； Kunkel 等， Methods Enzymol.154 ： 367-382(1987) ； Sambrook 等 (1989) Molecular Cloning ： A Laboratory Manual(《分子克隆 ： 实验室手册》 )( 纽约州冷泉港 (Cold Spring Harbor， N.Y.)) ； 美国专利号 4,873,192 ； 和其中引用的参考文献 ； 通过引用 全文纳入本文。 有关不影响感兴趣多肽生物学活性的合适氨基酸取代的指南可参见下述文 献中的模型 ： Dayhoff 等 (1978)， Atlas of Protein Sequence and Structure(《蛋白质 序列和结构图册》 )( 华盛顿特区的国家生物医学研究基金会 (Natl.Biomed.Res.Found.， Washington， D.C.))， 第 345-352 页， 通过引用全文纳入本文。Dayhoff 等的模型利用点 接受突变 (Point Accepted Mutation， PAM) 氨基酸相似矩阵 (PAM 250 矩阵 ) 来确定合适的保守性氨基酸取代。可能优选保守取代， 如用具有相似特性的另一氨基酸交换某种 氨基酸。Dayhoff 等的模型中 PAM 250 矩阵教导的保守氨基酸取代的例子包括但不限于 ： 和 在构建抗 -CD100 结合分子， 如抗体或其抗原结合片段的过程中， 制得感兴趣多 肽、 修饰物以使变体仍具有所需特性， 例如， 能够特异性结合 CD100， 如人、 鼠或者人和鼠的 CD100， 例如， 在细胞表面表达或由细胞分泌的 CD100， 并具有 CD100 阻断活性， 如本文所述。 显然， 编码变体多肽的 DNA 中出现的任何突变一定不能将序列置于阅读框外， 优选不产生 可产生二级 mRNA 结构的互补区。参见欧洲专利申请公开号 75,444。
测定抗 -CD100 结合分子， 如抗体或其抗原结合片段的结合特异性的方法包括 但不限于 ： 标准竞争结合实验、 T 细胞或 B 细胞的免疫球蛋白分泌的监测实验、 T 细胞 增 殖 实 验、 凋 亡 实 验、 ELISA 实 验 等。 参 见 例 如， WO 93/14125 ； Shi 等， Immunity 13 ： 633-642(2000) ； Kumanogoh 等， J Immunol 169 ： 1175-1181(2002) ； Watanabe 等， J Immunol 167 ： 4321-4328(2001) ； Wang 等， Blood97 ： 3498-3504(2001) ； 和 Giraudon 等， J Immunol 172(2) ： 1246-1255(2004) 公开的实验， 通过引用将其全文纳入本文。
本文在讨论本文公开的任何具体多肽， 包括恒定区、 CDR、 VH 结构域或 VL 结构域是 否与另一多肽至少约 65％、 约 70％、 约 75 ％、 约 80 ％、 约 85 ％、 约 90 ％、 约 91 ％、 约 92 ％、 约 93％、 约 94％、 约 95％、 约 96％、 约 97％、 约 98％、 约 99％或者甚至约 100％相同时， 相同 性％可采用本领域已知的方法和计算机程序 / 软件测定， 例如但不限于 BESTFIT 程序 ( 威 斯康星序列分析软件包， 用于 Unix 系统的第 8 版， 遗传学计算机团队 (Genetics Computer Group)， 大 学 研 究 园 区 (University Research Park)， 科 学 大 道 575 号 (575 Science Drive)， 威斯康星州麦迪逊 )， 53711)。BESTFIT 利用 Smith 和 Waterman(1981)Adv.Appl. Math.2 ： 482-489 的局部同源性算法， 找到两条序列之间的最佳同源性区段。使用 BESTFIT 或任何其它序列比对程序来确定某具体序列是否与本发明参比序列 ( 例如 )95％相同时， 当然要设定参数使得在参比多肽序列的全长上计算相同性百分数， 并且在参比序列的氨基 酸总数中允许至多有 5％的同源性缺口。
出于本发明目的， 可采用史密斯 - 沃特曼 (Smith-Waterman) 同源性搜索算法测 定序列相同性百分数， 该算法使用仿射缺口搜索， 其中缺口开放罚 12 分， 缺口延伸罚 2 分， BLOSUM 矩阵计 62 分。Smith 和 Waterman(1981)Adv.Appl.Math.2 ： 482-489 中公开了史密 斯 - 沃特曼同源性搜索算法。变体与参比抗 -CD100 抗体 ( 如 MAb 2503、 67 或 76) 可以相 差， 例如， 少至 1-15 个氨基酸残基， 少至 1-10 个氨基酸残基， 如 6-10 个， 少至 5 个， 少至 4、 3、 2、 或者甚至 1 个氨基酸残基。
能够特异性结合 CD100 并保留所需 CD100 阻断活性的多肽的准确化学结构取决于 多种因素。由于分子中存在可离子化的氨基和羧基， 可获得酸盐或碱盐或中性形式的特定 多肽。 放入合适环境条件中保持生物学活性的所有这类制备物均落入本文所用的抗 -CD100 抗体的定义范围内。另外， 可利用糖部分 ( 糖基化 ) 或其它补充分子如脂质、 磷酸酯 ( 盐 )、 乙酰基等衍生化， 以扩充所述多肽的一级氨基酸序列。也可通过与糖偶联进行扩充。这种 扩充的某些方面通过生产宿主的翻译后加工系统实现 ； 其它这类修饰可在体外引入。在任 何情况下， 这类修饰均包括在本文所用抗 -CD100 抗体的定义范围内， 只要抗 -CD100 抗体的 所需特性不被破坏。在不同实验中， 预计这类修饰可通过提高或降低多肽活性定量或定性
地影响活性。而且， 可通过氧化、 还原或其它衍生化方法修饰链内单独氨基酸残基， 可切割 所述多肽以获得保留活性的片段。不破坏所需特性 ( 如 CD100 的结合特异性、 结合亲和力 和 CD100 阻断活性 ) 的这类改变不会使该多肽序列从本文所述的感兴趣的抗 -CD100 抗体 的定义中剥离。
本领域提供有关制备和使用多肽变体的大量指导。在制备抗 -CD100 结合分子， 如 抗体或其抗原结合片段、 变体时， 本领域技术人员不难确定对天然蛋白质的核苷酸或氨基 酸序列进行何种修饰将产生适合用作本发明方法所用的药物组合物的治疗活性组分的变 体。
可以多种方式使抗 -CD100 抗体的恒定区突变以改变效应物功能。例如， 参见美国 专利号 6,737,056B1 和美国专利申请公开号 2004/0132101A1， 其公开了优化抗体与 Fc 受体 结合的 Fc 突变。
在某些抗 -CD100 抗体中， 可利用本领域已知技术突变 Fc 部分以降低效应物功能。 例如， 恒定区结构域的缺失或失活 ( 通过点突变或其它方式 ) 可降低循环的修饰抗体与 Fc 受体的结合， 从而提高肿瘤定位。 在其它情况下， 可能是与本发明相一致的恒定区修饰降低 互补物结合， 从而缩短所偶联细胞毒素的血清半衰期和非特异性结合。可利用恒定区的其 它修饰来改变二硫键连接或寡糖部分， 以便因抗原特异性或抗体柔性提高而加强定位。无 需过多实验， 即可容易地利用熟知的免疫学技术测定或定量分析修饰所得的生理学概况、 生物利用度和其它生化作用， 如肿瘤定位、 生物分布和血清半衰期。
本发明抗 -CD100 抗体也包括修饰的衍生物， 例如通过将任何类型的分子共价连 接到抗体上， 使得该共价连接不会防止抗体特异性结合其关联表位而修饰的衍生物。例如 但不限于， 抗体衍生物包括通过， 例如糖基化、 乙酰化、 PEG 化、 磷酸化、 酰胺化、 通过已知保 护 / 封闭基团衍生化、 蛋白水解切割、 连接于细胞配体或其它蛋白质等方法修饰的抗体。通 过已知技术可进行多种化学修饰， 包括但不限于 ： 特异性化学切割、 乙酰化、 甲酰化等。此 外， 衍生物可包含一种或多种非经典氨基酸。
“保守性氨基酸取代” 是氨基酸残基被具有带相似电荷的侧链的氨基酸残基取代。 本领域已定义具有带相似电荷的侧链的氨基酸残基家族。这些家族包括， 具有碱性侧链的 氨基酸 ( 如赖氨酸、 精氨酸、 组氨酸 )、 具有酸性侧链的氨基酸 ( 如天冬氨酸、 谷氨酸 )、 具有 不带电的极性侧链的氨基酸 ( 如甘氨酸、 天冬酰胺、 谷氨酰胺、 丝氨酸、 苏氨酸、 酪氨酸、 半 胱氨酸 )、 具有非极性侧链的氨基酸 ( 如丙氨酸、 缬氨酸、 亮氨酸、 异亮氨酸、 脯氨酸、 苯丙氨 酸、 甲硫氨酸、 色氨酸 )、 具有 β- 分支侧链的氨基酸 ( 如苏氨酸、 缬氨酸、 异亮氨酸 ) 和具有 芳族侧链的氨基酸 ( 如酪氨酸、 苯丙氨酸、 色氨酸、 组氨酸 )。或者， 也可沿所有或一部分编 码序列随机引入突变 ( 例如通过饱和诱变 )， 可筛选所得突变体的生物学活性， 以鉴定保持 活性 ( 例如， 结合抗 -CD100 多肽的能力 ) 的突变体。
例如， 可能仅在抗体分子的构架区内或仅在 CDR 区内引入突变。引入的突变可能 是沉默或中性错义突变， 即对抗体的抗原结合能力没有影响或影响很小。可使用这些突变 类型来优化密码子使用， 或提高杂交瘤的抗体产量。 或者， 非中性错义突变可改变抗体的抗 原结合能力。大部分沉默和中性错义突变的位置可能位于构架区内， 而大部分非中性错义 突变的位置可能在 CDR 内， 但这不是必然的要求。本领域技术人员能够设计和检测具有所 需特性， 例如抗原结合活性无改变或结合活性有改变 ( 如抗原结合活性提高或抗体特异性改变 ) 的突变分子。诱变后， 可通过常规方式表达编码蛋白， 并可利用本文所述技术或本领 域已知的常规修饰技术测定该编码蛋白的功能和 / 或生物学活性 ( 例如， 免疫特异性结合 CD100 多肽的至少一个表位的能力 )。
在 某 些 实 施 方 式 中， 本 发 明 抗 -CD100 抗 体 包 含 至 少 一 个 优 化 的 互 补 决 定 区 (CDR)。 “优化 CDR” 指该 CDR 已被修饰， 并且根据赋予包含该优化 CDR 的抗 -CD100 抗体的 维持或提高的结合亲和力和 / 或抗 -CD100 活性选择优化序列。 “抗 -CD100 活性” 或 “CD100 阻断活性” 可包括调节一种或多种与 CD100 相关的下述活性的活性 ： B 细胞活化、 聚集和存 活； CD40- 诱导的增殖和抗体生产 ； 对 T 细胞依赖性抗原的抗体应答 ； T 细胞或其它免疫细 胞增殖 ； 树突细胞成熟 ； 脱髓鞘和轴突变性 ； 全能神经前体和 / 或少突胶质细胞的凋亡 ； 诱 导内皮细胞迁移 ； 抑制自发性单核细胞迁移 ； 结合细胞表面丛蛋白 B1 ； 或与可溶性 CD100 或 CD100+ 细胞表面上表达的 CD100 相关的任何其它活性。 抗 -CD100 活性也用于解释 CD100 表达相关性疾病的发病率或严重程度降低， 这些疾病包括但不限于 ： 某些类型的淋巴瘤， 自身免疫病， 炎性疾病， 包括中枢神经系统 (CNS) 和周围神经系统 (PNS) 炎性疾病， 移植物 排斥和侵袭性血管新生。基于鼠抗 -CD100 MAb BD16 和 BB18 的优化抗体的例子可参见美 国公开号 2008/0219971A1， 国际专利申请 WO 93/14125 和 Herold 等， Int.Immunol.7(1) ： 1-8(1995)， 通过引用全文纳入本文。所述修饰可包括置换 CDR 内的氨基酸残基， 以使 抗 -CD100 抗体保持对 CD100 抗原的特异性并提高结合亲和力和 / 或提高抗 -CD100 活性。
IV. 编码抗 -CD100 抗体的多核苷酸
本发明还提供编码本发明抗 -CD100 抗体， 或其抗原结合片段、 变体或衍生物的核 酸分子。
在一个实施方式中， 本发明提供分离的多核苷酸， 它包含免疫球蛋白重链可变区 (VH 结构域 ) 的编码核酸、 基本由其组成或由其组成， 其中所述 VH 结构域的至少一个 CDR 具 有与 SEQ ID NO ： 3、 SEQ ID NO ： 4 或 SEQ ID NO ： 5 所示多核苷酸序列至少约 80％、 约 85％、 约 90％、 约 95％、 约 96％、 约 97％、 约 98％、 约 99％相同或完全相同的氨基酸序列。
在其它实施方式中， 本发明提供分离的多核苷酸， 其包含免疫球蛋白 VH 结构域的 编码核酸、 基本由其组成或由其组成， 其中所述 VH 结构域的至少一个 CDR 选自 ： (a) 包含 SEQ ID NO ： 6 所示氨基酸序列的 CDR1 ； (b) 包含 SEQID NO ： 7 所示氨基酸序列的 CDR2 ； 和 (c) 包含 SEQ ID NO ： 8 所示氨基酸序列的 CDR3。
在另一个实施方式中， 本发明包括分离的多核苷酸， 其包含 VH 结构域的编码核 酸、 基本由其组成或由其组成， 其中所述 VH 结构域具有与包含 SEQ IDNO ： 9 或 SEQ ID NO ： 10 的参比 VH 结构域多肽序列至少约 80％、 约 85％、 约 90％、 约 91％、 约 92％、 约 93％、 约 94％、 约 95％、 约 96％、 约 97％、 约 98％、 约 99％或 100％相同的氨基酸序列， 其中包含所述 编码的 VH 结构域的抗 -CD100 抗体特异性或优先结合 CD100。
在一个实施方式中， 本发明提供分离的多核苷酸， 它包含免疫球蛋白轻链可变区 (VL 结构域 ) 的编码核酸、 基本由其组成或由其组成， 其中所述 VL 结构域的至少一个 CDR 具有与 SEQ ID NO ： 11、 SEQ ID NO ： 12 或 SEQ ID NO ： 13 所示多核苷酸序列至少约 80％、 约 85％、 约 90％、 约 95％、 约 96％、 约 97％、 约 98％、 约 99％相同或完全相同的氨基酸序列。
在其它实施方式中， 本发明提供分离的多核苷酸， 其包含免疫球蛋白 VL 结构域的 编码核酸、 基本由其组成或由其组成， 其中所述 VL 结构域的至少一个 CDR 选自 ： (a) 包含SEQ ID NO ： 14 所示氨基酸序列的 CDR1 ； (b) 包含 SEQ ID NO ： 15 所示氨基酸序列的 CDR2 ； 和 (c) 包含 SEQ ID NO ： 16 所示氨基酸序列的 CDR3。
在另一个实施方式中， 本发明包括分离的多核苷酸， 其包含 VL 结构域的编码核 酸、 基本由其组成或由其组成， 其中所述 VL 结构域具有与包含 SEQ IDNO ： 17 或 SEQ ID NO ： 18 的参比 VL 结构域多肽序列至少约 80％、 约 85％、 约 90％、 约 91％、 约 92％、 约 93％、 约 94％、 约 95％、 约 96％、 约 97％、 约 98％、 约 99％或 100％相同的氨基酸序列， 其中包含所述 编码的 VL 结构域的抗 -CD100 抗体特异性或优先结合 CD100。
上述任何多核苷酸还可包含编码， 例如， 信号肽以指导编码多肽、 本文所述抗体恒 定区或本文所述其它异源多肽的分泌的额外核酸。 另外， 如本文另作详述， 本发明包括包含 一种或多种上述多核苷酸的组合物。
在一个实施方式中， 本发明包括包含第一多核苷酸和第二多核苷酸的组合物， 其 中所述第一多核苷酸编码本文所述的 VH 结构域， 所述第二多核苷酸编码本文所述的 VL 结 构域。具体说， 组合物包含编码 VH 结构域的多核苷酸和编码 VL 结构域的多核苷酸、 基本由 其组成或由其组成， 其中编码 VH 结构域的多核苷酸如 SEQ ID NO ： 19 或 SEQ ID NO ： 20 所 示， 编码 VL 结构域的多核苷酸如 SEQ ID NO ： 21 或 SEQ ID NO ： 22 所示。 如本文另述， 本发明还包括本发明多核苷酸的片段。 此外， 本发明还考虑编码本文 所述的融合多肽、 Fab 片段和其它衍生物的多核苷酸。
所述多核苷酸可通过本领域已知的任何方法产生或生产。例如， 如果抗体的核苷 酸序列已知， 则可由化学合成的寡核苷酸组装编码该抗体的多核苷酸 ( 如 Kutmeier 等， BioTechniques 17 ： 242(1994) 所述 )， 简言之， 该方法包括合成含有编码该抗体的序列的 某部分的重叠寡核苷酸， 使这些寡核苷酸退火和连接， 然后通过 PCR 扩增连接的寡核苷酸。
或者， 编码本发明抗 -CD100 抗体， 或其抗原结合片段、 变体或衍生物的多核苷酸 可由合适来源的核酸产生。如果无法获得含有编码特定抗体的核酸的克隆， 但该抗体分子 的序列已知， 则可通过化学合成或利用可与该序列 3′和 5′端杂交的合成引物进行 PCR 扩增、 或利用具体基因序列的特异性寡核苷酸探针进行克隆以鉴定 cDNA 文库中编码该抗 体或其它抗 -CD100 抗体的 cDNA 克隆， 由合适来源 ( 如抗体 cDNA 文库， 或由表达该抗体或 其它抗 -CD100 抗体的任何组织或细胞， 如选择表达抗体的杂交瘤细胞分离的核酸， 优选聚 A+RNA 产生的 cDNA 文库 ) 获得编码该抗体的核酸。然后， 可利用本领域熟知的任何方法将 PCR 产生的扩增核酸克隆到可复制克隆载体中。
一旦确定抗 -CD100 抗体或其抗原结合片段、 变体或衍生物的核苷酸序列和相 应氨基酸序列， 就可利用本领域熟知的操作核苷酸序列的方法， 例如重组 DNA 技术、 定点 诱变、 PCR 等操作其核苷酸序列。( 参见例如， Sambrook 等 (1990)Molecular Cloning， A Laboratory Manual(《分子克隆， 实验室手册》 )( 第 2 版 ； 纽约州冷泉港的冷泉港实验室公 司 (Cold Spring Harbor Laboratory， Cold Spring Harbor， N.Y.)) 和 Ausubel 等编 (1998) Current Protocols in Molecular Biology(《新编分子生物学实验指南》 )( 纽约州的约 翰韦利森公司 (John Wiley&Sons， NY)) 所述技术， 将这些文献全文纳入本文作参考 )， 以产 生具有不同氨基酸序列以产生 ( 例如 ) 氨基酸取代、 缺失和 / 或插入的抗体。
编码抗 -CD100 结合分子， 如抗体或其抗原结合片段、 变体或衍生物的多核苷酸可 由任何多核糖核苷酸或多脱氧核糖核苷酸构成， 可以是未修饰的 RNA 或 DNA 或修饰的 RNA
或 DNA。例如， 编码抗 -CD100 抗体或其抗原结合片段、 变体或衍生物的多核苷酸可由单链 和双链 DNA、 单链和双链区域混合的 DNA、 单链和双链 RNA 以及单链和双链区域混合的 RNA， 包含可以是单链、 更常见是双链、 或是单链和双链区域混合的 DNA 和 RNA 的杂交分子构成。 此外， 编码抗 -CD100 结合分子， 如抗体或其抗原结合片段、 变体或衍生物的多核苷酸可由 包含 RNA、 DNA、 或者 RNA 和 DNA 的三链区域构成。编码抗 -CD100 结合分子， 如抗体或其抗 原结合片段、 变体或衍生物的多核苷酸也可含有一个或多个修饰碱基， 或者因稳定性或其 它原因修饰的 DNA 或 RNA 主链。 “修饰的” 碱基包括， 例如三苯甲基碱基和非常见碱基如肌 苷。可对 DNA 和 RNA 进行多种修饰 ； 因此 “多核苷酸” 涵盖化学、 酶或代谢修饰形式。
编码衍生自免疫球蛋白 ( 如免疫球蛋白重链部分或轻链部分 ) 的多肽的非天然变 体的分离多核苷酸可通过将一个或多个核苷酸取代、 添加或缺失引入免疫球蛋白的核苷酸 序列来产生， 以便将一个或多个氨基酸取代、 添加或缺失引入编码蛋白。 突变可通过标准技 术引入， 例如定点诱变和 PCR 介导的诱变。优选在一个或多个非必需氨基酸残基处产生保 守性氨基酸取代。
V. 融合蛋白和抗体偶联物
如本文另作详述， 抗 -CD100 结合分子， 如本发明抗体或其抗原结合片段、 变体或 衍生物还可与异源多肽的 N- 或 C- 末端重组融合， 或与多肽或其它组合物化学偶联 ( 包括 共价和非共价偶联 )。 例如， 抗 -CD100 抗体可与用作检测实验标签和效应物分子， 如异源多 肽、 药物、 放射性核素或毒素的分子重组融合或偶联。参见例如， PCT 公开 WO 92/08495 ； WO 91/14438 ； WO 89/12624 ； 美国专利号 5,314,995 ； 和 EP 396,387。 本发明抗 -CD100 抗体， 或其抗原结合片段、 变体或衍生物可包括通过将任何类型 的分子与抗体共价连接使该共价连接不防止抗体结合抗 -CD100， 修饰的衍生物。例如但不 限于， 抗体衍生物包括通过， 例如糖基化、 乙酰化、 PEG 化、 磷酸化、 酰胺化、 通过已知保护 / 封闭基团衍生化、 蛋白水解切割、 连接于细胞配体或其它蛋白质等方法修饰的抗体。 通过已 知技术可进行多种化学修饰， 包括但不限于 ： 特异性化学切割、 乙酰化、 甲酰化等。此外， 衍 生物可包含一种或多种非经典氨基酸。
抗 -CD100 结合分子， 如本发明抗体或其抗原结合片段、 变体或衍生物可由通过肽 键或修饰的肽键， 即肽等构物而彼此结合的氨基酸组成， 并可包含 20 种基因编码的氨基酸 以外的氨基酸。例如， 可通过天然方法， 例如翻译后加工， 或通过本领域熟知的化学修饰技 术修饰抗 -CD100 抗体。这些修饰在基础文本和更具体的专著中已有深入描述， 并在大量 研究文献中也有叙述。可以在抗 -CD100 结合分子的任何位置进行修饰， 包括在肽主链、 氨 或者在某部分如糖上进行修饰。应当了解相同类型的修饰可 基酸侧链和氨基或羧基末端， 以在给定抗 -CD100 结合分子的多个位置以相同或不同程度出现。并且， 给定的抗 -CD100 结合分子可包含许多类型的修饰。抗 -CD100 结合分子可以是分支的， 例如因泛素化造成， 它们可以是含有或不含分支的环状。环状的、 分支的、 和分支环状的抗 -CD100 结合分子 可以由翻译后的天然加工造成也可通过合成方法产生。修饰包括乙酰化、 酰基化、 ADP- 核 糖基化、 酰胺化、 共价结合黄素、 共价结合血红素部分、 共价结合核苷酸或核苷酸衍生物、 共价结合脂质或脂质衍生物、 共价结合磷脂酰肌醇、 交联、 环化、 二硫键形成、 去甲基化、 形 成共价交联、 形成半胱氨酸、 形成焦谷氨酸、 甲酰化、 γ- 羧化、 糖基化、 GPI 锚体形成、 羟基 化、 碘化、 甲基化、 十四烷基化、 氧化、 聚乙二醇化、 蛋白水解加工、 磷酸化、 异戊二烯化、 外消
旋化、 硒化、 硫化、 转移 RNA 介导的蛋白质氨基酸加成如精氨酰化、 以及泛素化。( 参见例 如， Proteins--Structure and Molecular Properties(《蛋白质 - 结构和分子特性》 )， T.E.Creighton， W.H. 弗 里 曼 公 司 (W.H.Freeman and Company)， 纽约 ； 第 2 版 (1993) ； Johnson 编 (1983)Posttranslational Covalent Modification of Proteins( 《蛋白质的 翻译后共价修饰》 )( 学术出版社 (Academic Press)， 纽约 )， 第 1-12 页 ； Seifter 等， Meth. Enzymol.182 ： 626-646(1990) ； Rattan 等， Ann.NY Acad.Sci.663 ： 48-62(1992))。
本发明也提供包含抗 -CD100 抗体或其抗原结合片段、 变体或衍生物， 以及异源多 肽的融合蛋白。与抗体融合的异源多肽可用于产生某种功能或用于靶向表达抗 -CD100 多 肽的细胞。
在一个实施方式中， 本发明融合蛋白包含具有本发明抗体的任何一个或多个 VH 结构域的氨基酸序列、 本发明抗体的任何一个或多个 VL 结构域的氨基酸序列、 或其片段或 变体， 以及异源多肽序列的多肽， 基本由其组成或由其组成。
在另一实施方式中， 用于本文所述诊断和治疗方法的融合蛋白包含具有抗 -CD100 抗体的 VH 结构域的任何一个、 两个、 三个 CDR 的氨基酸序列或者其片段、 变体或衍生物， 或 者抗 -CD100 抗体的 VL 结构域的任何一个、 两个、 三个 CDR 的氨基酸序列或者其片段、 变体 或衍生物， 以及异源多肽序列的多肽， 基本由其组成或由其组成。在一个实施方式中， 融合 蛋白包含具有本发明抗 -CD100 抗体的至少一个 VH 结构域的氨基酸序列和本发明抗 -CD100 抗体的至少一个 VL 结构域的氨基酸序列， 或者其片段、 衍生物或变体， 以及异源多肽序列 的多肽。优选地， 所述融合蛋白的 VH 和 VL 结构域对应于特异性结合 CD100 的至少一个表 位的单一来源抗体 ( 或 scFv 或 Fab 片段 )。在又一实施方式中， 用于本文所述的诊断和治 疗方法的融合蛋白包含具有抗 -CD100 抗体的 VH 结构域的任何一个、 两个、 三个或更多个 CDR 的氨基酸序列和抗 -CD100 抗体的 VL 结构域的任何一个、 两个、 三个或更多个 CDR 的氨 基酸序列， 或者其片段或变体， 以及异源多肽序列的多肽。 优选地， VH 结构域或 VL 结构域的 两个、 三个、 四个、 五个、 六个或更多个 CDR 对应于本发明单一来源抗体 ( 或 scFv 或 Fab 片 段 )。本发明也涵盖编码这些融合蛋白的核酸分子。
文 献 中 报 道 的 示 范 性 融 合 蛋 白 包 括 T 细 胞 受 体 (Gascoigne 等， Proc.Natl. Acad.Sci.USA 84 ： 2936-2940(1987)) ； CD4(Capon 等， Nature 337 ： 525-531(1989) ； Traunecker 等， Nature 339 ： 68-70(1989) ； Zettmeissl 等， DNA Cell Biol.USA 9 ： 347-353(1990) ； 和 Byrn 等， Nature 344 ： 667-670(1990)) ； L- 选择素 ( 寻靶受体 )(Watson 等， J.Cell.Biol.110 ： 2221-2229(1990) ； 和 Watson 等， Nature349 ： 164-167(1991)) ； CD44(Aruffo 等， Cell 61 ： 1303-1313(1990)) ； CD28 和 B7(Linsley 等， J.Exp.Med.173 ： 721-730(1991)) ； CTLA-4(Lisley 等， J.Exp.Med.174 ： 561-569(1991)) ； CD22(Stamenkovic 等， Cell 66 ： 1133-1144(1991)) ； TNF 受体 (Ashkenazi 等， Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88 ： 10535-10539(1991) ； Lesslauer 等， Eur.J.Immunol.27 ： 2883-2886(1991) ； 和 Peppel 等， J.Exp.Med.174 ： 1483-1489(1991)) ；和 IgE 受 体 a(Ridgway 和 Gorman， J.Cell.Biol. Vol.115， 文摘号 (Abstract No.)1448(1991)) 的融合物。
如本文其它地方所述， 抗 -CD100 结合分子， 如本发明抗体或其抗原结合片段、 变 体或衍生物可与异源多肽融合， 以提高所述多肽的体内半衰期或用于以本领域已知方法 进行的免疫实验。例如， 在一个实施方式中， 可将 PEG 偶联于本发明抗 -CD100 抗体， 以提高其体内半衰期。参见 Leong 等， Cytokine16 ： 106(2001) ； Adv.in Drug Deliv.Rev.54 ： 531(2002) ； 或 Weir 等， Biochem.Soc.Transactions 30 ： 512(2002)。
而且， 抗 -CD100 结合分子， 如本发明抗体或其抗原结合片段、 变体或衍生物可融 合标记物序列如肽， 以利于其纯化或检测。 在优选实施方式中， 标记物氨基酸序列是六组氨 酸肽， 例如 pQE 载体 ( 凯杰公司 (QIAGEN， Inc.)， 伊顿大街 (Eton Avenue)9259 号， 查茨沃斯 (Chatsworth)， 加州 91311) 提供的标签等， 其中许多标记可购得。如 Gentz 等， 1989， Proc. Natl.Acad.Sci.USA 86 ： 821-824 所述， 六 - 组氨酸提供了方便的融合蛋白纯化方法。用于 纯化的其它肽标签包括但不限于 ： 对应于流感血凝素蛋白衍生表位的 “HA” 标签 (Wilson 等， Cell37 ： 767(1984))， 以及 “flag” 标签。
可采用本领域熟知方法制备融合蛋白 ( 参见例如， 美国专利号 5,116,964 和 5,225,538)。可凭经验选择进行融合的准确位点， 以优化融合蛋白的分泌或结合特性。然 后， 用编码融合蛋白的 DNA 转染宿主细胞进行表达。
抗 -CD100 结合分子， 如本发明抗体或其抗原结合片段、 变体或衍生物， 可以非偶 联形式使用， 或者可偶联于各种分子的至少一种， 例如， 以改善该分子的治疗特性、 利于靶 点检测、 或用于患者成像或治疗。可以在纯化前或纯化后， 或者在进行纯化时标记或偶联 抗 -CD100 结合分子， 如本发明抗体或其抗原结合片段、 变体或衍生物。
具体说， 本发明抗 -CD100 抗体或其抗原结合片段、 变体或衍生物可偶联于治疗 剂、 前药、 肽、 蛋白质、 酶、 病毒、 脂质、 生物反应修饰剂、 药物或 PEG。
本领域技术人员能理解， 根据所选的偶联物质， 可采用各种技术组装偶联物。例 如， 可通过使结合多肽与生物素的活化酯如生物素 N- 羟基琥珀酰亚胺酯反应， 制备生物素 偶联物。相似地， 可以在偶联剂， 如本文所列偶联剂存在下或通过与异硫氰酸酯， 优选荧光 素 - 异硫氰酸酯反应制备荧光标记偶联物。以类似方式制备本发明抗 -CD100 抗体或其抗 原结合片段、 变体或衍生物。
本发明还包括偶联于诊断剂或治疗剂的抗 -CD100 结合分子， 如本发明抗体或其 抗原结合片段、 变体或衍生物。可将本发明抗 -CD100 抗体， 包括其抗原结合片段、 变体和衍 生物用于诊断目的， 例如， 作为临床测试步骤的一部分监测疾病的发展或进展， 从而 ( 如 ) 确定给定的治疗和 / 或预防方案的效果。例如， 将抗 -CD100 抗体或其抗原结合片段、 变体 或衍生物偶联于可检测物质可利于检测。可检测物质的例子包括各种酶、 辅基、 荧光材料、 发光材料、 生物发光材料、 放射性材料、 使用各种正电子发射断层显像术的正电子发射金属 和非放射性顺磁金属离子。参见例如， 美国专利号 4,741,900 中的金属离子， 可根据本发明 将其与抗体偶联用于诊断。合适酶的例子包括辣根过氧化物酶、 碱性磷酸酶、 β- 半乳糖苷 酶或乙酰基胆碱酯酶 ； 合适的辅基复合物的例子包括链霉亲和素 / 生物素和亲和素 / 生物 素； 合适的荧光材料的例子包括 ： 伞形花内酯、 荧光素、 荧光素异硫氰酸酯、 罗丹明、 二氯三 嗪胺荧光素、 丹磺酰氯或藻红蛋白 ； 发光材料的例子是氨基苯二酰肼 ； 生物发光材料的例 125 131 111 90 子包括 ： 萤光素酶、 萤光素和发光蛋白 ； 合适的放射性物质的例子包括 I、 I、 In、 Y或 99 Tc。
抗 -CD100 结合分子， 如抗体或其抗原结合片段、 变体或衍生物可偶联治疗部分， 如细胞毒素、 治疗剂或放射性金属离子。 细胞毒素或细胞毒剂包括对细胞有害的任何物质。
抗 -CD100 结合分子， 如抗体或其抗原结合片段、 变体或衍生物还可通过偶联于化学发光化合物进行可检测地标记。 然后， 通过检测化学反应过程中产生的发光， 确定化学发 光标记的抗 -CD100 结合分子的存在。特别有用的化学发光标记化合物的例子是氨基苯二 酰肼、 异氨基苯二酰肼、 热发光性 (theromatic) 吖啶
酯、 咪唑、 吖啶盐和草酸酯。对抗 -CD100 抗体或其抗原结合片段、 变体或衍生物进行可检测标记的一种方 式 是 将 其 连 接 于 酶， 并 用 连 接 产 物 进 行 酶 促 免 疫 实 验 (EIA)(Voller， A.， The Enzyme Linked Immunosorbent Assay(ELISA)(“酶 联 免 疫 吸 附 实 验” )， 微生物联合会季 刊 (Microbiological Associates Quarterly Publication)， 马里兰州沃克斯维尔 (Walkersville， Md.) ； 诊 断 地 平 线 (Diagnostic Horizons)2 ： 1-7(1978) ； Voller 等， J.Clin.Pathol.31 ： 507-520(1978) ； Butler， Meth.Enzymol.73 ： 482-523(1981) ； Maggio 编 (1980)Enzyme Immunoassay(《酶促免疫实验》 )， 佛罗里达州伯克莱屯的 CRC 出版社 (CRC Press， Boca Raton， Fla.) ； Ishikawa 等编 (1981)Enzyme Immunoassay(《酶促免疫实验》 ) (Kgaku Shoin， 东京 )。结合于抗 -CD100 抗体的酶与合适底物， 优选发色底物发生反应， 其反应方式产生可通过 ( 例如 ) 分光光度法、 荧光测定法或目测法检测的化学部分。可用 于可检测标记抗体的酶包括但不限于 ： 苹果酸脱氢酶、 葡萄球菌核酸酶、 δ-5- 类固醇异构 酶、 酵母醇脱氢酶、 α 甘油磷酸脱氢酶、 磷酸丙糖异构酶、 辣根过氧化物酶、 碱性磷酸酶、 天 冬酰胺酶、 葡萄糖氧化酶、 β 半乳糖苷酶、 核糖核酸酶、 脲酶、 过氧化氢酶、 葡萄糖 -6 磷酸脱 氢酶、 葡糖淀粉酶和乙酰胆碱酯酶。此外， 可通过利用酶发色底物进行的比色法进行检测。 也可通过目测比较底物与类似方法制备的标准品的酶反应程度进行检测。 也可利用各种其它免疫实验进行检测。例如， 通过放射性标记抗 -CD100 结合分 子， 如抗体或其抗原结合片段、 变体或衍生物， 可以使用放射性免疫实验 (RIA) 检测结合 分 子 ( 参 见 例 如， Weintraub(1986 年 3 月 )Principles of Radioimmunoassays(《放 射 性免疫实验原理》 )， 第七届放射性配体实验技术培训课程 (Seventh Training Course on Radioligand Assay Techniques)( 内分泌协会 (The Endocrine Society))， 通过引用全文 纳入本文 )。放射性同位素可通过各种方式检测， 包括但不限于 ： γ 计数器、 闪烁计数器或 放射自显影。
也可利用荧光发射金属， 如 152Eu 或其它镧系元素对抗 -CD100 结合分子， 如抗 体或其抗原结合片段、 变体或衍生物进行可检测地标记。可用诸如二亚乙基三胺五乙酸 (DTPA) 或乙二胺四乙酸 (EDTA) 之类的金属螯合基团将这些金属连接于结合分子。
将 不 同 部 分 偶 联 于 抗 体 ( 如 抗 -CD100 抗 体 ) 或 其 抗 原 结 合 片 段、 变体或衍 生 物 的 技 术 是 众 所 周 知 的， 参 见 例 如， Amon 等 (1985)Monoclonal Antibodies for Immunotargeting of Drugs in Cancer Therapy(“癌症治疗中用于药物的免疫靶向的 单克隆抗体” )， 收录于 Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy(《单克隆抗体和癌 症治疗》 )， Reisfeld 等编 (ARL 公司 (Alan R.Liss， Inc.))， 第 243-56 页 ； Hellstrom 等 (1987)Antibodies for Drug Delivery( “用于药物递送的抗体” )， 收录于 Controlled Drug Delivery(《控制药物递送》 )， Robinson 等编 ( 第 2 版 ； MD 公司 (Marcel Dekker， Inc.))， 第 623-53 页 ) ； Thorpe(1985)Antibody Carriers of Cytotoxic Agents in Cancer Therapy ： A Review(“癌症治疗中细胞毒剂的抗体运载体 ： 综述” )， 收录于 Monoclonal Antibodies′ 84 ： Biological and Clinical Applications( 《单克隆抗体′ 84 ： 生物学和 临床应用》 )， Pinchera 等编， 第 475-506 页 ； Analysis， Results， and Future Prospective
of the Therapeutic Use of Radiolabeled Antibody in Cancer Therapy( “在癌症治疗中 治疗性使用放射性标记的抗体的分析、 结果和展望” )， 收录于 Monoclonal Antibodies for Cancer Detection and Therapy(《用于检测和治疗癌症的单克隆抗体》 )， Baldwin 等编， 学术出版社 (Academic Press)， 第 303-16 页 (1985) ； 和 Thorpe 等 (1982)The Preparation and Cytotoxic Properties of Antibody-Toxin Conjugates( “抗体 - 毒素偶联物的制备 和细胞毒特性” )， Immunol.Rev.62 ： 119-58。
VI. 抗体多肽的表达
编码抗体的轻链和重链的 DNA 序列可根据熟知方法利用逆转录酶和 DNA 聚合酶同 时或单独制备。可根据公开的重链和轻链 DNA 和氨基酸序列， 用共有恒定区引物或更具特 异性的引物启动 PCR。如上所述， 也可利用 PCR 分离编码抗体轻链和重链的 DNA 克隆。在这 种情况下， 可利用共有引物或较大的同源探针， 如小鼠恒定区探针筛选文库。
DNA， 通常是质粒 DNA， 可利用本领域已知技术从细胞中分离， 按照如上述重组 DNA 技术相关文献中详述的标准熟知技术进行限制性作图和测序。当然， 可以在分离过程或后 续分析过程期间的任何时间点按照本发明合成 DNA。
操作分离的遗传物质以提供本发明抗 -CD100 抗体， 或其抗原结合片段、 变体或衍 生物后， 通常将编码该抗 -CD100 抗体的多核苷酸插入表达载体， 以便引入可用于产生所需 量抗 -CD100 抗体的宿主细胞中。
重组表达抗体或其片段、 衍生物或类似物， 例如， 结合本文所述靶分子如 CD100 的 抗体重链或轻链， 需要构建含有编码该抗体的多核苷酸的表达载体。一旦获得编码本发明 抗体分子、 抗体的重链或轻链、 或其一部分 ( 优选含有重链或轻链可变区 ) 的多核苷酸后， 可使用本领域熟知方法通过重组 DNA 技术获得产生抗体分子的载体。因此， 本文描述了通 过含抗体编码核苷酸序列的多核苷酸表达制备蛋白质的方法。 可利用本领域技术人员熟知 的方法构建含有抗体编码序列和合适的转录和翻译控制信号的表达载体。 这些方法包括例 如， 体外重组 DNA 技术、 合成技术和体内遗传重组。因此， 本发明提供可复制载体， 其包含操 作性连接于启动子的编码本发明抗体分子、 或其重链或轻链、 或其重链或轻链可变区的核 苷酸序列。这种载体可包括， 编码抗体分子恒定区的核苷酸序列 ( 参见例如， PCT 公开 WO 86/05807 ； PCT 公开 WO 89/01036 ； 和美国专利号 5,122,464)， 可将抗体可变区克隆到这类 载体中以便表达完整的重链或轻链。
本文所用术语 “载体” 或 “表达载体” 指在本发明中用作运载体在宿主细胞中引入 和表达所需基因的载体。正如本领域技术人员所知， 这种载体可容易地选自质粒、 噬菌体、 病毒和逆转录病毒。 通常， 与本发明相容的载体包含选择性标记物、 有利于克隆所需基因的 合适限制性位点和进入真核或原核细胞中并在其中复制的能力。
出于本发明目的， 可采用多种表达载体系统。 例如， 一类载体利用衍生自动物病毒 如牛乳头瘤病毒、 多瘤病毒、 腺病毒、 牛痘病毒、 杆状病毒、 逆转录病毒 (RSV、 MMTV 或 MOMLV) 或 SV40 病毒的 DNA 元件。其它包括使用具有内部核糖体结合位点的多顺反子系统。此外， 通过引入能够选择转染的宿主细胞的一种或多种标记物， 可选择将 DNA 整合入染色体中的 细胞。该标记物可向营养缺陷型宿主提供提供原营养， 以及生物杀灭剂 ( 如抗生素 ) 抗性 或重金属抗性如铜抗性。选择性标记物基因可直接连接于待表达的 DNA 序列， 或者通过共 同转化引入同一细胞内。在 mRNA 的优化合成中， 也可能需要其它元件。这些元件可包括信号序列、 剪接信号以及转录启动子、 增强子和终止信号。
在特别优选的实施方式中， 将克隆的可变区基因和如上所述合成的重链和轻链恒 定区基因 ( 优选人 ) 插入表达载体内。当然， 能够在真核细胞中引发表达的任何表达载体 均可用于本发明。合适载体的例子包括但不限于 ： 质粒 pcDNA3、 pHCMV/Zeo、 pCR3.1、 pEF1/ His、 pIND/GS、 pRc/HCMV2、 pSV40/Zeo2、 pTRACER-HCMV、 pUB6/V5-His、 pVAX1 和 pZeoSV2( 可 获自加州圣地亚哥的英杰公司 (Invitrogen， San Diego， Calif.)) 和质粒 pCI( 可获自威斯 康星州麦迪逊的普洛麦格公司 (Promega， Madison， Wis.))。通常， 筛选大量转化细胞以选 出适当高水平表达免疫球蛋白重链和轻链的转化细胞是可通过 ( 例如 ) 机器人系统进行的 常规实验。
更常见地， 一旦制备得到编码抗 -CD100 抗体的单体亚基的载体或 DNA 序列， 就可 将表达载体引入合适的宿主细胞内。可通过本领域技术人员熟知的各种技术将质粒引入 宿主细胞内。这些技术包括但不限于 ： 转染 ( 包括电泳和电穿孔 )、 原生质体融合、 磷酸钙 沉淀、 细胞与包膜 DNA 融合、 显微注射和用完整病毒感染。参见 Ridgway(1988)Mammalian Expression Vectors(“哺乳动物表达载体” )， 收录于 Vectors(《载体》 )， Rodriguez 和 Denhardt 编 ( 马萨诸塞州波士顿的巴特沃思公司 (Butterworths， Boston， Mass.))， 第 24.2 章， 第 470-472 页。通常， 通过电穿孔将质粒引入宿主。在适合产生轻链和重链的条件下培 养携带表达构建物的宿主细胞， 并测定重链和 / 或轻链蛋白的合成。示范性实验技术包括 酶联免疫吸附实验 (ELISA)、 放射性免疫实验 (RIA) 或荧光活化的细胞分选分析 (FACS)、 免 疫组化等。
通过常规技术将该表达载体转移到宿主细胞中， 然后通过常规技术培养该转染细 胞， 产生用于本文所述方法的抗体。 因此， 本发明包括含有操作性连接于异源启动子的本发 明抗体或其重链或轻链的编码多核苷酸的宿主细胞。在优选实施方式中， 为了表达双链抗 体， 可以在宿主细胞中共同表达编码重链和轻链的载体， 以表达整个免疫球蛋白分子， 如下 详述。
本文所用 “宿主细胞” 指携带用重组 DNA 技术构建并编码至少一种异源基因的载 体的细胞。在描述从重组宿主中分离抗体的方法时， 除非另有明确说明， 术语 “细胞” 和 “细 胞培养物” 可互换使用， 指抗体来源。换言之， 从 “细胞” 回收多肽可以指从离心的全细胞或 含有培养基和悬浮细胞的培养物回收。
可利用各种宿主 - 表达载体系统来表达用于本文所述方法的抗体分子。这类宿 主 - 表达系统代表可产生并随后纯化感兴趣编码序列的载体， 但也代表用合适的核苷酸编 码序列转化或转染时， 可原位表达本发明抗体分子的细胞。它们包括但不限于微生物， 例 如用含有抗体编码序列的重组噬菌体 DNA、 质粒 DNA 或粘粒 DNA 表达载体转化的细菌 ( 如 大肠杆菌 (E.coli) 和枯草芽孢杆菌 (B.subtilis)) ； 用含有抗体编码序列的重组酵母表达 载体转化的酵母 ( 如毕赤酵母 (Saccharomyces Pichia)) ； 用含有抗体编码序列的重组病 毒表达载体 ( 如杆状病毒 ) 感染的昆虫细胞系统 ； 用重组病毒表达载体 ( 如花椰菜花叶病 毒， CaMV ； 烟草花叶病毒， TMV) 感染的或用含有抗体编码序列的重组质粒表达载体 ( 如 Ti 质粒 ) 转化的植物细胞系统 ； 或者哺乳动物细胞系统 ( 如 COS、 CHO、 BLK、 293 和 3T3 细胞 )， 其携带含有衍生自哺乳动物细胞基因组 ( 如金属硫蛋白启动子 ) 或哺乳动物病毒 ( 如腺病 毒晚期启动子 ； 牛痘病毒 7.5K 启动子 ) 的启动子的重组表达构建物。重组抗体分子的表达优选利用细菌细胞如大肠杆菌 (Escherichia coli)， 更优选真核细胞 ( 特别是表达完整重 组抗体分子时 )。 例如， 哺乳动物细胞如中华仓鼠卵巢细胞 (CHO) 与某载体如来自人巨细胞 病毒的主要中间体早期基因启动子元件联用， 是抗体的有效表达系统 (Foecking 等， Gene 45 ： 101(1986) ； 和 Cockett 等， Bio/Technology 8 ： 2(1990))。
用于表达蛋白质的宿主细胞系常常是哺乳动物来源的 ； 本领域技术人员能够优 先确定最适合表达所需基因产物的具体宿主细胞系。示范性宿主细胞系包括但不限于 ： CHO( 中华仓鼠卵巢 )、 DG44 和 DUXB11( 中华仓鼠卵巢品系、 DHFR-)、 HELA( 人宫颈癌 )、 CVI( 猴肾品系 )、 COS( 具有 SV40T 抗原的 CVI 衍生品系 )、 VERY、 BHK( 幼仓鼠肾 )、 MDCK、 293、 WI38、 R1610( 中华仓鼠成纤维细胞 )BALBC/3T3( 小鼠成纤维细胞 )、 HAK( 仓鼠肾品 系 )、 SP2/O( 小鼠骨髓瘤 )、 P3.times.63-Ag3.653( 小鼠骨髓瘤 )、 BFA-1c1BPT( 牛内皮细 胞 )、 RAJI( 人淋巴细胞 ) 和 293( 人肾 )。宿主细胞系通常可从商业服务来源如美国组织 培养物保藏中心或公开文献获得。
此外， 可选择以所需的特定方式调节插入序列表达、 或修饰和加工该基因产物的 宿主细胞系。对蛋白质产物的这种修饰 ( 如糖基化 ) 和加工 ( 如切割 ) 可能对蛋白质功能 至关重要。 不同宿主细胞对蛋白质和基因产物的翻译后加工和修饰具有特征性和特定的机 制。 可选择合适的细胞系或宿主系统， 以保证对所表达的外来蛋白进行正确的修饰和加工。 为此， 可采用具有能适当地加工初始转录物、 对基因产物进行糖基化和磷酸化的细胞机器 的真核宿主细胞。
为了长期、 高产率地生产重组蛋白， 优选稳定的表达。例如， 可工程改造稳定表达 抗体分子的细胞系。与其使用含有病毒复制起点的表达载体， 不如用合适表达控制元件 ( 如启动子、 增强子、 序列、 转录终止子、 聚腺苷酸化位点等 ) 控制的 DNA 和选择性标记来转 化宿主细胞。引入外来 DNA 后， 使工程改造细胞在富营养培养基中生长 1-2 天， 然后换到选 择性培养基中。重组质粒中的选择性标记提供对选择压的抗性， 使得细胞能够将该质粒稳 定整合入染色体， 生长形成细胞灶， 进而可克隆并扩增成细胞系。 可有益地利用这种方法工 程改造稳定表达该抗体分子的细胞系。
可采用许多选择系统， 包括但不限于可分别用于 tk-、 hgprt- 或 aprt- 细胞的单 纯疱疹病毒胸苷激酶 (Wigler 等， Cell 11 ： 223(1977))、 次黄嘌呤 - 鸟嘌呤磷酸核糖基转 移酶 (Szybalska 和 Szybalski， Proc.Natl.Acad.Sci.USA 48 ： 202(1992)) 和腺嘌呤磷酸 核糖基转移酶 (Lowy 等， Cell 22 ： 817(1980)) 基因。另外， 抗代谢剂抗性可用作选择以 下基因的基础 ： dhfr， 产生甲氨蝶呤抗性 (Wigler 等， 1980， Natl.Acad.Sci.USA， 77 ： 357 ； O’ Hare 等， 1981， Proc.Natl.Acad.Sci.USA， 78 ： 1527) ； gpt， 产生霉酚酸抗性 (Mulligan 和 Berg， 1981， Proc.Natl.Acad.Sci.USA， 78 ： 2072) ； neo， 产生氨基糖苷 G-418 抗性 (Clinical Pharmacy 12 ： 488-505 ； Wu 和 Wu， 1991， Biotherapy 3 ： 87-95 ； Tolstoshev， 1993， Ann. Rev.Pharmacol.Toxicol.32 ： 573-596 ； Mulligan， 1993， Science 260 ： 926-932 ； 和 Morgan 和 Anderson， Ann.Rev.Biochem.62 ： 191-217(1993) ； TIB TECH11(5) ： 155-215(1993 年 5 月 )) ； 和 hygro， 产生潮霉素抗性 (Santerre 等， 1984， Gene， 30 ： 147)。本领域已知可用于 重组 DNA 技术的方法参见如 Ausubel 等， Current Protocols in Molecular Biology( 《新 编分子生物学实验指南》 )， 纽约州的约翰韦利父子公司 (John Wiley&Sons， NY)(1993) ； Kriegler， Gene Transfer and Expression， A Laboratory Manual(“基因转移和表达， 实验室手册” )， 纽约的斯托克顿出版社 (Stockton Press)(1990) ； Dracopoli 等 ( 编 )(1994) Current Protocols in Human Genetics(《新编人类基因组学实验指南》 )( 纽约州的约翰 韦利父子公司 )， 第 12 和 13 章 ； Colberre-Garapin 等 (1981)J.Mol.Biol.150 ： 1， 通过引用 全文纳入本文。
可通过载体扩增提高抗体分子的表达水平 ( 综述参见 Bebbington 和 Hentschel， “The Use of Vectors Based on Gene Amplification for the Expression of Cloned Genes in Mammalian Cells in DNA Cloning” ( 在 DNA 克隆中使用基于基因扩增的载体在 哺乳动物细胞中表达克隆的基因 )， ( 纽约州的学术出版社 (Academic Press)))， 第 3 卷。 当表达抗体的载体系统中的标记可扩增时， 提高宿主细胞培养物中存在的抑制剂水平会增 加标记基因的拷贝数。由于扩增区域与抗体基因相连， 所以抗体产量也会提高 (Crouse 等， Mol.Cell.Biol.3 ： 257(1983))。
体外生产允许放大规模产生大量所需多肽。 本领域已知在组织培养条件下培养哺 乳动物细胞的技术， 包括均一悬浮培养， 例如在气升式反应器或在连续搅拌反应器中培养， 或者固定或捕获式细胞培养， 例如在中空纤维中、 微囊中、 琼脂糖微珠上或陶瓷筒上培养。 如果必要和 / 或需要， 多肽溶液可通过常规色谱法进行纯化， 例如， 在优先生物合成合成绞 链区多肽之后或者在本文所述的 HIC 色谱步骤之前或之后， 进行如凝胶过滤、 离子交换色 谱、 DEAE- 纤维素色谱或 ( 免疫 -) 亲和力色谱。
编码本发明抗 -CD100 抗体或其抗原结合片段、 变体或衍生物的基因也可在非 哺乳动物细胞， 如昆虫细胞、 细菌细胞、 酵母细胞或植物细胞中表达。易于摄入核酸的 细菌包括肠杆菌科成员， 例如大肠杆菌 (Escherichia coli) 或沙门菌属 (Salmonella) 菌株 ； 芽 孢 杆 菌 科 (Bacillaceae)， 如 枯 草 芽 孢 杆 菌 (Bacillus subtilis) 菌 株 ； 肺炎 球 菌 (Pneumococcus) 菌 株 ； 链 球 菌 (Streptococcus) 和 流 感 嗜 血 杆 菌 (Haemophilus influenzae) 的菌株。还应理解， 在细菌中表达时， 异源多肽通常是包含体的一部分。异源 多肽必须被分离、 纯化、 然后组装成功能分子。需要抗体的四价形式时， 亚基会自组装成四 价抗体 (WO 02/096948A2)。
在细菌系统中， 可根据所表达抗体分子的指定应用对许多表达载体进行有利地选 择。例如， 准备产生大量这类蛋白质时， 为了产生抗体分子的药物组合物， 可能需要能够介 导易于纯化的融合蛋白产物高水平表达的载体。这类载体包括但不限于 ： 大肠杆菌表达载 体 pUR278(Ruther 等， EMBO J.2 ： 1791(1983))， 其中抗体编码序列可单独连接到载体内， 与 lacZ 编码区位于同一读框内， 以产生融合蛋白 ； pIN 载体 (Inouye 和 Inouye， Nucleic Acids Res.13 ： 3101-3109(1985) ； Van Heeke 和 Schuster， J.Biol.Chem.， 24 ： 5503-5509(1989)) ； 等等。也可采用 pGEX 载体表达外来多肽与谷胱甘肽 -S- 转移酶 (GST) 的融合蛋白。通常， 这类融合蛋白可溶， 并可从裂解细胞容易地通过吸附和结合于基质谷胱甘肽琼脂糖珠后在 游离谷胱甘肽的存在下洗脱而纯化。设计 pGEX 载体， 使其包含凝血酶或因子 Xa 蛋白酶切 割位点， 以便由 GST 部分释放克隆的靶基因产物。
除原核生物外， 还可使用真核微生物。酿酒酵母 (Saccharomyces cerevisiae) 或 常见的面包酵母是最常使用的真核微生物， 但也可使用许多其它菌株， 例如巴斯德毕赤酵 母 (Pichia pastoris)。
为 了 在 酵 母 (Saccharomyces) 中 表 达， 常 常 使 用 质 粒 YRp7， 例 如 (Stinchcomb等， Nature 282 ： 39(1979) ； Kingsman 等， Gene 7 ： 141(1979) ； Tschemper 等， Gene 10 ： 157(1980))。这种质粒已经含有 TRP1 基因， 其为缺乏在色氨酸中生长的能力的酵母突变菌 株如 ATCC 编号 44076 或 PEP4-1(Jones， Genetics 85 ： 12(1977)) 提供选择性标记物。 然后， 酵母宿主细胞基因组特征性 trp1 损伤的存在提供了用于通过在无色氨酸环境下生长来检 测转化的有效环境。
在 昆 虫 系 统 中， 苜 蓿 银 纹 夜 蛾 (Autographa californica) 核 多 面 体 病 病 毒 (AcNPV) 通常用作表达外来基因的载体。该病毒在草地贪夜蛾 (Spodoptera frugiperda) 细胞中生长。可将抗体编码序列单独克隆到病毒的非必需区 ( 如多角体蛋白基因 ) 中， 并 置于 AcNPV 启动子 ( 如多角体蛋白启动子 ) 的控制下。
本发明抗体分子一旦重组表达后， 可通过本领域已知的任何免疫球蛋白分子纯 化方法进行纯化， 例如， 通过层析 ( 如离子交换层析， 亲和力层析， 特别是在蛋白 A 之后对 特定抗原的亲和力层析， 以及大小筛分柱层析 )、 离心、 差异溶解度或任何其它蛋白质纯化 标准技术来纯化。或者， 提高本发明抗体亲和力的优选方法可参见美国专利申请公开号 20020123057A1。
VII. 使用治疗性抗 -CD100 抗体的治疗方法
本发明方法涉及使用抗 -CD100 结合分子， 如抗体， 包括其抗原结合片段、 变体和 衍生物治疗患者， 该患者患有与表达 CD100 的细胞分泌或表达的可溶性 CD100 相关的疾病。 “表达 CD100 的细胞” 指表达 CD100 抗原的正常和恶性细胞。本领域熟知检测细胞内 CD100 表达的方法， 包括但不限于 ： PCR 技术、 免疫组化、 流式细胞术、 Western 印迹、 ELISA 等。
虽然下述讨论涉及与本发明抗 -CD100 抗体有关的各种疾病和失调的诊断和治疗 方法， 但本文所述方法也可应用于保持本发明抗 -CD100 抗体的所需特性， 例如能够特异性 结合 CD100， 如人、 小鼠或者人和小鼠的 CD100， 并具有 CD100 中和活性的抗 -CD100 抗体的 抗原结合片段、 变体和衍生物。
在一个实施方式中， 治疗包括将本发明抗 -CD100 结合分子， 如抗体或其抗原结合 片段应用于或给予患者， 或将抗 -CD100 结合分子应用于或给予由患者分离的组织或细胞 系， 其中所述患者患有疾病、 出现疾病症状或具有疾病倾向。在另一实施方式中， 治疗还应 包括将包含抗 -CD100 结合分子， 如本发明抗体或其抗原结合片段应用于或给予患者， 或将 包含抗 -CD100 结合分子的药物组合物应用于或给予由患者分离的组织或细胞系， 其中所 述患者患有疾病、 出现疾病症状或具有疾病倾向。
所述抗 -CD100 结合分子， 如本发明抗体或其结合片段可用于治疗各种恶性和非 恶性肿瘤。 “抗肿瘤活性” 指表达 CD100 的恶性细胞增殖或累积速率降低， 因此已有肿瘤或 在治疗期间出现的肿瘤的生长速率降低， 和 / 或已有的成瘤 ( 肿瘤 ) 细胞或新形成的成瘤 细胞被破坏， 因而治疗期间肿瘤总体缩小。例如， 用至少一种抗 -CD100 抗体进行治疗引起 生理响应， 例如， 血管新生减少， 这对人体中 CD100 表达细胞相关性疾病状态的治疗有益。
在一个实施方式中， 本发明涉及用作药物， 具体是用于治疗或预防癌症或用于癌 前病症或病损的抗 -CD100 结合分子， 如本发明抗体或其结合片段。在某些实施方式中， 用 抗 -CD100 结合分子， 如本发明抗体或其结合片段治疗过度表达 CD100 的癌症。在某些实施 方式中， 用抗 -CD100 结合分子， 如本发明抗体或其结合片段治疗过度表达 CD100 的头颈癌 或结肠癌。另外， 抗 -CD100 结合分子， 如本发明抗体或其结合片段还可用于抑制血管新 生， 以治疗依赖于新血管形成的病理状况， 包括肿瘤发生和黄斑变性。血管新生是复 杂多步形态发生事件， 在该期间血管重塑的主要决定因素刺激内皮细胞动态改变其细 胞 - 细胞和细胞 - 基质接触， 并定向移动以重排成成熟的血管树 (Bussolino 等， Trends Biochem Sci.22 ： 251-256(1997) ； Risau， Nature386 ： 671-674(1997) ； Jain， Nat.Med.9 ： 685-693(2003))。新血管形成是胚胎发育期间的关键步骤， 但它也在生理学和病理学状 况中出现， 如视网膜病、 类风湿性关节炎、 缺血， 特别是肿瘤生长和转移 (Carmeliet， Nat. Med.9 ： 653-660(2003))。新血管的这种病理形成过程在本文中称为 “侵袭性血管新生” 。 Basile 等， PNAS 103(24) ： 9017-9022(2006)) 证明， 从 HNSCC 细胞中排出时， CD100 刺激内 皮细胞迁移， 这一过程被 CD100- 阻断抗体和 CD100 敲减阻断。 CD100 过度表达也出现在前列 腺癌、 结肠癌、 乳腺癌和肺癌中， 提示 CD100 表达可能是各种癌促进血管新生的常用策略。
按照本发明方法， 对于恶性人细胞， 利用至少一种抗 -CD100 结合分子， 如本文另 述的抗体或其抗原结合片段提高阳性治疗响应。癌症治疗的 “阳性治疗响应” 指与这些结 合分子， 如抗体或其片段的抗肿瘤活性有关的疾病改善， 和 / 或与疾病相关症状的改善。也 就是说， 可观察到抗增殖作用、 防止肿瘤进一步生长、 肿瘤缩小、 肿瘤血管减少、 癌细胞数量 减少和 / 或一种或多种疾病相关症状减轻。因此， 例如， 疾病改善的特征可以是完全响应。 “完全响应” 指归一化至任何之前异常的射线照片研究、 骨髓和脑脊液 (CSF) 时， 不存在临床 上可检测的疾病。这种响应必须在本发明方法治疗后， 持续至少一个月。或者， 疾病改善可 归为部分响应。 “部分响应” 指不存在新病损的情况下， 所有可检测的肿瘤负担 ( 即， 对象中 存在的肿瘤细胞数量 ) 降低至少约 50％， 并持续至少一个月。这种响应仅适用于可检测的 肿瘤。
可采用筛选技术如生物发光成像， 例如， 荧光素酶成像、 骨扫描成像和肿瘤生物活 检采样包括吸取骨髓 (BMA)， 通过肿瘤形态改变 ( 即总体肿瘤负担、 肿瘤细胞计数等 ) 评估 肿瘤响应。除这些阳性治疗响应外， 用抗 -CD100 结合分子， 如抗体或其抗原结合片段治疗 对象可产生疾病相关症状改善的有益效果。例如， 所述对象可出现所谓的 B 症状， 如夜汗、 发热、 体重降低和 / 或荨麻疹减轻。
抗 -CD100 结合分子， 如本文所述抗体或其抗原结合片段也可用于治疗与 CD100 表 达细胞有关的炎性疾病和免疫系统的缺陷或失调。炎性疾病的特征是炎症和组织破坏， 或 其组合。 “抗炎活性” 指炎症减轻或阻断。 “炎性疾病” 包括任何免疫介导的炎性过程， 其中 免疫应答的启动事件或靶点包括非自身抗原， 包括例如， 同种异体抗原、 异种抗原、 病毒抗 原、 细菌抗原、 未知抗原或变应原。在一个实施方式中， 炎性疾病是外周或中枢神经系统的 炎性疾病。在另一实施方式中， 炎性疾病是关节的炎性疾病。
另外， 出于本发明目的， 术语 “炎性疾病” 包括 “自身免疫病” 。本文所用术语 “自身 免疫病” 通常应包括涉及 “自身抗原” 的免疫介导的炎性过程。在自身免疫病中， 自身抗原 引发宿主免疫应答。自身免疫病可能由针对自身抗原 ( 自体抗原 ) 的不当免疫应答产生， 这偏离了自身耐受的正常状态。通常， 用作细胞毒性分子或免疫复合物的抗体 ( 具体是但 不限于 IgG 抗体 ) 是各种自身免疫病的主要介导物， 其中许多自身免疫病可能造成失能或 威胁生命。
在一个实施方式中， 利用抗 -CD100 结合分子， 如本发明抗体或抗原结合片段治疗多发性硬化 (MS)。MS 也称为弥散性硬化症或弥散性脑脊髓炎， 是免疫系统攻击中枢神经系 统， 导致脱髓鞘的自身免疫病症。多发性硬化这个名称指神经系统中形成的疤痕 ( 硬化， 也 被称为斑块或病损 )。MS 病损通常包括接近小脑脑室、 脑干、 基底神经节和脊髓以及视神经 的白质区域。MS 导致少突胶质细胞破坏， 该细胞负责产生和维持髓鞘。MS 导致髓磷脂减少 或完全消失， 随着疾病进展， 还导致神经元横断。
神经病学症状可随着 MS 改变， 该疾病常常发展到身体和认知失能。MS 有多种形 式， 新症状独立发作 ( 复发形式 ) 或随时间缓慢累积 ( 渐进形式 )。在发作之间， 症状可能 完全消失， 但常常产生永久的神经损伤， 特别是随着疾病进展。
可采用本发明抗 -CD100 单克隆抗体， 如 MAb 2503、 MAb 67 或 MAb 76 中和 CD100， 以通过几种不同机制降低 MS 严重程度， 例如， 抗 -CD100 单克隆抗体可阻断 CD100 的免疫成 熟和活化， 以通过降低对 CNS 抗原的次级免疫应答降低复发率， 抗 -CD100 单克隆抗体可阻 断可溶性 CD100 在介导 CNS 中的少突胶质细胞凋亡中的作用， 可通过减少脱髓鞘减轻疾病 严重程度。
在一个实施方式中， 利用抗 -CD100 结合分子， 如本发明抗体或抗原结合片段治疗 关节炎。关节炎是关节的炎性疾病， 它可能由免疫系统攻击关节的自身免疫病症引起。在 某些实施方式中， 关节炎选自骨关节炎、 痛风性关节炎、 强直性脊柱炎、 牛皮癣性关节炎、 活 动性关节炎、 类风湿性关节炎、 青少年发病类风湿性关节炎、 感染性关节炎、 炎性关节炎、 脓 毒性关节炎、 变性关节炎、 破坏性关节炎 (arthritis mutilans) 和莱姆关节炎。在一个实 施方式中， 关节炎是类风湿性关节炎 (RA)。 本发明包括通过将本发明抗 -CD100 结合分子， 如 MAb 2503、 MAb 67 或 MAb 76 给 予对象， 治疗或预防关节炎的方法。 本发明方法可减轻与关节炎， 如类风湿性关节炎相关联 的疼痛、 肿胀或僵硬。本发明还涉及改善关节性能、 功能和健康状况的方法。在本发明的一 些实施方式中， 治疗导致关节炎严重性评分降低、 关节炎严重性 / 曲线下面积降低、 与关节 炎有关的组织病理参数 ( 炎症、 血管翳、 软骨损伤和骨损伤 ) 降低、 血清花生四烯酸水平降 低、 或抗 - 胶原抗体减少。在某些实施方式中， 有益或所需的临床结果包括但不限于 ： 关节 炎相关症状减轻 ； 预防关节炎 ； 关节炎发病推迟 ； 人群中关节炎发病率降低 ； 关节炎相关病 症的严重程度下降 ； 与关节炎相关的病症、 失调或疾病状态稳定化 ( 即不恶化 ) ； 与关节炎 相关的病症、 失调或疾病发病推迟或减缓 ； 与关节炎相关的病症、 失调或疾病改善 ； 与关节 炎相关的病症、 失调或疾病在可检测或不可检测水平的消退 ( 部分或完全 ) ； 或者与关节炎 相关的病症、 失调或疾病增强或改善。
本发明方法可给予患有关节炎的个体或处于关节炎发病风险中的个体。因此， 在一些实施方式中， 本发明涉及一种治疗具有正常关节、 处于临界关节炎的关节或真正有 关节炎的关节的对象的方法， 该方法包括如本文所述将本发明抗 -CD100 结合分子， 如 MAb 2503、 MAb 67 或 MAb 76 给予对象。在一些实施方式中， 本发明方法可用于在对象余生中治 疗慢性关节炎。
按照本发明方法， 利用至少一种抗 -CD100 结合分子， 如本文另述的抗体或其抗原 结合片段提高对自身免疫病症和 / 或炎性疾病的治疗或预防的阳性治疗响应。提及自身免 疫病和 / 或炎性疾病时， “阳性治疗响应” 指与这些抗体的抗炎活性、 抗血管新生活性、 抗凋 亡活性等相关的疾病改善， 和 / 或疾病相关症状的改善。也就是说， 可观察到抗增殖作用、
防止 CD100 表达细胞的进一步增殖、 减轻炎症反应， 包括但不限于 ： 炎性细胞因子、 粘着分 子、 蛋白酶、 免疫球蛋白 ( 在携带 CD100 的细胞是 B 细胞的情况下 )、 它们的组合等的分泌减 少， 抗炎蛋白产量增加， 自身反应性细胞数量减少， 免疫耐受提高， 自身反应性细胞存活被 抑制， 凋亡减少， 内皮细胞迁移减少， 自发性单核细胞迁移增加， 刺激 sCD100 或 CD100 表达 细胞介导的一种或多种症状减轻和 / 或降低。这种阳性治疗响应不仅限于给药途径， 可包 括给予供体、 供体组织 ( 如器官灌注 )、 宿主或其任何组合等。
可利用筛选技术评估临床响应， 如磁共振成象 (MRI) 扫描、 x- 射线成像、 计算机断 层成像 (CT) 扫描、 流式细胞术或荧光活化的细胞分选 (FACS) 分析、 组织学分析、 宏观病理 学分析和血液化学分析， 包括但不限于可通过 ELISA、 RIA、 色谱等检测到的改变。除这些阳 性治疗响应外， 用抗 -CD100 结合分子， 如抗体或其抗原结合片段治疗对象可产生疾病相关 症状改善的有益效果。
抗 -CD100 结合分子， 如抗体或其抗原结合片段可与至少一种其它癌症治疗联合 使用， 包括但不限于 ： 手术或外科程序 ( 如脾切除术、 肝切除术、 淋巴结切除术、 白细胞透入 (leukophoresis)、 骨髓移植等 ) ； 放疗 ； 化疗， 任选与自体骨髓移植或其它癌症治疗联用 ； 其中在抗 -CD100 结合分子， 如抗体或其抗原结合片段的治疗之前、 期间或之后给予额外癌 症治疗。因此， 联合治疗包括给予抗 -CD100 结合分子， 如本发明抗体或其抗原结合片段以 及给予另一治疗剂， 如化疗、 放疗、 其它抗癌抗体治疗、 小分子癌症治疗或基于疫苗 / 免疫 治疗的癌症治疗时， 本发明方法包括采用单独制剂或单一药物制剂共同给予， 和 / 或以任 一顺序连续给予。
本发明的抗 -CD100 结合分子， 如抗体或其结合片段可与自身免疫病和炎性疾病 的任何已知治疗联合使用， 这些已知治疗包括本领域已知可用于治疗自身免疫病和炎性疾 病， 或者已经用于或正在用于治疗自身免疫病和炎性疾病的任何药剂或药剂组合。 因此， 当 联合治疗包括给予抗 -CD100 结合分子和给予另一治疗剂时， 本发明方法包括采用单独制 剂或单一药物制剂共同给予， 和 / 或以任一顺序连续给予。在本发明的一些实施方式中， 本 文所述的抗 -CD100 抗体与免疫抑制药物或消炎药联合给予， 其中所述抗体和治疗剂可以 任何顺序依次给予， 或同时给予 ( 即， 同时或在同一时间框内 )。
在一些其它实施方式中， 本发明的抗 -CD100 结合分子， 如抗体或其抗原结合片段 可单独使用或与免疫抑制药物联合使用， 以治疗和 / 或预防类风湿性关节炎。因此， 在一 些实施方式中， 当本发明抗 -CD100 抗体用于治疗类风湿性关节炎时， 所述抗体可与合适的 免疫抑制药物联合使用。如上所述， 可采用任何方式评估治疗有效性， 包括但不限于， 通过 美国风湿病学院标准、 欧洲风湿病联盟标准或任何其它标准定义的临床响应衡量有效性。 参见例如， Felson 等， Arthritis.Rheum.38 ： 727-35(1995) 和 van Gestel 等， Arthritis. Rheum.39 ： 34-40(1996)。
在其它实施方式中， 本发明抗 -CD100 抗体可单独使用或与免疫抑制药物联合使 用以治疗和 / 或预防多发性硬化。因此， 在一些实施方式中， 当本发明抗 -CD100 抗体用于 治疗多发性硬化时， 所述抗体可与合适的免疫抑制药物联合使用。
本发明的另一实施方式是使用抗 -CD100 结合分子如抗体或其抗原结合片段诊断 性监测组织中的蛋白质水平作为临床测试步骤的一部分， 例如， 以确定给定治疗方案的功 效。 例如， 将抗体与可检测物质偶联可利于探测。 可检测物质的例子包括各种酶、 辅基、 荧光材料、 发光材料、 生物发光材料和放射性材料。合适酶的例子包括辣根过氧化物酶、 碱性磷 酸酶、 β- 半乳糖苷酶或乙酰胆碱酯酶 ； 合适的辅基复合物的例子包括链霉亲和素 / 生物素 和亲和素 / 生物素 ； 合适的荧光材料的例子包括 ： 伞形花内酯、 荧光素、 荧光素异硫氰酸酯、 罗丹明、 二氯三嗪胺荧光素、 丹磺酰氯或藻红蛋白 ； 发光材料的例子是氨基苯二酰肼 ； 生物 发光材料的例子包括 ： 萤光素酶、 萤光素和发光蛋白 ； 合适的放射性物质的例子包括 125I、 131 35 I、 S 或 3H。
VIII. 药物组合物和给药方法
本领域技术人员熟知或不难确定制备和给予本发明抗 -CD100 结合分子， 如抗体 或其抗原结合片段、 变体或衍生物的方法。抗 -CD100 结合分子， 如抗体或其抗原结合片段、 变体或衍生物的给药途径可以是 ( 例如 )， 口服、 胃肠道外、 吸入或外用。本文所用术语 “胃 肠道外” 包括例如， 静脉内、 动脉内、 腹膜内、 肌肉内、 皮下、 直肠或阴道给药。虽然所有这些 给药形式均明确落入本发明范围， 但给药形式的例子是注射液， 特别是用于静脉内或动脉 内注射或滴注。通常， 合适的注射用药物组合物可包含缓冲剂 ( 如乙酸盐、 磷酸盐或柠檬酸 盐缓冲剂 )、 表面活性剂 ( 如聚山梨酯 )， 以及任选的稳定剂 ( 如人白蛋白 ) 等。然而， 在与 本文内容相容的其它方法中， 本发明抗 -CD100 结合分子， 如抗体或其抗原结合片段、 变体 或衍生物可直接递送到不良细胞群的部位， 从而提高患病组织与治疗剂的接触。
如本文所用， 本发明抗 -CD100 结合分子， 如抗体或其抗原结合片段、 变体或衍生 物可以药学有效量给予， 用于在体内治疗 CD100 表达细胞介导的疾病， 如某些类型的癌症、 自身免疫病、 炎性疾病包括中枢神经系统 (CNS) 和周围神经系统 (PNS) 炎性疾病， 以及侵袭 性血管新生。在这方面， 应理解， 将配制本发明公开的结合分子， 以利于给药并提高活性物 质的稳定性。优选地， 本发明药物组合物包含药学上可接受的无毒无菌运载体， 如生理盐 水、 无毒缓冲液、 防腐剂等。出于本申请目的， 偶联或未偶联的抗 -CD100 结合分子， 如抗体 或其抗原结合片段、 变体或衍生物的药学有效量应被认为是足以实现有效靶点结合或足以 实现 ( 例如 ) 改善疾病或失调的症状等益处， 或足以监测物质或细胞的量。
本发明所用的药物组合物包含药学上可接受的运载体， 包括例如， 离子交换物质、 氧化铝、 硬脂酸铝、 卵磷脂， 血清蛋白质如人血清白蛋白， 缓冲物质如磷酸盐、 甘氨酸、 山梨 酸、 山梨酸钾、 饱和植物脂肪酸的部分甘油酯混合物、 水、 盐或电解质， 如硫酸鱼精蛋白、 磷 酸氢二钠、 磷酸氢钾、 氯化钠、 锌盐、 胶体二氧化硅、 三硅酸镁、 聚乙烯吡咯烷酮、 纤维素基物 质、 聚乙二醇、 羧甲基纤维素钠、 聚丙烯酸酯、 蜡、 聚乙烯 - 聚氧丙烯 - 嵌段聚合物、 聚乙二醇 和羊毛脂。
胃肠道外给药制剂包括无菌的水性或非水性溶液、 混悬液和乳液。非水性溶剂的 例子是丙二醇、 聚乙二醇、 植物油如橄榄油和可注射有机酯如油酸乙酯。水性载体包括例 如， 水、 醇 / 水溶液、 乳液或悬液， 包括盐水和缓冲介质。在本发明中， 药学上可接受的运载 体包括但不限于 ： 0.01-0.1M 并优选 0.05M 的磷酸盐缓冲液或 0.8％盐水。其它常见的胃肠 道外载体包括磷酸钠溶液、 林格右旋糖、 右旋糖和氯化钠、 乳酸林格溶液或不挥发油。静脉 内运载体包括液体和营养补充剂、 电解质补充剂， 例如基于林格右旋糖的那些物质等。 也可 包含防腐剂和其它添加剂， 例如， 抗微生物剂、 抗氧化剂、 螯合剂和惰性气体等。
更具体说， 适用于注射使用的药物组合物包括无菌水溶液 ( 水溶性时 ) 或分散 体， 以及用于临用前配制无菌注射液或分散体的无菌粉末。在这种情况下， 该组合物必须无菌， 并应该是存在注射容易性 (easy syringability) 的流体。它应该在制造和储存条 件下稳定， 并且优选在保存过程中能够抵抗微生物如细菌和真菌的污染作用。载体可以是 包含如水、 乙醇、 多元醇 ( 例如甘油、 丙二醇和液体聚乙二醇等 ) 及其合适混合物的溶剂 或分散介质。可通过使用涂覆材料如卵磷脂、 如果是分散体则保持所需粒度以及使用表 面活性剂， 来维持合适的流动性。适用于本文所述治疗方法的制剂可参见 Remington′ s Pharmaceutical Sciences(《雷明顿药物科学》 )( 马克出版公司 (Mack Publishing Co.)) 第 16 版 (1980)。
也可通过各种抗菌剂和抗真菌剂， 如对羟基苯甲酸酯类、 氯丁醇、 苯酚、 抗坏血酸、 硫柳汞等实现防止微生物的作用。在许多情况下， 组合物中优选包含等张剂， 例如糖、 多元 醇如甘露醇、 山梨醇或氯化钠。组合物中可包含延迟吸收的试剂如单硬脂酸铝和明胶以延 长可注射组合物的吸收。
在任何情况下， 可按照需要， 将所需量的活性化合物 ( 如抗 -CD100 抗体或其抗原 结合片段、 变体或衍生物， 本身或与其它活性剂联合 ) 掺入含有本文所列的一种成分或多 种成分的组合的合适溶剂， 然后进行过滤除菌制得无菌注射溶液。 通常， 将活性活化物掺入 含有碱性分散介质和上述其它所需成分的无菌载体中制备分散体。 当制备无菌注射液制备 所需的无菌粉末时， 优选的制备方法是真空干燥和冷冻干燥， 由之前无菌过滤的溶液得到 活性组分和任何其它所需组分的粉末。注射制剂在无菌条件下按照本领域已知方法加工， 装入容器， 如安瓿、 袋、 瓶、 注射器或小管中， 并密封。另外， 可包装该制剂， 并以药盒形式出 售， 如美国专利申请系列号 09/259,337 所述。这类制品优选具有标签或标贴， 表明相关组 合物可用于治疗患有或倾向于患有疾病或失调的对象。
胃肠道外制剂可以是单一推注剂量， 输注或起始推注剂量， 随后给予维持剂量。 这 些组合物可以特定的固定间隔或可变间隔给予， 例如每天一次， 或 “按需” 给予。
本发明的某些药物组合物可以用可接受的剂型口服给予， 包括例如， 胶囊、 片剂、 水性悬液或溶液。某些药物组合物也可通过鼻喷雾或吸入方式给予。这类组合物可制备成 盐水溶液， 其中采用苄醇或其它合适的防腐剂、 吸收促进剂以提高生物利用度， 和 / 或采用 其它常规的增溶剂或分散剂。
可与载体材料组合后得到单一剂量形式的抗 -CD100 结合分子， 如抗体或其片段、 变体或衍生物的量可以根据治疗时宿主以及具体的给药模式而变化。 该组合物可作为单一 剂量、 多个剂量或在确定时间段通过输注给予。也可调整给药方案， 以提供最优所需响应 ( 例如， 治疗或预防响应 )。
在本发明范围内， 本发明抗 -CD100 抗体或其抗原结合片段、 变体或衍生物可按照 上述治疗方法给予人或其它动物， 其给予量足以产生疗效。本发明抗 -CD100 抗体， 或其抗 原结合片段、 变体或衍生物可以常规剂型给予所述人或其它动物， 该剂型是通过已知技术 将本发明抗体与常规的药学上可接受的运载体或稀释剂混合制备的。 本领域技术人员应认 识到， 药学上可接受的运载体或稀释剂的形式和特点是由混合的活性成分含量、 给药途径 和其它熟知变量决定的。本领域技术人员还应理解， 包含一种或多种抗 -CD100 结合分子， 如本发明抗体或其抗原结合片段、 变体或衍生物的混合物可能被证明特别有效。
“治疗有效剂量或治疗有效量” 或者 “有效量” 指给予时， 在患有待治疗疾病患者的 治疗中带来阳性治疗响应的抗 -CD100 结合分子， 如抗体或其抗原结合片段的用量。用于治疗 CD100 表达细胞介导的疾病， 例如某些类型的癌症， 如头颈癌、 前列腺 癌、 结肠癌、 乳腺癌和肺癌 ； 自身免疫病， 如关节炎、 多发性硬化、 炎性疾病包括中枢神经系 统 (CNS) 和周围神经系统 (PNS) 炎性疾病 ； 和侵袭性血管新生时， 本发明组合物的治疗有效 剂量取决于多种不同因素， 包括给药方式、 目标部位、 患者生理状态、 患者是人或是动物、 给 予的其它药物和该治疗是预防性治疗或是治疗性治疗。 通常， 患者是人， 但也可治疗非人哺 乳动物， 包括转基因哺乳动物。 可采用本领域技术人员已知的常规方法确定治疗剂量， 以优 化安全性和效能。
在给出本发明公开内容的情况下， 本领域普通技术人员无需过多实验即可确定至 少一种抗 -CD100 结合分子， 如抗体或其结合片段的给予量。影响给药方式以及至少一种 抗 -CD100 结合分子， 如抗体或其抗原结合片段、 变体或衍生物各自用量的因素包括但不限 于： 接受治疗的个体的疾病严重程度、 病史、 年龄、 身高、 体重、 健康状况和身体状况。类似 地， 抗 -CD100 结合分子， 如抗体或其片段、 变体或衍生物的给予量取决于给药方式、 对象是 否接受单一剂量或多剂量的此种药剂。
本发明还提供抗 -CD100 结合分子， 如抗体或其抗原结合片段、 变体或衍生物在制 备治疗自身免疫病和 / 或炎性疾病的药物中的应用， 所述疾病包括例如， 关节炎、 多发性硬 化、 CNS 和 PNS 炎性疾病或癌症。
本发明还提供抗 -CD100 结合分子， 如本发明抗体或其抗原结合片段、 变体或衍生 物在制备治疗对象的自身免疫病和 / 或炎性疾病或癌症的药物中的应用， 其中所述药物用 于已用至少一种其它治疗预先治疗的对象。 “预先治疗” 或 “预治疗” 指该对象在接受包含 抗 -CD100 结合分子， 如抗体或其抗原结合片段、 变体或衍生物的药物之前， 接受过一种或 多种其它治疗 ( 例如， 已用至少一种其它癌症疗法治疗 )。 “预先治疗” 或 “预治疗” 包括在 用包含抗 -CD100 结合分子， 例如， 本文所述的单克隆抗体 2503 或其抗原结合片段、 变体或 衍生物的药物开始治疗前 2 年内、 18 个月内、 1 年内、 6 个月内、 2 个月内、 6 周内、 1 个月内、 4 周内、 3 周内、 2 周内、 1 周内、 6 天内、 5 天内、 4 天内、 3 天内、 2 天内、 或者甚至 1 天内， 用至少 一种其它疗法治疗对象。 对象不一定是一种或多种在先疗法预治疗的响应者。 因此， 接受包 含抗 -CD100 结合分子， 如抗体或其抗原结合片段、 变体或衍生物的药物的对象可以对在先 疗法的预治疗或者对一种或多种在先疗法 ( 预治疗包括多种疗法时 ) 有响应或无响应 ( 例 如， 癌症为难治性癌症 )。在接受包含抗 -CD100 结合分子， 如抗体或其抗原结合片段、 变体 或衍生物的药物之前， 对象可能已接受预治疗的其它癌症疗法的例子包括但不限于 ： 手术 ； 放疗 ； 化疗， 任选与自体骨髓移植联用， 其中合适的化疗药包括但不限于前述药物 ； 其它抗 癌单克隆抗体疗法 ； 小分子癌症治疗， 包括但不限于 ： 本文前述小分子 ； 基于疫苗 / 免疫治 疗的癌症治疗 ； 类固醇疗法 ； 其它癌症疗法 ； 或其任何组合。
IX. 诊断
本发明还提供可用于诊断 CD100 表达细胞介导的疾病的诊断方法， 所述疾病包括 例如某些类型的癌症、 自身免疫病、 炎性疾病， 包括例如关节炎、 多发性硬化、 中枢神经系 统 (CNS) 和周围神经系统 (PNS) 炎性疾病以及侵袭性血管新生， 所述方法包括测定来自个 体的组织或其它细胞或体液中 CD100 蛋白或转录物的表达水平， 并将测定的表达水平与正 常组织或体液中的标准 CD100 表达水平作比较， 与标准水平相比表达水平上升表明存在疾 病。通 过 本 领 域 技 术 人 员 已 知 的 经 典 免 疫 组 织 学 方 法， 可 利 用 本 发 明 抗 -CD100 抗 体 及 其 抗 原 结 合 片 段、 变 体 和 衍 生 物 测 定 生 物 样 品 中 的 CD100 蛋 白 水 平 ( 参 见 例 如 Jalkanen 等， J.Cell.Biol.101 ： 976-985(1985) ； Jalkanen 等， J.Cell Biol.105 ： 3087-3096(1987))。用于检测 CD100 蛋白表达的其它基于抗体的方法包括免疫实验， 如酶 联免疫吸附实验 (ELISA)、 免疫沉淀或蛋白质印迹。合适的实验在本文中另有详述。
“测定 CD100 多肽表达水平” 指对第一生物样品中的 CD100 多肽水平以直接 ( 例 如， 通过测定或估计绝对蛋白质水平 ) 或相对 ( 例如， 通过与第二生物样品中的疾病相关多 肽水平作比较 ) 方式进行定性或定量测定或估计。优选地， 测定或估计第一生物样品中的 CD100 多肽表达水平， 并与标准 CD100 多肽水平作比较， 该标准水平取自未患该疾病的个体 所得的第二生物样品或通过未患该疾病的群体的平均水平确定。本领域技术人员应理解， 一旦 “标准” CD100 多肽水平已知， 可以重复地用作比较标准。
“生物样品” 指由可能表达 CD100 的个体、 细胞系、 组织培养物或其它细胞来源获得 的任何生物样品。从哺乳动物获得组织活检样品和体液的方法是本领域熟知的。
X. 免疫实验
可通过本领域的任何已知方法测定本发明抗 -CD100 抗体或其抗原结合片段、 变 体或衍生物的免疫特异性结合。可使用的免疫实验包括但不限于， 使用如下技术的竞争和 非竞争实验系统， 如蛋白质印迹、 放射性免疫实验、 ELISA( 酶联免疫吸附实验 )、 “夹心” 免疫 实验、 免疫沉淀实验、 沉淀素反应、 凝胶扩散沉淀素反应、 免疫扩散实验、 凝集实验、 补体结 合实验、 免疫放射实验、 荧光免疫实验、 蛋白 A 免疫实验等等。这类实验是本领域公知的常 规实验 ( 参见例如， Ausubel 等编， (1994)， Current Protocols in Molecular Biology( 《新 编分子生物学实验指南》 )， 纽约约翰韦利父子公司 (John Wiley&Sons， Inc.， NY)， 第 1 卷， 通过引用全文纳入本文 )。下面简述示范性免疫测定 ( 但不限于此 )。
免疫沉淀方案通常包括用补充有蛋白质磷酸酶和 / 或蛋白酶抑制剂 ( 如 EDTA、 PMSF、 抑肽酶、 钒酸钠 ) 的裂解缓冲液如 RIPA 缓冲液 (1％ NP-40 或曲通 X-100、 1％脱氧胆 酸钠、 0.1％ SDS、 0.15M NaCl、 0.01M 磷酸钠 pH 7.2， 1％特斯乐 (Trasylol)) 裂解细胞群， 将 感兴趣的抗体加入该细胞裂解物， 4℃培育一段时间 ( 如 1-4 小时 )， 将蛋白 A 和 / 或蛋白 G 琼脂糖珠加入该细胞裂解物， 4℃培育约一小时或更久， 用裂解缓冲液洗珠， 并将珠子重悬 于 SDS/ 样品缓冲液。可通过， 例如蛋白质印迹分析评估感兴趣抗体免疫沉淀特定抗原的 能力。本领域技术人员应认识到， 可改变参数以提高抗体抗原的结合和降低背景 ( 如， 用琼 脂糖珠预先清洁细胞裂解物 )。有关免疫沉淀方案的进一步讨论参见例如， Ausubel 等编， (1994)， (Current Protocols in Molecular Biology(《新编分子生物学实验指南》 )， 纽约 约翰韦利父子公司 (John Wiley&Sons， Inc.， NY)， 第 1 卷， 10.16.1。
蛋白质印迹分析通常包括 ： 制备蛋白质样品， 用聚丙烯酰胺凝胶电泳蛋白质样品 ( 如， 根据抗原分子量采用 8％ -20％ SDS-PAGE)， 将蛋白质样品从聚丙烯酰胺凝胶中转移到 膜如硝酸纤维、 PVDF 或尼龙膜上， 在封闭缓冲液 ( 如， 含有 3％ BSA 或脱脂奶粉的 PBS) 中封 闭该膜， 用洗涤缓冲液 ( 如 PBS- 吐温 20) 洗涤该膜， 用稀释于封闭缓冲液的第一抗体 ( 感 兴趣抗体 ) 封闭该膜， 用洗涤缓冲液洗涤该膜， 用稀释于封闭缓冲液的偶联有酶底物 ( 如辣 根过氧化物酶或碱性磷酸酶 ) 或放射性分子 ( 如 32P 或 125I) 的第二抗体 ( 识别第一抗体， 如抗人抗体 ) 封闭该膜， 用洗涤缓冲液洗涤该膜， 和检测抗原的存在。本领域技术人员了解可改变参数以提高检测到的信号和降低背景噪声。 有关蛋白质印迹方案的进一步讨论参见 例如， Ausubel 等编， (1994)， Current Protocols in Molecular Biology(《新编分子生物 学实验指南》 )， 纽约约翰韦利父子公司 (John Wiley&Sons， Inc.， NY)， 第 1 卷， 10.8.1。
ELISA 包括制备抗原， 用该抗原包被 96 孔微量滴定板的孔， 将偶联于可检测化合 物如酶底物 ( 如， 辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶 ) 的感兴趣抗体加入孔中， 培育一段时间并 检测抗原的存在。 在 ELISA 中， 感兴趣抗体不必偶联于可检测化合物 ； 而可将偶联于可检测 化合物的第二抗体 ( 识别感兴趣抗体 ) 加入孔中。另外， 除了用抗原包被孔外， 还可用抗体 包被孔。 在这种情况下， 可加入偶联于可检测化合物的第二抗体， 然后向包被孔中加入感兴 趣抗原。 本领域熟练技术人员了解可对参数进行修改以提高检测信号并了解本领域所知的 其它对 ELISA 的改变。有关 ELISA 的进一步讨论参见例如， Ausubel 等编， (1994)， Current Protocols in Molecular Biology(《新编分子生物学实验指南》 )， 纽约约翰韦利父子公司 (John Wiley&Sons， Inc.， NY)， 第 1 卷， 11.2.1。
可通过竞争性结合实验测定抗体与抗原的结合亲和力和抗体 - 抗原相互作用的 解离速率。竞争性结合实验的一个例子是放射性免疫实验， 包括在含量递增的未标记抗原 3 125 存在下用感兴趣抗体培育标记抗原 ( 如 H 或 I) 和检测结合于标记抗原的抗体。可通过 Scatchard 作图分析的数据确定感兴趣的抗体与特定抗原的亲和力和结合解离速率。也可 利用放射性免疫实验确定与第二抗体的竞争。在这种情况下， 在含量递增的未标记第二抗 3 125 体存在下， 将抗原与偶联于标记化合物 ( 如 H 或 I) 的感兴趣抗体一起培育。
此外， 本发明抗 -CD100 抗体， 或其抗原结合片段、 变体或衍生物可通过组织学方 法使用， 例如用于免疫荧光、 免疫电子显微术或非免疫实验， 用于原位检测 CD100 蛋白或者 其保守变体或肽片段。 原位检测可通过以下步骤进行 ： 从患者中取出组织学样品， 向其施加 标记的抗 -CD100 抗体或其抗原结合片段、 变体或衍生物， 优选通过将标记抗体 ( 或片段 ) 覆盖在生物样品上施加。通过使用这一方法， 可能不仅确定 CD100 蛋白或者其保守变体或 肽片段的存在， 还可确定其在所检测组织中的分布。 使用本发明时， 本领域普通技术人员不 难构想到， 可改变各种组织学方法中的任何方法 ( 如染色步骤 )， 以实现这种原位检测。
CD100 基因产物或其保守变体或肽片段的免疫实验和非免疫实验通常包括 ： 在能 够结合 CD100 或其保守变体或肽片段的可检测标记的抗体存在下培育样品， 例如生物学液 体、 组织提取物、 新收获的细胞或细胞培养物中培育细胞的裂解物， 和通过本领域熟知的任 何技术检测结合抗体。
生物样品可接触或固定于能够固定细胞、 细胞颗粒或可溶性蛋白质的固相支持物 或运载体如硝基纤维素或其它固体支持物。 然后， 可用合适的缓冲液洗涤该支持物， 然后用 可检测标记的抗 -CD100 抗体或其抗原结合片段、 变体或衍生物进行处理。然后， 第二次用 缓冲液洗涤固相支持物， 以去除未结合的抗体。任选地， 随后标记抗体。然后， 可通过常规 方式检测固体支持物上结合的标记的量。
“固相支持物或运载体” 指能够结合抗原或抗体的任何支持物。熟知的支持物或 运载体包括玻璃、 聚苯乙烯、 聚丙烯、 聚乙烯、 右旋糖苷、 尼龙、 淀粉酶、 天然和改性纤维素、 聚丙烯酰胺、 辉长岩和磁铁矿。 出于本发明目的， 运载体的性质可以是某种程度上可溶或不 溶。 支持物材料可具有基本上任何可能的结构构型， 只要偶联的分子能够结合抗原或抗体。 因此， 支持物构型可以是如珠的球形或如试管内表面或杆状物外表面的圆柱形。 或者， 该表面可以是平坦表面， 例如片层、 测试条等。优选的支持物包括聚苯乙烯珠。本领域技术人员 了解或能够用常规实验确定许多适合结合抗体或抗原的其它运载体。
可以按照熟知方法确定给定批次的抗 -CD100 抗体或其抗原结合片段、 变体或衍 生物的结合活性。本领域技术人员能够利用常规实验确定每次测定的操作和优化实验条 件。
有各种方法可用于测定抗体 - 抗原相互作用的亲和力， 但测定速率常数的较少。 大部分方法依赖于标记抗体或抗原， 其不可避免地使常规测定复杂化并在测定量中引入不 确定性。
与测定抗体 - 抗原相互作用亲和力的常规方法相比， 用 进行的表面 等离振子共振 (SPR) 提供若干优点 ： (i) 无需标记抗体或抗原 ； (ii) 抗体不需要事先纯化， 细胞培养物上清液可直接使用 ； (iii) 实时测定， 能够快速半定量地比较不同单克隆抗体 的相互作用， 能够和足以用于许多评价目的 ； (iv) 生物特异性表面可再生， 使得可以容易 地在相同条件下比较一系列不同单克隆抗体 ； (v) 分析步骤完全自动化， 大量测定可以在 没有操作人员干预的情况下进行。BIAapplications Handbook(《BIA 应用手册》 )， AB 版 (1998 再版 )， 编号 BR-1001-86 ； BIAtechnology Handbook( 《BIA 技术手册》 )， AB 版 (1998 再版 )， 编号 BR-1001-84。 基于 SPR 的结合研究需要将结合对的一 个成员固定到传感器表面上。固定的结合伙伴称为配体。溶液中的结合伙伴称为分析物。 在某些情况下， 配体通过结合于被称为捕获分子的另一固定分子间接地连接于表面。 SPR 响 应反映出随着分析物的结合或解离， 检测器表面上质量浓度的改变。
根据 SPR， 实时 测定直接监测正在发生的相互作用。该技术非常适合 测定动力学参数。比较亲和力排序简单易行， 动力学和亲和力常数都可获自传感图数据。
以独立脉冲在配体表面上注射分析物时， 所得的传感器图可分成三个基本相 ： (i) 样品注射期间分析物与配体的结合 ； (ii) 样品注射期间平衡或稳态， 其中分析物结合速率 与从复合物解离的速率达到平衡 ； (iii) 缓冲液流动期间分析物与表面解离。
结合和解离相提供有关分析物 - 配体相互作用的动力学的信息 (ka 和 kd 是复合物 形成和解离的速率， kd/ka ＝ KD)。平衡相提供有关分析物 - 配体相互作用亲和力 (KD) 的信 息。
BIA 评估软件是综合的曲线拟合工具， 其采用数值积分和全局拟合算法。 通过对数 据进行适当的分析， 可由简单 研究获得相互作用的分离速率和亲和力常数。 可 通过此种技术测定的亲和力范围非常宽泛， 从 mM 级到 pM 级。
表位特异性是单克隆抗体的重要特征。与采用放射性免疫实验、 ELISA 或其它表 面吸附方法的常规技术不同， 用 进行表位作图不需要标记或纯化的抗体， 并允 许用若干单克隆抗体的序列进行多位点特异性测试。此外， 大量分析可自动进行。
逐对结合实验测试两种 MAb 同时结合同一抗原的能力。针对单独表位的 MAb 将单 独结合， 而针对相同或紧密相关表位的 MAb 将互相干扰结合。 采用 进行的这些 结合实验简单易行。
例如， 可使用捕获分子结合第一种 Mab， 随后依次加入抗原和第二种 MAb。传感器 图将揭示 ： (1) 多少抗原结合第一 Mab， (2) 第二 MAb 结合表面连接抗原的程度， (3) 如果第 二 MAb 不结合， 逆转逐对测试的顺序是否会改变结果。肽抑制是用于表位作图的另一项技术。抗原的一级序列已知时， 这种方法可补充 逐对抗体结合研究， 并可将功能表位与结构特征相关联。测定肽或抗原片段对不同 MAb 与 固定抗原的结合的抑制作用。 假定干扰给定 MAb 的结合的肽与该 MAb 限定的表位结构相关。
除非另有说明， 本发明的实施将采用细胞生物学、 细胞培养、 分子生物学、 转基 因生物学、 微生物学、 重组 DNA 和免疫学的常规技术， 它们均在本领域技术范围内。这些 技 术 在 文 献 中 已 有 充 分 描 述。 参 见 例 如， Sambrook 等 编 (1989)Molecular Cloning A Laboratory Manual(《分子克隆 ： 实验室手册》 )( 第 2 版 ； 冷泉港实验室出版社 (Cold Spring Harbor Laboratory Press)) ； Sambrook 等 编 (1992)Molecular Cloning ： A Laboratory Manual(《分子克隆 ： 实验室手册》 ()， ( 纽约州的冷泉港实验室出版社 (Cold Springs Harbor Laboratory， NY)) ； D.N.Glover 编， (1985)DNA Cloning(《DNA 克隆》 )， 第 I 和 II 卷 ； Gait 编 (1984)Oligonucleotide Synthesis(《寡核苷酸合成》 )； Mullis 等， 美国专利号 4,683,195 ； Hames 和 Higgins 编 (1984)Nucleic Acid Hybridization(《核酸 杂交》 )； Hames 和 Higgins 编 (1984)Transcription And Translation(《转录和翻译》 )； Freshney(1987)Culture Of Animal Cells(《动物细胞培养》 )(ARL 公司 (Alan R.Liss， Inc.)) ； Immobilized Cells And Enzymes(《固 定 的 细 胞 和 酶》 )(IRL 出 版 社 )(1986) ； Perbal(1984)A Practical Guide To Molecular Cloning(《分子克隆实践指南》 )； 论文， Methods In Enzymology(《酶学方法》 )( 学术出版社公司 (Academic Press， Inc.)， 纽约 州)； Miller 和 Calos 编 (1987)Gene Transfer Vectors For MammalianCells( 《哺乳动物 细胞的基因转移载体》 )( 冷泉港实验室出版社 (Cold Spring Harbor Laboratory)) ； Wu 等 编， Methods In Enzymology(《酶学方法》 )， 第 154 和 155 卷 ； Mayer 和 Walker 编 (1987) Immunochemical Methods In Cell And Molecular Biology( 《细胞和分子生物学中的免疫 化学方法》 )( 伦敦的学术出版社 (Academic Press， London)) ； Weir 和 Blackwell 编 (1986) Handbook Of Experimental Immunology(《实验免疫学手册》 )， 第 I-IV 卷 ； Manipulating the Mouse Embryo( 《小鼠胚胎操作》 )， 纽约州冷泉港的冷泉港实验室出版社 (Cold Spring Harbor Laboratory， Cold Spring Harbor， N.Y.)， (1986) ； 和 Ausubel 等 (1989)Current Protocols in Molecular Biology(《新编分子生物学实验指南》 )( 马里兰州巴尔的摩的 约翰韦利父子公司 (John Wiley&Sons， Baltimore， Md.))。
抗体工程的通用方法可参见 Borrebaeck 编辑 (1995)Antibody Engineering( 《抗 体工程》 )( 第 2 版 ； 牛津大学出版社 (Oxford Univ.Press))。 蛋白质工程的通用方法可参见 Rickwood 等编 (1995)Protein Engineering， A Practical Approach( 《蛋白质工程， 实践方 法》 )， ( 英国牛津的牛津大学出版社的 IRL 出版公司 (IRL Press at Oxford Univ.Press， Oxford， Eng.))。抗体和抗体 - 半抗原结合的总体方法可参见 ： Nisonoff(1984)Molecular Immunology(《分子免疫学》 )( 第 2 版 ； 马萨诸塞州桑德兰的辛奥尔联合公司 (Sinauer Associates， Sunderland， Mass.)) ； 和 Steward(1984)Antibodies， Their Structure and Function(《抗体的结构和功能》 )(Chapman 和 Hall， 纽约州纽约市 )。此外， 本领域已知 且没有具体描述的免疫学标准方法通常按照下述文献所述进行 ： Current Protocols in Immunology(《新编免疫学实验指南》 )， 纽约州的约翰韦利父子公司 (John Wiley&Sons) ； Stites 等编 (1994)， Basic and Clinical Immunology(《基础和临床免疫学》 )( 第 8 版 ； Appleton 和 Lange， 康涅狄格州诺沃克 (Norwalk， Conn.)) 和 Mishell 和 Shiigi( 编 )(1980)Selected Methods in Cellular Immunology(《细胞免疫学中的所选方法》 )( 纽约州的 W.H. 弗里曼公司 (W.H.Freeman and Co.， NY))。
列 出 免 疫 学 通 用 原 理 的 标 准 参 考 文 献 包 括： Current Protocols in Immunology(《新编免疫学实验指南》 )， 纽约州的约翰韦利父子公司 (John Wiley&Sons) ； Klein(1982)J.， Immunology ： The Science of Self-Nonself Discrimination(《免 疫 学： 自身 - 非自身区别的科学》 )( 纽约州的约翰韦利父子公司 ) ； Kennett 等编 (1980) Monoclonal Antibodies， Hybridoma ： A New Dimension in Biological Analyses(《单 克隆抗体， 杂交瘤 ： 生物学分析的新领域》 )( 纽约州普莱努公司 (Plenum Press， NY)) ； Campbell(1984)″ Monoclonal Antibody Technology″ in Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology″ (《生化和分子生物学实验室技术》 中的 “单克 隆抗体技术” )， Burden 等编 ( 阿姆斯特丹的埃尔斯威尔公司 (Elsevere， Amsterdam)) ； Goldsby 等 编 (2000)Kuby Immunnology(《酷 比 免 疫 学》 )( 第 4 版 ； H. 弗 里 曼 公 司 (H.Freemand&Co.)) ； Roitt 等 (2001)Immunology(《免疫学》 )( 第 6 版 ； 伦敦 ： 摩兹比公 司 (Mosby)) ； Abbas 等 (2005)Cellular and Molecular Immunology(《细胞和分子免疫 学》 )( 第 5 版 ； 埃尔斯威尔健康科学分公司 (Elsevier Health Sciences Division)) ； Kontermann 和 Dubel(2001)Antibody Engineering( 《抗体工程》 )( 施普林格公司 (Springer Verlan)) ； Sambrook 和 Russell(2001)Molecular Cloning ： ALaboratory Manual(《分 子 克隆 ： 实验室手册》 )( 冷泉港出版社 (Cold Spring Harbor Press)) ； Lewin(2003)Gene VIII(《基因 VIII》 )( 普伦蒂斯霍尔出版社 (Prentice Hall)2003) ； Harlow 和 Lane(1988) Antibodies ： A Laboratory Manual(《抗体 ： 实验室手册》 )( 冷泉港出版社 ) ； Dieffenbach 和 Dveksler(2003)PCRPrimer(《PCR 引物》 )( 冷泉港出版社 )。
将上文中引用的所有参考文献以及其中引用的参考文献全文纳入本文作参考。
通过说明的方式、 而非限制的方式提供以下实施例。 实施例 实施例 1
CD100 特异性抗体的选择和表征
利用下述方法产生识别人、 猴和鼠 CD100 的小鼠抗 -CD100 抗体。
“品系 1” 细胞系衍生自 BALB/c 小鼠的自发肺肿瘤。本发明人以前证明， 用转染外 源 cDNA 的活的品系 1 细胞注射 BALB/c 小鼠是诱导免疫应答的有效途径 ( 数据未公开 )。 用编码全长人 CD100 cDNA(SEQ ID NO ： 23) 的表达质粒转染品系 1 细胞系。由转染细胞系 分离表达人 CD100 的稳定细胞系 ( 品系 1.CD100)。用完全弗氏佐剂 (CFA) 乳化的纯化的小 鼠 CD100- 组氨酸 ( 具有用于纯化的 C- 末端 6X 组氨酸标记的小鼠 CD100 的胞外结构域 ) 初 免 CD100 缺陷小鼠 (BALB/c 背景， 参见 Kumanogoh 等， J.Immunol.169 ： 1175-1181(2002))。 进行该免疫后一周， 该小鼠肌肉内 (i.m.) 注射 200,000 个活的品系 1.CD100 细胞。注射 品系 1.CD1009 天后， 处死小鼠， 收集脾脏， 按照标准程序与 P3X63Ag8.653 融合伙伴 (ATCC# CRL-1580) 融合产生杂交瘤。通过 ELISA 筛选结合人和小鼠 CD100 的杂交瘤克隆。具体说， 用杂交瘤技术制备 MAb 67 特异性的杂交瘤细胞系。(Kohler 等， Nature 256 ： 495(1975) ； Kohler 等， Eur.J.Immunol.6 ： 511(1976) ； Kohler 等， Eur.J.Immunol.6 ： 292(1976) ；
Hammerling 等， Monoclonal Antibodies and T-Cell Hybridomas(《单克隆抗体和 T 细胞 杂交瘤》 )， 纽约州埃尔斯威尔公司 (Elsevier， N.Y.)， 第 571-681 页 (1981))。产生一大类 小鼠 CD100 特异性抗体。这些抗体中， 大多数以高亲和力结合人 CD100。两种杂交瘤， 即克 隆 67-2 和 76-1， 产生对小鼠和人 CD100 均显示出高亲和力的单克隆抗体 ( 分别称为 MAb 67 和 MAb 76)( 见表 2)。
表 2. 小鼠抗 -CD100MAb 的亲和力测定
*用 表面等离振子共振技术测定亲和力。
抗体交叉阻断 ELISA 显示出， MAb 67 和 MAb 76 识别 CD100 上的不同表位。此外， MAb 67 和 76 识别的表位与单独产生的鼠抗 - 人 CD100 抗体 BD16 识别的表位不同 ( 如 US 2008/0219971A1 所述 )。因此， 产生两种单独的小鼠抗 -CD100 抗体 MAb 76( 参见 SEQ ID NO ： 25-40) 和 MAb 67( 参见 SEQ ID NO ： 3-8 ； 10 ； 11-16 ； 18 ； 20 和 22)。
实施例 2
MAb 67 和 76 阻断小鼠和人 CD100 的体外活性
在荧光阻断实验中， 筛选 CD100 特异性抗体抑制 CD100 结合的能力。用于检测 CD100 特异性抗体是否阻断 CD100 与丛蛋白 B1 结合的方法见图 1。用编码 CD100 受体 ： 丛 蛋白 B1 的 cDNA 转染人 293 细胞。选择表达丛蛋白 B1 的稳定细胞系 (293/ 丛蛋白 )。利 用生物素偶联的组氨酸标签特异性单克隆抗体和链霉亲和素 -APC， 通过流式细胞术检测结 合细胞表面上丛蛋白 B1 的 CD100- 组氨酸。检测的抗 -CD100MAb 能够阻断 CD100 与丛蛋白 B1 结合时， 在细胞上检测到较少的 CD100- 组氨酸， 导致荧光较弱。
40 纳克 (ng) 人或小鼠 CD100- 组氨酸 (C- 末端组氨酸标签 ) 单独培育， 或与不同 浓度的抗 -CD100MAb 一起于 4℃培育过夜。 第二天早晨， 将 (1) 仅 CD100 或 (2) 用抗 -CD100 MAb(67 或 76) 预孵育的 CD100 与 293/ 丛蛋白细胞混合， 冰上孵育 30 分钟。通过丛蛋白 B1 结合细胞的 CD100 用生物素化多克隆兔抗 - 组氨酸 MAb、 然后是链霉亲和素 -APC 进行检测， 通过流式细胞术分析细胞。结果表明， 中和 CD100 导致荧光较弱。具体说， 与只有 CD100 相 比， 用 MAb 67 或 MAb 76 预孵育 CD100 导致荧光较弱 ( 图 2)。抗 -CD100 MAb 67 或 76 的浓 度从 0.156μg/ml 提高到 0.625μg/ml 导致荧光进一步减弱。也观察到对人 CD100 的类似 阻断 ( 数据未显示 )。因此， 这些结果显示， MAb 67 和 MAb 76 均能够阻断人和小鼠 CD100 与丛蛋白 B1 结合。
已证明， CD100/ 丛蛋白 B1 信号转导能通过诱导肌动蛋白丝重组织诱导细胞从胞 外基质脱附和细胞破坏 ( 参见 Kruger 等， Nature Reviews Molecular Cell Biology 6 ： 789-800(2005))。利用在结合于胞外基质后测定细胞脱附的异源实验确定抗 -CD100 抗体 是否可阻断 CD100 诱导的 293/ 丛蛋白细胞从纤连蛋白包被平板上脱附。
在细胞脱附实验中， 将 293/ 丛蛋白细胞 ( 通常培养为悬浮细胞系 ) 以 40,000 个 细胞 / 孔的密度接种于纤连蛋白包被的 96 孔板中， 使其贴壁过夜。2μg/ml 小鼠 CD100- 组 氨酸 (C- 末端组氨酸标签 ) 单独或与不同浓度的抗 -CD100 MAb(67 或 76) 一起于 4℃培育
6 小时。然后， 使 CD100 样品回复至室温， 然后加入 293/ 丛蛋白细胞。利用 CD100 或已用抗 体在 37℃预孵育 30 分钟的 CD100 处理细胞， 用 PBS 洗涤两次， 用结晶紫染色 15 分钟。然 后， 用 PBS 洗涤细胞两次并干燥。在扫描仪上获得图像作记录。然后， 在室温下用 100μl 33％冰醋酸溶解结晶紫， 将其吸移到新平板中。在 570nm 读出吸光度。CD100 引起平板贴附 细胞的数量减少， 因此吸光度降低， 而中和 CD100 导致吸光度增加。
如图 3 所示， 与同种型对照相比， MAb 67 和 MAb 76 均能够阻断小鼠 CD100 介导的 细胞脱附并提高吸光度。类似地， 两种 MAb 均能够阻断人 CD100 介导的细胞脱附 ( 数据未 显示 )。
MAb 67 和 76 阻断 CD100 与细胞表面丛蛋白 B1 结合， 并诱导 293/ 丛蛋白细胞从纤 连蛋白包被平板上脱附。上述体外功能实验的结果证明， MAb 67 和 MAb 76 均能够在体外 阻断小鼠和人 CD100 的功能。
实施例 3
在小鼠疾病模型中评价抗 -CD100 单克隆抗体
在 SJL EAE 动物模型中体内检测抗 -CD100 中和性单克隆抗体 (76 和 67)。复发性 实验性自身免疫脑脊髓炎 (R-EAE) 是 CD4+T 细胞 - 介导的疾病， 其特征是中枢神经系统内 的炎症和脱髓鞘。在 SJL 小鼠中， 用蛋白脂质蛋白质的肽表位 (PLP139-151)(HSLGKWLGHPDKF ； SEQ ID NO ： 24) 免疫可诱导 R-EAE。 这一模型的特征是中度至重度的急性瘫痪期， 随后是消 退和后续复发。用表 3 所列的评分方法对疾病严重程度进行评分。
表 3.EAE 临床体征的评价
用 CFA 配制的 100μg PLP139-151 免疫 SJL 小鼠。在第 0 天给予百日咳毒素， 48 小时 后再次给予。用 30mg/kg MAb 76、 67 或同种型对照抗体治疗小鼠， 从第 0 天开始每周两次， 或从第 7 天开始每周一次。从 EAE 诱导后从第 10 天开始对 EAE 临床体征进行评分。
如图 4A 所示， 与小鼠 IgG 对照相比， 在 SJL 小鼠中用 MAb 76 或 MAb 67 治疗能降 低 EAE 严重程度。在第 21 天和研究结束之间， MAb 76 和 67、 1X/ 周和 2x/ 周的组平均评 分 (GMS) 的降低百分数见图 4B。如图 4B 所示， MAb 76(1X/ 周 ) 对 GMS 的抑制百分数为 35-40％ ； MAb 67(1X/ 周 ) 对 GMS 的抑制百分数为 65-70％ ； MAb 76(2X/ 周 ) 对 GMS 的抑制 百分数为 40-50％； 和 MAb 67(2X/ 周 ) 对 GMS 的抑制百分数为 45-50％。这些结果说明， 在 SJL 小鼠中 MAb 67 和 MAb 76 均能减轻复发缓解型 EAE。
用 MAb 76 以 30mg/kg 剂量和 1X/ 周的给药方案重复 SJL EAE 研究。结果进一步
证明， 与小鼠 IgG 相比， 在 SJL 小鼠中 MAb 76 能够降低 EAE 的严重程度 ( 数据未显示 )。在 第 21 天和研究结束之间， 组平均评分 (GMS) 的降低百分数为 50-60％。而且， 利用 MAb 76 或 MAb 67 以 30mg/kg、 1X/ 周的给药方案重复 SJL EAE 研究。用 MAb 67 或 MAb 76 治疗导 致在第 21 天和研究结束之间， GMS 降低百分数为 30-40％。图 5A 和 5B 的结果进一步证明， 在 SJL 小鼠中 MAb 76 和 MAb 67 能够降低 EAE 的严重程度。
利用 MAb 67 以 30mg/kg、 1X/ 周的给药方案重复 SJL EAE 研究， 其中治疗从免疫后 第 7 天开始。从第 7 天开始用 MAb 67 治疗导致在第 21 天和研究结束之间， GMS 降低百分 数约为 50％。结果见图 6。
这些体内研究的结果证明， 在不同的鼠 EAE 实验中， 用 MAb 76 或 MAb67 中和 CD100 能减轻 EAE 的临床体征。在这些实验中， MAb 76 和 MAb 67 的结果类似。
这些结果表明， MAb 76 和 MAb 67 能够在体外阻断 CD100 活性， 更重要的是， 能够 在小鼠 EAE 模型上进行的不同给药实验中减轻 EAE 严重程度。
实施例 4
嵌合和人源化抗 -CD100 单克隆抗体的制备
上述鼠单克隆抗体克隆 67 显示能够在体外中和人和小鼠 CD100 并在鼠模型体内 改善 EAE。
从克隆 67 杂交瘤克隆重链可变区 (VH) 和轻链可变区 (VK) 基因， 并测定其序列。 MAb 67VH 和 VK 基因的氨基酸序列见下， 其中 CDR1、 CDR2 和 CDR3 区域用下划线表示。
MAb 67 VH ：
QVQLQQSGPELVKPGASVKISCKASGYSFSDYYMHWVKQSPENSLEWIGQINPTTGGASYNQKFKGKAT LTVDKSSSTAYMQLKSLTSEESAVYYCTRYYYGRHFDVWGQGTTVTVSS(SEQ ID NO ： 10)
MAb 67VK ：
DIVMTQSPASLAVSLGQRATISCKASQSVDYDGDSYMNWYQQKPGQPPKLLIYAASNLESGIPARFSGS GSGTDFTLNIHPVEEEDAATYYCQQSNEDPYTFGGGTKLEIK(SEQ ID NO ： 18)
将 MAb 67VH 基因克隆到含有人 γ4 重链恒定区编码序列的哺乳动物表达载体中， 产生全长嵌合重链。将 MAb 67VK 克隆到具有人 κ 恒定区编码序列的哺乳动物表达载体 中， 产生全长嵌合轻链。 为了制备嵌合抗体， 将含有嵌合重链和嵌合轻链的表达载体共转染 到 CHO-S 细胞内。产生的单克隆抗体由细胞分泌， 3-6 天表达期过后收获。利用蛋白质 A 色 谱纯化所得 MAb 并进行表征。通过流式细胞术和 ELISA 证明所得的嵌合 MAb(MAb 2368) 对 CD100 有特异性， 并显示能够与鼠 MAb 67 竞争结合 CD100。总之， 这些数据证明， 分离到编 码所述 67MAb 的正确的 VH 和 VK 基因。
利用 MAb 67 可变 CDR 区产生人源化单克隆抗体。将人源化 VH 和 VK 基因分别克 隆到含有人 γ4 和人 κ 恒定区的载体中。成对的人源化 VH 和人源化 VK 产生 IgG4/κMAb 2503。人源化 MAb 67VH(H2160) 和 VK(L553) 的氨基酸序列如下所示， 其中 CDR1、 CDR2 和 CDR3 区域用下划线表示。
H2160 的序列 ：
QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGYSFSDYYMHWVRQAPGQGLEWMGQINPTTGGASYNQKFKGKAT ITVDKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARYYYGRHFDVWGQGTTVTVSS(SEQ ID NO ： 9)
L553 的序列 ：DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKASQSVDYDGDSYMNWYQQKPGQPPKLLIYAASNLESGVPDRFSGS GSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQQSNEDPYTFGQGTKLEIK(SEQ ID NO ： 17)
将编码 MAb 2503 抗体的 VH( 具有人 γ 的人免疫球蛋白基因 ； H2160) 和 VK( 具 有人 κ 的人免疫球蛋白基因 ； L553) 区的多核苷酸克隆到 pCMV-Script( 司查塔基公司 (Stratagene)) 载体内， 并于 2009 年 5 月 7 日保藏于美国典型培养物保藏中心 ( “ATCC” )， 获 得 的 ATCC 保 藏 号 分 别 为 PTA-10004 和 PTA-10005。ATCC 位 于 美 国 弗 吉 尼 亚 州 玛 纳 萨 斯 (20110-2209) 的 大 学 大 道 10801 号 (10801University Boulevard， Manassas， VA 20110-2209， USA)。 按照布达佩斯条约有关国际认可的微生物保藏机构的条款， 出于专利程 序目的， 在 ATCC 进行保藏。
实施例 5
人源化抗 -CD100 单克隆抗体 2503 的表征
通过 ELISA 和流式细胞术鉴定 MAb 2503 的特异性。在采用 MAb 67 的表位竞争实 验中和采用 表面等离振子共振技术的亲和力测定实验中检测 MAb 2503。
通过竞争 ELISA 测定 MAb 2503 和 MAb 67 的表位特异性。在 ELISA 方案中， 用 CD100-Fc 包被 ELISA 平板。滴定小鼠 67 或人源化 2503MAb。让抗体结合 CD100， 并洗去未 结合的抗体。加入生物素化 MAb 67。让抗体结合 CD100， 并洗去未结合的抗体。用链霉亲 和素 -HRP 检测结合 CD100 的生物素化 MAb 67。用 ELISA 分析 MAb 2503 或 MAb 67 阻断生 物素化 67 与人 CD100( 图 7A) 和小鼠 CD100( 图 7B) 结合的能力。
用 表面等离振子共振技术测定抗 -CD100MAb 的结合亲和力。MAb 2503 只能结合 CD100( 人、 小鼠和狨 ) 和 CD100 表达细胞系， 表明 MAb 2503 对 CD100 有特 异性。与 MAb 67 相比， MAb 2503 对人和小鼠 CD100 的亲和力较高。有关 MAb 2503 和 MAb 67 的亲和力特征的小结见表 4。
表 4. 抗 -CD100MAb 对人、 狨和小鼠 CD100 的亲和力
*用 表面等离振子共振技术测定亲和力。
这些实验表明， MAb 2503 对 CD100 有特异性， 并且与小鼠 MAb 67 结合相同的表位。 MAb 2503 显示能结合小鼠和人的 CD100， 因此 MAb 2503 的优势是可以在小鼠和人中测定其 安全性和功效。而且， 已证明 MAb 2305 能结合人、 猴和小鼠的 CD100。
实施例 6
MAb 2503 阻断小鼠和人 CD100 的体外活性
利用上述实施例 2 所述的实验， 包括 (1) 流式细胞术阻断实验和 (2) 细胞脱附实 验， 测定 MAb 2503 阻断 CD100 功能的能力。
在荧光阻断实验中， 筛选 CD100 特异性抗体 MAb 67 和 MAb 2503 抑制 CD100 与丛 蛋白 B1 结合的能力。用于检测 CD100 特异性抗体是否阻断 CD100 与丛蛋白 B1 结合的方法 见图 1( 实施例 2)。与只有 CD100 相比， 用 MAb 67 或 MAb 2503 预孵育 CD 100 导致荧光较
弱。MAb 2503 能够在体外阻断人 ( 见图 8A)、 狨 ( 见图 8B) 和小鼠 ( 见图 8C)CD100 的结合。 因此， 这些结果显示， MAb67 和 MAb 2503 均能够阻断人、 猴和小鼠 CD100 与丛蛋白 B1 结合。
利用如实施例 2 所述的细胞脱附实验测定抗 -CD100MAb 阻断人和猴 CD100 介导的 293/ 丛蛋白细胞从纤连蛋白包被平板上脱附的能力。CD100 引起平板贴附细胞数量减少， 因此吸光度降低。用 MAb2503 或 MAb 67 中和人 CD100 和狨 CD100 导致吸光度增加， 分别如 图 9A 和 9B 所示。该实验中， MAb 2503 和 MAb 67 也中和小鼠 CD100( 数据未显示 )。
MAb 2503 阻断人、 小鼠和猴 CD100 与细胞表面丛蛋白 B1 结合， 并诱导 293/ 丛蛋白 细胞从纤连蛋白包被平板上脱附。因此， 这些结果表明， MAb 2503 能够在功能上中和人、 小 鼠和猴 CD100。
实施例 7
抗 -CD100 抗体在体内抑制血管新生
CD100 是强效的促血管新生分子， 通过 CD100 结合活化丛蛋白 B1 能反式激活 c-Met， 提高肿瘤细胞的侵袭能力并促进血管新生。
为了证明缺乏 CD100 对肿瘤生长的体内影响， 将 CT26 肿瘤细胞注射到野生型 Balb/c 或 CD100-/- 小鼠的腿部肌肉内， 测定所得的肿瘤生长。如图 10 所示， 在本研究中， 与野生型 Balb/c 小鼠相比， CD100-/- 小鼠的肿瘤体积缩小。这些结果证明， 在缺少 CD100 的环境中小鼠结肠癌细胞系 (CT26) 的生长受损。
接下来， 在野生型 Balb/c 小鼠中测定 MAb 67 降低 CT26 肿瘤细胞生长的能力。将 CT26 肿瘤细胞注射到野生型 Balb/c(n ＝ 48) 或 CD100-/-(n ＝ 9) 小鼠的腿部肌肉内。注 射后， 将野生型小鼠分成两组， 每组 24 只小鼠。 一组通过从第 1 天开始腹膜内注射 1mg MAb 67 进行治疗， 另一组通过腹膜内注射 1mg 小鼠 IgG 进行治疗。每 7 天重复治疗一次。分析 小鼠的肿瘤生长。如图 11 所示， 在 Balb/c 小鼠中， 与小鼠 IgG 对照组相比， 用 MAb 67 治疗 能降低 CT26 肿瘤的生长。
因此， 这些结果表明， 具有 MAb 67 的结构和功能特征的抗体能在体内降低肿瘤生 长。
实施例 8
抗 -CD100 抗体在体内抑制胶原诱导性关节炎
在胶原诱导性关节炎 (CIA) 小鼠模型中检测 MAb 67 减轻关节炎的能力。胶原诱 导性关节炎 (CIA) 模型是广泛用于解释疾病病理和验证治疗性 RA 靶点的类风湿性关节炎 (RA) 的临床前动物炎症模型 (Brand 等， Nat.Protoc.2(5) ： 1269-75(2007))。CIA 总程序如 图 12 所示 ( 对该总程序的任何改动如下所述 )。简要说， 在第 0 天， 通过皮内尾部注射含 有胶原和完全弗氏佐剂 (CFA) 的乳液诱导关节炎。然后， 从第 20 天开始每周两次通过皮下 (s.c.) 或腹膜内 (i.p.) 注射给予对照和测试治疗。研究 1 的测试组如表 5 所示。
表 5. 胶原诱导性关节炎 (CIA) 研究 1 测试组
用表 6 所列的评分方法对疾病严重程度进行评分。对各小鼠的爪进行评分 ( 每周 三次评价关节炎的宏观体征 )。通过加入单独的爪评分计算关节炎指数 (AI)(AI 最大值＝ 16)。通常， 在免疫后 21-28 天， CIA 模型中第一次出现关节炎体征。
表 6.CIA 评分方法
评分 0 1 2 3 4
说明 没有观察到关节炎效应 1 个指头出现水肿和 / 或红斑 2 个指头出现水肿和 / 或红斑 多于 2 个指头出现水肿和 / 或红斑 整个爪和全部指头出现严重关节炎研究 1 的结果证明， 600μg MAb 67 治疗组的 CIA 模型中关节炎疾病进展减缓。 在第 20 天开始治疗时， 600μg MAb 67 治疗的小鼠的关节炎指数 (AI) 与 600μg 阴性对照 (IgG1) 和 600μg 阳性对照 ( 依那西普 ) 治疗的小鼠的 AI 作比较。结果见图 13A。这些结 果表明， 在减缓 CIA 模型的关节炎疾病进展方面， MAb67 与依那西普同样好， 甚至优于依那 西普。
第二项研究 ( 研究 2) 包括 MAb 67 和阳性对照治疗， 其中治疗推迟， 即从关节炎指 数≥ 3 时开始治疗。研究 2 的测试组如表 7 所示。
表 7. 胶原诱导性关节炎 (CIA) 研究 2 测试组
在研究 2 中， 将 MAb 67 治疗的 AI 结果 ( 治疗从第 20 天或 AI ≥ 3 时开始 ) 与阴 性对照 (IgG1) 和阳性对照 ( 依那西普 ； 治疗从 AI ≥ 3 时开始 ) 治疗结果作比较。结果见 图 13B。这些结果说明， 在减缓 CIA 模型的关节炎疾病进展方面， 治疗从第 20 天或推迟至
AI ≥ 3 时开始时， MAb 67 与依那西普同样好， 甚至优于依那西普。因此， 在 CIA 模型中， 在 AI ≥ 3 时开始给药时， MAb 67 能防止关节炎疾病进展并治疗关节炎疾病。
实施例 9
抗 -CD100 抗体在体内阻断原发和记忆 B 细胞应答
用明矾 ( 氢氧化铝 / 氢氧化镁 ) 沉淀的 (4- 羟基 -3- 硝基苯基 ) 乙酰基偶联的 鸡 γ 球蛋白 ( ″ NP-CGG ″ ) 免疫 Balb/c 和 CD100-/- 小鼠， 然后用对照 IgG1(Balb/c 和 CD100-/-) 或 MAb 67( 仅 Balb/c) 治疗。测试组如下表 8 所示。
表 8. 测试组的原发和记忆 B 细胞应答
如上表 8 所述， 从第 -7 天开始治疗小鼠， 并在第 0 天用 NP-CGG 免疫。在第 10 天， 每组处死三只小鼠， 分析脾脏和淋巴结的生发中心 (GC)B 细胞 ( “B220+CD38 低 PNA+” )。各 脾脏进行单独分析， 将所有三只小鼠的淋巴结合并成一个样品进行分析。如表 8 所示， 继续 对其余小鼠进行治疗。 在第 21 天， 用含有明矾的相同 NP-CGG 对小鼠进行加强免疫。 在第 31 天， 将其余小鼠处死， 分析脾脏和淋巴结的生发中心 (GC)B 细胞 (“B220+CD38 低 PNA+” )。 各脾脏进行单独分析， 将所有三只小鼠的淋巴结合并成一个样品中进行分析。 图 14A 和 B 的 结果表明， 首次免疫 (14A) 和第二次免疫 (14B) 后， 用 600μg MAb67 治疗能减少脾脏 (SP) 和淋巴结 (LN) 中的 GC B 细胞数量。因此， MAb 67 能在体内阻断首次和记忆 B 细胞应答。
实施例 10
抗 -CD100 抗体在体内减缓肿瘤生长
在 CT26 和 BCA34 小鼠异种移植瘤模型中检测 MAb 67 对肿瘤生长的抑制作用。在 这些研究中， 将肿瘤细胞肌肉内注射至 Balb/c 小鼠腿部。从植入后 1 天开始， 以 1X/ 周的 频率腹膜内 (i.p.) 注射 0.2ml 体积的 1mg MAb 67 抗体或阴性对照 (IgG)， 以治疗小鼠。测 3 3 定肿瘤体积 (mm ) 和 / 或大腿体积 (mm ) 的改变， 以确定肿瘤生长速率。利用与阴性对照小 鼠的肿瘤生长速率相比 MAb 67 治疗小鼠的肿瘤生长速率计算肿瘤生长延迟 (TGD)。
还检测 BCA34 和 EMT6 肿瘤细胞在缺乏 CD100 的环境中生长的能力。在这些研究 中， 将肿瘤细胞注射到 Balb/c 和 CD100-/-(SEMA4D-/-) 小鼠腿内， 测定肿瘤生长。
CT26 结肠肿瘤细胞
CT26 肿瘤细胞衍生自鼠结肠肿瘤， 其 CD100 表达水平非常低。用 50,000 个 CT26 结肠肿瘤细胞 s.c 注射野生型 Balb/c 小鼠 (20 只小鼠 / 治疗组 )。与注射 IgG 对照的小鼠 相比， 测定从植入后第 1 天开始每周用 1mg MAb 67 治疗的小鼠的肿瘤体积改变 (mm3)。结 果 ( 随时间变化的平均肿瘤体积 ) 见图 15。MAb 67 治疗小鼠的 TGD 为 17％ (p ＝ 0.0317)。 这些结果表明， MAb 67 治疗的小鼠中 CT26 肿瘤生长降低。
BCA34 成纤维细胞肿瘤细胞
BCA34 肿瘤细胞中 CD100 表达水平较低。首先， 将 50,000 个 BCA34 肿瘤细胞皮下 注射到野生型 Balb/c 小鼠或 CD100-/-(“SEMA4D-/-” ) 小鼠的腹部区域内。测定这些小 3 鼠的肿瘤体积改变 (mm )， 结果如图 16A 所示。这些结果表明， BCA34 肿瘤细胞在缺少 CD100 的环境中生长受损。
在单独实验中， 将 50,000 个 BCA34 肿瘤细胞注射到野生型 Balb/c 小鼠的腿部肌 肉内 (21 只小鼠 / 治疗组 )。与注射 IgG 对照的小鼠相比， 测定从植入后第 1 天开始每周用 3 1mg MAb 67 治疗的小鼠的肿瘤体积改变 (mm )。结果 ( 随时间变化的平均大腿体积 ) 见图 16B。MAb 67 治疗小鼠的 TGD 为 18％ (p ＝ 0.009)。这些结果表明， MAb 67 治疗的小鼠中 BCA34 肿瘤生长降低。
EMT6 乳腺癌肿瘤细胞
EMT6 肿瘤细胞衍生自鼠乳腺癌肿瘤， 其 CD100 表达水平中等。 将 50,000 个 EMT6 肿 瘤细胞注射到野生型 Balb/c 小鼠或 CD100-/-( “SEMA4D-/-” ) 小鼠的腿部肌肉内。测定这 3 些小鼠的肿瘤体积改变 (mm )， 结果如图 17 所示。 显示了野生型 Balb/c 小鼠和 CD100-/- 小 3 鼠 (“SEMA4D-/-” ) 的肿瘤体积改变 (mm )。这些结果表明， EMT6 肿瘤细胞在缺少 CD100 的 环境中生长受损。
实施例 11
抗 -CD100 抗体在体内减缓人肿瘤生长
在 HN12 和 HN6 HIF1a mODD 人异种移植瘤模型中检测 MAb 2503 对肿瘤生长的 抑制作用。HN12 和 HN6 HIF1a mODD 衍生人头颈肿瘤， 这两种异种移植瘤均高水平表达 HIF1a 和 CD100。HN6 HIF-1a mODD 异种移植瘤模型可参见 Sun 等， J Biol Chem 284(46) ： 32066-74(2009)。在这些实验中， 将 2 个肿瘤 / 小鼠皮下注射到无胸腺裸小鼠内 (10 只小 鼠 / 治疗组 )。从植入后 1 天开始， 以 1X/ 周的频率 i.p. 注射 0.2ml 体积的 1mg MAb 2503 抗体或阴性对照 (IgG4)， 以治疗小鼠。测定肿瘤体积改变 (mm3)。利用与阴性对照小鼠的 生长速率相比 MAb 2503 治疗的 HN6 HIF-1a mODD 小鼠的肿瘤生长速率计算肿瘤生长延迟 (TGD)。
该实验的终点是 TGD。 HN12 和 HN6 HIF-1a mODD 异种移植瘤模型中 MAb 2503 治疗 的肿瘤生长结果分别参见图 18 和 19A。用 MAb 2503 治疗的 HN6 HIF-1a mODD 异种移植瘤 小鼠的 TGD 为 13％ (p ＝ 0.0008)。而且， IgG4 对照和 MAb 2505 治疗的 HN6 HIF-1a mODD 异种移植瘤小鼠的代表性肿瘤照片见图 19B。这些结果表明， 用 MAb 2503 治疗能在体内降 低人头颈肿瘤的生长。
实施例 12
表达高滴度 MAb 2503 的稳定的 CHO-S 细胞系
获得表达高滴度 MAb 2503 的稳定的 CHO-S 细胞系。利用人源化抗 -CD100 单克隆抗体 2503 的重链和轻链的互补 DNA(cDNA)， 利用 GPExTM 技术 ( 威斯康星州麦迪逊的卡塔兰 药物解决方案公司 (Catalent Pharma Solutions， Madison， Wisconsin)) 和祖细胞 CHO-S 细胞 ( 参见 Bleck 等， An Alternative Method for the Rapid Generation of Stable， High-Expressing Mammalian Cell Lines( “快速产生稳定的高表达哺乳动物细胞系的替代 方法” )， BioProcessing Journal(2005 年 9/10 月 )) 构建产生若干中华仓鼠卵巢 (CHO-S) 表达细胞系。
单细胞克隆后， 根据在培养物中的生长和抗体产量选择一个表达克隆， 产生装瓶 的表达细胞研究库。利用体外和体内功能实验 ( 如， 流动阻断和脱附实验 ) 鉴定该克隆产 生的表达抗体的功效和特异性。随后， 培养扩增来自所选 CHO 表达克隆的细胞， 制备和冷冻 第二个库 ( 亲代种子储库 (Parental Seed Stock))。随后， 培养扩增来自亲代种子储库中 一瓶的细胞， 并用于 cGMP 产生主细胞库 (Master Cell Bank， MCB)。
实施例 13
在大鼠和猕猴中进行抗 -CD100 抗体剂量和 PK 研究
在大鼠和猕猴中进行 MAb 2503 的单次静脉内注射饱和分析。
大鼠研究 ： 向 36 只 SD(Sprague-Dawley) 大鼠单次静脉内注射给予 0.01 至 100mg/ kg 的 MAb 2503(3 只 / 性别 / 组 )。 在对不同时间点的裂解全血进行基于流式细胞术的饱和 实验， 以确定用 MAb 2503 饱和的细胞靶点 (SEMA4D) 的百分数。 与血清中检测到的 MAb 含量 的良好数据相关性提示， 饱和依赖于血清中游离药物的含量， 在血清中检测到大约 1-5μg/ ml 游离药物时细胞被饱和。在雄性和雌性大鼠中， MAb 2503 剂量为 0、 0.01、 0.1、 1.0、 10 和 100mg/kg 时 SEMA4D 的饱和百分数分别如图 20A 和 20B 所示。
灵长动物研究 ： 向 28 只猕猴单次静脉内注射给予 0.01 至 100mg/kg 的 MAb 2503(2 只 / 性别 / 组 ； 4 只 / 性别 / 对照组 )。 对不同时间点的裂解全血进行基于流式细胞术的饱和 实验， 以确定用 MAb 2503 饱和的细胞靶点 (SEMA4D) 的百分数。 与血清中检测到的 MAb 含量 的良好数据相关性提示， 饱和依赖于血清中游离药物的含量， 在血清中检测到大约 1-5ìg/ ml 游离药物时细胞被饱和。在雄性和雌性大鼠 ( 合并 ) 中， MAb 2503 剂量为 0、 0.01、 0.1、 1.0、 10 和 100mg/kg 时 SEMA4D 的饱和百分数如图 21 所示。大鼠和灵长动物饱和结果非常 类似。
在大鼠和灵长动物中单次静脉内注射 0.01、 0.1、 1.0、 10 或 100mg/kg MAb2503 后， 药代动力学 (PK) 结果包括生物学半衰期 ( 小时 ( 天 ))、 在注射后时间 0 点的血浆抗体浓度 (C0) 和从时间 0 点到 t 时间点的血浆浓度曲线的曲线下面积 (AUC0-t) 如表 9 所示。
表 9. 在大鼠和灵长动物 ( 猕猴 ) 中 2503 抗体的 PK 值
发现 MAb 2503 在大鼠和猕猴中的清除半衰期相似， 以剂量依赖方式从约 6 小时至 约 10 天。饱和与 PK 结果看来是剂量依赖性的， 这提示大鼠和猕猴的情况明显类似。而且， MAb 2503 剂量范围从 0.01 到 100mg/kg 时， 在大鼠或猕猴中未见明显毒性。
以上具体实施方式的描述完全揭示了本发明的一般性质， 可以通过应用本领域技 术人员的知识， 他人无需过多的试验很容易对这些具体实施方式进行修改和 / 或调试以用 于各种应用而不背离本发明总体理念。 因此， 基于本文所列出的教导和指导， 这些修改和改 良包括在所揭示的实施方式的含义和等价内容范围之内。 应当理解本文中的措词和术语仅 仅是描述性的而非限制性的， 因此本说明书的术语或措词可由本领域技术人员根据所述教 导和指导解读。
本发明的宽度和范围不应局限于任何上述示例性实施方式， 而仅由下面的权利要 求书和其等同项来定义。
CD100， 也称为脑信号蛋白 4D(SEMA4D)， 是属于脑信号蛋白基因家族的跨膜蛋白 ( 如 SEQ ID NO ： 1( 人 ) ； SEQ ID NO ： 2( 鼠 ))。CD100 在细胞表面上以同源二聚体的形式 表达， 但细胞活化后， CD100 可通过蛋白水解切割从细胞表面上释放， 产生活性该蛋白的可 溶 形 式 sCD100。 参 见 Suzuki 等， Nature Rev.Immunol.3 ： 159-167(2003) ； Kukutani 等， Nature Immunol.9 ： 17-23(2008)。
最初， 通过产生对抗活化人 T 细胞克隆的两种小鼠单克隆抗体 BD16 和 BB18 鉴定 CD100(Herold 等， Int.Immunol.7 ： 1-8(1994))。CD100 是免疫系统所表达脑信号蛋白中的 首例。CD100 在静息 T 细胞表面上表达丰富， 在静息 B 细胞、 单核细胞和专性抗原提呈细胞 如树突细胞 (DC) 上表达较弱。 细胞活化可刺激上调 CD100 在 B 细胞和树突细胞表面上的表 达， 以及 sCD100 的产生。认为 CD100 既可用作受体通过其胞质结构域传递信号、 又可用作 配体 (Hall 等， PNAS 93 ： 11780-11785(1996))。已鉴定的 CD100 的受体之一是丛蛋白 -B1。 丛蛋白 -B1 在非淋巴样组织中表达， 是 CD100 的高亲和 (1nM) 受体 (Tamagnone 等， Cell 99 ： 71-80(1999))。
CD100 是 T 细胞和 B 细胞活化的重要介导物。CD100 敲除 (CD100-/-) 小鼠对 T 依 赖性抗原的抗体应答降低， 并且 T 细胞初敏受损。这两项功能在给予 sCD100 后得到恢复 (Shi 等， Immunity 13 ： 633-642(2000))。
除了已证明的 CD100 对免疫细胞的作用外， CD100 也显示在神经炎性疾病中观 察到的脱髓鞘和轴突变性中起到直接作用。炎性脱髓鞘疾病， 如 MS 的发病机理包括涉及 免疫细胞的炎性期和选择性脱髓鞘和神经变性的时期。CD100 在中枢神经系统 (CNS) 少 突胶质细胞中表达， 是轴突变性的抑制剂。CD100 表达在脊髓损伤外周的少突胶质细胞 中上调 (Moreau-Fauvarque 等， J.Neuroscience 23 ： 9229-9239(2003))。将表达 sCD100 的长期活化 T 细胞与人多能神经前体或来自大鼠脑的原代少突胶质细胞一起培养能诱 导凋亡和突起伸长破坏 (process extension collapse)(Giraudon 等， J.Immunol.172 ： 1246-1255(2004) ； Giraudon 等， NeuroMolecular Med.7 ： 207-216(2005))。BD16 抗 -CD100 抗体可抑制 CD100 诱导的神经前体凋亡。
CD100 敲除小鼠能抵抗实验性变应性脑脊髓炎 (EAE)， 这是人多发性硬化 (MS) 的 小鼠模型 (Kumanogoh 等， J.Immulol.169 ： 1175-1181(2002))。
其它多项研究已证明， CD100 能诱导神经元的生长锥破坏， 且据报道在 HTLV-1 相 关脊髓病 / 热带痉挛性轻截瘫 (HAM/TSP) 患者的脑脊液 (CSF) 中 sCD100 水平急剧升高， 进一步支持 CD100 在神经炎症中的功能相关性。因此， sCD100 对少突胶质细胞和神经前体 完整性具有直接有害作用， 并且 CD100 可能在脱髓鞘中起致病作用。作为炎症反应和直接 脱髓鞘的重要介导物， 本领域需要用于治疗炎性疾病和脱髓鞘疾病的 CD100 中和分子， 如 抗 -CD100 抗体。
CD100 也是有效的促血管新生分子。通过 CD100 结合激活丛蛋白 -B1 可在体内和 体外反式激活 c-Met、 促进肿瘤细胞的侵袭能力、 还能促进血管新生。在较大肿瘤样本中的
除了已证明的 CD100 对免疫细胞的作用外， CD100 也显示在神经炎性疾病中观 察到的脱髓鞘和轴突变性中起到直接作用。炎性脱髓鞘疾病， 如 MS 的发病机理包括涉及 免疫细胞的炎性期和选择性脱髓鞘和神经变性的时期。CD100 在中枢神经系统 (CNS) 少 突胶质细胞中表达， 是轴突变性的抑制剂。CD100 表达在脊髓损伤外周的少突胶质细胞 中上调 (Moreau-Fauvarque 等， J.Neuroscience 23 ： 9229-9239(2003))。将表达 sCD100 的长期活化 T 细胞与人多能神经前体或来自大鼠脑的原代少突胶质细胞一起培养能诱 导凋亡和突起伸长破坏 (process extension collapse)(Giraudon 等， J.Immunol.172 ： 1246-1255(2004) ； Giraudon 等， NeuroMolecular Med.7 ： 207-216(2005))。BD16 抗 -CD100 抗体可抑制 CD100 诱导的神经前体凋亡。
CD100 敲除小鼠能抵抗实验性变应性脑脊髓炎 (EAE)， 这是人多发性硬化 (MS) 的 小鼠模型 (Kumanogoh 等， J.Immulol.169 ： 1175-1181(2002))。
其它多项研究已证明， CD100 能诱导神经元的生长锥破坏， 且据报道在 HTLV-1 相 关脊髓病 / 热带痉挛性轻截瘫 (HAM/TSP) 患者的脑脊液 (CSF) 中 sCD100 水平急剧升高， 进一步支持 CD100 在神经炎症中的功能相关性。因此， sCD100 对少突胶质细胞和神经前体 完整性具有直接有害作用， 并且 CD100 可能在脱髓鞘中起致病作用。作为炎症反应和直接 脱髓鞘的重要介导物， 本领域需要用于治疗炎性疾病和脱髓鞘疾病的 CD100 中和分子， 如 抗 -CD100 抗体。
CD100 也是有效的促血管新生分子。通过 CD100 结合激活丛蛋白 -B1 可在体内和 体外反式激活 c-Met、 促进肿瘤细胞的侵袭能力、 还能促进血管新生。在较大肿瘤样本中的
CD100 免疫组化分析揭示出 CD100 过度表达是头颈癌、 前列腺癌、 结肠癌、 乳腺癌和肺癌中 非常常见的事件。
CD100/ 丛 蛋 白 B1 信 号 转 导 也 能 诱 导 内 皮 细 胞 迁 移， 并促进肿瘤细胞迁移 (Conrotto 等， Blood 105 ： 4321-4329(2005) ； Giordano 等， Nature Cell Biology4 ： 720-724(2002))。通过 CD100- 阻断抗体和 CD100 敲减， 可防止 CD100 诱导的内皮细胞 迁移。植入裸小鼠之前， 用 CD100 短发夹 RNA(shRNA) 敲减头颈鳞状细胞癌 (HNSCC) 细 胞的 CD100 表达导致肿瘤血管化程度和肿瘤生长水平显著降低 (Basile 等， PNAS 103 ： 9017-9022(2006))。近期的报道指出肿瘤基质的炎性浸润和高血管化等级之间紧密相关。 CD100 由肿瘤微环境中存在的炎性细胞产生。在缺少 CD100 的环境中， 小鼠乳腺癌细胞 产生肿瘤体和转移灶的能力被严重削弱， CD100 的来源是肿瘤相关巨噬细胞 (Sierra 等， JEM205 ： 1673-1685(2008))。因此， 本领域还需要用于治疗 CD100 癌症的 CD100 中和分子， 如抗 -CD100 抗体。 发明领域
本发明涉及 CD100 中和抗体， 如人源化单克隆抗体， 所述抗体的使用方法， 和治疗 CD100 表达细胞相关病症和疾病的方法。 发明概述
提供治疗 CD100 相关疾病的组合物和方法， 包括某些类型的自身免疫病、 炎性疾 病、 癌症和侵袭性血管新生。具体说， 已经开发了抗 -CD100 单克隆抗体来中和 CD100。小 鼠 MAb67 在体外显示出阻断 CD100 活性的能力， 并在小鼠模型中减轻实验性变应性脑脊髓 炎 (EAE)、 胶原诱导性关节炎 (CIA) 和癌症的临床征象的严重性。 MAb 2503 是人源化的 MAb 67， 已证明它与人和鼠 CD100 的亲和力提高， 并且与 MAb 67 具有相似的 CD100 阻断活性。
在一个实施方式中， 本发明提供分离的结合分子， 其与选自 2503、 67 或 76 的参比 单克隆抗体相同的 CD100 表位特异性结合。
在另一实施方式中， 本发明提供特异性结合 CD100 的分离的结合分子， 所述结合 分子竞争性抑制选自 2503、 67 或 76 的参比单克隆抗体特异性结合 CD100。
在另一实施方式中， 本发明提供特异性结合 CD100 的分离的抗体或其抗原结合片 段， 所述抗体或其片段是单克隆抗体 2503、 67 或 76。
在某些实施方式中， 本发明所述特异性结合 CD100 的分离的抗体或其抗原结合片 段包含重链可变区 (VH)， 该重链可变区的氨基酸序列与 SEQ ID NO ： 9、 SEQ ID NO ： 10 或 SEQ ID NO ： 25 至少 90％相同。在本发明的另一方面， 所述抗体或其片段的 VH 包含除 20 个或更 少保守性氨基酸取代外， 与 SEQ IDNO ： 9、 SEQ ID NO ： 10 或 SEQ ID NO ： 25 相同的氨基酸序 列。在本发明的另一方面， 所述抗体或其片段的 VH 包含氨基酸序列 SEQ ID NO ： 9、 SEQ ID NO ： 10 或 SEQ ID NO ： 25， 或由其组成。
在某些实施方式中， 本发明所述特异性结合 CD100 的分离的抗体或其抗原结合片 段包含轻链可变区 (VL)， 该轻链可变区的氨基酸序列与 SEQ ID NO ： 17、 SEQ ID NO ： 18 或 SEQ ID NO ： 29 至少 90％相同。在本发明的另一方面， 所述抗体或其片段的 VL 包含除 20 个 或更少保守性氨基酸取代外， 与 SEQ IDNO ： 17、 SEQ ID NO ： 18 或 SEQ ID NO ： 29 相同的氨基 酸序列。 在本发明的另一方面， 所述抗体或其片段的 VL 包含氨基酸序列 SEQ ID NO ： 17、 SEQ
提供治疗 CD100 相关疾病的组合物和方法， 包括某些类型的自身免疫病、 炎性疾 病、 癌症和侵袭性血管新生。具体说， 已经开发了抗 -CD100 单克隆抗体来中和 CD100。小 鼠 MAb67 在体外显示出阻断 CD100 活性的能力， 并在小鼠模型中减轻实验性变应性脑脊髓 炎 (EAE)、 胶原诱导性关节炎 (CIA) 和癌症的临床征象的严重性。 MAb 2503 是人源化的 MAb 67， 已证明它与人和鼠 CD100 的亲和力提高， 并且与 MAb 67 具有相似的 CD100 阻断活性。
在一个实施方式中， 本发明提供分离的结合分子， 其与选自 2503、 67 或 76 的参比 单克隆抗体相同的 CD100 表位特异性结合。
在另一实施方式中， 本发明提供特异性结合 CD100 的分离的结合分子， 所述结合 分子竞争性抑制选自 2503、 67 或 76 的参比单克隆抗体特异性结合 CD100。
在另一实施方式中， 本发明提供特异性结合 CD100 的分离的抗体或其抗原结合片 段， 所述抗体或其片段是单克隆抗体 2503、 67 或 76。
在某些实施方式中， 本发明所述特异性结合 CD100 的分离的抗体或其抗原结合片 段包含重链可变区 (VH)， 该重链可变区的氨基酸序列与 SEQ ID NO ： 9、 SEQ ID NO ： 10 或 SEQ ID NO ： 25 至少 90％相同。在本发明的另一方面， 所述抗体或其片段的 VH 包含除 20 个或更 少保守性氨基酸取代外， 与 SEQ IDNO ： 9、 SEQ ID NO ： 10 或 SEQ ID NO ： 25 相同的氨基酸序 列。在本发明的另一方面， 所述抗体或其片段的 VH 包含氨基酸序列 SEQ ID NO ： 9、 SEQ ID NO ： 10 或 SEQ ID NO ： 25， 或由其组成。
在某些实施方式中， 本发明所述特异性结合 CD100 的分离的抗体或其抗原结合片 段包含轻链可变区 (VL)， 该轻链可变区的氨基酸序列与 SEQ ID NO ： 17、 SEQ ID NO ： 18 或 SEQ ID NO ： 29 至少 90％相同。在本发明的另一方面， 所述抗体或其片段的 VL 包含除 20 个 或更少保守性氨基酸取代外， 与 SEQ IDNO ： 17、 SEQ ID NO ： 18 或 SEQ ID NO ： 29 相同的氨基 酸序列。 在本发明的另一方面， 所述抗体或其片段的 VL 包含氨基酸序列 SEQ ID NO ： 17、 SEQ
ID NO ： 18 或 SEQ ID NO ： 29， 或由其组成。
在另一实施方式中， 本发明提供特异性结合 CD100 的分离的抗体或其抗原结合 片段， 其中所述抗体或其片段的 VH 包含以下 CDR 中至少一个 ： 除 2 个或更少氨基酸取代 外， 与 SEQ ID NO ： 6 相同的 Chothia-Kabat 重链互补决定区 -1(VH-CDR1) 氨基酸序列 ； 除 4 个或更少氨基酸取代外， 与 SEQ ID NO ： 7 相同的 Kabat 重链互补决定区 -2(VH-CDR2) 氨 基酸序列 ； 或者除 2 个或更少氨基酸取代外， 与 SEQ ID NO ： 8 相同的 Kabat 重链互补决定 区 -3(VH-CDR3) 氨基酸序列。
在另一实施方式中， 本发明提供特异性结合 CD100 的分离的抗体或其抗原结合片 段， 其中所述抗体或其片段的 VL 包含以下 CDR 中至少一个 ： 除 4 个或更少氨基酸取代外， 与 SEQ ID NO ： 14 相同的 Kabat 轻链互补决定区 -1(VL-CDR1) 氨基酸序列 ； 除 2 个或更少氨基 酸取代外， 与 SEQ ID NO ： 15 相同的 Kabat 轻链互补决定区 -2(VL-CDR2) 氨基酸序列 ； 或者 除 2 个或更少氨基酸取代外， 与 SEQ ID NO ： 16 相同的 Kabat 轻链互补决定区 -3(VL-CDR3) 氨基酸序列。
在另一方面， 本发明抗体或其片段的 VH 包含 VH-CDR1、 VH-CDR2 和 VH-CDR3 氨基酸 序列， 在一个或多个所述 VH-CDR 中， 除 2 个或更少氨基酸取代外， 它们分别包含 SEQ ID NO ： 6、 7 和 8。另一方面， 所述 VH-CDR1、 VH-CDR2 和 VH-CDR3 氨基酸序列分别是 SEQ ID NO ： 6、 7 和 8。 在另一方面， 本发明抗体或其片段的 VL 包含 VL-CDR1、 VL-CDR2 和 VL-CDR3 氨基酸 序列， 在一个或多个所述 VL-CDR 中， 除 2 个或更少保守性氨基酸取代外， 它们分别包含 SEQ ID NO ： 14、 15 和 16。另一方面， 所述 VL-CDR1、 VL-CDR2 和 VL-CDR3 氨基酸序列分别是 SEQ ID NO ： 14、 15 和 16。
在另一实施方式中， 本发明提供特异性结合 CD100 的分离的抗体或其抗原结合片 段， 其中所述抗体或其片段的 VH 包含以下 CDR 中至少一个 ： 除 2 个或更少氨基酸取代外， 与 SEQ ID NO ： 26 相同的 Kabat 重链互补决定区 -1(VH-CDR1) 氨基酸序列 ； 除 4 个或更少氨基 酸取代外， 与 SEQ ID NO ： 27 相同的 Kabat 重链互补决定区 -2(VH-CDR2) 氨基酸序列 ； 或者 除 2 个或更少氨基酸取代外， 与 SEQ ID NO ： 28 相同的 Kabat 重链互补决定区 -3(VH-CDR3) 氨基酸序列。
在另一实施方式中， 本发明提供特异性结合 CD100 的分离的抗体或其抗原结合片 段， 其中所述抗体或其片段的 VL 包含以下 CDR 中至少一个 ： 除 4 个或更少氨基酸取代外， 与 SEQ ID NO ： 30 相同的 Kabat 轻链互补决定区 -1(VL-CDR1) 氨基酸序列 ； 除 2 个或更少氨基 酸取代外， 与 SEQ ID NO ： 31 相同的 Kabat 轻链互补决定区 -2(VL-CDR2) 氨基酸序列 ； 或者 除 2 个或更少氨基酸取代外， 与 SEQ ID NO ： 32 相同的 Kabat 轻链互补决定区 -3(VL-CDR3) 氨基酸序列。
在另一方面， 本发明抗体或其片段的 VH 包含 VH-CDR1、 VH-CDR2 和 VH-CDR3 氨基酸 序列， 在一个或多个所述 VH-CDR 中， 除 4 个或更少氨基酸取代外， 它们分别包含 SEQ ID NO ： 26、 27 和 28。另一方面， 所述 VH-CDR1、 VH-CDR2 和 VH-CDR3 氨基酸序列分别是 SEQ ID NO ： 26、 27 和 28。
在另一方面， 本发明抗体或其片段的 VL 包含 VL-CDR1、 VL-CDR2 和 VL-CDR3 氨基酸 序列， 在一个或多个所述 VL-CDR 中， 除 4 个或更少氨基酸取代外， 它们分别包含 SEQ ID NO ：
30、 31 和 32。另一方面， 所述 VL-CDR1、 VL-CDR2 和 VL-CDR3 氨基酸序列分别是 SEQ ID NO ： 30、 31 和 32。
在另一方面， 本发明抗体或其片段结合人和鼠 CD100。在另一方面， 本发明抗体或 其片段特异性结合 CD100 多肽或其片段或者 CD100 变体多肽的亲和力特征是解离常数 (KD) 不 大 于 5x10-2M、 10-2M、 5x10-3M、 10-3M、 5x10-4M、 10-4M、 5x10-5M、 10-5M、 5x10-6M、 10-6M、 5x10-7M、 10-7M、 5x10-8M、 10-8M、 5x10-9M、 10-9M、 5x10-10M、 10-10M、 5x10-11M、 10-11M、 5x10-12M、 5.7x10-12M、 8.4x10-12M、 10-12M、 5x10-13M、 10-13M、 5x10-14M、 10-14M、 5x10-15M 或 10-15M。 在 某 些 方 面， 所述 CD100 多肽或其片段或者 CD100 变体多肽是人或鼠的。在其它方面， CD100 多肽或其片段或 -9 -9 者 CD100 变体多肽是人的， 所述 KD 为约 5x10 M 至 6x10 M。在另一方面， CD100 多肽或其片 -9 -9 段或者 CD100 变体多肽是鼠的， 所述 KD 为约 1x10 M 至 2x10 M。
在另一方面， 本发明抗体或其片段是人源化的、 灵长化的或嵌合的。
在另一实施方式中， 本发明提供包含本发明抗体或其片段以及运载体的组合物。
在另一实施方式中， 本发明提供一种分离的多核苷酸， 其包含编码本发明抗体 VH 或 VL 多肽的核酸。在另一方面， 本发明多核苷酸包含编码本发明抗体或其片段的核酸或者 由其组成。另一方面， 本发明提供包含本发明多核苷酸的载体。在另一方面， 本发明提供包 含本发明载体的宿主细胞。在另一方面， 本发明提供一种产生本发明抗体的方法。
在另一实施方式中， 本发明提供一种在需要治疗的动物中治疗自身免疫病症或炎 性疾病的方法， 所述方法包括给予所述动物一种组合物， 该组合物包含 ： 本发明的分离的抗 体或其片段和药学上可接受的运载体。在其它实施方式中， 所述自身免疫病或炎性疾病是 多发性硬化或关节炎。
在另一实施方式中， 本发明提供一种在需要治疗的动物中治疗癌症的方法， 所述 方法包括给予所述动物一种组合物， 该组合物包含 ： 本发明的分离的抗体或其片段和药学 上可接受的运载体。
在另一实施方式中， 本发明提供一种在需要治疗癌症的动物中抑制血管新生的方 法， 所述方法包括给予所述动物一种组合物， 该组合物包含 ： 本发明的分离的抗体或其片段 和药学上可接受的运载体。
另一方面， 本发明抗体或其片段抑制 CD100 与 CD100 受体的结合。在本发明的另 一方面， 所述 CD100 受体是丛蛋白 -B1。
附图简要说明
图 1.CD100 阻断实验图示。CD100- 组氨酸显示与表达丛蛋白 B1 的稳定细胞系 (293/ 丛蛋白 ) 细胞表面上丛蛋白 B1 的结合。用生物素偶联的抗 - 组氨酸标签特异性单克 隆抗体和链霉亲和素 -APC 检测结合于丛蛋白 B1 的 CD100- 组氨酸。经流式细胞术检测， 能 够阻断 CD100- 组氨酸与丛蛋白 B1 结合的抗 -CD100MAb 产生的与 293/ 丛蛋白细胞相关的 荧光较低。
图 2. 显 示 在 图 1 所 示 的 CD100 阻 断 实 验 中 检 测 兔 抗 - 组 氨 酸 + 链 霉 亲 和 素 -APC(Rb 抗 - 组 氨 酸 +sAPC)、 小 鼠 CD100( 只 有 muCD100)、 小 鼠 CD100+0.625μg/ml MAb(MAb 67、 MAb 76 和 mIgG 同种型 ) 和小鼠 CD100+0.156μg/ml MAb(MAb 67、 MAb 76 和 mIgG 同种型 ) 的流式细胞分析结果。单克隆抗体 67 和 76 阻断小鼠 CD100 与丛蛋白 B1 受 体的结合。图 3.MAb 67(67-2) 和 76(76-1) 的吸光度比同种型对照增加说明， 单克隆抗体 67 和 76 阻断小鼠 CD100 介导的 293/ 丛蛋白 B 细胞从纤连蛋白包被平板上解离。
图 4. 临床评分降低说明， 与小鼠 IgG 对照的治疗相比， 在 SJL 小鼠中用 30mg/kg 抗 -CD100MAb 76(1X/ 周或 2X/ 周 ) 或 MAb 67(1X/ 周或 2X/ 周 ) 治疗能减轻复发缓解型 EAE(4A)。通过各个 MAb 治疗的小组平均分 (GMS) 的降低百分数在第 21 天和研究结束之间 的比较， 进一步说明该结果 (4B)。
图 5. 临床评分降低说明， 与小鼠 IgG 对照的治疗相比， 在 SJL 小鼠中用 30mg/kg 抗 -CD100MAb 76(1X/ 周 ) 或 MAb 67(1X/ 周 ) 治疗能减轻复发缓解型 EAE(5A)。通过两个 MAb 治疗的小组平均分 (GMS) 的降低百分数在第 18 天和研究结束之间， ， 进一步说明该结果 (5B)。
图 6. 临床评分降低说明， 与小鼠 IgG 对照的治疗相比， 在 SJL 小鼠中从免疫后第 7 天开始用 30mg/kg 抗 -CD100MAb 67(1X/ 周 ) 治疗能减轻复发缓解型 EAE。
图 7.ELISA 结果显示由于 MAb 2503、 MAb 67 或 IgG 对照的竞争性结合， 生物素化 的 67 与人 CD100(7A) 或小鼠 CD100(7B) 结合的阻断百分数 (％ )。
图 8. 显示在图 1 所示的 CD100 阻断实验中检测的链霉亲和素 -APC( 只有 sAPC)、 人 CD100(huCD100)、 狨 CD100(marmCD100)、 小鼠 CD100(muCD100)、 1.0μg 同种型和 1.0μg MAb(67 或 2503) 的流式细胞分析结果。MAb 67 和 MAb2503 阻断人 CD100(8A)、 狨 (8B) 或小 鼠 (8C)CD100 与丛蛋白 B1 受体的结合。
图 9. 显示由于 MAb 67、 MAb 2503 和 IgG 对照中和 CD100， CD100 造成吸光度降低 被阻断。抗 -CD100 MAb 67 和 MAb 2503 阻断人 CD100(9A) 和狨 CD100(9B) 介导的 293/ 丛 蛋白细胞从纤连蛋白包被平板上解离。
图 10. 显示将 50,000 个 CT26 结肠肿瘤细胞注射入小鼠腿部肌肉后， 野生型 Balb/ 3 c 小鼠和 CD100-/- 小鼠的肿瘤体积变化 (mm )。
图 11. 显示将 50,000 个 CT26 肿瘤细胞注射入小鼠腿部肌肉后， 用 1mgMAb 67 或 1mg 对照小鼠 IgG 治疗的野生型 Balb/c 小鼠和 CD100-/- 小鼠 (″ KO″ ) 的平均腿体积变 化 (mm3)。
图 12. 胶原诱导型关节炎 (CIA) 总体治疗方案的示意图。
图 13. 显示在 600μg MAb 67 治疗组中， CIA 模型中关节炎疾病发展减缓。 600μg MAb 67 治疗小鼠的关节炎指数 (AI) 与 600μg 阴性对照 (IgG1) 和 600μg 阳性对照依那西 普 治疗小鼠的 AI 在第 20 天开始治疗时的比较 (13A)。在第 20 天或 AI ≥ 3 时开 治疗的关节 始治疗时， 比较 MAb 67 治疗与阴性对照 (IgG1) 和阳性对照依那西普炎指数 (AI) 结果 (13B)。
图 14. 用铝 ( 氢氧化铝 / 氢氧化镁 ) 沉淀的 (4- 羟基 -3- 硝基苯基 ) 乙酰基偶联 的鸡 γ 球蛋白 (″ NP-CGG″ ) 对 Balb/c 小鼠进行初次免疫 (14A) 和二次免疫 (14B) 后， 600μg MAb 67 治疗降低脾脏 (SP) 和淋巴结 (LN) 中生发中心 (GC)B 细胞 (″ B220+CD38 低 PNA+″ ) 的数量。也显示了使用或不用 NP-CGG 免疫的 CD100-/- 小鼠和 Balb/c 小鼠的 结果。
图 15. 显示将 50,000 个 CT26 结肠肿瘤细胞注射入小鼠腿部肌肉后， 野生型 Balb/ c 小鼠的肿瘤体积变化 (mm3)。显示从第 1 天开始每周注射 1mg MAb 67 的小鼠与注射 IgG对照的小鼠相比的结果。该研究进行至肿瘤生长延迟结束。
图 16. 显示将 50,000 个 BCA34 成纤维细胞肿瘤细胞皮下注射到小鼠腹部区域后， 野生型 Balb/c 小鼠和 CD100-/- 小鼠 (″ SEMA4D-/-″ ) 的肿瘤体积变化 (mm3)(16A)。显 示将 50,000 个 BCA34 成纤维细胞肿瘤细胞注射入小鼠腿部肌肉后， 用 1mg MAb 67 或 1mg 3 对照小鼠 IgG 治疗的野生型 Balb/c 小鼠的平均大腿体积变化 (mm )(16B)。
图 17. 显示将 50,000 个 EMT6 小鼠乳腺癌肿瘤细胞注射入小鼠腿部肌肉后， 野生 3 型 Balb/c 小鼠和 CD 100-/- 小鼠 (″ SEMA4D-/-″ ) 的肿瘤体积变化 (mm )。
图 18. 显示在无胸腺裸小鼠中， 向小鼠的胁部肌肉内皮下注射两个 HN12 头颈肿瘤 3 后的肿瘤体积变化 (mm )。显示从移植后第 1 天开始每周注射 1mgMAb 2503 的小鼠与注射 IgG4 对照的小鼠相比的结果。
图 19. 显示在无胸腺裸小鼠中， 向小鼠的腿部肌肉内皮下注射两个 HN6HIF1a 3 mODD 头颈肿瘤后的肿瘤体积变化 (mm )。显示从移植后第 1 天开始每周注射 1mg MAb 2503 的小鼠与注射 IgG4 对照的小鼠相比的结果 (19A)。来自 IgG4 对照和 MAb 2503 治疗的小鼠 的代表性肿瘤照片 (19B)。
图 20. 大鼠中进行的 MAb2503 单次静脉内注射饱和分析的饱和百分数结果。通过 静脉内单次注射将 0、 0.01、 0.1、 1.0、 10 和 100mg/kg 剂量 MAb 2503 给予 Sprague-Dawley 大鼠。对雄性 (20A) 和雌性 (20B) 大鼠在不同时间点的裂解全血进行基于流式细胞术的饱 和实验， 以确定细胞靶点 (SEMA4D) 被 MAb 2503 饱和的百分数。 图 21. 猕猴中进行的 MAb2503 单次静脉内注射饱和分析的饱和百分数结果。通 过单次静脉内注射将 0、 0.01、 0.1、 1.0、 10 和 100mg/kg 剂量的 MAb 2503 给予猕猴。在对 不同时间点的裂解全血进行基于流式细胞术的饱和实验， 以确定细胞靶点 (SEMA4D) 被 MAb 2503 饱和的百分数 ( 雄性和雌性数据合并 )。
发明详述
I. 定义
需要注意， 术语 “一个” 或 “一种” 物质指一种或多种该物质 ； 例如， “一种抗 -CD100 抗体” 应理解为代表一种或多种抗 -CD100 抗体。例如， 术语 “一个” (或 “一种” )、 “一个或 多个” 和 “至少一个” 在本文中可以互换使用。
本文所用术语 “肿瘤” 是指无论恶性或良性的所有成瘤性细胞生长和增殖， 以及所 有的癌和癌前的细胞和组织。
“侵袭性血管新生” 指支持病理状况， 包括恶性和非恶性肿瘤的血管形成以及黄斑 变性中新血管的异常形成。
术语 “癌症” 和 “癌” 是用于描述哺乳动物的生理病症， 其典型特征是细胞生长失 控。癌症的例子包括但不限于癌、 淋巴瘤和白血病。
本文所用术语 “多肽” 包括单数形式和复数形式， 涵盖酰胺键 ( 也称肽键 ) 线性连 接的单体 ( 氨基酸 ) 所组成的分子。术语 “多肽” 指两个或多个氨基酸的任何一条链或多 条链， 而非具体长度的产物。因此， 肽、 二肽、 三肽、 寡肽、 “蛋白质” 、 “氨基酸链” 或其它任何 用于指两个或多个氨基酸的一条或多条链的术语均包含于 “多肽” 的定义内， 术语 “多肽” 可 与这些术语替代或互换使用。术语 “多肽” 还指多肽表达后修饰的产物， 这些修饰包括但不 限于糖基化， 乙酰基化， 磷酸化， 酰胺化， 通过已知保护 / 封闭基团衍生化， 蛋白酶切割或非
天然氨基酸修饰。多肽可能由天然生物来源衍生或由重组技术产生， 但不一定由标明的核 酸序列翻译而来。可以任何方式产生多肽， 包括化学合成。
本发明多肽的大小可以是约 3 个或更多个、 5 个或更多个、 10 个或更多个、 20 个或 更多个、 25 个或更多个、 50 个或更多个、 75 个或更多个、 100 个或更多个、 200 个或更多个、 500 个或更多个、 1,000 个或更多个或者 2,000 个或更多个氨基酸。多肽可具有确定的三维 结构， 但它们不一定具有这种结构。 具有确定三维结构的多肽称为折叠多肽， 不具有确定的 三维结构、 但可采用大量不同构象的多肽称为非折叠多肽。本文所用术语 “糖蛋白” 指偶联 于至少一个糖部分的蛋白质， 所述糖部分通过某些氨基酸残基， 如丝氨酸残基或天冬酰胺 残基的含氧或含氮侧链连接于蛋白质。
“分离的” 多肽或其片段、 变体或衍生物指不在其天然环境中的多肽。不要求特定 的纯化水平。例如， 可从其自然或天然环境中取出分离多肽。根据本发明目的， 在宿主细胞 中表达的重组产生的多肽和蛋白质被认为是分离的， 通过任何合适技术分离、 分级、 部分或 基本上纯化的天然或重组多肽也是如此。
本发明多肽也包括上述多肽的片段、 衍生物、 类似物或变体， 及其任何组合。提到 本发明抗 -CD100 抗体或抗体多肽时， 术语 “片段” 、 “变体” 、 “衍生物” 和 “类似物” 包括保持 相应的本发明抗体或本发明抗体多肽的至少一部分抗原结合特性的任何多肽。 除本文其它 部分讨论的具体抗体片段外， 本发明多肽的片段还包括蛋白酶水解片段， 以及缺失片段。 本 发明抗 -CD100 抗体和抗体多肽的变体包括上述片段， 以及具有因氨基酸取代、 缺失或插入 而改变氨基酸序列的多肽。变体可以是天然产生的或非天然产生的。可使用本领域所知的 诱变技术产生非天然变体。 变体多肽可包含保守的或非保守的氨基酸取代、 缺失或添加。 多 肽变体本文中也称作 “多肽类似物” 。本文所用抗 -CD100 抗体或抗体多肽的 “衍生物” 指具 有由官能性侧链基团反应化学衍生的一个或多个残基的对象多肽。 “衍生物” 还包括那些含 有一个或多个 20 种标准氨基酸的天然氨基酸衍生物的肽。例如， 4- 羟基脯氨酸可取代脯 氨酸 ； 5- 羟基赖氨酸可取代赖氨酸 ； 3- 甲基组氨酸可取代组氨酸 ； 高丝氨酸可取代丝氨酸 ； 鸟氨酸可取代赖氨酸。本发明抗 -CD100 抗体和抗体多肽的衍生物可包括经改变具有本发 明参比抗体或抗体多肽上不存在的额外特征的多肽。
术语 “多核苷酸” 包括单个核酸和多个核酸， 指分离的核酸分子或构建物， 例如信 使 RNA(mRNA) 或质粒 DNA(pDNA)。 多核苷酸可包含常规磷酸二酯键或非常规键 ( 如酰胺键， 如肽核酸 (PNA) 中的酰胺键 )。术语 “核酸” 指多核苷酸中存在的任何一种或多种核酸区 段， 如 DNA 或 RNA 片段。 “分离的” 核酸或多核苷酸指从其天然环境中取出的核酸分子， DNA 或 RNA。例如， 根据本发明目的， 包含在载体中的编码抗 -CD100 结合分子， 如抗体或其抗原 结合片段的重组多核苷酸被认为是分离的。 分离的多核苷酸的其它例子包括保持于异源宿 主细胞的重组多核苷酸或纯化 ( 部分或基本上纯化 ) 在溶液中的多核苷酸。分离的 RNA 分 子包括本发明多核苷酸的体内或体外 RNA 转录物。根据本发明， 分离的多核苷酸或核酸还 包括合成产生的此类分子。此外， 多核苷酸或核酸可以是或可包括调控元件， 如启动子、 核 糖体结合位点或转录终止子。
本文所用术语 “编码区” 指由翻译成氨基酸的密码子组成的核酸部分。虽然 “终止 密码子” (TAG、 TGA 或 TAA) 不翻译成氨基酸， 但它可被认为是编码区的一部分， 而任何侧接 序列， 如启动子、 核糖体结合位点、 转录终止子、 内含子等均不是编码区的一部分。 本发明的两个或多个编码区可安置在同一多核苷酸构建物中， 例如在同一载体上， 或者在单独的多 核苷酸构建物中， 例如在单独 ( 不同 ) 载体上。而且， 任何载体可包含单个编码区， 或者可 包含两个或多个编码区， 例如， 单一载体可单独编码免疫球蛋白重链可变区和免疫球蛋白 轻链可变区。此外， 本发明的载体、 多核苷酸或核酸可编码与抗 -CD100 抗体或其片段、 变体 或衍生物的编码核酸融合或不融合的异源编码区。 异源编码区包括但不限于专用的元件或 基序， 如分泌信号肽或异源功能结构域。
在某些实施方式中， 所述多核苷酸或核酸是 DNA。当指 DNA 时， 包含多肽编码核酸 的多核苷酸通常包含启动子和 / 或其它转录或翻译控制元件， 这些元件与一个或多个编码 区可操作地连接。可操作地连接指， 当基因产物如多肽的编码区与一个或多个调控序列以 此方式连接时， 将使该基因产物的表达受到该调控序列的影响或控制。如果启动子功能的 诱导使编码所需基因产物的 mRNA 转录， 且如果两个 DNA 片段间连接的属性不干扰表达调控 序列指导基因产物表达或不干扰转录 DNA 模板的能力， 则两个 DNA 片段 ( 如多肽编码区及 其相连的启动子 ) “可操作地连接” 。因此， 如果启动子能够影响核酸的转录， 则启动子区域 与多肽编码核酸可操作地连接。启动子可以是仅在预先确定的细胞中指导 DNA 实质转录的 细胞特异性启动子。 启动子以外的其它转录控制元件如增强子、 操纵子、 阻抑物和转录终止 信号， 可与多核苷酸可操作地连接以指导细胞特异性转录。本文公开了合适的启动子和其 它转录控制区。
许多转录控制区是本领域技术人员已知的。它们包括但不限于在脊椎动物细胞 中发挥作用的转录控制区， 例如但不限于， 来自巨细胞病毒 ( 立即早期启动子， 与内含子 -A 联用 )、 猿病毒 40( 早期启动子 ) 和逆转录病毒 ( 如劳氏肉瘤病毒 ) 的启动子和增强子区 段。其它转录控制区包括衍生自脊椎动物基因， 例如肌动蛋白、 热激蛋白、 牛生长激素和兔 β- 珠蛋白的那些， 以及能够在真核细胞中控制基因表达的其它序列。 其它合适的转录控制 区包括组织特异性启动子和增强子， 以及淋巴因子诱导型启动子 ( 如干扰素或白介素诱导 的启动子 )。
类似地， 本领域普通技术人员了解各种翻译控制元件。 它们包括但不限于 ： 核糖体 结合位点、 翻译起始和终止密码子以及衍生自小核糖核酸病毒的元件 ( 特别是内部核糖体 进入位点或 IRES， 也称为 CITE 序列 )。
在其它实施方式中， 本发明多核苷酸是 RNA， 例如， 信使 RNA(mRNA) 形式。
本发明的多核苷酸和核酸编码区可与编码指导本发明多核苷酸编码多肽分泌的 分泌或信号肽的其它编码区联合。根据信号假说， 哺乳动物细胞分泌的蛋白质具有信号肽 或分泌前导序列， 一旦生长的蛋白质链向粗面内质网外的输出过程启动， 就将这些序列从 成熟蛋白质上切掉。本领域普通技术人员了解， 脊椎动物细胞分泌的多肽通常具有融合于 所述多肽 N 末端的信号肽， 它们从完整或 “全长” 多肽上切掉后产生分泌或 “成熟” 形式的多 肽。在某些实施方式中， 使用天然信号肽， 例如免疫球蛋白重链或轻链信号肽， 或者使用仍 然能够指导与其操作性相连的多肽分泌的该序列的功能衍生物。或者， 可采用异源哺乳动 物信号肽或其功能衍生物。例如， 野生型前导序列可以用人组织纤溶酶原激活物 (TPA) 或 小鼠 β- 葡糖醛酸糖苷酶的前导序列代替。
广义来说， 本发明″结合分子″或″抗原结合分子″指特异性结合抗原决定簇的 分子。 在一个实施方式中， 所述结合分子特异性结合 CD100， 如大约 150kDa 的跨膜 CD100 多肽或大约 120kDa 的可溶性 CD100 多肽 ( 通常称为 sCD100)。在另一实施方式中， 本发明结 合分子是抗体或其抗原结合片段。在另一个实施方式中， 本发明结合分子包括抗体分子的 至少一个重链或轻链 CDR。 在另一个实施方式中， 本发明结合分子包括来自一种或多种抗体 分子的至少两个 CDR。 在另一个实施方式中， 本发明结合分子包括来自一种或多种抗体分子 的至少三个 CDR。 在另一个实施方式中， 本发明结合分子包括来自一种或多种抗体分子的至 少四个 CDR。 在另一个实施方式中， 本发明结合分子包括来自一种或多种抗体分子的至少五 个 CDR。在另一个实施方式中， 本发明结合分子包括来自一种或多种抗体分子的至少六个 CDR。
本发明涉及某些抗 -CD100 抗体或其抗原结合片段、 变体或衍生物。除非特别提到 完整大小的抗体， 如天然产生的抗体， 术语 “抗 -CD100 抗体” 包括完整大小的抗体以及这种 抗体的抗原结合片段、 变体、 类似物或衍生物， 例如天然产生的抗体或免疫球蛋白分子， 或 以类似于抗体分子的方式结合抗原的工程改造的抗体分子或片段。
本文所用术语 “人” 或 “完全人” 抗体包括具有人免疫球蛋白的氨基酸序列的抗 体， 包括分离自人免疫球蛋白文库的抗体或不表达内源性免疫球蛋白的一种或多种人免疫 球蛋白的转基因动物， 如下文所述， 例如， Kucherlapati 等的美国专利 5,939,598。 “人” 或 “完全人” 抗体也包括至少包含重链可变区或至少包含重链和轻链可变区的抗体， 其中所述 可变区具有人免疫球蛋白可变区的氨基酸序列。
“人” 或 “完全人” 抗体还包括如上所述包含本文所述抗体分子 ( 如 VH 区和 / 或 VL 区 ) 的变体 ( 包括衍生物 ) 或基本由其组成或由其组成的 “人” 或 “完全人” 抗体， 所述抗体 或其片段免疫学特异性结合于 CD100 多肽或其片段或变体。可利用本领域技术人员已知的 标准技术在编码人抗 -CD100 抗体的核苷酸序列中引入突变， 包括但不限于， 导致氨基酸取 代的定点诱变和 PCR 介导的诱变。优选地， 相对于参比 VH 区、 VHCDR1、 VHCDR2、 VHCDR3、 VL 区、 VLCDR1、 VLCDR2 或 VLCDR3， 该变体 ( 包括衍生物 ) 编码少于 50 个氨基酸取代、 少于 40 个氨基酸取代、 少于 30 个氨基酸取代、 少于 25 个氨基酸取代、 少于 20 个氨基酸取代、 少于 15 个氨基酸取代、 少于 10 个氨基酸取代、 少于 5 个氨基酸取代、 少于 4 个氨基酸取代、 少于 3 个氨基酸取代或少于 2 个氨基酸取代。
在某些实施方式中， 氨基酸取代是保守性氨基酸取代， 如下详述。或者， 也可沿所 有或一部分编码序列随机引入突变， 例如通过饱和诱变引入， 可筛选所得突变体的生物学 活性， 以鉴定保持活性 ( 例如， 结合 CD100 多肽， 如结合人 CD100、 鼠 CD100 或同时结合人和 鼠 CD100 的能力 ) 的突变体。 “人” 或 “完全人” 抗体的这类变体 ( 或其衍生物 ) 也可称为 “优化” 或 “为抗原结合所优化” 的人或完全人抗体， 包括与抗原亲和力提高的抗体。
术语 “抗体” 和 “免疫球蛋白” 在本文中可互换使用。抗体或免疫球蛋白至少包括 重链可变区， 通常至少包括重链和轻链的可变区。脊椎动物系统中的基本免疫球蛋白结构 是众所周知的。参见例如， Harlow 等 (1988)Antibodies ： ALaboratory Manual(《抗体 ： 实 验室手册》 )( 第 2 版 ； 冷泉港实验室出版社 (Cold Spring Harbor Laboratory Press))。
正如下文中详细讨论的， 术语 “免疫球蛋白” 包括可通过生化性质区分的各种类型 的多肽。本领域技术人员应理解， 重链分为 gamma、 mu、 alpha、 delta 或 epsilon(γ， μ， α， δ， ε)， 其中还有一些小类 ( 如 γ1-γ4)。该链的特性决定抗体分 “类” 为 IgG、 IgM、 IgA、 IgG 或 IgE。免疫球蛋白小类 ( 同种型 ) 如 IgG1、 IgG2、 IgG3、 IgG4、 IgA1 等已被良好表征，且已知能产生特殊功能特性。根据本文公开内容， 本领域技术人员不难区分这些类和同种 型的修饰形式， 因此， 它们涵盖在本发明范围内。所有免疫球蛋白类型明显属于本发明范 围， 以下讨论通常论及免疫球蛋白分子的 IgG 类。在 IgG 中， 标准的免疫球蛋白分子包括分 子量约为 23,000 道尔顿的两个相同的轻链多肽和分子量为 53,000-70,000 的两个相同的 重链多肽。这四条链通常通过二硫键结合起来形成 “Y” 构型， 其中轻链从 Y 的口部开始夹 叉重链， 并延续通过可变区。
轻链分类为 kappa 或 lambda(κ、 λ)。各重链类可与 κ 或 λ 轻链结合。通常， 通过杂交瘤、 B 细胞或遗传工程改造的宿主细胞产生免疫球蛋白时， 轻链和重链互相共价结 合， 两条重链的 “尾部” 通过共价二硫键或非共价连接互相结合。在重链中， 氨基酸序列从 Y 构型的分叉末端的 N 末端走向每条链底部的 C 末端。
轻链和重链都可以分成结构和功能同源的区域。术语 “恒定” 和 “可变” 从功能角 度使用。在这方面， 应理解轻链 (VL 或 VK) 和重链 (VH) 部分的可变区决定抗原识别和特异 性。相反， 轻链 (CL) 和重链 (CH1、 CH2 或 CH3) 的恒定区产生重要的生物学特性， 例如分泌、 跨胎盘移动、 Fc 受体结合、 补体结合等。通常， 恒定区结构域的编号越大， 离抗体的抗原结 合位点或氨基末端越远。N- 末端部分是可变区， C- 末端部分是恒定区 ； CH3 和 CL 结构域实 际上分别包括重链和轻链的羧基末端。
如上所述， 可变区允许抗体选择性识别和特异性结合抗原上的表位。 也就是说， 抗 体的 VL 和 VH 结构域、 或这些可变区内的互补决定区 (CDR) 亚组组合形成确定三维抗原结 合位点的可变区。在 Y 的每条臂末端形成的这种四联抗体结构构成抗原结合位点。更具体 说， 所述抗原结合位点由各 VH 和 VL 链带有的三个 CDR 决定。在一些情况下， 例如在衍生自 羊驼或根据羊驼免疫球蛋白工程改造的某些免疫球蛋白分子中， 完整的免疫球蛋白分子可 仅由重链构成而不含轻链。参见例如， Hamers-Casterman 等， Nature 363 ： 446-448(1993)。
在天然产生的抗体中， 每个抗原结合域上出现的六个 “互补决定区” 或 “CDR” 是短 的非毗连氨基酸序列， 随着抗体在水性环境中确定其三维构型时， 它们特别定位以形成抗 原结合域。抗原结合域中的其余氨基酸称为 “构架” 区， 该区域的分子间变化较小。构架区 主要采用 β- 片层构象， CDR 形成环连接 β- 片层结构， 并在某些情况下构成 β- 片层结构 的部分。因此， 构架区通过链间非共价相互作用形成支架为 CDR 提供正确定位。通过定位 的 CDR 形成的抗原结合域能确定与免疫反应性抗原上表位互补的表面。这种互补表面促进 抗体与其关联表位的非共价结合。 本领域普通技术人员不难鉴定任何给定的重链或轻链可 变区中包含 CDR 和构架区的氨基酸， 因为它们已被精确定义 ( 见下 )。
除非另有明确说明， 在本领域使用和 / 或接受某术语的两种或多种定义的情 况下， 本文所用的该术语的定义应包括所有这些含义。具体例子是使用术语 “互补决定 区” (CDR) 描述在重链和轻链多肽的可变区内发现的非毗连抗原结合位点。这一特定 区域的描述可参见通过引用全文纳入本文的 Kabat 等 (1983) 美国健康和公共服务部 (U.S.Dept.of Health and Human Services)， Sequences of Proteins of Immunological Interest(“具 有 免 疫 学 重 要 性 的 蛋 白 质 序 列” )， Chothia 和 Lesk， J.Mol.Biol.196 ： 901-917(1987)()， 互相比较时， 所述定义包括重叠的氨基酸残基或氨基酸残基亚组。尽管 如此， 应用任一定义指代抗体或其变体的 CDR 均应落入本文所定义和使用的术语的范围。 合适氨基酸残基包括上文引用的各参考文献中定义的 CDR， 如下表 1 所示以作比较。 包括特定 CDR 的准确残基编号取决于 CDR 的序列和大小。在给定抗体的可变区氨基酸序列的情况 下， 本领域技术人员可常规确定哪些残基包括哪个具体 CDR。
表 1.CDR 定义 1
Kabat VH CDR1 VH CDR2 VH CDR3 VL CDR1 VL CDR2 VL CDR3
1Chothia 26-32 52-58 95-102 26-32 50-52 91-9631-35 50-65 95-102 24-34 50-56 89-97表 1 中所有 CDR 定义的编号均根据 Kabat 等所述的编号规则 ( 见下 )。
Kabat 等也定义了适用于任何抗体的可变区序列的编号系统。本领域普通技 术人员可毫无疑义地将 “Kabat 编号” 系统应用于任何可变区序列， 而不依赖序列本身外 的任何实验数据。本文所用的 “Kabat 编号” 指 Kabat 等 (1983) 美国健康和公共服务部 (U.S.Dept.of Health and Human Services)， Sequences of Proteins of Immunological Interest(“具免疫学重要性的蛋白质序列” ) 中所述的编号系统。除非另有说明， 提到本 发明抗 -CD100 抗体或其抗原结合片段、 变体或衍生物中具体氨基酸残基的编号时， 均指按 照 Kabat 编号系统的编号。
本发明的抗体或抗原结合片段、 变体、 或其衍生物包括但不限于 ： 多克隆、 单克 隆、 多特异性、 人、 人源化、 灵长化或嵌合抗体， 单链抗体， 表位结合片段如 Fab、 Fab ′和 F(ab′ )2、 Fd、 Fv、 单链 Fv(scFv)、 二硫键连接的 Fv(sdFv)、 包含 VL 或 VH 结构域的片段、 Fab 表达文库产生的片段和抗 - 独特型 ( 抗 -Id) 抗体 ( 包括例如， 本文所述抗 -CD100 抗体的 抗 -Id 抗体 )。ScFv 分子是本领域已知的， 参见例如， 美国专利号 5,892,019。本发明抗体 可以是任何类型 ( 如 IgG、 IgE、 IgM、 IgD、 IgA 和 IgY)、 类 ( 如 IgG1、 IgG2、 IgG3、 IgG4、 IgA1 和 IgA2 等 ) 或小类的免疫球蛋白分子。
本文所用术语 “重链部分” 包括衍生自免疫球蛋白重链的氨基酸序列。包含重链 部分的多肽包括下组中的至少一个 ： CH1 结构域、 铰链 ( 如上部、 中部和 / 或下部绞链区 ) 结 构域、 CH2 结构域、 CH3 结构域或者其变体或片段。例如， 本发明所用的结合多肽可包括含 有 CH1 结构域的多肽链 ； 含有 CH1 结构域、 绞链区的至少一部分和 CH2 结构域的多肽链 ； 含 有 CH1 结构域和 CH3 结构域的多肽链 ； 含有 CH1 结构域、 绞链区的至少一部分和 CH3 结构域 的多肽链， 或者含有 CH1 结构域、 绞链区的至少一部分、 CH2 结构域和 CH3 结构域的多肽链。 在另一实施方式中， 本发明多肽包括含有 CH3 结构域的多肽链。另外， 本发明所用的结合多 肽可能缺少 CH2 结构域的至少一部分 ( 例如， 所有 CH2 结构域或其部分 )。如上所述， 本领 域技术人员应理解， 可修饰这些结构域 ( 例如重链部分 )， 以使它们的氨基酸序列不同于天然产生的免疫球蛋白分子。
在本文公开的某些抗 -CD100 抗体， 或其抗原结合片段、 变体或衍生物中， 多聚体 的一条多肽链的重链部分与该多聚体的第二条多肽链的相同。或者， 本发明含有重链部分 的单体不同。例如， 各单体可包含不同的靶结合位点， 形成， 例如， 双特异性抗体。
本文公开的诊断和治疗方法中所用结合分子的重链部分可衍生自不同的免疫球 蛋白分子。例如， 多肽的重链部分可包含衍生自 IgG1 分子的 CH1 结构域和衍生自 IgG3 分子 的绞链区。在另一个实例中， 重链部分可包含部分衍生自 IgG1 分子、 部分衍生自 IgG3 分子 的绞链区。在另一个实例中， 重链部分可包含部分衍生自 IgG1 分子、 部分衍生自 IgG4 分子 的嵌合铰链。
本文所用术语 “轻链部分” 包括衍生自免疫球蛋白轻链， 如 κ 或 λ 轻链的氨基酸 序列。优选地， 所述轻链部分包含 VL 或 CL 结构域中的至少一个。
本文所述的抗 -CD100 抗体， 或其抗原结合片段、 变体或衍生物可根据它们识别或 特异性结合的抗原如本文所述的靶多肽 ( 如 CD100) 的表位或部分进行描述或说明。靶多 肽与抗体的抗原结合域特异性相互作用的部分是 “表位” 或 “抗原决定簇” 。靶多肽可包含 单个表位， 但通常包含至少两个表位， 并可包括任意数量的表位， 这取决于抗原的大小、 构 象和类型。而且， 应该注意到， 靶多肽上的 “表位” 可以是或可包括非多肽元件， 例如表位可 包括糖侧链。
据信， 抗体的肽或多肽表位最小大约是 4-5 个氨基酸。肽或多肽表位优选包含至 少七个， 更优选至少九个， 最优选至少约 15 个至 30 个氨基酸。由于 CDR 能以三联形式识 别抗原性肽或多肽， 所以包含表位的氨基酸不一定是毗连的， 在某些情况下甚至不一定在 同一肽链上。本发明抗 -CD100 抗体识别的肽或多肽表位可包含 CD100 中至少 4 个、 至少 5 个、 至少 6 个、 至少 7 个、 更优选至少 8 个、 至少 9 个、 至少 10 个、 至少 15 个、 至少 20 个、 至 少 25 个、 或约 15 至 30 个毗连或非毗连的氨基酸的序列。
“特异性结合” 通常指该抗体通过其抗原结合域结合于表位， 并且该结合必然伴随 着抗原结合域和表位之间的某种程度的互补。按照这一定义， 抗体通过其抗原结合域与表 位的结合易于与随机无关表位的结合时， 称该抗体 “特异性结合” 该表位。本文术语 “特异 性” 用于定性分析某种抗体与某种表位结合的相对亲和力。例如， 可认为抗体 “A” 对某给定 表位的特异性高于抗体 “B” ， 或者可以说抗体 “A” 结合表位 “C” 的特异性高于它对相关表位 “D” 的特异性。
“优先结合” 指与结合相关的、 相似的、 同源的或类似的表位相比， 该抗体更容易特 异性结合某表位。因此， 与相关表位相比， “优先结合” 给定表位的抗体更可能结合该表位， 即便这种抗体可能与相关表位发生交叉反应。
作为非限制性示例， 如果抗体与第一表位结合的解离常数 (KD) 低于抗体与第二表 位的 KD， 则可认为抗体优先结合第一表位。 在另一个非限制性例子中， 如果抗体与第一表位 结合的亲和力使 KD 比抗体与第二表位的 KD 低至少一个数量级， 则可认为抗体优先结合第一 抗原。在另一个非限制性例子中， 如果抗体与第一表位结合的亲和力使 KD 比抗体与第二表 位的 KD 低至少两个数量级， 则可认为抗体优先结合第一表位。
在另一个非限制性例子中， 如果抗体与第一表位结合的解离速率 (k(off)) 比抗 体与第二表位的 k(off) 低， 则可认为抗体优先结合第一表位。在另一个非限制性例子中，如果抗体与第一表位结合的亲和力使 k(off) 比抗体与第二表位的 k(off) 低至少一个数量 级， 则可认为抗体优先结合第一表位。 在另一个非限制性例子中， 如果抗体与第一表位结合 的亲和力使 k(off) 比抗体与第二表位的 k(off) 低至少两个数量级， 则可认为抗体优先结 合第一表位。 可以说， 本文所述的抗体或其抗原结合片段、 变体或衍生物结合本文公开的靶 多肽 ( 如 CD100， 如人、 鼠或者人和鼠的 CD100) 或其片段或变体， 其解离速率 (k(off)) 低于 -2 -1 -2 -1 -3 -1 -3 -1 或等于 5X10 s 、 10 s 、 5X10 s 或 10 s 。 更优选地， 可以说， 本发明抗体结合本文所述的 靶多肽 ( 如 CD100， 如人、 鼠、 或者人和鼠的 CD100) 或其片段或变体， 其解离速率 (k(off)) -4 -1 -4 -1 -5 -1 -5 -1 -6 -1 -6 -1 低于或等于 5X10 s 、 10 s 、 5X10 s 、 或 10 s 、 5X10 s 、 10 s 、 5X10-7s-1 或 10-7s-1。
可以说， 本文所述的抗体或其抗原结合片段、 变体或衍生物结合本文公开的靶多 肽 ( 如 CD100， 如人、 鼠或者人和鼠 CD100) 或其片段或变体， 其结合速率 (k(on)) 高于或等 3 -1 -1 3 -1 -1 4 -1 -1 4 -1 -1 于 10 M s 、 5X10 M s 、 10 M s 或 5X10 M s 。 更优选地， 可以说， 本发明抗体结合本文公开 的靶多肽 ( 如 CD100， 如人、 鼠或者人和鼠的 CD100) 或其片段或变体， 其结合速率 (k(on)) 5 -1 -1 5 -1 -1 6 -1 -1 6 -1 -1 7 -1 -1 高于或等于 10 M s 、 5X10 M s 、 10 M s 或 5X10 M s 或 10 M s 。
如果抗体优先结合给定表位以至于在某种程度上阻断参比抗体与该表位的结合， 则称该抗体能竞争性抑制参比抗体与给定表位的结合。 竞争性抑制可通过本领域已知的任 何方法确定， 例如竞争 ELISA 实验。可以说， 抗体将参比抗体与给定表位的结合竞争性抑制 至少 90％、 至少 80％、 至少 70％、 至少 60％或至少 50％。 本文所用术语 “亲和力” 是单独表位与免疫球蛋白分子的 CDR 结合强度的衡量。参 见例如， Harlow 等 (1988)Antibodies ： A Laboratory Manual(《抗体 ： 实验室手册》 )( 冷泉 港实验室出版社 (Cold Spring Harbor Laboratory Press)， 第 2 版 )， 第 27-28 页。本文 所用术语 “亲合力” 指免疫球蛋白群体和抗原间复合物的总体稳定性， 即免疫球蛋白混合物 与抗原的功能性结合强度。参见例如， Harlow， 第 29-34 页。亲合力既与群体中单独免疫球 蛋白分子与特定表位的亲和力相关， 也与免疫球蛋白分子和抗原的价态相关。 例如， 二价单 克隆抗体和具有高度重复表位结构的抗原， 例如多聚体之间的相互作用是高亲合力的一个 例子。
本发明的抗 -CD100 抗体或其抗原结合片段、 变体或其衍生物也可按照其交叉反 应性进行描述或说明。本文所用术语 “交叉反应性” 指对某一种抗原具有特异性的抗体与 第二种抗原发生反应的能力 ； 它是两种不同抗原性物质之间相关性的衡量。 因此， 如果抗体 结合于诱导其形成的表位以外的其他表位， 则它具有交叉反应性。交叉反应性表位通常含 有许多与诱导表位相同的互补结构特征， 在某些情况下甚至比原始表位更适用。
例如， 某些抗体具有一定程度的交叉反应性， 因为它们结合相关但不相同的表位， 例如， 与参比表位至少 95％、 至少 90％、 至少 85％、 至少 80％、 至少 75％、 至少 70％、 至少 65％、 至少 60％、 至少 55％和至少 50％相同 ( 按照本领域已知方法和本文所述方法计算 ) 的表位。 如果抗体不结合与参比表位少于 95％、 少于 90％、 少于 85％、 少于 80％、 少于 75％、 少于 70％、 少于 65％、 少于 60％、 少于 55％和少于 50％相同 ( 按照本领域已知方法和本文 所述方法计算 ) 的表位， 则可以说该抗体具有很小的交叉反应性或不具有交叉反应性。如 果某抗体不结合某表位的任何其它类似物、 直向同源物或同源物， 则可认为该抗体对该表 位 “高度特异” 。
本发明的抗 -CD100 结合分子， 如抗体或其抗原结合片段、 变体或衍生物可根据
与本发明多肽， 例如， CD100， 如人、 鼠或者人和鼠的 CD100 的结合亲和力进行描述或说明。 优选的结合亲和力包括解离常数或 Kd 低于 5x10-2M、 10-2M、 5x10-3M、 10-3M、 5x10-4M、 10-4M、 5x10-5M、 10-5M、 5x10-6M、 10-6M、 5x10-7M、 10-7M、 5x10-8M、 10-8M、 5x10-9M、 10-9M、 5x10-10M、 10-10M、 5x10-11M、 10-11M、 5x10-12M、 10-12M、 5x10-13M、 10-13M、 5x10-14M、 10-14M、 5x10-15M 或 10-15M 的那些。 在 某些实施方式中， 本发明的抗 -CD100 结合分子， 如抗体或其抗原结合片段结合人 CD100 的 -9 -9 Kd 约为 5x10 至 6x10 。在另一实施方式中， 本发明的抗 -CD100 结合分子， 如抗体或其抗 -9 -9 原结合片段结合鼠 CD100 的 Kd 约为 1x10 至 2x10 。
本发明的抗 -CD100 抗体或其抗原结合片段、 变体或衍生物可能是 “多特异性” 的， 例如是双特异性、 三特异性或更多特异性的， 这意味着它能同时识别和结合一种或多种不 同抗原 ( 如蛋白质 ) 上出现的两种或更多种不同表位。因此， 抗 -CD100 抗体是 “单特异性” 还是 “多特异性” 如 “双特异性” ， 是指结合多肽发生反应的不同表位的数量。多特异性抗体 可以是对本文所述的靶多肽的不同表位有特异性， 或是对靶多肽以及异源表位， 例如异源 多肽或固体支持材料有特异性。
本文所用术语 “价态” 指结合多肽或 CD100 结合分子， 如抗体或其抗原结合片段中 存在的潜在结合域， 如抗原结合域的数量。各结合域特异性结合一种表位。当结合多肽或 CD100 结合分子包含一个以上结合域时， 对具有两个结合域的抗体来说各结合域可特异性 结合同一表位时， 称为 “二价单特异性” ， 或对具有两个结合域的抗体来说特异性结合不同 表位时， 称为 “二价双特异性” 。 抗体或其抗原结合片段也可以是双特异性， 每种特异性有二 价 ( 称为 “双特异性四价抗体” )。在另一实施方式中， 可制备四价小抗体或结构域缺失抗 体。
双 特 异 性 二 价 抗 体 及 其 制 备 方 法 可 参 见 例 如， 美 国 专 利 号 5,731,168 ； 5,807,706 ； 5,821,333 ； 以及美国专利申请公开号 2003/020734 和 2002/0155537， 通过引 用将其全部内容纳入本文。双特异性四价抗体及其制备方法可参见例如， WO 02/096948 和 WO 00/44788， 通过引用将其全部内容纳入本文。总地参见， 国际公开号 WO 93/17715、 WO 92/08802、 WO 91/00360、 WO 92/05793 ； Tutt 等， J.Immunol.147 ： 60-69(1991) ； 美国 专 利 号 4,474,893、 4,714,681、 4,925,648、 5,573,920 和 5,601,819 ； 以 及 Kostelny 等， J.Immunol.148 ： 1547-1553(1992)。
如前所述， 各种免疫球蛋白类的恒定区的亚基结构和三维构型是众所周知的。本 文所用术语 “VH 结构域” 包括免疫球蛋白重链的氨基末端可变区， 术语 “CH1 结构域” 包括 免疫球蛋白重链的第一 ( 最靠氨基末端 ) 恒定区结构域。CH1 结构域邻近 VH 结构域， 并且 位于免疫球蛋白重链分子的绞链区的氨基末端。
本文所用术语 “CH2 结构域” 包括用常规编号方案大概从抗体的残基 244 延伸至残 基 360 的重链分子部分 ( 残基 244 至 360， Kabat 编号系统 ； 和残基 231-340， EU 编号系统 ； 参见 Kabat EA 等 )。CH2 结构域是独特的， 因为它与其它结构域不是紧密配对的。恰恰相 反， 两个 N- 连接的分支糖链间插在完整天然 IgG 分子的两个 CH2 结构域之间。CH3 结构域 已有很多记载， 它从 IgG 分子的 CH2 结构域向 C 末端延伸， 并包含大约 108 个残基。
本文所用术语 “绞链区” 包括连接 CH1 结构域和 CH2 结构域的重链分子部分。该绞 链区包括约 25 个残基并具有挠性， 因此使两个 N- 末端抗原结合区能独立移动。绞链区可 细分成三个不同结构域 ： 上部、 中部和下部绞链区 (Roux 等， J.Immunol.161 ： 4083(1998))。本文所用术语 “二硫键” 包括在两个硫原子之间形成的共价键。氨基酸半胱氨酸 包括可形成二硫键或与第二个巯基桥接的巯基。在大部分天然产生的 IgG 分子中， CH1 和 CL 区域通过二硫键相连， 两条重链通过对应于 Kabat 编号系统 239 和 242 位 (EU 编号系统 是 226 或 229 位 ) 的两个二硫键相连。
本文所用术语 “嵌合抗体” 指免疫反应性区域或位点获自或衍生自第一物种， 而恒 定区 ( 根据本发明， 可能是完整的、 一部分或修饰的 ) 获自第二物种的任何抗体。在优选实 施方式中， 靶结合区域或位点来自非人来源 ( 如小鼠或灵长动物 ) 而恒定区是人的 ( 例如， 本文所述的单克隆抗体 (MAb)2368)。
本文所用术语 “工程抗体” 指如果必要， 通过部分构架区置换和序列改变至少部 分置换来自已知特异性抗体的一个或多个 CDR， 以改变重链或轻链或二者中的可变区的抗 体。虽然 CDR 可衍生自与产生构架区的抗体属于同一类或亚类的抗体， 但考虑到 CDR 衍生 自不同类的抗体， 优选衍生自不同物种的抗体。 将已知特异性的非人抗体的一个或多个 “供 体” CDR 移植到人重链或轻链构架区内形成的工程抗体在本文中称为 “人源化抗体” 。可能 不一定需要用来自供体可变区的完整 CDR 代替所有 CDR 就能将一种可变区的抗原结合能力 转移给另一可变区。相反， 可能只需要转移维持靶结合活性所必需的那些残基。
进一步认识到， 人源化抗体的重链或轻链或二者中可变区内的构架区可仅包含 人来源的残基， 在这种情况下人源化抗体的这些构架区称为 “完全人构架区” ( 例如， MAb 2503)。或者， 如果需要， 可以在人源化抗体的重链或轻链或二者的可变区的人构架区的相 应位置内工程改造供体可变区的构架区的一个或多个残基， 以维持适当的结合或提高与 CD100 抗原的结合。因此， 以此方式工程改造的人构架区包含人和供体构架区残基的混合 物， 在本文中称为 “部分人构架区” 。
例如， 抗 -CD100 抗体的人源化过程可基本按照 Winter 和同事所述方法进行 (Jones 等， Nature 321 ： 522-525(1986) ； Riechmann 等， Nature 332 ： 323-327(1988) ； Verhoeyen 等， Science 239 ： 1534-1536(1988))， 即用啮齿动物或突变型啮齿动物 CDR 或 CDR 序列代替人抗 -CD100 抗体的相应序列。也参见美国专利号 5,225,539 ； 5,585,089 ； 5,693,761 ； 5,693,762 ； 5,859,205 ； 通过引用纳入本文。所得的人源化抗 -CD100 抗体将 在人源化抗体的重链和 / 或轻链的可变区的完全人构架区内， 包含至少一个啮齿动物或突 变型啮齿动物 CDR。在一些情况下， 人源化抗 -CD100 抗体的一个或多个可变区的构架区 内的残基被相应非人人 ( 例如， 啮齿动物 ) 残基代替 ( 参见例如， 美国专利号 5,585,089 ； 5,693,761 ； 5,693,762 ； 和 6,180,370)， 在这种情况下所得的人源化抗 -CD100 抗体将在重 链和 / 或轻链的可变区内包含部分人构架区。
而且， 人源化抗体可包含在受体抗体或供体抗体中没有的残基。 进行这些修饰， 以 进一步改善抗体性能 ( 例如， 获得所需亲和力 )。 通常， 人源化抗体将基本上包含至少一个、 通常两个可变区的全部， 其中全部或基本上全部的 CDR 对应于非人免疫球蛋白的 CDR， 全部 或基本上全部的构架区是人免疫球蛋白序列的构架区。 人源化抗体还任选包含至少一部分 免疫球蛋白恒定区 (Fc)， 一般是人免疫球蛋白的 Fc。更多的细节参见 Jones 等， Nature， 331 ： 522-525(1986) ； Riechmann 等， Nature， 332 ： 323-329(1988) ； 和 Presta， Curr. Op.Struct.Biol.， 2： 593-596(1992)， 通过引用全文纳入本文。因此， 这类 “人源化” 抗体可 包括其中明显小于完整的人可变区被来自非人物种的相应序列所取代的抗体。实践中， 人源化抗体通常是一些 CDR 残基和可能的一些构架残基被啮齿动物抗体中相似位点的残基 所取代的人抗体。参见例如， 美国专利号 5,225,539 ； 5,585,089 ； 5,693,761 ； 5,693,762 ； 5,859,205。也参见美国专利号 6,180,370 和国际公开号 WO 01/27160， 其中公开了人源化 抗体和用于产生对预定抗原亲和力提高的人源化抗体的技术。
本文所用术语 “连接” 、 “融合的” 和 “融合” 可以互换使用。这些术语指通过某些 方式如化学偶联或重组将两个或更多的元件或组件结合在一起。 “框内融合” 指以维持原有 ORF 正确翻译读框的方式， 将两个或多个多核苷酸开放阅读框 (ORF) 连接形成连续的较长 ORF。因此， 重组融合蛋白是包含两个或多个片段的单一蛋白质， 所述片段对应原始 ORF 编 码的多肽 ( 这些片段在自然条件下通常不如此连接 )。 尽管阅读框为连续的融合片段， 但片 段仍可被物理或空间分割， 如框内接头序列。例如， 编码免疫球蛋白可变区 CDR 的多核苷酸 可框内融合， 但用编码至少一个免疫球蛋白构架区或额外 CDR 区的多核苷酸间隔开， 只要 “融合的” CDR 作为连续多肽的一部分共同翻译。
在多肽的情况下， “线性序列” 或 “序列” 是多肽中从氨基到羧基的方向上氨基酸的 顺序， 在序列中相邻的残基是多肽一级结构中的毗连残基。
本文所用术语 “表达” 指基因产生生化物质如多肽的过程。 该过程包括在细胞内基 因的任何功能表现， 包括但不限于， 基因敲除以及瞬时表达和稳定表达。它包括但不限于， 基因转录成信使 RNA(mRNA) 和这类 mRNA 翻译成多肽。若最终期望产物是生化物质， 则表达 包括产生该生化物质和任何前体。基因表达产生 “基因产物” 。本文所用的基因产物可以是 核酸， 如基因转录产生的信使 RNA， 或由转录物翻译得到的多肽。本文所述的基因产物还包 括具有转录后修饰， 例如聚腺苷酸化的核酸， 或具有翻译后修饰， 如甲基化、 糖基化、 加入脂 质、 连接其它蛋白质亚基、 经蛋白酶水解切割等的多肽。
本文所用术语 “治疗” 和 “治疗处理” 都指治疗性处理和预防性或预防方法， 其目的 是防止或减缓 ( 缓解 ) 不期望的生理改变或病症， 例如多发性硬化、 关节炎或癌症的进展。 有益或所需的临床结果包括但不限于可检测或不可检测地 ： 缓解症状、 减轻疾病程度、 疾病 状态稳定 ( 即不恶化 )、 延迟或减缓疾病进展、 改善或减轻疾病状态和缓解 ( 部分或完全 )。 “治疗” 也可以指与不接受治疗的预计生存期相比延长生存期。需要治疗的人包括已经患有 病症或失调的人， 以及倾向于患有病症或失调的人或需预防病症或失调的人。
“对象” 或 “个体” 或 “动物” 或 “患者” 或 “哺乳动物” 指需要诊断、 预防或治疗的任 何对象， 特别是哺乳动物对象。 哺乳动物对象包括人、 饲养动物、 家畜和动物园动物、 运动动 物或宠物， 如犬、 猫、 豚鼠、 兔、 大鼠、 小鼠、 马、 牛、 奶牛等等。
本文所用术语 “给予抗 -CD100 抗体时能够获益的对象” 和 “需要治疗的动物” 包括 能够从给予抗 -CD100 抗体和 / 或从抗 -CD100 抗体治疗， 即减轻或预防疾病的治疗中获益 的对象， 如哺乳动物对象， 该抗体可用于 ( 例如 ) 检测抗 -CD100 多肽 ( 如用于诊断方法 )。 如本文更详细描述的， 抗 -CD100 抗体可以非偶联形式使用， 或者可偶联于 ( 例如 ) 药物、 前 药或同位素。
II. 靶多肽描述
本文所用术语 “CD100” 和 “CD100 多肽” 可互换使用。在某些实施方式中， CD100 在细胞表面表达或由细胞分泌。在另一实施方式中， CD100 结合于膜。在另一实施方式中， CD100 是可溶的， 如， sCD100。在其它实施方式中， CD100 可包括全长 CD100 或其片段， 或者CD100 变体多肽， 其中 CD100 的片段或 CD100 变体多肽保持全长 CD100 的一些或全部功能特 性。
全长人 CD100 蛋白是由两条 150kDa 的多肽链组成的同源二聚跨膜蛋白。 CD100 属 于细胞表面受体的脑信号蛋白家族， 也称为 SEMA4D。 人和小鼠 Sema4D/CD100 都可以由其跨 膜形式经蛋白水解切割形成 120-kDa 可溶形式， 表明存在两种 Sema4D 同种型 (Kumanogoh 等， J.Cell Science 116(7) ： 3464(2003))。脑信号蛋白由可溶性和膜结合的蛋白质组 成， 这些蛋白质最初定义为轴突 - 导向因子， 它在建立神经元和其合适靶点之间的准确联 系中起到重要作用。结构上视为 IV 类脑信号蛋白的 CD100 由氨基末端的信号序列， 后接 特征性 ‘Sema’ 结构域构成， 其包含 17 个保守的半胱氨酸残基、 Ig- 样结构域、 富赖氨酸臂 (stretch)、 疏水性跨膜区和胞质尾。
CD100 的各多肽链包括约 13 个氨基酸的信号序列， 后接约 512 个氨基酸的脑信号 蛋白结构域、 约 65 个氨基酸的免疫球蛋白 - 样 (Ig- 样 ) 结构域、 104 个氨基酸的富赖氨酸 臂、 约 19 个氨基酸的疏水性跨膜区和 110 个氨基酸的胞质尾。胞质尾中酪氨酸磷酸化的共 有位点支持预测的 CD100 与酪氨酸激酶的结合 (Schlossman 等编 (1995)Leucocyte Typing V(《白细胞分型 V》 )( 牛津的牛津大学出版社 (Oxford University Press， Oxford))。
已经鉴定了 CD100 的两类受体。一种受体 -- 丛蛋白 -B1 在非淋巴样组织中表达， 是 CD100 的高亲和 (1nM) 受体 (Tamagnone 等， Cell 99 ： 71-80(1999))。已证明， CD100 刺 激丛蛋白 B1 信号转导能诱导神经元的生长锥破坏， 并诱导少突胶质细胞的突起延伸破坏 (process extension collapse) 和凋亡 (Giraudon 等， J.Immunol.172 ： 1246-1255(2004) ； Giraudon 等， NeuroMolecular Med.7 ： 207-216(2005))。 与 CD100 结 合 后， 丛 蛋 白 B1 信 号转导介导 R-Ras 的失活， 导致整联蛋白介导的与胞外基质的附连降低， 以及 Rho 激活， 导 致 细 胞 骨 架 重 排 造 成 的 细 胞 破 坏。 参 见 Kruger 等， Nature Rev.Mol.Cell Biol.6 ： 789-800(2005) ； Pasterkamp， TRENDS in Cell Biology 15 ： 61-64(2005))。
在淋巴组织中， CD72 用作低亲和 (300nM)CD 100 受体 (Kumanogoh 等， Immunity 13 ： 621-631(2000))。 B 细胞和 APC 表达 CD72， 抗 -CD72 抗体具有与 sCD100 相同的许多作用， 如增强 CD40 诱导的 B 细胞应答和 B 细胞排出 CD23。认为 CD72 可通过征集能结合很多抑制 性受体的酪氨酸磷酸酶 SHP-1 用作 B 细胞应答的负调节物。CD100 与 CD72 的相互作用导致 SHP-1 的解离， 从而丢失该负激活信号。 已证明， CD100 能在体外促进 T 细胞刺激以及 B 细胞 的聚集和存活。 加入表达 CD100 的细胞或 sCD100 能在体外增强 CD40 诱导的 B 细胞增殖和免 疫球蛋白产量， 并在体内加速抗体应答 (Ishida 等， Inter.Immunol.15 ： 1027-1034(2003) ； Kumanogoh 和 H.Kukutani， Trends in Immunol.22 ： 670-676(2001))。sCD100 增 强 CD40 诱导的 DC 成熟， 包括上调共同刺激分子和增加 IL-12 分泌。此外， sCD100 可抑制免疫 细胞迁移， 这种抑制作用可通过加入阻断性抗 -CD100 小鼠抗体得以逆转 (Elhabazi 等， J.Immunol.166 ： 4341-4347(2001) ； Delaire 等， J.Immunol.166 ： 4348-4354(2001))。
Sema4D 在淋巴器官和非淋巴器官中高水平表达， 所述淋巴器官包括脾脏、 胸腺和 淋巴结， 所述非淋巴器官包括例如， 脑、 心和肾。在淋巴器官中， Sema4D 在静息 T 细胞上大 量表达， 但在静息 B 细胞和抗原提呈细胞 (APC)， 如树突细胞 (DC) 上表达很弱。
细胞活化能提高 CD100 的表面表达， 以及可溶性 CD100(sCD100) 的产生。CD100 的表达模式提示， 它在免疫系统中起到重要的生理学和病理学作用。已证明， CD100 能促进B 细胞活化、 聚集和存活 ； 增加 CD40 诱导的增殖和抗体产生 ； 增强对 T 细胞依赖性抗原的 抗体应答 ； 增加 T 细胞增殖 ； 增强树突细胞的成熟和刺激 T 细胞的能力 ； 并且与脱髓鞘和轴 突变性直接相关联 (Shi 等， Immunity 13 ： 633-642(2000) ； Kumanogoh 等， J Immunol 169 ： 1175-1181(2002) ； 和 Watanabe 等， J Immunol 167 ： 4321-4328(2001))。
CD100 敲除 (CD100-/- 小鼠已提供额外证据证明 CD100 在体液免疫和细胞免疫应 答中均起到重要作用。 尚不了解 CD100-/- 小鼠中非淋巴组织的任何异常。 来自 CD100-/- 小 鼠的树突细胞 (DC) 具有较差的同种异体刺激 (allostimulatory) 能力， 并显示共同刺激 分子的表达有缺陷， 该缺陷可通过加入 sCD100 加以挽救。CD100 缺陷小鼠 (CD100-/-) 无 法产生髓磷脂少突胶质细胞糖蛋白肽诱导的实验性自身免疫性脑脊髓炎， 因为在不存在 CD100 时不产生髓磷脂少突胶质细胞糖蛋白 - 特异性 T 细胞 (Kumanogoh 等， J Immunol169 ： 1175-1181(2002))。还在易生自身免疫病的 MRL/lpr 小鼠 ( 全身性自身免疫病如 SLE 的模 型 ) 的血清中检测到显著量的可溶性 CD100， 但在正常小鼠中检测不到。另外， sCD100 水平 与自身抗体水平相关， 并随年龄增加 (Wang 等， Blood 97 ： 3498-3504(2001))。还证明， 可 溶性 CD100 能在脱髓鞘疾病患者的脑脊液和血清中累积， 而 sCD100 能诱导人全能神经前体 (Dev 细胞 ) 凋亡， 二者在体外都抑制突起延伸并诱导大鼠少突胶质细胞的凋亡 (Giraudon 等， JImmunol 172(2) ： 1246-1255(2004))。此种凋亡被抗 -CD100MAb 阻断。 III. 抗 -CD100 抗体
本领域记载了结合 CD100 的抗体。参见例如， 美国公开号 2008/0219971A1， 国际 专利申请 WO 93/14125 和 Herold 等， Int.Immunol.7(1) ： 1-8(1995)， 通过引用全文纳入本 文。
本发明抗体包含结合于 CD100 的抗 -CD100 抗体或其抗原结合片段、 变体或衍生 物， 如 MAb 2503、 MAb 67 和 MAb 76。在某些实施方式中， 抗 -CD100 抗体结合人、 鼠或者人 和鼠的 CD100。在其它实施方式中， 抗 -CD100 抗体阻断 CD100 结合其受体如丛蛋白 -B。
在一个实施方式中， 本发明提供分离的结合分子， 如抗体或其抗原结合片段， 它们 特异性结合的 CD100 表位与单克隆抗体 2503、 67 或 76 相同。在另一个实施方式中， 本发明 提供分离的结合分子， 如抗体或其抗原结合片段， 它们特异性结合 CD100 并竞争性抑制单 克隆抗体 2503、 67 或 76 特异性结合 CD100 如人、 鼠或者人和鼠的 CD100。
在某些实施方式中， 本发明结合分子的氨基酸序列与参比抗 -CD100 抗体分子的 氨基酸序列的序列相同性至少约 80％、 约 85％、 约 88％、 约 89％、 约 90％、 约 91％、 约 92％、 约 93％、 约 94％或约 95％。在另一个实施方式中， 所述结合分子与参比抗体的序列相同性 为至少约 96％、 约 97％、 约 98％、 约 99％或 100％。
在另一实施方式中， 本发明提供分离的抗体或其抗原结合片段， 它包含免疫球蛋 白重链可变区 (VH 结构域 )、 基本由其组成或由其组成， 其中所述 VH 结构域的至少一个 CDR 具有与 SEQ ID NO ： 9 或 10 的 CDR1、 CDR2 或 CDR3 至少约 80％、 约 85％、 约 90％、 约 95％、 约 96％、 约 97％、 约 98％、 约 99％相同或完全相同的氨基酸序列。
在另一实施方式中， 本发明提供分离的抗体或其抗原结合片段， 它包含免疫球蛋 白重链可变区 (VH 结构域 )、 基本由其组成或由其组成， 其中所述 VH 结构域的至少一个 CDR 具有与 SEQ ID NO ： 6、 SEQ ID NO ： 7 或 SEQ ID NO ： 8 至少约 80％、 约 85％、 约 90％、 约 95％、 约 96％、 约 97％、 约 98％、 约 99％相同或完全相同的氨基酸序列。
在另一实施方式中， 本发明提供分离的抗体或其抗原结合片段， 它包含免疫球蛋 白重链可变区 (VH 结构域 )、 基本由其组成或由其组成， 其中所述 VH 结构域的至少一个 CDR 具有除 1、 2、 3、 4 或 5 个保守氨基酸取代外， 与 SEQID NO ： 6、 SEQ ID NO ： 7 或 SEQ ID NO ： 8 相同的氨基酸序列。
在另一实施方式中， 本发明提供分离的抗体或其抗原结合片段， 它包含 VH 结构 域、 基本由其组成或由其组成， 该 VH 结构域具有与 SEQ ID NO ： 9 或 SEQ ID NO ： 10 至少 约 80％、 约 85％、 约 90％、 约 91％、 约 92％、 约 93％、 约 94％、 约 95％、 约 96％、 约 97％、 约 98％、 约 99％或 100％相同的氨基酸序列， 其中包含编码的 VH 结构域的抗 -CD100 抗体特异 性或优先结合 CD100。
在另一实施方式中， 本发明提供分离的抗体或其抗原结合片段， 它包含免疫球蛋 白轻链可变区 (VL 结构域 )、 基本由其组成或由其组成， 其中所述 VL 结构域的至少一个 CDR 具有与 SEQ ID NO ： 17 或 18 的 CDR1、 CDR2 或 CDR3 至少约 80％、 约 85％、 约 90％、 约 95％、 约 96％、 约 97％、 约 98％、 约 99％相同或完全相同的氨基酸序列。
在另一实施方式中， 本发明提供分离的抗体或其抗原结合片段， 它包含免疫球蛋 白轻链可变区 (VL 结构域 )、 基本由其组成或由其组成， 其中所述 VL 结构域的至少一个 CDR 具有与 SEQ ID NO ： 14、 SEQ ID NO ： 15 或 SEQ ID NO ： 16 至少约 80％、 约 85％、 约 90％、 约 95％、 约 96％、 约 97％、 约 98％、 约 99％相同或完全相同的氨基酸序列。
在另一实施方式中， 本发明提供分离的抗体或其抗原结合片段， 它包含免疫球蛋 白轻链可变区 (VL 结构域 )、 基本由其组成或由其组成， 其中所述 VL 结构域的至少一个 CDR 具有除 1、 2、 3、 4 或 5 个保守氨基酸取代外， 与 SEQ IDNO ： 14、 SEQ ID NO ： 15 或 SEQ ID NO ： 16 相同的氨基酸序列。
在另一实施方式中， 本发明包括分离的抗体或其抗原结合片段， 它包含 VL 结构 域、 基本由其组成或由其组成， 该 VL 结构域具有与 SEQ ID NO ： 17 或 SEQ ID NO ： 18 至少 约 80％、 约 85％、 约 90％、 约 91％、 约 92％、 约 93％、 约 94％、 约 95％、 约 96％、 约 97％、 约 98％、 约 99％或 100％相同的氨基酸序列， 其中包含编码的 VL 结构域的抗 -CD100 抗体特异 性或优先结合 CD100。
本发明抗 -CD100 抗体的合适的生物活性变体可用于本发明方法。这种变体将保 持母体抗 -CD100 抗体的所需结合性质。制备抗体变体的方法是本领域通常可获得的。
诱 变 和 改 变 核 苷 酸 序 列 的 方 法 是 本 领 域 众 所 周 知 的。 参 见 例 如， Walker 和 Gaastra 编 (1983)Techniques in Molecular Biology(《分子生物学技术》 )( 纽约麦克米 兰出版公司 (MacMillan Publishing Company)) ； Kunkel， Proc.Natl.Acad.Sci.USA 82 ： 488-492(1985) ； Kunkel 等， Methods Enzymol.154 ： 367-382(1987) ； Sambrook 等 (1989) Molecular Cloning ： A Laboratory Manual(《分子克隆 ： 实验室手册》 )( 纽约州冷泉港 (Cold Spring Harbor， N.Y.)) ； 美国专利号 4,873,192 ； 和其中引用的参考文献 ； 通过引用 全文纳入本文。 有关不影响感兴趣多肽生物学活性的合适氨基酸取代的指南可参见下述文 献中的模型 ： Dayhoff 等 (1978)， Atlas of Protein Sequence and Structure(《蛋白质 序列和结构图册》 )( 华盛顿特区的国家生物医学研究基金会 (Natl.Biomed.Res.Found.， Washington， D.C.))， 第 345-352 页， 通过引用全文纳入本文。Dayhoff 等的模型利用点 接受突变 (Point Accepted Mutation， PAM) 氨基酸相似矩阵 (PAM 250 矩阵 ) 来确定合适的保守性氨基酸取代。可能优选保守取代， 如用具有相似特性的另一氨基酸交换某种 氨基酸。Dayhoff 等的模型中 PAM 250 矩阵教导的保守氨基酸取代的例子包括但不限于 ： 和 在构建抗 -CD100 结合分子， 如抗体或其抗原结合片段的过程中， 制得感兴趣多 肽、 修饰物以使变体仍具有所需特性， 例如， 能够特异性结合 CD100， 如人、 鼠或者人和鼠的 CD100， 例如， 在细胞表面表达或由细胞分泌的 CD100， 并具有 CD100 阻断活性， 如本文所述。 显然， 编码变体多肽的 DNA 中出现的任何突变一定不能将序列置于阅读框外， 优选不产生 可产生二级 mRNA 结构的互补区。参见欧洲专利申请公开号 75,444。
测定抗 -CD100 结合分子， 如抗体或其抗原结合片段的结合特异性的方法包括 但不限于 ： 标准竞争结合实验、 T 细胞或 B 细胞的免疫球蛋白分泌的监测实验、 T 细胞 增 殖 实 验、 凋 亡 实 验、 ELISA 实 验 等。 参 见 例 如， WO 93/14125 ； Shi 等， Immunity 13 ： 633-642(2000) ； Kumanogoh 等， J Immunol 169 ： 1175-1181(2002) ； Watanabe 等， J Immunol 167 ： 4321-4328(2001) ； Wang 等， Blood97 ： 3498-3504(2001) ； 和 Giraudon 等， J Immunol 172(2) ： 1246-1255(2004) 公开的实验， 通过引用将其全文纳入本文。
本文在讨论本文公开的任何具体多肽， 包括恒定区、 CDR、 VH 结构域或 VL 结构域是 否与另一多肽至少约 65％、 约 70％、 约 75 ％、 约 80 ％、 约 85 ％、 约 90 ％、 约 91 ％、 约 92 ％、 约 93％、 约 94％、 约 95％、 约 96％、 约 97％、 约 98％、 约 99％或者甚至约 100％相同时， 相同 性％可采用本领域已知的方法和计算机程序 / 软件测定， 例如但不限于 BESTFIT 程序 ( 威 斯康星序列分析软件包， 用于 Unix 系统的第 8 版， 遗传学计算机团队 (Genetics Computer Group)， 大 学 研 究 园 区 (University Research Park)， 科 学 大 道 575 号 (575 Science Drive)， 威斯康星州麦迪逊 )， 53711)。BESTFIT 利用 Smith 和 Waterman(1981)Adv.Appl. Math.2 ： 482-489 的局部同源性算法， 找到两条序列之间的最佳同源性区段。使用 BESTFIT 或任何其它序列比对程序来确定某具体序列是否与本发明参比序列 ( 例如 )95％相同时， 当然要设定参数使得在参比多肽序列的全长上计算相同性百分数， 并且在参比序列的氨基 酸总数中允许至多有 5％的同源性缺口。
出于本发明目的， 可采用史密斯 - 沃特曼 (Smith-Waterman) 同源性搜索算法测 定序列相同性百分数， 该算法使用仿射缺口搜索， 其中缺口开放罚 12 分， 缺口延伸罚 2 分， BLOSUM 矩阵计 62 分。Smith 和 Waterman(1981)Adv.Appl.Math.2 ： 482-489 中公开了史密 斯 - 沃特曼同源性搜索算法。变体与参比抗 -CD100 抗体 ( 如 MAb 2503、 67 或 76) 可以相 差， 例如， 少至 1-15 个氨基酸残基， 少至 1-10 个氨基酸残基， 如 6-10 个， 少至 5 个， 少至 4、 3、 2、 或者甚至 1 个氨基酸残基。
能够特异性结合 CD100 并保留所需 CD100 阻断活性的多肽的准确化学结构取决于 多种因素。由于分子中存在可离子化的氨基和羧基， 可获得酸盐或碱盐或中性形式的特定 多肽。 放入合适环境条件中保持生物学活性的所有这类制备物均落入本文所用的抗 -CD100 抗体的定义范围内。另外， 可利用糖部分 ( 糖基化 ) 或其它补充分子如脂质、 磷酸酯 ( 盐 )、 乙酰基等衍生化， 以扩充所述多肽的一级氨基酸序列。也可通过与糖偶联进行扩充。这种 扩充的某些方面通过生产宿主的翻译后加工系统实现 ； 其它这类修饰可在体外引入。在任 何情况下， 这类修饰均包括在本文所用抗 -CD100 抗体的定义范围内， 只要抗 -CD100 抗体的 所需特性不被破坏。在不同实验中， 预计这类修饰可通过提高或降低多肽活性定量或定性
地影响活性。而且， 可通过氧化、 还原或其它衍生化方法修饰链内单独氨基酸残基， 可切割 所述多肽以获得保留活性的片段。不破坏所需特性 ( 如 CD100 的结合特异性、 结合亲和力 和 CD100 阻断活性 ) 的这类改变不会使该多肽序列从本文所述的感兴趣的抗 -CD100 抗体 的定义中剥离。
本领域提供有关制备和使用多肽变体的大量指导。在制备抗 -CD100 结合分子， 如 抗体或其抗原结合片段、 变体时， 本领域技术人员不难确定对天然蛋白质的核苷酸或氨基 酸序列进行何种修饰将产生适合用作本发明方法所用的药物组合物的治疗活性组分的变 体。
可以多种方式使抗 -CD100 抗体的恒定区突变以改变效应物功能。例如， 参见美国 专利号 6,737,056B1 和美国专利申请公开号 2004/0132101A1， 其公开了优化抗体与 Fc 受体 结合的 Fc 突变。
在某些抗 -CD100 抗体中， 可利用本领域已知技术突变 Fc 部分以降低效应物功能。 例如， 恒定区结构域的缺失或失活 ( 通过点突变或其它方式 ) 可降低循环的修饰抗体与 Fc 受体的结合， 从而提高肿瘤定位。 在其它情况下， 可能是与本发明相一致的恒定区修饰降低 互补物结合， 从而缩短所偶联细胞毒素的血清半衰期和非特异性结合。可利用恒定区的其 它修饰来改变二硫键连接或寡糖部分， 以便因抗原特异性或抗体柔性提高而加强定位。无 需过多实验， 即可容易地利用熟知的免疫学技术测定或定量分析修饰所得的生理学概况、 生物利用度和其它生化作用， 如肿瘤定位、 生物分布和血清半衰期。
本发明抗 -CD100 抗体也包括修饰的衍生物， 例如通过将任何类型的分子共价连 接到抗体上， 使得该共价连接不会防止抗体特异性结合其关联表位而修饰的衍生物。例如 但不限于， 抗体衍生物包括通过， 例如糖基化、 乙酰化、 PEG 化、 磷酸化、 酰胺化、 通过已知保 护 / 封闭基团衍生化、 蛋白水解切割、 连接于细胞配体或其它蛋白质等方法修饰的抗体。通 过已知技术可进行多种化学修饰， 包括但不限于 ： 特异性化学切割、 乙酰化、 甲酰化等。此 外， 衍生物可包含一种或多种非经典氨基酸。
“保守性氨基酸取代” 是氨基酸残基被具有带相似电荷的侧链的氨基酸残基取代。 本领域已定义具有带相似电荷的侧链的氨基酸残基家族。这些家族包括， 具有碱性侧链的 氨基酸 ( 如赖氨酸、 精氨酸、 组氨酸 )、 具有酸性侧链的氨基酸 ( 如天冬氨酸、 谷氨酸 )、 具有 不带电的极性侧链的氨基酸 ( 如甘氨酸、 天冬酰胺、 谷氨酰胺、 丝氨酸、 苏氨酸、 酪氨酸、 半 胱氨酸 )、 具有非极性侧链的氨基酸 ( 如丙氨酸、 缬氨酸、 亮氨酸、 异亮氨酸、 脯氨酸、 苯丙氨 酸、 甲硫氨酸、 色氨酸 )、 具有 β- 分支侧链的氨基酸 ( 如苏氨酸、 缬氨酸、 异亮氨酸 ) 和具有 芳族侧链的氨基酸 ( 如酪氨酸、 苯丙氨酸、 色氨酸、 组氨酸 )。或者， 也可沿所有或一部分编 码序列随机引入突变 ( 例如通过饱和诱变 )， 可筛选所得突变体的生物学活性， 以鉴定保持 活性 ( 例如， 结合抗 -CD100 多肽的能力 ) 的突变体。
例如， 可能仅在抗体分子的构架区内或仅在 CDR 区内引入突变。引入的突变可能 是沉默或中性错义突变， 即对抗体的抗原结合能力没有影响或影响很小。可使用这些突变 类型来优化密码子使用， 或提高杂交瘤的抗体产量。 或者， 非中性错义突变可改变抗体的抗 原结合能力。大部分沉默和中性错义突变的位置可能位于构架区内， 而大部分非中性错义 突变的位置可能在 CDR 内， 但这不是必然的要求。本领域技术人员能够设计和检测具有所 需特性， 例如抗原结合活性无改变或结合活性有改变 ( 如抗原结合活性提高或抗体特异性改变 ) 的突变分子。诱变后， 可通过常规方式表达编码蛋白， 并可利用本文所述技术或本领 域已知的常规修饰技术测定该编码蛋白的功能和 / 或生物学活性 ( 例如， 免疫特异性结合 CD100 多肽的至少一个表位的能力 )。
在 某 些 实 施 方 式 中， 本 发 明 抗 -CD100 抗 体 包 含 至 少 一 个 优 化 的 互 补 决 定 区 (CDR)。 “优化 CDR” 指该 CDR 已被修饰， 并且根据赋予包含该优化 CDR 的抗 -CD100 抗体的 维持或提高的结合亲和力和 / 或抗 -CD100 活性选择优化序列。 “抗 -CD100 活性” 或 “CD100 阻断活性” 可包括调节一种或多种与 CD100 相关的下述活性的活性 ： B 细胞活化、 聚集和存 活； CD40- 诱导的增殖和抗体生产 ； 对 T 细胞依赖性抗原的抗体应答 ； T 细胞或其它免疫细 胞增殖 ； 树突细胞成熟 ； 脱髓鞘和轴突变性 ； 全能神经前体和 / 或少突胶质细胞的凋亡 ； 诱 导内皮细胞迁移 ； 抑制自发性单核细胞迁移 ； 结合细胞表面丛蛋白 B1 ； 或与可溶性 CD100 或 CD100+ 细胞表面上表达的 CD100 相关的任何其它活性。 抗 -CD100 活性也用于解释 CD100 表达相关性疾病的发病率或严重程度降低， 这些疾病包括但不限于 ： 某些类型的淋巴瘤， 自身免疫病， 炎性疾病， 包括中枢神经系统 (CNS) 和周围神经系统 (PNS) 炎性疾病， 移植物 排斥和侵袭性血管新生。基于鼠抗 -CD100 MAb BD16 和 BB18 的优化抗体的例子可参见美 国公开号 2008/0219971A1， 国际专利申请 WO 93/14125 和 Herold 等， Int.Immunol.7(1) ： 1-8(1995)， 通过引用全文纳入本文。所述修饰可包括置换 CDR 内的氨基酸残基， 以使 抗 -CD100 抗体保持对 CD100 抗原的特异性并提高结合亲和力和 / 或提高抗 -CD100 活性。
IV. 编码抗 -CD100 抗体的多核苷酸
本发明还提供编码本发明抗 -CD100 抗体， 或其抗原结合片段、 变体或衍生物的核 酸分子。
在一个实施方式中， 本发明提供分离的多核苷酸， 它包含免疫球蛋白重链可变区 (VH 结构域 ) 的编码核酸、 基本由其组成或由其组成， 其中所述 VH 结构域的至少一个 CDR 具 有与 SEQ ID NO ： 3、 SEQ ID NO ： 4 或 SEQ ID NO ： 5 所示多核苷酸序列至少约 80％、 约 85％、 约 90％、 约 95％、 约 96％、 约 97％、 约 98％、 约 99％相同或完全相同的氨基酸序列。
在其它实施方式中， 本发明提供分离的多核苷酸， 其包含免疫球蛋白 VH 结构域的 编码核酸、 基本由其组成或由其组成， 其中所述 VH 结构域的至少一个 CDR 选自 ： (a) 包含 SEQ ID NO ： 6 所示氨基酸序列的 CDR1 ； (b) 包含 SEQID NO ： 7 所示氨基酸序列的 CDR2 ； 和 (c) 包含 SEQ ID NO ： 8 所示氨基酸序列的 CDR3。
在另一个实施方式中， 本发明包括分离的多核苷酸， 其包含 VH 结构域的编码核 酸、 基本由其组成或由其组成， 其中所述 VH 结构域具有与包含 SEQ IDNO ： 9 或 SEQ ID NO ： 10 的参比 VH 结构域多肽序列至少约 80％、 约 85％、 约 90％、 约 91％、 约 92％、 约 93％、 约 94％、 约 95％、 约 96％、 约 97％、 约 98％、 约 99％或 100％相同的氨基酸序列， 其中包含所述 编码的 VH 结构域的抗 -CD100 抗体特异性或优先结合 CD100。
在一个实施方式中， 本发明提供分离的多核苷酸， 它包含免疫球蛋白轻链可变区 (VL 结构域 ) 的编码核酸、 基本由其组成或由其组成， 其中所述 VL 结构域的至少一个 CDR 具有与 SEQ ID NO ： 11、 SEQ ID NO ： 12 或 SEQ ID NO ： 13 所示多核苷酸序列至少约 80％、 约 85％、 约 90％、 约 95％、 约 96％、 约 97％、 约 98％、 约 99％相同或完全相同的氨基酸序列。
在其它实施方式中， 本发明提供分离的多核苷酸， 其包含免疫球蛋白 VL 结构域的 编码核酸、 基本由其组成或由其组成， 其中所述 VL 结构域的至少一个 CDR 选自 ： (a) 包含SEQ ID NO ： 14 所示氨基酸序列的 CDR1 ； (b) 包含 SEQ ID NO ： 15 所示氨基酸序列的 CDR2 ； 和 (c) 包含 SEQ ID NO ： 16 所示氨基酸序列的 CDR3。
在另一个实施方式中， 本发明包括分离的多核苷酸， 其包含 VL 结构域的编码核 酸、 基本由其组成或由其组成， 其中所述 VL 结构域具有与包含 SEQ IDNO ： 17 或 SEQ ID NO ： 18 的参比 VL 结构域多肽序列至少约 80％、 约 85％、 约 90％、 约 91％、 约 92％、 约 93％、 约 94％、 约 95％、 约 96％、 约 97％、 约 98％、 约 99％或 100％相同的氨基酸序列， 其中包含所述 编码的 VL 结构域的抗 -CD100 抗体特异性或优先结合 CD100。
上述任何多核苷酸还可包含编码， 例如， 信号肽以指导编码多肽、 本文所述抗体恒 定区或本文所述其它异源多肽的分泌的额外核酸。 另外， 如本文另作详述， 本发明包括包含 一种或多种上述多核苷酸的组合物。
在一个实施方式中， 本发明包括包含第一多核苷酸和第二多核苷酸的组合物， 其 中所述第一多核苷酸编码本文所述的 VH 结构域， 所述第二多核苷酸编码本文所述的 VL 结 构域。具体说， 组合物包含编码 VH 结构域的多核苷酸和编码 VL 结构域的多核苷酸、 基本由 其组成或由其组成， 其中编码 VH 结构域的多核苷酸如 SEQ ID NO ： 19 或 SEQ ID NO ： 20 所 示， 编码 VL 结构域的多核苷酸如 SEQ ID NO ： 21 或 SEQ ID NO ： 22 所示。 如本文另述， 本发明还包括本发明多核苷酸的片段。 此外， 本发明还考虑编码本文 所述的融合多肽、 Fab 片段和其它衍生物的多核苷酸。
所述多核苷酸可通过本领域已知的任何方法产生或生产。例如， 如果抗体的核苷 酸序列已知， 则可由化学合成的寡核苷酸组装编码该抗体的多核苷酸 ( 如 Kutmeier 等， BioTechniques 17 ： 242(1994) 所述 )， 简言之， 该方法包括合成含有编码该抗体的序列的 某部分的重叠寡核苷酸， 使这些寡核苷酸退火和连接， 然后通过 PCR 扩增连接的寡核苷酸。
或者， 编码本发明抗 -CD100 抗体， 或其抗原结合片段、 变体或衍生物的多核苷酸 可由合适来源的核酸产生。如果无法获得含有编码特定抗体的核酸的克隆， 但该抗体分子 的序列已知， 则可通过化学合成或利用可与该序列 3′和 5′端杂交的合成引物进行 PCR 扩增、 或利用具体基因序列的特异性寡核苷酸探针进行克隆以鉴定 cDNA 文库中编码该抗 体或其它抗 -CD100 抗体的 cDNA 克隆， 由合适来源 ( 如抗体 cDNA 文库， 或由表达该抗体或 其它抗 -CD100 抗体的任何组织或细胞， 如选择表达抗体的杂交瘤细胞分离的核酸， 优选聚 A+RNA 产生的 cDNA 文库 ) 获得编码该抗体的核酸。然后， 可利用本领域熟知的任何方法将 PCR 产生的扩增核酸克隆到可复制克隆载体中。
一旦确定抗 -CD100 抗体或其抗原结合片段、 变体或衍生物的核苷酸序列和相 应氨基酸序列， 就可利用本领域熟知的操作核苷酸序列的方法， 例如重组 DNA 技术、 定点 诱变、 PCR 等操作其核苷酸序列。( 参见例如， Sambrook 等 (1990)Molecular Cloning， A Laboratory Manual(《分子克隆， 实验室手册》 )( 第 2 版 ； 纽约州冷泉港的冷泉港实验室公 司 (Cold Spring Harbor Laboratory， Cold Spring Harbor， N.Y.)) 和 Ausubel 等编 (1998) Current Protocols in Molecular Biology(《新编分子生物学实验指南》 )( 纽约州的约 翰韦利森公司 (John Wiley&Sons， NY)) 所述技术， 将这些文献全文纳入本文作参考 )， 以产 生具有不同氨基酸序列以产生 ( 例如 ) 氨基酸取代、 缺失和 / 或插入的抗体。
编码抗 -CD100 结合分子， 如抗体或其抗原结合片段、 变体或衍生物的多核苷酸可 由任何多核糖核苷酸或多脱氧核糖核苷酸构成， 可以是未修饰的 RNA 或 DNA 或修饰的 RNA
或 DNA。例如， 编码抗 -CD100 抗体或其抗原结合片段、 变体或衍生物的多核苷酸可由单链 和双链 DNA、 单链和双链区域混合的 DNA、 单链和双链 RNA 以及单链和双链区域混合的 RNA， 包含可以是单链、 更常见是双链、 或是单链和双链区域混合的 DNA 和 RNA 的杂交分子构成。 此外， 编码抗 -CD100 结合分子， 如抗体或其抗原结合片段、 变体或衍生物的多核苷酸可由 包含 RNA、 DNA、 或者 RNA 和 DNA 的三链区域构成。编码抗 -CD100 结合分子， 如抗体或其抗 原结合片段、 变体或衍生物的多核苷酸也可含有一个或多个修饰碱基， 或者因稳定性或其 它原因修饰的 DNA 或 RNA 主链。 “修饰的” 碱基包括， 例如三苯甲基碱基和非常见碱基如肌 苷。可对 DNA 和 RNA 进行多种修饰 ； 因此 “多核苷酸” 涵盖化学、 酶或代谢修饰形式。
编码衍生自免疫球蛋白 ( 如免疫球蛋白重链部分或轻链部分 ) 的多肽的非天然变 体的分离多核苷酸可通过将一个或多个核苷酸取代、 添加或缺失引入免疫球蛋白的核苷酸 序列来产生， 以便将一个或多个氨基酸取代、 添加或缺失引入编码蛋白。 突变可通过标准技 术引入， 例如定点诱变和 PCR 介导的诱变。优选在一个或多个非必需氨基酸残基处产生保 守性氨基酸取代。
V. 融合蛋白和抗体偶联物
如本文另作详述， 抗 -CD100 结合分子， 如本发明抗体或其抗原结合片段、 变体或 衍生物还可与异源多肽的 N- 或 C- 末端重组融合， 或与多肽或其它组合物化学偶联 ( 包括 共价和非共价偶联 )。 例如， 抗 -CD100 抗体可与用作检测实验标签和效应物分子， 如异源多 肽、 药物、 放射性核素或毒素的分子重组融合或偶联。参见例如， PCT 公开 WO 92/08495 ； WO 91/14438 ； WO 89/12624 ； 美国专利号 5,314,995 ； 和 EP 396,387。 本发明抗 -CD100 抗体， 或其抗原结合片段、 变体或衍生物可包括通过将任何类型 的分子与抗体共价连接使该共价连接不防止抗体结合抗 -CD100， 修饰的衍生物。例如但不 限于， 抗体衍生物包括通过， 例如糖基化、 乙酰化、 PEG 化、 磷酸化、 酰胺化、 通过已知保护 / 封闭基团衍生化、 蛋白水解切割、 连接于细胞配体或其它蛋白质等方法修饰的抗体。 通过已 知技术可进行多种化学修饰， 包括但不限于 ： 特异性化学切割、 乙酰化、 甲酰化等。此外， 衍 生物可包含一种或多种非经典氨基酸。
抗 -CD100 结合分子， 如本发明抗体或其抗原结合片段、 变体或衍生物可由通过肽 键或修饰的肽键， 即肽等构物而彼此结合的氨基酸组成， 并可包含 20 种基因编码的氨基酸 以外的氨基酸。例如， 可通过天然方法， 例如翻译后加工， 或通过本领域熟知的化学修饰技 术修饰抗 -CD100 抗体。这些修饰在基础文本和更具体的专著中已有深入描述， 并在大量 研究文献中也有叙述。可以在抗 -CD100 结合分子的任何位置进行修饰， 包括在肽主链、 氨 或者在某部分如糖上进行修饰。应当了解相同类型的修饰可 基酸侧链和氨基或羧基末端， 以在给定抗 -CD100 结合分子的多个位置以相同或不同程度出现。并且， 给定的抗 -CD100 结合分子可包含许多类型的修饰。抗 -CD100 结合分子可以是分支的， 例如因泛素化造成， 它们可以是含有或不含分支的环状。环状的、 分支的、 和分支环状的抗 -CD100 结合分子 可以由翻译后的天然加工造成也可通过合成方法产生。修饰包括乙酰化、 酰基化、 ADP- 核 糖基化、 酰胺化、 共价结合黄素、 共价结合血红素部分、 共价结合核苷酸或核苷酸衍生物、 共价结合脂质或脂质衍生物、 共价结合磷脂酰肌醇、 交联、 环化、 二硫键形成、 去甲基化、 形 成共价交联、 形成半胱氨酸、 形成焦谷氨酸、 甲酰化、 γ- 羧化、 糖基化、 GPI 锚体形成、 羟基 化、 碘化、 甲基化、 十四烷基化、 氧化、 聚乙二醇化、 蛋白水解加工、 磷酸化、 异戊二烯化、 外消
旋化、 硒化、 硫化、 转移 RNA 介导的蛋白质氨基酸加成如精氨酰化、 以及泛素化。( 参见例 如， Proteins--Structure and Molecular Properties(《蛋白质 - 结构和分子特性》 )， T.E.Creighton， W.H. 弗 里 曼 公 司 (W.H.Freeman and Company)， 纽约 ； 第 2 版 (1993) ； Johnson 编 (1983)Posttranslational Covalent Modification of Proteins( 《蛋白质的 翻译后共价修饰》 )( 学术出版社 (Academic Press)， 纽约 )， 第 1-12 页 ； Seifter 等， Meth. Enzymol.182 ： 626-646(1990) ； Rattan 等， Ann.NY Acad.Sci.663 ： 48-62(1992))。
本发明也提供包含抗 -CD100 抗体或其抗原结合片段、 变体或衍生物， 以及异源多 肽的融合蛋白。与抗体融合的异源多肽可用于产生某种功能或用于靶向表达抗 -CD100 多 肽的细胞。
在一个实施方式中， 本发明融合蛋白包含具有本发明抗体的任何一个或多个 VH 结构域的氨基酸序列、 本发明抗体的任何一个或多个 VL 结构域的氨基酸序列、 或其片段或 变体， 以及异源多肽序列的多肽， 基本由其组成或由其组成。
在另一实施方式中， 用于本文所述诊断和治疗方法的融合蛋白包含具有抗 -CD100 抗体的 VH 结构域的任何一个、 两个、 三个 CDR 的氨基酸序列或者其片段、 变体或衍生物， 或 者抗 -CD100 抗体的 VL 结构域的任何一个、 两个、 三个 CDR 的氨基酸序列或者其片段、 变体 或衍生物， 以及异源多肽序列的多肽， 基本由其组成或由其组成。在一个实施方式中， 融合 蛋白包含具有本发明抗 -CD100 抗体的至少一个 VH 结构域的氨基酸序列和本发明抗 -CD100 抗体的至少一个 VL 结构域的氨基酸序列， 或者其片段、 衍生物或变体， 以及异源多肽序列 的多肽。优选地， 所述融合蛋白的 VH 和 VL 结构域对应于特异性结合 CD100 的至少一个表 位的单一来源抗体 ( 或 scFv 或 Fab 片段 )。在又一实施方式中， 用于本文所述的诊断和治 疗方法的融合蛋白包含具有抗 -CD100 抗体的 VH 结构域的任何一个、 两个、 三个或更多个 CDR 的氨基酸序列和抗 -CD100 抗体的 VL 结构域的任何一个、 两个、 三个或更多个 CDR 的氨 基酸序列， 或者其片段或变体， 以及异源多肽序列的多肽。 优选地， VH 结构域或 VL 结构域的 两个、 三个、 四个、 五个、 六个或更多个 CDR 对应于本发明单一来源抗体 ( 或 scFv 或 Fab 片 段 )。本发明也涵盖编码这些融合蛋白的核酸分子。
文 献 中 报 道 的 示 范 性 融 合 蛋 白 包 括 T 细 胞 受 体 (Gascoigne 等， Proc.Natl. Acad.Sci.USA 84 ： 2936-2940(1987)) ； CD4(Capon 等， Nature 337 ： 525-531(1989) ； Traunecker 等， Nature 339 ： 68-70(1989) ； Zettmeissl 等， DNA Cell Biol.USA 9 ： 347-353(1990) ； 和 Byrn 等， Nature 344 ： 667-670(1990)) ； L- 选择素 ( 寻靶受体 )(Watson 等， J.Cell.Biol.110 ： 2221-2229(1990) ； 和 Watson 等， Nature349 ： 164-167(1991)) ； CD44(Aruffo 等， Cell 61 ： 1303-1313(1990)) ； CD28 和 B7(Linsley 等， J.Exp.Med.173 ： 721-730(1991)) ； CTLA-4(Lisley 等， J.Exp.Med.174 ： 561-569(1991)) ； CD22(Stamenkovic 等， Cell 66 ： 1133-1144(1991)) ； TNF 受体 (Ashkenazi 等， Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88 ： 10535-10539(1991) ； Lesslauer 等， Eur.J.Immunol.27 ： 2883-2886(1991) ； 和 Peppel 等， J.Exp.Med.174 ： 1483-1489(1991)) ；和 IgE 受 体 a(Ridgway 和 Gorman， J.Cell.Biol. Vol.115， 文摘号 (Abstract No.)1448(1991)) 的融合物。
如本文其它地方所述， 抗 -CD100 结合分子， 如本发明抗体或其抗原结合片段、 变 体或衍生物可与异源多肽融合， 以提高所述多肽的体内半衰期或用于以本领域已知方法 进行的免疫实验。例如， 在一个实施方式中， 可将 PEG 偶联于本发明抗 -CD100 抗体， 以提高其体内半衰期。参见 Leong 等， Cytokine16 ： 106(2001) ； Adv.in Drug Deliv.Rev.54 ： 531(2002) ； 或 Weir 等， Biochem.Soc.Transactions 30 ： 512(2002)。
而且， 抗 -CD100 结合分子， 如本发明抗体或其抗原结合片段、 变体或衍生物可融 合标记物序列如肽， 以利于其纯化或检测。 在优选实施方式中， 标记物氨基酸序列是六组氨 酸肽， 例如 pQE 载体 ( 凯杰公司 (QIAGEN， Inc.)， 伊顿大街 (Eton Avenue)9259 号， 查茨沃斯 (Chatsworth)， 加州 91311) 提供的标签等， 其中许多标记可购得。如 Gentz 等， 1989， Proc. Natl.Acad.Sci.USA 86 ： 821-824 所述， 六 - 组氨酸提供了方便的融合蛋白纯化方法。用于 纯化的其它肽标签包括但不限于 ： 对应于流感血凝素蛋白衍生表位的 “HA” 标签 (Wilson 等， Cell37 ： 767(1984))， 以及 “flag” 标签。
可采用本领域熟知方法制备融合蛋白 ( 参见例如， 美国专利号 5,116,964 和 5,225,538)。可凭经验选择进行融合的准确位点， 以优化融合蛋白的分泌或结合特性。然 后， 用编码融合蛋白的 DNA 转染宿主细胞进行表达。
抗 -CD100 结合分子， 如本发明抗体或其抗原结合片段、 变体或衍生物， 可以非偶 联形式使用， 或者可偶联于各种分子的至少一种， 例如， 以改善该分子的治疗特性、 利于靶 点检测、 或用于患者成像或治疗。可以在纯化前或纯化后， 或者在进行纯化时标记或偶联 抗 -CD100 结合分子， 如本发明抗体或其抗原结合片段、 变体或衍生物。
具体说， 本发明抗 -CD100 抗体或其抗原结合片段、 变体或衍生物可偶联于治疗 剂、 前药、 肽、 蛋白质、 酶、 病毒、 脂质、 生物反应修饰剂、 药物或 PEG。
本领域技术人员能理解， 根据所选的偶联物质， 可采用各种技术组装偶联物。例 如， 可通过使结合多肽与生物素的活化酯如生物素 N- 羟基琥珀酰亚胺酯反应， 制备生物素 偶联物。相似地， 可以在偶联剂， 如本文所列偶联剂存在下或通过与异硫氰酸酯， 优选荧光 素 - 异硫氰酸酯反应制备荧光标记偶联物。以类似方式制备本发明抗 -CD100 抗体或其抗 原结合片段、 变体或衍生物。
本发明还包括偶联于诊断剂或治疗剂的抗 -CD100 结合分子， 如本发明抗体或其 抗原结合片段、 变体或衍生物。可将本发明抗 -CD100 抗体， 包括其抗原结合片段、 变体和衍 生物用于诊断目的， 例如， 作为临床测试步骤的一部分监测疾病的发展或进展， 从而 ( 如 ) 确定给定的治疗和 / 或预防方案的效果。例如， 将抗 -CD100 抗体或其抗原结合片段、 变体 或衍生物偶联于可检测物质可利于检测。可检测物质的例子包括各种酶、 辅基、 荧光材料、 发光材料、 生物发光材料、 放射性材料、 使用各种正电子发射断层显像术的正电子发射金属 和非放射性顺磁金属离子。参见例如， 美国专利号 4,741,900 中的金属离子， 可根据本发明 将其与抗体偶联用于诊断。合适酶的例子包括辣根过氧化物酶、 碱性磷酸酶、 β- 半乳糖苷 酶或乙酰基胆碱酯酶 ； 合适的辅基复合物的例子包括链霉亲和素 / 生物素和亲和素 / 生物 素； 合适的荧光材料的例子包括 ： 伞形花内酯、 荧光素、 荧光素异硫氰酸酯、 罗丹明、 二氯三 嗪胺荧光素、 丹磺酰氯或藻红蛋白 ； 发光材料的例子是氨基苯二酰肼 ； 生物发光材料的例 125 131 111 90 子包括 ： 萤光素酶、 萤光素和发光蛋白 ； 合适的放射性物质的例子包括 I、 I、 In、 Y或 99 Tc。
抗 -CD100 结合分子， 如抗体或其抗原结合片段、 变体或衍生物可偶联治疗部分， 如细胞毒素、 治疗剂或放射性金属离子。 细胞毒素或细胞毒剂包括对细胞有害的任何物质。
抗 -CD100 结合分子， 如抗体或其抗原结合片段、 变体或衍生物还可通过偶联于化学发光化合物进行可检测地标记。 然后， 通过检测化学反应过程中产生的发光， 确定化学发 光标记的抗 -CD100 结合分子的存在。特别有用的化学发光标记化合物的例子是氨基苯二 酰肼、 异氨基苯二酰肼、 热发光性 (theromatic) 吖啶
酯、 咪唑、 吖啶盐和草酸酯。对抗 -CD100 抗体或其抗原结合片段、 变体或衍生物进行可检测标记的一种方 式 是 将 其 连 接 于 酶， 并 用 连 接 产 物 进 行 酶 促 免 疫 实 验 (EIA)(Voller， A.， The Enzyme Linked Immunosorbent Assay(ELISA)(“酶 联 免 疫 吸 附 实 验” )， 微生物联合会季 刊 (Microbiological Associates Quarterly Publication)， 马里兰州沃克斯维尔 (Walkersville， Md.) ； 诊 断 地 平 线 (Diagnostic Horizons)2 ： 1-7(1978) ； Voller 等， J.Clin.Pathol.31 ： 507-520(1978) ； Butler， Meth.Enzymol.73 ： 482-523(1981) ； Maggio 编 (1980)Enzyme Immunoassay(《酶促免疫实验》 )， 佛罗里达州伯克莱屯的 CRC 出版社 (CRC Press， Boca Raton， Fla.) ； Ishikawa 等编 (1981)Enzyme Immunoassay(《酶促免疫实验》 ) (Kgaku Shoin， 东京 )。结合于抗 -CD100 抗体的酶与合适底物， 优选发色底物发生反应， 其反应方式产生可通过 ( 例如 ) 分光光度法、 荧光测定法或目测法检测的化学部分。可用 于可检测标记抗体的酶包括但不限于 ： 苹果酸脱氢酶、 葡萄球菌核酸酶、 δ-5- 类固醇异构 酶、 酵母醇脱氢酶、 α 甘油磷酸脱氢酶、 磷酸丙糖异构酶、 辣根过氧化物酶、 碱性磷酸酶、 天 冬酰胺酶、 葡萄糖氧化酶、 β 半乳糖苷酶、 核糖核酸酶、 脲酶、 过氧化氢酶、 葡萄糖 -6 磷酸脱 氢酶、 葡糖淀粉酶和乙酰胆碱酯酶。此外， 可通过利用酶发色底物进行的比色法进行检测。 也可通过目测比较底物与类似方法制备的标准品的酶反应程度进行检测。 也可利用各种其它免疫实验进行检测。例如， 通过放射性标记抗 -CD100 结合分 子， 如抗体或其抗原结合片段、 变体或衍生物， 可以使用放射性免疫实验 (RIA) 检测结合 分 子 ( 参 见 例 如， Weintraub(1986 年 3 月 )Principles of Radioimmunoassays(《放 射 性免疫实验原理》 )， 第七届放射性配体实验技术培训课程 (Seventh Training Course on Radioligand Assay Techniques)( 内分泌协会 (The Endocrine Society))， 通过引用全文 纳入本文 )。放射性同位素可通过各种方式检测， 包括但不限于 ： γ 计数器、 闪烁计数器或 放射自显影。
也可利用荧光发射金属， 如 152Eu 或其它镧系元素对抗 -CD100 结合分子， 如抗 体或其抗原结合片段、 变体或衍生物进行可检测地标记。可用诸如二亚乙基三胺五乙酸 (DTPA) 或乙二胺四乙酸 (EDTA) 之类的金属螯合基团将这些金属连接于结合分子。
将 不 同 部 分 偶 联 于 抗 体 ( 如 抗 -CD100 抗 体 ) 或 其 抗 原 结 合 片 段、 变体或衍 生 物 的 技 术 是 众 所 周 知 的， 参 见 例 如， Amon 等 (1985)Monoclonal Antibodies for Immunotargeting of Drugs in Cancer Therapy(“癌症治疗中用于药物的免疫靶向的 单克隆抗体” )， 收录于 Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy(《单克隆抗体和癌 症治疗》 )， Reisfeld 等编 (ARL 公司 (Alan R.Liss， Inc.))， 第 243-56 页 ； Hellstrom 等 (1987)Antibodies for Drug Delivery( “用于药物递送的抗体” )， 收录于 Controlled Drug Delivery(《控制药物递送》 )， Robinson 等编 ( 第 2 版 ； MD 公司 (Marcel Dekker， Inc.))， 第 623-53 页 ) ； Thorpe(1985)Antibody Carriers of Cytotoxic Agents in Cancer Therapy ： A Review(“癌症治疗中细胞毒剂的抗体运载体 ： 综述” )， 收录于 Monoclonal Antibodies′ 84 ： Biological and Clinical Applications( 《单克隆抗体′ 84 ： 生物学和 临床应用》 )， Pinchera 等编， 第 475-506 页 ； Analysis， Results， and Future Prospective
of the Therapeutic Use of Radiolabeled Antibody in Cancer Therapy( “在癌症治疗中 治疗性使用放射性标记的抗体的分析、 结果和展望” )， 收录于 Monoclonal Antibodies for Cancer Detection and Therapy(《用于检测和治疗癌症的单克隆抗体》 )， Baldwin 等编， 学术出版社 (Academic Press)， 第 303-16 页 (1985) ； 和 Thorpe 等 (1982)The Preparation and Cytotoxic Properties of Antibody-Toxin Conjugates( “抗体 - 毒素偶联物的制备 和细胞毒特性” )， Immunol.Rev.62 ： 119-58。
VI. 抗体多肽的表达
编码抗体的轻链和重链的 DNA 序列可根据熟知方法利用逆转录酶和 DNA 聚合酶同 时或单独制备。可根据公开的重链和轻链 DNA 和氨基酸序列， 用共有恒定区引物或更具特 异性的引物启动 PCR。如上所述， 也可利用 PCR 分离编码抗体轻链和重链的 DNA 克隆。在这 种情况下， 可利用共有引物或较大的同源探针， 如小鼠恒定区探针筛选文库。
DNA， 通常是质粒 DNA， 可利用本领域已知技术从细胞中分离， 按照如上述重组 DNA 技术相关文献中详述的标准熟知技术进行限制性作图和测序。当然， 可以在分离过程或后 续分析过程期间的任何时间点按照本发明合成 DNA。
操作分离的遗传物质以提供本发明抗 -CD100 抗体， 或其抗原结合片段、 变体或衍 生物后， 通常将编码该抗 -CD100 抗体的多核苷酸插入表达载体， 以便引入可用于产生所需 量抗 -CD100 抗体的宿主细胞中。
重组表达抗体或其片段、 衍生物或类似物， 例如， 结合本文所述靶分子如 CD100 的 抗体重链或轻链， 需要构建含有编码该抗体的多核苷酸的表达载体。一旦获得编码本发明 抗体分子、 抗体的重链或轻链、 或其一部分 ( 优选含有重链或轻链可变区 ) 的多核苷酸后， 可使用本领域熟知方法通过重组 DNA 技术获得产生抗体分子的载体。因此， 本文描述了通 过含抗体编码核苷酸序列的多核苷酸表达制备蛋白质的方法。 可利用本领域技术人员熟知 的方法构建含有抗体编码序列和合适的转录和翻译控制信号的表达载体。 这些方法包括例 如， 体外重组 DNA 技术、 合成技术和体内遗传重组。因此， 本发明提供可复制载体， 其包含操 作性连接于启动子的编码本发明抗体分子、 或其重链或轻链、 或其重链或轻链可变区的核 苷酸序列。这种载体可包括， 编码抗体分子恒定区的核苷酸序列 ( 参见例如， PCT 公开 WO 86/05807 ； PCT 公开 WO 89/01036 ； 和美国专利号 5,122,464)， 可将抗体可变区克隆到这类 载体中以便表达完整的重链或轻链。
本文所用术语 “载体” 或 “表达载体” 指在本发明中用作运载体在宿主细胞中引入 和表达所需基因的载体。正如本领域技术人员所知， 这种载体可容易地选自质粒、 噬菌体、 病毒和逆转录病毒。 通常， 与本发明相容的载体包含选择性标记物、 有利于克隆所需基因的 合适限制性位点和进入真核或原核细胞中并在其中复制的能力。
出于本发明目的， 可采用多种表达载体系统。 例如， 一类载体利用衍生自动物病毒 如牛乳头瘤病毒、 多瘤病毒、 腺病毒、 牛痘病毒、 杆状病毒、 逆转录病毒 (RSV、 MMTV 或 MOMLV) 或 SV40 病毒的 DNA 元件。其它包括使用具有内部核糖体结合位点的多顺反子系统。此外， 通过引入能够选择转染的宿主细胞的一种或多种标记物， 可选择将 DNA 整合入染色体中的 细胞。该标记物可向营养缺陷型宿主提供提供原营养， 以及生物杀灭剂 ( 如抗生素 ) 抗性 或重金属抗性如铜抗性。选择性标记物基因可直接连接于待表达的 DNA 序列， 或者通过共 同转化引入同一细胞内。在 mRNA 的优化合成中， 也可能需要其它元件。这些元件可包括信号序列、 剪接信号以及转录启动子、 增强子和终止信号。
在特别优选的实施方式中， 将克隆的可变区基因和如上所述合成的重链和轻链恒 定区基因 ( 优选人 ) 插入表达载体内。当然， 能够在真核细胞中引发表达的任何表达载体 均可用于本发明。合适载体的例子包括但不限于 ： 质粒 pcDNA3、 pHCMV/Zeo、 pCR3.1、 pEF1/ His、 pIND/GS、 pRc/HCMV2、 pSV40/Zeo2、 pTRACER-HCMV、 pUB6/V5-His、 pVAX1 和 pZeoSV2( 可 获自加州圣地亚哥的英杰公司 (Invitrogen， San Diego， Calif.)) 和质粒 pCI( 可获自威斯 康星州麦迪逊的普洛麦格公司 (Promega， Madison， Wis.))。通常， 筛选大量转化细胞以选 出适当高水平表达免疫球蛋白重链和轻链的转化细胞是可通过 ( 例如 ) 机器人系统进行的 常规实验。
更常见地， 一旦制备得到编码抗 -CD100 抗体的单体亚基的载体或 DNA 序列， 就可 将表达载体引入合适的宿主细胞内。可通过本领域技术人员熟知的各种技术将质粒引入 宿主细胞内。这些技术包括但不限于 ： 转染 ( 包括电泳和电穿孔 )、 原生质体融合、 磷酸钙 沉淀、 细胞与包膜 DNA 融合、 显微注射和用完整病毒感染。参见 Ridgway(1988)Mammalian Expression Vectors(“哺乳动物表达载体” )， 收录于 Vectors(《载体》 )， Rodriguez 和 Denhardt 编 ( 马萨诸塞州波士顿的巴特沃思公司 (Butterworths， Boston， Mass.))， 第 24.2 章， 第 470-472 页。通常， 通过电穿孔将质粒引入宿主。在适合产生轻链和重链的条件下培 养携带表达构建物的宿主细胞， 并测定重链和 / 或轻链蛋白的合成。示范性实验技术包括 酶联免疫吸附实验 (ELISA)、 放射性免疫实验 (RIA) 或荧光活化的细胞分选分析 (FACS)、 免 疫组化等。
通过常规技术将该表达载体转移到宿主细胞中， 然后通过常规技术培养该转染细 胞， 产生用于本文所述方法的抗体。 因此， 本发明包括含有操作性连接于异源启动子的本发 明抗体或其重链或轻链的编码多核苷酸的宿主细胞。在优选实施方式中， 为了表达双链抗 体， 可以在宿主细胞中共同表达编码重链和轻链的载体， 以表达整个免疫球蛋白分子， 如下 详述。
本文所用 “宿主细胞” 指携带用重组 DNA 技术构建并编码至少一种异源基因的载 体的细胞。在描述从重组宿主中分离抗体的方法时， 除非另有明确说明， 术语 “细胞” 和 “细 胞培养物” 可互换使用， 指抗体来源。换言之， 从 “细胞” 回收多肽可以指从离心的全细胞或 含有培养基和悬浮细胞的培养物回收。
可利用各种宿主 - 表达载体系统来表达用于本文所述方法的抗体分子。这类宿 主 - 表达系统代表可产生并随后纯化感兴趣编码序列的载体， 但也代表用合适的核苷酸编 码序列转化或转染时， 可原位表达本发明抗体分子的细胞。它们包括但不限于微生物， 例 如用含有抗体编码序列的重组噬菌体 DNA、 质粒 DNA 或粘粒 DNA 表达载体转化的细菌 ( 如 大肠杆菌 (E.coli) 和枯草芽孢杆菌 (B.subtilis)) ； 用含有抗体编码序列的重组酵母表达 载体转化的酵母 ( 如毕赤酵母 (Saccharomyces Pichia)) ； 用含有抗体编码序列的重组病 毒表达载体 ( 如杆状病毒 ) 感染的昆虫细胞系统 ； 用重组病毒表达载体 ( 如花椰菜花叶病 毒， CaMV ； 烟草花叶病毒， TMV) 感染的或用含有抗体编码序列的重组质粒表达载体 ( 如 Ti 质粒 ) 转化的植物细胞系统 ； 或者哺乳动物细胞系统 ( 如 COS、 CHO、 BLK、 293 和 3T3 细胞 )， 其携带含有衍生自哺乳动物细胞基因组 ( 如金属硫蛋白启动子 ) 或哺乳动物病毒 ( 如腺病 毒晚期启动子 ； 牛痘病毒 7.5K 启动子 ) 的启动子的重组表达构建物。重组抗体分子的表达优选利用细菌细胞如大肠杆菌 (Escherichia coli)， 更优选真核细胞 ( 特别是表达完整重 组抗体分子时 )。 例如， 哺乳动物细胞如中华仓鼠卵巢细胞 (CHO) 与某载体如来自人巨细胞 病毒的主要中间体早期基因启动子元件联用， 是抗体的有效表达系统 (Foecking 等， Gene 45 ： 101(1986) ； 和 Cockett 等， Bio/Technology 8 ： 2(1990))。
用于表达蛋白质的宿主细胞系常常是哺乳动物来源的 ； 本领域技术人员能够优 先确定最适合表达所需基因产物的具体宿主细胞系。示范性宿主细胞系包括但不限于 ： CHO( 中华仓鼠卵巢 )、 DG44 和 DUXB11( 中华仓鼠卵巢品系、 DHFR-)、 HELA( 人宫颈癌 )、 CVI( 猴肾品系 )、 COS( 具有 SV40T 抗原的 CVI 衍生品系 )、 VERY、 BHK( 幼仓鼠肾 )、 MDCK、 293、 WI38、 R1610( 中华仓鼠成纤维细胞 )BALBC/3T3( 小鼠成纤维细胞 )、 HAK( 仓鼠肾品 系 )、 SP2/O( 小鼠骨髓瘤 )、 P3.times.63-Ag3.653( 小鼠骨髓瘤 )、 BFA-1c1BPT( 牛内皮细 胞 )、 RAJI( 人淋巴细胞 ) 和 293( 人肾 )。宿主细胞系通常可从商业服务来源如美国组织 培养物保藏中心或公开文献获得。
此外， 可选择以所需的特定方式调节插入序列表达、 或修饰和加工该基因产物的 宿主细胞系。对蛋白质产物的这种修饰 ( 如糖基化 ) 和加工 ( 如切割 ) 可能对蛋白质功能 至关重要。 不同宿主细胞对蛋白质和基因产物的翻译后加工和修饰具有特征性和特定的机 制。 可选择合适的细胞系或宿主系统， 以保证对所表达的外来蛋白进行正确的修饰和加工。 为此， 可采用具有能适当地加工初始转录物、 对基因产物进行糖基化和磷酸化的细胞机器 的真核宿主细胞。
为了长期、 高产率地生产重组蛋白， 优选稳定的表达。例如， 可工程改造稳定表达 抗体分子的细胞系。与其使用含有病毒复制起点的表达载体， 不如用合适表达控制元件 ( 如启动子、 增强子、 序列、 转录终止子、 聚腺苷酸化位点等 ) 控制的 DNA 和选择性标记来转 化宿主细胞。引入外来 DNA 后， 使工程改造细胞在富营养培养基中生长 1-2 天， 然后换到选 择性培养基中。重组质粒中的选择性标记提供对选择压的抗性， 使得细胞能够将该质粒稳 定整合入染色体， 生长形成细胞灶， 进而可克隆并扩增成细胞系。 可有益地利用这种方法工 程改造稳定表达该抗体分子的细胞系。
可采用许多选择系统， 包括但不限于可分别用于 tk-、 hgprt- 或 aprt- 细胞的单 纯疱疹病毒胸苷激酶 (Wigler 等， Cell 11 ： 223(1977))、 次黄嘌呤 - 鸟嘌呤磷酸核糖基转 移酶 (Szybalska 和 Szybalski， Proc.Natl.Acad.Sci.USA 48 ： 202(1992)) 和腺嘌呤磷酸 核糖基转移酶 (Lowy 等， Cell 22 ： 817(1980)) 基因。另外， 抗代谢剂抗性可用作选择以 下基因的基础 ： dhfr， 产生甲氨蝶呤抗性 (Wigler 等， 1980， Natl.Acad.Sci.USA， 77 ： 357 ； O’ Hare 等， 1981， Proc.Natl.Acad.Sci.USA， 78 ： 1527) ； gpt， 产生霉酚酸抗性 (Mulligan 和 Berg， 1981， Proc.Natl.Acad.Sci.USA， 78 ： 2072) ； neo， 产生氨基糖苷 G-418 抗性 (Clinical Pharmacy 12 ： 488-505 ； Wu 和 Wu， 1991， Biotherapy 3 ： 87-95 ； Tolstoshev， 1993， Ann. Rev.Pharmacol.Toxicol.32 ： 573-596 ； Mulligan， 1993， Science 260 ： 926-932 ； 和 Morgan 和 Anderson， Ann.Rev.Biochem.62 ： 191-217(1993) ； TIB TECH11(5) ： 155-215(1993 年 5 月 )) ； 和 hygro， 产生潮霉素抗性 (Santerre 等， 1984， Gene， 30 ： 147)。本领域已知可用于 重组 DNA 技术的方法参见如 Ausubel 等， Current Protocols in Molecular Biology( 《新 编分子生物学实验指南》 )， 纽约州的约翰韦利父子公司 (John Wiley&Sons， NY)(1993) ； Kriegler， Gene Transfer and Expression， A Laboratory Manual(“基因转移和表达， 实验室手册” )， 纽约的斯托克顿出版社 (Stockton Press)(1990) ； Dracopoli 等 ( 编 )(1994) Current Protocols in Human Genetics(《新编人类基因组学实验指南》 )( 纽约州的约翰 韦利父子公司 )， 第 12 和 13 章 ； Colberre-Garapin 等 (1981)J.Mol.Biol.150 ： 1， 通过引用 全文纳入本文。
可通过载体扩增提高抗体分子的表达水平 ( 综述参见 Bebbington 和 Hentschel， “The Use of Vectors Based on Gene Amplification for the Expression of Cloned Genes in Mammalian Cells in DNA Cloning” ( 在 DNA 克隆中使用基于基因扩增的载体在 哺乳动物细胞中表达克隆的基因 )， ( 纽约州的学术出版社 (Academic Press)))， 第 3 卷。 当表达抗体的载体系统中的标记可扩增时， 提高宿主细胞培养物中存在的抑制剂水平会增 加标记基因的拷贝数。由于扩增区域与抗体基因相连， 所以抗体产量也会提高 (Crouse 等， Mol.Cell.Biol.3 ： 257(1983))。
体外生产允许放大规模产生大量所需多肽。 本领域已知在组织培养条件下培养哺 乳动物细胞的技术， 包括均一悬浮培养， 例如在气升式反应器或在连续搅拌反应器中培养， 或者固定或捕获式细胞培养， 例如在中空纤维中、 微囊中、 琼脂糖微珠上或陶瓷筒上培养。 如果必要和 / 或需要， 多肽溶液可通过常规色谱法进行纯化， 例如， 在优先生物合成合成绞 链区多肽之后或者在本文所述的 HIC 色谱步骤之前或之后， 进行如凝胶过滤、 离子交换色 谱、 DEAE- 纤维素色谱或 ( 免疫 -) 亲和力色谱。
编码本发明抗 -CD100 抗体或其抗原结合片段、 变体或衍生物的基因也可在非 哺乳动物细胞， 如昆虫细胞、 细菌细胞、 酵母细胞或植物细胞中表达。易于摄入核酸的 细菌包括肠杆菌科成员， 例如大肠杆菌 (Escherichia coli) 或沙门菌属 (Salmonella) 菌株 ； 芽 孢 杆 菌 科 (Bacillaceae)， 如 枯 草 芽 孢 杆 菌 (Bacillus subtilis) 菌 株 ； 肺炎 球 菌 (Pneumococcus) 菌 株 ； 链 球 菌 (Streptococcus) 和 流 感 嗜 血 杆 菌 (Haemophilus influenzae) 的菌株。还应理解， 在细菌中表达时， 异源多肽通常是包含体的一部分。异源 多肽必须被分离、 纯化、 然后组装成功能分子。需要抗体的四价形式时， 亚基会自组装成四 价抗体 (WO 02/096948A2)。
在细菌系统中， 可根据所表达抗体分子的指定应用对许多表达载体进行有利地选 择。例如， 准备产生大量这类蛋白质时， 为了产生抗体分子的药物组合物， 可能需要能够介 导易于纯化的融合蛋白产物高水平表达的载体。这类载体包括但不限于 ： 大肠杆菌表达载 体 pUR278(Ruther 等， EMBO J.2 ： 1791(1983))， 其中抗体编码序列可单独连接到载体内， 与 lacZ 编码区位于同一读框内， 以产生融合蛋白 ； pIN 载体 (Inouye 和 Inouye， Nucleic Acids Res.13 ： 3101-3109(1985) ； Van Heeke 和 Schuster， J.Biol.Chem.， 24 ： 5503-5509(1989)) ； 等等。也可采用 pGEX 载体表达外来多肽与谷胱甘肽 -S- 转移酶 (GST) 的融合蛋白。通常， 这类融合蛋白可溶， 并可从裂解细胞容易地通过吸附和结合于基质谷胱甘肽琼脂糖珠后在 游离谷胱甘肽的存在下洗脱而纯化。设计 pGEX 载体， 使其包含凝血酶或因子 Xa 蛋白酶切 割位点， 以便由 GST 部分释放克隆的靶基因产物。
除原核生物外， 还可使用真核微生物。酿酒酵母 (Saccharomyces cerevisiae) 或 常见的面包酵母是最常使用的真核微生物， 但也可使用许多其它菌株， 例如巴斯德毕赤酵 母 (Pichia pastoris)。
为 了 在 酵 母 (Saccharomyces) 中 表 达， 常 常 使 用 质 粒 YRp7， 例 如 (Stinchcomb等， Nature 282 ： 39(1979) ； Kingsman 等， Gene 7 ： 141(1979) ； Tschemper 等， Gene 10 ： 157(1980))。这种质粒已经含有 TRP1 基因， 其为缺乏在色氨酸中生长的能力的酵母突变菌 株如 ATCC 编号 44076 或 PEP4-1(Jones， Genetics 85 ： 12(1977)) 提供选择性标记物。 然后， 酵母宿主细胞基因组特征性 trp1 损伤的存在提供了用于通过在无色氨酸环境下生长来检 测转化的有效环境。
在 昆 虫 系 统 中， 苜 蓿 银 纹 夜 蛾 (Autographa californica) 核 多 面 体 病 病 毒 (AcNPV) 通常用作表达外来基因的载体。该病毒在草地贪夜蛾 (Spodoptera frugiperda) 细胞中生长。可将抗体编码序列单独克隆到病毒的非必需区 ( 如多角体蛋白基因 ) 中， 并 置于 AcNPV 启动子 ( 如多角体蛋白启动子 ) 的控制下。
本发明抗体分子一旦重组表达后， 可通过本领域已知的任何免疫球蛋白分子纯 化方法进行纯化， 例如， 通过层析 ( 如离子交换层析， 亲和力层析， 特别是在蛋白 A 之后对 特定抗原的亲和力层析， 以及大小筛分柱层析 )、 离心、 差异溶解度或任何其它蛋白质纯化 标准技术来纯化。或者， 提高本发明抗体亲和力的优选方法可参见美国专利申请公开号 20020123057A1。
VII. 使用治疗性抗 -CD100 抗体的治疗方法
本发明方法涉及使用抗 -CD100 结合分子， 如抗体， 包括其抗原结合片段、 变体和 衍生物治疗患者， 该患者患有与表达 CD100 的细胞分泌或表达的可溶性 CD100 相关的疾病。 “表达 CD100 的细胞” 指表达 CD100 抗原的正常和恶性细胞。本领域熟知检测细胞内 CD100 表达的方法， 包括但不限于 ： PCR 技术、 免疫组化、 流式细胞术、 Western 印迹、 ELISA 等。
虽然下述讨论涉及与本发明抗 -CD100 抗体有关的各种疾病和失调的诊断和治疗 方法， 但本文所述方法也可应用于保持本发明抗 -CD100 抗体的所需特性， 例如能够特异性 结合 CD100， 如人、 小鼠或者人和小鼠的 CD100， 并具有 CD100 中和活性的抗 -CD100 抗体的 抗原结合片段、 变体和衍生物。
在一个实施方式中， 治疗包括将本发明抗 -CD100 结合分子， 如抗体或其抗原结合 片段应用于或给予患者， 或将抗 -CD100 结合分子应用于或给予由患者分离的组织或细胞 系， 其中所述患者患有疾病、 出现疾病症状或具有疾病倾向。在另一实施方式中， 治疗还应 包括将包含抗 -CD100 结合分子， 如本发明抗体或其抗原结合片段应用于或给予患者， 或将 包含抗 -CD100 结合分子的药物组合物应用于或给予由患者分离的组织或细胞系， 其中所 述患者患有疾病、 出现疾病症状或具有疾病倾向。
所述抗 -CD100 结合分子， 如本发明抗体或其结合片段可用于治疗各种恶性和非 恶性肿瘤。 “抗肿瘤活性” 指表达 CD100 的恶性细胞增殖或累积速率降低， 因此已有肿瘤或 在治疗期间出现的肿瘤的生长速率降低， 和 / 或已有的成瘤 ( 肿瘤 ) 细胞或新形成的成瘤 细胞被破坏， 因而治疗期间肿瘤总体缩小。例如， 用至少一种抗 -CD100 抗体进行治疗引起 生理响应， 例如， 血管新生减少， 这对人体中 CD100 表达细胞相关性疾病状态的治疗有益。
在一个实施方式中， 本发明涉及用作药物， 具体是用于治疗或预防癌症或用于癌 前病症或病损的抗 -CD100 结合分子， 如本发明抗体或其结合片段。在某些实施方式中， 用 抗 -CD100 结合分子， 如本发明抗体或其结合片段治疗过度表达 CD100 的癌症。在某些实施 方式中， 用抗 -CD100 结合分子， 如本发明抗体或其结合片段治疗过度表达 CD100 的头颈癌 或结肠癌。另外， 抗 -CD100 结合分子， 如本发明抗体或其结合片段还可用于抑制血管新 生， 以治疗依赖于新血管形成的病理状况， 包括肿瘤发生和黄斑变性。血管新生是复 杂多步形态发生事件， 在该期间血管重塑的主要决定因素刺激内皮细胞动态改变其细 胞 - 细胞和细胞 - 基质接触， 并定向移动以重排成成熟的血管树 (Bussolino 等， Trends Biochem Sci.22 ： 251-256(1997) ； Risau， Nature386 ： 671-674(1997) ； Jain， Nat.Med.9 ： 685-693(2003))。新血管形成是胚胎发育期间的关键步骤， 但它也在生理学和病理学状 况中出现， 如视网膜病、 类风湿性关节炎、 缺血， 特别是肿瘤生长和转移 (Carmeliet， Nat. Med.9 ： 653-660(2003))。新血管的这种病理形成过程在本文中称为 “侵袭性血管新生” 。 Basile 等， PNAS 103(24) ： 9017-9022(2006)) 证明， 从 HNSCC 细胞中排出时， CD100 刺激内 皮细胞迁移， 这一过程被 CD100- 阻断抗体和 CD100 敲减阻断。 CD100 过度表达也出现在前列 腺癌、 结肠癌、 乳腺癌和肺癌中， 提示 CD100 表达可能是各种癌促进血管新生的常用策略。
按照本发明方法， 对于恶性人细胞， 利用至少一种抗 -CD100 结合分子， 如本文另 述的抗体或其抗原结合片段提高阳性治疗响应。癌症治疗的 “阳性治疗响应” 指与这些结 合分子， 如抗体或其片段的抗肿瘤活性有关的疾病改善， 和 / 或与疾病相关症状的改善。也 就是说， 可观察到抗增殖作用、 防止肿瘤进一步生长、 肿瘤缩小、 肿瘤血管减少、 癌细胞数量 减少和 / 或一种或多种疾病相关症状减轻。因此， 例如， 疾病改善的特征可以是完全响应。 “完全响应” 指归一化至任何之前异常的射线照片研究、 骨髓和脑脊液 (CSF) 时， 不存在临床 上可检测的疾病。这种响应必须在本发明方法治疗后， 持续至少一个月。或者， 疾病改善可 归为部分响应。 “部分响应” 指不存在新病损的情况下， 所有可检测的肿瘤负担 ( 即， 对象中 存在的肿瘤细胞数量 ) 降低至少约 50％， 并持续至少一个月。这种响应仅适用于可检测的 肿瘤。
可采用筛选技术如生物发光成像， 例如， 荧光素酶成像、 骨扫描成像和肿瘤生物活 检采样包括吸取骨髓 (BMA)， 通过肿瘤形态改变 ( 即总体肿瘤负担、 肿瘤细胞计数等 ) 评估 肿瘤响应。除这些阳性治疗响应外， 用抗 -CD100 结合分子， 如抗体或其抗原结合片段治疗 对象可产生疾病相关症状改善的有益效果。例如， 所述对象可出现所谓的 B 症状， 如夜汗、 发热、 体重降低和 / 或荨麻疹减轻。
抗 -CD100 结合分子， 如本文所述抗体或其抗原结合片段也可用于治疗与 CD100 表 达细胞有关的炎性疾病和免疫系统的缺陷或失调。炎性疾病的特征是炎症和组织破坏， 或 其组合。 “抗炎活性” 指炎症减轻或阻断。 “炎性疾病” 包括任何免疫介导的炎性过程， 其中 免疫应答的启动事件或靶点包括非自身抗原， 包括例如， 同种异体抗原、 异种抗原、 病毒抗 原、 细菌抗原、 未知抗原或变应原。在一个实施方式中， 炎性疾病是外周或中枢神经系统的 炎性疾病。在另一实施方式中， 炎性疾病是关节的炎性疾病。
另外， 出于本发明目的， 术语 “炎性疾病” 包括 “自身免疫病” 。本文所用术语 “自身 免疫病” 通常应包括涉及 “自身抗原” 的免疫介导的炎性过程。在自身免疫病中， 自身抗原 引发宿主免疫应答。自身免疫病可能由针对自身抗原 ( 自体抗原 ) 的不当免疫应答产生， 这偏离了自身耐受的正常状态。通常， 用作细胞毒性分子或免疫复合物的抗体 ( 具体是但 不限于 IgG 抗体 ) 是各种自身免疫病的主要介导物， 其中许多自身免疫病可能造成失能或 威胁生命。
在一个实施方式中， 利用抗 -CD100 结合分子， 如本发明抗体或抗原结合片段治疗多发性硬化 (MS)。MS 也称为弥散性硬化症或弥散性脑脊髓炎， 是免疫系统攻击中枢神经系 统， 导致脱髓鞘的自身免疫病症。多发性硬化这个名称指神经系统中形成的疤痕 ( 硬化， 也 被称为斑块或病损 )。MS 病损通常包括接近小脑脑室、 脑干、 基底神经节和脊髓以及视神经 的白质区域。MS 导致少突胶质细胞破坏， 该细胞负责产生和维持髓鞘。MS 导致髓磷脂减少 或完全消失， 随着疾病进展， 还导致神经元横断。
神经病学症状可随着 MS 改变， 该疾病常常发展到身体和认知失能。MS 有多种形 式， 新症状独立发作 ( 复发形式 ) 或随时间缓慢累积 ( 渐进形式 )。在发作之间， 症状可能 完全消失， 但常常产生永久的神经损伤， 特别是随着疾病进展。
可采用本发明抗 -CD100 单克隆抗体， 如 MAb 2503、 MAb 67 或 MAb 76 中和 CD100， 以通过几种不同机制降低 MS 严重程度， 例如， 抗 -CD100 单克隆抗体可阻断 CD100 的免疫成 熟和活化， 以通过降低对 CNS 抗原的次级免疫应答降低复发率， 抗 -CD100 单克隆抗体可阻 断可溶性 CD100 在介导 CNS 中的少突胶质细胞凋亡中的作用， 可通过减少脱髓鞘减轻疾病 严重程度。
在一个实施方式中， 利用抗 -CD100 结合分子， 如本发明抗体或抗原结合片段治疗 关节炎。关节炎是关节的炎性疾病， 它可能由免疫系统攻击关节的自身免疫病症引起。在 某些实施方式中， 关节炎选自骨关节炎、 痛风性关节炎、 强直性脊柱炎、 牛皮癣性关节炎、 活 动性关节炎、 类风湿性关节炎、 青少年发病类风湿性关节炎、 感染性关节炎、 炎性关节炎、 脓 毒性关节炎、 变性关节炎、 破坏性关节炎 (arthritis mutilans) 和莱姆关节炎。在一个实 施方式中， 关节炎是类风湿性关节炎 (RA)。 本发明包括通过将本发明抗 -CD100 结合分子， 如 MAb 2503、 MAb 67 或 MAb 76 给 予对象， 治疗或预防关节炎的方法。 本发明方法可减轻与关节炎， 如类风湿性关节炎相关联 的疼痛、 肿胀或僵硬。本发明还涉及改善关节性能、 功能和健康状况的方法。在本发明的一 些实施方式中， 治疗导致关节炎严重性评分降低、 关节炎严重性 / 曲线下面积降低、 与关节 炎有关的组织病理参数 ( 炎症、 血管翳、 软骨损伤和骨损伤 ) 降低、 血清花生四烯酸水平降 低、 或抗 - 胶原抗体减少。在某些实施方式中， 有益或所需的临床结果包括但不限于 ： 关节 炎相关症状减轻 ； 预防关节炎 ； 关节炎发病推迟 ； 人群中关节炎发病率降低 ； 关节炎相关病 症的严重程度下降 ； 与关节炎相关的病症、 失调或疾病状态稳定化 ( 即不恶化 ) ； 与关节炎 相关的病症、 失调或疾病发病推迟或减缓 ； 与关节炎相关的病症、 失调或疾病改善 ； 与关节 炎相关的病症、 失调或疾病在可检测或不可检测水平的消退 ( 部分或完全 ) ； 或者与关节炎 相关的病症、 失调或疾病增强或改善。
本发明方法可给予患有关节炎的个体或处于关节炎发病风险中的个体。因此， 在一些实施方式中， 本发明涉及一种治疗具有正常关节、 处于临界关节炎的关节或真正有 关节炎的关节的对象的方法， 该方法包括如本文所述将本发明抗 -CD100 结合分子， 如 MAb 2503、 MAb 67 或 MAb 76 给予对象。在一些实施方式中， 本发明方法可用于在对象余生中治 疗慢性关节炎。
按照本发明方法， 利用至少一种抗 -CD100 结合分子， 如本文另述的抗体或其抗原 结合片段提高对自身免疫病症和 / 或炎性疾病的治疗或预防的阳性治疗响应。提及自身免 疫病和 / 或炎性疾病时， “阳性治疗响应” 指与这些抗体的抗炎活性、 抗血管新生活性、 抗凋 亡活性等相关的疾病改善， 和 / 或疾病相关症状的改善。也就是说， 可观察到抗增殖作用、
防止 CD100 表达细胞的进一步增殖、 减轻炎症反应， 包括但不限于 ： 炎性细胞因子、 粘着分 子、 蛋白酶、 免疫球蛋白 ( 在携带 CD100 的细胞是 B 细胞的情况下 )、 它们的组合等的分泌减 少， 抗炎蛋白产量增加， 自身反应性细胞数量减少， 免疫耐受提高， 自身反应性细胞存活被 抑制， 凋亡减少， 内皮细胞迁移减少， 自发性单核细胞迁移增加， 刺激 sCD100 或 CD100 表达 细胞介导的一种或多种症状减轻和 / 或降低。这种阳性治疗响应不仅限于给药途径， 可包 括给予供体、 供体组织 ( 如器官灌注 )、 宿主或其任何组合等。
可利用筛选技术评估临床响应， 如磁共振成象 (MRI) 扫描、 x- 射线成像、 计算机断 层成像 (CT) 扫描、 流式细胞术或荧光活化的细胞分选 (FACS) 分析、 组织学分析、 宏观病理 学分析和血液化学分析， 包括但不限于可通过 ELISA、 RIA、 色谱等检测到的改变。除这些阳 性治疗响应外， 用抗 -CD100 结合分子， 如抗体或其抗原结合片段治疗对象可产生疾病相关 症状改善的有益效果。
抗 -CD100 结合分子， 如抗体或其抗原结合片段可与至少一种其它癌症治疗联合 使用， 包括但不限于 ： 手术或外科程序 ( 如脾切除术、 肝切除术、 淋巴结切除术、 白细胞透入 (leukophoresis)、 骨髓移植等 ) ； 放疗 ； 化疗， 任选与自体骨髓移植或其它癌症治疗联用 ； 其中在抗 -CD100 结合分子， 如抗体或其抗原结合片段的治疗之前、 期间或之后给予额外癌 症治疗。因此， 联合治疗包括给予抗 -CD100 结合分子， 如本发明抗体或其抗原结合片段以 及给予另一治疗剂， 如化疗、 放疗、 其它抗癌抗体治疗、 小分子癌症治疗或基于疫苗 / 免疫 治疗的癌症治疗时， 本发明方法包括采用单独制剂或单一药物制剂共同给予， 和 / 或以任 一顺序连续给予。
本发明的抗 -CD100 结合分子， 如抗体或其结合片段可与自身免疫病和炎性疾病 的任何已知治疗联合使用， 这些已知治疗包括本领域已知可用于治疗自身免疫病和炎性疾 病， 或者已经用于或正在用于治疗自身免疫病和炎性疾病的任何药剂或药剂组合。 因此， 当 联合治疗包括给予抗 -CD100 结合分子和给予另一治疗剂时， 本发明方法包括采用单独制 剂或单一药物制剂共同给予， 和 / 或以任一顺序连续给予。在本发明的一些实施方式中， 本 文所述的抗 -CD100 抗体与免疫抑制药物或消炎药联合给予， 其中所述抗体和治疗剂可以 任何顺序依次给予， 或同时给予 ( 即， 同时或在同一时间框内 )。
在一些其它实施方式中， 本发明的抗 -CD100 结合分子， 如抗体或其抗原结合片段 可单独使用或与免疫抑制药物联合使用， 以治疗和 / 或预防类风湿性关节炎。因此， 在一 些实施方式中， 当本发明抗 -CD100 抗体用于治疗类风湿性关节炎时， 所述抗体可与合适的 免疫抑制药物联合使用。如上所述， 可采用任何方式评估治疗有效性， 包括但不限于， 通过 美国风湿病学院标准、 欧洲风湿病联盟标准或任何其它标准定义的临床响应衡量有效性。 参见例如， Felson 等， Arthritis.Rheum.38 ： 727-35(1995) 和 van Gestel 等， Arthritis. Rheum.39 ： 34-40(1996)。
在其它实施方式中， 本发明抗 -CD100 抗体可单独使用或与免疫抑制药物联合使 用以治疗和 / 或预防多发性硬化。因此， 在一些实施方式中， 当本发明抗 -CD100 抗体用于 治疗多发性硬化时， 所述抗体可与合适的免疫抑制药物联合使用。
本发明的另一实施方式是使用抗 -CD100 结合分子如抗体或其抗原结合片段诊断 性监测组织中的蛋白质水平作为临床测试步骤的一部分， 例如， 以确定给定治疗方案的功 效。 例如， 将抗体与可检测物质偶联可利于探测。 可检测物质的例子包括各种酶、 辅基、 荧光材料、 发光材料、 生物发光材料和放射性材料。合适酶的例子包括辣根过氧化物酶、 碱性磷 酸酶、 β- 半乳糖苷酶或乙酰胆碱酯酶 ； 合适的辅基复合物的例子包括链霉亲和素 / 生物素 和亲和素 / 生物素 ； 合适的荧光材料的例子包括 ： 伞形花内酯、 荧光素、 荧光素异硫氰酸酯、 罗丹明、 二氯三嗪胺荧光素、 丹磺酰氯或藻红蛋白 ； 发光材料的例子是氨基苯二酰肼 ； 生物 发光材料的例子包括 ： 萤光素酶、 萤光素和发光蛋白 ； 合适的放射性物质的例子包括 125I、 131 35 I、 S 或 3H。
VIII. 药物组合物和给药方法
本领域技术人员熟知或不难确定制备和给予本发明抗 -CD100 结合分子， 如抗体 或其抗原结合片段、 变体或衍生物的方法。抗 -CD100 结合分子， 如抗体或其抗原结合片段、 变体或衍生物的给药途径可以是 ( 例如 )， 口服、 胃肠道外、 吸入或外用。本文所用术语 “胃 肠道外” 包括例如， 静脉内、 动脉内、 腹膜内、 肌肉内、 皮下、 直肠或阴道给药。虽然所有这些 给药形式均明确落入本发明范围， 但给药形式的例子是注射液， 特别是用于静脉内或动脉 内注射或滴注。通常， 合适的注射用药物组合物可包含缓冲剂 ( 如乙酸盐、 磷酸盐或柠檬酸 盐缓冲剂 )、 表面活性剂 ( 如聚山梨酯 )， 以及任选的稳定剂 ( 如人白蛋白 ) 等。然而， 在与 本文内容相容的其它方法中， 本发明抗 -CD100 结合分子， 如抗体或其抗原结合片段、 变体 或衍生物可直接递送到不良细胞群的部位， 从而提高患病组织与治疗剂的接触。
如本文所用， 本发明抗 -CD100 结合分子， 如抗体或其抗原结合片段、 变体或衍生 物可以药学有效量给予， 用于在体内治疗 CD100 表达细胞介导的疾病， 如某些类型的癌症、 自身免疫病、 炎性疾病包括中枢神经系统 (CNS) 和周围神经系统 (PNS) 炎性疾病， 以及侵袭 性血管新生。在这方面， 应理解， 将配制本发明公开的结合分子， 以利于给药并提高活性物 质的稳定性。优选地， 本发明药物组合物包含药学上可接受的无毒无菌运载体， 如生理盐 水、 无毒缓冲液、 防腐剂等。出于本申请目的， 偶联或未偶联的抗 -CD100 结合分子， 如抗体 或其抗原结合片段、 变体或衍生物的药学有效量应被认为是足以实现有效靶点结合或足以 实现 ( 例如 ) 改善疾病或失调的症状等益处， 或足以监测物质或细胞的量。
本发明所用的药物组合物包含药学上可接受的运载体， 包括例如， 离子交换物质、 氧化铝、 硬脂酸铝、 卵磷脂， 血清蛋白质如人血清白蛋白， 缓冲物质如磷酸盐、 甘氨酸、 山梨 酸、 山梨酸钾、 饱和植物脂肪酸的部分甘油酯混合物、 水、 盐或电解质， 如硫酸鱼精蛋白、 磷 酸氢二钠、 磷酸氢钾、 氯化钠、 锌盐、 胶体二氧化硅、 三硅酸镁、 聚乙烯吡咯烷酮、 纤维素基物 质、 聚乙二醇、 羧甲基纤维素钠、 聚丙烯酸酯、 蜡、 聚乙烯 - 聚氧丙烯 - 嵌段聚合物、 聚乙二醇 和羊毛脂。
胃肠道外给药制剂包括无菌的水性或非水性溶液、 混悬液和乳液。非水性溶剂的 例子是丙二醇、 聚乙二醇、 植物油如橄榄油和可注射有机酯如油酸乙酯。水性载体包括例 如， 水、 醇 / 水溶液、 乳液或悬液， 包括盐水和缓冲介质。在本发明中， 药学上可接受的运载 体包括但不限于 ： 0.01-0.1M 并优选 0.05M 的磷酸盐缓冲液或 0.8％盐水。其它常见的胃肠 道外载体包括磷酸钠溶液、 林格右旋糖、 右旋糖和氯化钠、 乳酸林格溶液或不挥发油。静脉 内运载体包括液体和营养补充剂、 电解质补充剂， 例如基于林格右旋糖的那些物质等。 也可 包含防腐剂和其它添加剂， 例如， 抗微生物剂、 抗氧化剂、 螯合剂和惰性气体等。
更具体说， 适用于注射使用的药物组合物包括无菌水溶液 ( 水溶性时 ) 或分散 体， 以及用于临用前配制无菌注射液或分散体的无菌粉末。在这种情况下， 该组合物必须无菌， 并应该是存在注射容易性 (easy syringability) 的流体。它应该在制造和储存条 件下稳定， 并且优选在保存过程中能够抵抗微生物如细菌和真菌的污染作用。载体可以是 包含如水、 乙醇、 多元醇 ( 例如甘油、 丙二醇和液体聚乙二醇等 ) 及其合适混合物的溶剂 或分散介质。可通过使用涂覆材料如卵磷脂、 如果是分散体则保持所需粒度以及使用表 面活性剂， 来维持合适的流动性。适用于本文所述治疗方法的制剂可参见 Remington′ s Pharmaceutical Sciences(《雷明顿药物科学》 )( 马克出版公司 (Mack Publishing Co.)) 第 16 版 (1980)。
也可通过各种抗菌剂和抗真菌剂， 如对羟基苯甲酸酯类、 氯丁醇、 苯酚、 抗坏血酸、 硫柳汞等实现防止微生物的作用。在许多情况下， 组合物中优选包含等张剂， 例如糖、 多元 醇如甘露醇、 山梨醇或氯化钠。组合物中可包含延迟吸收的试剂如单硬脂酸铝和明胶以延 长可注射组合物的吸收。
在任何情况下， 可按照需要， 将所需量的活性化合物 ( 如抗 -CD100 抗体或其抗原 结合片段、 变体或衍生物， 本身或与其它活性剂联合 ) 掺入含有本文所列的一种成分或多 种成分的组合的合适溶剂， 然后进行过滤除菌制得无菌注射溶液。 通常， 将活性活化物掺入 含有碱性分散介质和上述其它所需成分的无菌载体中制备分散体。 当制备无菌注射液制备 所需的无菌粉末时， 优选的制备方法是真空干燥和冷冻干燥， 由之前无菌过滤的溶液得到 活性组分和任何其它所需组分的粉末。注射制剂在无菌条件下按照本领域已知方法加工， 装入容器， 如安瓿、 袋、 瓶、 注射器或小管中， 并密封。另外， 可包装该制剂， 并以药盒形式出 售， 如美国专利申请系列号 09/259,337 所述。这类制品优选具有标签或标贴， 表明相关组 合物可用于治疗患有或倾向于患有疾病或失调的对象。
胃肠道外制剂可以是单一推注剂量， 输注或起始推注剂量， 随后给予维持剂量。 这 些组合物可以特定的固定间隔或可变间隔给予， 例如每天一次， 或 “按需” 给予。
本发明的某些药物组合物可以用可接受的剂型口服给予， 包括例如， 胶囊、 片剂、 水性悬液或溶液。某些药物组合物也可通过鼻喷雾或吸入方式给予。这类组合物可制备成 盐水溶液， 其中采用苄醇或其它合适的防腐剂、 吸收促进剂以提高生物利用度， 和 / 或采用 其它常规的增溶剂或分散剂。
可与载体材料组合后得到单一剂量形式的抗 -CD100 结合分子， 如抗体或其片段、 变体或衍生物的量可以根据治疗时宿主以及具体的给药模式而变化。 该组合物可作为单一 剂量、 多个剂量或在确定时间段通过输注给予。也可调整给药方案， 以提供最优所需响应 ( 例如， 治疗或预防响应 )。
在本发明范围内， 本发明抗 -CD100 抗体或其抗原结合片段、 变体或衍生物可按照 上述治疗方法给予人或其它动物， 其给予量足以产生疗效。本发明抗 -CD100 抗体， 或其抗 原结合片段、 变体或衍生物可以常规剂型给予所述人或其它动物， 该剂型是通过已知技术 将本发明抗体与常规的药学上可接受的运载体或稀释剂混合制备的。 本领域技术人员应认 识到， 药学上可接受的运载体或稀释剂的形式和特点是由混合的活性成分含量、 给药途径 和其它熟知变量决定的。本领域技术人员还应理解， 包含一种或多种抗 -CD100 结合分子， 如本发明抗体或其抗原结合片段、 变体或衍生物的混合物可能被证明特别有效。
“治疗有效剂量或治疗有效量” 或者 “有效量” 指给予时， 在患有待治疗疾病患者的 治疗中带来阳性治疗响应的抗 -CD100 结合分子， 如抗体或其抗原结合片段的用量。用于治疗 CD100 表达细胞介导的疾病， 例如某些类型的癌症， 如头颈癌、 前列腺 癌、 结肠癌、 乳腺癌和肺癌 ； 自身免疫病， 如关节炎、 多发性硬化、 炎性疾病包括中枢神经系 统 (CNS) 和周围神经系统 (PNS) 炎性疾病 ； 和侵袭性血管新生时， 本发明组合物的治疗有效 剂量取决于多种不同因素， 包括给药方式、 目标部位、 患者生理状态、 患者是人或是动物、 给 予的其它药物和该治疗是预防性治疗或是治疗性治疗。 通常， 患者是人， 但也可治疗非人哺 乳动物， 包括转基因哺乳动物。 可采用本领域技术人员已知的常规方法确定治疗剂量， 以优 化安全性和效能。
在给出本发明公开内容的情况下， 本领域普通技术人员无需过多实验即可确定至 少一种抗 -CD100 结合分子， 如抗体或其结合片段的给予量。影响给药方式以及至少一种 抗 -CD100 结合分子， 如抗体或其抗原结合片段、 变体或衍生物各自用量的因素包括但不限 于： 接受治疗的个体的疾病严重程度、 病史、 年龄、 身高、 体重、 健康状况和身体状况。类似 地， 抗 -CD100 结合分子， 如抗体或其片段、 变体或衍生物的给予量取决于给药方式、 对象是 否接受单一剂量或多剂量的此种药剂。
本发明还提供抗 -CD100 结合分子， 如抗体或其抗原结合片段、 变体或衍生物在制 备治疗自身免疫病和 / 或炎性疾病的药物中的应用， 所述疾病包括例如， 关节炎、 多发性硬 化、 CNS 和 PNS 炎性疾病或癌症。
本发明还提供抗 -CD100 结合分子， 如本发明抗体或其抗原结合片段、 变体或衍生 物在制备治疗对象的自身免疫病和 / 或炎性疾病或癌症的药物中的应用， 其中所述药物用 于已用至少一种其它治疗预先治疗的对象。 “预先治疗” 或 “预治疗” 指该对象在接受包含 抗 -CD100 结合分子， 如抗体或其抗原结合片段、 变体或衍生物的药物之前， 接受过一种或 多种其它治疗 ( 例如， 已用至少一种其它癌症疗法治疗 )。 “预先治疗” 或 “预治疗” 包括在 用包含抗 -CD100 结合分子， 例如， 本文所述的单克隆抗体 2503 或其抗原结合片段、 变体或 衍生物的药物开始治疗前 2 年内、 18 个月内、 1 年内、 6 个月内、 2 个月内、 6 周内、 1 个月内、 4 周内、 3 周内、 2 周内、 1 周内、 6 天内、 5 天内、 4 天内、 3 天内、 2 天内、 或者甚至 1 天内， 用至少 一种其它疗法治疗对象。 对象不一定是一种或多种在先疗法预治疗的响应者。 因此， 接受包 含抗 -CD100 结合分子， 如抗体或其抗原结合片段、 变体或衍生物的药物的对象可以对在先 疗法的预治疗或者对一种或多种在先疗法 ( 预治疗包括多种疗法时 ) 有响应或无响应 ( 例 如， 癌症为难治性癌症 )。在接受包含抗 -CD100 结合分子， 如抗体或其抗原结合片段、 变体 或衍生物的药物之前， 对象可能已接受预治疗的其它癌症疗法的例子包括但不限于 ： 手术 ； 放疗 ； 化疗， 任选与自体骨髓移植联用， 其中合适的化疗药包括但不限于前述药物 ； 其它抗 癌单克隆抗体疗法 ； 小分子癌症治疗， 包括但不限于 ： 本文前述小分子 ； 基于疫苗 / 免疫治 疗的癌症治疗 ； 类固醇疗法 ； 其它癌症疗法 ； 或其任何组合。
IX. 诊断
本发明还提供可用于诊断 CD100 表达细胞介导的疾病的诊断方法， 所述疾病包括 例如某些类型的癌症、 自身免疫病、 炎性疾病， 包括例如关节炎、 多发性硬化、 中枢神经系 统 (CNS) 和周围神经系统 (PNS) 炎性疾病以及侵袭性血管新生， 所述方法包括测定来自个 体的组织或其它细胞或体液中 CD100 蛋白或转录物的表达水平， 并将测定的表达水平与正 常组织或体液中的标准 CD100 表达水平作比较， 与标准水平相比表达水平上升表明存在疾 病。通 过 本 领 域 技 术 人 员 已 知 的 经 典 免 疫 组 织 学 方 法， 可 利 用 本 发 明 抗 -CD100 抗 体 及 其 抗 原 结 合 片 段、 变 体 和 衍 生 物 测 定 生 物 样 品 中 的 CD100 蛋 白 水 平 ( 参 见 例 如 Jalkanen 等， J.Cell.Biol.101 ： 976-985(1985) ； Jalkanen 等， J.Cell Biol.105 ： 3087-3096(1987))。用于检测 CD100 蛋白表达的其它基于抗体的方法包括免疫实验， 如酶 联免疫吸附实验 (ELISA)、 免疫沉淀或蛋白质印迹。合适的实验在本文中另有详述。
“测定 CD100 多肽表达水平” 指对第一生物样品中的 CD100 多肽水平以直接 ( 例 如， 通过测定或估计绝对蛋白质水平 ) 或相对 ( 例如， 通过与第二生物样品中的疾病相关多 肽水平作比较 ) 方式进行定性或定量测定或估计。优选地， 测定或估计第一生物样品中的 CD100 多肽表达水平， 并与标准 CD100 多肽水平作比较， 该标准水平取自未患该疾病的个体 所得的第二生物样品或通过未患该疾病的群体的平均水平确定。本领域技术人员应理解， 一旦 “标准” CD100 多肽水平已知， 可以重复地用作比较标准。
“生物样品” 指由可能表达 CD100 的个体、 细胞系、 组织培养物或其它细胞来源获得 的任何生物样品。从哺乳动物获得组织活检样品和体液的方法是本领域熟知的。
X. 免疫实验
可通过本领域的任何已知方法测定本发明抗 -CD100 抗体或其抗原结合片段、 变 体或衍生物的免疫特异性结合。可使用的免疫实验包括但不限于， 使用如下技术的竞争和 非竞争实验系统， 如蛋白质印迹、 放射性免疫实验、 ELISA( 酶联免疫吸附实验 )、 “夹心” 免疫 实验、 免疫沉淀实验、 沉淀素反应、 凝胶扩散沉淀素反应、 免疫扩散实验、 凝集实验、 补体结 合实验、 免疫放射实验、 荧光免疫实验、 蛋白 A 免疫实验等等。这类实验是本领域公知的常 规实验 ( 参见例如， Ausubel 等编， (1994)， Current Protocols in Molecular Biology( 《新 编分子生物学实验指南》 )， 纽约约翰韦利父子公司 (John Wiley&Sons， Inc.， NY)， 第 1 卷， 通过引用全文纳入本文 )。下面简述示范性免疫测定 ( 但不限于此 )。
免疫沉淀方案通常包括用补充有蛋白质磷酸酶和 / 或蛋白酶抑制剂 ( 如 EDTA、 PMSF、 抑肽酶、 钒酸钠 ) 的裂解缓冲液如 RIPA 缓冲液 (1％ NP-40 或曲通 X-100、 1％脱氧胆 酸钠、 0.1％ SDS、 0.15M NaCl、 0.01M 磷酸钠 pH 7.2， 1％特斯乐 (Trasylol)) 裂解细胞群， 将 感兴趣的抗体加入该细胞裂解物， 4℃培育一段时间 ( 如 1-4 小时 )， 将蛋白 A 和 / 或蛋白 G 琼脂糖珠加入该细胞裂解物， 4℃培育约一小时或更久， 用裂解缓冲液洗珠， 并将珠子重悬 于 SDS/ 样品缓冲液。可通过， 例如蛋白质印迹分析评估感兴趣抗体免疫沉淀特定抗原的 能力。本领域技术人员应认识到， 可改变参数以提高抗体抗原的结合和降低背景 ( 如， 用琼 脂糖珠预先清洁细胞裂解物 )。有关免疫沉淀方案的进一步讨论参见例如， Ausubel 等编， (1994)， (Current Protocols in Molecular Biology(《新编分子生物学实验指南》 )， 纽约 约翰韦利父子公司 (John Wiley&Sons， Inc.， NY)， 第 1 卷， 10.16.1。
蛋白质印迹分析通常包括 ： 制备蛋白质样品， 用聚丙烯酰胺凝胶电泳蛋白质样品 ( 如， 根据抗原分子量采用 8％ -20％ SDS-PAGE)， 将蛋白质样品从聚丙烯酰胺凝胶中转移到 膜如硝酸纤维、 PVDF 或尼龙膜上， 在封闭缓冲液 ( 如， 含有 3％ BSA 或脱脂奶粉的 PBS) 中封 闭该膜， 用洗涤缓冲液 ( 如 PBS- 吐温 20) 洗涤该膜， 用稀释于封闭缓冲液的第一抗体 ( 感 兴趣抗体 ) 封闭该膜， 用洗涤缓冲液洗涤该膜， 用稀释于封闭缓冲液的偶联有酶底物 ( 如辣 根过氧化物酶或碱性磷酸酶 ) 或放射性分子 ( 如 32P 或 125I) 的第二抗体 ( 识别第一抗体， 如抗人抗体 ) 封闭该膜， 用洗涤缓冲液洗涤该膜， 和检测抗原的存在。本领域技术人员了解可改变参数以提高检测到的信号和降低背景噪声。 有关蛋白质印迹方案的进一步讨论参见 例如， Ausubel 等编， (1994)， Current Protocols in Molecular Biology(《新编分子生物 学实验指南》 )， 纽约约翰韦利父子公司 (John Wiley&Sons， Inc.， NY)， 第 1 卷， 10.8.1。
ELISA 包括制备抗原， 用该抗原包被 96 孔微量滴定板的孔， 将偶联于可检测化合 物如酶底物 ( 如， 辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶 ) 的感兴趣抗体加入孔中， 培育一段时间并 检测抗原的存在。 在 ELISA 中， 感兴趣抗体不必偶联于可检测化合物 ； 而可将偶联于可检测 化合物的第二抗体 ( 识别感兴趣抗体 ) 加入孔中。另外， 除了用抗原包被孔外， 还可用抗体 包被孔。 在这种情况下， 可加入偶联于可检测化合物的第二抗体， 然后向包被孔中加入感兴 趣抗原。 本领域熟练技术人员了解可对参数进行修改以提高检测信号并了解本领域所知的 其它对 ELISA 的改变。有关 ELISA 的进一步讨论参见例如， Ausubel 等编， (1994)， Current Protocols in Molecular Biology(《新编分子生物学实验指南》 )， 纽约约翰韦利父子公司 (John Wiley&Sons， Inc.， NY)， 第 1 卷， 11.2.1。
可通过竞争性结合实验测定抗体与抗原的结合亲和力和抗体 - 抗原相互作用的 解离速率。竞争性结合实验的一个例子是放射性免疫实验， 包括在含量递增的未标记抗原 3 125 存在下用感兴趣抗体培育标记抗原 ( 如 H 或 I) 和检测结合于标记抗原的抗体。可通过 Scatchard 作图分析的数据确定感兴趣的抗体与特定抗原的亲和力和结合解离速率。也可 利用放射性免疫实验确定与第二抗体的竞争。在这种情况下， 在含量递增的未标记第二抗 3 125 体存在下， 将抗原与偶联于标记化合物 ( 如 H 或 I) 的感兴趣抗体一起培育。
此外， 本发明抗 -CD100 抗体， 或其抗原结合片段、 变体或衍生物可通过组织学方 法使用， 例如用于免疫荧光、 免疫电子显微术或非免疫实验， 用于原位检测 CD100 蛋白或者 其保守变体或肽片段。 原位检测可通过以下步骤进行 ： 从患者中取出组织学样品， 向其施加 标记的抗 -CD100 抗体或其抗原结合片段、 变体或衍生物， 优选通过将标记抗体 ( 或片段 ) 覆盖在生物样品上施加。通过使用这一方法， 可能不仅确定 CD100 蛋白或者其保守变体或 肽片段的存在， 还可确定其在所检测组织中的分布。 使用本发明时， 本领域普通技术人员不 难构想到， 可改变各种组织学方法中的任何方法 ( 如染色步骤 )， 以实现这种原位检测。
CD100 基因产物或其保守变体或肽片段的免疫实验和非免疫实验通常包括 ： 在能 够结合 CD100 或其保守变体或肽片段的可检测标记的抗体存在下培育样品， 例如生物学液 体、 组织提取物、 新收获的细胞或细胞培养物中培育细胞的裂解物， 和通过本领域熟知的任 何技术检测结合抗体。
生物样品可接触或固定于能够固定细胞、 细胞颗粒或可溶性蛋白质的固相支持物 或运载体如硝基纤维素或其它固体支持物。 然后， 可用合适的缓冲液洗涤该支持物， 然后用 可检测标记的抗 -CD100 抗体或其抗原结合片段、 变体或衍生物进行处理。然后， 第二次用 缓冲液洗涤固相支持物， 以去除未结合的抗体。任选地， 随后标记抗体。然后， 可通过常规 方式检测固体支持物上结合的标记的量。
“固相支持物或运载体” 指能够结合抗原或抗体的任何支持物。熟知的支持物或 运载体包括玻璃、 聚苯乙烯、 聚丙烯、 聚乙烯、 右旋糖苷、 尼龙、 淀粉酶、 天然和改性纤维素、 聚丙烯酰胺、 辉长岩和磁铁矿。 出于本发明目的， 运载体的性质可以是某种程度上可溶或不 溶。 支持物材料可具有基本上任何可能的结构构型， 只要偶联的分子能够结合抗原或抗体。 因此， 支持物构型可以是如珠的球形或如试管内表面或杆状物外表面的圆柱形。 或者， 该表面可以是平坦表面， 例如片层、 测试条等。优选的支持物包括聚苯乙烯珠。本领域技术人员 了解或能够用常规实验确定许多适合结合抗体或抗原的其它运载体。
可以按照熟知方法确定给定批次的抗 -CD100 抗体或其抗原结合片段、 变体或衍 生物的结合活性。本领域技术人员能够利用常规实验确定每次测定的操作和优化实验条 件。
有各种方法可用于测定抗体 - 抗原相互作用的亲和力， 但测定速率常数的较少。 大部分方法依赖于标记抗体或抗原， 其不可避免地使常规测定复杂化并在测定量中引入不 确定性。
与测定抗体 - 抗原相互作用亲和力的常规方法相比， 用 进行的表面 等离振子共振 (SPR) 提供若干优点 ： (i) 无需标记抗体或抗原 ； (ii) 抗体不需要事先纯化， 细胞培养物上清液可直接使用 ； (iii) 实时测定， 能够快速半定量地比较不同单克隆抗体 的相互作用， 能够和足以用于许多评价目的 ； (iv) 生物特异性表面可再生， 使得可以容易 地在相同条件下比较一系列不同单克隆抗体 ； (v) 分析步骤完全自动化， 大量测定可以在 没有操作人员干预的情况下进行。BIAapplications Handbook(《BIA 应用手册》 )， AB 版 (1998 再版 )， 编号 BR-1001-86 ； BIAtechnology Handbook( 《BIA 技术手册》 )， AB 版 (1998 再版 )， 编号 BR-1001-84。 基于 SPR 的结合研究需要将结合对的一 个成员固定到传感器表面上。固定的结合伙伴称为配体。溶液中的结合伙伴称为分析物。 在某些情况下， 配体通过结合于被称为捕获分子的另一固定分子间接地连接于表面。 SPR 响 应反映出随着分析物的结合或解离， 检测器表面上质量浓度的改变。
根据 SPR， 实时 测定直接监测正在发生的相互作用。该技术非常适合 测定动力学参数。比较亲和力排序简单易行， 动力学和亲和力常数都可获自传感图数据。
以独立脉冲在配体表面上注射分析物时， 所得的传感器图可分成三个基本相 ： (i) 样品注射期间分析物与配体的结合 ； (ii) 样品注射期间平衡或稳态， 其中分析物结合速率 与从复合物解离的速率达到平衡 ； (iii) 缓冲液流动期间分析物与表面解离。
结合和解离相提供有关分析物 - 配体相互作用的动力学的信息 (ka 和 kd 是复合物 形成和解离的速率， kd/ka ＝ KD)。平衡相提供有关分析物 - 配体相互作用亲和力 (KD) 的信 息。
BIA 评估软件是综合的曲线拟合工具， 其采用数值积分和全局拟合算法。 通过对数 据进行适当的分析， 可由简单 研究获得相互作用的分离速率和亲和力常数。 可 通过此种技术测定的亲和力范围非常宽泛， 从 mM 级到 pM 级。
表位特异性是单克隆抗体的重要特征。与采用放射性免疫实验、 ELISA 或其它表 面吸附方法的常规技术不同， 用 进行表位作图不需要标记或纯化的抗体， 并允 许用若干单克隆抗体的序列进行多位点特异性测试。此外， 大量分析可自动进行。
逐对结合实验测试两种 MAb 同时结合同一抗原的能力。针对单独表位的 MAb 将单 独结合， 而针对相同或紧密相关表位的 MAb 将互相干扰结合。 采用 进行的这些 结合实验简单易行。
例如， 可使用捕获分子结合第一种 Mab， 随后依次加入抗原和第二种 MAb。传感器 图将揭示 ： (1) 多少抗原结合第一 Mab， (2) 第二 MAb 结合表面连接抗原的程度， (3) 如果第 二 MAb 不结合， 逆转逐对测试的顺序是否会改变结果。肽抑制是用于表位作图的另一项技术。抗原的一级序列已知时， 这种方法可补充 逐对抗体结合研究， 并可将功能表位与结构特征相关联。测定肽或抗原片段对不同 MAb 与 固定抗原的结合的抑制作用。 假定干扰给定 MAb 的结合的肽与该 MAb 限定的表位结构相关。
除非另有说明， 本发明的实施将采用细胞生物学、 细胞培养、 分子生物学、 转基 因生物学、 微生物学、 重组 DNA 和免疫学的常规技术， 它们均在本领域技术范围内。这些 技 术 在 文 献 中 已 有 充 分 描 述。 参 见 例 如， Sambrook 等 编 (1989)Molecular Cloning A Laboratory Manual(《分子克隆 ： 实验室手册》 )( 第 2 版 ； 冷泉港实验室出版社 (Cold Spring Harbor Laboratory Press)) ； Sambrook 等 编 (1992)Molecular Cloning ： A Laboratory Manual(《分子克隆 ： 实验室手册》 ()， ( 纽约州的冷泉港实验室出版社 (Cold Springs Harbor Laboratory， NY)) ； D.N.Glover 编， (1985)DNA Cloning(《DNA 克隆》 )， 第 I 和 II 卷 ； Gait 编 (1984)Oligonucleotide Synthesis(《寡核苷酸合成》 )； Mullis 等， 美国专利号 4,683,195 ； Hames 和 Higgins 编 (1984)Nucleic Acid Hybridization(《核酸 杂交》 )； Hames 和 Higgins 编 (1984)Transcription And Translation(《转录和翻译》 )； Freshney(1987)Culture Of Animal Cells(《动物细胞培养》 )(ARL 公司 (Alan R.Liss， Inc.)) ； Immobilized Cells And Enzymes(《固 定 的 细 胞 和 酶》 )(IRL 出 版 社 )(1986) ； Perbal(1984)A Practical Guide To Molecular Cloning(《分子克隆实践指南》 )； 论文， Methods In Enzymology(《酶学方法》 )( 学术出版社公司 (Academic Press， Inc.)， 纽约 州)； Miller 和 Calos 编 (1987)Gene Transfer Vectors For MammalianCells( 《哺乳动物 细胞的基因转移载体》 )( 冷泉港实验室出版社 (Cold Spring Harbor Laboratory)) ； Wu 等 编， Methods In Enzymology(《酶学方法》 )， 第 154 和 155 卷 ； Mayer 和 Walker 编 (1987) Immunochemical Methods In Cell And Molecular Biology( 《细胞和分子生物学中的免疫 化学方法》 )( 伦敦的学术出版社 (Academic Press， London)) ； Weir 和 Blackwell 编 (1986) Handbook Of Experimental Immunology(《实验免疫学手册》 )， 第 I-IV 卷 ； Manipulating the Mouse Embryo( 《小鼠胚胎操作》 )， 纽约州冷泉港的冷泉港实验室出版社 (Cold Spring Harbor Laboratory， Cold Spring Harbor， N.Y.)， (1986) ； 和 Ausubel 等 (1989)Current Protocols in Molecular Biology(《新编分子生物学实验指南》 )( 马里兰州巴尔的摩的 约翰韦利父子公司 (John Wiley&Sons， Baltimore， Md.))。
抗体工程的通用方法可参见 Borrebaeck 编辑 (1995)Antibody Engineering( 《抗 体工程》 )( 第 2 版 ； 牛津大学出版社 (Oxford Univ.Press))。 蛋白质工程的通用方法可参见 Rickwood 等编 (1995)Protein Engineering， A Practical Approach( 《蛋白质工程， 实践方 法》 )， ( 英国牛津的牛津大学出版社的 IRL 出版公司 (IRL Press at Oxford Univ.Press， Oxford， Eng.))。抗体和抗体 - 半抗原结合的总体方法可参见 ： Nisonoff(1984)Molecular Immunology(《分子免疫学》 )( 第 2 版 ； 马萨诸塞州桑德兰的辛奥尔联合公司 (Sinauer Associates， Sunderland， Mass.)) ； 和 Steward(1984)Antibodies， Their Structure and Function(《抗体的结构和功能》 )(Chapman 和 Hall， 纽约州纽约市 )。此外， 本领域已知 且没有具体描述的免疫学标准方法通常按照下述文献所述进行 ： Current Protocols in Immunology(《新编免疫学实验指南》 )， 纽约州的约翰韦利父子公司 (John Wiley&Sons) ； Stites 等编 (1994)， Basic and Clinical Immunology(《基础和临床免疫学》 )( 第 8 版 ； Appleton 和 Lange， 康涅狄格州诺沃克 (Norwalk， Conn.)) 和 Mishell 和 Shiigi( 编 )(1980)Selected Methods in Cellular Immunology(《细胞免疫学中的所选方法》 )( 纽约州的 W.H. 弗里曼公司 (W.H.Freeman and Co.， NY))。
列 出 免 疫 学 通 用 原 理 的 标 准 参 考 文 献 包 括： Current Protocols in Immunology(《新编免疫学实验指南》 )， 纽约州的约翰韦利父子公司 (John Wiley&Sons) ； Klein(1982)J.， Immunology ： The Science of Self-Nonself Discrimination(《免 疫 学： 自身 - 非自身区别的科学》 )( 纽约州的约翰韦利父子公司 ) ； Kennett 等编 (1980) Monoclonal Antibodies， Hybridoma ： A New Dimension in Biological Analyses(《单 克隆抗体， 杂交瘤 ： 生物学分析的新领域》 )( 纽约州普莱努公司 (Plenum Press， NY)) ； Campbell(1984)″ Monoclonal Antibody Technology″ in Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology″ (《生化和分子生物学实验室技术》 中的 “单克 隆抗体技术” )， Burden 等编 ( 阿姆斯特丹的埃尔斯威尔公司 (Elsevere， Amsterdam)) ； Goldsby 等 编 (2000)Kuby Immunnology(《酷 比 免 疫 学》 )( 第 4 版 ； H. 弗 里 曼 公 司 (H.Freemand&Co.)) ； Roitt 等 (2001)Immunology(《免疫学》 )( 第 6 版 ； 伦敦 ： 摩兹比公 司 (Mosby)) ； Abbas 等 (2005)Cellular and Molecular Immunology(《细胞和分子免疫 学》 )( 第 5 版 ； 埃尔斯威尔健康科学分公司 (Elsevier Health Sciences Division)) ； Kontermann 和 Dubel(2001)Antibody Engineering( 《抗体工程》 )( 施普林格公司 (Springer Verlan)) ； Sambrook 和 Russell(2001)Molecular Cloning ： ALaboratory Manual(《分 子 克隆 ： 实验室手册》 )( 冷泉港出版社 (Cold Spring Harbor Press)) ； Lewin(2003)Gene VIII(《基因 VIII》 )( 普伦蒂斯霍尔出版社 (Prentice Hall)2003) ； Harlow 和 Lane(1988) Antibodies ： A Laboratory Manual(《抗体 ： 实验室手册》 )( 冷泉港出版社 ) ； Dieffenbach 和 Dveksler(2003)PCRPrimer(《PCR 引物》 )( 冷泉港出版社 )。
将上文中引用的所有参考文献以及其中引用的参考文献全文纳入本文作参考。
通过说明的方式、 而非限制的方式提供以下实施例。 实施例 实施例 1
CD100 特异性抗体的选择和表征
利用下述方法产生识别人、 猴和鼠 CD100 的小鼠抗 -CD100 抗体。
“品系 1” 细胞系衍生自 BALB/c 小鼠的自发肺肿瘤。本发明人以前证明， 用转染外 源 cDNA 的活的品系 1 细胞注射 BALB/c 小鼠是诱导免疫应答的有效途径 ( 数据未公开 )。 用编码全长人 CD100 cDNA(SEQ ID NO ： 23) 的表达质粒转染品系 1 细胞系。由转染细胞系 分离表达人 CD100 的稳定细胞系 ( 品系 1.CD100)。用完全弗氏佐剂 (CFA) 乳化的纯化的小 鼠 CD100- 组氨酸 ( 具有用于纯化的 C- 末端 6X 组氨酸标记的小鼠 CD100 的胞外结构域 ) 初 免 CD100 缺陷小鼠 (BALB/c 背景， 参见 Kumanogoh 等， J.Immunol.169 ： 1175-1181(2002))。 进行该免疫后一周， 该小鼠肌肉内 (i.m.) 注射 200,000 个活的品系 1.CD100 细胞。注射 品系 1.CD1009 天后， 处死小鼠， 收集脾脏， 按照标准程序与 P3X63Ag8.653 融合伙伴 (ATCC# CRL-1580) 融合产生杂交瘤。通过 ELISA 筛选结合人和小鼠 CD100 的杂交瘤克隆。具体说， 用杂交瘤技术制备 MAb 67 特异性的杂交瘤细胞系。(Kohler 等， Nature 256 ： 495(1975) ； Kohler 等， Eur.J.Immunol.6 ： 511(1976) ； Kohler 等， Eur.J.Immunol.6 ： 292(1976) ；
Hammerling 等， Monoclonal Antibodies and T-Cell Hybridomas(《单克隆抗体和 T 细胞 杂交瘤》 )， 纽约州埃尔斯威尔公司 (Elsevier， N.Y.)， 第 571-681 页 (1981))。产生一大类 小鼠 CD100 特异性抗体。这些抗体中， 大多数以高亲和力结合人 CD100。两种杂交瘤， 即克 隆 67-2 和 76-1， 产生对小鼠和人 CD100 均显示出高亲和力的单克隆抗体 ( 分别称为 MAb 67 和 MAb 76)( 见表 2)。
表 2. 小鼠抗 -CD100MAb 的亲和力测定
*用 表面等离振子共振技术测定亲和力。
抗体交叉阻断 ELISA 显示出， MAb 67 和 MAb 76 识别 CD100 上的不同表位。此外， MAb 67 和 76 识别的表位与单独产生的鼠抗 - 人 CD100 抗体 BD16 识别的表位不同 ( 如 US 2008/0219971A1 所述 )。因此， 产生两种单独的小鼠抗 -CD100 抗体 MAb 76( 参见 SEQ ID NO ： 25-40) 和 MAb 67( 参见 SEQ ID NO ： 3-8 ； 10 ； 11-16 ； 18 ； 20 和 22)。
实施例 2
MAb 67 和 76 阻断小鼠和人 CD100 的体外活性
在荧光阻断实验中， 筛选 CD100 特异性抗体抑制 CD100 结合的能力。用于检测 CD100 特异性抗体是否阻断 CD100 与丛蛋白 B1 结合的方法见图 1。用编码 CD100 受体 ： 丛 蛋白 B1 的 cDNA 转染人 293 细胞。选择表达丛蛋白 B1 的稳定细胞系 (293/ 丛蛋白 )。利 用生物素偶联的组氨酸标签特异性单克隆抗体和链霉亲和素 -APC， 通过流式细胞术检测结 合细胞表面上丛蛋白 B1 的 CD100- 组氨酸。检测的抗 -CD100MAb 能够阻断 CD100 与丛蛋白 B1 结合时， 在细胞上检测到较少的 CD100- 组氨酸， 导致荧光较弱。
40 纳克 (ng) 人或小鼠 CD100- 组氨酸 (C- 末端组氨酸标签 ) 单独培育， 或与不同 浓度的抗 -CD100MAb 一起于 4℃培育过夜。 第二天早晨， 将 (1) 仅 CD100 或 (2) 用抗 -CD100 MAb(67 或 76) 预孵育的 CD100 与 293/ 丛蛋白细胞混合， 冰上孵育 30 分钟。通过丛蛋白 B1 结合细胞的 CD100 用生物素化多克隆兔抗 - 组氨酸 MAb、 然后是链霉亲和素 -APC 进行检测， 通过流式细胞术分析细胞。结果表明， 中和 CD100 导致荧光较弱。具体说， 与只有 CD100 相 比， 用 MAb 67 或 MAb 76 预孵育 CD100 导致荧光较弱 ( 图 2)。抗 -CD100 MAb 67 或 76 的浓 度从 0.156μg/ml 提高到 0.625μg/ml 导致荧光进一步减弱。也观察到对人 CD100 的类似 阻断 ( 数据未显示 )。因此， 这些结果显示， MAb 67 和 MAb 76 均能够阻断人和小鼠 CD100 与丛蛋白 B1 结合。
已证明， CD100/ 丛蛋白 B1 信号转导能通过诱导肌动蛋白丝重组织诱导细胞从胞 外基质脱附和细胞破坏 ( 参见 Kruger 等， Nature Reviews Molecular Cell Biology 6 ： 789-800(2005))。利用在结合于胞外基质后测定细胞脱附的异源实验确定抗 -CD100 抗体 是否可阻断 CD100 诱导的 293/ 丛蛋白细胞从纤连蛋白包被平板上脱附。
在细胞脱附实验中， 将 293/ 丛蛋白细胞 ( 通常培养为悬浮细胞系 ) 以 40,000 个 细胞 / 孔的密度接种于纤连蛋白包被的 96 孔板中， 使其贴壁过夜。2μg/ml 小鼠 CD100- 组 氨酸 (C- 末端组氨酸标签 ) 单独或与不同浓度的抗 -CD100 MAb(67 或 76) 一起于 4℃培育
6 小时。然后， 使 CD100 样品回复至室温， 然后加入 293/ 丛蛋白细胞。利用 CD100 或已用抗 体在 37℃预孵育 30 分钟的 CD100 处理细胞， 用 PBS 洗涤两次， 用结晶紫染色 15 分钟。然 后， 用 PBS 洗涤细胞两次并干燥。在扫描仪上获得图像作记录。然后， 在室温下用 100μl 33％冰醋酸溶解结晶紫， 将其吸移到新平板中。在 570nm 读出吸光度。CD100 引起平板贴附 细胞的数量减少， 因此吸光度降低， 而中和 CD100 导致吸光度增加。
如图 3 所示， 与同种型对照相比， MAb 67 和 MAb 76 均能够阻断小鼠 CD100 介导的 细胞脱附并提高吸光度。类似地， 两种 MAb 均能够阻断人 CD100 介导的细胞脱附 ( 数据未 显示 )。
MAb 67 和 76 阻断 CD100 与细胞表面丛蛋白 B1 结合， 并诱导 293/ 丛蛋白细胞从纤 连蛋白包被平板上脱附。上述体外功能实验的结果证明， MAb 67 和 MAb 76 均能够在体外 阻断小鼠和人 CD100 的功能。
实施例 3
在小鼠疾病模型中评价抗 -CD100 单克隆抗体
在 SJL EAE 动物模型中体内检测抗 -CD100 中和性单克隆抗体 (76 和 67)。复发性 实验性自身免疫脑脊髓炎 (R-EAE) 是 CD4+T 细胞 - 介导的疾病， 其特征是中枢神经系统内 的炎症和脱髓鞘。在 SJL 小鼠中， 用蛋白脂质蛋白质的肽表位 (PLP139-151)(HSLGKWLGHPDKF ； SEQ ID NO ： 24) 免疫可诱导 R-EAE。 这一模型的特征是中度至重度的急性瘫痪期， 随后是消 退和后续复发。用表 3 所列的评分方法对疾病严重程度进行评分。
表 3.EAE 临床体征的评价
用 CFA 配制的 100μg PLP139-151 免疫 SJL 小鼠。在第 0 天给予百日咳毒素， 48 小时 后再次给予。用 30mg/kg MAb 76、 67 或同种型对照抗体治疗小鼠， 从第 0 天开始每周两次， 或从第 7 天开始每周一次。从 EAE 诱导后从第 10 天开始对 EAE 临床体征进行评分。
如图 4A 所示， 与小鼠 IgG 对照相比， 在 SJL 小鼠中用 MAb 76 或 MAb 67 治疗能降 低 EAE 严重程度。在第 21 天和研究结束之间， MAb 76 和 67、 1X/ 周和 2x/ 周的组平均评 分 (GMS) 的降低百分数见图 4B。如图 4B 所示， MAb 76(1X/ 周 ) 对 GMS 的抑制百分数为 35-40％ ； MAb 67(1X/ 周 ) 对 GMS 的抑制百分数为 65-70％ ； MAb 76(2X/ 周 ) 对 GMS 的抑制 百分数为 40-50％； 和 MAb 67(2X/ 周 ) 对 GMS 的抑制百分数为 45-50％。这些结果说明， 在 SJL 小鼠中 MAb 67 和 MAb 76 均能减轻复发缓解型 EAE。
用 MAb 76 以 30mg/kg 剂量和 1X/ 周的给药方案重复 SJL EAE 研究。结果进一步
证明， 与小鼠 IgG 相比， 在 SJL 小鼠中 MAb 76 能够降低 EAE 的严重程度 ( 数据未显示 )。在 第 21 天和研究结束之间， 组平均评分 (GMS) 的降低百分数为 50-60％。而且， 利用 MAb 76 或 MAb 67 以 30mg/kg、 1X/ 周的给药方案重复 SJL EAE 研究。用 MAb 67 或 MAb 76 治疗导 致在第 21 天和研究结束之间， GMS 降低百分数为 30-40％。图 5A 和 5B 的结果进一步证明， 在 SJL 小鼠中 MAb 76 和 MAb 67 能够降低 EAE 的严重程度。
利用 MAb 67 以 30mg/kg、 1X/ 周的给药方案重复 SJL EAE 研究， 其中治疗从免疫后 第 7 天开始。从第 7 天开始用 MAb 67 治疗导致在第 21 天和研究结束之间， GMS 降低百分 数约为 50％。结果见图 6。
这些体内研究的结果证明， 在不同的鼠 EAE 实验中， 用 MAb 76 或 MAb67 中和 CD100 能减轻 EAE 的临床体征。在这些实验中， MAb 76 和 MAb 67 的结果类似。
这些结果表明， MAb 76 和 MAb 67 能够在体外阻断 CD100 活性， 更重要的是， 能够 在小鼠 EAE 模型上进行的不同给药实验中减轻 EAE 严重程度。
实施例 4
嵌合和人源化抗 -CD100 单克隆抗体的制备
上述鼠单克隆抗体克隆 67 显示能够在体外中和人和小鼠 CD100 并在鼠模型体内 改善 EAE。
从克隆 67 杂交瘤克隆重链可变区 (VH) 和轻链可变区 (VK) 基因， 并测定其序列。 MAb 67VH 和 VK 基因的氨基酸序列见下， 其中 CDR1、 CDR2 和 CDR3 区域用下划线表示。
MAb 67 VH ：
QVQLQQSGPELVKPGASVKISCKASGYSFSDYYMHWVKQSPENSLEWIGQINPTTGGASYNQKFKGKAT LTVDKSSSTAYMQLKSLTSEESAVYYCTRYYYGRHFDVWGQGTTVTVSS(SEQ ID NO ： 10)
MAb 67VK ：
DIVMTQSPASLAVSLGQRATISCKASQSVDYDGDSYMNWYQQKPGQPPKLLIYAASNLESGIPARFSGS GSGTDFTLNIHPVEEEDAATYYCQQSNEDPYTFGGGTKLEIK(SEQ ID NO ： 18)
将 MAb 67VH 基因克隆到含有人 γ4 重链恒定区编码序列的哺乳动物表达载体中， 产生全长嵌合重链。将 MAb 67VK 克隆到具有人 κ 恒定区编码序列的哺乳动物表达载体 中， 产生全长嵌合轻链。 为了制备嵌合抗体， 将含有嵌合重链和嵌合轻链的表达载体共转染 到 CHO-S 细胞内。产生的单克隆抗体由细胞分泌， 3-6 天表达期过后收获。利用蛋白质 A 色 谱纯化所得 MAb 并进行表征。通过流式细胞术和 ELISA 证明所得的嵌合 MAb(MAb 2368) 对 CD100 有特异性， 并显示能够与鼠 MAb 67 竞争结合 CD100。总之， 这些数据证明， 分离到编 码所述 67MAb 的正确的 VH 和 VK 基因。
利用 MAb 67 可变 CDR 区产生人源化单克隆抗体。将人源化 VH 和 VK 基因分别克 隆到含有人 γ4 和人 κ 恒定区的载体中。成对的人源化 VH 和人源化 VK 产生 IgG4/κMAb 2503。人源化 MAb 67VH(H2160) 和 VK(L553) 的氨基酸序列如下所示， 其中 CDR1、 CDR2 和 CDR3 区域用下划线表示。
H2160 的序列 ：
QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGYSFSDYYMHWVRQAPGQGLEWMGQINPTTGGASYNQKFKGKAT ITVDKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARYYYGRHFDVWGQGTTVTVSS(SEQ ID NO ： 9)
L553 的序列 ：DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKASQSVDYDGDSYMNWYQQKPGQPPKLLIYAASNLESGVPDRFSGS GSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQQSNEDPYTFGQGTKLEIK(SEQ ID NO ： 17)
将编码 MAb 2503 抗体的 VH( 具有人 γ 的人免疫球蛋白基因 ； H2160) 和 VK( 具 有人 κ 的人免疫球蛋白基因 ； L553) 区的多核苷酸克隆到 pCMV-Script( 司查塔基公司 (Stratagene)) 载体内， 并于 2009 年 5 月 7 日保藏于美国典型培养物保藏中心 ( “ATCC” )， 获 得 的 ATCC 保 藏 号 分 别 为 PTA-10004 和 PTA-10005。ATCC 位 于 美 国 弗 吉 尼 亚 州 玛 纳 萨 斯 (20110-2209) 的 大 学 大 道 10801 号 (10801University Boulevard， Manassas， VA 20110-2209， USA)。 按照布达佩斯条约有关国际认可的微生物保藏机构的条款， 出于专利程 序目的， 在 ATCC 进行保藏。
实施例 5
人源化抗 -CD100 单克隆抗体 2503 的表征
通过 ELISA 和流式细胞术鉴定 MAb 2503 的特异性。在采用 MAb 67 的表位竞争实 验中和采用 表面等离振子共振技术的亲和力测定实验中检测 MAb 2503。
通过竞争 ELISA 测定 MAb 2503 和 MAb 67 的表位特异性。在 ELISA 方案中， 用 CD100-Fc 包被 ELISA 平板。滴定小鼠 67 或人源化 2503MAb。让抗体结合 CD100， 并洗去未 结合的抗体。加入生物素化 MAb 67。让抗体结合 CD100， 并洗去未结合的抗体。用链霉亲 和素 -HRP 检测结合 CD100 的生物素化 MAb 67。用 ELISA 分析 MAb 2503 或 MAb 67 阻断生 物素化 67 与人 CD100( 图 7A) 和小鼠 CD100( 图 7B) 结合的能力。
用 表面等离振子共振技术测定抗 -CD100MAb 的结合亲和力。MAb 2503 只能结合 CD100( 人、 小鼠和狨 ) 和 CD100 表达细胞系， 表明 MAb 2503 对 CD100 有特 异性。与 MAb 67 相比， MAb 2503 对人和小鼠 CD100 的亲和力较高。有关 MAb 2503 和 MAb 67 的亲和力特征的小结见表 4。
表 4. 抗 -CD100MAb 对人、 狨和小鼠 CD100 的亲和力
*用 表面等离振子共振技术测定亲和力。
这些实验表明， MAb 2503 对 CD100 有特异性， 并且与小鼠 MAb 67 结合相同的表位。 MAb 2503 显示能结合小鼠和人的 CD100， 因此 MAb 2503 的优势是可以在小鼠和人中测定其 安全性和功效。而且， 已证明 MAb 2305 能结合人、 猴和小鼠的 CD100。
实施例 6
MAb 2503 阻断小鼠和人 CD100 的体外活性
利用上述实施例 2 所述的实验， 包括 (1) 流式细胞术阻断实验和 (2) 细胞脱附实 验， 测定 MAb 2503 阻断 CD100 功能的能力。
在荧光阻断实验中， 筛选 CD100 特异性抗体 MAb 67 和 MAb 2503 抑制 CD100 与丛 蛋白 B1 结合的能力。用于检测 CD100 特异性抗体是否阻断 CD100 与丛蛋白 B1 结合的方法 见图 1( 实施例 2)。与只有 CD100 相比， 用 MAb 67 或 MAb 2503 预孵育 CD 100 导致荧光较
弱。MAb 2503 能够在体外阻断人 ( 见图 8A)、 狨 ( 见图 8B) 和小鼠 ( 见图 8C)CD100 的结合。 因此， 这些结果显示， MAb67 和 MAb 2503 均能够阻断人、 猴和小鼠 CD100 与丛蛋白 B1 结合。
利用如实施例 2 所述的细胞脱附实验测定抗 -CD100MAb 阻断人和猴 CD100 介导的 293/ 丛蛋白细胞从纤连蛋白包被平板上脱附的能力。CD100 引起平板贴附细胞数量减少， 因此吸光度降低。用 MAb2503 或 MAb 67 中和人 CD100 和狨 CD100 导致吸光度增加， 分别如 图 9A 和 9B 所示。该实验中， MAb 2503 和 MAb 67 也中和小鼠 CD100( 数据未显示 )。
MAb 2503 阻断人、 小鼠和猴 CD100 与细胞表面丛蛋白 B1 结合， 并诱导 293/ 丛蛋白 细胞从纤连蛋白包被平板上脱附。因此， 这些结果表明， MAb 2503 能够在功能上中和人、 小 鼠和猴 CD100。
实施例 7
抗 -CD100 抗体在体内抑制血管新生
CD100 是强效的促血管新生分子， 通过 CD100 结合活化丛蛋白 B1 能反式激活 c-Met， 提高肿瘤细胞的侵袭能力并促进血管新生。
为了证明缺乏 CD100 对肿瘤生长的体内影响， 将 CT26 肿瘤细胞注射到野生型 Balb/c 或 CD100-/- 小鼠的腿部肌肉内， 测定所得的肿瘤生长。如图 10 所示， 在本研究中， 与野生型 Balb/c 小鼠相比， CD100-/- 小鼠的肿瘤体积缩小。这些结果证明， 在缺少 CD100 的环境中小鼠结肠癌细胞系 (CT26) 的生长受损。
接下来， 在野生型 Balb/c 小鼠中测定 MAb 67 降低 CT26 肿瘤细胞生长的能力。将 CT26 肿瘤细胞注射到野生型 Balb/c(n ＝ 48) 或 CD100-/-(n ＝ 9) 小鼠的腿部肌肉内。注 射后， 将野生型小鼠分成两组， 每组 24 只小鼠。 一组通过从第 1 天开始腹膜内注射 1mg MAb 67 进行治疗， 另一组通过腹膜内注射 1mg 小鼠 IgG 进行治疗。每 7 天重复治疗一次。分析 小鼠的肿瘤生长。如图 11 所示， 在 Balb/c 小鼠中， 与小鼠 IgG 对照组相比， 用 MAb 67 治疗 能降低 CT26 肿瘤的生长。
因此， 这些结果表明， 具有 MAb 67 的结构和功能特征的抗体能在体内降低肿瘤生 长。
实施例 8
抗 -CD100 抗体在体内抑制胶原诱导性关节炎
在胶原诱导性关节炎 (CIA) 小鼠模型中检测 MAb 67 减轻关节炎的能力。胶原诱 导性关节炎 (CIA) 模型是广泛用于解释疾病病理和验证治疗性 RA 靶点的类风湿性关节炎 (RA) 的临床前动物炎症模型 (Brand 等， Nat.Protoc.2(5) ： 1269-75(2007))。CIA 总程序如 图 12 所示 ( 对该总程序的任何改动如下所述 )。简要说， 在第 0 天， 通过皮内尾部注射含 有胶原和完全弗氏佐剂 (CFA) 的乳液诱导关节炎。然后， 从第 20 天开始每周两次通过皮下 (s.c.) 或腹膜内 (i.p.) 注射给予对照和测试治疗。研究 1 的测试组如表 5 所示。
表 5. 胶原诱导性关节炎 (CIA) 研究 1 测试组
用表 6 所列的评分方法对疾病严重程度进行评分。对各小鼠的爪进行评分 ( 每周 三次评价关节炎的宏观体征 )。通过加入单独的爪评分计算关节炎指数 (AI)(AI 最大值＝ 16)。通常， 在免疫后 21-28 天， CIA 模型中第一次出现关节炎体征。
表 6.CIA 评分方法
评分 0 1 2 3 4
说明 没有观察到关节炎效应 1 个指头出现水肿和 / 或红斑 2 个指头出现水肿和 / 或红斑 多于 2 个指头出现水肿和 / 或红斑 整个爪和全部指头出现严重关节炎研究 1 的结果证明， 600μg MAb 67 治疗组的 CIA 模型中关节炎疾病进展减缓。 在第 20 天开始治疗时， 600μg MAb 67 治疗的小鼠的关节炎指数 (AI) 与 600μg 阴性对照 (IgG1) 和 600μg 阳性对照 ( 依那西普 ) 治疗的小鼠的 AI 作比较。结果见图 13A。这些结 果表明， 在减缓 CIA 模型的关节炎疾病进展方面， MAb67 与依那西普同样好， 甚至优于依那 西普。
第二项研究 ( 研究 2) 包括 MAb 67 和阳性对照治疗， 其中治疗推迟， 即从关节炎指 数≥ 3 时开始治疗。研究 2 的测试组如表 7 所示。
表 7. 胶原诱导性关节炎 (CIA) 研究 2 测试组
在研究 2 中， 将 MAb 67 治疗的 AI 结果 ( 治疗从第 20 天或 AI ≥ 3 时开始 ) 与阴 性对照 (IgG1) 和阳性对照 ( 依那西普 ； 治疗从 AI ≥ 3 时开始 ) 治疗结果作比较。结果见 图 13B。这些结果说明， 在减缓 CIA 模型的关节炎疾病进展方面， 治疗从第 20 天或推迟至
AI ≥ 3 时开始时， MAb 67 与依那西普同样好， 甚至优于依那西普。因此， 在 CIA 模型中， 在 AI ≥ 3 时开始给药时， MAb 67 能防止关节炎疾病进展并治疗关节炎疾病。
实施例 9
抗 -CD100 抗体在体内阻断原发和记忆 B 细胞应答
用明矾 ( 氢氧化铝 / 氢氧化镁 ) 沉淀的 (4- 羟基 -3- 硝基苯基 ) 乙酰基偶联的 鸡 γ 球蛋白 ( ″ NP-CGG ″ ) 免疫 Balb/c 和 CD100-/- 小鼠， 然后用对照 IgG1(Balb/c 和 CD100-/-) 或 MAb 67( 仅 Balb/c) 治疗。测试组如下表 8 所示。
表 8. 测试组的原发和记忆 B 细胞应答
如上表 8 所述， 从第 -7 天开始治疗小鼠， 并在第 0 天用 NP-CGG 免疫。在第 10 天， 每组处死三只小鼠， 分析脾脏和淋巴结的生发中心 (GC)B 细胞 ( “B220+CD38 低 PNA+” )。各 脾脏进行单独分析， 将所有三只小鼠的淋巴结合并成一个样品进行分析。如表 8 所示， 继续 对其余小鼠进行治疗。 在第 21 天， 用含有明矾的相同 NP-CGG 对小鼠进行加强免疫。 在第 31 天， 将其余小鼠处死， 分析脾脏和淋巴结的生发中心 (GC)B 细胞 (“B220+CD38 低 PNA+” )。 各脾脏进行单独分析， 将所有三只小鼠的淋巴结合并成一个样品中进行分析。 图 14A 和 B 的 结果表明， 首次免疫 (14A) 和第二次免疫 (14B) 后， 用 600μg MAb67 治疗能减少脾脏 (SP) 和淋巴结 (LN) 中的 GC B 细胞数量。因此， MAb 67 能在体内阻断首次和记忆 B 细胞应答。
实施例 10
抗 -CD100 抗体在体内减缓肿瘤生长
在 CT26 和 BCA34 小鼠异种移植瘤模型中检测 MAb 67 对肿瘤生长的抑制作用。在 这些研究中， 将肿瘤细胞肌肉内注射至 Balb/c 小鼠腿部。从植入后 1 天开始， 以 1X/ 周的 频率腹膜内 (i.p.) 注射 0.2ml 体积的 1mg MAb 67 抗体或阴性对照 (IgG)， 以治疗小鼠。测 3 3 定肿瘤体积 (mm ) 和 / 或大腿体积 (mm ) 的改变， 以确定肿瘤生长速率。利用与阴性对照小 鼠的肿瘤生长速率相比 MAb 67 治疗小鼠的肿瘤生长速率计算肿瘤生长延迟 (TGD)。
还检测 BCA34 和 EMT6 肿瘤细胞在缺乏 CD100 的环境中生长的能力。在这些研究 中， 将肿瘤细胞注射到 Balb/c 和 CD100-/-(SEMA4D-/-) 小鼠腿内， 测定肿瘤生长。
CT26 结肠肿瘤细胞
CT26 肿瘤细胞衍生自鼠结肠肿瘤， 其 CD100 表达水平非常低。用 50,000 个 CT26 结肠肿瘤细胞 s.c 注射野生型 Balb/c 小鼠 (20 只小鼠 / 治疗组 )。与注射 IgG 对照的小鼠 相比， 测定从植入后第 1 天开始每周用 1mg MAb 67 治疗的小鼠的肿瘤体积改变 (mm3)。结 果 ( 随时间变化的平均肿瘤体积 ) 见图 15。MAb 67 治疗小鼠的 TGD 为 17％ (p ＝ 0.0317)。 这些结果表明， MAb 67 治疗的小鼠中 CT26 肿瘤生长降低。
BCA34 成纤维细胞肿瘤细胞
BCA34 肿瘤细胞中 CD100 表达水平较低。首先， 将 50,000 个 BCA34 肿瘤细胞皮下 注射到野生型 Balb/c 小鼠或 CD100-/-(“SEMA4D-/-” ) 小鼠的腹部区域内。测定这些小 3 鼠的肿瘤体积改变 (mm )， 结果如图 16A 所示。这些结果表明， BCA34 肿瘤细胞在缺少 CD100 的环境中生长受损。
在单独实验中， 将 50,000 个 BCA34 肿瘤细胞注射到野生型 Balb/c 小鼠的腿部肌 肉内 (21 只小鼠 / 治疗组 )。与注射 IgG 对照的小鼠相比， 测定从植入后第 1 天开始每周用 3 1mg MAb 67 治疗的小鼠的肿瘤体积改变 (mm )。结果 ( 随时间变化的平均大腿体积 ) 见图 16B。MAb 67 治疗小鼠的 TGD 为 18％ (p ＝ 0.009)。这些结果表明， MAb 67 治疗的小鼠中 BCA34 肿瘤生长降低。
EMT6 乳腺癌肿瘤细胞
EMT6 肿瘤细胞衍生自鼠乳腺癌肿瘤， 其 CD100 表达水平中等。 将 50,000 个 EMT6 肿 瘤细胞注射到野生型 Balb/c 小鼠或 CD100-/-( “SEMA4D-/-” ) 小鼠的腿部肌肉内。测定这 3 些小鼠的肿瘤体积改变 (mm )， 结果如图 17 所示。 显示了野生型 Balb/c 小鼠和 CD100-/- 小 3 鼠 (“SEMA4D-/-” ) 的肿瘤体积改变 (mm )。这些结果表明， EMT6 肿瘤细胞在缺少 CD100 的 环境中生长受损。
实施例 11
抗 -CD100 抗体在体内减缓人肿瘤生长
在 HN12 和 HN6 HIF1a mODD 人异种移植瘤模型中检测 MAb 2503 对肿瘤生长的 抑制作用。HN12 和 HN6 HIF1a mODD 衍生人头颈肿瘤， 这两种异种移植瘤均高水平表达 HIF1a 和 CD100。HN6 HIF-1a mODD 异种移植瘤模型可参见 Sun 等， J Biol Chem 284(46) ： 32066-74(2009)。在这些实验中， 将 2 个肿瘤 / 小鼠皮下注射到无胸腺裸小鼠内 (10 只小 鼠 / 治疗组 )。从植入后 1 天开始， 以 1X/ 周的频率 i.p. 注射 0.2ml 体积的 1mg MAb 2503 抗体或阴性对照 (IgG4)， 以治疗小鼠。测定肿瘤体积改变 (mm3)。利用与阴性对照小鼠的 生长速率相比 MAb 2503 治疗的 HN6 HIF-1a mODD 小鼠的肿瘤生长速率计算肿瘤生长延迟 (TGD)。
该实验的终点是 TGD。 HN12 和 HN6 HIF-1a mODD 异种移植瘤模型中 MAb 2503 治疗 的肿瘤生长结果分别参见图 18 和 19A。用 MAb 2503 治疗的 HN6 HIF-1a mODD 异种移植瘤 小鼠的 TGD 为 13％ (p ＝ 0.0008)。而且， IgG4 对照和 MAb 2505 治疗的 HN6 HIF-1a mODD 异种移植瘤小鼠的代表性肿瘤照片见图 19B。这些结果表明， 用 MAb 2503 治疗能在体内降 低人头颈肿瘤的生长。
实施例 12
表达高滴度 MAb 2503 的稳定的 CHO-S 细胞系
获得表达高滴度 MAb 2503 的稳定的 CHO-S 细胞系。利用人源化抗 -CD100 单克隆抗体 2503 的重链和轻链的互补 DNA(cDNA)， 利用 GPExTM 技术 ( 威斯康星州麦迪逊的卡塔兰 药物解决方案公司 (Catalent Pharma Solutions， Madison， Wisconsin)) 和祖细胞 CHO-S 细胞 ( 参见 Bleck 等， An Alternative Method for the Rapid Generation of Stable， High-Expressing Mammalian Cell Lines( “快速产生稳定的高表达哺乳动物细胞系的替代 方法” )， BioProcessing Journal(2005 年 9/10 月 )) 构建产生若干中华仓鼠卵巢 (CHO-S) 表达细胞系。
单细胞克隆后， 根据在培养物中的生长和抗体产量选择一个表达克隆， 产生装瓶 的表达细胞研究库。利用体外和体内功能实验 ( 如， 流动阻断和脱附实验 ) 鉴定该克隆产 生的表达抗体的功效和特异性。随后， 培养扩增来自所选 CHO 表达克隆的细胞， 制备和冷冻 第二个库 ( 亲代种子储库 (Parental Seed Stock))。随后， 培养扩增来自亲代种子储库中 一瓶的细胞， 并用于 cGMP 产生主细胞库 (Master Cell Bank， MCB)。
实施例 13
在大鼠和猕猴中进行抗 -CD100 抗体剂量和 PK 研究
在大鼠和猕猴中进行 MAb 2503 的单次静脉内注射饱和分析。
大鼠研究 ： 向 36 只 SD(Sprague-Dawley) 大鼠单次静脉内注射给予 0.01 至 100mg/ kg 的 MAb 2503(3 只 / 性别 / 组 )。 在对不同时间点的裂解全血进行基于流式细胞术的饱和 实验， 以确定用 MAb 2503 饱和的细胞靶点 (SEMA4D) 的百分数。 与血清中检测到的 MAb 含量 的良好数据相关性提示， 饱和依赖于血清中游离药物的含量， 在血清中检测到大约 1-5μg/ ml 游离药物时细胞被饱和。在雄性和雌性大鼠中， MAb 2503 剂量为 0、 0.01、 0.1、 1.0、 10 和 100mg/kg 时 SEMA4D 的饱和百分数分别如图 20A 和 20B 所示。
灵长动物研究 ： 向 28 只猕猴单次静脉内注射给予 0.01 至 100mg/kg 的 MAb 2503(2 只 / 性别 / 组 ； 4 只 / 性别 / 对照组 )。 对不同时间点的裂解全血进行基于流式细胞术的饱和 实验， 以确定用 MAb 2503 饱和的细胞靶点 (SEMA4D) 的百分数。 与血清中检测到的 MAb 含量 的良好数据相关性提示， 饱和依赖于血清中游离药物的含量， 在血清中检测到大约 1-5ìg/ ml 游离药物时细胞被饱和。在雄性和雌性大鼠 ( 合并 ) 中， MAb 2503 剂量为 0、 0.01、 0.1、 1.0、 10 和 100mg/kg 时 SEMA4D 的饱和百分数如图 21 所示。大鼠和灵长动物饱和结果非常 类似。
在大鼠和灵长动物中单次静脉内注射 0.01、 0.1、 1.0、 10 或 100mg/kg MAb2503 后， 药代动力学 (PK) 结果包括生物学半衰期 ( 小时 ( 天 ))、 在注射后时间 0 点的血浆抗体浓度 (C0) 和从时间 0 点到 t 时间点的血浆浓度曲线的曲线下面积 (AUC0-t) 如表 9 所示。
表 9. 在大鼠和灵长动物 ( 猕猴 ) 中 2503 抗体的 PK 值
发现 MAb 2503 在大鼠和猕猴中的清除半衰期相似， 以剂量依赖方式从约 6 小时至 约 10 天。饱和与 PK 结果看来是剂量依赖性的， 这提示大鼠和猕猴的情况明显类似。而且， MAb 2503 剂量范围从 0.01 到 100mg/kg 时， 在大鼠或猕猴中未见明显毒性。
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