核酸递送组合物及其使用方法 相关申请的交叉参考
本申请要求于 2009 年 6 月 1 日提交的美国临时申请号 61/182,832 的优先权， 该 申请的公开内容通过引用合并入本文。
技术领域
本公开书涉及用于转导细胞的组合物和方法。背景技术 已经使用各种各样的重组病毒载体、 脂质递送系统和电穿孔在体外和体内进行核 酸至细胞的递送。 这些技术通过敲除基因表达或提供用于基因治疗的遗传构建物设法治疗 各种疾病和病症或研究不同的生物系统。
聚阴离子寡聚物诸如寡核苷酸不容易跨细胞膜扩散。 为了克服培养细胞的这个问 题， 阳离子脂质与阴离子寡核苷酸结合以帮助摄取。 不幸的是， 该复合物对细胞通常是有毒 的， 这意味着必须小心地控制阳离子脂的暴露时间和浓度， 以保证活细胞的转染。
作为选择性降解 mRNA 的细胞机理的 RNA 干扰的发现使得可以靶向操作细胞培 养物的表型和发展定向治疗技术 (Behlke， Mol.Ther.13， 644-670， 2006 ； Xie 等人， Drug Discov.Today 11， 67-73， 2006)。然而， 由于它们的大小和负 ( 阴离子 ) 电荷的性质， siRNA 是不能进入细胞的大分子。实际上， siRNA 超过了 Lipinski 的用于细胞递送膜可扩散分子 的 “5s 规则” (Rule of 5s) 的 25 倍， 在该规则中， 通常膜可扩散分子限制为小于 500Da 的尺 寸。因此， 在不存在递送载体或转染剂时， 裸露的 siRNA 不进入细胞， 即使在毫摩尔的浓度 下也不能 (Barquinero 等人， Gene Ther.11 Suppl 1， S3-9， 2004)。重要的关注集中在使用 阳离子脂质上， 其凝聚 siRNA 并在细胞膜上打孔来解决 siRNA 的递送问题。尽管已经广泛 使用， 但转染剂不能实现有效地递送到许多细胞类型， 尤其是原代细胞和造血细胞系中 (T 细胞和 B 细胞， 巨噬细胞 )。而且脂质转染试剂经常导致不同程度的细胞毒性， 从肿瘤细胞 中的轻度到原代细胞中的高度的细胞毒性。
发明内容 本公开书提供了用于将掩蔽的寡核苷酸或多核苷酸递送到活细胞中的方法和组 合物。本发明提供了短暂保护的寡核苷酸或多核苷酸， 其包含阴离子电荷中和部分 / 基团。 在一个实施方案中， 所述电荷中和部分包含碱性 / 阳离子电荷。在另一个实施方案中， 所述 部分包括沿本发明的三酯保护基团的伯胺、 仲胺或叔胺。这些化合物可以通过胞吞或大型 胞饮机制进入活细胞的细胞胞质。在一个实施方案中， 所述磷酸三酯保护 / 中和基团当暴 露于细胞内环境时， 被设计成通过酶活性或通过被动的细胞内方法 ( 例如， pH 改变 ) 除去， 以提供能够诱发 RNAi 应答的寡核苷酸或多核苷酸。因此， 本发明提供了可用作治疗剂、 诊 断剂和作为研究工具的寡核苷酸前药。
本公开书提供了 RNAi 诱导的单个可溶性核糖核酸碱 (siRNB) 分子。在一些实施
方案中， siRNB 分子与肽转导结构域 (PTD) 细胞递送肽 (PTD-siRNB) 缀合， 所述肽转导结构 4 域 (PTD) 细胞递送肽 (PTD-siRNB) ＜ 2x10 Da。RNB 亚磷酰胺结构单元被改造从而包含生 物学可逆的氨基异丁基 S- 酰基硫代乙基碱性磷酸三酯， 其被细胞质硫酯酶特异性地去除， 导致反转为野生型磷酸二酯。自递送的 PTD-siRNB 在培养的原代和转化细胞的全部群体中 诱导快速的 RNAi 应答， 并且在小鼠模型的鼻和上呼吸道中体内诱导 RNAi 应答。PTD-siRNB 代表一种新型的诱导 RNAi 应答的单个可溶性分子方式。
本公开书提供了伯胺基团形式 (pKa ＞ 9.0) 的碱性 ( 正 ) 电荷， 其使 RNB 可溶于 水中， 并且不会被 PTD 递送肽从溶液中驱除。
本公开书提供了在电荷中和的寡核苷酸中使用的修饰核苷酸。 核苷酸包含与核苷 酸的磷酸基团缀合的氨基烷基 S- 酰基硫代烷基 (“电荷中和部分” 或 “N-SATE” )。中和基 团协助包含所述修饰的核苷酸的寡核苷酸跨细胞膜运输。一旦被细胞摄取， 所述中和基团 被例如内源性或外源性硫酯酶去除。
在一个实施方案中， 用于将 N-SATE 添加至寡核苷酸 ( 例如， 和 RNA 寡核苷酸 ) 的 结构单元包含电荷中和部分， 所述电荷中和部分具有下列通式结构 ：
其中 R 是氨基或末端为氨基的 1-7 个原子的烷基、 取代的烷基、 烷氧基、 取代的烷 氧基、 环烷基、 取代的环烷基、 烯基、 取代的烯基、 炔基、 取代的炔基、 芳基、 取代的芳基、 杂环 或取代的杂环。前述结构可以在生成 siRNB 分子的 RNA 合成反应期间加入。
在一个实施方案中， 所述电荷中和部分包含具有下列通式结构的 N-SATE ：
其中 R1 可以存在或可以不存在， 当 R1 存在时， R1 选自烷基、 取代的烷基、 烷氧基、 取 代的烷氧基、 环烷基、 取代的环烷基、 烯基、 取代的烯基、 炔基、 取代的炔基、 芳基、 取代的芳 基、 杂环或取代的杂环 ；
其中 R2 可以存在或可以不存在， 当 R2 存在时， R2 选自 1-7 个原子的烷基、 取代的烷 基、 烷氧基、 取代的烷氧基、 环烷基、 取代的环烷基、 烯基、 取代的烯基、 炔基、 取代的炔基、 芳 基、 取代的芳基、 杂环或取代的杂环。在一个实施方案中， 所述电荷中和部分选自 ：
所述电荷中和部分可以与核酸碱基 ( 即， A、 G、 T、 U、 C) 中任一种的磷酸基团缀合。 例如， 本公开书提供了具有下列通式结构的核苷酸 ：
其中 R1 可以存在或可以不存在， 当 R1 存在时， R1 选自烷基、 取代的烷基、 烷氧基、 取 代的烷氧基、 环烷基、 取代的环烷基、 烯基、 取代的烯基、 炔基、 取代的炔基、 芳基、 取代的芳 基、 杂环或取代的杂环 ；
其中 R2 可以存在或可以不存在， 当 R2 存在时， R2 选自 1-7 个原子的烷基、 取代的烷 基、 烷氧基、 取代的烷氧基、 环烷基、 取代的环烷基、 烯基、 取代的烯基、 炔基、 取代的炔基、 芳 基、 取代的芳基、 杂环或取代的杂环。在一个实施方案中， 所述电荷中和部分选自 ：
本公开书还提供了包含寡核苷酸或多核苷酸的核酸构建物， 所述寡核苷酸或多核 苷酸包含减少所述寡核苷酸或多核苷酸主链的净阴离子电荷的电荷中和部分 ( 例如， 磷 酸二酯和 / 或硫代磷酸酯保护基团 )。在一个实施方案中， 所述寡核苷酸或多核苷酸包括 siRNA 分子。 还在另一个实施方案中， 所述寡核苷酸包括多个修饰的具有电荷中和部分的核 苷酸。还在另一个实施方案中， 所述寡核苷酸或多核苷酸包含多个邻近的具有电荷中和部 分的核苷酸。还在另一个实施方案中， 所述寡核苷酸或多核苷酸包含多个彼此间隔 1 个或 多个核苷酸碱基 ( 例如， 2、 3、 4、 5、 6、 7、 8、 9 或多个核苷酸碱基 ) 的具有电荷中和部分的核苷 酸。还在另一个实施方案中， 包含电荷中和部分的寡核苷酸或多核苷酸与转导结构域缀合 或可操作地连接， 所述转导结构域包括膜转运功能， 与所述寡核苷酸或多核苷酸结构域可 操作连接。
本公开书也提供了药物组合物， 其包含本文所述的核酸构建物。
本公开书描述了包括将一个或多个蛋白转导结构域连接到核酸构建物的方法。 在
一个方面， 所述一个或多个蛋白转导结构域包含 2-5 个蛋白转导结构域。
本公开书也提供了产生核酸构建物的方法， 该方法包括 ： 基本上纯化蛋白转导结 构域 ； 合成寡核苷酸 ； 用电荷中和基团电荷中和所述寡核苷酸的阴离子电荷 ； 和将所述寡 核苷酸连接到一个或多个蛋白转导结构域。
还提供了转染细胞的方法， 所述方法包括用本公开书的核酸构建物接触细胞。所 述接触可以在体内或体外。
本公开书也提供了治疗疾病或病症的方法， 所述方法包括向受试者施用本公开书 的核酸构建物， 其中所述寡核苷酸或多核苷酸包含治疗性或诊断性分子。 附图说明
图 1 描绘了细胞摄取电荷中和的寡核苷酸和酶法脱保护。 图 2 描绘了 N-SATE 磷酸三酯脱保护。 图 3 显示了亚磷酰胺结合至 RNA 寡核苷酸中的实施方案。 图 4A-B 显示了本公开书的核苷亚磷酰胺合成路线。 图 5 显示了 Fmoc-N1-SATE 纯化和表征。 图 6 显示了 Fmoc-N1-SATE U 亚磷酰胺纯化和表征。 图 7 显示了 Fmoc-N1-SATE C 亚磷酰胺纯化和表征。 图 8 显示了 Fmoc-N1-SATE A 亚磷酰胺纯化和表征。 图 9 显示了 Fmoc-N2-SATE 纯化和表征。 图 10 显示了 Fmoc-N2-SATE U 亚磷酰胺纯化和表征。 图 11 显示了 Fmoc-Ala-SATE 亚磷酰胺的合成。 图 12 显示了 Fmoc-Ala-SATE 纯化和表征。 图 13 显示了 Fmoc-Ala-SATE U 亚磷酰胺纯化和表征。 图 14 显示了包含具有 N1-U-SATE 核苷酸的 SEQ ID NO ： 21 的测试序列以及纯化和 图 15 显示了包含具有 N1-U-SATE 核苷酸的 SEQ ID NO ： 22 的测试序列以及纯化和表征。
表征。 图 16 显示了包含具有 N1-U-SATE 核苷酸的 SEQ ID NO ： 23 的针对 GFP 的 RNAi 和 显示在 24 小时 GFP 表达的抑制的剂量响应曲线。
图 17 显示了包含具有 N1-U-SATE 核苷酸的 SEQ ID NO ： 23 的针对 GFP 的 RNAi 和 显示在 48 小时 GFP 表达的抑制的剂量响应曲线。
图 18 显示了在细胞中的 GFP RNAi 抑制作用。
图 19 显示了 HPLC 纯化 AS-10 N1-SATE(SEQ ID NO ： 24)。
图 20 显示了 3S-9N1-SATE(SEQ ID NO ： 25) 的 HPLC 纯化结果。
图 21 显示了在变性凝胶分析中 S 和 AS N1-SATE 寡核苷酸的纯化。
图 22 显示了纯化的 S-9N1-SATE(SEQ ID NO ： 25) 和 AS-10-N1-SATE(SEQ ID NO ： 24) 形成 dsRNB。
图 23 显示了在存在各种 siRNA 抑制剂和浓度 (SEQ ID NOs ： 24 和 25) 的条件下的 24 小时 GFP 表达测量。
图 24 显示了在存在各种 siRNA 抑制剂和浓度 (SEQ ID NOs ： 24 和 25) 的条件下的 48 小时 GFP 表达测量。
图 25 显示了在存在各种 siRNA 抑制剂和浓度 (SEQ ID NOs ： 24 和 25) 的条件下的 48 小时 GFP 表达测量。
图 26 显示了使用电荷保护的 siRNA 制剂的表达抑制。
图 27 显示了合成测试物 N2-SATE 磷酸三酯寡核苷酸 (SEQ ID NO ： 21)。
图 28 显示了包含 9 个电荷中和部分的 SEQ ID NO ： 25 的纯化。
图 29 显示了包含 15 个电荷中和部分的 SEQ ID NO ： 25 的纯化。
图 30 显示了 SEQ ID NO ： 25 的脱保护反应。
图 31 显示了使用 21 聚体电荷保护的寡核苷酸 (SEQ ID NO ： 23) 针对 GFP 的 RNAi 应答。
图 32 显示了使用本公开书的电荷保护基团的电荷保护的寡核苷酸 (SEQ ID NO ： 23) 可溶于盐溶液中。 具体实施方式 如本文和在所附权利要求所用， 单数形式 “一” 、 “和” 以及 “该” 包括复数指代物， 除非上下文另外清楚地说明。因此， 例如， 提及 “一个 PTD” 包括几个这种 PTD， 提及 “所述细 胞” 包括提及本技术领域人员所知的一个或多个细胞， 等等。
除非另外说明， 本文所用的所有技术和科学术语具有本公开书所属领域技术人员 通常理解的相同意思。 但是类似于或等同于本文所述那些的方法和材料可以被用于实施所 公开的方法和组合物， 本文描述了示例性方法， 装置和材料。
此外， “或” 的使用是指 “和 / 或” ， 除非另外说明。同样， “包含” 、 “包括” 、 “含有” 和 “具有” 是可互换的并且不意在是限制性的。
还要理解， 当各个实施方案的描述使用术语 “包括” 时， 本领域技术人员将理解在 具体的情况下， 实施方案可以备选地使用 “基本由 ... 组成” 或 “由 ... 组成” 的表述。
上述和全文所述的出版物仅仅提供它们在本申请申请日之前的公开内容。 此处绝 不应理解为承认由于在先公开内容的存在本发明人无权先于这些公开内容而获得授权。
递送一些生物活性剂到细胞内的能力是存在问题的， 因为存在细胞膜所带来的生 物利用度的限制。细胞胞质膜形成屏障， 其将细胞内摄取的分子局限在那些具有足够的非 极性和尺寸小于大约 500 道尔顿的分子。以前的提高蛋白细胞内化的努力集中在与受体配 体的融合蛋白 (Ng 等人， Proc.Natl.Acad.Sci.USA， 99 ： 10706-11， 2002) 或通过将它们包装 进笼形脂质体载体中 (Abu-Amer 等人， J.Biol.Chem.276 ： 30499-503， 2001)。然而， 这些技 术常导致不良的细胞摄取和细胞内隔离进入胞吞途径。
其它高度带电的具有治疗能力的核酸分子面临相同的递送屏障。例如， RNA 适体 具有高的结合、 隔离和抑制在＞ 10,000 道尔顿和高度带电的蛋白的能力， 它们自己不具有 或具有有限的能力到进入细胞。本公开书的方法和组合物允许细胞内递送 RNA 适体、 siRNA 和 DNA 载体。
由于它们的阴离子电荷和～ 14,000 道尔顿的大尺寸， 在哺乳动物包括人中递送 siRNAi 面临很大的挑战。然而， 带正电荷的肽和蛋白已经在寡核苷酸方面获得了进展。例
如， 将蛋白转导结构域 (PTD) 连接至核酸已经在寡核苷酸递送方面提供了一些进展。然而， 甚至在这些情况下， siRNA 和 PTD 的阴离子和阳离子电荷经常分别彼此中和， 减少了被具有 阳离子电荷所促进的摄取。
本公开书提供了通过保护 / 中和与寡核苷酸或多核苷酸相关的电荷来促进和提 高细胞摄取核酸分子的方法和组合物。在一些实施方案中， 本公开书的组合物将阳离子电 荷提供至核酸以促进摄取。在其他的实施方案中， 额外的带正电荷的部分可以连接至核酸 分子。
本公开书提供了递送可用于选择性地治疗人类疾病和有利于研究的序列特异的 寡核苷酸或多核苷酸的组合物和方法。 本公开书的组合物和方法更有效地递送寡核苷酸和 多核苷酸， 包括 siRNA、 RNA 适体和 DNA 载体至受试者和细胞。本公开书克服使这种 RNAi 构 建物难以递送或不能递送的大小和电荷的限制。通过可逆的中和在核酸 ( 例如， dsRNA) 上 的阴离子电荷， 包含根据本公开书的磷酸三酯和 / 或硫代磷酸酯保护基团的构建物可以在 体外和体内将核酸递送进入细胞。
本公开书提供了包含电荷中和部分 ( 例如， 磷酸三酯和 / 或硫代磷酸酯保护基团 ) 的核酸构建物。该构建物可以进一步包括用于细胞转导和细胞调节的组合物。这种组合物 可以包括包含膜转运功能的转导部分结构域并且可以进一步包含足以可逆地中和核酸上 的阴离子电荷的核酸结合结构域。 如本文所证明的， 向核酸添加一个或多个可去除的 ( 例如， 可逆地结合的 ) 电荷中 和部分可以有效地促进细胞转导。 任何核酸， 无论哪种序列组成， 均可以通过本公开书的电 荷中和部分被修饰。
本公开书提供了寡核苷酸或多核苷酸， 在一些实施方案中， 其具有一个或多个生 物可逆的电荷中和部分， 这些电荷中和部分促成了提高细胞膜的穿透和抵抗外切和内切核 酸酶降解的化学和生物物理性质。 本公开书进一步提供用于合成生物可逆保护的寡核苷酸 或多核苷酸的酰胺试剂。而且， 这些保护基团在合成的过程中是稳定的。
具有一个或多个生物可逆的电荷中和部分的本公开书的所述寡核苷酸或多核苷 酸有时称为前寡核苷酸或前多核苷酸。在本公开书的实施方案中， 前寡核苷酸能够增加细 胞脂质双分子层穿透能力以及对体内和体外外切和内切核酸酶降解的抗性。在细胞中， 电 荷中和部分可以通过硫酯酶的作用通过还原条件、 酶活性 ( 例如， 内源羧酸酯酶 ) 等除去， 以产生生物活性的寡核苷酸化合物， 所述化合物能够杂交到具体的内源核酸和 / 或对其具 有亲合力。
所述电荷中和部分可以与合成的 DNA 或 RNA 的反义寡核苷酸或与靶序列的互补序 列的混合分子一起使用， 所述靶序列属于基因或 RNA 信使， 其表达被特定设计为阻断或下 调。反义寡核苷酸可以针对靶信使 RNA 序列或者， 可选地针对靶 DNA 序列， 并杂交到它们互 补的核酸。因此， 这些分子有效地阻断或下调基因表达。
电荷中和的寡核苷酸或多核苷酸也可以针对一些双链 DNA 区 ( 同型嘌呤 / 同型嘧 啶序列或富含嘌呤 / 嘧啶的序列 )， 并因此形成三螺旋。 特定序列的三螺旋的形成可以阻断 调节或否则控制基因表达的蛋白因子的相互作用， 和 / 或可以促进被引入到具体的核酸位 点的不可逆损害， 条件是得到的寡核苷酸具有反应性官能团。
本文提供了核酸构建物， 和产生这种构建物的方法， 它们可以用于促进寡核苷酸
或多核苷酸递送至细胞中。在一个实施方案中， 核酸构建物包括一个或多个电荷中和部分 以中和与核酸诸如 RNA 和 / 或 DNA 缔合的磷酸二酯阴离子电荷。一旦进入细胞， 电荷中和 部分可以从构建物中通过细胞内过程除去， 所述细胞内过程包括二硫键还原、 酯水解或其 它酶介导的过程 ( 例如， 硫酯酶活性 )。在其它实施方案中， 包含一个或多个电荷中和部分 的核酸构建物进一步包含一个或多个转导结构域诸如蛋白转导结构域 (PTD)。例如， PTD 可 以通过游离的硫醇基直接缀合到包含该核酸构建物的寡核苷酸 ( 例如， RNA 或 DNA)， 诸如 5’ 和 / 或 3’ 端。例如， 通过生物学上敏感和可逆的方式， 诸如二硫键， PTD 可以连接到该构 建物。该方法可以应用到任何寡核苷酸或多核苷酸长度和允许将 RNA( 例如， siRNA、 RNA 适 体 ) 或 DNA 递送至细胞中。
在另一个实施方案中， 核酸构建物可以包括碱性基团， 诸如胍盐基团 ( 类似于头 基精氨酸， PTD 的活性组分 )， 其连接到可逆的保护基团和由此限制对 PTD 的需要。
因此， 本文提供了核苷酸 ( 例如， RNA 或 DNA)， 其被合成以包括用于递送核酸序列 通过细胞膜的电荷中和部分。构建物也可以包括， 例如， 一个或多个转导结构域和 / 或含有 碱性基团的保护基团。一旦进入细胞， 所述核酸构建物的寡核苷酸 / 多核苷酸通过水解或 其它酶活性 ( 例如， 硫酯酶活性 )， 基于还原环境回复到未保护 / 野生型的寡核苷酸 / 多核 苷酸。
分离的电荷保护的寡核苷酸或多核苷酸构建物是指包含具有电荷中和部分的核 苷酸的寡核苷酸或多核苷酸。
所述电荷中和的寡核苷酸可以使用具有下列通式的亚磷酰胺结构来合成 ：
包含 U、 T、 C 或 A 核苷酸的上述结构可以用于 RNA 合成仪中寡核苷酸的合成。
当在本文中使用时， 阴离子电荷中和部分或基团是指可以减少与其缔合的寡核苷 酸或多核苷酸的总净阴离子电荷的分子或化学基团。如本文所述的氨基 -S- 酰基 - 硫代烷 基部分是阴离子电荷 - 中和部分。 这些电荷中和部分是可逆的。 一个或多个阴离子电荷 - 中 和部分或基团可以与寡核苷酸或多核苷酸缔合， 其中每个独立地导致所述寡核苷酸或多核 苷酸的阴离子电荷的减少和或阳离子电荷的增加。例如， 一个或多个电荷中和部分可以与 寡核苷酸缔合， 且 “受保护的寡核苷酸” 可以与一个或多个阳离子转导结构域 ( 例加， PTD) 缔合， 使得相对于没有所述电荷中和部分和 / 或 PTD 的所述寡核苷酸， 构建物的总净阴离子 电荷减少或构建物的总净电荷为中性或构建物的总净电荷是阳离子。
本公开书提供了电荷中和部分， 包含这样的电荷中和部分的核苷酸， 以及包含这 样的电荷中和部分的寡核苷酸或多核苷酸。在一个实施方案中， 所述电荷中和部分具有通 式：
( 在本文中通常称为 N-SATE)， 其中 R1 可以存在或可以不存在， 当 R1 存在时， R1 选 自烷基、 取代的烷基、 烷氧基、 取代的烷氧基、 环烷基、 取代的环烷基、 烯基、 取代的烯基、 炔 基、 取代的炔基、 芳基、 取代的芳基、 杂环或取代的杂环 ；
其中 R2 可以存在或可以不存在， 当 R2 存在时， R2 选自 1-7 个原子的烷基、 取代的烷 基、 烷氧基、 取代的烷氧基、 环烷基、 取代的环烷基、 烯基、 取代的烯基、 炔基、 取代的炔基、 芳 基、 取代的芳基、 杂环或取代的杂环， 其中 X 是所述电荷中和部分与核酸主链连接的位置， 并且其中 R3 是 H、 H2 或保护基团。在一个实施方案中， 所述电荷中和部分 (N-SATE) 包含 ：
其中 R1 可以存在或可以不存在， 当 R1 存在时， R1 选自烷基、 取代的烷基、 烷氧基、 取 代的烷氧基、 环烷基、 取代的环烷基、 烯基、 取代的烯基、 炔基、 取代的炔基、 芳基、 取代的芳 基、 杂环或取代的杂环 ；
其中 R2 可以存在或可以不存在， 当 R2 存在时， R2 选自 1-7 个原子的烷基、 取代的烷 基、 烷氧基、 取代的烷氧基、 环烷基、 取代的环烷基、 烯基、 取代的烯基、 炔基、 取代的炔基、 芳 基、 取代的芳基、 杂环或取代的杂环， 其中 X 是核酸主链。在一个实施方案中， 所述电荷中和 部分选自 ：
还在另一个实施方案中， 包含保护基团的电荷中和部分 (N-SATE) 选自下列 ：
Alloc-2- 氨基 2， 2- 二甲基 乙醇 S- 酰基 硫代乙基 磷酸三酯 (Alloc N1-SATE)Alloc-3- 氨基 2， 2- 二甲基 丙醇 S酰基硫代乙基 磷酸三酯 (Alloc-N2-SATE)-Alloc-3- 氨基 -2， 2- 二甲基 丙醇 S酰基硫代丁基 磷酸三酯 (Alloc-N2-SATB)
Alloc-2- 氨基 2， 2- 二甲基 丁醇 S- 酰基 硫代乙基 磷酸三酯 (Alloc-N3-SATE)苯基乙酰基 -3氨基 -2， 2- 二甲基 丙醇 S- 酰基 硫代乙基 磷酸三酯 (PhAc-N2-SATE)苯基乙酰基 -4氨基 -2， 2- 二甲基 丁醇 S- 酰基 硫代乙基 磷酸三酯 (PhAc-N3-SATE)
乙酰基 - 丙氨酸 -2氨基 -2， 2- 二甲基 S- 酰基硫代乙基 磷酸三酯 (Ac-Ala-N1-SATE)乙酰基 - 丙氨酸 -3二甲基 - 丙醇 S- 酰基硫代乙基 磷酸三酯 (Ac-Ala-N2-SATE)Fmoc-2- 氨基 -2甲基 - 乙醇 S- 酰基硫代乙基 磷酸三酯 (Fmoc-N0-SATE)
Fmoc-2- 氨基 -2， 2二甲基 - 乙醇 S- 酰基硫代乙基 磷酸三酯 (Fmoc-N1-SATE)Fmoc-3- 氨基 -2， 2二甲基 - 丙醇 S- 酰基硫代乙基 磷酸三酯 (Fmoc-N2-SATE)下面对各种化学基团进行简要的描述。如对本领域技术人员显而易见的那样， 基 于位阻选择基团。此外， 最终的结构应当具有总体阳离子电荷或是中性的。而且， 选择此类 基团以符合前述标准也将对本领域技术人员是显而易见的。
烷基基团包括直链的、 支链的和环状烷基基团。烷基基团包括那些具有 1 到 20 个 碳原子的基团。烷基基团包括具有 1 到 3 个碳原子的小的烷基基团。烷基基团包括具有 4-10 个碳原子的中等长度的烷基基团。 烷基基团包括具有多于 10 个碳原子的长烷基基团， 尤其是具有 10-20 个碳原子的那些。环状烷基基团包括具有一个或多个环的那些。环状烷 基基团包括具有 3、 4、 5、 6、 7、 8、 9 或 10 元碳环的那些和特别是具有 3、 4、 5、 6、 或 7 元环的基 团的那些。环状烷基基团中的碳环也可以携带烷基基团。环状烷基基团可以包括二环和三 环烷基基团。烷基基团任选地包括取代的烷基基团。取代的烷基基团尤其地包括被芳基基 团取代的那些基团， 所述芳基也可以被任选地取代。具体的烷基基团包括甲基、 乙基、 正丙 基、 异丙基、 环丙基、 正丁基、 s- 丁基、 叔丁基、 环丁基、 正戊基、 支链的戊基、 环戊基、 正己基、 支链的己基和环己基， 所有这些被任选地取代。
烯基基团包括直链的、 支链的和环状烯基基团。烯基基团包括具有 1、 2 或更多个 双键的那些和其中两个更多个双键是缀合的双键的那些。烯基基团包括具有 2 到 20 个碳 原子的烯基基团的那些。烯基基团包括具有 2 到 3 个碳原子的小烷基基团。烯基基团包括 具有 4-10 个碳原子的中等长度的烯基基团。烯基基团包括具有多于 10 个碳原子的长烯基 基团， 特别是那些具有 10-20 个碳原子的那些。环状烯基基团包括具有一个或多个环的那 些。环状烯基基团包括其中双键在环中或在与环连接的烯基基团中的那些。环状烯基基团 包括具有 3、 4、 5、 6、 7、 8、 9 或 10 元碳环的那些和特别是具有 3、 4、 5、 6 或 7 元环的那些基团。 在环状烯基基团中的碳环也可以携带烷基基团。 环状烯基基团可以包括二环和三环烷基基 团。 烯基基团任选地被取代。 取代的烯基基团尤其包括被烷基或芳基基团取代的那些， 所述 烷基或芳基基团也可以任选地被取代。具体的烯基基团包括乙烯基、 丙 -1- 烯基、 丙 -2- 烯 基、 环丙 -1- 烯基、 丁 -1- 烯基、 丁 -2- 烯基、 环丁 -1- 烯基 -、 环丁 -2- 烯基、 戊 -1- 烯基、 戊 -2- 烯基、 支链的戊烯基、 环戊 -1- 烯基、 己 -1- 烯基、 支链的己烯基、 环己烯基 -， 所有这 些任选地被取代。
芳基基团包括基团具有一个或多个 5 或 6 元芳族的或杂芳族环。芳基基团可以含 有一个或多个稠合的芳族环。杂芳族环可以在环中包括一个或多个 N、 O、 或 S 原子。杂芳族 环可以包括具有一个、 两个或三个 N 的那些环， 具有一个或两个 O 的那些环， 和具有一个或 两个 S 的那些环。芳基基团任选地被取代。取代的芳基基团尤其包括被烷基或烯基基团取 代的那些基团， 所述烷基或烯基也可以任选地被取代。具体的芳基基团包括苯基、 联苯基、 吡啶基和萘基基团， 所有这些任选地被取代。
芳基烷基基团是被一个或多个芳基基团取代的烷基基团， 其中烷基基团任选地携 带另外的取代基， 并且芳基基团任选地被取代。具体的烷基芳基基团是苯基取代的烷基基 团， 例加， 苯基甲基基团。
烷基芳基基团是被一个或多个烷基基团取代的芳基基团， 其中烷基基团任选地携 带另外的取代基并且芳基基团任选地被取代。 具体的烷基芳基基团是烷基取代的苯基基团 诸如甲基苯基。
环可以是任选取代的环烷基基团、 任选取代的环烯基基团或芳族基团。环可以含有 3、 4、 5、 6、 7 或更多个碳。环可以是杂芳族的， 其中芳族环的一个、 两个或三个碳被 N、 O或 S 取代。环可以是杂烷基或杂烯基， 其中环中的一个或多个 CH2 基团被 O、 N、 NH 或 S 取代。
任何烷基、 烯基和芳基基团的任选取代包括被以下取代基中的一个或多个取代 ： 卤素、 --CN、 --COOR、 --OR、 --COR、 --OCOOR、 --CON(R)2、 --OCON(R)2、 --N(R)2、 --NO2、 --SR、 --S O2R、 --SO2N(R)2 或 --SOR 基团。 烷基基团的任选取代包括被一个或多个烯基基团、 芳基基团 或两者的取代， 其中烯基基团或芳基基团任选地被取代。烯基基团的任选取代包括被一个 或多个烷基基团、 芳基基团、 或两者取代， 其中烷基基团或芳基基团任选地被取代。芳基基 团的任选取代包括用一个或多个烷基基团、 烯基基团或两者取代芳环， 其中烷基基团或烯 基基团任选地被取代。
烷基、 烯基和芳基基团的任选取代基尤其包括以下 ：
--COOR， 其中 R 是氢或烷基基团或芳基基团， 和更具体地， 其中 R 是甲基、 乙基、 丙 基、 丁基、 或苯基基团， 所有这些任选地被取代 ；
--COR， 其中 R 是氢、 或烷基基团或芳基基团和更具体地， 其中 R 是甲基、 乙基、 丙 基、 丁基或苯基基团， 所有这些基团任选地被取代 ；
--CON(R)2， 其中每个 R， 与其它 R 彼此独立地是氢或烷基基团或芳基基团和更具体 地， 其中 R 是甲基、 乙基、 丙基、 丁基或苯基基团， 所有这些基团任选地被取代 ； R 和 R 可以形 成环， 其可以含有一个或多个双键 ；
--OCON(R)2， 其中每个 R， 与其它 R 彼此独立地是氢或烷基基团或芳基基团和更具 体地， 其中 R 是甲基、 乙基、 丙基、 丁基或苯基基团， 所有这些基团任选地被取代 ； R 和 R 可以 形成环， 其可以含有一个或多个双键 ；
--N(R)2， 其中每个 R， 与其它 R 彼此独立地是氢、 或烷基基团、 酰基基团或芳基基团 和更具体地， 其中 R 是甲基、 乙基、 丙基、 丁基或苯基或乙酰基， 所有这些任选地被取代 ； 或R 和 R 可以形成环， 该环可以含有一个或多个双键。
--SR、 --SO2R 或 --SOR 其中 R 是烷基基团或芳基基团和更具体地， 其中 R 是甲基、 乙基、 丙基、 丁基、 苯基基团， 所有这些任选地被取代 ； 对于 SR， R 可以是氢 ；
--OCOOR， 其中 R 是烷基基团或芳基基团 ；
--SO2N(R)2， 其中 R 是氢、 烷基基团或芳基基团， 且 R 和 R 可以形成环 ；
--OR， 其中 R ＝ H、 烷基、 芳基或酰基 ； 例如， R 可以是产生酰基的 --OCOR*， 其中 R* 是氢或烷基基团或芳基基团和更具体地， 其中 R* 是甲基、 乙基、 丙基、 丁基或苯基基团， 所 有这些基团任选地被取代。
具体的取代的烷基基团包括卤烷基基团， 尤其是三卤甲基基团和特别是三氟甲基 基团。 具体的取代的芳基基团包括一、 二、 三、 四、 和五卤素 - 取代的苯基 ； 一、 二、 三、 四、 五、 六、 和七卤素 - 取代的萘基 ； 3- 或 4- 卤素 - 取代的苯基， 3- 或 4- 烷基 - 取代的苯基， 3- 或 4- 烷氧基 - 取代的苯基， 3- 或 4-RCO- 取代的苯基， 5- 或 6- 卤素 - 取代的萘基。更具体地， 取代的芳基包括乙酰基苯基， 特别是 4- 乙酰基苯基 ； 氟苯基， 特别是 3- 氟苯基和 4- 氟苯 基； 氯苯基， 特别是 3- 氯苯基和 4- 氯苯基 ； 甲基苯基， 特别是 4- 甲基苯基， 和甲氧基苯基， 特别是 4- 甲氧基苯基。
当寡核苷酸或多核苷酸连接到 PTD 时， 带阴离子电荷的寡核苷酸或多核苷酸的电 荷中和释放带正电荷的 PTD， 以与细胞表面有效地相互作用， 并且也阻止了缀合物的聚集。例如， 暴露的带阳离子电荷的 PTD 与细胞表面相互作用和诱导大型胞饮作用。所述寡核苷 酸被释放进入细胞质。一旦进入细胞， 电荷中和基团 ( 例如， 氨基 -S- 酰基硫代烷基 ) 可以 被细胞过程裂解除去， 所述细胞过程诸如还原酶、 氧化酶、 还原剂、 氧化剂或酯酶， 脱保护所 述寡核苷酸或多核苷酸， 使核酸到回复到其自然构型。
如本文所用， 核酸结构域 ( 与寡核苷酸或多核苷酸结构域互换使用 ) 可以是任何 寡核苷酸或多核苷酸 ( 例如， 核酶， 反义分子， siRNA、 dsRNA、 多核苷酸、 寡核苷酸等 )。寡 核苷酸或多核苷酸通常含有磷酸二酯键， 但是在一些情况， 包括核酸类似物， 所述核酸类似 物可以具有替代主链， 包括， 例如， 氨基磷酸酯、 硫代磷酸酯、 二硫代磷酸酯、 或 O- 甲基亚磷 酰胺键 ( 见 Eckstein， Oligonucletides and Analogues ： A Practical Approach， Oxford University Press) ； 和肽核酸主链和键。其它类似物核酸包括具有正电荷主链 ； 非离子主 链， 和非核糖主链的那些， 包括在美国专利 s.5,235,033 和 5,034,506， 以及第 6 和 7 章， ASC Symposium Series 580， Carbohydrate Modifications in Antisense Research， Sanghui&Cook， eds 中描述的那些。 含有一个或多个碳环状糖的核酸也包括在核酸的一个定 义中。可以为了多种原因修饰核糖 - 磷酸主链， 例如为了增加这种分子在生理环境中的稳 定性和半衰期。天然存在的核酸和类似物的混合物也包括在术语寡核苷酸和多核苷酸中 ； 可选地， 可以制备不同核酸类似物的混合物， 以及天然存在的核酸和类似物的混合物。而 且， 可以使用 RNN、 RNB、 DNA 和 RNA 的杂合体。dsDNA、 ssDNA、 dsRNA、 siRNA 包涵在术语寡核 苷酸和多核苷酸中。 多核苷酸指由任意数目的共价结合核苷酸单体构成的聚合化合物， 包括核酸分子 诸如 DNA 和 RNA 分子， 包括单、 双和三链的这种分子， 并且特别意在包含通常称为 “寡核苷 酸” 的多核苷酸的基团， 寡核苷酸通常被区分为具有相对小数目的 ( 不多于大约 30， 例如， 大约 5-10、 10-20 或 20-30) 核苷酸碱基。
当在本文中使用， 术语 “siRNA” 是 “短干扰 RNA” 的缩写， 有时也称为 “小干扰 RNA” 或 “沉默 RNA” ， 并且指一类大约 19-25 个核苷酸长的双链核糖核酸分子， 在真核生物中， 其 参与 RNA 干涉 (RNAi) 途径， 导致转录后的、 序列特异的基因沉默。
术语 “dsRNA” 是 “双链 RNA″的缩写， 和当在本文中使用时是指具有两个互补 RNA 链的核糖核酸分子， 并且其与 siRNA 的不同之处在于， 其为至少大约 26 个核苷酸长度， 和更 典型地是至少大约 50 到大约 100 个核苷酸长度。
如上所述， 核酸可以是 DNA( 基因组 DNA 和 cDNA)、 RNA 或杂合体， 其中核酸可以含 有脱氧核糖和核糖核苷酸的组合， 和碱基的组合， 所述碱基包括尿嘧啶、 腺嘌呤、 胸腺嘧啶、 胞嘧啶、 鸟嘌呤、 肌苷、 黄嘌呤、 次黄嘌呤、 异胞嘧啶、 异鸟嘌呤， 等。 当在本文中使用时， 术语 “核苷” 包括核苷酸和核苷以及核苷酸类似物， 和修饰的核苷诸如氨基修饰的核苷。另外， “核苷” 包括非天然存在的类似结构。因此， 例如肽核酸的每个单元 ( 每个含有碱 ) 在本文 中称为核苷。
本文所述的核酸构建物的核酸结构域不限制为任何特定序列。可用于诊断剂、 治 疗剂和研究的任意数目的寡核苷酸或多核苷酸可以被用于本公开书的方法和组合物。 寡核 苷酸和多核苷酸的不同来源对本领域技术人员是可得的。例如， 基因组片段可以是分离的 和根据本公开书修饰的分离的多核苷酸可以使用氨基 S- 酰基硫代烷基电荷中和部分减少 总净阴离子电荷或可以使用例如， 本领域已知的核酸合成技术作为所述寡核苷酸或多核苷
酸延伸的来源。
从 M.Caruthers 和 S.Beaucage 以及他人的出版著作中了解了实施亚磷酰胺化学 以 制 备 寡 核 苷 酸。 美 国 专 利 ： 4,458,066、 4,500,707、 5,132,418、 4,415,732、 4,668,777、 4,973,679 、 5,278,302 、 5,153,319 、 5,218,103 、 5,268,464 、 5,000,307 、 5,319,079 、 4,659,774、 4,672,110、 4,517,338、 4,725,677 和 Re.34,069， 每个通过引用并入， 描述了寡 核苷酸合成的方法。另外， 实施亚磷酰胺化学已被以下文献系统地综述 ： Beaucage 和 Iyer 于 Beaucage， S.L. 和 Iyer， R.P.， Tetrahedron， 1992， 48， 2223-2311 以及 Beaucage， S.L. 和 Iyer， R.P.， Tetrahedron， 1993， 49， 6123-6194， 或者其中引用的参考文献， 所有这些通过引 用并入本文。
核酸合成仪可商业获得， 且它们的使用通常被本领域普通技术人员理解为有效地 产生几乎任何可能期望的合理长度的寡核苷酸。
在实施亚磷酰胺化学中， 有用的 5’ OH 糖保护基团是三苯甲基、 单甲氧基三苯甲 基、 二甲氧基三苯甲基和三甲氧基三苯甲基， 尤其是二甲氧基三苯甲基 (DMTr)。 在实施亚磷 酰胺化学中有用的亚磷酸激活基团， 即， NR2， 是二烷基取代的氮基团和氮杂环。一个方法包 括使用二异丙基氨基激活基团。 寡核苷酸可以通过 Mermade-6 固相自动化寡核苷酸合成仪或任何通常可获得 的 自 动 化 寡 核 苷 酸 合 成 仪 合 成。 例 如 在 M.Caruthers， Oligonucleotides ： Antisense Inhibitors of Gene Expression.， pp.7-24， J.S.Cohen， ed.(CRC Press， Inc.Boca Raton， Fla.， 1989) 或 Oligonucleotide synthesis， a practical approach， Ed.M.J.Gait， IRL Press， 1984 ； ″ Oligonucleotides and Analogues， A Practical Approach ″， Ed.F.Eckstein， IRL Press， 1991 中描述的三酯、 亚磷酰胺或膦酸氢偶联化学， 被这些合 成仪用于提供期望的寡核苷酸。Beaucage 试剂， 如在 Journal of American Chemical Society， 1990， 112， 1253-1255 中 所 述， 或 元 素 硫， 如 在 Beaucage 等 人， Tetrahedron Letters， 1981， 22， 1859-1862 中所述， 与亚磷酰胺或膦酸氢化学一起使用以提供取代的硫 代磷酸酯寡核苷酸。例如， 包括本文所述的保护基团的试剂可以用于许多期望进行保护的 应用中。这种应用包括， 但不限于， 固相和液相的、 寡核苷酸合成、 多核苷酸合成等。使用核 苷和核苷酸类似物也被本公开书考虑用于提供携带本文公开的保护基团的寡核苷酸或寡 核苷类似物。 因此术语核苷、 核苷酸、 脱氧核苷和脱氧核苷酸通常包括如本文所述的那些类 似物。这些类似物是具有与天然存在的核苷或核苷酸共同的一些结构特征的那些分子， 使 得当掺入寡核苷酸或寡核苷序列时， 它们允许与溶液中的天然存在的寡核苷酸序列杂交。 典型的， 这些类似物通过置换和 / 或修饰碱基、 核糖或磷酸二酯部分衍生于天然存在的核 苷和核苷酸。 改变可以被定制以稳定或去稳定杂合体形成或提高与所期望的互补核酸序列 的杂交特异性。
例如， 结构基团被任选地加到核糖或核苷的碱基上以掺入到寡核苷酸中， 诸如在 核糖 2’ -O 位置的甲基、 丙基或烯丙基基团， 或取代 2’ -O 基团的氟基团， 或在核糖核苷碱 基的溴基团。为了和亚磷酰胺化学一起使用， 多种酰胺 (amidite) 试剂可商购获得， 包括 2’ - 脱氧酰胺， 2′ -O- 甲基酰胺和 2′ -O- 羟基酰胺。用于这种合成的任何其它方法也可 以使用。所述寡核苷酸的实际合成在本领域技术人员的技能范围内。使用类似技术制备其 它寡核苷酸诸如硫代磷酸酯、 甲基膦酸酯和烷基化衍生物也是公知的。使用类似的技术和
可商业获得的修饰的酰胺和可控孔径玻璃 (CPG) 产品， 诸如生物素、 Cy3、 荧光素、 吖啶或补 骨脂素修饰的酰胺和 / 或 CPG( 可购自 Glen Research， Sterling Va.) 以合成荧光标记的、 生物素化的或其它缀合的寡核苷酸也是公知的。
但是本文所述的磷酸三酯中和 / 保护基团可用于中和核酸结构域的阴离子电荷， 连接到受保护的核酸结构域的其他带正电荷的部分可以被用于进一步帮助摄取寡核苷酸 和多核苷酸。 最近对可以有效地穿过真核细胞质膜的几种蛋白的发现已经导致识别新一类 蛋白， 由该蛋白已经得到了肽转导结构域。
例如， 使用氨基 S- 酰基硫代烷基部分 (SATE) 对氨基阴离子核酸 ( 例如， RNA 分子 ) 的电荷中和促进了摄取。在其中电荷中和的阴离子核酸与 PTD 连接的实施方案中， 带阴离 子电荷的核酸的电荷中和释放阳离子 PTD 穿过膜并且防止由于净阳离子电荷引起的缀合 物聚集。 PTD 的暴露的自由阳离子电荷然后可以有效地与细胞表面相互作用， 诱导大型胞饮 作用， 并且从大胞饮泡 (macropinosome) 脱出至细胞质中。一旦在细胞内， 磷酸三酯和 / 或 硫代磷酸酯保护基团可以通过细胞内过程 ( 诸如二硫键的还原或酯水解 ) 被去除， 从而可 以在细胞质中从所述构建物被去除。在一个实施方案中， 电荷中和基团的去除通过硫酯酶 的活性实现。包括例如 dsRNA 的核酸构建物然后可以被 Dicer( 一种 RNAse III 样核糖核 酸酶 ) 水解， 从而释放沉默靶基因的 siRNA。
一些蛋白转导结构域 / 肽为本领域已知， 并且已经证明促进连接到转导结构域的 外源分子 ( 例如， 货物分子 (cargo molecule)) 的摄取。这种转导结构域促进通过称为大 型胞饮作用的过程摄取。大型胞饮作用是所有细胞进行的非选择形式的胞吞作用。
这 些 蛋 白 被 最 佳 表 征 的 是 果 蝇 同 源 异 型 蛋 白 触 足 转 录 蛋 白 (Drosophila homeoprotein antennapedia transcription protein)(AntHD)(Joliot 等人， New Biol.3 ： 1121-34， 1991 ； Joliot 等 人， Proc.Natl.Acad.Sci.USA， 88 ： 1864-8， 1991 ； Le Roux 等 人， Proc.Natl.Acad.Sci.USA， 90 ： 9120-4， 1993)、 单纯性疱疹病毒结构蛋白 VP22(Elliott 和 O’ Hare， Cell 88 ： 223-33， 1997)， HIV-1 转 录 激 活 剂 TAT 蛋 白 (Green 和 Loewenstein， Cell 55 ： 1179-1188， 1988 ； Frankel 和 Pabo， Cell 55 ： 1189-1193， 1988)， 和更最近的朊病 毒蛋白的阳离子 N 端结构域。这些蛋白不但可以穿过胞质膜， 而且其它蛋白的结合， 诸如 酶 β- 半乳糖苷酶， 足以刺激细胞摄取这些复合物。这种嵌合蛋白以生物活性形式存在于 细胞质和核中。该过程的特征显示摄取这些融合多肽是快速的， 以受体独立的方式， 常发 生在几分钟内。而且， 这些蛋白的转导看上去不受细胞类型的影响， 并且可以有效地转导 培养物中的 100 ％细胞， 而没有明显的毒性 (Nagahara 等人， Nat.Med.4 ： 1449-52， 1998)。 除了全长蛋白， 蛋白转导结构域也已经成功地用于诱导细胞内摄取 DNA(Abu-Amer， 见上 )、 反 义 寡 核 苷 酸 (Astriab-Fisher 等 人， Pharm.Res， 19 ： 744-54， 2002)、 小 分 子 (Polyakov 等人， Bioconjug.Chem.11 ： 762-71， 2000) 和甚至是无机的 40 纳米的铁粒子 (Dodd 等人， J.Immunol.Methods 256 ： 89-105， 2001 ； Wunderbaldinger 等 人， Bioconjug.Chem.13 ： 264-8， 2002 ； Lewin 等人， Nat.Biotechnol.18 ： 410-4， 2000 ； Josephson 等人， Biocobjug.， Chem.10 ： 186-91， 1999)， 表明对该过程没有明显的大小限制。 使用转导结构域的有效转导， 部分受到在 PTD- 货物构建物上的总分子电荷的限制。
蛋白转导结构域 (PTD) 与外源分子 ( 例如， 多核苷酸、 小分子或蛋白 ) 的融合足以 导致它们以浓度依赖的方式转导进入多种不同的细胞。而且， 用于蛋白递送的该技术似乎避免了与 DNA 和基于药物的技术有关的许多问题。
PTD 本性是典型的阳离子。这些阳离子蛋白转导结构域进入携带有其所连接的货 物的脂筏内体， 并且通过破坏内体小泡释放它们的货物进入到细胞质。 通常， 本公开书的核 酸构建物的转导结构域可以是几乎任何合成的或天然存在的氨基酸序列， 该氨基酸序列可 以转导或帮助转导融合分子。典型地， 转导结构域是带正电荷的。例如， 转导可以根据本公 开书通过使用核酸构建物实现， 所述核酸构建物包括磷酸三酯和 / 或硫代磷酸酯保护基团 和蛋白序列诸如 HIV TAT 蛋白或其片段， 所述蛋白序列或其片段在 N 端或 C 端连接到包括磷 酸三酯和 / 或硫代磷酸酯保护基团的寡核苷酸或多核苷酸。在一些实施方案中， 核酸可以 包含磷酸三酯和 / 或硫代磷酸酯保护基团并且也可以包含双链结合结构域 ( 例如， DRBD)。 转导蛋白结构域， 例如， 可以是触足同源异型结构域或 HSV VP22 序列， 朊病毒蛋白的 N 端片 段或其合适的转导片段， 诸如本领域已知的那些片段。
可以连接至电荷中和的核酸分子的 PTD 的类型和大小将通过包括期望转导程度 的几个参数来指导。PTD 能够转导至少大约 20％、 25％、 50％、 75％、 80％、 90％、 95％、 98％、 99％或 100％的细胞。转导效率， 典型地表达为转导细胞的百分比， 可以通过几种常规的方 法确定。
PTD 会显示细胞进出率 ( 有时分别称为 K1 和 K2)， 其支持细胞内至少皮摩尔量的融 合分子。通过标准动力学分析使用可检测标记的融合分子， PTD 和任何货物的进出率可以 容易地确定， 或至少被近似地确定。典型地， 进入率与排出率的比率在大约 5 到大约 100 直 至大约 1000 的范围。
在一个实施方案中， 可用于本公开书的方法和组合物的 PTD 包含特征为大量 α 螺 旋的肽。已经发现， 当 PTD 显示显著的 α 螺旋时转导被优化。在另一个实施方案中， PTD 包 括含有碱性氨基酸残基的序列， 所述碱性氨基酸残基基本沿着所述肽的至少一个面排列。 本公开书的 PTD 结构域可以是天然存在的肽或合成的肽。
在本公开书的一个实施方案中， PTD 包括包含强 α 螺旋结构的氨基酸序列， 精氨 酸 (Arg) 残基在螺旋柱的下方。还在另一个实施方案中， PTD 结构域包括以下通式表示的 肽： B1-X1-X2-X3-B2-X4-X5-B3(SEQ ID NO ： 1) 其中 B1、 B2 和 B3 各自独立地是碱性氨基酸， 相同 或不同 ； 并且 X1、 X2、 X 3、 X4 和 X5 各自独立地是 α 螺旋增强氨基酸， 相同或不同。在另一个 实施方案中， PTD 结构域由以下通式表示 ： B1-X1-X2-B2-B3-X3-X4-B4(SEQ ID NO ： 2) 其中 B1、 B2、 B3 和 B4 各自独立地是碱性氨基酸， 相同或不同 ； 并且 X1、 X 2、 X3 和 X4 各自独立地是 α 螺 旋增强氨基酸， 相同或不同。
另外 PTD 结构域包含碱性残基， 例加， 赖氨酸 (Lys) 或精氨酸 (Arg)， 并进一步包括 至少一个脯氨酸 (Pro) 残基从而足以将 “扭结” 引入到结构域。这种结构域的实例包括朊 病毒的转导结构域。例如， 这种肽包括 KKRPKPG(SEQ ID NO ： 3)。
在一个实施方案中， 结构域是以下序列表示的肽 ： X-X-R-X-(P/X)-(B/X)-B-(P/ X)-X-B-(B/X)(SEQ ID NO ： 4)， 其中 X 是任何 α 螺旋促进残基， 诸如丙氨酸 ； P/X 是脯氨酸 或如前面所定义的 X ； B 是碱性氨基酸残基， 例如， 精氨酸 (Arg) 或赖氨酸 (Lys) ； R 是精氨酸 (Arg) 和 B/X 是上面所定义的 B 或 X。
在另一个实施方式中， PTD 是阳离子的且由 7 和 10 个之间的氨基酸构成， 具有 式 K-X1-R-X2-X1(SEQ ID NO ： 5) 其中 X1 是 R 或 K 且 X2 是任何氨基酸。这种肽的实例包括RKKRRQRRR(SEQ ID NO ： 6)。
另外的转导结构域包括 TAT 片段， 其包括 TAT 的至少氨基酸 49 到 56 直至大约全 长的 TAT 序列 ( 见， 例如， SEQ ID NO ： 7)。TAT 片段可以包括一个或多个氨基酸改变， 所述 改变足以增加片段的 α 螺旋。在一些情况， 引入的氨基酸改变将包括加入识别的 α 螺旋 增强氨基酸。可选地， 氨基酸改变将包括从 TAT 片段除去阻碍 α 螺旋形成或稳定性的一个 或多个氨基酸。在更具体的实施方案中， TAT 片段将包括被 α 螺旋增强氨基酸的至少一个 氨基酸置换。典型的 TAT 片段或其它 PTD 将通过标准的肽合成技术制备， 尽管在一些情况 下可以使用重组 DNA 方法。
可以用于本公开书的核酸构建物的另外的转导蛋白 (PTD) 包括 TAT 片段， 其中 TAT49-56 序列已被修饰， 使得序列中的至少两个碱性氨基酸沿着 TAT 片段的至少一个面基 本对齐。示例性的 TAT 片段包括在 TAT 的至少氨基酸 49-56 中的一个特定氨基酸置换， 该 置换与 49-56 序列的碱性氨基酸残基沿着该片段和典型的 TAT 49-56 序列的至少一个面对 齐。
另外的转导蛋白包括 TAT 片段， 其中 TAT 49-56 序列包括被 α 螺旋增强氨基酸的 至少一个置换。在一个实施方案中， 选择所述置换使得在 TAT 片段中的至少两个碱性氨基 酸残基沿着 TAT 片段的至少一个面基本对齐。在更具体的实施方案中， 选择所述置换使得 在 TAT 49-56 序列中的至少两个碱性氨基酸残基沿着该序列的至少一个面基本对齐。
PTD 的其他实例包括 AntHD、 TAT、 VP22、 阳离子朊病毒蛋白结构域、 poly-Arg、 AGRKKRRQRRR(SEQ ID NO ： 14)、 YARKARRQARR(SEQ ID NO ： 15)、 YARAAARQARA(SEQ ID NO ： 16)、 YARAARRAARR(SEQ ID NO ： 17)、 YARAARRAARA(SEQ ID NO ： 18)、 YARRRRRRRRR(SEQ ID NO ： 19)、 YAAARRRRRRR(SEQ ID NO ： 20) 及其功能片段和变体。本公开书在一个实施方案中提供 了将电荷中和的核酸与 PTD 诸如 TAT 和 poly-Arg 的使用结合的方法和组合物。电荷中和 是指核酸 ( 例如， 寡核苷酸或多核苷酸 ) 的总阴离子电荷在构建物中被减少、 中和或比不存 在磷酸三酯和 / 或硫代磷酸酯保护基团， 或磷酸三酯和 / 或硫代磷酸酯保护基团和能够中 和核酸 ( 即， “货物” ) 结构域上的阴离子电荷的结合结构域和 / 或蛋白转导结构域的相同 核酸具有更多的阳离子。
还包括嵌合的 PTD 结构域。这种嵌合的转导蛋白包括至少两个不同的转导蛋白的 部分。 例如， 嵌合的转导蛋白可以通过融合两个不同的 TAT 片段形成， 例加， 一个来自 HIV-1 和另一个来自 HIV-2 或一个来自朊病毒蛋白， 另一个来自 HIV。
PTD 可以与任意数目的包含寡核苷酸或多核苷酸的其它分子连接或融合。可选 地， 核酸构建物或 PTD 可以结合到包含核酸结合结构域、 靶向作用部分等的其它分子实体。 例如， 两个以上的 PTD( 例如， 1-5， 2-4， 典型的 3 个 ) 可以被连续连接或被一个或多个其它 结构域 ( 例如， 核酸结构域或肽接头 ) 分开。通过减少阴离子电荷使得 PTD 结构域的阳 离子电荷足以转导 / 跨越细胞膜， 核酸结合结构域可以促进摄取包含核酸 ( 包括包含保 护基团的寡核苷酸或多核苷酸 ) 的融合构建物。可以理解的是， PTD 可以融合到包含阴离 子电荷中和基团的寡核苷酸或多核苷酸， 并可以进一步连接到核酸结合结构域。示例性 的 RNA 结合蛋白 ( 例如， DRBD) 包括组蛋白、 RDE-4 蛋白或鱼精蛋白。另外的 dsRNA 结合 蛋白 ( 和它们括号内的登录号 ) 包括 ： PKR(AAA36409、 AAA61926、 Q03963)、 TRBP(P97473、 AAA36765) 、 PACT(AAC25672 、 AAA49947 、 NP609646) 、 Staufen(AAD17531 、 AAF98119 、AAD17529、 P25159)、 NFAR1(AF167569)、 NFAR2(AF167570、 AAF31446、 AAC71052、 AAA19960、 AAA19961、 AAG22859)、 SPNR(AAK20832、 AAF59924、 A57284)、 RHA(CAA71668、 AAC05725、 AAF57297)、 NREBP(AAK07692、 AAF23120、 AAF54409、 T33856)、 kanadaptin(AAK29177、 AAB88191、 AAF55582、 NP499172、 NP198700、 BAB19354)、 HYL1(NP563850)、 偏 下 性 叶 (hyponastic leaves)(CAC05659 、 BAB00641) 、 ADAR1(AAB97118 、 P55266 、 AAK16102 、 AAB51687、 AF051275)、 ADAR2P78563、 P51400、 A AK17102、 AAF63702)、 ADAR3(AAF78094、 AAB41862 、 AAF76894) 、 TENR(XP059592 、 CAA59168) 、 RNaseIII(AAF80558 、 AAF59169 、 Z81070Q02555/S55784、 PO5797)、 和 Dicer(BAA78691、 AF408401、 AAF56056、 S44849、 AAF03534、 Q9884)、 RDE-4(AY071926)、 FLJ20399(NP060273、 BAB26260)、 CG1434(AAF48360、 EAA12065、 CAA21662)、 CG13139(XP059208、 XP143416、 XP110450、 AAF52926、 EEA14824)、 DGCRK6(BAB83032 、XP110167)CG1800(AAF57175 、EAA08039) 、FLJ20036(AH22270 、 XP134159)、 MRP-L45(BAB14234、 XP129893)、 CG2109(AAF52025)、 CG12493(NP647927)、 CG10630(AAF50777)、 CG17686(AAD50502)、 T22A3.5(CAB03384) 和登录号 EAA14308。
可以用于本公开书的融合多肽和方法中的肽接头典型地包含达大约 20 或 30 个 氨基酸， 通常达到大约 10 或 15 个氨基酸， 和更常见的大约 1 到 5 个氨基酸。接头序列是 通常柔性的， 使得不将融合分子保持为单一刚性构象。接头序列可以被用来， 例如， 将 PTD 结构域与核酸结合结构域和 / 或核酸结构域隔开。例如， 肽接头序列可以被定位以提供分 子柔性。选择接头部分的长度以优化包含 PTD 结构域融合构建物的多肽的生物学活性并 可以经验性地确定而无需过多的实验。接头部分应该足够长和足够柔性， 以允许 PTD 与 核酸自由地相互作用， 或反之亦然。接头部分的实例是 --Gly--Gly--GGGGS(SEQ ID NO ： 8)、 (GGGGS)N(SEQ ID NO ： 8， 重复的 )、 GKSSGSGSESKS(SEQ ID NO ： 9)、 GSTSGSGKSSEGKG(SEQ ID NO ： 10)、 GSTSGSGKSSEGSGSTKG(SEQ ID NO ： 11)、 GSTSGSGKPGSGEGSTKG(SEQ ID NO ： 12) 或 EGKSSGSGSESKEF(SEQ ID NO ： 13)。连接部分例如在 Huston 等人， Proc.Nat’ l Acad. Sci 85 ： 5879， 1988 ； Whitlow 等人， Protein Engineering 6 ： 989， 1993 ； 和 Newton 等人， Biochemistry 35 ： 545， 1996 中被叙述。 其它合适的肽接头是描述在美国专利号 4,751,180 和 4,935,233 中的那些， 这些通过引用并入。
本公开书的方法、 组合物和融合多肽提供了细胞在体外和在体内对核酸分子的增 强摄取和释放。
术语 “治疗” 以通用意义使用， 包括治疗剂、 预防剂和替代剂。治疗性分子的实例 包括， 但不限于， 细胞周期调控剂 ； 抑制周期蛋白的药剂， 诸如周期蛋白 G1 和周期蛋白 D1 基因的反义多核苷酸 ； 可以被裂解以提供针对具体的生长因子的 siRNA 分子的 dsRNA， 所 述生长因子诸如， 例如， 表皮生长因子 (EGF)、 血管内皮生长因子 (VEGF)、 促红细胞生成素、 G-CSF、 GM-CSF、 TGF-α、 TGF-β 和成纤维细胞生长因子 ； 细胞因子， 包括， 但不限于， 白细胞 介素 1-13 和肿瘤坏死因子 ； 抗凝剂， 抗血小板剂 ； TNF 受体结构域等。
使用这种方法和组合物， 可以治疗不同疾病和病症。例如， 在递送抗肿瘤 siRNA 后， 肿瘤细胞的生长可以被抑制、 阻止或破坏。
因此， 可以理解的是本公开书不局限于任何特定的转导结构域或寡核苷酸 / 多核 苷酸。任何带阴离子电荷的核酸 ( 例如， dsRNA、 siRNA 等 ) 可以使用本公开书的方法和组 合物递送。在本公开书使用的多肽 ( 例如， 关于融合多肽或全长融合多肽的特定结构域 ) 可 以包含氨基酸的 L- 光学异构体或 D- 光学异构体或两者的组合。可以在本公开书使用的多 肽包括修饰的序列诸如糖蛋白、 逆 - 反 (retro-inverso) 多肽、 D- 氨基酸修饰的多肽， 等。 多肽包括天然存在的蛋白， 以及通过重组或合成方法合成的那些多肽。 “片段” 是多肽的一 部分。术语 “片段” 指多肽的部分， 其显示至少一个有用的表位或功能结构域。术语 “功能 片段” 指保留多肽活性的多肽片段。例如， PTD 的功能片段包括保留了转导活性的片段。
在一些实施方式中， 使用逆 - 反肽。 “逆 - 反” 指氨基 - 羧基倒位以及在一个或 多个氨基酸中的对映异构体变化 ( 即， 左旋 (L) 到右旋 (D))。本公开书的多肽包括， 例 如， 氨基酸序列的氨基 - 羧基倒位， 含有一个或多个 D- 氨基酸的氨基 - 羧基倒位， 和含有 一个或多个 D- 氨基酸的非倒位序列。稳定的和保留生物学活性的逆 - 反模拟肽可以根 据 Brugidou 等 人 (Biochem.Biophys.Res.Comm.214(2) ： 685-693， 1995) 和 Chorev 等 人 (Trends Biotechnol.13(10) ： 438-445， 1995) 所述设计。
本公开书还提供了编码本公开书的融合蛋白构建物的多核苷酸。 这种多核苷酸包 含编码一个或多个 PTD 结构域， 和 / 或核酸结合结构域 ( 例如， DRBD) 的序列。多核苷酸也 可以编码接头结构域， 其将一个或多个 PTD 和 / 或核酸结合结构域分开。 在一个方面产生包 含两个以上的 PTD 结构域的融合多肽， 并且接着连接到电荷减少的 / 受保护的包含 N-SATE 的寡核苷酸或多核苷酸。
多核苷酸构建物可以结合 ( 即， 克隆 ) 进入合适的载体。为了表达， 编码本公开 书的融合多肽的多核苷酸可以插入至重组表达载体中。术语 “重组表达载体” 指质粒、 病 毒， 或本领域已知的其它载体， 所述载体已通过插入或结合编码本公开书的融合多肽的多 核苷酸而进行操作。表达载体典型地含有复制起始点、 启动子， 以及允许表型选择转化细 胞的特定基因。适合于这种用途的载体包括， 但不限于， 用于在细菌中表达的 T7 基表达载 体 (Rosenberg 等人， Gene， 56 ： 125， 1987)， 用于在哺乳动物细胞中表达的 pMSXND 表达载体 (Lee 和 Nathans， J.Biol.Chem.， 263 ： 3521， 1988)， 用于在昆虫细胞中表达的杆状病毒衍生 载体， 用于在植物中表达的花椰菜花叶病病毒、 CaMV 和烟草花叶病病毒 TMV。
根据使用的载体， 任意数目的合适的转录和翻译元件 ( 调节序列 )， 包括组成性和 诱导性启动子、 转录增强子元件、 转录终止子等可以用于表达载体中 ( 见， 例如， Bitter 等 人， Methods in Enzymology， 153 ： 516-544， 1987)。这些元件为本领域普通技术人员所公 知。
术语 “可操作地连接” 和 “可操作地结合” 互换使用， 在本文中广义指两个在其它 方面不同的结构域的化学或物理偶联， 每个结构域具有独立的生物学功能。 例如， 可操作地 连接指在调控序列和受调控序列调节的多核苷酸之间的功能连接。在另一方面， 可操作地 连接指核酸结构域和转导结构域的结合， 使得每个结构域在合适的条件下保留其独立的生 物学活性。可操作地连接进一步指融合多肽的编码结构域之间的连接， 使得每个结构域在 框内连接， 以产生期望的多肽序列。
在酵母中， 可以使用含有组成性或诱导性启动子的一些载体 ( 见， 例如， Current Protocols in Molecular Biology， Vol.2， Ed.Ausubel 等人， Greene Publish.Assoc.& Wiley Interscience， Ch.13， 1988 ； Grant 等人， “Expression and Secretion Vectors for Yeast， ” in Methods in Enzymology， Eds.Wu &Grossman， Acad.Press， N.Y.， Vol.153，pp.516-544， 1987 ； Glover， DNA Cloning， Vol.II， IRL Press， Wash.， D.C.， Ch.3， 1986 ； “Bitter， Heterologous Gene Expression in Yeast， ” Methods in Enzymology， Eds. Berger & Kimmel， Acad.Press， N.Y.， Vol.152， pp.673-684， 1987 ； 和 The Molecular Biology of the Yeast Saccharomyces， Eds.Strathern 等人， Cold Spring Harbor Press， Vols.I and II， 1982)。可以使用组成性酵母启动子， 如 ADH 或 LEU2， 或诱导性启动子， 如 GAL(“Cloning in Yeast， ” Ch.3， R.Rothstein In ： DNA Cloning Vol.11， A Practical Approach， Ed.DM Glover， IRL Press， Wash.， D.C.， 1986)。可选地， 可以使用促进外源 DNA 序列整合进入酵母染色体中的载体。
表达载体可以用于转化宿主细胞。 “转化” 是指将细胞外源的多核苷酸整合进入细 胞后在细胞中诱导的永久性遗传变化。当细胞是哺乳动物细胞时， 永久性遗传变化通常是 通过引入多核苷酸进入细胞的基因组实现的。 “转化细胞” 或” 重组宿主细胞” 意思是通过 分子生物学技术已引入编码本公开书的融合多肽的多核苷酸的细胞 ( 或者其祖先 )。转化 宿主细胞可以通过本技术领域人员所知的常规技术进行。当宿主是原核生物， 诸如大肠杆 菌时， 这些能够摄取多核苷酸的感受态细胞可以如下制备 ： 指数生长期后收获细胞， 然后通 过本领域已知的程序通过 CaCl2 方法处理。可选地， 可以使用 MgCl2 或 RbCl。转化也可以 在形成宿主细胞的原生质体后或通过电穿孔进行。 本公开书的融合多肽可以通过在原核生物中表达编码融合多肽的多核苷酸来产 生。这些包括， 但不限于， 微生物， 诸如用编码本公开书的融合多肽的重组噬菌体 DNA、 质粒 DNA 或粘粒 DNA 表达载体转化的细菌。构建物可以在大肠杆菌中大规模表达。当序列包括 用于通过镍 - 螯合层析一步纯化的标签时， 简化了从细菌的纯化。因此， 编码融合多肽的多 核苷酸也可以包含标签以简化融合多肽的分离。 例如， 例如， 六个组氨酸残基聚组氨酸标签 可以结合在融合多肽的氨基端。聚组氨酸标签允许通过镍 - 螯合层析方便地一步分离蛋 白。本公开书的融合多肽也可以被改造为含有裂解位点以帮助蛋白回收。裂解位点可以是 上述的接头部分的一部分。编码期望肽接头的 DNA 序列可以插入其中， 并且在与其后接着 核酸结构域的编码 PTD 的多核苷酸或其片段相同的读框中， PTD 也可以使用任何合适的常 规技术连接到期望核酸 ( 例如， dsRNA、 DNA、 siRNA， 等 )。例如， 编码接头的化学合成的寡核 苷酸可以连接在两个编码的多核苷酸之间。在具体的实施方案中， 本公开书的多核苷酸编 码包含通过接头隔开的两个至四个单独的结构域 ( 例如， 一个或多个 PTD 结构域和一个或 多个核酸结构域 ) 的融合多肽。在一些实施方案中， 一旦纯化， 包含多个 PTD 的融合多肽就 与包含阴离子电荷中和基团或其它阴离子电荷减少基团的寡核苷酸结合或连接。
当宿主细胞是真核细胞时， 可以使用转染 DNA 的方法如磷酸钙共沉淀， 常规的机 械程序诸如显微注射、 电穿孔， 插入包埋在脂质体中的质粒， 或病毒载体。真核细胞也可 以用编码本公开书的 PTD- 融合多肽的多核苷酸， 和编码可筛选表型的第二多核苷酸分 子诸如单纯性疱疹胸苷激酶基因共转染。另一个方法是使用真核病毒载体， 诸如猿猴病 毒 40(SV40) 或牛乳头瘤病毒， 短暂地感染或转化真核细胞和表达融合多肽 ( 见， 例如， Eukaryotic Viral Vectors， Cold Spring Harbor Laboratory， Gluzman ed.， 1982)。
真核系统和典型的哺乳动物表达系统， 允许对表达的哺乳动物蛋白发生适宜的翻 译后修饰。具有用于初级转录物的适宜加工、 糖基化、 磷酸化， 和有利地分泌融合产物的细 胞机器的真核细胞可以用作宿主细胞以表达本公开书的 PTD- 融合多肽。这种宿主细胞系
可以包括， 但不限于， CHO、 VERO、 BHK、 HeLa、 COS、 MDCK、 Jurkat、 HEK-293 和 WI38。
长期大量生产重组蛋白， 需要稳定表达。 不使用含有病毒复制起始点的表达载体， 宿主细胞可以用编码本公开书的融合多肽的 cDNA 转化， 所述融合多肽通过合适的表达调 控元件 ( 例如， 启动子、 增强子、 序列、 转录终止子、 多聚腺苷酸化位点等 ) 和可筛选标志物 调控。 在重组质粒中的可筛选标志物赋予选择性 ( 例如， 通过细胞毒素抗性 ) 和使细胞稳定 地整合质粒进入它们的染色体中和生长形成灶， 后者依次地可被克隆和扩充进入细胞系。 例如， 引入外源 DNA 后， 被改造的细胞可以被允许在富集培养基中生长 1-2 天， 接着转到选 择培养基。可以使用许多选择系统， 包括， 但不限于， 单纯性疱疹病毒胸苷激酶 (Wigler 等 人， Cell， 11 ： 223， 1977)， 次黄嘌呤 - 鸟嘌呤磷酸核糖基转移酶 (Szybalska & Szybalski， Proc.Natl.Acad.Sci.USA， 48 ： 2026， 1962)， 和腺嘌呤磷酸核糖基转移酶 (Lowy 等人， Cell， 22 ： 817， 1980) 基因可以被分别用于 tk-、 hgprt- 或 aprt- 细胞。此外， 抗代谢物抗性可 以用作以下的选择基础 ： dhfr， 其赋予氨甲喋呤抗性 (Wigler 等人， Proc.Natl.Acad.Sci. USA， 77 ： 3567， 1980 ； O ′ Hare 等 人， Proc.Natl.Acad.Sci.USA， 8： 1527， 1981) ； gpt， 其赋 予霉酚酸抗性 (Mulligan & Berg， Proc.Natl.Acad.Sci.USA， 78 ： 2072， 1981) ； neo， 其赋予 氨基糖苷 G-418 抗性 (Colberre-Garapin 等人， J.Mol.Biol.， 150 ： 1， 1981) ； 和 hygro， 其 赋予潮霉素基因抗性 (Santerre 等人， Gene， 30 ： 147， 1984)。已经叙述了另外的可筛选基 因， 即 trpB， 其允许细胞使用吲哚取代色氨酸 ； hisD， 其允许细胞使用组氨醇 (histinol) 取 代 组 氨 酸 (Hartman & Mulligan， Proc.Natl.Acad.Sci.USA， 85 ： 8047， 1988) ； 和 ODC( 乌 氨酸脱羧酶 )， 其赋予对鸟氨酸脱羧酶抑制剂， 2-( 二氟甲基 )--DL- 鸟氨酸， DFMO 的抗 性 (McConlogue L.， In ： Current Communications in Molecular Biology， Cold Spring Harbor Laboratory， ed.， 1987)。
用于分离和纯化微生物或真核表达的本公开书的 PTD- 融合多肽的技术可以通过 任何常规手段， 诸如， 例如， 制备性色谱分离和免疫分离， 诸如涉及使用单克隆或多克隆抗 体或抗原的那些。
本公开书的融合多肽可用于递送带阴离子电荷的核酸分子 ( 例如， dsRNA、 siRNA、 DNA、 反义、 核酶等 )， 以用于治疗和 / 或诊断一些疾病和病症。 例如， 融合多肽可以用于治疗 细胞增生性病症， 其中受保护的寡 - 或多核苷酸被可逆地修饰， 使得其单独或结合 PTD 跨细 胞膜到诱导细胞增殖的靶基因。PTD 结构域增加核酸构建物的总净阳离子电荷或减少核酸 构建物的总净阴离子电荷， 促进细胞的摄取。 因此， 构建物可用于治疗具有细胞增生性病症 的细胞。 同样， 本公开书的构建物可以用于治疗炎性疾病和病症、 感染、 血管疾病和病症等。
在一个实施方案中， 本公开书的构建物可以可选地包含， 或除了以上还可以包含， PTD、 靶向结构域。 靶向结构域可以是受体、 受体配体或抗体， 其用于将构建物导入表达关联 结合结构域的特定细胞类型。
因此， 本公开书提供了包含减少阴离子电荷的 N-SATE 部分的寡核苷酸 ( 电荷中和 的寡核苷酸 )。 本公开书还提供了与 PTD 连接的电荷中和的寡核苷酸， 所述 PTD 包括包含融 合蛋白的 PTD。本公开书还提供了包含 RNA 结合结构域蛋白的电荷中和的寡核苷酸。在一 些实施方案中， PTD 和 RNA 结合结构域蛋白的组合与电荷中和的寡核苷酸连接或构建。 通常 这样的电荷中和的寡核苷酸和构建物具有 (i) 减少的阴离子电荷， (ii) 中性电荷， 或 (iii) 阳离子电荷。本公开书的多核苷酸的递送可以通过使用本领域技术人员已知的多种方法使细 胞与多核苷酸接触来实现。因为包含单独 N-SATE 或 N-SATE 和 PTD 的多核苷酸或寡核苷酸 具有总体中性或阳离子电荷， 所述多核苷酸能够跨越细胞膜。 在一些实施方案中， 所述寡核 苷酸与各种载体、 分散剂等一起配制， 如本文其他地方更详细描述的那样。
本公开书的构建物典型地可以与药学上可接受的载体一起制备， 尽管融合多肽可 以作为药物组合物单独施用。
根据本公开书的药物组合物可以包括本公开书的电荷保护的寡核苷酸或构建物， 用载体、 赋形剂、 和添加剂或辅剂制备成适于施用于受试者的形式。 经常使用的载体或辅剂 包括碳酸镁、 二氧化钛、 乳糖、 甘露醇和其它糖类、 滑石、 乳蛋白、 明胶、 淀粉、 维生素、 纤维素 及其衍生物、 动物和植物油、 聚乙二醇和溶剂诸如无菌水、 醇、 甘油和多元醇。 静脉内载体包 括流体和营养补充剂。防腐剂包括抗微生物剂、 抗氧化剂、 螯合剂、 和惰性气体。其它药学 上可接受的载体包括水溶液、 无毒的赋形剂包括盐、 防腐剂、 缓冲液等， 如在以下中所述， 例 如， Remington′ s Pharmaceutical Sciences， 15th ed.， Easton ： Mack Publishing Co.， 1405-1412， 1461-1487(1975)， 和 The National Formulary XIV.， 14th ed.， Washington ： American Pharmaceutical Association(1975)， 其内容通过引用结合入本文。药物组合 物的 pH 和不同组分的准确浓度根据本领域常规技术调整。见 Goodman 和 Gilman′ s， The Pharmacological Basis for Therapeutics( 第 7 版 )。
根据本公开书的药物组合物可以局部或全身施用。 “治疗有效剂量” 是指预防、 治 愈或至少部分抑制疾病或病症的症状 ( 例如， 到抑制细胞增殖的程度 ) 所需要的根据本公 开书的融合多肽的量。 该使用的有效量， 当然， 取决于疾病的严重性和受试者的体重和一般 状况。 典型地， 在体外使用的剂量可以对用于原位施用药物组合物的量提供有用的指导， 动 物模型可以使用以确定治疗特定病症的有效的剂量。在以下文献中叙述了不同考虑因素， 例如， Langer， Science， 249 ： 1527， (1990) ； Gilman 等人 ( 编辑 )(1990)， 它们通过引用并 入。
当在本文中使用时， “施用治疗有效量” 意在包括对受试者给予或施用本公开书的 药物组合物的方法， 其允许钙组合物发挥其意欲的治疗功能。治疗有效量将根据许多因素 而变化， 所述因素诸如受试者中的感染程度， 个体的年龄、 性别和体重。剂量方案可以被调 节以提供最优的治疗反应。例如， 几个分次剂量可以每日施用或剂量可以按照治疗情况的 迫切性按比例地减少。
药物组合物可以以方便的方式施用， 诸如通过注射 ( 例如， 皮下、 静脉内等 )、 口 服、 吸入、 透皮给药或直肠给药。根据给药途径， 药物组合物可以用材料包衣以保护药物组 合物免受酶、 酸和可以使药物组合物失活的其他自然条件的作用。药物组合物也可以经胃 肠外或腹膜内施用。分散液也可以在甘油、 液体聚乙二醇， 和它们的混合物中， 以及在油中 制备。在通常的贮存和使用条件下， 这些制剂可以含有防腐剂以阻止微生物的生长。
适于注射使用的药物组合物包括无菌水溶液 ( 在为水溶性的时候 ) 或分散液和用 于临时制备无菌注射溶液或分散液的无菌粉末。 组合物典型地是无菌的和是达到容易注射 程度的流体。 典型地， 组合物在制造和贮存条件下是稳定的， 并且可以被保存以防止微生物 的污染作用， 诸如细菌和真菌。载体能够是溶剂或分散介质， 其含有例如， 水、 乙醇、 多元醇 ( 例如， 甘油、 丙二醇和液体聚乙二醇， 等 )， 它们的合适混合物， 和植物油。适宜的流动性可以通过下述方法来保持， 例如， 通过使用包衣， 诸如卵磷脂， 在分散液的情况下通过保持所 需的颗粒大小， 和通过使用表面活性剂。阻止微生物的作用可以通过不同的抗细菌剂和抗 真菌剂， 例如， 对羟基苯甲酸酯、 氯丁醇、 酚、 抗坏血酸、 硫柳汞等实现。在许多情况制备， 等 渗剂例如， 糖、 多元醇诸如甘露醇、 山梨醇， 或氯化钠用于组合物中。 注射组合物的延长吸收 可以通过在组合物中包括延迟吸收剂， 例如， 单硬脂酸铝和明胶来获得。
无菌注射溶液可以根据需要， 通过在合适的溶剂中加入所需要量的药物组合物和 以上列举的成分之一或组合， 然后通过过滤灭菌来制备。 通常， 分散液通过将药物组合物加 入到含有碱性分散介质和以上列举的那些中所需要的其它成分的无菌载体中来制备。
药物组合物可以例如， 和惰性稀释剂或可吸收的食用载体一起口服施用。药物组 合物和其它成分也可以封装在硬或软壳明胶胶囊中， 压缩成片剂， 或直接加入至受试者的 膳食中。对于口服治疗施用， 药物组合物可以和赋形剂结合并以可摄取的片剂、 口含片剂、 锭剂、 胶囊、 酏剂、 混悬剂、 糖浆剂、 糯米纸囊剂等形式施用。这种组合物和制剂应该含有至 少 1％重量的活性化合物。当然， 组合物和制剂的百分比可以变化并且可以适宜地在大约 5％到大约 80％的单位重量之间。
片剂、 锭剂、 丸剂、 胶囊等也可以含有以下 ： 粘合剂， 诸如黄蓍胶、 阿拉伯树胶、 玉米 淀粉或明胶 ； 赋形剂诸如磷酸二钙 ； 崩解剂， 诸如玉米淀粉、 马铃薯淀粉、 藻酸等 ； 润滑剂， 诸如硬脂酸镁 ； 和增甜剂， 诸如蔗糖、 乳糖或糖精， 或矫味剂诸如薄荷油、 冬青油或樱桃香 精。当剂量单位形式是胶囊时， 除了以上类型的材料外， 其可以含有， 液体载体。多种其它 材料可以作为包衣存在或否则改变剂量单位的物理形式。 例如， 片剂、 丸剂或胶囊可以用虫 胶、 糖或两者包衣。糖浆剂或酏剂可以含有药剂， 作为增甜剂的蔗糖， 作为防腐剂的对羟基 苯甲酸甲酯和丙酯， 染料， 和矫味剂诸如樱桃或橙子香料。当然， 用于制备任何剂量单位形 式的任何材料应该是药学纯的和在使用的量下基本无毒的。另外， 药物组合物可以结合至 持续释放制剂和剂型中。
因此， “药学上可接受的载体” 意在包括溶剂、 分散介质、 包衣、 抗细菌剂和抗真菌 剂、 等渗和吸收延迟剂等。 用于药学活性物质的这种介质和药剂的使用是本领域公知的。 除 非任何常规的介质或药剂与药物组合物是不相容的， 否则会考虑它们在治疗性组合物和方 法中的使用。补充性活性化合物也可以加入至所述组合物中。
尤其有益的是， 以剂量单位形式配制胃肠外组合物， 以易于施用和剂量均一。 “剂 量单位形式” 当在本文中使用时， 指适合作为用于待治疗的受试者的单位剂量的物理离散 单位 ； 每个单位含有预定量的药物组合物， 其被计算为与所需要的药物载体一起产生期望 的治疗效果。 本公开书的剂量单位形式的规格与药物组合物的特性和所要获得的特定治疗 效果有关。
主要的药物组合物与合适的药学上可接受的载体以可接受的剂量单位复合， 用于 以有效量方便和有效地施用。在含有补充性活性成分的组合物的情况下， 通过参照所述成 分的常规剂量和施用方式来确定剂量。
实施例
在附图中给出了合成和用途的多个实施例。另外， 本公开书提供了下列用于中和 与阴离子寡核苷酸结合的电荷的亚磷酰胺和结构。
Alloc N1SATE
Alloc N1SATE-U
Alloc N1SATE-CPac
Alloc N1SATE-APac
Alloc N2SATE
Alloc N2SATE-U
Alloc N2SATE-CPac
Alloc N2SATE-APac
Alloc N3SATE
Alloc N3SATE-U
Alloc N3SATE-CPac
Alloc N3SATE-APac
Alloc N2SATB
Alloc N2SATB-U
Alloc N2SATB-CPac
Alloc N2SATB-APac
苯基乙酰基 N2SATE
苯基乙酰基 N2SATE-U
苯基乙酰基 N2SATE-CPac
苯基乙酰基 N2SATE-APac
苯基乙酰基 N2SATB
苯基乙酰基 N2SATB-U
Fmoc N0SATE
Fmoc N0SATE-U
Fmoc N1SATE
Fmoc N1SATE-U
Fmoc N1SATE-CAc
Fmoc N1SATE-APac
Fmoc N2SATE
Fmoc N2SATE-UFmoc N2SATE-CAc
Fmoc N2SATE-APac已经描述了本公开书的许多实施方案。 然而， 要理解的是， 在不脱离本公开书的精 神和范围的前提下， 可以作出各种改动。 因此其他实施方案包括在下列权利要求的范围内。
本申请要求于 2009 年 6 月 1 日提交的美国临时申请号 61/182,832 的优先权， 该 申请的公开内容通过引用合并入本文。
【技术领域】
本公开书涉及用于转导细胞的组合物和方法。背景技术 已经使用各种各样的重组病毒载体、 脂质递送系统和电穿孔在体外和体内进行核 酸至细胞的递送。 这些技术通过敲除基因表达或提供用于基因治疗的遗传构建物设法治疗 各种疾病和病症或研究不同的生物系统。
聚阴离子寡聚物诸如寡核苷酸不容易跨细胞膜扩散。 为了克服培养细胞的这个问 题， 阳离子脂质与阴离子寡核苷酸结合以帮助摄取。 不幸的是， 该复合物对细胞通常是有毒 的， 这意味着必须小心地控制阳离子脂的暴露时间和浓度， 以保证活细胞的转染。
作为选择性降解 mRNA 的细胞机理的 RNA 干扰的发现使得可以靶向操作细胞培 养物的表型和发展定向治疗技术 (Behlke， Mol.Ther.13， 644-670， 2006 ； Xie 等人， Drug Discov.Today 11， 67-73， 2006)。然而， 由于它们的大小和负 ( 阴离子 ) 电荷的性质， siRNA 是不能进入细胞的大分子。实际上， siRNA 超过了 Lipinski 的用于细胞递送膜可扩散分子 的 “5s 规则” (Rule of 5s) 的 25 倍， 在该规则中， 通常膜可扩散分子限制为小于 500Da 的尺 寸。因此， 在不存在递送载体或转染剂时， 裸露的 siRNA 不进入细胞， 即使在毫摩尔的浓度 下也不能 (Barquinero 等人， Gene Ther.11 Suppl 1， S3-9， 2004)。重要的关注集中在使用 阳离子脂质上， 其凝聚 siRNA 并在细胞膜上打孔来解决 siRNA 的递送问题。尽管已经广泛 使用， 但转染剂不能实现有效地递送到许多细胞类型， 尤其是原代细胞和造血细胞系中 (T 细胞和 B 细胞， 巨噬细胞 )。而且脂质转染试剂经常导致不同程度的细胞毒性， 从肿瘤细胞 中的轻度到原代细胞中的高度的细胞毒性。
聚阴离子寡聚物诸如寡核苷酸不容易跨细胞膜扩散。 为了克服培养细胞的这个问 题， 阳离子脂质与阴离子寡核苷酸结合以帮助摄取。 不幸的是， 该复合物对细胞通常是有毒 的， 这意味着必须小心地控制阳离子脂的暴露时间和浓度， 以保证活细胞的转染。
作为选择性降解 mRNA 的细胞机理的 RNA 干扰的发现使得可以靶向操作细胞培 养物的表型和发展定向治疗技术 (Behlke， Mol.Ther.13， 644-670， 2006 ； Xie 等人， Drug Discov.Today 11， 67-73， 2006)。然而， 由于它们的大小和负 ( 阴离子 ) 电荷的性质， siRNA 是不能进入细胞的大分子。实际上， siRNA 超过了 Lipinski 的用于细胞递送膜可扩散分子 的 “5s 规则” (Rule of 5s) 的 25 倍， 在该规则中， 通常膜可扩散分子限制为小于 500Da 的尺 寸。因此， 在不存在递送载体或转染剂时， 裸露的 siRNA 不进入细胞， 即使在毫摩尔的浓度 下也不能 (Barquinero 等人， Gene Ther.11 Suppl 1， S3-9， 2004)。重要的关注集中在使用 阳离子脂质上， 其凝聚 siRNA 并在细胞膜上打孔来解决 siRNA 的递送问题。尽管已经广泛 使用， 但转染剂不能实现有效地递送到许多细胞类型， 尤其是原代细胞和造血细胞系中 (T 细胞和 B 细胞， 巨噬细胞 )。而且脂质转染试剂经常导致不同程度的细胞毒性， 从肿瘤细胞 中的轻度到原代细胞中的高度的细胞毒性。
发明内容 本公开书提供了用于将掩蔽的寡核苷酸或多核苷酸递送到活细胞中的方法和组 合物。本发明提供了短暂保护的寡核苷酸或多核苷酸， 其包含阴离子电荷中和部分 / 基团。 在一个实施方案中， 所述电荷中和部分包含碱性 / 阳离子电荷。在另一个实施方案中， 所述 部分包括沿本发明的三酯保护基团的伯胺、 仲胺或叔胺。这些化合物可以通过胞吞或大型 胞饮机制进入活细胞的细胞胞质。在一个实施方案中， 所述磷酸三酯保护 / 中和基团当暴 露于细胞内环境时， 被设计成通过酶活性或通过被动的细胞内方法 ( 例如， pH 改变 ) 除去， 以提供能够诱发 RNAi 应答的寡核苷酸或多核苷酸。因此， 本发明提供了可用作治疗剂、 诊 断剂和作为研究工具的寡核苷酸前药。
本公开书提供了 RNAi 诱导的单个可溶性核糖核酸碱 (siRNB) 分子。在一些实施
方案中， siRNB 分子与肽转导结构域 (PTD) 细胞递送肽 (PTD-siRNB) 缀合， 所述肽转导结构 4 域 (PTD) 细胞递送肽 (PTD-siRNB) ＜ 2x10 Da。RNB 亚磷酰胺结构单元被改造从而包含生 物学可逆的氨基异丁基 S- 酰基硫代乙基碱性磷酸三酯， 其被细胞质硫酯酶特异性地去除， 导致反转为野生型磷酸二酯。自递送的 PTD-siRNB 在培养的原代和转化细胞的全部群体中 诱导快速的 RNAi 应答， 并且在小鼠模型的鼻和上呼吸道中体内诱导 RNAi 应答。PTD-siRNB 代表一种新型的诱导 RNAi 应答的单个可溶性分子方式。
本公开书提供了伯胺基团形式 (pKa ＞ 9.0) 的碱性 ( 正 ) 电荷， 其使 RNB 可溶于 水中， 并且不会被 PTD 递送肽从溶液中驱除。
本公开书提供了在电荷中和的寡核苷酸中使用的修饰核苷酸。 核苷酸包含与核苷 酸的磷酸基团缀合的氨基烷基 S- 酰基硫代烷基 (“电荷中和部分” 或 “N-SATE” )。中和基 团协助包含所述修饰的核苷酸的寡核苷酸跨细胞膜运输。一旦被细胞摄取， 所述中和基团 被例如内源性或外源性硫酯酶去除。
在一个实施方案中， 用于将 N-SATE 添加至寡核苷酸 ( 例如， 和 RNA 寡核苷酸 ) 的 结构单元包含电荷中和部分， 所述电荷中和部分具有下列通式结构 ：
其中 R 是氨基或末端为氨基的 1-7 个原子的烷基、 取代的烷基、 烷氧基、 取代的烷 氧基、 环烷基、 取代的环烷基、 烯基、 取代的烯基、 炔基、 取代的炔基、 芳基、 取代的芳基、 杂环 或取代的杂环。前述结构可以在生成 siRNB 分子的 RNA 合成反应期间加入。
在一个实施方案中， 所述电荷中和部分包含具有下列通式结构的 N-SATE ：
其中 R1 可以存在或可以不存在， 当 R1 存在时， R1 选自烷基、 取代的烷基、 烷氧基、 取 代的烷氧基、 环烷基、 取代的环烷基、 烯基、 取代的烯基、 炔基、 取代的炔基、 芳基、 取代的芳 基、 杂环或取代的杂环 ；
其中 R2 可以存在或可以不存在， 当 R2 存在时， R2 选自 1-7 个原子的烷基、 取代的烷 基、 烷氧基、 取代的烷氧基、 环烷基、 取代的环烷基、 烯基、 取代的烯基、 炔基、 取代的炔基、 芳 基、 取代的芳基、 杂环或取代的杂环。在一个实施方案中， 所述电荷中和部分选自 ：
所述电荷中和部分可以与核酸碱基 ( 即， A、 G、 T、 U、 C) 中任一种的磷酸基团缀合。 例如， 本公开书提供了具有下列通式结构的核苷酸 ：
其中 R1 可以存在或可以不存在， 当 R1 存在时， R1 选自烷基、 取代的烷基、 烷氧基、 取 代的烷氧基、 环烷基、 取代的环烷基、 烯基、 取代的烯基、 炔基、 取代的炔基、 芳基、 取代的芳 基、 杂环或取代的杂环 ；
其中 R2 可以存在或可以不存在， 当 R2 存在时， R2 选自 1-7 个原子的烷基、 取代的烷 基、 烷氧基、 取代的烷氧基、 环烷基、 取代的环烷基、 烯基、 取代的烯基、 炔基、 取代的炔基、 芳 基、 取代的芳基、 杂环或取代的杂环。在一个实施方案中， 所述电荷中和部分选自 ：
本公开书还提供了包含寡核苷酸或多核苷酸的核酸构建物， 所述寡核苷酸或多核 苷酸包含减少所述寡核苷酸或多核苷酸主链的净阴离子电荷的电荷中和部分 ( 例如， 磷 酸二酯和 / 或硫代磷酸酯保护基团 )。在一个实施方案中， 所述寡核苷酸或多核苷酸包括 siRNA 分子。 还在另一个实施方案中， 所述寡核苷酸包括多个修饰的具有电荷中和部分的核 苷酸。还在另一个实施方案中， 所述寡核苷酸或多核苷酸包含多个邻近的具有电荷中和部 分的核苷酸。还在另一个实施方案中， 所述寡核苷酸或多核苷酸包含多个彼此间隔 1 个或 多个核苷酸碱基 ( 例如， 2、 3、 4、 5、 6、 7、 8、 9 或多个核苷酸碱基 ) 的具有电荷中和部分的核苷 酸。还在另一个实施方案中， 包含电荷中和部分的寡核苷酸或多核苷酸与转导结构域缀合 或可操作地连接， 所述转导结构域包括膜转运功能， 与所述寡核苷酸或多核苷酸结构域可 操作连接。
本公开书也提供了药物组合物， 其包含本文所述的核酸构建物。
本公开书描述了包括将一个或多个蛋白转导结构域连接到核酸构建物的方法。 在
一个方面， 所述一个或多个蛋白转导结构域包含 2-5 个蛋白转导结构域。
本公开书也提供了产生核酸构建物的方法， 该方法包括 ： 基本上纯化蛋白转导结 构域 ； 合成寡核苷酸 ； 用电荷中和基团电荷中和所述寡核苷酸的阴离子电荷 ； 和将所述寡 核苷酸连接到一个或多个蛋白转导结构域。
还提供了转染细胞的方法， 所述方法包括用本公开书的核酸构建物接触细胞。所 述接触可以在体内或体外。
本公开书也提供了治疗疾病或病症的方法， 所述方法包括向受试者施用本公开书 的核酸构建物， 其中所述寡核苷酸或多核苷酸包含治疗性或诊断性分子。 附图说明
图 1 描绘了细胞摄取电荷中和的寡核苷酸和酶法脱保护。 图 2 描绘了 N-SATE 磷酸三酯脱保护。 图 3 显示了亚磷酰胺结合至 RNA 寡核苷酸中的实施方案。 图 4A-B 显示了本公开书的核苷亚磷酰胺合成路线。 图 5 显示了 Fmoc-N1-SATE 纯化和表征。 图 6 显示了 Fmoc-N1-SATE U 亚磷酰胺纯化和表征。 图 7 显示了 Fmoc-N1-SATE C 亚磷酰胺纯化和表征。 图 8 显示了 Fmoc-N1-SATE A 亚磷酰胺纯化和表征。 图 9 显示了 Fmoc-N2-SATE 纯化和表征。 图 10 显示了 Fmoc-N2-SATE U 亚磷酰胺纯化和表征。 图 11 显示了 Fmoc-Ala-SATE 亚磷酰胺的合成。 图 12 显示了 Fmoc-Ala-SATE 纯化和表征。 图 13 显示了 Fmoc-Ala-SATE U 亚磷酰胺纯化和表征。 图 14 显示了包含具有 N1-U-SATE 核苷酸的 SEQ ID NO ： 21 的测试序列以及纯化和 图 15 显示了包含具有 N1-U-SATE 核苷酸的 SEQ ID NO ： 22 的测试序列以及纯化和表征。
表征。 图 16 显示了包含具有 N1-U-SATE 核苷酸的 SEQ ID NO ： 23 的针对 GFP 的 RNAi 和 显示在 24 小时 GFP 表达的抑制的剂量响应曲线。
图 17 显示了包含具有 N1-U-SATE 核苷酸的 SEQ ID NO ： 23 的针对 GFP 的 RNAi 和 显示在 48 小时 GFP 表达的抑制的剂量响应曲线。
图 18 显示了在细胞中的 GFP RNAi 抑制作用。
图 19 显示了 HPLC 纯化 AS-10 N1-SATE(SEQ ID NO ： 24)。
图 20 显示了 3S-9N1-SATE(SEQ ID NO ： 25) 的 HPLC 纯化结果。
图 21 显示了在变性凝胶分析中 S 和 AS N1-SATE 寡核苷酸的纯化。
图 22 显示了纯化的 S-9N1-SATE(SEQ ID NO ： 25) 和 AS-10-N1-SATE(SEQ ID NO ： 24) 形成 dsRNB。
图 23 显示了在存在各种 siRNA 抑制剂和浓度 (SEQ ID NOs ： 24 和 25) 的条件下的 24 小时 GFP 表达测量。
图 24 显示了在存在各种 siRNA 抑制剂和浓度 (SEQ ID NOs ： 24 和 25) 的条件下的 48 小时 GFP 表达测量。
图 25 显示了在存在各种 siRNA 抑制剂和浓度 (SEQ ID NOs ： 24 和 25) 的条件下的 48 小时 GFP 表达测量。
图 26 显示了使用电荷保护的 siRNA 制剂的表达抑制。
图 27 显示了合成测试物 N2-SATE 磷酸三酯寡核苷酸 (SEQ ID NO ： 21)。
图 28 显示了包含 9 个电荷中和部分的 SEQ ID NO ： 25 的纯化。
图 29 显示了包含 15 个电荷中和部分的 SEQ ID NO ： 25 的纯化。
图 30 显示了 SEQ ID NO ： 25 的脱保护反应。
图 31 显示了使用 21 聚体电荷保护的寡核苷酸 (SEQ ID NO ： 23) 针对 GFP 的 RNAi 应答。
图 32 显示了使用本公开书的电荷保护基团的电荷保护的寡核苷酸 (SEQ ID NO ： 23) 可溶于盐溶液中。 具体实施方式 如本文和在所附权利要求所用， 单数形式 “一” 、 “和” 以及 “该” 包括复数指代物， 除非上下文另外清楚地说明。因此， 例如， 提及 “一个 PTD” 包括几个这种 PTD， 提及 “所述细 胞” 包括提及本技术领域人员所知的一个或多个细胞， 等等。
除非另外说明， 本文所用的所有技术和科学术语具有本公开书所属领域技术人员 通常理解的相同意思。 但是类似于或等同于本文所述那些的方法和材料可以被用于实施所 公开的方法和组合物， 本文描述了示例性方法， 装置和材料。
此外， “或” 的使用是指 “和 / 或” ， 除非另外说明。同样， “包含” 、 “包括” 、 “含有” 和 “具有” 是可互换的并且不意在是限制性的。
还要理解， 当各个实施方案的描述使用术语 “包括” 时， 本领域技术人员将理解在 具体的情况下， 实施方案可以备选地使用 “基本由 ... 组成” 或 “由 ... 组成” 的表述。
上述和全文所述的出版物仅仅提供它们在本申请申请日之前的公开内容。 此处绝 不应理解为承认由于在先公开内容的存在本发明人无权先于这些公开内容而获得授权。
递送一些生物活性剂到细胞内的能力是存在问题的， 因为存在细胞膜所带来的生 物利用度的限制。细胞胞质膜形成屏障， 其将细胞内摄取的分子局限在那些具有足够的非 极性和尺寸小于大约 500 道尔顿的分子。以前的提高蛋白细胞内化的努力集中在与受体配 体的融合蛋白 (Ng 等人， Proc.Natl.Acad.Sci.USA， 99 ： 10706-11， 2002) 或通过将它们包装 进笼形脂质体载体中 (Abu-Amer 等人， J.Biol.Chem.276 ： 30499-503， 2001)。然而， 这些技 术常导致不良的细胞摄取和细胞内隔离进入胞吞途径。
其它高度带电的具有治疗能力的核酸分子面临相同的递送屏障。例如， RNA 适体 具有高的结合、 隔离和抑制在＞ 10,000 道尔顿和高度带电的蛋白的能力， 它们自己不具有 或具有有限的能力到进入细胞。本公开书的方法和组合物允许细胞内递送 RNA 适体、 siRNA 和 DNA 载体。
由于它们的阴离子电荷和～ 14,000 道尔顿的大尺寸， 在哺乳动物包括人中递送 siRNAi 面临很大的挑战。然而， 带正电荷的肽和蛋白已经在寡核苷酸方面获得了进展。例
如， 将蛋白转导结构域 (PTD) 连接至核酸已经在寡核苷酸递送方面提供了一些进展。然而， 甚至在这些情况下， siRNA 和 PTD 的阴离子和阳离子电荷经常分别彼此中和， 减少了被具有 阳离子电荷所促进的摄取。
本公开书提供了通过保护 / 中和与寡核苷酸或多核苷酸相关的电荷来促进和提 高细胞摄取核酸分子的方法和组合物。在一些实施方案中， 本公开书的组合物将阳离子电 荷提供至核酸以促进摄取。在其他的实施方案中， 额外的带正电荷的部分可以连接至核酸 分子。
本公开书提供了递送可用于选择性地治疗人类疾病和有利于研究的序列特异的 寡核苷酸或多核苷酸的组合物和方法。 本公开书的组合物和方法更有效地递送寡核苷酸和 多核苷酸， 包括 siRNA、 RNA 适体和 DNA 载体至受试者和细胞。本公开书克服使这种 RNAi 构 建物难以递送或不能递送的大小和电荷的限制。通过可逆的中和在核酸 ( 例如， dsRNA) 上 的阴离子电荷， 包含根据本公开书的磷酸三酯和 / 或硫代磷酸酯保护基团的构建物可以在 体外和体内将核酸递送进入细胞。
本公开书提供了包含电荷中和部分 ( 例如， 磷酸三酯和 / 或硫代磷酸酯保护基团 ) 的核酸构建物。该构建物可以进一步包括用于细胞转导和细胞调节的组合物。这种组合物 可以包括包含膜转运功能的转导部分结构域并且可以进一步包含足以可逆地中和核酸上 的阴离子电荷的核酸结合结构域。 如本文所证明的， 向核酸添加一个或多个可去除的 ( 例如， 可逆地结合的 ) 电荷中 和部分可以有效地促进细胞转导。 任何核酸， 无论哪种序列组成， 均可以通过本公开书的电 荷中和部分被修饰。
本公开书提供了寡核苷酸或多核苷酸， 在一些实施方案中， 其具有一个或多个生 物可逆的电荷中和部分， 这些电荷中和部分促成了提高细胞膜的穿透和抵抗外切和内切核 酸酶降解的化学和生物物理性质。 本公开书进一步提供用于合成生物可逆保护的寡核苷酸 或多核苷酸的酰胺试剂。而且， 这些保护基团在合成的过程中是稳定的。
具有一个或多个生物可逆的电荷中和部分的本公开书的所述寡核苷酸或多核苷 酸有时称为前寡核苷酸或前多核苷酸。在本公开书的实施方案中， 前寡核苷酸能够增加细 胞脂质双分子层穿透能力以及对体内和体外外切和内切核酸酶降解的抗性。在细胞中， 电 荷中和部分可以通过硫酯酶的作用通过还原条件、 酶活性 ( 例如， 内源羧酸酯酶 ) 等除去， 以产生生物活性的寡核苷酸化合物， 所述化合物能够杂交到具体的内源核酸和 / 或对其具 有亲合力。
所述电荷中和部分可以与合成的 DNA 或 RNA 的反义寡核苷酸或与靶序列的互补序 列的混合分子一起使用， 所述靶序列属于基因或 RNA 信使， 其表达被特定设计为阻断或下 调。反义寡核苷酸可以针对靶信使 RNA 序列或者， 可选地针对靶 DNA 序列， 并杂交到它们互 补的核酸。因此， 这些分子有效地阻断或下调基因表达。
电荷中和的寡核苷酸或多核苷酸也可以针对一些双链 DNA 区 ( 同型嘌呤 / 同型嘧 啶序列或富含嘌呤 / 嘧啶的序列 )， 并因此形成三螺旋。 特定序列的三螺旋的形成可以阻断 调节或否则控制基因表达的蛋白因子的相互作用， 和 / 或可以促进被引入到具体的核酸位 点的不可逆损害， 条件是得到的寡核苷酸具有反应性官能团。
本文提供了核酸构建物， 和产生这种构建物的方法， 它们可以用于促进寡核苷酸
或多核苷酸递送至细胞中。在一个实施方案中， 核酸构建物包括一个或多个电荷中和部分 以中和与核酸诸如 RNA 和 / 或 DNA 缔合的磷酸二酯阴离子电荷。一旦进入细胞， 电荷中和 部分可以从构建物中通过细胞内过程除去， 所述细胞内过程包括二硫键还原、 酯水解或其 它酶介导的过程 ( 例如， 硫酯酶活性 )。在其它实施方案中， 包含一个或多个电荷中和部分 的核酸构建物进一步包含一个或多个转导结构域诸如蛋白转导结构域 (PTD)。例如， PTD 可 以通过游离的硫醇基直接缀合到包含该核酸构建物的寡核苷酸 ( 例如， RNA 或 DNA)， 诸如 5’ 和 / 或 3’ 端。例如， 通过生物学上敏感和可逆的方式， 诸如二硫键， PTD 可以连接到该构 建物。该方法可以应用到任何寡核苷酸或多核苷酸长度和允许将 RNA( 例如， siRNA、 RNA 适 体 ) 或 DNA 递送至细胞中。
在另一个实施方案中， 核酸构建物可以包括碱性基团， 诸如胍盐基团 ( 类似于头 基精氨酸， PTD 的活性组分 )， 其连接到可逆的保护基团和由此限制对 PTD 的需要。
因此， 本文提供了核苷酸 ( 例如， RNA 或 DNA)， 其被合成以包括用于递送核酸序列 通过细胞膜的电荷中和部分。构建物也可以包括， 例如， 一个或多个转导结构域和 / 或含有 碱性基团的保护基团。一旦进入细胞， 所述核酸构建物的寡核苷酸 / 多核苷酸通过水解或 其它酶活性 ( 例如， 硫酯酶活性 )， 基于还原环境回复到未保护 / 野生型的寡核苷酸 / 多核 苷酸。
分离的电荷保护的寡核苷酸或多核苷酸构建物是指包含具有电荷中和部分的核 苷酸的寡核苷酸或多核苷酸。
所述电荷中和的寡核苷酸可以使用具有下列通式的亚磷酰胺结构来合成 ：
包含 U、 T、 C 或 A 核苷酸的上述结构可以用于 RNA 合成仪中寡核苷酸的合成。
当在本文中使用时， 阴离子电荷中和部分或基团是指可以减少与其缔合的寡核苷 酸或多核苷酸的总净阴离子电荷的分子或化学基团。如本文所述的氨基 -S- 酰基 - 硫代烷 基部分是阴离子电荷 - 中和部分。 这些电荷中和部分是可逆的。 一个或多个阴离子电荷 - 中 和部分或基团可以与寡核苷酸或多核苷酸缔合， 其中每个独立地导致所述寡核苷酸或多核 苷酸的阴离子电荷的减少和或阳离子电荷的增加。例如， 一个或多个电荷中和部分可以与 寡核苷酸缔合， 且 “受保护的寡核苷酸” 可以与一个或多个阳离子转导结构域 ( 例加， PTD) 缔合， 使得相对于没有所述电荷中和部分和 / 或 PTD 的所述寡核苷酸， 构建物的总净阴离子 电荷减少或构建物的总净电荷为中性或构建物的总净电荷是阳离子。
本公开书提供了电荷中和部分， 包含这样的电荷中和部分的核苷酸， 以及包含这 样的电荷中和部分的寡核苷酸或多核苷酸。在一个实施方案中， 所述电荷中和部分具有通 式：
( 在本文中通常称为 N-SATE)， 其中 R1 可以存在或可以不存在， 当 R1 存在时， R1 选 自烷基、 取代的烷基、 烷氧基、 取代的烷氧基、 环烷基、 取代的环烷基、 烯基、 取代的烯基、 炔 基、 取代的炔基、 芳基、 取代的芳基、 杂环或取代的杂环 ；
其中 R2 可以存在或可以不存在， 当 R2 存在时， R2 选自 1-7 个原子的烷基、 取代的烷 基、 烷氧基、 取代的烷氧基、 环烷基、 取代的环烷基、 烯基、 取代的烯基、 炔基、 取代的炔基、 芳 基、 取代的芳基、 杂环或取代的杂环， 其中 X 是所述电荷中和部分与核酸主链连接的位置， 并且其中 R3 是 H、 H2 或保护基团。在一个实施方案中， 所述电荷中和部分 (N-SATE) 包含 ：
其中 R1 可以存在或可以不存在， 当 R1 存在时， R1 选自烷基、 取代的烷基、 烷氧基、 取 代的烷氧基、 环烷基、 取代的环烷基、 烯基、 取代的烯基、 炔基、 取代的炔基、 芳基、 取代的芳 基、 杂环或取代的杂环 ；
其中 R2 可以存在或可以不存在， 当 R2 存在时， R2 选自 1-7 个原子的烷基、 取代的烷 基、 烷氧基、 取代的烷氧基、 环烷基、 取代的环烷基、 烯基、 取代的烯基、 炔基、 取代的炔基、 芳 基、 取代的芳基、 杂环或取代的杂环， 其中 X 是核酸主链。在一个实施方案中， 所述电荷中和 部分选自 ：
还在另一个实施方案中， 包含保护基团的电荷中和部分 (N-SATE) 选自下列 ：
Alloc-2- 氨基 2， 2- 二甲基 乙醇 S- 酰基 硫代乙基 磷酸三酯 (Alloc N1-SATE)Alloc-3- 氨基 2， 2- 二甲基 丙醇 S酰基硫代乙基 磷酸三酯 (Alloc-N2-SATE)-Alloc-3- 氨基 -2， 2- 二甲基 丙醇 S酰基硫代丁基 磷酸三酯 (Alloc-N2-SATB)
Alloc-2- 氨基 2， 2- 二甲基 丁醇 S- 酰基 硫代乙基 磷酸三酯 (Alloc-N3-SATE)苯基乙酰基 -3氨基 -2， 2- 二甲基 丙醇 S- 酰基 硫代乙基 磷酸三酯 (PhAc-N2-SATE)苯基乙酰基 -4氨基 -2， 2- 二甲基 丁醇 S- 酰基 硫代乙基 磷酸三酯 (PhAc-N3-SATE)
乙酰基 - 丙氨酸 -2氨基 -2， 2- 二甲基 S- 酰基硫代乙基 磷酸三酯 (Ac-Ala-N1-SATE)乙酰基 - 丙氨酸 -3二甲基 - 丙醇 S- 酰基硫代乙基 磷酸三酯 (Ac-Ala-N2-SATE)Fmoc-2- 氨基 -2甲基 - 乙醇 S- 酰基硫代乙基 磷酸三酯 (Fmoc-N0-SATE)
Fmoc-2- 氨基 -2， 2二甲基 - 乙醇 S- 酰基硫代乙基 磷酸三酯 (Fmoc-N1-SATE)Fmoc-3- 氨基 -2， 2二甲基 - 丙醇 S- 酰基硫代乙基 磷酸三酯 (Fmoc-N2-SATE)下面对各种化学基团进行简要的描述。如对本领域技术人员显而易见的那样， 基 于位阻选择基团。此外， 最终的结构应当具有总体阳离子电荷或是中性的。而且， 选择此类 基团以符合前述标准也将对本领域技术人员是显而易见的。
烷基基团包括直链的、 支链的和环状烷基基团。烷基基团包括那些具有 1 到 20 个 碳原子的基团。烷基基团包括具有 1 到 3 个碳原子的小的烷基基团。烷基基团包括具有 4-10 个碳原子的中等长度的烷基基团。 烷基基团包括具有多于 10 个碳原子的长烷基基团， 尤其是具有 10-20 个碳原子的那些。环状烷基基团包括具有一个或多个环的那些。环状烷 基基团包括具有 3、 4、 5、 6、 7、 8、 9 或 10 元碳环的那些和特别是具有 3、 4、 5、 6、 或 7 元环的基 团的那些。环状烷基基团中的碳环也可以携带烷基基团。环状烷基基团可以包括二环和三 环烷基基团。烷基基团任选地包括取代的烷基基团。取代的烷基基团尤其地包括被芳基基 团取代的那些基团， 所述芳基也可以被任选地取代。具体的烷基基团包括甲基、 乙基、 正丙 基、 异丙基、 环丙基、 正丁基、 s- 丁基、 叔丁基、 环丁基、 正戊基、 支链的戊基、 环戊基、 正己基、 支链的己基和环己基， 所有这些被任选地取代。
烯基基团包括直链的、 支链的和环状烯基基团。烯基基团包括具有 1、 2 或更多个 双键的那些和其中两个更多个双键是缀合的双键的那些。烯基基团包括具有 2 到 20 个碳 原子的烯基基团的那些。烯基基团包括具有 2 到 3 个碳原子的小烷基基团。烯基基团包括 具有 4-10 个碳原子的中等长度的烯基基团。烯基基团包括具有多于 10 个碳原子的长烯基 基团， 特别是那些具有 10-20 个碳原子的那些。环状烯基基团包括具有一个或多个环的那 些。环状烯基基团包括其中双键在环中或在与环连接的烯基基团中的那些。环状烯基基团 包括具有 3、 4、 5、 6、 7、 8、 9 或 10 元碳环的那些和特别是具有 3、 4、 5、 6 或 7 元环的那些基团。 在环状烯基基团中的碳环也可以携带烷基基团。 环状烯基基团可以包括二环和三环烷基基 团。 烯基基团任选地被取代。 取代的烯基基团尤其包括被烷基或芳基基团取代的那些， 所述 烷基或芳基基团也可以任选地被取代。具体的烯基基团包括乙烯基、 丙 -1- 烯基、 丙 -2- 烯 基、 环丙 -1- 烯基、 丁 -1- 烯基、 丁 -2- 烯基、 环丁 -1- 烯基 -、 环丁 -2- 烯基、 戊 -1- 烯基、 戊 -2- 烯基、 支链的戊烯基、 环戊 -1- 烯基、 己 -1- 烯基、 支链的己烯基、 环己烯基 -， 所有这 些任选地被取代。
芳基基团包括基团具有一个或多个 5 或 6 元芳族的或杂芳族环。芳基基团可以含 有一个或多个稠合的芳族环。杂芳族环可以在环中包括一个或多个 N、 O、 或 S 原子。杂芳族 环可以包括具有一个、 两个或三个 N 的那些环， 具有一个或两个 O 的那些环， 和具有一个或 两个 S 的那些环。芳基基团任选地被取代。取代的芳基基团尤其包括被烷基或烯基基团取 代的那些基团， 所述烷基或烯基也可以任选地被取代。具体的芳基基团包括苯基、 联苯基、 吡啶基和萘基基团， 所有这些任选地被取代。
芳基烷基基团是被一个或多个芳基基团取代的烷基基团， 其中烷基基团任选地携 带另外的取代基， 并且芳基基团任选地被取代。具体的烷基芳基基团是苯基取代的烷基基 团， 例加， 苯基甲基基团。
烷基芳基基团是被一个或多个烷基基团取代的芳基基团， 其中烷基基团任选地携 带另外的取代基并且芳基基团任选地被取代。 具体的烷基芳基基团是烷基取代的苯基基团 诸如甲基苯基。
环可以是任选取代的环烷基基团、 任选取代的环烯基基团或芳族基团。环可以含有 3、 4、 5、 6、 7 或更多个碳。环可以是杂芳族的， 其中芳族环的一个、 两个或三个碳被 N、 O或 S 取代。环可以是杂烷基或杂烯基， 其中环中的一个或多个 CH2 基团被 O、 N、 NH 或 S 取代。
任何烷基、 烯基和芳基基团的任选取代包括被以下取代基中的一个或多个取代 ： 卤素、 --CN、 --COOR、 --OR、 --COR、 --OCOOR、 --CON(R)2、 --OCON(R)2、 --N(R)2、 --NO2、 --SR、 --S O2R、 --SO2N(R)2 或 --SOR 基团。 烷基基团的任选取代包括被一个或多个烯基基团、 芳基基团 或两者的取代， 其中烯基基团或芳基基团任选地被取代。烯基基团的任选取代包括被一个 或多个烷基基团、 芳基基团、 或两者取代， 其中烷基基团或芳基基团任选地被取代。芳基基 团的任选取代包括用一个或多个烷基基团、 烯基基团或两者取代芳环， 其中烷基基团或烯 基基团任选地被取代。
烷基、 烯基和芳基基团的任选取代基尤其包括以下 ：
--COOR， 其中 R 是氢或烷基基团或芳基基团， 和更具体地， 其中 R 是甲基、 乙基、 丙 基、 丁基、 或苯基基团， 所有这些任选地被取代 ；
--COR， 其中 R 是氢、 或烷基基团或芳基基团和更具体地， 其中 R 是甲基、 乙基、 丙 基、 丁基或苯基基团， 所有这些基团任选地被取代 ；
--CON(R)2， 其中每个 R， 与其它 R 彼此独立地是氢或烷基基团或芳基基团和更具体 地， 其中 R 是甲基、 乙基、 丙基、 丁基或苯基基团， 所有这些基团任选地被取代 ； R 和 R 可以形 成环， 其可以含有一个或多个双键 ；
--OCON(R)2， 其中每个 R， 与其它 R 彼此独立地是氢或烷基基团或芳基基团和更具 体地， 其中 R 是甲基、 乙基、 丙基、 丁基或苯基基团， 所有这些基团任选地被取代 ； R 和 R 可以 形成环， 其可以含有一个或多个双键 ；
--N(R)2， 其中每个 R， 与其它 R 彼此独立地是氢、 或烷基基团、 酰基基团或芳基基团 和更具体地， 其中 R 是甲基、 乙基、 丙基、 丁基或苯基或乙酰基， 所有这些任选地被取代 ； 或R 和 R 可以形成环， 该环可以含有一个或多个双键。
--SR、 --SO2R 或 --SOR 其中 R 是烷基基团或芳基基团和更具体地， 其中 R 是甲基、 乙基、 丙基、 丁基、 苯基基团， 所有这些任选地被取代 ； 对于 SR， R 可以是氢 ；
--OCOOR， 其中 R 是烷基基团或芳基基团 ；
--SO2N(R)2， 其中 R 是氢、 烷基基团或芳基基团， 且 R 和 R 可以形成环 ；
--OR， 其中 R ＝ H、 烷基、 芳基或酰基 ； 例如， R 可以是产生酰基的 --OCOR*， 其中 R* 是氢或烷基基团或芳基基团和更具体地， 其中 R* 是甲基、 乙基、 丙基、 丁基或苯基基团， 所 有这些基团任选地被取代。
具体的取代的烷基基团包括卤烷基基团， 尤其是三卤甲基基团和特别是三氟甲基 基团。 具体的取代的芳基基团包括一、 二、 三、 四、 和五卤素 - 取代的苯基 ； 一、 二、 三、 四、 五、 六、 和七卤素 - 取代的萘基 ； 3- 或 4- 卤素 - 取代的苯基， 3- 或 4- 烷基 - 取代的苯基， 3- 或 4- 烷氧基 - 取代的苯基， 3- 或 4-RCO- 取代的苯基， 5- 或 6- 卤素 - 取代的萘基。更具体地， 取代的芳基包括乙酰基苯基， 特别是 4- 乙酰基苯基 ； 氟苯基， 特别是 3- 氟苯基和 4- 氟苯 基； 氯苯基， 特别是 3- 氯苯基和 4- 氯苯基 ； 甲基苯基， 特别是 4- 甲基苯基， 和甲氧基苯基， 特别是 4- 甲氧基苯基。
当寡核苷酸或多核苷酸连接到 PTD 时， 带阴离子电荷的寡核苷酸或多核苷酸的电 荷中和释放带正电荷的 PTD， 以与细胞表面有效地相互作用， 并且也阻止了缀合物的聚集。例如， 暴露的带阳离子电荷的 PTD 与细胞表面相互作用和诱导大型胞饮作用。所述寡核苷 酸被释放进入细胞质。一旦进入细胞， 电荷中和基团 ( 例如， 氨基 -S- 酰基硫代烷基 ) 可以 被细胞过程裂解除去， 所述细胞过程诸如还原酶、 氧化酶、 还原剂、 氧化剂或酯酶， 脱保护所 述寡核苷酸或多核苷酸， 使核酸到回复到其自然构型。
如本文所用， 核酸结构域 ( 与寡核苷酸或多核苷酸结构域互换使用 ) 可以是任何 寡核苷酸或多核苷酸 ( 例如， 核酶， 反义分子， siRNA、 dsRNA、 多核苷酸、 寡核苷酸等 )。寡 核苷酸或多核苷酸通常含有磷酸二酯键， 但是在一些情况， 包括核酸类似物， 所述核酸类似 物可以具有替代主链， 包括， 例如， 氨基磷酸酯、 硫代磷酸酯、 二硫代磷酸酯、 或 O- 甲基亚磷 酰胺键 ( 见 Eckstein， Oligonucletides and Analogues ： A Practical Approach， Oxford University Press) ； 和肽核酸主链和键。其它类似物核酸包括具有正电荷主链 ； 非离子主 链， 和非核糖主链的那些， 包括在美国专利 s.5,235,033 和 5,034,506， 以及第 6 和 7 章， ASC Symposium Series 580， Carbohydrate Modifications in Antisense Research， Sanghui&Cook， eds 中描述的那些。 含有一个或多个碳环状糖的核酸也包括在核酸的一个定 义中。可以为了多种原因修饰核糖 - 磷酸主链， 例如为了增加这种分子在生理环境中的稳 定性和半衰期。天然存在的核酸和类似物的混合物也包括在术语寡核苷酸和多核苷酸中 ； 可选地， 可以制备不同核酸类似物的混合物， 以及天然存在的核酸和类似物的混合物。而 且， 可以使用 RNN、 RNB、 DNA 和 RNA 的杂合体。dsDNA、 ssDNA、 dsRNA、 siRNA 包涵在术语寡核 苷酸和多核苷酸中。 多核苷酸指由任意数目的共价结合核苷酸单体构成的聚合化合物， 包括核酸分子 诸如 DNA 和 RNA 分子， 包括单、 双和三链的这种分子， 并且特别意在包含通常称为 “寡核苷 酸” 的多核苷酸的基团， 寡核苷酸通常被区分为具有相对小数目的 ( 不多于大约 30， 例如， 大约 5-10、 10-20 或 20-30) 核苷酸碱基。
当在本文中使用， 术语 “siRNA” 是 “短干扰 RNA” 的缩写， 有时也称为 “小干扰 RNA” 或 “沉默 RNA” ， 并且指一类大约 19-25 个核苷酸长的双链核糖核酸分子， 在真核生物中， 其 参与 RNA 干涉 (RNAi) 途径， 导致转录后的、 序列特异的基因沉默。
术语 “dsRNA” 是 “双链 RNA″的缩写， 和当在本文中使用时是指具有两个互补 RNA 链的核糖核酸分子， 并且其与 siRNA 的不同之处在于， 其为至少大约 26 个核苷酸长度， 和更 典型地是至少大约 50 到大约 100 个核苷酸长度。
如上所述， 核酸可以是 DNA( 基因组 DNA 和 cDNA)、 RNA 或杂合体， 其中核酸可以含 有脱氧核糖和核糖核苷酸的组合， 和碱基的组合， 所述碱基包括尿嘧啶、 腺嘌呤、 胸腺嘧啶、 胞嘧啶、 鸟嘌呤、 肌苷、 黄嘌呤、 次黄嘌呤、 异胞嘧啶、 异鸟嘌呤， 等。 当在本文中使用时， 术语 “核苷” 包括核苷酸和核苷以及核苷酸类似物， 和修饰的核苷诸如氨基修饰的核苷。另外， “核苷” 包括非天然存在的类似结构。因此， 例如肽核酸的每个单元 ( 每个含有碱 ) 在本文 中称为核苷。
本文所述的核酸构建物的核酸结构域不限制为任何特定序列。可用于诊断剂、 治 疗剂和研究的任意数目的寡核苷酸或多核苷酸可以被用于本公开书的方法和组合物。 寡核 苷酸和多核苷酸的不同来源对本领域技术人员是可得的。例如， 基因组片段可以是分离的 和根据本公开书修饰的分离的多核苷酸可以使用氨基 S- 酰基硫代烷基电荷中和部分减少 总净阴离子电荷或可以使用例如， 本领域已知的核酸合成技术作为所述寡核苷酸或多核苷
酸延伸的来源。
从 M.Caruthers 和 S.Beaucage 以及他人的出版著作中了解了实施亚磷酰胺化学 以 制 备 寡 核 苷 酸。 美 国 专 利 ： 4,458,066、 4,500,707、 5,132,418、 4,415,732、 4,668,777、 4,973,679 、 5,278,302 、 5,153,319 、 5,218,103 、 5,268,464 、 5,000,307 、 5,319,079 、 4,659,774、 4,672,110、 4,517,338、 4,725,677 和 Re.34,069， 每个通过引用并入， 描述了寡 核苷酸合成的方法。另外， 实施亚磷酰胺化学已被以下文献系统地综述 ： Beaucage 和 Iyer 于 Beaucage， S.L. 和 Iyer， R.P.， Tetrahedron， 1992， 48， 2223-2311 以及 Beaucage， S.L. 和 Iyer， R.P.， Tetrahedron， 1993， 49， 6123-6194， 或者其中引用的参考文献， 所有这些通过引 用并入本文。
核酸合成仪可商业获得， 且它们的使用通常被本领域普通技术人员理解为有效地 产生几乎任何可能期望的合理长度的寡核苷酸。
在实施亚磷酰胺化学中， 有用的 5’ OH 糖保护基团是三苯甲基、 单甲氧基三苯甲 基、 二甲氧基三苯甲基和三甲氧基三苯甲基， 尤其是二甲氧基三苯甲基 (DMTr)。 在实施亚磷 酰胺化学中有用的亚磷酸激活基团， 即， NR2， 是二烷基取代的氮基团和氮杂环。一个方法包 括使用二异丙基氨基激活基团。 寡核苷酸可以通过 Mermade-6 固相自动化寡核苷酸合成仪或任何通常可获得 的 自 动 化 寡 核 苷 酸 合 成 仪 合 成。 例 如 在 M.Caruthers， Oligonucleotides ： Antisense Inhibitors of Gene Expression.， pp.7-24， J.S.Cohen， ed.(CRC Press， Inc.Boca Raton， Fla.， 1989) 或 Oligonucleotide synthesis， a practical approach， Ed.M.J.Gait， IRL Press， 1984 ； ″ Oligonucleotides and Analogues， A Practical Approach ″， Ed.F.Eckstein， IRL Press， 1991 中描述的三酯、 亚磷酰胺或膦酸氢偶联化学， 被这些合 成仪用于提供期望的寡核苷酸。Beaucage 试剂， 如在 Journal of American Chemical Society， 1990， 112， 1253-1255 中 所 述， 或 元 素 硫， 如 在 Beaucage 等 人， Tetrahedron Letters， 1981， 22， 1859-1862 中所述， 与亚磷酰胺或膦酸氢化学一起使用以提供取代的硫 代磷酸酯寡核苷酸。例如， 包括本文所述的保护基团的试剂可以用于许多期望进行保护的 应用中。这种应用包括， 但不限于， 固相和液相的、 寡核苷酸合成、 多核苷酸合成等。使用核 苷和核苷酸类似物也被本公开书考虑用于提供携带本文公开的保护基团的寡核苷酸或寡 核苷类似物。 因此术语核苷、 核苷酸、 脱氧核苷和脱氧核苷酸通常包括如本文所述的那些类 似物。这些类似物是具有与天然存在的核苷或核苷酸共同的一些结构特征的那些分子， 使 得当掺入寡核苷酸或寡核苷序列时， 它们允许与溶液中的天然存在的寡核苷酸序列杂交。 典型的， 这些类似物通过置换和 / 或修饰碱基、 核糖或磷酸二酯部分衍生于天然存在的核 苷和核苷酸。 改变可以被定制以稳定或去稳定杂合体形成或提高与所期望的互补核酸序列 的杂交特异性。
例如， 结构基团被任选地加到核糖或核苷的碱基上以掺入到寡核苷酸中， 诸如在 核糖 2’ -O 位置的甲基、 丙基或烯丙基基团， 或取代 2’ -O 基团的氟基团， 或在核糖核苷碱 基的溴基团。为了和亚磷酰胺化学一起使用， 多种酰胺 (amidite) 试剂可商购获得， 包括 2’ - 脱氧酰胺， 2′ -O- 甲基酰胺和 2′ -O- 羟基酰胺。用于这种合成的任何其它方法也可 以使用。所述寡核苷酸的实际合成在本领域技术人员的技能范围内。使用类似技术制备其 它寡核苷酸诸如硫代磷酸酯、 甲基膦酸酯和烷基化衍生物也是公知的。使用类似的技术和
可商业获得的修饰的酰胺和可控孔径玻璃 (CPG) 产品， 诸如生物素、 Cy3、 荧光素、 吖啶或补 骨脂素修饰的酰胺和 / 或 CPG( 可购自 Glen Research， Sterling Va.) 以合成荧光标记的、 生物素化的或其它缀合的寡核苷酸也是公知的。
但是本文所述的磷酸三酯中和 / 保护基团可用于中和核酸结构域的阴离子电荷， 连接到受保护的核酸结构域的其他带正电荷的部分可以被用于进一步帮助摄取寡核苷酸 和多核苷酸。 最近对可以有效地穿过真核细胞质膜的几种蛋白的发现已经导致识别新一类 蛋白， 由该蛋白已经得到了肽转导结构域。
例如， 使用氨基 S- 酰基硫代烷基部分 (SATE) 对氨基阴离子核酸 ( 例如， RNA 分子 ) 的电荷中和促进了摄取。在其中电荷中和的阴离子核酸与 PTD 连接的实施方案中， 带阴离 子电荷的核酸的电荷中和释放阳离子 PTD 穿过膜并且防止由于净阳离子电荷引起的缀合 物聚集。 PTD 的暴露的自由阳离子电荷然后可以有效地与细胞表面相互作用， 诱导大型胞饮 作用， 并且从大胞饮泡 (macropinosome) 脱出至细胞质中。一旦在细胞内， 磷酸三酯和 / 或 硫代磷酸酯保护基团可以通过细胞内过程 ( 诸如二硫键的还原或酯水解 ) 被去除， 从而可 以在细胞质中从所述构建物被去除。在一个实施方案中， 电荷中和基团的去除通过硫酯酶 的活性实现。包括例如 dsRNA 的核酸构建物然后可以被 Dicer( 一种 RNAse III 样核糖核 酸酶 ) 水解， 从而释放沉默靶基因的 siRNA。
一些蛋白转导结构域 / 肽为本领域已知， 并且已经证明促进连接到转导结构域的 外源分子 ( 例如， 货物分子 (cargo molecule)) 的摄取。这种转导结构域促进通过称为大 型胞饮作用的过程摄取。大型胞饮作用是所有细胞进行的非选择形式的胞吞作用。
这 些 蛋 白 被 最 佳 表 征 的 是 果 蝇 同 源 异 型 蛋 白 触 足 转 录 蛋 白 (Drosophila homeoprotein antennapedia transcription protein)(AntHD)(Joliot 等人， New Biol.3 ： 1121-34， 1991 ； Joliot 等 人， Proc.Natl.Acad.Sci.USA， 88 ： 1864-8， 1991 ； Le Roux 等 人， Proc.Natl.Acad.Sci.USA， 90 ： 9120-4， 1993)、 单纯性疱疹病毒结构蛋白 VP22(Elliott 和 O’ Hare， Cell 88 ： 223-33， 1997)， HIV-1 转 录 激 活 剂 TAT 蛋 白 (Green 和 Loewenstein， Cell 55 ： 1179-1188， 1988 ； Frankel 和 Pabo， Cell 55 ： 1189-1193， 1988)， 和更最近的朊病 毒蛋白的阳离子 N 端结构域。这些蛋白不但可以穿过胞质膜， 而且其它蛋白的结合， 诸如 酶 β- 半乳糖苷酶， 足以刺激细胞摄取这些复合物。这种嵌合蛋白以生物活性形式存在于 细胞质和核中。该过程的特征显示摄取这些融合多肽是快速的， 以受体独立的方式， 常发 生在几分钟内。而且， 这些蛋白的转导看上去不受细胞类型的影响， 并且可以有效地转导 培养物中的 100 ％细胞， 而没有明显的毒性 (Nagahara 等人， Nat.Med.4 ： 1449-52， 1998)。 除了全长蛋白， 蛋白转导结构域也已经成功地用于诱导细胞内摄取 DNA(Abu-Amer， 见上 )、 反 义 寡 核 苷 酸 (Astriab-Fisher 等 人， Pharm.Res， 19 ： 744-54， 2002)、 小 分 子 (Polyakov 等人， Bioconjug.Chem.11 ： 762-71， 2000) 和甚至是无机的 40 纳米的铁粒子 (Dodd 等人， J.Immunol.Methods 256 ： 89-105， 2001 ； Wunderbaldinger 等 人， Bioconjug.Chem.13 ： 264-8， 2002 ； Lewin 等人， Nat.Biotechnol.18 ： 410-4， 2000 ； Josephson 等人， Biocobjug.， Chem.10 ： 186-91， 1999)， 表明对该过程没有明显的大小限制。 使用转导结构域的有效转导， 部分受到在 PTD- 货物构建物上的总分子电荷的限制。
蛋白转导结构域 (PTD) 与外源分子 ( 例如， 多核苷酸、 小分子或蛋白 ) 的融合足以 导致它们以浓度依赖的方式转导进入多种不同的细胞。而且， 用于蛋白递送的该技术似乎避免了与 DNA 和基于药物的技术有关的许多问题。
PTD 本性是典型的阳离子。这些阳离子蛋白转导结构域进入携带有其所连接的货 物的脂筏内体， 并且通过破坏内体小泡释放它们的货物进入到细胞质。 通常， 本公开书的核 酸构建物的转导结构域可以是几乎任何合成的或天然存在的氨基酸序列， 该氨基酸序列可 以转导或帮助转导融合分子。典型地， 转导结构域是带正电荷的。例如， 转导可以根据本公 开书通过使用核酸构建物实现， 所述核酸构建物包括磷酸三酯和 / 或硫代磷酸酯保护基团 和蛋白序列诸如 HIV TAT 蛋白或其片段， 所述蛋白序列或其片段在 N 端或 C 端连接到包括磷 酸三酯和 / 或硫代磷酸酯保护基团的寡核苷酸或多核苷酸。在一些实施方案中， 核酸可以 包含磷酸三酯和 / 或硫代磷酸酯保护基团并且也可以包含双链结合结构域 ( 例如， DRBD)。 转导蛋白结构域， 例如， 可以是触足同源异型结构域或 HSV VP22 序列， 朊病毒蛋白的 N 端片 段或其合适的转导片段， 诸如本领域已知的那些片段。
可以连接至电荷中和的核酸分子的 PTD 的类型和大小将通过包括期望转导程度 的几个参数来指导。PTD 能够转导至少大约 20％、 25％、 50％、 75％、 80％、 90％、 95％、 98％、 99％或 100％的细胞。转导效率， 典型地表达为转导细胞的百分比， 可以通过几种常规的方 法确定。
PTD 会显示细胞进出率 ( 有时分别称为 K1 和 K2)， 其支持细胞内至少皮摩尔量的融 合分子。通过标准动力学分析使用可检测标记的融合分子， PTD 和任何货物的进出率可以 容易地确定， 或至少被近似地确定。典型地， 进入率与排出率的比率在大约 5 到大约 100 直 至大约 1000 的范围。
在一个实施方案中， 可用于本公开书的方法和组合物的 PTD 包含特征为大量 α 螺 旋的肽。已经发现， 当 PTD 显示显著的 α 螺旋时转导被优化。在另一个实施方案中， PTD 包 括含有碱性氨基酸残基的序列， 所述碱性氨基酸残基基本沿着所述肽的至少一个面排列。 本公开书的 PTD 结构域可以是天然存在的肽或合成的肽。
在本公开书的一个实施方案中， PTD 包括包含强 α 螺旋结构的氨基酸序列， 精氨 酸 (Arg) 残基在螺旋柱的下方。还在另一个实施方案中， PTD 结构域包括以下通式表示的 肽： B1-X1-X2-X3-B2-X4-X5-B3(SEQ ID NO ： 1) 其中 B1、 B2 和 B3 各自独立地是碱性氨基酸， 相同 或不同 ； 并且 X1、 X2、 X 3、 X4 和 X5 各自独立地是 α 螺旋增强氨基酸， 相同或不同。在另一个 实施方案中， PTD 结构域由以下通式表示 ： B1-X1-X2-B2-B3-X3-X4-B4(SEQ ID NO ： 2) 其中 B1、 B2、 B3 和 B4 各自独立地是碱性氨基酸， 相同或不同 ； 并且 X1、 X 2、 X3 和 X4 各自独立地是 α 螺 旋增强氨基酸， 相同或不同。
另外 PTD 结构域包含碱性残基， 例加， 赖氨酸 (Lys) 或精氨酸 (Arg)， 并进一步包括 至少一个脯氨酸 (Pro) 残基从而足以将 “扭结” 引入到结构域。这种结构域的实例包括朊 病毒的转导结构域。例如， 这种肽包括 KKRPKPG(SEQ ID NO ： 3)。
在一个实施方案中， 结构域是以下序列表示的肽 ： X-X-R-X-(P/X)-(B/X)-B-(P/ X)-X-B-(B/X)(SEQ ID NO ： 4)， 其中 X 是任何 α 螺旋促进残基， 诸如丙氨酸 ； P/X 是脯氨酸 或如前面所定义的 X ； B 是碱性氨基酸残基， 例如， 精氨酸 (Arg) 或赖氨酸 (Lys) ； R 是精氨酸 (Arg) 和 B/X 是上面所定义的 B 或 X。
在另一个实施方式中， PTD 是阳离子的且由 7 和 10 个之间的氨基酸构成， 具有 式 K-X1-R-X2-X1(SEQ ID NO ： 5) 其中 X1 是 R 或 K 且 X2 是任何氨基酸。这种肽的实例包括RKKRRQRRR(SEQ ID NO ： 6)。
另外的转导结构域包括 TAT 片段， 其包括 TAT 的至少氨基酸 49 到 56 直至大约全 长的 TAT 序列 ( 见， 例如， SEQ ID NO ： 7)。TAT 片段可以包括一个或多个氨基酸改变， 所述 改变足以增加片段的 α 螺旋。在一些情况， 引入的氨基酸改变将包括加入识别的 α 螺旋 增强氨基酸。可选地， 氨基酸改变将包括从 TAT 片段除去阻碍 α 螺旋形成或稳定性的一个 或多个氨基酸。在更具体的实施方案中， TAT 片段将包括被 α 螺旋增强氨基酸的至少一个 氨基酸置换。典型的 TAT 片段或其它 PTD 将通过标准的肽合成技术制备， 尽管在一些情况 下可以使用重组 DNA 方法。
可以用于本公开书的核酸构建物的另外的转导蛋白 (PTD) 包括 TAT 片段， 其中 TAT49-56 序列已被修饰， 使得序列中的至少两个碱性氨基酸沿着 TAT 片段的至少一个面基 本对齐。示例性的 TAT 片段包括在 TAT 的至少氨基酸 49-56 中的一个特定氨基酸置换， 该 置换与 49-56 序列的碱性氨基酸残基沿着该片段和典型的 TAT 49-56 序列的至少一个面对 齐。
另外的转导蛋白包括 TAT 片段， 其中 TAT 49-56 序列包括被 α 螺旋增强氨基酸的 至少一个置换。在一个实施方案中， 选择所述置换使得在 TAT 片段中的至少两个碱性氨基 酸残基沿着 TAT 片段的至少一个面基本对齐。在更具体的实施方案中， 选择所述置换使得 在 TAT 49-56 序列中的至少两个碱性氨基酸残基沿着该序列的至少一个面基本对齐。
PTD 的其他实例包括 AntHD、 TAT、 VP22、 阳离子朊病毒蛋白结构域、 poly-Arg、 AGRKKRRQRRR(SEQ ID NO ： 14)、 YARKARRQARR(SEQ ID NO ： 15)、 YARAAARQARA(SEQ ID NO ： 16)、 YARAARRAARR(SEQ ID NO ： 17)、 YARAARRAARA(SEQ ID NO ： 18)、 YARRRRRRRRR(SEQ ID NO ： 19)、 YAAARRRRRRR(SEQ ID NO ： 20) 及其功能片段和变体。本公开书在一个实施方案中提供 了将电荷中和的核酸与 PTD 诸如 TAT 和 poly-Arg 的使用结合的方法和组合物。电荷中和 是指核酸 ( 例如， 寡核苷酸或多核苷酸 ) 的总阴离子电荷在构建物中被减少、 中和或比不存 在磷酸三酯和 / 或硫代磷酸酯保护基团， 或磷酸三酯和 / 或硫代磷酸酯保护基团和能够中 和核酸 ( 即， “货物” ) 结构域上的阴离子电荷的结合结构域和 / 或蛋白转导结构域的相同 核酸具有更多的阳离子。
还包括嵌合的 PTD 结构域。这种嵌合的转导蛋白包括至少两个不同的转导蛋白的 部分。 例如， 嵌合的转导蛋白可以通过融合两个不同的 TAT 片段形成， 例加， 一个来自 HIV-1 和另一个来自 HIV-2 或一个来自朊病毒蛋白， 另一个来自 HIV。
PTD 可以与任意数目的包含寡核苷酸或多核苷酸的其它分子连接或融合。可选 地， 核酸构建物或 PTD 可以结合到包含核酸结合结构域、 靶向作用部分等的其它分子实体。 例如， 两个以上的 PTD( 例如， 1-5， 2-4， 典型的 3 个 ) 可以被连续连接或被一个或多个其它 结构域 ( 例如， 核酸结构域或肽接头 ) 分开。通过减少阴离子电荷使得 PTD 结构域的阳 离子电荷足以转导 / 跨越细胞膜， 核酸结合结构域可以促进摄取包含核酸 ( 包括包含保 护基团的寡核苷酸或多核苷酸 ) 的融合构建物。可以理解的是， PTD 可以融合到包含阴离 子电荷中和基团的寡核苷酸或多核苷酸， 并可以进一步连接到核酸结合结构域。示例性 的 RNA 结合蛋白 ( 例如， DRBD) 包括组蛋白、 RDE-4 蛋白或鱼精蛋白。另外的 dsRNA 结合 蛋白 ( 和它们括号内的登录号 ) 包括 ： PKR(AAA36409、 AAA61926、 Q03963)、 TRBP(P97473、 AAA36765) 、 PACT(AAC25672 、 AAA49947 、 NP609646) 、 Staufen(AAD17531 、 AAF98119 、AAD17529、 P25159)、 NFAR1(AF167569)、 NFAR2(AF167570、 AAF31446、 AAC71052、 AAA19960、 AAA19961、 AAG22859)、 SPNR(AAK20832、 AAF59924、 A57284)、 RHA(CAA71668、 AAC05725、 AAF57297)、 NREBP(AAK07692、 AAF23120、 AAF54409、 T33856)、 kanadaptin(AAK29177、 AAB88191、 AAF55582、 NP499172、 NP198700、 BAB19354)、 HYL1(NP563850)、 偏 下 性 叶 (hyponastic leaves)(CAC05659 、 BAB00641) 、 ADAR1(AAB97118 、 P55266 、 AAK16102 、 AAB51687、 AF051275)、 ADAR2P78563、 P51400、 A AK17102、 AAF63702)、 ADAR3(AAF78094、 AAB41862 、 AAF76894) 、 TENR(XP059592 、 CAA59168) 、 RNaseIII(AAF80558 、 AAF59169 、 Z81070Q02555/S55784、 PO5797)、 和 Dicer(BAA78691、 AF408401、 AAF56056、 S44849、 AAF03534、 Q9884)、 RDE-4(AY071926)、 FLJ20399(NP060273、 BAB26260)、 CG1434(AAF48360、 EAA12065、 CAA21662)、 CG13139(XP059208、 XP143416、 XP110450、 AAF52926、 EEA14824)、 DGCRK6(BAB83032 、XP110167)CG1800(AAF57175 、EAA08039) 、FLJ20036(AH22270 、 XP134159)、 MRP-L45(BAB14234、 XP129893)、 CG2109(AAF52025)、 CG12493(NP647927)、 CG10630(AAF50777)、 CG17686(AAD50502)、 T22A3.5(CAB03384) 和登录号 EAA14308。
可以用于本公开书的融合多肽和方法中的肽接头典型地包含达大约 20 或 30 个 氨基酸， 通常达到大约 10 或 15 个氨基酸， 和更常见的大约 1 到 5 个氨基酸。接头序列是 通常柔性的， 使得不将融合分子保持为单一刚性构象。接头序列可以被用来， 例如， 将 PTD 结构域与核酸结合结构域和 / 或核酸结构域隔开。例如， 肽接头序列可以被定位以提供分 子柔性。选择接头部分的长度以优化包含 PTD 结构域融合构建物的多肽的生物学活性并 可以经验性地确定而无需过多的实验。接头部分应该足够长和足够柔性， 以允许 PTD 与 核酸自由地相互作用， 或反之亦然。接头部分的实例是 --Gly--Gly--GGGGS(SEQ ID NO ： 8)、 (GGGGS)N(SEQ ID NO ： 8， 重复的 )、 GKSSGSGSESKS(SEQ ID NO ： 9)、 GSTSGSGKSSEGKG(SEQ ID NO ： 10)、 GSTSGSGKSSEGSGSTKG(SEQ ID NO ： 11)、 GSTSGSGKPGSGEGSTKG(SEQ ID NO ： 12) 或 EGKSSGSGSESKEF(SEQ ID NO ： 13)。连接部分例如在 Huston 等人， Proc.Nat’ l Acad. Sci 85 ： 5879， 1988 ； Whitlow 等人， Protein Engineering 6 ： 989， 1993 ； 和 Newton 等人， Biochemistry 35 ： 545， 1996 中被叙述。 其它合适的肽接头是描述在美国专利号 4,751,180 和 4,935,233 中的那些， 这些通过引用并入。
本公开书的方法、 组合物和融合多肽提供了细胞在体外和在体内对核酸分子的增 强摄取和释放。
术语 “治疗” 以通用意义使用， 包括治疗剂、 预防剂和替代剂。治疗性分子的实例 包括， 但不限于， 细胞周期调控剂 ； 抑制周期蛋白的药剂， 诸如周期蛋白 G1 和周期蛋白 D1 基因的反义多核苷酸 ； 可以被裂解以提供针对具体的生长因子的 siRNA 分子的 dsRNA， 所 述生长因子诸如， 例如， 表皮生长因子 (EGF)、 血管内皮生长因子 (VEGF)、 促红细胞生成素、 G-CSF、 GM-CSF、 TGF-α、 TGF-β 和成纤维细胞生长因子 ； 细胞因子， 包括， 但不限于， 白细胞 介素 1-13 和肿瘤坏死因子 ； 抗凝剂， 抗血小板剂 ； TNF 受体结构域等。
使用这种方法和组合物， 可以治疗不同疾病和病症。例如， 在递送抗肿瘤 siRNA 后， 肿瘤细胞的生长可以被抑制、 阻止或破坏。
因此， 可以理解的是本公开书不局限于任何特定的转导结构域或寡核苷酸 / 多核 苷酸。任何带阴离子电荷的核酸 ( 例如， dsRNA、 siRNA 等 ) 可以使用本公开书的方法和组 合物递送。在本公开书使用的多肽 ( 例如， 关于融合多肽或全长融合多肽的特定结构域 ) 可 以包含氨基酸的 L- 光学异构体或 D- 光学异构体或两者的组合。可以在本公开书使用的多 肽包括修饰的序列诸如糖蛋白、 逆 - 反 (retro-inverso) 多肽、 D- 氨基酸修饰的多肽， 等。 多肽包括天然存在的蛋白， 以及通过重组或合成方法合成的那些多肽。 “片段” 是多肽的一 部分。术语 “片段” 指多肽的部分， 其显示至少一个有用的表位或功能结构域。术语 “功能 片段” 指保留多肽活性的多肽片段。例如， PTD 的功能片段包括保留了转导活性的片段。
在一些实施方式中， 使用逆 - 反肽。 “逆 - 反” 指氨基 - 羧基倒位以及在一个或 多个氨基酸中的对映异构体变化 ( 即， 左旋 (L) 到右旋 (D))。本公开书的多肽包括， 例 如， 氨基酸序列的氨基 - 羧基倒位， 含有一个或多个 D- 氨基酸的氨基 - 羧基倒位， 和含有 一个或多个 D- 氨基酸的非倒位序列。稳定的和保留生物学活性的逆 - 反模拟肽可以根 据 Brugidou 等 人 (Biochem.Biophys.Res.Comm.214(2) ： 685-693， 1995) 和 Chorev 等 人 (Trends Biotechnol.13(10) ： 438-445， 1995) 所述设计。
本公开书还提供了编码本公开书的融合蛋白构建物的多核苷酸。 这种多核苷酸包 含编码一个或多个 PTD 结构域， 和 / 或核酸结合结构域 ( 例如， DRBD) 的序列。多核苷酸也 可以编码接头结构域， 其将一个或多个 PTD 和 / 或核酸结合结构域分开。 在一个方面产生包 含两个以上的 PTD 结构域的融合多肽， 并且接着连接到电荷减少的 / 受保护的包含 N-SATE 的寡核苷酸或多核苷酸。
多核苷酸构建物可以结合 ( 即， 克隆 ) 进入合适的载体。为了表达， 编码本公开 书的融合多肽的多核苷酸可以插入至重组表达载体中。术语 “重组表达载体” 指质粒、 病 毒， 或本领域已知的其它载体， 所述载体已通过插入或结合编码本公开书的融合多肽的多 核苷酸而进行操作。表达载体典型地含有复制起始点、 启动子， 以及允许表型选择转化细 胞的特定基因。适合于这种用途的载体包括， 但不限于， 用于在细菌中表达的 T7 基表达载 体 (Rosenberg 等人， Gene， 56 ： 125， 1987)， 用于在哺乳动物细胞中表达的 pMSXND 表达载体 (Lee 和 Nathans， J.Biol.Chem.， 263 ： 3521， 1988)， 用于在昆虫细胞中表达的杆状病毒衍生 载体， 用于在植物中表达的花椰菜花叶病病毒、 CaMV 和烟草花叶病病毒 TMV。
根据使用的载体， 任意数目的合适的转录和翻译元件 ( 调节序列 )， 包括组成性和 诱导性启动子、 转录增强子元件、 转录终止子等可以用于表达载体中 ( 见， 例如， Bitter 等 人， Methods in Enzymology， 153 ： 516-544， 1987)。这些元件为本领域普通技术人员所公 知。
术语 “可操作地连接” 和 “可操作地结合” 互换使用， 在本文中广义指两个在其它 方面不同的结构域的化学或物理偶联， 每个结构域具有独立的生物学功能。 例如， 可操作地 连接指在调控序列和受调控序列调节的多核苷酸之间的功能连接。在另一方面， 可操作地 连接指核酸结构域和转导结构域的结合， 使得每个结构域在合适的条件下保留其独立的生 物学活性。可操作地连接进一步指融合多肽的编码结构域之间的连接， 使得每个结构域在 框内连接， 以产生期望的多肽序列。
在酵母中， 可以使用含有组成性或诱导性启动子的一些载体 ( 见， 例如， Current Protocols in Molecular Biology， Vol.2， Ed.Ausubel 等人， Greene Publish.Assoc.& Wiley Interscience， Ch.13， 1988 ； Grant 等人， “Expression and Secretion Vectors for Yeast， ” in Methods in Enzymology， Eds.Wu &Grossman， Acad.Press， N.Y.， Vol.153，pp.516-544， 1987 ； Glover， DNA Cloning， Vol.II， IRL Press， Wash.， D.C.， Ch.3， 1986 ； “Bitter， Heterologous Gene Expression in Yeast， ” Methods in Enzymology， Eds. Berger & Kimmel， Acad.Press， N.Y.， Vol.152， pp.673-684， 1987 ； 和 The Molecular Biology of the Yeast Saccharomyces， Eds.Strathern 等人， Cold Spring Harbor Press， Vols.I and II， 1982)。可以使用组成性酵母启动子， 如 ADH 或 LEU2， 或诱导性启动子， 如 GAL(“Cloning in Yeast， ” Ch.3， R.Rothstein In ： DNA Cloning Vol.11， A Practical Approach， Ed.DM Glover， IRL Press， Wash.， D.C.， 1986)。可选地， 可以使用促进外源 DNA 序列整合进入酵母染色体中的载体。
表达载体可以用于转化宿主细胞。 “转化” 是指将细胞外源的多核苷酸整合进入细 胞后在细胞中诱导的永久性遗传变化。当细胞是哺乳动物细胞时， 永久性遗传变化通常是 通过引入多核苷酸进入细胞的基因组实现的。 “转化细胞” 或” 重组宿主细胞” 意思是通过 分子生物学技术已引入编码本公开书的融合多肽的多核苷酸的细胞 ( 或者其祖先 )。转化 宿主细胞可以通过本技术领域人员所知的常规技术进行。当宿主是原核生物， 诸如大肠杆 菌时， 这些能够摄取多核苷酸的感受态细胞可以如下制备 ： 指数生长期后收获细胞， 然后通 过本领域已知的程序通过 CaCl2 方法处理。可选地， 可以使用 MgCl2 或 RbCl。转化也可以 在形成宿主细胞的原生质体后或通过电穿孔进行。 本公开书的融合多肽可以通过在原核生物中表达编码融合多肽的多核苷酸来产 生。这些包括， 但不限于， 微生物， 诸如用编码本公开书的融合多肽的重组噬菌体 DNA、 质粒 DNA 或粘粒 DNA 表达载体转化的细菌。构建物可以在大肠杆菌中大规模表达。当序列包括 用于通过镍 - 螯合层析一步纯化的标签时， 简化了从细菌的纯化。因此， 编码融合多肽的多 核苷酸也可以包含标签以简化融合多肽的分离。 例如， 例如， 六个组氨酸残基聚组氨酸标签 可以结合在融合多肽的氨基端。聚组氨酸标签允许通过镍 - 螯合层析方便地一步分离蛋 白。本公开书的融合多肽也可以被改造为含有裂解位点以帮助蛋白回收。裂解位点可以是 上述的接头部分的一部分。编码期望肽接头的 DNA 序列可以插入其中， 并且在与其后接着 核酸结构域的编码 PTD 的多核苷酸或其片段相同的读框中， PTD 也可以使用任何合适的常 规技术连接到期望核酸 ( 例如， dsRNA、 DNA、 siRNA， 等 )。例如， 编码接头的化学合成的寡核 苷酸可以连接在两个编码的多核苷酸之间。在具体的实施方案中， 本公开书的多核苷酸编 码包含通过接头隔开的两个至四个单独的结构域 ( 例如， 一个或多个 PTD 结构域和一个或 多个核酸结构域 ) 的融合多肽。在一些实施方案中， 一旦纯化， 包含多个 PTD 的融合多肽就 与包含阴离子电荷中和基团或其它阴离子电荷减少基团的寡核苷酸结合或连接。
当宿主细胞是真核细胞时， 可以使用转染 DNA 的方法如磷酸钙共沉淀， 常规的机 械程序诸如显微注射、 电穿孔， 插入包埋在脂质体中的质粒， 或病毒载体。真核细胞也可 以用编码本公开书的 PTD- 融合多肽的多核苷酸， 和编码可筛选表型的第二多核苷酸分 子诸如单纯性疱疹胸苷激酶基因共转染。另一个方法是使用真核病毒载体， 诸如猿猴病 毒 40(SV40) 或牛乳头瘤病毒， 短暂地感染或转化真核细胞和表达融合多肽 ( 见， 例如， Eukaryotic Viral Vectors， Cold Spring Harbor Laboratory， Gluzman ed.， 1982)。
真核系统和典型的哺乳动物表达系统， 允许对表达的哺乳动物蛋白发生适宜的翻 译后修饰。具有用于初级转录物的适宜加工、 糖基化、 磷酸化， 和有利地分泌融合产物的细 胞机器的真核细胞可以用作宿主细胞以表达本公开书的 PTD- 融合多肽。这种宿主细胞系
可以包括， 但不限于， CHO、 VERO、 BHK、 HeLa、 COS、 MDCK、 Jurkat、 HEK-293 和 WI38。
长期大量生产重组蛋白， 需要稳定表达。 不使用含有病毒复制起始点的表达载体， 宿主细胞可以用编码本公开书的融合多肽的 cDNA 转化， 所述融合多肽通过合适的表达调 控元件 ( 例如， 启动子、 增强子、 序列、 转录终止子、 多聚腺苷酸化位点等 ) 和可筛选标志物 调控。 在重组质粒中的可筛选标志物赋予选择性 ( 例如， 通过细胞毒素抗性 ) 和使细胞稳定 地整合质粒进入它们的染色体中和生长形成灶， 后者依次地可被克隆和扩充进入细胞系。 例如， 引入外源 DNA 后， 被改造的细胞可以被允许在富集培养基中生长 1-2 天， 接着转到选 择培养基。可以使用许多选择系统， 包括， 但不限于， 单纯性疱疹病毒胸苷激酶 (Wigler 等 人， Cell， 11 ： 223， 1977)， 次黄嘌呤 - 鸟嘌呤磷酸核糖基转移酶 (Szybalska & Szybalski， Proc.Natl.Acad.Sci.USA， 48 ： 2026， 1962)， 和腺嘌呤磷酸核糖基转移酶 (Lowy 等人， Cell， 22 ： 817， 1980) 基因可以被分别用于 tk-、 hgprt- 或 aprt- 细胞。此外， 抗代谢物抗性可 以用作以下的选择基础 ： dhfr， 其赋予氨甲喋呤抗性 (Wigler 等人， Proc.Natl.Acad.Sci. USA， 77 ： 3567， 1980 ； O ′ Hare 等 人， Proc.Natl.Acad.Sci.USA， 8： 1527， 1981) ； gpt， 其赋 予霉酚酸抗性 (Mulligan & Berg， Proc.Natl.Acad.Sci.USA， 78 ： 2072， 1981) ； neo， 其赋予 氨基糖苷 G-418 抗性 (Colberre-Garapin 等人， J.Mol.Biol.， 150 ： 1， 1981) ； 和 hygro， 其 赋予潮霉素基因抗性 (Santerre 等人， Gene， 30 ： 147， 1984)。已经叙述了另外的可筛选基 因， 即 trpB， 其允许细胞使用吲哚取代色氨酸 ； hisD， 其允许细胞使用组氨醇 (histinol) 取 代 组 氨 酸 (Hartman & Mulligan， Proc.Natl.Acad.Sci.USA， 85 ： 8047， 1988) ； 和 ODC( 乌 氨酸脱羧酶 )， 其赋予对鸟氨酸脱羧酶抑制剂， 2-( 二氟甲基 )--DL- 鸟氨酸， DFMO 的抗 性 (McConlogue L.， In ： Current Communications in Molecular Biology， Cold Spring Harbor Laboratory， ed.， 1987)。
用于分离和纯化微生物或真核表达的本公开书的 PTD- 融合多肽的技术可以通过 任何常规手段， 诸如， 例如， 制备性色谱分离和免疫分离， 诸如涉及使用单克隆或多克隆抗 体或抗原的那些。
本公开书的融合多肽可用于递送带阴离子电荷的核酸分子 ( 例如， dsRNA、 siRNA、 DNA、 反义、 核酶等 )， 以用于治疗和 / 或诊断一些疾病和病症。 例如， 融合多肽可以用于治疗 细胞增生性病症， 其中受保护的寡 - 或多核苷酸被可逆地修饰， 使得其单独或结合 PTD 跨细 胞膜到诱导细胞增殖的靶基因。PTD 结构域增加核酸构建物的总净阳离子电荷或减少核酸 构建物的总净阴离子电荷， 促进细胞的摄取。 因此， 构建物可用于治疗具有细胞增生性病症 的细胞。 同样， 本公开书的构建物可以用于治疗炎性疾病和病症、 感染、 血管疾病和病症等。
在一个实施方案中， 本公开书的构建物可以可选地包含， 或除了以上还可以包含， PTD、 靶向结构域。 靶向结构域可以是受体、 受体配体或抗体， 其用于将构建物导入表达关联 结合结构域的特定细胞类型。
因此， 本公开书提供了包含减少阴离子电荷的 N-SATE 部分的寡核苷酸 ( 电荷中和 的寡核苷酸 )。 本公开书还提供了与 PTD 连接的电荷中和的寡核苷酸， 所述 PTD 包括包含融 合蛋白的 PTD。本公开书还提供了包含 RNA 结合结构域蛋白的电荷中和的寡核苷酸。在一 些实施方案中， PTD 和 RNA 结合结构域蛋白的组合与电荷中和的寡核苷酸连接或构建。 通常 这样的电荷中和的寡核苷酸和构建物具有 (i) 减少的阴离子电荷， (ii) 中性电荷， 或 (iii) 阳离子电荷。本公开书的多核苷酸的递送可以通过使用本领域技术人员已知的多种方法使细 胞与多核苷酸接触来实现。因为包含单独 N-SATE 或 N-SATE 和 PTD 的多核苷酸或寡核苷酸 具有总体中性或阳离子电荷， 所述多核苷酸能够跨越细胞膜。 在一些实施方案中， 所述寡核 苷酸与各种载体、 分散剂等一起配制， 如本文其他地方更详细描述的那样。
本公开书的构建物典型地可以与药学上可接受的载体一起制备， 尽管融合多肽可 以作为药物组合物单独施用。
根据本公开书的药物组合物可以包括本公开书的电荷保护的寡核苷酸或构建物， 用载体、 赋形剂、 和添加剂或辅剂制备成适于施用于受试者的形式。 经常使用的载体或辅剂 包括碳酸镁、 二氧化钛、 乳糖、 甘露醇和其它糖类、 滑石、 乳蛋白、 明胶、 淀粉、 维生素、 纤维素 及其衍生物、 动物和植物油、 聚乙二醇和溶剂诸如无菌水、 醇、 甘油和多元醇。 静脉内载体包 括流体和营养补充剂。防腐剂包括抗微生物剂、 抗氧化剂、 螯合剂、 和惰性气体。其它药学 上可接受的载体包括水溶液、 无毒的赋形剂包括盐、 防腐剂、 缓冲液等， 如在以下中所述， 例 如， Remington′ s Pharmaceutical Sciences， 15th ed.， Easton ： Mack Publishing Co.， 1405-1412， 1461-1487(1975)， 和 The National Formulary XIV.， 14th ed.， Washington ： American Pharmaceutical Association(1975)， 其内容通过引用结合入本文。药物组合 物的 pH 和不同组分的准确浓度根据本领域常规技术调整。见 Goodman 和 Gilman′ s， The Pharmacological Basis for Therapeutics( 第 7 版 )。
根据本公开书的药物组合物可以局部或全身施用。 “治疗有效剂量” 是指预防、 治 愈或至少部分抑制疾病或病症的症状 ( 例如， 到抑制细胞增殖的程度 ) 所需要的根据本公 开书的融合多肽的量。 该使用的有效量， 当然， 取决于疾病的严重性和受试者的体重和一般 状况。 典型地， 在体外使用的剂量可以对用于原位施用药物组合物的量提供有用的指导， 动 物模型可以使用以确定治疗特定病症的有效的剂量。在以下文献中叙述了不同考虑因素， 例如， Langer， Science， 249 ： 1527， (1990) ； Gilman 等人 ( 编辑 )(1990)， 它们通过引用并 入。
当在本文中使用时， “施用治疗有效量” 意在包括对受试者给予或施用本公开书的 药物组合物的方法， 其允许钙组合物发挥其意欲的治疗功能。治疗有效量将根据许多因素 而变化， 所述因素诸如受试者中的感染程度， 个体的年龄、 性别和体重。剂量方案可以被调 节以提供最优的治疗反应。例如， 几个分次剂量可以每日施用或剂量可以按照治疗情况的 迫切性按比例地减少。
药物组合物可以以方便的方式施用， 诸如通过注射 ( 例如， 皮下、 静脉内等 )、 口 服、 吸入、 透皮给药或直肠给药。根据给药途径， 药物组合物可以用材料包衣以保护药物组 合物免受酶、 酸和可以使药物组合物失活的其他自然条件的作用。药物组合物也可以经胃 肠外或腹膜内施用。分散液也可以在甘油、 液体聚乙二醇， 和它们的混合物中， 以及在油中 制备。在通常的贮存和使用条件下， 这些制剂可以含有防腐剂以阻止微生物的生长。
适于注射使用的药物组合物包括无菌水溶液 ( 在为水溶性的时候 ) 或分散液和用 于临时制备无菌注射溶液或分散液的无菌粉末。 组合物典型地是无菌的和是达到容易注射 程度的流体。 典型地， 组合物在制造和贮存条件下是稳定的， 并且可以被保存以防止微生物 的污染作用， 诸如细菌和真菌。载体能够是溶剂或分散介质， 其含有例如， 水、 乙醇、 多元醇 ( 例如， 甘油、 丙二醇和液体聚乙二醇， 等 )， 它们的合适混合物， 和植物油。适宜的流动性可以通过下述方法来保持， 例如， 通过使用包衣， 诸如卵磷脂， 在分散液的情况下通过保持所 需的颗粒大小， 和通过使用表面活性剂。阻止微生物的作用可以通过不同的抗细菌剂和抗 真菌剂， 例如， 对羟基苯甲酸酯、 氯丁醇、 酚、 抗坏血酸、 硫柳汞等实现。在许多情况制备， 等 渗剂例如， 糖、 多元醇诸如甘露醇、 山梨醇， 或氯化钠用于组合物中。 注射组合物的延长吸收 可以通过在组合物中包括延迟吸收剂， 例如， 单硬脂酸铝和明胶来获得。
无菌注射溶液可以根据需要， 通过在合适的溶剂中加入所需要量的药物组合物和 以上列举的成分之一或组合， 然后通过过滤灭菌来制备。 通常， 分散液通过将药物组合物加 入到含有碱性分散介质和以上列举的那些中所需要的其它成分的无菌载体中来制备。
药物组合物可以例如， 和惰性稀释剂或可吸收的食用载体一起口服施用。药物组 合物和其它成分也可以封装在硬或软壳明胶胶囊中， 压缩成片剂， 或直接加入至受试者的 膳食中。对于口服治疗施用， 药物组合物可以和赋形剂结合并以可摄取的片剂、 口含片剂、 锭剂、 胶囊、 酏剂、 混悬剂、 糖浆剂、 糯米纸囊剂等形式施用。这种组合物和制剂应该含有至 少 1％重量的活性化合物。当然， 组合物和制剂的百分比可以变化并且可以适宜地在大约 5％到大约 80％的单位重量之间。
片剂、 锭剂、 丸剂、 胶囊等也可以含有以下 ： 粘合剂， 诸如黄蓍胶、 阿拉伯树胶、 玉米 淀粉或明胶 ； 赋形剂诸如磷酸二钙 ； 崩解剂， 诸如玉米淀粉、 马铃薯淀粉、 藻酸等 ； 润滑剂， 诸如硬脂酸镁 ； 和增甜剂， 诸如蔗糖、 乳糖或糖精， 或矫味剂诸如薄荷油、 冬青油或樱桃香 精。当剂量单位形式是胶囊时， 除了以上类型的材料外， 其可以含有， 液体载体。多种其它 材料可以作为包衣存在或否则改变剂量单位的物理形式。 例如， 片剂、 丸剂或胶囊可以用虫 胶、 糖或两者包衣。糖浆剂或酏剂可以含有药剂， 作为增甜剂的蔗糖， 作为防腐剂的对羟基 苯甲酸甲酯和丙酯， 染料， 和矫味剂诸如樱桃或橙子香料。当然， 用于制备任何剂量单位形 式的任何材料应该是药学纯的和在使用的量下基本无毒的。另外， 药物组合物可以结合至 持续释放制剂和剂型中。
因此， “药学上可接受的载体” 意在包括溶剂、 分散介质、 包衣、 抗细菌剂和抗真菌 剂、 等渗和吸收延迟剂等。 用于药学活性物质的这种介质和药剂的使用是本领域公知的。 除 非任何常规的介质或药剂与药物组合物是不相容的， 否则会考虑它们在治疗性组合物和方 法中的使用。补充性活性化合物也可以加入至所述组合物中。
尤其有益的是， 以剂量单位形式配制胃肠外组合物， 以易于施用和剂量均一。 “剂 量单位形式” 当在本文中使用时， 指适合作为用于待治疗的受试者的单位剂量的物理离散 单位 ； 每个单位含有预定量的药物组合物， 其被计算为与所需要的药物载体一起产生期望 的治疗效果。 本公开书的剂量单位形式的规格与药物组合物的特性和所要获得的特定治疗 效果有关。
主要的药物组合物与合适的药学上可接受的载体以可接受的剂量单位复合， 用于 以有效量方便和有效地施用。在含有补充性活性成分的组合物的情况下， 通过参照所述成 分的常规剂量和施用方式来确定剂量。
实施例
在附图中给出了合成和用途的多个实施例。另外， 本公开书提供了下列用于中和 与阴离子寡核苷酸结合的电荷的亚磷酰胺和结构。
Alloc N1SATE
Alloc N1SATE-U
Alloc N1SATE-CPac
Alloc N1SATE-APac
Alloc N2SATE
Alloc N2SATE-U
Alloc N2SATE-CPac
Alloc N2SATE-APac
Alloc N3SATE
Alloc N3SATE-U
Alloc N3SATE-CPac
Alloc N3SATE-APac
Alloc N2SATB
Alloc N2SATB-U
Alloc N2SATB-CPac
Alloc N2SATB-APac
苯基乙酰基 N2SATE
苯基乙酰基 N2SATE-U
苯基乙酰基 N2SATE-CPac
苯基乙酰基 N2SATE-APac
苯基乙酰基 N2SATB
苯基乙酰基 N2SATB-U
Fmoc N0SATE
Fmoc N0SATE-U
Fmoc N1SATE
Fmoc N1SATE-U
Fmoc N1SATE-CAc
Fmoc N1SATE-APac
Fmoc N2SATE
Fmoc N2SATE-UFmoc N2SATE-CAc
Fmoc N2SATE-APac已经描述了本公开书的许多实施方案。 然而， 要理解的是， 在不脱离本公开书的精 神和范围的前提下， 可以作出各种改动。 因此其他实施方案包括在下列权利要求的范围内。
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