具有溶血栓活性的寡肽及其制备方法和应用 【技术领域】
本发明具有溶血栓活性的寡肽， 属于生物医药领域。背景技术 P6A(ARPAK) 为纤维蛋白 β 链降解产物之一， 具有溶血栓活性。在 P6A 的代谢研 究中发现了代谢产物 PAK。在大鼠动静脉旁路插管溶血栓模型上， PAK 的溶血栓活性比母体 P6A 强。按照一般的认识， 多肽在体内都会迅速降解。通过 PAK 的结构修饰延缓体内降解速 率和提高溶血栓活性， 是寡肽溶血栓药物研究的重要途径。
按照一般的认识， 含多肽的两亲性分子， 例如脂肪胺链修饰的多肽， 在适当的条件 下通过分子间非共价键相互作用可发生自组装， 形成纳米结构。借助纳米结构可改善多肽 在体内的输送、 延缓多肽在体内的降解速率和提高多肽的体内活性。 根据这些认识， 发明人 提出了本发明。
发明内容
本发明的目的在于提供具有溶血栓活性的寡肽， 并通过动物实验评价了这些寡肽 的溶血栓活性， 证明了本发明的寡肽具有优秀的溶血栓活性。
本发明是通过以下技术方案来实现的 ：
本发明的目的之一是提供以下结构的化合物， 通式 4a-f， 其中， n 为 6、 8、 10、 12、 14 或 16。 本发明的目的之二是提供本发明化合物的制备方法， 其特征在于， 包括如下步
骤： 1) 在二环己基碳二亚胺 (DCC) 和 N- 羟基琥珀酰亚胺 (HOSu) 存在下 Boc-Pro 在无 水 THF 中与 Ala 缩合为 Boc-Pro-Ala ；
2) 在 DCC 和 HOBt 存 在 下， Boc-Pro-Ala 在 无 水 THF 中 与 Lys(Z)-OBzl 或 Lys-(Boc)-OBzl 缩合为 Boc-Pro-Ala-Lys(Z)-OBzl 或 Boc-Pro-Ala-Lys-(Boc)-OBzl ；
3) 在 甲 醇 中 将 步 骤 2) 所 得 的 产 物 皂 化 为 Boc-Pro-Ala-Lys(Z) 或 Boc-Pro-Ala-Lys-(Boc) ；
4) 在 DCC 存在下， Boc-Asp 在无水 THF 中与饱和脂肪胺缩合为 Boc-Asp[NHCH2(CH2) nCH3]-NHCH2(CH2)nCH3， 其中， n 为 6、 8、 10、 12、 14 或 16 ；
5) 在氯化氢 - 乙酸乙酯溶液中， Boc-Asp[NHCH2(CH2)nCH3]-NHCH2(CH2)nCH3 脱去 Boc 生成 Asp[NHCH2(CH2)nCH3]-NHCH2(CH2)nCH3 ；
6) 在 DCC 和 HOBt 存在下， 步骤 3) 所得产物在无水 THF 中与步骤 5) 所得产物缩合 为 Boc-Pro-Ala-Lys(Z)-Asp[NHCH2(CH2)nCH3]-NHCH2(CH2)nCH3 或 Boc-Pro-Ala-Lys(Boc)-Asp[NHCH2(CH2)nCH3]-NHCH2(CH2)nCH3 ；
7) 当 步 骤 6) 的 产 物 为 Boc-Pro-Ala-Lys(Z)-Asp[NHCH 2 (CH 2 ) nCH3]-NHCH2(CH2)nCH3 时， 在 甲 醇、 Pd/C 和 H2 存 在 下， 将 步 骤 6) 的 产 物 氢 解， 得到 Boc-Pro-Ala-Lys-Asp[NHCH2(CH2)nCH3]-NHCH2(CH2)nCH3， 再在氯化氢 - 乙酸乙酯溶液中脱 出 Boc， 得到本发明化合物 ；
当步骤 6) 的产物为 Boc-Pro-Ala-Lys(Boc)-Asp[NHCH2(CH2)nCH3]-NHCH2(CH2)nCH3 时， 在氯化氢 - 乙酸乙酯溶液中将步骤 6) 的产物脱出 Boc， 得到本发明化合物。
本发明的目的之三是提供一种药物组合物， 该药物组合物含有治疗上有效剂量的 本发明化合物， 并含有一种或多种药学上可接受的赋型剂或者辅加剂。
本发明的目的之四是提供一种药物制剂， 该药物制剂是将本发明化合物与药学上 可接受的赋型剂或者辅加剂的混合物制成片剂、 胶囊剂、 粉剂、 颗粒剂、 锭剂或口服液。
本发明的化合物与本发明的药物组合物均可用于制备溶血栓药物。
本发明通过动物实验评价了本发明寡肽的溶血栓活性， 证明了本发明的寡肽具有 优秀的溶血栓活性。 附图说明
图 1 为本发明化合物的结构通式 ； 图 2 为本发明化合物的合成路线图 ； 图 3 为本发明化合物 4f 的透射电子显微镜照片。 在图 2 中， i)DCC、 HOBt 和 NMM ； ii)NaOH ； iii)HCl/EA ； iv)Pd/C， H2。具体实施方式 为了进一步阐述本发明， 下面给出一系列实施例。 这些实施例完全是例证性的， 它 们仅用来对本发明进行具体描述， 不应当理解为对本发明的限制。
在本发明的实施例中， 所用的以下缩略术语表示以下含义 ：
THF 四氢呋喃
HOBt N- 羟基苯并三氮唑
DCC 二环己基碳二亚胺
TLC 薄层色谱
Boc 叔丁氧羰基
实施例 1 制备 Boc-Asp[NHCH2(CH2)6CH3]-NHCH2(CH2)6CH3(1a)
将 1.17g(5mmol)Boc-Asp 用 20ml 无 水 THF 溶 解。 向 得 到 的 溶 液 中 加 入 0.68g(5mmol)N- 羟基苯并三氮唑 (HOBT)。10 分钟后， 在冰浴下加入 2.06g(10mmol) 二 环 己 基 碳 二 亚 胺 (DCC) 与 25ml 无 水 THF 的 溶 液， 得 到 反 应 液 (I)。 把 1.42g(11mmol) 得到反应液 (II)。 冰浴下将反应液 (II) NH2CH2(CH2)6CH3 溶于 10ml 无水 THF 并搅拌 30 分钟， 加入反应液 (I) 中， 然后室温搅拌 12h， TLC( 二氯甲烷 / 甲醇， 20 ∶ 1) 显示 Boc-Asp 消失。 反应混合物过滤， 滤除二环己基脲 (DCU)。滤液减压浓缩， 除去 THF。残留物用 250ml 乙酸 乙酯溶解。得到的溶液依次用饱和 NaHCO3 水溶液洗、 饱和 NaCl 水溶液洗、 5％ KHSO4 水溶液 洗和饱和 NaCl 水溶液洗。乙酸乙酯相用无水 Na2SO4 干燥、 过滤、 滤液减压浓缩至干， 残留物
经柱层析纯化， 得到 1.64g(72％ ) 目标化合物， 为无色粉末。ESI-MS(m/e) ： 457[M+H]+.
实施例 2 制备 Boc-Asp[NHCH2(CH2)8CH3]-NHCH2(CH2)8CH3(1b)
按 照 实 施 例 1 的 方 法 由 2.796g(12mmol)Boc-Asp 和 4.145g(26.4mmol) CH3(CH2)8CH2NH2 制 得 4.353g(71 ％ ) 目 标 化 合 物， 为 无 色 固 体 粉 末。ESI-MS(m/e) ： + 512[M+H] .
实施例 3 制备 Boc-Asp[NHCH2(CH2)10CH3]-NHCH2(CH2)10CH3(1c)
按 照 实 施 例 1 的 方 法 由 2g(8.6mmol)Boc-Asp 和 3.493g(18.9mmol) CH3(CH2)10CH2NH2 制得 3.31g(68％ ) 目标化合物， 为无色固体粉末。 ESI-MS(m/e) ： 568[M+H]+.
实施例 4 制备 Boc-Asp[NHCH2(CH2)12CH3]-NHCH2(CH2)12CH3(1d)
按 照 实 施 例 1 的 方 法 由 2.770(11.9mmol)Boc-Asp 和 5.572g(26.2mmol) CH3(CH2)12CH2NH2 制 得 4.815g(65 ％ ) 目 标 化 合 物， 为 无 色 固 体 粉 末。ESI-MS(m/e) ： + 624[M+H] .
实施例 5 制备 Boc-Asp[NHCH2(CH2)14CH3]-NHCH2(CH2)14CH3(1e)
按 照 实 施 例 1 的 方 法 由 2..796g(12mmol)Boc-Asp 和 6.362g(26.4mmol) CH3(CH2)14CH2NH2 制 得 3.744g(46 ％ ) 目 标 化 合 物， 为 无 色 固 体 粉 末。ESI-MS(m/e) ： + 680[M+H] . 实施例 6 制备 Boc-Asp[NHCH2(CH2)16CH3]-NHCH2(CH2)16CH3(1f)
按照实施例 1 的方法由 2.33g(10mmol)Boc-Asp 和 6.73g(25mmol)CH3(CH2)16CH2NH2 制得 3.606g(49％ ) 目标化合物， 为无色固体粉末。ESI-MS(m/e) ： 736[M+H]+.
实施例 7 制备 Asp[NHCH2(CH2)6CH3]-NHCH2(CH2)6CH3(2a)
将 2.28g(5mmol)Boc-Asp[NHCH2(CH2)6CH3]-NHCH2(CH2)6CH3 溶 解 在 20ml 4N 氯 化 氢 - 乙 酸 乙 酯 溶 液 中， 室 温 搅 拌 1 小 时， TLC( 二 氯 甲 烷 / 甲 醇， 20 ∶ 1) 显 示 Boc-Asp(NHC8H17)-NHC8H17 消失， 减压浓缩除去乙酸乙酯， 残留物反复加少量乙醚进行减压 浓缩以除去氯化氢。最后加少量乙醚将残留物研磨成 1.62g(93％ ) 目标化合物， 为无色粉 + 末。ESI-MS(m/e) ： 357[M+H] .
实施例 8 制备 Asp[NHCH2(CH2)8CH3]-NHCH2(CH2)8CH3(2b)
按照实施例 7 的方法 2.044g(4mmol)Boc-Asp[NHCH2(CH2)8CH3]-NHCH2(CH2)8CH3 制 得 1.717g(84％ ) 目标化合物， 为无色固体粉末。ESI-MS(m/e) ： 412[M+H]+..
实施例 9 制备 Asp[NHCH2(CH2)10CH3]-NHCH2(CH2)10CH3(2c)
按照实施例 7 的方法 1.5g(2.65mmol)Boc-Asp[NHCH2(CH2)10CH3]-NHCH2(CH2)10CH3 制得 1.225g(92％ ) 目标化合物， 为无色固体粉末。ESI-MS(m/e) ： 468[M+H]+.
实施例 10 制备 Asp[NHCH2(CH2)12CH3]-NHCH2(CH2)12CH3(2d)
按照实施例 7 的方法 2.0g(3.21mmol)Boc-Asp[NHCH2(CH2)12CH3]-NHCH2(CH2)12CH3 制得 1.688g(94％ ) 目标化合物， 为无色固体粉末。ESI-MS(m/e) ： 524[M+H]+.
实施例 11 制备 Asp[NHCH2(CH2)14CH3]-NHCH2(CH2)14CH3(2e)
按照实施例 7 的方法 2.716g(4mmol)Boc-Asp[NHCH2(CH2)14CH3]-NHCH2(CH2)14CH3 制 得 2.240g(82％ ) 目标化合物， 为无色固体粉末。ESI-MS(m/e) ： 580[M+H]+.
实施例 12 制备 Asp[NHCH2(CH2)16CH3]-NHCH2(CH2)16CH3(2f)
按照实施例 7 的方法 3.68g(5mmol)Boc-Asp[NHCH2(CH2)16CH3]-NHCH2(CH2)16CH3 制
得 2.86g(90％ ) 目标化合物， 为无色固体粉末。ESI-MS(m/e) ： 636[M+H]+.
实施例 13 制备 Boc-Pro-Ala
将 2.7g(12.6mmol)Boc-Pro 用 30ml 无 水 THF，向 得 到 的 溶 液 中 加 入 1.59g(13.86mmol)N- 羟 基 琥 珀 酰 亚 胺 (HOSu)。10 分 钟 后， 在冰浴的条件下加入 2.86g(13.86mmol) 二环己基碳二亚胺 (DCC) 与 20ml 无水 THF。在室温下搅拌 10h， TLC( 二 氯甲烷 / 甲醇， 30 ∶ 1) 显示 Boc-Pro 消失。滤除二环己基脲 (DCU)， 减压除去 THF。残留 物用 250ml 乙酸乙酯溶解， 5％ NaHCO3 洗三次， 收集有机相， 减压除去乙酸乙酯得白色固体， THF 溶解得反应液 (I)。 1.23g(13.86mmol)Ala 溶于 30ml 水中， 得到反应液 (II)。 冰浴下将 反应液 (II) 加入反应液 (I) 中， 饱和 NaHCO3 调 pH 至 8， 在室温下搅拌 16h， TLC( 二氯甲烷 / 甲醇， 30 ∶ 1) 显示 Boc-Pro 与 HOSu 的缩合产物消失。饱和 KHSO4 调 pH 至 7， 减压除 THF， 残 留物用饱和 KHSO4 调 pH 至 2。 得到的溶液用乙酸乙酯少量多次萃取， 收集有机相， 饱和 NaCl 水溶液洗三次。有机相用无水 Na2SO4 干燥、 过滤、 滤液减压浓缩至干， 得到 3.44g(95％ ) 目 + 标化合物， 为白色固体粉末。ESI-MS(m/e) ： 287[M+H] .
实施例 14 制备 Boc-Pro-Ala-Lys(Z)-OBzl
按 照 实 施 例 1 的 方 法 由 1.37g(4.8mmol)Boc-Pro-Ala 和 2.17g(4mmol) Lys(Z)-OBzl， 经过柱层析制得 1.56g(61％ ) 目标化合物， 为无色固体粉末。ESI-MS(m/e) ： + 639[M+H] .
实施例 15 制备 Boc-Pro-Ala-Lys(Boc)-OBzl
按 照 实 施 例 1 的 方 法 由 3.146g(11mmol)Boc-Pro-Ala 和 2.966g(10mmol) Lys(Boc)-OBzl， 经过柱层析制得 4.472g(85％ ) 目标化合物， 为无色固体粉末。ESI-MS(m/ + e) ： 529[M+H] .
实施例 16 制备 Boc-Pro-Ala-Lys(Z)
1.92g(3mmol)Boc-Pro-Ala-Lys(z)-OBzl 溶于甲醇中， 冰浴搅拌下用 2N NaOH 调 pH 至 12， 冰浴搅拌 4 小时， TLC( 二氯甲烷∶甲醇＝ 30 ∶ 1) 得 Boc-Pro-Ala-Lys(Z)-OBzl 消失。饱和 KHSO4 调 pH 至 6， 减压除甲醇。饱和 KHSO4 调 pH 至 2， 乙酸乙酯少量多次萃取， 收集有机相， 饱和 NaCl 水溶液洗三次。有机相用无水 Na2SO4 干燥、 过滤、 滤液减压浓缩至 干， 制得 1.48g(90％ ) 目标化合物， 为无色固体粉末。ESI-MS(m/e) ： 547[M-H]-.
实施例 17 制备 Boc-Pro-Ala-Lys(Boc)
按 照 实 施 例 16 的 方 法 由 2.640g(mmol)Boc-Pro-Ala-Lys(Boc)-OBzl 制 得 2.397g(93％ ) 目标化合物， 为白色固体粉末。ESI-MS(m/e) ： 515[M+H]-.
实施例 18 制备 Boc-Pro-Ala-Lys(Z)-Asp[NHCH2(CH2)6CH3]-NHCH2(CH2)6CH3(3a)
按 照 实 施 例 1 的 方 法 由 0.789g(1.44mmol)Boc-Pro-Ala-Lys(Z) 和 0.465g(1.2mmol)Asp[NHCH2(CH2)6CH3]-NHCH2(CH2)6CH3， 经过柱层析制得 0.659g(63％ ) 目标 25 化合物， 为无色粉末。 Mp 116℃； [α]D ＝ -34.0(c ＝ 0.5， 甲醇 ) ； ESI-MS(m/e) ： 872[M+H]+ ； IR(KBr) ： 3324， 3082， 3937， 2854， 1690， 1641， 1538， 1449， 1398， 1310， 1247， 1168， 1089， 1 1049 ， 980 ， 894 ， 739 ， 695 ， 648. H NMR(300MHz ， CDCl 3) ： δ /ppm ＝ 7.69-7.54(m ， 1H) ， 7.54-7.32(m， 6H)， 7.27-6.96(m， 1H)， 6.5-6.30(m， 1H)， 5.49-5.23(m， 1H)， 5.23-4.96(m， 2H)， 4.70(s， 1H)， 4.39-4.02(m， 3H)， 3.61-3.33(m， 2H)， 3.33-3.07(m， 6H)， 2.87-2.63(m， 1H)， 2.32-1.01(m， 50H)， 0.86(t， J ＝ 6.6Hz， 6H).实施例 19 制备 Boc-Pro-Ala-Lys(Boc)-Asp[NHCH2(CH2)8CH3]-NHCH2(CH2)8CH3(3b)
按 照 实 施 例 1 的 方 法 由 1.096g(2mmol)Boc-Pro-Ala-Lys(Boc) 和 0.986g(2.2mmol)Asp[NHCH2(CH2)8CH3]-NHCH2(CH2)8CH3 制得 0.567g(31 ％ ) 目标化合物， 为 + 25 无色粉末。 Mp 109℃； [α]D ＝ -47.3(c ＝ 0.56， 甲醇 ) ； ESI-MS(m/e) ： 942[M+H] ； IR(KBr) ： 3292， 3080， 2927， 2857， 1696， 1641， 1547， 1454， 1401， 1260， 1164， 1123， 1025， 1479， 702.1H NMR(300MHz， DMSO-d6) ： δ/ppm ＝ 8.15-7.89(m， 3H)， 7.88-7.79(m， 1H)， 7.54-7.42(m， 1H)， 7.41-7.18(m， 5H)， 4.99(s， 1H)， 4.55-4.38(m， 1H)， 4.38-4.19(m， 1H)， 4.17-3.03(m， 2H)， 3.09-2.89(m， 6H)， 2.12-2.03(m， 2H)， 1.88-1.72(m， 2H)， 1.72-1.57(m， 2H)， 1.55-1.48(m， 2H)， 1.45-1.28(m， 16H)， 1.28-1.09(m， 32H)， 0.86(t， J ＝ 4.8Hz， J ＝ 6.6Hz， 6H).
实施例 20 制备 Boc-Pro-Ala-Lys(Z)-Asp[NHCH2(CH2)10CH3]-NHCH2(CH2)10CH3(3c)
按照实施例 1 的方法由 1.458g(2.2mmol)Boc-Pro-Ala-Lys(Z) 和 1.007g(2mmol) Asp[NHCH2(CH2)10CH3]-NHCH2(CH2)10CH3 制 得 857mg(45 ％ ) 目 标 化 合 物， 为 无 色 粉 末。 IR(KBr) ： 3289， 3088， 2925， 2859， 19601641， 1547， 1455.51， 1400， 1304， 1260， 1164， 1121， + 1 1025， 980， 918， 767， 696， 579.ESI-MS(m/e) ： 1020[M+Na] . H NMR(300MHz， DMSO-d6) ： δ/ ppm ＝ 8.07-7.98(m， 3H)， 7.83(s， 1H)， 7.45(s， 1H)， 7.34(s， 5H)， 7.18(s， 1H)， 5.0(s， 2H)， 4.49-4.36(m ， 2H) ， 4.10(s ， 2H) ， 3.01-2.95(m ， 7H) ， 2.74(s ， 1H) ， 2.33(s ， 1H) ， 2.07(s ， 1H)， 1.87-1.77(m， 4H)， 1.69-1.65(m， 2H)， 1.65-1.55(m， 2H)， 1.39(s， 6H)， 1.32(s， 11H)， 1.23(s， 40)， 0.87-0.83(t， J ＝ 6.3HzJ ＝ 6.9Hz 3H).
实施例 21 制备 Boc-Pro-Ala-Lys(Z)-Asp[NHCH2(CH2)12CH3]-NHCH2(CH2)12CH3(3d)
按 照 实 施 例 1 的 方 法 由 1.069g(1.95mmol)Boc-Pro-Ala-Lys(Z) 和 0.785g(1.5mmol)Asp[NHCH2(CH2)12CH3]-NHCH2(CH2)12CH3 制得 0.664g(42％ ) 目标化合物， 为 + 1 无色粉末。ESI-MS(m/e) ： 1055[M+H] . H NMR(300MHz， DMSO-d6) ： δ/ppm ＝ 8.05-7.94(m， 3H) ， 7.85(s ， 1H) ， 7.46(s ， 1H) ， 7.34(s ， 5H) ， 7.20(s ， 1H) ， 5.00(s ， 2H) ， 4.41(s ， 1H) ， 4.10-4.00(m ， 4H) ， 3.06-2.96(m 8H) ， 2.73(s ， 1H) ， 2.28(s ， 1H) ， 2.06(s ， 1H) ， 1.99(s ， 1H) ， 1.76(s ， 4H) ， 1.64(s ， 2H) ， 1.52(s ， 2H) ， 1.38(s ， 6H) ， 1.32(s ， 13H) ， 1.23(s ， 44H) ， 0.87-0.83(t， J ＝ 6.3Hz J ＝ 6.3Hz 3H).
实 施 例 22 制 备 Boc-Pro-Ala-Lys(Boc)-Asp[NHCH2(CH2)14CH3]-NHCH2(CH2)14CH3(3 e)
按 照 实 施 例 1 的 方 法 由 0.514g(1mmol)Boc-Pro-Ala-Lys(Boc) 和 0.677g(1.1mmol)Asp[NHCH2(CH2)14CH3]-NHCH2(CH2)14CH3 制 得 370mg(34 ％ ) 目 标 化 合 物， 为 无 色 粉 末。Mp 99 ℃ ； [α]D25 ＝ -42.5(c ＝ 0.65， 甲醇 )； ESI-MS(m/e) ： 1075[M+H]+ ； 1098[M+Na]+， IR(KBr) ： 3289， 3088， 2923， 2853， 1690， 1642， 1544， 1462， 1397， 1364， 1456， 1 1249， 1170， 718. H NMR(300MHz， DMSO-d6) ： δ/ppm ＝ 8.09-7.82(m， 4H)， 6.22-6.05(m， 2H) ， 4.92-4.19(m ， 4H) ， 3.37-3.09(m ， 10H) ， 2.18-1.62(m ， 8H) ， 1.62-1.1.18(m ， 68H) ， 0.89-0.84(m， 6H).
实施例 23 制备 Boc-Pro-Ala-Lys(Z)-Asp[NHCH2(CH2)16CH3]-NHCH2(CH2)16CH3(3f)
按照实施例 1 的方法由 0.658g(1.2mmol)Boc-Pro-Ala-Lys(Z) 和 0.635g(1mmol) Asp[NHCH2(CH2)16CH3]-NHCH2(CH2)16CH3 制 得 0.606g(52 ％ ) 目 标 化 合 物， 为 无 色 粉 末。Mp + 25 110 ℃ ； [α]D ＝ -31.8(c ＝ 0.6， 甲醇 ) ； ESI-MS(m/e) ： 1166[M+H] ； IR(KBr) ： 3294， 3073，2922， 2853， 1693， 1642， 1544， 1456， 1400， 1257， 1257， 1165， 1123， 1021， 697.1H NMR(300MHz， CDCl3) ： δ/ppm ＝ 7.46-7.31(m， 5H)， 6.76-6.59(m， 1H)， 5.11(s， 2H)， 4.78-4.68(m， 1H)， 4.50-4.09(m， 3H)， 3.81-3.59(m， 1H)， 3.59-3.37(m， 3H)， 3.29-3.11(m， 5H)， 2.89-2.72(m， 1H)， 2.60-2.31(m， 1H)， 2.05(s， 3H)， 2.0-1.78(m， 5H)， 1.78-1.63(m， 3H)， 1.57-1.43(m， 14H)， 1.43-1.38(m， 5H)， 1.38-1.20(m， 56H)， 0.89(t， J ＝ 4.8Hz， J ＝ 6.6Hz， 6H).
实施例 24 制备 Boc-Pro-Ala-Lys-Asp[NHCH2(CH2)6CH3]-NHCH2(CH2)6CH3
将 0.871g(1mmol)Boc-Pro-Ala-Lys(Z)-Asp[NHCH 2(CH 2) 6CH 3]-NHCH 2-(CH 2) 6C H3 用 25ml 甲醇溶解， 往溶液中加入 0.15g Pd/C， 通 H2(0.02Mba) 室温搅拌至 Boc-Pro-A la-Lys(Z)-Asp[NHCH2(CH2)6CH3]-NHCH2(CH2)6CH3 消 失。 滤 除 Pd/C、 滤液减压浓缩至干得 + 0.691g(92％ ) 目标化合物， 为无色粉末。ESI-MS(m/e) ： 752[M+H] .
实施例 25 制备 Boc-Pro-Ala-Lys-Asp[NHCH2(CH2)10CH3]-NHCH2(CH2)10CH3
按照实施例 24 的方法由 0.997g(1mmol)Boc-Pro-Ala-Lys(Z)-Asp[NHCH2(CH2)10CH 为无色粉末。ESI-MS(m/e) ： 865[M+H]+. 3]-NHCH2(CH2)10CH3 制得 0.804(93％ ) 目标化合物，
实施例 26 制备 Boc-Pro-Ala-Lys-Asp[NHCH2(CH2)12CH3]-NHCH2(CH2)12CH3
按照实施例 24 的方法由 0.954g(1mmol)Boc-Pro-Ala-Lys(Z)-Asp[NHCH2(CH2)12CH ]-NHCH2(CH2)12CH3 制得 0.747g(91％ ) 目标化合物， 为无色粉末。 ESI-MS(m/e) ： 921[M+H]+.
实施例 27 制备 Boc-Pro-Ala-Lys-Asp[NHCH2(CH2)16CH3]-NHCH2(CH2)16CH3
按 照 实 施 例 24 的 方 法 由 1.165g(1mmol)Boc-Pro-Ala-Lys(Z)-Asp[NHCH2(CH2 )16CH3]-NHCH2(CH2)16CH3， 制 得 0.928g(90 ％ ) 目 标 化 合 物， 为 无 色 粉 末。ESI-MS(m/e) ： + 1032[M+H] .
实施例 28 制备 Pro-Ala-Lys-Asp[NHCH2(CH2)6CH3]-NHCH2(CH2)6CH3(4a)
按照实施例 7 的方法 0.376g(0.5mmol) 由 Boc-Pro-Ala-Lys-Asp[NHCH2-(CH2)6CH3 ]-NHCH2(CH2)6CH3 制得 0.293g(90％ ) 目标化合物， 为无色粉末。Mp93℃； [α]D25 ＝ -45.8(c ＝ 0.70，甲 醇 ) ； ESI-MS(m/e) ： 653[M+H]+ ； IR(KBr) ： 3291， 3060， 2927， 2857， 1644， 1547， 1 1456， 1379， 1249， 1156， 710 ； H NMR(300MHz， DMSO) ： δ/ppm ＝ 8.80-8.74(d， J ＝ 6.9Hz， 1H)， 8.27-8.21(d， J ＝ 7.2Hz， 1H)， 8.10-8.04(d， J ＝ 7.8Hz， 1H)， 7.95-7.84(m， 4H)， 7.65-7.58(s， 1H)， 4.50-4.31(m， 2h)， 4.25-4.10(m， 2H)， 3.28-3.11(m， 3H)， 3.10-2.89(m， 4H) ， 2.79-2.65(m ， 2H) ， 2.35-2.26(m ， 1H) ， 1.97-1.79(m ， 3H) ， 1.62-1.47(m ， 4H) ， 1.46-1.11(m， 29H)， 0.79-0.91(t， J ＝ 5.7Hz， 6H).
实施例 29 制备 Pro-Ala-Lys-Asp[NHCH2(CH2)8CH3]-NHCH2(CH2)8CH3(4b)
按 照 实 施 例 7 的 方 法 由 Boc-Pro-Ala-Lys(Boc)-Asp[NHCH2(CH2)8CH3]-NHCH2(CH 目标化合物， 为无色粉末。Mp 105 ℃ ； [α]D25 ＝ -51.8(c 2)8CH30.150g 制得 109g(79 ％ )， ＝ 0.75，甲 醇 ) ； ESI-MS(m/e) ： 708[M+H]+ ； IR(KBr) ： 3289， 3073， 2924， 2855， 1642， 1547， 1 1457， 1382， 1238， 1164， 1053， 712， H-NMR(300MHz， DMSO-d6) ： δ/ppm ＝ 8.67-8.57(m， 1H)， 8.38-8.17(m， 2H)， 8.02-7.94(m， 1H)， 7.64-7.56(m， 1H)， 4.49-4.30(m， 3H)， 3.09-2.93(m， 6H)， 2.73(s， 2H)， 2.29(s， 1H)， 2.21-2.10(m， 1H)， 1.87-1.44(m， 14H)， 1.44-0.97(m， 42H)， 0.85(t， J ＝ 5.1Hz， J ＝ 6.9Hz， 6H).
实施例 30 制备 Pro-Ala-Lys-Asp[NHCH2(CH2)10CH3]-NHCH2(CH2)10CH3(4c)
按 照 实 施 例 7 的 方 法 由 0.432g(0.5mmol)Boc-Pro-Ala-Lys-Asp[NHCH2(CH2)10C3H3]-NHCH2(CH2)10 制 得 0.336g(88 ％ ) 目 标 化 合 物， 为 无 色 粉 末。[α]D25 ＝ -33.43(c ＝ 节 .57， 甲醇 ) ； IR(KBr) ： 3290， 2922， 2853， 1643， 1546， 1463， 1378， 1294， 1221， 1160， 714.1H NMR(300MHz， DMSO-d6) ： δ/ppm ＝ 8.79-8.77(d， J ＝ 6.9Hz， 1H)， 8.26-8.24(d， J ＝ 7.2Hz， 1H)， 8.10-7.95(m， 2H)， 7.61(m， 3H)， 4.74-4.34(m， 2H)， 4.20-4.13(m， 2H)， 3.26-3.17(m， 2H)， 3.10-2.90(m， 2H)， 2.46-2.28(m， 3H)， 1.87(s， 3H)， 1.68-1.45(m， 5H)， 1.4-1.28(m， 11H)， 1.25(s， 36H)， 0.87-0.83(t， J ＝ 5.4Hz， 6H).
实施例 31 制备 Pro-Ala-Lys-Asp[NHCH2(CH2)12CH3]-NHCH2(CH2)12CH3(4d)
按 照 实 施 例 7 的 方 法 由 185mg(0.18mmol)Boc-Pro-Ala-Lys-Asp[NHCH2(CH2) 为 无 色 粉 末。Mp 109 ℃ ； [α] 12CH3]-NHCH2(CH2)12CH3 制 得 152mg(94 ％ ) 目 标 化 合 物， + 25 ＝ -58(c ＝ 0.50，氯 仿 ) ； ESI-MS(m/e) ： 822[M+H] ； IR(KBr) ： 3944， 3433， 3298， 3229， D 2922， 2855， 2749， 1742， 1647， 1545， 1462， 1387， 1344， 1292， 1221， 1169， 1067， 1003， 723.1H NMR(300MHz， DMSO-d6) ： δ/ppm ＝ 10.07(s， 1H)， 8.39(d， J ＝ 7.8Hz， 1H)， 8.12(d， J ＝ 7.8Hz， 1H)， 4.66-4.62(m， 1H)， 4.36-4.31(m， 1H)， 4.26-4.18(m， 2H)， 4.02-3.99(m， 4H)， 3.24-3.17(m， 2H)， 2.74-2.72(m， 4H)， 2.34-2.29(m， 1H)， 1.91-1.85(m， 3H)， 1.68-1.52(m， 9H)， 1.27-1.23(m， 49H)， 0.86(t， J ＝ 5.7Hz， J ＝ 6.6Hz， 6H). 实施例 32 制备 Pro-Ala-Lys-Asp[NHCH2(CH2)14CH3]-NHCH2(CH2)14CH3(4e)
按 照 实 施 7 的 方 法 由 0.100g(0.09mmol)Boc-Pro-Ala-Lys(Boc)-Asp[NHCH2(CH2 )14CH3]-NHCH2(CH2)14CH3 制得 0.078g(81 ％ ) 目标化合物， 为无色粉末。Mp 104 ℃ ； [α]D25 ＝ -19.7(c ＝ 0.50，甲 醇 ) ； ESI-MS(m/e) ： 877[M+H]+ ； IR(KBr) ： 3489， 3293， 3069， 2921， 1 2852， 1644， 1551， 1465， 1372， 1303， 1229， 1146， 1075， 718， 510. H NMR(300MHz， DMSO-d6) ： δ/ppm ＝ 8.07-7.82(m， 4H)， 8.07-7.82(m， 4H)， 5.68-5.56(m， 3H)， 4.56-4.12(m， 3H)， 4.56-4.12(m， 3H)， 2.88-2.65(m， 5H)， 1.96-1.82(m， 6H)， 1.82-1.68(m， 7H)， 1.68-1.57(m， 8H)， 1.57-1.43(m， 8H)， 1.43-1.13(m， 57H)， 0.86(m， 6H).
实施例 33 制备 Pro-Ala-Lys-Asp[NHCH2(CH2)16CH3]-NHCH2(CH2)16CH3(4f)
按照实施例 7 的方法由 0.52g(0.5mmol)Boc-Pro-Ala-Lys-Asp[NHCH2(CH2)16CH3]NHCH2(CH2)16CH3 制得 0.42g(89％ ) 目标化合物， 为无色粉末。Mp 97℃ ； [α]D25 ＝ -11.4(c ＝ 0.56，甲 醇 ) ； ESI-MS(m/e) ： 933[M+H]+ ； IR(KBr) ： 3289， 3068， 2919， 2851， 1644， 1546， 1463， 1376， 1244， 1164， 714 ； 1H-NMR(300MHz， DMSO-d6) ： δ/ppm ＝ 8.32-7.73(m， 5H)， 7.41-7.23(m， 1H)， 4.40-3.98(m， 4H)， 3.70-3.49(m， 3H)， 3.27-3.14(m， 6H)， 2.74(s， 3H)， 2.35-2.20(m， 2H)， 2.03-1.42(m， 19H)， 1.41-1.02(m， 59H)， 0.86-0.84(t， J ＝ 5.1Hz， J ＝ 7.2Hz， 6H).
实验例 14a-f 的溶血栓活性
将 200-220g 雄性 SD 大鼠用 20％乌拉坦溶液 (6ml/kg， i.p.) 进行麻醉。麻醉大 鼠仰卧位固定， 分离右颈总动脉， 于近心端夹动脉夹， 近心端和远心端分别穿入手术线， 将 远心端的手术线于皮毛用止血钳夹紧， 在远心端插管， 松开动脉夹， 放出约 1ml 动脉血并装 在 1ml 的 EP 管中。往垂直固定的玻璃管 ( 长 15mm， 内径 2.5mm， 外径 5.0mm， 管底用胶塞密 封 ) 中注入 0.1ml 大鼠动脉血液， 往管内迅速插入一支不锈钢质料的血栓固定螺栓。该血 栓固定螺旋用直径为 0.2mm 的不锈钢丝绕成， 螺旋部分长 12mm， 含 15 个螺圈， 螺圈的直径为 1.0mm， 托柄与螺旋相连， 长 7.0mm， 呈问号型。血液凝固 15min 后， 打开玻璃管底部的胶塞，
用镊子固定血栓固定螺旋的托柄， 从玻璃管中取出被血栓包裹的血栓固定螺旋， 精确称重。
旁路插管由 3 段构成， 中段为聚乙烯胶管， 长 60mm， 内径 3.5mm， 两端为相同的聚乙 烯管， 长 100mm， 内径 1mm， 外径 2mm， 该管的一端拉成尖管 ( 用于插入大鼠颈动脉或静脉 )， 外径 1mm， 另一端的外部套一段长 7mm， 外径 3.5mm 的聚乙烯管 ( 加粗， 用于插入中段的聚乙 烯胶管内 )。3 段管的内壁均硅烷化。将血栓包裹的血栓固定螺旋放入中段聚乙烯胶管内， 胶管的两端分别与两根聚乙烯的加粗端相套。 用注射器通过尖管端将管中注满肝素生理盐 水溶液 (50IU/kg) 备用。
分离大鼠的左颈外静脉， 近心端和远心端分别穿入手术线， 在暴露的左颈外静脉 上小心地剪一斜口， 将上面制备好的旁路管道的尖管由斜口插入左颈外静脉开口的近心 端， 同时远离旁路管中段 ( 含精确称重的血栓固定螺旋 ) 内血栓固定螺旋的托柄。用注射 器通过另一端的尖管推入准确量的肝素生理盐水 (50IU/kg)， 此时注射器不撤离聚乙烯管， 用止血钳夹住注射器与聚乙烯管之间的软管。在右颈总动脉的近心端用动脉夹止血， 在离 动脉夹不远处将右颈总动脉小心地剪一斜口。从聚乙烯管的尖部拔出注射器， 将聚乙烯管 的尖部插入动脉斜口的近心端。旁路管道的两端都用 4 号手术缝线与动静脉固定。
用头皮针将生理盐水 (3ml/kg)， 尿激酶的生理盐水溶液 (20000IU/kg) 或不同浓 度本发明化合物的生理盐水溶液通过旁路管的中段 ( 含精确称重的血栓固定螺旋 )， 刺入 远离血栓固定螺旋的近静脉处， 打开动脉夹， 使血流通过旁路管道从动脉流向静脉， 此即大 鼠动静脉旁路溶栓模型， 缓慢将注射器中的液体注入到血液中 ( 约 6min)， 使生理盐水 ( 空 白对照 )， 尿激酶 ( 阳性对照 ) 或本发明的化合物通过血液循环， 按静脉 - 心脏 - 动脉的顺 序作用到血栓上。 从开始注射时计时， 1h 后从旁路管道中取出血栓固定螺旋， 精确称重。 计 算每只大鼠旁路管道中血栓固定螺旋给药前后的质量差， 统计并评价化合物的体内溶栓活 性。结果见表 1。
表 1 1nmol/kg 4a-f 对大鼠血栓减重的影响 a
a)n ＝ 10， 血栓湿重用均值 ±SDmg 表示 ； b) 与生理盐水组相比， p ＜ 0.01。
实验例 2 剂量对 4f 体内溶血栓活性的影响
按照实验例 1 的实验方法， 选取溶栓效果最好的 4f 考察 1nmol/kg、 0.1nmol/kg 和 0.01nmol/kg 三个剂量下的溶栓活性。结果如表 2 所示。结果表明， 4f 的溶栓作用显示剂 量依赖性。
表2
表 2 为 4f 的剂量对大鼠血栓减重的影响 a， 其中， a 表示样本数， 即所用大鼠的 个数， a)n ＝ 10， 血栓减重用均值 ±SD mg 表示 ； b) 与生理盐水及 0.1nmol/kg 4f 组比， p ＜ 0.01 ； c) 与生理盐水及 0.01nmol/kg 4f 组比， p ＜ 0.05 ； d) 与生理盐水相比， p ＜ 0.01。
实验例 2 水溶液中 4a-f 的纳米球的粒径
1) 水溶液中 4a-f 纳米球的粒径
在激光散射粒度仪上观察了 25℃和 37℃时 4a-f 在 10-4M、 10-5M 和 10-6M 水溶液中 形成的纳米球的粒径。结果如表 3 所示， 结果表明， 4a-f 在水溶液中可组装为纳米球， 25℃ 时粒径为 166 至 554nm， 37℃时粒径为 141 至 291nm。
表3
2)4a-f 的纳米球的形态
将 4a-f 配成浓度为 1×10-12mg/ml 的水溶液， 然后将此溶液滴在铜网上， 挥发干 溶剂后在 JEM-1230 透射电子显微镜下观察纳米球的形态。以 4f 为例， 4f 的透射电子显微 镜照片如图 3 所示。从图 3 可知， 4a-f 形成规则的纳米球。