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具有免疫调节剂的PH敏感释放的靶向合成纳米载体.pdf

上传人：b*** 文档编号：846487 上传时间：2018-03-15 格式：PDF 页数：64 大小：1.22MB
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摘要
申请专利号：

CN201080028109.6

 申请日：

2010.05.26
公开号：

CN102481374A

 公开日：

2012.05.30
当前法律状态：

实审

 有效性：

审中
法律详情：

实质审查的生效IPC(主分类):A61K 47/48申请日:20100526|||公开
IPC分类号：

A61K47/48; A61K39/385; A61K39/39; A61P37/04; A61K9/16

 主分类号：

A61K47/48
申请人：

西莱克塔生物科技公司
发明人：

查尔斯·泽普; 高云; 马克·J·基根; 萨姆·鲍德温; 付芬妮; 洛伊德·约翰斯顿; 格雷森·B·利甫福德
地址：

美国马萨诸塞州
优先权：

2009.05.27 US 61/217,124; 2009.05.27 US 61/217,117; 2009.05.27 US 61/217,116; 2009.05.27 US 61/217,129
专利代理机构：

北京集佳知识产权代理有限公司 11227

 代理人：

顾晋伟;彭鲲鹏
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内容摘要

本发明涉及靶向细胞中作用位点的合成纳米载体的组合物、以及相关方法，这些细胞例如抗原递呈细胞(APC)，并且包括以一种pH敏感方式从合成纳米载体离解的免疫调节剂。还披露了多种组合物和方法，这些组合物和方法涉及胶囊化不稳定的免疫调节剂的合成纳米载体，这些免疫调节剂以一种pH敏感的方式从这些合成纳米载体解离。

权利要求书

1： 一种组合物， 包括 ： 合成纳米载体， 包括一种偶合到该合成纳米载体上的免疫调节剂 ； 其中该免疫调节剂根据以下关系从该合成纳米载体解离 ： IArel(4.5)24％ /IArel(7.4)24％≥ 1.2 ； 其中 IArel(4.5)24％被定义为在 pH ＝ 4.5， 将该合成纳米载体暴露于体外水环境 24 小 时， 释放的免疫调节剂的重量除以在 pH ＝ 4.5， 将该合成纳米载体暴露于体外水环境 24 小 时， 释放的免疫调节剂的重量加上在 pH ＝ 4.5， 将该合成纳米载体暴露于体外水环境 24 小 时， 保留在该合成纳米载体中的免疫调节剂的重量之和， 表示为重量百分数， 并且被取作跨 合成纳米载体样品的平均数 ； 并且 其中 IArel(7.4)24％被定义为在 pH ＝ 7.4， 将该合成纳米载体暴露于体外水环境 24 小 时， 释放的免疫调节剂的重量除以在 pH ＝ 7.4， 将该合成纳米载体暴露于体外水环境 24 小 时， 释放的免疫调节剂的重量加上在 pH ＝ 7.4， 将该合成纳米载体暴露于体外水环境 24 小 时， 保留在该合成纳米载体中的免疫调节剂的重量之和， 表示为重量百分数， 并且被取作跨 合成纳米载体样品的平均数。
2： 如权利要求 1 所述的组合物， 其中该免疫调节剂经由一个免疫调节剂偶合部分偶合 到该合成纳米载体上。
3： 如权利要求 1 所述的组合物， 其中该免疫调节剂被胶囊化在该合成纳米载体内。 4. 如权利要求 3 所述的组合物， 其中该免疫调节剂包括一种不稳定的免疫调节剂。 5. 如权利要求 4 所述的组合物， 其中该不稳定的免疫调节剂包括一种咪唑并喹啉、 一 种腺嘌呤衍生物、 或包括 5’ -CG-3’ 的一种寡核苷酸， 其中 C 未甲基化并且其中该寡核苷酸 包括一个主链， 该主链包括一个或多个不稳定的核苷酸间连键。 6. 如权利要求 5 所述的组合物， 其中该咪唑并喹啉包括一种咪唑并喹啉胺、 一种咪唑 并吡啶胺、 一种 6， 7- 稠合的环烷基咪唑并吡啶胺、 一种咪唑并喹啉胺、 咪喹莫特、 或瑞喹莫 德。 7. 如权利要求 5 所述的组合物， 其中该寡核苷酸的主链不包括稳定化的化学修饰， 这 些修饰的功能是在生理条件下稳定化该主链。 8. 如权利要求 7 所述的组合物， 其中该寡核苷酸的主链包括一个未被修饰以结合稳定 化学修饰的硫代磷酸酯的主链。 9. 如权利要求 1-3 中任意一项所述的组合物， 其中该免疫调节剂是一种佐剂。 10. 如权利要求 9 所述的组合物， 其中该佐剂包括一种 Toll 样受体 (TLR) 激动剂。 11. 如权利要求 10 所述的组合物， 其中该 TLR 激动剂是一种 TLR3 激动剂、 TLR7 激动 剂、 TLR8 激动剂、 TLR7/8 激动剂或一种 TLR9 激动剂。 12. 如权利要求 10 或 11 所述的组合物， 其中该 TLR 激动剂是一种免疫刺激核酸。 13. 如权利要求 12 所述的组合物， 其中该免疫刺激核酸是一种免疫刺激 DNA 或免疫刺 激 RNA。 14. 如权利要求 12 或 13 所述的组合物， 其中该免疫刺激核酸是一种含有 CpG 的免疫刺 激核酸， 它包括一种或多种稳定化学修饰， 这些修饰的功能是在生理条件下稳定化该主链。 15. 如权利要求 9 所述的组合物， 其中该佐剂包括一种通用 T- 细胞抗原。 16. 如权利要求 1-15 中任意一项所述的组合物， 其中这些合成纳米载体进一步包括一 2 种 B 细胞抗原和 / 或一种 T 细胞抗原。 17. 如权利要求 1-16 中任意一项所述的组合物， 其中这些合成纳米载体进一步包括一 种抗原递呈细胞 (APC) 靶向特征。 18. 如权利要求 1-17 中任意一项所述的组合物， 其中这些合成纳米载体包括一种或多 种可生物降解的聚合物。 19. 如权利要求 18 所述的组合物， 其中该免疫调节剂经由该免疫调节剂偶合部分偶合 到这一种或多种可生物降解的聚合物上。 20. 如权利要求 18 或 19 所述的组合物， 其中该可生物降解的聚合物包括聚 ( 丙交酯 )、 聚 ( 乙交酯 )、 或聚 ( 丙交酯乙交酯 ) 共聚物。 21. 如权利要求 18-20 中任意一项所述的组合物， 其中如使用凝胶渗透色谱法确定的 那样， 这些可生物降解的聚合物具有范围从 800 道尔顿至 10,000 道尔顿的重均分子量。 22. 如权利要求 2 和 9-21 中任意一项所述的组合物， 其中该免疫调节剂偶合部分包括 一个酰胺键。 23. 如权利要求 2 和 9-21 中任意一项所述的组合物， 其中该免疫调节剂偶合部分包括 一个酯键。 24. 如权利要求 1-23 中任意一项所述的组合物， 其中这些合成纳米载体包括脂基纳米 颗粒， 聚合物纳米颗粒， 金属纳米颗粒， 表面活性剂基乳液， 树枝状化合物， 巴奇球， 纳米线， 病毒状颗粒， 肽或蛋白基颗粒， 包括纳米材料、 球状纳米颗粒、 立方纳米颗粒、 锥形纳米颗 粒、 长方形纳米颗粒、 圆柱形纳米颗粒、 或环形纳米颗粒的一种组合的纳米颗粒。 25. 一种组合物， 包括 ： 合成纳米载体， 包括一种偶合到该合成纳米载体上的免疫调节剂 ； 其中该免疫调节剂根据以下关系从该合成纳米载体解离 ： IA(4.5)24/IA(4.5)6 ≥ 1.2 ； 其中 IA(4.5)24 被定义为在 pH ＝ 4.5， 将该合成纳米载体暴露于体外水环境 24 小时， 取作跨合成纳米载体样品的平均数的释放的免疫调节剂的重量 ； 并且 其中 IA(4.5)6 被定义为在 pH ＝ 4.5， 将该合成纳米载体暴露于体外水环境 6 小时， 取 作跨合成纳米载体样品的平均数的释放的免疫调节剂的重量。 26. 如权利要求 25 所述的组合物， 其中该免疫调节剂包括胶囊化在该合成纳米载体内 的一种不稳定的免疫调节剂。 27. 如权利要求 26 所述的组合物， 其中该不稳定的免疫调节剂包括一种咪唑并喹啉、 一种腺嘌呤衍生物、 或包括 5’ -CG-3’ 的一种寡核苷酸， 其中 C 未甲基化并且其中该寡核苷 酸包括一个主链， 该主链包括一个或多个不稳定的核苷酸间连键。 28. 如权利要求 27 所述的组合物， 其中该咪唑并喹啉包括一种咪唑并喹啉胺、 一种咪 唑并吡啶胺、 一种 6， 7- 稠合的环烷基咪唑并吡啶胺、 一种咪唑并喹啉胺、 咪喹莫特、 或瑞喹 莫德。 29. 如权利要求 27 所述的组合物， 其中该寡核苷酸的主链不包括稳定化的化学修饰， 这些修饰的功能是在生理条件下稳定化该主链。 30. 如权利要求 29 所述的组合物， 其中该寡核苷酸的主链包括一个未被修饰以结合稳 定化学修饰的硫代磷酸酯的主链。 3 31. 一种组合物， 包括 ： 合成纳米载体， 包括一种偶合到该合成纳米载体上的免疫调节剂 ； 其中该免疫调节剂根据以下关系从该合成纳米载体解离 ： 6 ≤ IA(4.5)24/IA(4.5)6 ≥ 1.2 ； 其中 IA(4.5)24 被定义为在 pH ＝ 4.5， 将该合成纳米载体暴露于体外水环境 24 小时， 取作跨合成纳米载体样品的平均数的释放的免疫调节剂的重量 ； 并且 其中 IA(4.5)6 被定义为在 pH ＝ 4.5， 将该合成纳米载体暴露于体外水环境 6 小时， 取 作跨合成纳米载体样品的平均数的释放的免疫调节剂的重量。 32. 如权利要求 31 所述的组合物， 其中该免疫调节剂包括胶囊化在该合成纳米载体内 的一种不稳定的免疫调节剂。 33. 如权利要求 32 所述的组合物， 其中该不稳定的免疫调节剂包括一种咪唑并喹啉、 一种腺嘌呤衍生物、 或包括 5’ -CG-3’ 的一种寡核苷酸， 其中 C 未甲基化并且其中该寡核苷 酸包括一个主链， 该主链包括一个或多个不稳定的核苷酸间连键。 34. 如权利要求 33 所述的组合物， 其中该咪唑并喹啉包括一种咪唑并喹啉胺、 一种咪 唑并吡啶胺、 一种 6， 7- 稠合的环烷基咪唑并吡啶胺、 一种咪唑并喹啉胺、 咪喹莫特、 或瑞喹 莫德。 35. 如权利要求 33 所述的组合物， 其中该寡核苷酸的主链不包括稳定化的化学修饰， 这些修饰的功能是在生理条件下稳定化该主链。 36. 如权利要求 35 所述的组合物， 其中该寡核苷酸的主链包括一个未被修饰以结合稳 定化学修饰的硫代磷酸酯的主链。 37. 如权利要求 25 或 31 所述的组合物， 其中该免疫调节剂经由一个免疫调节剂偶合部 分偶合到该合成纳米载体上。 38. 如权利要求 25 或 31 所述的组合物， 其中该免疫调节剂被胶囊化在该合成纳米载体 内。 39. 如权利要求 25、 31、 或 37 所述的组合物， 其中该免疫调节剂是一种佐剂。 40. 如权利要求 39 所述的组合物， 其中该佐剂包括一种 Toll 样受体 (TLR) 激动剂。 41. 如权利要求 40 所述的组合物， 其中该 TLR 激动剂是一种 TLR3 激动剂、 TLR7 激动 剂、 TLR8 激动剂、 TLR7/8 激动剂或一种 TLR9 激动剂。 42. 如权利要求 40 或 41 所述的组合物， 其中该 TLR 激动剂是一种免疫刺激核酸。 43. 如权利要求 42 所述的组合物， 其中该免疫刺激核酸是一种免疫刺激 DNA 或免疫刺 激 RNA。 44. 如权利要求 42 或 43 所述的组合物， 其中该免疫刺激核酸是一种含有 CpG 的免疫刺 激核酸， 它包括一种或多种稳定化学修饰， 这些修饰的功能是在生理条件下稳定化该主链。 45. 如权利要求 39 所述的组合物， 其中该佐剂包括一种通用 T- 细胞抗原。 46. 如权利要求 25-45 中任意一项所述的组合物， 其中该合成纳米载体进一步包括一 种 B 细胞抗原和 / 或一种 T 细胞抗原。 47. 如权利要求 25-46 中的任意一项所述的组合物， 其中该合成纳米载体进一步包括 一种抗原递呈细胞 (APC) 靶向特征。 48. 如权利要求 25-47 中任意一项所述的组合物， 其中这些合成纳米载体包括一种或 4 多种可生物降解的聚合物。 49. 如权利要求 48 所述的组合物， 其中该免疫调节剂经由该免疫调节剂偶合部分偶合 到这一种或多种可生物降解的聚合物上。 50. 如权利要求 48 或 49 所述的组合物， 其中该可生物降解的聚合物包括聚 ( 丙交酯 )、 聚 ( 乙交酯 )、 或聚 ( 丙交酯乙交酯 ) 共聚物。 51. 如权利要求 48-50 中任意一项所述的组合物， 其中如使用凝胶渗透色谱法确定的 那样， 这些可生物降解的聚合物具有范围从 800 道尔顿至 10,000 道尔顿的重均分子量。 52. 如权利要求 37 和 39-51 中任意一项所述的组合物， 其中该免疫调节剂偶合部分包 括一个酰胺键。 53. 如权利要求 37 和 39-51 中任意一项所述的组合物， 其中该免疫调节剂偶合部分包 括一个酯键。 54. 如权利要求 25-53 中任意一项所述的组合物， 其中这些合成纳米载体包括脂基纳 米颗粒， 聚合物纳米颗粒， 金属纳米颗粒， 表面活性剂基乳液， 树枝状化合物， 巴奇球， 纳米 线， 病毒状颗粒， 肽或蛋白基颗粒， 包括纳米材料、 球状纳米颗粒、 立方纳米颗粒、 锥形纳米 颗粒、 长方形纳米颗粒、 圆柱形纳米颗粒、 或环形纳米颗粒的一种组合的纳米颗粒。 55. 如权利要求 1-54 中任意一项所述的组合物， 进一步包括一种药学上可接受的赋形 剂。 56. 一种组合物， 包括一种疫苗， 该疫苗包括如权利要求 1-55 中任意一项所述的组合 物。 57. 一种方法， 包括 ： 将如权利要求 1-56 中任意一项所述的组合物给予一个受试者。 58. 如权利要求 57 所述的方法， 其中该组合物以一个有效诱导或增强免疫应答的量存 在。 59. 如权利要求 58 所述的方法， 其中该受试者患有癌、 一种传染病、 一种非自身免疫性 代谢病、 一种退行性疾病、 或一种依赖症。
4： 5)24％ /IArel(7.4)24％≥ 1.2 ； 其中 IArel(4.5)24％被定义为在 pH ＝ 4.5， 将该合成纳米载体暴露于体外水环境 24 小 时， 释放的免疫调节剂的重量除以在 pH ＝ 4.5， 将该合成纳米载体暴露于体外水环境 24 小 时， 释放的免疫调节剂的重量加上在 pH ＝ 4.5， 将该合成纳米载体暴露于体外水环境 24 小 时， 保留在该合成纳米载体中的免疫调节剂的重量之和， 表示为重量百分数， 并且被取作跨 合成纳米载体样品的平均数 ； 并且 其中 IArel(7.4)24％被定义为在 pH ＝ 7.4， 将该合成纳米载体暴露于体外水环境 24 小 时， 释放的免疫调节剂的重量除以在 pH ＝ 7.4， 将该合成纳米载体暴露于体外水环境 24 小 时， 释放的免疫调节剂的重量加上在 pH ＝ 7.4， 将该合成纳米载体暴露于体外水环境 24 小 时， 保留在该合成纳米载体中的免疫调节剂的重量之和， 表示为重量百分数， 并且被取作跨 合成纳米载体样品的平均数。 2. 如权利要求 1 所述的组合物， 其中该免疫调节剂经由一个免疫调节剂偶合部分偶合 到该合成纳米载体上。 3. 如权利要求 1 所述的组合物， 其中该免疫调节剂被胶囊化在该合成纳米载体内。 4. 如权利要求 3 所述的组合物， 其中该免疫调节剂包括一种不稳定的免疫调节剂。
5： 如权利要求 4 所述的组合物， 其中该不稳定的免疫调节剂包括一种咪唑并喹啉、 一 种腺嘌呤衍生物、 或包括 5’ -CG-3’ 的一种寡核苷酸， 其中 C 未甲基化并且其中该寡核苷酸 包括一个主链， 该主链包括一个或多个不稳定的核苷酸间连键。
6： 如权利要求 5 所述的组合物， 其中该咪唑并喹啉包括一种咪唑并喹啉胺、 一种咪唑 并吡啶胺、 一种 6， 7- 稠合的环烷基咪唑并吡啶胺、 一种咪唑并喹啉胺、 咪喹莫特、 或瑞喹莫 德。 7. 如权利要求 5 所述的组合物， 其中该寡核苷酸的主链不包括稳定化的化学修饰， 这 些修饰的功能是在生理条件下稳定化该主链。 8. 如权利要求 7 所述的组合物， 其中该寡核苷酸的主链包括一个未被修饰以结合稳定 化学修饰的硫代磷酸酯的主链。 9. 如权利要求 1-3 中任意一项所述的组合物， 其中该免疫调节剂是一种佐剂。 10. 如权利要求 9 所述的组合物， 其中该佐剂包括一种 Toll 样受体 (TLR) 激动剂。 11. 如权利要求 10 所述的组合物， 其中该 TLR 激动剂是一种 TLR3 激动剂、 TLR7 激动 剂、 TLR8 激动剂、 TLR7/8 激动剂或一种 TLR9 激动剂。 12. 如权利要求 10 或 11 所述的组合物， 其中该 TLR 激动剂是一种免疫刺激核酸。 13. 如权利要求 12 所述的组合物， 其中该免疫刺激核酸是一种免疫刺激 DNA 或免疫刺 激 RNA。 14. 如权利要求 12 或 13 所述的组合物， 其中该免疫刺激核酸是一种含有 CpG 的免疫刺 激核酸， 它包括一种或多种稳定化学修饰， 这些修饰的功能是在生理条件下稳定化该主链。 15. 如权利要求 9 所述的组合物， 其中该佐剂包括一种通用 T- 细胞抗原。 16. 如权利要求 1-15 中任意一项所述的组合物， 其中这些合成纳米载体进一步包括一 2 种 B 细胞抗原和 / 或一种 T 细胞抗原。 17. 如权利要求 1-16 中任意一项所述的组合物， 其中这些合成纳米载体进一步包括一 种抗原递呈细胞 (APC) 靶向特征。 18. 如权利要求 1-17 中任意一项所述的组合物， 其中这些合成纳米载体包括一种或多 种可生物降解的聚合物。 19. 如权利要求 18 所述的组合物， 其中该免疫调节剂经由该免疫调节剂偶合部分偶合 到这一种或多种可生物降解的聚合物上。 20. 如权利要求 18 或 19 所述的组合物， 其中该可生物降解的聚合物包括聚 ( 丙交酯 )、 聚 ( 乙交酯 )、 或聚 ( 丙交酯乙交酯 ) 共聚物。 21. 如权利要求 18-20 中任意一项所述的组合物， 其中如使用凝胶渗透色谱法确定的 那样， 这些可生物降解的聚合物具有范围从 800 道尔顿至 10,000 道尔顿的重均分子量。 22. 如权利要求 2 和 9-21 中任意一项所述的组合物， 其中该免疫调节剂偶合部分包括 一个酰胺键。 23. 如权利要求 2 和 9-21 中任意一项所述的组合物， 其中该免疫调节剂偶合部分包括 一个酯键。 24. 如权利要求 1-23 中任意一项所述的组合物， 其中这些合成纳米载体包括脂基纳米 颗粒， 聚合物纳米颗粒， 金属纳米颗粒， 表面活性剂基乳液， 树枝状化合物， 巴奇球， 纳米线， 病毒状颗粒， 肽或蛋白基颗粒， 包括纳米材料、 球状纳米颗粒、 立方纳米颗粒、 锥形纳米颗 粒、 长方形纳米颗粒、 圆柱形纳米颗粒、 或环形纳米颗粒的一种组合的纳米颗粒。 25. 一种组合物， 包括 ： 合成纳米载体， 包括一种偶合到该合成纳米载体上的免疫调节剂 ； 其中该免疫调节剂根据以下关系从该合成纳米载体解离 ： IA(4.5)24/IA(4.5)6 ≥ 1.2 ； 其中 IA(4.5)24 被定义为在 pH ＝ 4.5， 将该合成纳米载体暴露于体外水环境 24 小时， 取作跨合成纳米载体样品的平均数的释放的免疫调节剂的重量 ； 并且 其中 IA(4.5)6 被定义为在 pH ＝ 4.5， 将该合成纳米载体暴露于体外水环境 6 小时， 取 作跨合成纳米载体样品的平均数的释放的免疫调节剂的重量。 26. 如权利要求 25 所述的组合物， 其中该免疫调节剂包括胶囊化在该合成纳米载体内 的一种不稳定的免疫调节剂。 27. 如权利要求 26 所述的组合物， 其中该不稳定的免疫调节剂包括一种咪唑并喹啉、 一种腺嘌呤衍生物、 或包括 5’ -CG-3’ 的一种寡核苷酸， 其中 C 未甲基化并且其中该寡核苷 酸包括一个主链， 该主链包括一个或多个不稳定的核苷酸间连键。 28. 如权利要求 27 所述的组合物， 其中该咪唑并喹啉包括一种咪唑并喹啉胺、 一种咪 唑并吡啶胺、 一种 6， 7- 稠合的环烷基咪唑并吡啶胺、 一种咪唑并喹啉胺、 咪喹莫特、 或瑞喹 莫德。 29. 如权利要求 27 所述的组合物， 其中该寡核苷酸的主链不包括稳定化的化学修饰， 这些修饰的功能是在生理条件下稳定化该主链。 30. 如权利要求 29 所述的组合物， 其中该寡核苷酸的主链包括一个未被修饰以结合稳 定化学修饰的硫代磷酸酯的主链。 3 31. 一种组合物， 包括 ： 合成纳米载体， 包括一种偶合到该合成纳米载体上的免疫调节剂 ； 其中该免疫调节剂根据以下关系从该合成纳米载体解离 ： 6 ≤ IA(4.5)24/IA(4.5)6 ≥ 1.2 ； 其中 IA(4.5)24 被定义为在 pH ＝ 4.5， 将该合成纳米载体暴露于体外水环境 24 小时， 取作跨合成纳米载体样品的平均数的释放的免疫调节剂的重量 ； 并且 其中 IA(4.5)6 被定义为在 pH ＝ 4.5， 将该合成纳米载体暴露于体外水环境 6 小时， 取 作跨合成纳米载体样品的平均数的释放的免疫调节剂的重量。 32. 如权利要求 31 所述的组合物， 其中该免疫调节剂包括胶囊化在该合成纳米载体内 的一种不稳定的免疫调节剂。 33. 如权利要求 32 所述的组合物， 其中该不稳定的免疫调节剂包括一种咪唑并喹啉、 一种腺嘌呤衍生物、 或包括 5’ -CG-3’ 的一种寡核苷酸， 其中 C 未甲基化并且其中该寡核苷 酸包括一个主链， 该主链包括一个或多个不稳定的核苷酸间连键。 34. 如权利要求 33 所述的组合物， 其中该咪唑并喹啉包括一种咪唑并喹啉胺、 一种咪 唑并吡啶胺、 一种 6， 7- 稠合的环烷基咪唑并吡啶胺、 一种咪唑并喹啉胺、 咪喹莫特、 或瑞喹 莫德。 35. 如权利要求 33 所述的组合物， 其中该寡核苷酸的主链不包括稳定化的化学修饰， 这些修饰的功能是在生理条件下稳定化该主链。 36. 如权利要求 35 所述的组合物， 其中该寡核苷酸的主链包括一个未被修饰以结合稳 定化学修饰的硫代磷酸酯的主链。 37. 如权利要求 25 或 31 所述的组合物， 其中该免疫调节剂经由一个免疫调节剂偶合部 分偶合到该合成纳米载体上。 38. 如权利要求 25 或 31 所述的组合物， 其中该免疫调节剂被胶囊化在该合成纳米载体 内。 39. 如权利要求 25、 31、 或 37 所述的组合物， 其中该免疫调节剂是一种佐剂。 40. 如权利要求 39 所述的组合物， 其中该佐剂包括一种 Toll 样受体 (TLR) 激动剂。 41. 如权利要求 40 所述的组合物， 其中该 TLR 激动剂是一种 TLR3 激动剂、 TLR7 激动 剂、 TLR8 激动剂、 TLR7/8 激动剂或一种 TLR9 激动剂。 42. 如权利要求 40 或 41 所述的组合物， 其中该 TLR 激动剂是一种免疫刺激核酸。 43. 如权利要求 42 所述的组合物， 其中该免疫刺激核酸是一种免疫刺激 DNA 或免疫刺 激 RNA。 44. 如权利要求 42 或 43 所述的组合物， 其中该免疫刺激核酸是一种含有 CpG 的免疫刺 激核酸， 它包括一种或多种稳定化学修饰， 这些修饰的功能是在生理条件下稳定化该主链。 45. 如权利要求 39 所述的组合物， 其中该佐剂包括一种通用 T- 细胞抗原。 46. 如权利要求 25-45 中任意一项所述的组合物， 其中该合成纳米载体进一步包括一 种 B 细胞抗原和 / 或一种 T 细胞抗原。 47. 如权利要求 25-46 中的任意一项所述的组合物， 其中该合成纳米载体进一步包括 一种抗原递呈细胞 (APC) 靶向特征。 48. 如权利要求 25-47 中任意一项所述的组合物， 其中这些合成纳米载体包括一种或 4 多种可生物降解的聚合物。 49. 如权利要求 48 所述的组合物， 其中该免疫调节剂经由该免疫调节剂偶合部分偶合 到这一种或多种可生物降解的聚合物上。 50. 如权利要求 48 或 49 所述的组合物， 其中该可生物降解的聚合物包括聚 ( 丙交酯 )、 聚 ( 乙交酯 )、 或聚 ( 丙交酯乙交酯 ) 共聚物。 51. 如权利要求 48-50 中任意一项所述的组合物， 其中如使用凝胶渗透色谱法确定的 那样， 这些可生物降解的聚合物具有范围从 800 道尔顿至 10,000 道尔顿的重均分子量。 52. 如权利要求 37 和 39-51 中任意一项所述的组合物， 其中该免疫调节剂偶合部分包 括一个酰胺键。 53. 如权利要求 37 和 39-51 中任意一项所述的组合物， 其中该免疫调节剂偶合部分包 括一个酯键。 54. 如权利要求 25-53 中任意一项所述的组合物， 其中这些合成纳米载体包括脂基纳 米颗粒， 聚合物纳米颗粒， 金属纳米颗粒， 表面活性剂基乳液， 树枝状化合物， 巴奇球， 纳米 线， 病毒状颗粒， 肽或蛋白基颗粒， 包括纳米材料、 球状纳米颗粒、 立方纳米颗粒、 锥形纳米 颗粒、 长方形纳米颗粒、 圆柱形纳米颗粒、 或环形纳米颗粒的一种组合的纳米颗粒。 55. 如权利要求 1-54 中任意一项所述的组合物， 进一步包括一种药学上可接受的赋形 剂。 56. 一种组合物， 包括一种疫苗， 该疫苗包括如权利要求 1-55 中任意一项所述的组合 物。 57. 一种方法， 包括 ： 将如权利要求 1-56 中任意一项所述的组合物给予一个受试者。 58. 如权利要求 57 所述的方法， 其中该组合物以一个有效诱导或增强免疫应答的量存 在。 59. 如权利要求 58 所述的方法， 其中该受试者患有癌、 一种传染病、 一种非自身免疫性 代谢病、 一种退行性疾病、 或一种依赖症。
7： 4)24％≥ 1.2 ； 其中 IArel(4.5)24％被定义为在 pH ＝ 4.5， 将该合成纳米载体暴露于体外水环境 24 小 时， 释放的免疫调节剂的重量除以在 pH ＝ 4.5， 将该合成纳米载体暴露于体外水环境 24 小 时， 释放的免疫调节剂的重量加上在 pH ＝ 4.5， 将该合成纳米载体暴露于体外水环境 24 小 时， 保留在该合成纳米载体中的免疫调节剂的重量之和， 表示为重量百分数， 并且被取作跨 合成纳米载体样品的平均数 ； 并且 其中 IArel(7.4)24％被定义为在 pH ＝ 7.4， 将该合成纳米载体暴露于体外水环境 24 小 时， 释放的免疫调节剂的重量除以在 pH ＝ 7.4， 将该合成纳米载体暴露于体外水环境 24 小 时， 释放的免疫调节剂的重量加上在 pH ＝ 7.4， 将该合成纳米载体暴露于体外水环境 24 小 时， 保留在该合成纳米载体中的免疫调节剂的重量之和， 表示为重量百分数， 并且被取作跨 合成纳米载体样品的平均数。 2. 如权利要求 1 所述的组合物， 其中该免疫调节剂经由一个免疫调节剂偶合部分偶合 到该合成纳米载体上。 3. 如权利要求 1 所述的组合物， 其中该免疫调节剂被胶囊化在该合成纳米载体内。 4. 如权利要求 3 所述的组合物， 其中该免疫调节剂包括一种不稳定的免疫调节剂。 5. 如权利要求 4 所述的组合物， 其中该不稳定的免疫调节剂包括一种咪唑并喹啉、 一 种腺嘌呤衍生物、 或包括 5’ -CG-3’ 的一种寡核苷酸， 其中 C 未甲基化并且其中该寡核苷酸 包括一个主链， 该主链包括一个或多个不稳定的核苷酸间连键。 6. 如权利要求 5 所述的组合物， 其中该咪唑并喹啉包括一种咪唑并喹啉胺、 一种咪唑 并吡啶胺、 一种 6， 7- 稠合的环烷基咪唑并吡啶胺、 一种咪唑并喹啉胺、 咪喹莫特、 或瑞喹莫 德。 7. 如权利要求 5 所述的组合物， 其中该寡核苷酸的主链不包括稳定化的化学修饰， 这 些修饰的功能是在生理条件下稳定化该主链。
8： 如权利要求 7 所述的组合物， 其中该寡核苷酸的主链包括一个未被修饰以结合稳定 化学修饰的硫代磷酸酯的主链。
9： 如权利要求 1-3 中任意一项所述的组合物， 其中该免疫调节剂是一种佐剂。
10： 如权利要求 9 所述的组合物， 其中该佐剂包括一种 Toll 样受体 (TLR) 激动剂。
11： 如权利要求 10 所述的组合物， 其中该 TLR 激动剂是一种 TLR3 激动剂、 TLR7 激动 剂、 TLR8 激动剂、 TLR7/8 激动剂或一种 TLR9 激动剂。
12： 如权利要求 10 或 11 所述的组合物， 其中该 TLR 激动剂是一种免疫刺激核酸。
13： 如权利要求 12 所述的组合物， 其中该免疫刺激核酸是一种免疫刺激 DNA 或免疫刺 激 RNA。
14： 如权利要求 12 或 13 所述的组合物， 其中该免疫刺激核酸是一种含有 CpG 的免疫刺 激核酸， 它包括一种或多种稳定化学修饰， 这些修饰的功能是在生理条件下稳定化该主链。
15： 如权利要求 9 所述的组合物， 其中该佐剂包括一种通用 T- 细胞抗原。
16： 如权利要求 1-15 中任意一项所述的组合物， 其中这些合成纳米载体进一步包括一 2 种 B 细胞抗原和 / 或一种 T 细胞抗原。
17： 如权利要求 1-16 中任意一项所述的组合物， 其中这些合成纳米载体进一步包括一 种抗原递呈细胞 (APC) 靶向特征。
18： 如权利要求 1-17 中任意一项所述的组合物， 其中这些合成纳米载体包括一种或多 种可生物降解的聚合物。
19： 如权利要求 18 所述的组合物， 其中该免疫调节剂经由该免疫调节剂偶合部分偶合 到这一种或多种可生物降解的聚合物上。
20： 如权利要求 18 或 19 所述的组合物， 其中该可生物降解的聚合物包括聚 ( 丙交酯 )、 聚 ( 乙交酯 )、 或聚 ( 丙交酯乙交酯 ) 共聚物。
21： 如权利要求 18-20 中任意一项所述的组合物， 其中如使用凝胶渗透色谱法确定的 那样， 这些可生物降解的聚合物具有范围从 800 道尔顿至 10,000 道尔顿的重均分子量。
22： 如权利要求 2 和 9-21 中任意一项所述的组合物， 其中该免疫调节剂偶合部分包括 一个酰胺键。
23： 如权利要求 2 和 9-21 中任意一项所述的组合物， 其中该免疫调节剂偶合部分包括 一个酯键。
24： 如权利要求 1-23 中任意一项所述的组合物， 其中这些合成纳米载体包括脂基纳米 颗粒， 聚合物纳米颗粒， 金属纳米颗粒， 表面活性剂基乳液， 树枝状化合物， 巴奇球， 纳米线， 病毒状颗粒， 肽或蛋白基颗粒， 包括纳米材料、 球状纳米颗粒、 立方纳米颗粒、 锥形纳米颗 粒、 长方形纳米颗粒、 圆柱形纳米颗粒、 或环形纳米颗粒的一种组合的纳米颗粒。
25： 一种组合物， 包括 ： 合成纳米载体， 包括一种偶合到该合成纳米载体上的免疫调节剂 ； 其中该免疫调节剂根据以下关系从该合成纳米载体解离 ： IA(4.5)24/IA(4.5)6 ≥ 1.2 ； 其中 IA(4.5)24 被定义为在 pH ＝ 4.5， 将该合成纳米载体暴露于体外水环境 24 小时， 取作跨合成纳米载体样品的平均数的释放的免疫调节剂的重量 ； 并且 其中 IA(4.5)6 被定义为在 pH ＝ 4.5， 将该合成纳米载体暴露于体外水环境 6 小时， 取 作跨合成纳米载体样品的平均数的释放的免疫调节剂的重量。
26： 如权利要求 25 所述的组合物， 其中该免疫调节剂包括胶囊化在该合成纳米载体内 的一种不稳定的免疫调节剂。
27： 如权利要求 26 所述的组合物， 其中该不稳定的免疫调节剂包括一种咪唑并喹啉、 一种腺嘌呤衍生物、 或包括 5’ -CG-3’ 的一种寡核苷酸， 其中 C 未甲基化并且其中该寡核苷 酸包括一个主链， 该主链包括一个或多个不稳定的核苷酸间连键。
28： 如权利要求 27 所述的组合物， 其中该咪唑并喹啉包括一种咪唑并喹啉胺、 一种咪 唑并吡啶胺、 一种 6， 7- 稠合的环烷基咪唑并吡啶胺、 一种咪唑并喹啉胺、 咪喹莫特、 或瑞喹 莫德。
29： 如权利要求 27 所述的组合物， 其中该寡核苷酸的主链不包括稳定化的化学修饰， 这些修饰的功能是在生理条件下稳定化该主链。
30： 如权利要求 29 所述的组合物， 其中该寡核苷酸的主链包括一个未被修饰以结合稳 定化学修饰的硫代磷酸酯的主链。 3
31： 一种组合物， 包括 ： 合成纳米载体， 包括一种偶合到该合成纳米载体上的免疫调节剂 ； 其中该免疫调节剂根据以下关系从该合成纳米载体解离 ： 6 ≤ IA(4.5)24/IA(4.5)6 ≥ 1.2 ； 其中 IA(4.5)24 被定义为在 pH ＝ 4.5， 将该合成纳米载体暴露于体外水环境 24 小时， 取作跨合成纳米载体样品的平均数的释放的免疫调节剂的重量 ； 并且 其中 IA(4.5)6 被定义为在 pH ＝ 4.5， 将该合成纳米载体暴露于体外水环境 6 小时， 取 作跨合成纳米载体样品的平均数的释放的免疫调节剂的重量。
32： 如权利要求 31 所述的组合物， 其中该免疫调节剂包括胶囊化在该合成纳米载体内 的一种不稳定的免疫调节剂。
33： 如权利要求 32 所述的组合物， 其中该不稳定的免疫调节剂包括一种咪唑并喹啉、 一种腺嘌呤衍生物、 或包括 5’ -CG-3’ 的一种寡核苷酸， 其中 C 未甲基化并且其中该寡核苷 酸包括一个主链， 该主链包括一个或多个不稳定的核苷酸间连键。
34： 如权利要求 33 所述的组合物， 其中该咪唑并喹啉包括一种咪唑并喹啉胺、 一种咪 唑并吡啶胺、 一种 6， 7- 稠合的环烷基咪唑并吡啶胺、 一种咪唑并喹啉胺、 咪喹莫特、 或瑞喹 莫德。
35： 如权利要求 33 所述的组合物， 其中该寡核苷酸的主链不包括稳定化的化学修饰， 这些修饰的功能是在生理条件下稳定化该主链。
36： 如权利要求 35 所述的组合物， 其中该寡核苷酸的主链包括一个未被修饰以结合稳 定化学修饰的硫代磷酸酯的主链。
37： 如权利要求 25 或 31 所述的组合物， 其中该免疫调节剂经由一个免疫调节剂偶合部 分偶合到该合成纳米载体上。
38： 如权利要求 25 或 31 所述的组合物， 其中该免疫调节剂被胶囊化在该合成纳米载体 内。
39： 如权利要求 25、 31、 或 37 所述的组合物， 其中该免疫调节剂是一种佐剂。
40： 如权利要求 39 所述的组合物， 其中该佐剂包括一种 Toll 样受体 (TLR) 激动剂。
41： 如权利要求 40 所述的组合物， 其中该 TLR 激动剂是一种 TLR3 激动剂、 TLR7 激动 剂、 TLR8 激动剂、 TLR7/8 激动剂或一种 TLR9 激动剂。
42： 如权利要求 40 或 41 所述的组合物， 其中该 TLR 激动剂是一种免疫刺激核酸。
43： 如权利要求 42 所述的组合物， 其中该免疫刺激核酸是一种免疫刺激 DNA 或免疫刺 激 RNA。
44： 如权利要求 42 或 43 所述的组合物， 其中该免疫刺激核酸是一种含有 CpG 的免疫刺 激核酸， 它包括一种或多种稳定化学修饰， 这些修饰的功能是在生理条件下稳定化该主链。
45： 如权利要求 39 所述的组合物， 其中该佐剂包括一种通用 T- 细胞抗原。
46： 如权利要求 25-45 中任意一项所述的组合物， 其中该合成纳米载体进一步包括一 种 B 细胞抗原和 / 或一种 T 细胞抗原。
47： 如权利要求 25-46 中的任意一项所述的组合物， 其中该合成纳米载体进一步包括 一种抗原递呈细胞 (APC) 靶向特征。
48： 如权利要求 25-47 中任意一项所述的组合物， 其中这些合成纳米载体包括一种或 4 多种可生物降解的聚合物。
49： 如权利要求 48 所述的组合物， 其中该免疫调节剂经由该免疫调节剂偶合部分偶合 到这一种或多种可生物降解的聚合物上。
50： 如权利要求 48 或 49 所述的组合物， 其中该可生物降解的聚合物包括聚 ( 丙交酯 )、 聚 ( 乙交酯 )、 或聚 ( 丙交酯乙交酯 ) 共聚物。
51： 如权利要求 48-50 中任意一项所述的组合物， 其中如使用凝胶渗透色谱法确定的 那样， 这些可生物降解的聚合物具有范围从 800 道尔顿至 10,000 道尔顿的重均分子量。
52： 如权利要求 37 和 39-51 中任意一项所述的组合物， 其中该免疫调节剂偶合部分包 括一个酰胺键。
53： 如权利要求 37 和 39-51 中任意一项所述的组合物， 其中该免疫调节剂偶合部分包 括一个酯键。
54： 如权利要求 25-53 中任意一项所述的组合物， 其中这些合成纳米载体包括脂基纳 米颗粒， 聚合物纳米颗粒， 金属纳米颗粒， 表面活性剂基乳液， 树枝状化合物， 巴奇球， 纳米 线， 病毒状颗粒， 肽或蛋白基颗粒， 包括纳米材料、 球状纳米颗粒、 立方纳米颗粒、 锥形纳米 颗粒、 长方形纳米颗粒、 圆柱形纳米颗粒、 或环形纳米颗粒的一种组合的纳米颗粒。
55： 如权利要求 1-54 中任意一项所述的组合物， 进一步包括一种药学上可接受的赋形 剂。
56： 一种组合物， 包括一种疫苗， 该疫苗包括如权利要求 1-55 中任意一项所述的组合 物。
57： 一种方法， 包括 ： 将如权利要求 1-56 中任意一项所述的组合物给予一个受试者。
58： 如权利要求 57 所述的方法， 其中该组合物以一个有效诱导或增强免疫应答的量存 在。
59： 如权利要求 58 所述的方法， 其中该受试者患有癌、 一种传染病、 一种非自身免疫性 代谢病、 一种退行性疾病、 或一种依赖症。

说明书


具有免疫调节剂的 pH 敏感释放的靶向合成纳米载体

    相关申请
     本申请要求在美国临时申请 61/217129、 61/217117、 61/217124、 和 61/217116 的 35U.S.C.§119 下的权益， 这几项申请中的每一件都是 2009 年 5 月 27 日提交的， 其中每一 件的内容都通过引用以其全文结合在此。
     发明领域 发明领域本发明涉及靶向细胞中作用位点的合成纳米载体的组合物、 以及相关方 法， 这些细胞例如抗原递呈细胞 (APC)， 并且包括以一种 pH 敏感方式从合成纳米载体解离 的免疫调节剂。本发明额外涉及保护不稳定的免疫调节剂， 借助它们在合成纳米载体中的 胶囊化。
     发明背景
     免疫调节剂被用于在受试者中产生免疫应答。免疫系统的刺激， 它包括先天性免 疫和获得性免疫之一或全部， 是一种可以导致宿主的保护性亦或不良生理结果的复杂现 象。近年对先天性免疫的机制已经存在增加的兴趣， 它被认为启动并支持获得性免疫。这 一兴趣部分地出于近期发现的称为 Toll 样受体 (TLR) 的高度保守模式识别受体蛋白的一 个家族， 这些受体被认为涉及先天性免疫， 作为用于病原相关分子模式 (PAMP) 的受体。
     因此对于调节先天性免疫有用的组合物和方法是具有很大兴趣的， 因为它们可以 影响对涉及炎症、 过敏症、 哮喘、 感染、 癌、 以及免疫缺陷等症状的治疗方法。
     有时偶合这样的媒介物至递送载体是有利的。 然而， 这样的信息还是缺乏 ： 关于这 样的媒介物 ( 特别是不稳定的免疫调节剂 ) 从递送载体的释放如何被控制， 以及什么种类 的释放提供最佳体内效果。
     对于用于递送免疫调节剂的、 允许最佳释放的新递送载体连同相关方法存在需 要。
     发明概述
     本发明的多个方面涉及包括合成纳米载体的组合物， 这些合成纳米载体包括偶合 到合成纳米载体的免疫调节剂， 其中根据以下关系， 该免疫调节剂从合成纳米载体解离 ： IArel(4.5)24％ /IArel(7.4)24％≥ 1.2， 其中 IArel(4.5)24％被定义为在 pH ＝ 4.5， 将合成 纳米载体暴露于体外水环境 24 小时， 释放的免疫调节剂的重量除以在 pH ＝ 4.5， 将合成纳 米载体暴露于体外水环境 24 小时， 释放的免疫调节剂的重量加上在 pH ＝ 4.5， 将合成纳米 载体暴露于体外水环境 24 小时， 保留在合成纳米载体中的免疫调节剂的重量之和， 表示为 重量百分数， 并且被取作跨合成纳米载体样品的平均数， 并且其中 IArel(7.4)24％被定义为 在 pH ＝ 7.4， 将合成纳米载体暴露于体外水环境 24 小时， 释放的免疫调节剂的重量除以在 pH ＝ 7.4， 将合成纳米载体暴露于体外水环境 24 小时， 释放的免疫调节剂的重量加上在 pH ＝ 7.4， 将合成纳米载体暴露于体外水环境 24 小时， 保留在合成纳米载体中的免疫调节剂 的重量之和， 表示为重量百分数， 并且被取作跨合成纳米载体样品的平均数。
     在一些实施方案中， 免疫调节剂经由免疫调节剂偶合部分偶合到合成纳米载体
     上。在某些实施方案中， 免疫调节剂被胶囊化在合成纳米载体内。在一些实施方案中， 免疫 调节剂包括不稳定的免疫调节剂， 例如咪唑并喹啉、 腺嘌呤衍生物、 或包括 5’ -CG-3’ 的寡核 苷酸， 其中 C 未甲基化并且其中该寡核苷酸包括一个主链， 该主链包括一个或多个不稳定 的核苷酸间连键。在某些实施方案中， 该咪唑并喹啉包括咪唑并喹啉胺、 咪唑并吡啶胺、 6， 7- 稠合的环烷基咪唑并吡啶胺、 咪唑并喹啉胺、 咪喹莫特、 或瑞喹莫德。
     在一些实施方案中， 该寡核苷酸的主链不包括稳定化的化学修饰， 这些修饰的功 能是在生理条件下稳定化主链。在一些实施方案中， 该寡核苷酸的主链包括一个未被修饰 以结合稳定化学修饰的硫代磷酸酯的主链。在一些实施方案中， 免疫调节剂是一种佐剂。 在某些实施方案中， 佐剂包括 Toll 样受体 (TLR) 激动剂 ( 例如 TLR3 激动剂、 TLR7 激动剂、 TLR8 激动剂、 TLR7/8 激动剂、 或 TLR9 激动剂。
     在一些实施方案中， TLR 激动剂是一种免疫刺激核酸 ( 例如免疫刺激 DNA 或免疫 刺激 RNA)。 在某些实施方案中， 免疫刺激核酸是一种含有 CpG 的免疫刺激核酸， 它包括一种 或多种稳定化学修饰， 这些修饰的功能是在生理条件下稳定化主链。 在一些实施方案中， 佐 剂包括一种通用 T 细胞抗原。
     在一些实施方案中， 合成纳米载体进一步包括一种 B 细胞抗原和 / 或一种 T 细胞 抗原。在某些实施方案中， 该合成纳米载体进一步包括一种抗原递呈细胞 (APC) 靶向特征。 在一些实施方案中， 合成纳米载体包括一种或多种可生物降解的聚合物。在一些实施方案 中， 免疫调节剂经由免疫调节剂偶合部分偶合到一种或多种可生物降解的聚合物上。在某 些实施方案中， 可生物降解的聚合物包括聚 ( 丙交酯 )、 聚 ( 乙交酯 )、 或聚 ( 丙交酯乙交 酯 ) 共聚物。 在一些实施方案中， 如使用凝胶渗透色谱法确定的那样， 该可生物降解的聚合物 具有范围从 800 道尔顿至 10,000 道尔顿的重均分子量。在某些实施方案中， 免疫调节剂偶 合部分包括一个酰胺键。在一些实施方案中， 免疫调节剂偶合部分包括一个酯键。
     在一些实施方案中， 合成纳米载体包括脂基纳米颗粒、 聚合物纳米颗粒， 金属纳米 颗粒， 表面活性剂基乳液， 树枝状化合物， 巴奇球， 纳米线， 病毒状颗粒， 肽或蛋白基颗粒， 包 括纳米材料、 球状纳米颗粒、 立方纳米颗粒、 锥形纳米颗粒、 长方形纳米颗粒、 圆柱形纳米颗 粒、 或环形纳米颗粒的一种组合的纳米颗粒。
     本发明的多个方面涉及包括合成纳米载体的组合物， 这些合成纳米载体包括偶合 到合成纳米载体的免疫调节剂， 其中根据以下关系， 该免疫调节剂从合成纳米载体解离 ： IA(4.5)24/IA(4.5)6 ≥ 1.2， 其中 IA(4.5)24 被定义为当合成纳米载体暴露于 pH ＝ 4.5 的体 外水环境 24 小时， 取作跨合成纳米载体样品的平均数的释放的免疫调节剂的重量， 并且其 中 IA(4.5)6 被定义为当合成纳米载体暴露于 pH ＝ 4.5 的体外水环境 6 小时， 取作跨合成 纳米载体样品的平均数的释放的免疫调节剂的重量。
     在一些实施方案中， 免疫调节剂包括胶囊化在合成纳米载体内的不稳定的免疫调 节剂。在某些实施方案中， 不稳定的免疫调节剂包括咪唑并喹啉、 腺嘌呤衍生物、 或包括 5’ -CG-3’ 的寡核苷酸， 其中 C 未甲基化并且其中该寡核苷酸包括一个主链， 该主链包括一 个或多个不稳定的核苷酸间连键。 在某些实施方案中， 该咪唑并喹啉包括咪唑并喹啉胺、 咪 唑并吡啶胺、 6， 7- 稠合的环烷基咪唑并吡啶胺、 咪唑并喹啉胺、 咪喹莫特、 或瑞喹莫德。 在一 些实施方案中， 该寡核苷酸的主链不包括稳定化的化学修饰， 这些修饰的功能是在生理条
     件下稳定化主链。在一些实施方案中， 该寡核苷酸的主链包括一个未被修饰以结合稳定化 学修饰的硫代磷酸酯的主链。
     本发明的其他方面涉及包括合成纳米载体的组合物， 这些合成纳米载体包括偶合 到合成纳米载体的免疫调节剂， 其中根据以下关系， 该免疫调节剂从合成纳米载体解离 ： 6 ≤ IA(4.5)24/IA(4.5)6 ≥ 1.2， 其中 IA(4.5)24 被定义为当合成纳米载体暴露于 pH ＝ 4.5 的体外水环境 24 小时， 取作跨合成纳米载体样品平均数的释放的免疫调节剂的重量， 并且 其中 IA(4.5)6 被定义为当合成纳米载体暴露于 pH ＝ 4.5 的体外水环境 6 小时， 取作跨合 成纳米载体样品的平均数的释放的免疫调节剂的重量。
     在一些实施方案中， 免疫调节剂包括胶囊化在合成纳米载体内的不稳定的免疫调 节剂。在一些实施方案中， 不稳定的免疫调节剂包括咪唑并喹啉、 腺嘌呤衍生物、 或包括 5’ -CG-3’ 的寡核苷酸， 其中 C 未甲基化并且其中该寡核苷酸包括一个主链， 该主链包括一 个或多个不稳定的核苷酸间连键。 在某些实施方案中， 该咪唑并喹啉包括咪唑并喹啉胺、 咪 唑并吡啶胺、 6， 7- 稠合的环烷基咪唑并吡啶胺、 咪唑并喹啉胺、 咪喹莫特、 或瑞喹莫德。
     在一些实施方案中， 该寡核苷酸的主链不包括稳定化的化学修饰， 这些修饰的功 能是在生理条件下稳定化主链。在一些实施方案中， 该寡核苷酸的主链包括一个未被修饰 以结合稳定化学修饰的硫代磷酸酯的主链。在某些实施方案中， 免疫调节剂经由免疫调节 剂偶合部分偶合到合成纳米载体上。在一些实施方案中， 免疫调节剂被胶囊化在合成纳米 载体内。 在一些实施方案中， 免疫调节剂是一种佐剂。在某些实施方案中， 佐剂包括 Toll 样受体 (TLR) 激动剂 ( 例如 TLR3 激动剂、 TLR7 激动剂、 TLR8 激动剂、 TLR7/8 激动剂、 或 TLR9 激动剂。在某些实施方案中， TLR 激动剂是一种免疫刺激核酸 ( 例如免疫刺激 DNA 或免疫 刺激 RNA)。
     在一些实施方案中， 免疫刺激核酸是一种含有 CpG 的免疫刺激核酸， 它包括一种 或多种稳定化学修饰， 这些修饰的功能是在生理条件下稳定化主链。 在某些实施方案中， 佐 剂包括一种通用 T 细胞抗原。在一些实施方案中， 合成纳米载体进一步包括一种 B 细胞抗 原和 / 或一种 T 细胞抗原。
     在一些实施方案中， 该合成纳米载体进一步包括一种抗原递呈细胞 (APC) 靶向特 征。 在某些实施方案中， 合成纳米载体包括一种或多种可生物降解的聚合物。 在一些实施方 案中， 免疫调节剂经由免疫调节剂偶合部分偶合到一种或多种可生物降解的聚合物上。在 某些实施方案中， 可生物降解的聚合物包括聚 ( 丙交酯 )、 聚 ( 乙交酯 )、 或聚 ( 丙交酯乙交 酯 ) 共聚物。
     在一些实施方案中， 如使用凝胶渗透色谱法确定的那样， 该可生物降解的聚合物 具有范围从 800 道尔顿至 10,000 道尔顿的重均分子量。在某些实施方案中， 免疫调节剂偶 合部分包括一个酰胺键。在一些实施方案中， 免疫调节剂偶合部分包括一个酯键。
     在一些实施方案中， 合成纳米载体包括脂基纳米颗粒、 聚合物纳米颗粒， 金属纳米 颗粒， 表面活性剂基乳液， 树枝状化合物， 巴奇球， 纳米线， 病毒状颗粒， 肽或蛋白基颗粒， 包 括纳米材料、 球状纳米颗粒、 立方纳米颗粒、 锥形纳米颗粒、 长方形纳米颗粒、 圆柱形纳米颗 粒、 或环形纳米颗粒的一种组合的纳米颗粒。 在某些实施方案中， 本发明相关的组合物进一 步包括一种药学上可以接受的赋形剂。
     本发明的其他方面涉及包括一种疫苗的组合物， 该疫苗包括任何本发明相关的组合物。 本发明的其他方面涉及包括将本发明相关的任何组合物给予受试者的方法。 在一 些实施方案中， 组合物以有效诱导或增强免疫应答的量存在。 在一些实施方案中， 受试者患 有癌、 传染病、 非自身免疫性代谢病、 退行性疾病、 或依赖症。
     附图简要说明
     图 1 证明了在 pH 7.4、 37℃条件下， 从合成纳米载体配制品释放瑞喹莫德 (R848)。
     图 2 证明了在 pH 4.5、 37℃条件下， 从合成纳米载体配制品释放 R848。
     图 3 证明了在 pH 7.4 和 pH 4.5， 在 24 小时条件下， 从合成纳米载体配制品释放 R848。
     图 4 示出与用不具有含 CpG 免疫刺激核酸的合成纳米载体的抗体诱导水平 ( 组 1) 比较， 用具有含 CpG 免疫刺激核酸的合成纳米载体的抗体诱导水平 ( 组 2 和 3)。
     图 5 示出用释放磷酸二酯、 非 - 硫代的含 CpG 免疫刺激核酸或硫代的含 CpG 免疫 刺激核酸的合成纳米载体的抗体诱导水平。
     图 6 示出用按不同速率释放 R848 的纳米载体的抗体诱导水平。
     图 7 示出由携带封存的磷酸二酯 (PO)CpG 的合成纳米载体 ( 指定为 NC-Nic/ PO-CpG) 诱导的抗体水平。
     图 8 示出在 pH4.5， 封存的 PO-CpG 从合成纳米载体的释放与在 pH7.5 的对比。数 据证明通过胶囊化， 不稳定的免疫调节剂 ( 例如 PO-CpG) 被保护在合成纳米载体内。在 pH 4.5( 例如在内含体 / 溶酶体中 )， 这样一种不稳定的媒介物可以在希望的作用点释放， 同时 在 pH 7.4( 例如在内含体 / 溶酶体外的一般 pH 值 ) 发生低水平的释放。
     详细说明
     在详细说明本发明以前， 已理解本发明并不局限于具体举例说明的材料或工艺参 数， 因为这些当然可以变化。还已理解在此使用的术语只是为了说明本发明的具体实施方 案的目的， 并不旨在限制使用可替代的术语来说明本发明。
     在此引用的所有出版物、 专利和专利申请， 无论在前或在后， 都出于所有目的通过 引用以其全文结合在此。
     如在本说明书和附加权利要求中使用的那样， 单数形式 “一个” 、 “一种” 和 “该” 包 括复数指示物， 除非该内容清楚地另外指明。例如， 引用 “一种聚合物” 包括两种或更多种 这样的分子的混合物， 引用 “一种溶剂” 包括两种或更多种这样的溶剂的混合物， 引用 “一种 粘合剂” 包括两种或更多种这样的材料的混合物， 并且以此类推。
     序论
     在感兴趣的细胞， 特别是抗原递呈细胞的作用点， 提供一种更直接地释放免疫调 节剂的方式方面， 本发明是有用的， 它会导致有益的免疫应答和 / 或减少脱靶效应和毒性， 因为免疫调节剂的释放多数会在感兴趣的细胞的作用点。对于递送佐剂， 这具有特别的兴 趣。控制释放特性第一次给感兴趣的免疫细胞提供递送免疫调节剂的受控方式， 并且允许 在免疫系统上的更精确的干涉， 包括在延长的时段释放免疫调节剂的能力。所有这些导致 一个非常可调的系统以获得免疫调节剂的最佳释放， 这样它将主要在所希望的细胞的作用 点释放。
     本发明的诸位发明人已经进一步认识到通过将不稳定的免疫调节剂胶囊化在本 发明的合成纳米载体内， 将不稳定的免疫调节剂偶合在本发明的合成纳米载体内， 并且提 供了递送不稳定的免疫调节剂至感兴趣的免疫细胞的受控方式， 优选地在一个延长的时 段， 导致不稳定的免疫调节剂的靶向递送， 同时最小化免疫调节剂的脱靶效应， 特别是与免 疫调节剂的全身给药相关的脱靶效应。此外， 这一方法还增强了具有短的消除半衰期的不 稳定的免疫调节剂的性能， 该免疫调节剂可能另外不具有希望水平的药理学活性。
     在一个实施方案中， 本发明涉及某些寡核苷酸。 最近， 已经存在很多说明某些类型 的核酸分子 ( 包括 CpG 核酸、 富含 GU 的 ssRNA 和双链 RNA) 的免疫刺激作用的报告。 值得注 意的是， 最近报告了 Toll 样受体 9(TLR9) 识别细菌 DNA 和含有一个 CpG 基序的寡核苷酸， 其 中胞嘧啶是未甲基化的。Hemmi H 等人 (2000)Nature 408 ： 740-5 ； Bauer S.et al.(2001) Proc Natl Acad Sci USA 98 ： 9237-42。在多个美国专利 ( 例如美国专利号 6,194,388 ； 6,207,646 ； 6,239,116 ； 和 6,218,371)， 以 及 公 开 的 国 际 专 利 申 请 ( 例 如 W098/37919、 W098/40100、 W098/52581、 和 W099/56755) 中已经广泛说明了含有 CpG 的寡核苷酸在免疫调 节上的作用。完整的免疫刺激剂核酸可以是未甲基化的或部分可以是未甲基化的， 但是至 少 5′ -CG-3′的 C 是未甲基化的。
     天然 DNA 寡核苷酸含有被在细胞外环境中发现的核酸酶迅速切割的磷酸二酯键。 Yu， D.， 等 人， Potent CpG oligonucleotides containing phosphodiester linkages ： in vitro and in vivo immunostimulatory properties.Biochem Biophys Res Commun， 2002.297(1) ： p.83-90(“Yu et al.” )； Heeg， K.， 等 人， Structural requirements for uptake and recognition of CpG oligonucleotides.Int J Med Microbiol， 2008.298(1-2) ： p.33-8(“Heeg et al.” ). 这样的天然寡核苷酸可以被认为是不稳定的免 疫调节剂。 因此， 在文献中已经广泛报告了通过用硫代磷酸酯基团取代磷酸二酯连接基团， 化学地稳定这些键的方法。参见美国专利 6811975-Phosphorothioate Oligonucleotides Having Modified Internucleoside Linkages。
     作为疫苗佐剂， 含有硫代磷酸酯 CpG 的寡核苷酸已经被全身给药。Yu 等人。然 而， 稳定的 CpG 寡核苷酸的全身给药可以导致脱靶免疫刺激效应， 例如一般的炎症、 淋 巴 细 胞 的 非 特 异 活 化、 以 及 类 似 流 感 的 症 状。Haas， T.， 等 人， Sequence independent interferon-alpha induction by multimerized phosphodiester DNA depends on spatial regulation of Toll-like receptor-9activation in plasmacytoid dendritic cells.Immunology， 2009.126(2) ： p.290-8(“Haas et al.” ). 因此， 在实践本发明中， 这样 的寡核苷酸可以被有用地结合， 如在以下更详细地说明的那样。
     本发明的诸位发明人已经意外地并且令人惊讶地发现， 通过实践在此披露的本发 明， 可以克服以上提到的问题和限制。 特别是， 本发明的诸位发明人已经意外地发现可能与 相关方法一起提供一种组合物， 包括 ： 包括偶合到合成纳米载体上的免疫调节剂的合成纳 米载体 ； 其中该免疫调节剂， 优选是不稳定的免疫调节剂， 根据以下关系从合成纳米载体解 离：
     IArel(4.5)t％ /IArel(7.4)t％≥ 1.2 ；
     其中 IArel(4.5)t％被定义为在 pH ＝ 4.5， 将合成纳米载体暴露于体外水环境 t 小 时， 释放的免疫调节剂的重量除以在 pH ＝ 4.5， 将合成纳米载体暴露于体外水环境 t 小时，释放的免疫调节剂的重量加上在 pH ＝ 4.5， 将合成纳米载体暴露于体外水环境 t 小时， 保留 在合成纳米载体中的免疫调节剂的重量之和， 表示为重量百分数， 并且被取作跨合成纳米 载体样品的平均数 ； 并且其中 IArel(7.4)t％被定义为在 pH ＝ 7.4， 将合成纳米载体暴露于 体外水环境 t 小时， 释放的免疫调节剂的重量除以在 pH ＝ 7.4， 将合成纳米载体暴露于体 外水环境 t 小时， 释放的免疫调节剂的重量加上在 pH ＝ 7.4， 将合成纳米载体暴露于体外 水环境 t 小时， 保留在合成纳米载体中的免疫调节剂的重量之和， 表示为重量百分数， 并且 被取作跨合成纳米载体样品的平均数 ； 并且其中 t 为 2、 4、 6、 8、 10、 12、 14、 16、 18、 20、 22、 24、 26、 28、 或 30 小时。
     在一些实施方案中， 免疫调节剂， 优选是不稳定的免疫调节剂， 根据以下关系从 合成纳米载体解离 ： IArel(4.5)t ％ /IArel(7.4)t ％ ≥ 1.3， IArel(4.5)t ％ /IArel(7.4) IArel(4.5)t ％ /IArel(7.4)t ％≥ 1.5， IArel(4.5)t ％ /IArel(7.4)t ％≥ 1.6， t ％≥ 1.4， IArel(4.5)t％ /IArel(7.4)t％≥ 1.7， IArel(4.5)t％ /IArel(7.4)t％≥ 1.8， IArel(4.5) IArel(4.5)t％ /IArel(7.4)t％≥ 2， IArel(4.5)t％ /IArel(7.4) t％ /IArel(7.4)t％≥ 1.9， IArel(4.5)t ％ /IArel(7.4)t ％≥ 2.5， IArel(4.5)t ％ /IArel(7.4)t ％≥ 2.7， t ％≥ 2.2， IArel(4.5)t％ /IArel(7.4)t％≥ 3， IArel(4.5)t％ /IArel(7.4)t％≥ 3.5， IArel(4.5)t％ /IArel(7.4)t ％≥ 4， IArel(4.5)t ％ /IArel(7.4)t ％≥ 4.5， IArel(4.5)t ％ /IArel(7.4) ％ ≥ 5， IArel(4.5)t ％ /IArel(7.4)t ％ ≥ 5.5， IArel(4.5)t ％ /IArel(7.4)t ％ ≥ 6， IArel(4.5)t ％ /IArel(7.4)t ％ ≥ 6.5， IArel(4.5)t ％ /IArel(7.4)t ％ ≥ 7， IArel(4.5) IArel(4.5)t ％ /IArel(7.4)t ％ ≥ 8， IArel(4.5)t ％ / t ％ /IArel(7.4)t ％ ≥ 7.5， IArel(7.4)t％≥ 8.5， IArel(4.5)t％ /IArel(7.4)t％≥ 9， IArel(4.5)t％ /IArel(7.4)t％ ≥ 9.5， IArel(4.5)t ％ /IArel(7.4)t ％≥ 10， IArel(4.5)t ％ /IArel(7.4)t ％≥ 10.5， or IArel(4.5)t％ /IArel(7.4)t％≥ 11， 其中 IArel(4.5)t％， IArel(7.4)t％， 并且 t 如以上定 义的那样。
     在其他实施方案中， 免疫调节剂， 优选是不稳定的免疫调节剂， 根据以下关系从 合成纳米载体解离 ： 2 ≤ IArel(4.5)t ％ /IArel(7.4)t ％ ≥ 1.2， 2.5 ≤ IArel(4.5)t ％ / IArel(7.4)t ％ ≥ 1.2， 3 ≤ IArel(4.5)t ％ /IArel(7.4)t ％ ≥ 1.2， 3.5 ≤ IArel(4.5)t ％ /IArel(7.4)t ％ ≥ 1.2， 4 ≤ IArel(4.5)t ％ /IArel(7.4)t ％ ≥ 1.2， 4.5 ≤ IArel(4.5) 5 ≤ IArel(4.5)t ％ /IArel(7.4)t ％ ≥ 1.2， 6 ≤ IArel(4.5) t ％ /IArel(7.4)t ％ ≥ 1.2， 7 ≤ IArel(4.5)t ％ /IArel(7.4)t ％ ≥ 1.2， 8 ≤ IArel(4.5) t ％ /IArel(7.4)t ％ ≥ 1.2， 9 ≤ IArel(4.5)t ％ /IArel(7.4)t ％ ≥ 1.2， 10 ≤ IArel(4.5) t ％ /IArel(7.4)t ％ ≥ 1.2， 10 ≤ IArel(4.5)t ％ /IArel(7.4)t ％ ≥ 2， 10 ≤ IArel(4.5) t ％ /IArel(7.4)t ％ ≥ 1.2， 10 ≤ IArel(4.5)t ％ /IArel(7.4)t ％ ≥ 3， 10 ≤ IArel(4.5) t ％ /IArel(7.4)t ％ ≥ 2.5， 10 ≤ IArel(4.5)t ％ /IArel(7.4)t ％ ≥ 4， 10 ≤ IArel(4.5) t ％ /IArel(7.4)t ％ ≥ 3.5， 10 ≤ IArel(4.5)t ％ /IArel(7.4)t ％ ≥ 5， 10 ≤ IArel(4.5) t ％ /IArel(7.4)t ％ ≥ 4.5， 10 ≤ IArel(4.5)t ％ /IArel(7.4)t ％ ≥ 7， 10 ≤ IArel(4.5) t ％ /IArel(7.4)t ％ ≥ 6， 10 ≤ IArel(4.5)t ％ /IArel(7.4)t ％ ≥ 9， 3 ≤ IArel(4.5) t ％ /IArel(7.4)t ％ ≥ 8， 4 ≤ IArel(4.5)t ％ /IArel(7.4)t ％ ≥ 3， 5 ≤ IArel(4.5)t ％ t ％ /IArel(7.4)t ％ ≥ 2， /IArel(7.4)t ％ ≥ 4， 6 ≤ IArel(4.5)t ％ /IArel(7.4)t ％ ≥ 5， 7 ≤ IArel(4.5)t ％ / IArel(7.4)t ％ ≥ 6， 8 ≤ IArel(4.5)t ％ /IArel(7.4)t ％ ≥ 7， or 9 ≤ IArel(4.5)t ％ /tIArel(7.4)t％≥ 8， 其中 IArel(4.5)t％， IArel(7.4)t％， 并且 t 如以上定义的那样。在一 些实施方案中， t 是 24 小时。
     因此， 本发明涉及包括在中性和酸性 pH 以显著不同的速率释放免疫调节剂的合 成纳米载体的组合物和方法。 在递送免疫调节剂中， 为了具有最有效的作用， 希望使得多数 免疫调节剂在它们可以具有希望的作用的 APC 内释放。在以游离态注射免疫调节剂时， 或 者在它们从 APC 外的合成纳米颗粒释放时， 只有小部分免疫调节剂找到它们通往 APC 的路， 同时剩余的通过身体扩散， 其中免疫刺激会更少并且会导致有害效果。在此提供的本发明 的合成纳米载体优先地被 APC 接收。 在被 APC 接收时， 假定合成纳米载体被内吞到内含体 / 溶酶体区室， 那里 pH 变得更酸， 和细胞外的中性 pH 相反。在这些条件下， 免疫调节剂表现 出从合成纳米载体 ( 例如从免疫调节剂偶合部分 ) 的 pH 敏感的解离并且从合成纳米载体 释放。然后免疫调节剂与内含体 / 溶酶体相关受体自由地相互作用， 并且刺激希望的免疫 应答。在或约中性 pH 下， 或者在或约生理 pH( 即 pH ＝ 7.4) 的实施方案中， 本发明的合成 纳米载体具有免疫调节剂的更低释放的特性， 但是对于它靶向免疫调节剂至合成纳米载体 靶向的 APC 的内含体 / 溶酶体区室， 在或约 4.5 的 pH 的增加的释放是希望的。
     通过很多方法中的任何一种， 免疫调节剂可以被偶合到合成纳米载体。 一般地， 偶 合可以是免疫调节剂和合成纳米载体之间的键合的结果。 该键合可以导致免疫调节剂被附 着到合成纳米载体表面和 / 或被包含 ( 胶囊化 ) 在合成纳米载体内。然而在一些实施方案 中， 由于合成纳米载体的结构， 免疫调节剂被合成纳米载体胶囊化而不是键合到合成纳米 载体。 在由于免疫调节剂和合成纳米载体之间的键合而发生偶合时， 经由一个免疫调节 剂偶合部分发生偶合。免疫调节剂偶合部分可以是任何部分， 免疫调节剂通过它被键合到 合成纳米载体上。 这样的部分包括共价键 ( 例如酰胺键或酯键 )， 连同键合 ( 共价地或非共 价地 ) 免疫调节剂至合成纳米载体的分离分子。这样的分子包括连接物或聚合物或它们的 单元。例如， 免疫调节剂偶合部分可以包括免疫调节剂 ( 例如一种免疫刺激核酸 ) 静电结 合的一种带电聚合物。如另一个实例， 免疫调节剂偶合部分可以包括免疫调节剂共价结合 的一种聚合物或其单元。
     在一些实施方案中， 该聚合物或其单元包括聚酯、 聚碳酸酯、 聚酰胺、 或聚醚、 或其 单元。在其他实施方案中， 该聚合物或其单元包括聚 ( 乙二醇 )(PEG)、 聚 ( 乳酸 )、 聚(乙 醇酸 )、 聚 ( 乳酸 - 乙醇酸 ) 共聚物、 或聚己酸内酯、 或其单元。在一些实施方案中， 优选该 聚合物是生物可降解的。因此， 在这些实施方案中， 优选如果该聚合物包括聚醚 ( 例如聚 ( 乙二醇 ) 或其单元 )， 那么该聚合物包括聚醚和生物可降解聚合物的嵌段共聚物， 这样该 聚合物是生物可降解的。在其他实施方案中， 该聚合物并不单独包括聚醚或其单元 ( 例如 聚 ( 乙二醇 ) 或其单元 )。因此如在此提供的免疫调节剂偶合部分可以包括一个以上提到 的聚合物或其单元 ( 例如一种丙交酯或乙交酯 )。
     在一些实施方案中， 对于用作合成纳米载体的一部分， 在 pH ＝ 7.4 并且在 25 ℃ 下， 在此提供的化合物或结合物的聚合物在水中是不可溶的， 是生物可降解的， 或者同时具 有这二者。在其他实施方案中， 在 pH ＝ 7.4 并且在 25℃下， 该聚合物在水中是不可溶的， 但是在 pH ＝ 4.5 并且在 25℃下是可溶的。仍在其他实施方案中， 在 pH ＝ 7.4 并且在 25℃ 下， 该聚合物在水中是不可溶的， 但是在 pH ＝ 4.5 并且在 25℃下是可溶的并且生物可降解
     的。 在其他实施方案中， 如使用凝胶渗透色谱法确定的那样， 任何在此提供的聚合物可以具 有约 800Da 至 10,000Da( 例如 2,000Da) 的重均分子量。
     在一些实施方案中， 免疫调节剂可以是一种佐剂 ( 例如咪唑并喹啉 )。 咪唑并喹啉 包括多种化合物， 例如咪喹莫特和瑞喹莫德 ( 也称为 R848)。 这样的佐剂可以被偶合到如以 上提到的聚合物上。如一个实例， 瑞喹莫德可以被结合到约 2000Da 的聚乳酸 (PLA) 聚合物 上。在体外释放研究中， 这样的一个实施方案证明在 pH 从 7.4 跌至 4.5 时， R848 的释放增 加了 3- 至 6- 倍。表 1 列出了测试的颗粒的组合物。这些包括了胶囊化 R848 的两种配制 品， 2 种具有通过 R848 胺共价偶合到 R848 的 PLA 的配制品， 四种具有共价偶合到 R848( 经 由一种开环作用方法 ) 的 PLA 的配制品。在所有配制品中， 在更低 pH 值， R848 的释放显著 增加。胶囊化的释放速率远远快于结合的释放速率， 并且在这些结合方法之间的释放速率 中也存在差异。
     表 1 具有共价 R848 的配制品靶
     13CN 102481374 A
     ＊说明书9/55 页C ＝共价 R848 ； E ＝ R848 的胶囊化
     虽然以上实例是用 PLA， 但是免疫调节剂 ( 例如 R848) 可以被偶合到其他聚合物或 其单元 ( 例如以上和此处的其他地方提供的那些 )， 包括聚丙交酯乙交酯 (PLGA) 嵌段共聚 物或其单元。免疫调节剂 ( 例如 R848) 可以通过一个酰胺键或酯键被偶合到这样的聚合物 或其单元上。在此处的其他地方和实例中提供了用于影响这样的偶合的方法的实例。
     本发明的诸位发明人已经意外地发现可能与相关方法一起提供一种组合物， 包 括：
     包括偶合到合成纳米载体上的免疫调节剂的合成纳米载体 ； 其中该免疫调节剂， 优选是不稳定的免疫调节剂， 根据以下关系从合成纳米载体解离 ：
     IA(4.5)t1/IA(4.5)t2 ≥ 1.2 ；
     其中 IA(4.5)t1 被定义为在 pH ＝ 4.5， 将合成纳米载体暴露于体外水环境 t1 小 时， 被取作跨合成纳米载体样品的平均数的释放的免疫调节剂的重量 ； 并且其中 IA(4.5)t2 被定义为在 pH ＝ 4.5， 将合成纳米载体暴露于体外水环境 t2 小时， 被取作跨合成纳米载体 样品的平均数的释放的免疫调节剂的重量 ； 并且其中 t1 为 4、 6、 8、 10、 12、 14、 16、 18、 20、 22、 24、 26、 28 或 30 小时 ； t2 为 2、 4、 6、 8、 10、 12、 14、 16、 18、 20、 22、 24、 26、 或 28 小时 ； 并且 t1 ＞ t2。在一些实施方案中， t1 是 24 小时， 并且 t2 是 6 小时。
     在一些实施方案中， 免疫调节剂， 优选是不稳定的免疫调节剂， 根据以下关系从合 成纳米载体解离 ： IA(4.5)t1/IA(4.5)t2 ≥ 1.5， IA(4.5)t1/IA(4.5)t2 ≥ 2， IA(4.5)t1/IA(4.5) IA(4.5)t1/IA(4.5)t2 ≥ 3， IA(4.5)t1/IA(4.5)t2 ≥ 3.5， IA(4.5)t1/IA(4.5)t2 ≥ 4， t2 ≥ 2.5， IA(4.5)t1/IA(4.5)t2 ≥ 4.5， IA(4.5)t1/IA(4.5)t2 ≥ 5， IA(4.5)t1/IA(4.5)t2 ≥ 6， IA(4.5)t1/ IA(4.5)t2 ≥ 7， IA(4.5)t1/IA(4.5)t2 ≥ 8， IA(4.5)t1/IA(4.5)t2 ≥ 9， 或 IA(4.5)t1/IA(4.5) 其中 IA(4.5)t1、 IA(4.5)t2、 t1、 和 t2 如以上定义的那样。在一些实施方案中， t1 是 t2 ≥ 10 ； 24 小时， 并且 t2 是 6 小时。
     在其他实施方案中， 免疫调节剂， 优选是不稳定的免疫调节剂， 根据以下关系从 合成纳米载体解离： 10 ≤ IA(4.5)t1/IA(4.5)t2 ≥ 1.2， 10 ≤ IA(4.5)t1/IA(4.5)t2 ≥ 2， 10 ≤ IA(4.5)t1/IA(4.5)t2 ≥ 2.5， 10 ≤ IA(4.5)t1/IA(4.5)t2 ≥ 3， 10 ≤ IA(4.5)t1/IA(4.5) 10 ≤ IA(4.5)t1/IA(4.5)t2 ≥ 4， 10 ≤ IA(4.5)t1/IA(4.5)t2 ≥ 4.5， 10 ≤ IA(4.5)t1/ t2 ≥ 3.5， IA(4.5)t2 ≥ 5， 10 ≤ IA(4.5)t1/IA(4.5)t2 ≥ 6， 10 ≤ IA(4.5)t1/IA(4.5)t2 ≥ 7， 10 ≤ IA(4.5) 10 ≤ IA(4.5)t1/IA(4.5)t2 ≥ 9， 9 ≤ IA(4.5)t1/IA(4.5)t2 ≥ 1.2， t1/IA(4.5)t2 ≥ 8， 8 ≤ IA(4.5)t1/IA(4.5)t2 ≥ 1.2， 7 ≤ IA(4.5)t1/IA(4.5)t2 ≥ 1.2， 6 ≤ IA(4.5)t1/IA(4.5) 5 ≤ IA(4.5)t1/IA(4.5)t2 ≥ 1.2， 4.5 ≤ IA(4.5)t1/IA(4.5)t2 ≥ 1.2， 4 ≤ IA(4.5) t2 ≥ 1.2， 3.5 ≤ IA(4.5)t1/IA(4.5)t2 ≥ 1.2， 3 ≤ IA(4.5)t1/IA(4.5)t2 ≥ 1.2， t1/IA(4.5)t2 ≥ 1.2， 2.5 ≤ IA(4.5)t1/IA(4.5)t2 ≥ 1.2， 2 ≤ IA(4.5)t1/IA(4.5)t2 ≥ 1.2， 1.5 ≤ IA(4.5)t1/ IA(4.5)t2 ≥ 1.2， 3 ≤ IA(4.5)t1/IA(4.5)t2 ≥ 2， 4 ≤ IA(4.5)t1/IA(4.5)t2 ≥ 3， 5 ≤ IA(4.5) 6 ≤ IA(4.5)t1/IA(4.5)t2 ≥ 5， 7 ≤ IA(4.5)t1/IA(4.5)t2 ≥ 6， 8 ≤ IA(4.5) t1/IA(4.5)t2 ≥ 4， or 9 ≤ IA(4.5)t1/IA(4.5)t2 ≥ 8 ； 其中 IA(4.5)t1、 IA(4.5)t2、 t1、 和 t2 如 t1/IA(4.5)t2 ≥ 7， 以上定义的那样。在一些实施方案中， t1 是 24 小时， 并且 t2 是 6 小时。
     本发明的合成纳米载体还已经显示表现出增大对特异性抗原的体液免疫反应的 特性。 已经发现提高了这样的增大的体液免疫反应， 在一些实施方案中， 具有免疫调节剂的更快释放。在一个实施方案中， 免疫调节剂是一种含有 CpG 的免疫刺激核酸， 并且含有 CpG 的免疫刺激核酸被胶囊化在合成纳米载体内。 在体外研究中， 进一步往下在实例中说明， 发 现含有 CpG 的免疫刺激核酸从合成纳米载体的最佳释放产生了对烟碱的提高的体液免疫 反应， 它还被偶合到合成纳米载体上。 在一些实施方案中， 发现这样的最佳释放导致对抗原 的抗体应答的更佳增大。
     最佳释放是免疫调节剂从合成纳米载体解离， 产生希望的一个或多个效果的最佳 水平。在一些实施方案中， 希望的效果是希望的水平的速发免疫反应 ( 即， 在给予合成纳米 载体以后很快发生的一种反应 )。 一般地， 速发免疫反应是一种在秒、 分钟、 或几个小时级别 上测量的反应。在其他实施方案中， 希望的效果是在几个小时以后发生的希望的水平的免 疫应答。 仍在其他实施方案中， 希望的效果是持续一个延长时段 ( 例如 1、 2、 5、 10、 15 或更多 小时 ) 的希望的水平的免疫应答。在其他实施方案中， 延长的时段是 1、 2、 5、 10、 15、 20、 25、 30 或更多天数。在进一步的实施方案中， 延长的时段是 1、 2、 5、 10 或更多月。在进一步的实 施方案中， 延长的时段是 1、 2、 5、 10 或更多年。在一些实施方案中， 提供最佳释放的合成纳 米载体的组合物是其中免疫调节剂根据以上关系之一从合成纳米载体解离的一种组合物。
     在实施方案中， 免疫调节剂， 优选是不稳定的免疫调节剂， 以满足以下关系的中 间速率从合成纳米载体解离 ： 6 ≤ IA(4.5)t1/IA(4.5)t2 ≥ 1.2， 5 ≤ IA(4.5)t1/IA(4.5) 4 ≤ IA(4.5)t1/IA(4.5)t2 ≥ 1.2， 3 ≤ IA(4.5)t1/IA(4.5)t2 ≥ 1.2， 2 ≤ IA(4.5) t2 ≥ 1.2， 6 ≤ IA(4.5)t1/IA(4.5)t2 ≥ 2， 6 ≤ IA(4.5)t1/IA(4.5)t2 ≥ 2.5， t1/IA(4.5)t2 ≥ 1.2， 6 ≤ IA(4.5)t1/IA(4.5)t2 ≥ 3， 6 ≤ IA(4.5)t1/IA(4.5)t2 ≥ 3.5， 6 ≤ IA(4.5)t1/IA(4.5) 6 ≤ IA(4.5)t1/IA(4.5)t2 ≥ 5， 4 ≤ IA(4.5)t1/IA(4.5)t2 ≥ 1.5， 3.5 ≤ IA(4.5)t1/ t2 ≥ 4， IA(4.5)t2 ≥ 1.5， 3 ≤ IA(4.5)t1/IA(4.5)t2 ≥ 1.5， 2.5 ≤ IA(4.5)t1/IA(4.5)t2 ≥ 1.5， 5 ≤ IA(4.5)t1/IA(4.5)t2 ≥ 2， 4 ≤ IA(4.5)t1/IA(4.5)t2 ≥ 2， 或 3 ≤ IA(4.5)t1/IA(4.5) 其中 IA(4.5)t1、 IA(4.5)t2、 t1、 和 t2 如以上定义的那样。在一些实施方案中， t1 是 t2 ≥ 2 ； 24 小时， 并且 t2 是 6 小时。
     如另一实例， 瑞喹莫德被胶囊化在合成纳米载体内。 在体外研究中， 进一步往下在 实例中说明， 发现包含在合成纳米载体内的瑞喹莫德增大了针对也偶合到合成纳米载体的 烟碱的体液免疫反应。还发现瑞喹莫德从合成纳米载体的中间释放是最佳的， 因为它导致 比瑞喹莫德的快或慢释放更高水平的抗体诱导。
     因此， 在此提供的合成纳米载体还可以包括一种或多种抗原。这些抗原可以是 B 细胞抗原或 T 细胞抗原或这二者的一个组合。这样的抗原可以被偶合到合成纳米载体上， 这样在一些实施方案中， 它们存在于合成纳米载体表面上、 胶囊化在合成纳米载体内或这 二者并存。在实施方案中， 免疫调节剂增大了对这样的抗原的免疫应答。如以上提到的那 样， 抗原还可以被偶合到合成纳米载体上。 然而在其他实施方案中， 例如抗原未偶合到合成 纳米载体上。在一些这些实施方案中， 这样的抗原可以被同时给予受试者。仍在其他这些 实施方案中， 这样的抗原未被同时给予受试者。
     定义
     “佐剂” 是指并不构成特异性抗原， 但是促进对抗原的免疫应答的强度和持续时 间的试剂。这样的佐剂可以包括， 但并不局限于模式识别受体 ( 例如 Toll 样受体、 RIG-1 和 NOD 样受体 ) 的刺激剂、 矿物盐 ( 例如明矾， 与肠道细菌 ( 例如大肠杆菌、 明尼苏达沙氏杆菌、 鼠伤寒沙门菌、 或弗氏志贺菌 ) 的单磷酰脂质 (MPL)A 结合的明矾或分别与 (AS04)、 以上提到的细菌的 MPL A 特异结合的明矾 )、 皂苷 ( 例如 QS-21、 Quil-A)、 ISCOMs、 ISCOMATRIXTM、 乳液 ( 例如 MF59TM、 + ISA 51 和 ISA 720)、 AS02(QS21+ 角鲨烯 )、 脂质体和脂质体配制品 ( 例如 AS01)、 合成的或特别制备的微颗粒和微载体 嵌段共聚物 )、 特异性修饰或制备的肽 ( 例( 例如淋病奈瑟菌 (N.gonorrheae)、 沙眼衣原体和其他细菌的细菌衍生的外膜泡 (OMV))、 或壳聚糖颗粒、 贮存形成剂 ( 例如 如胞壁酰二肽 )、 氨基烷基氨基葡糖苷 4- 磷酸盐 ( 例如 RC529)、 或蛋白质 ( 例如细菌类毒 素或毒素片段 )。在实施方案中， 佐剂包括用于模式识别受体 (PRR)( 包括但并不局限于 Toll 样受体 (TLR)， 特别是 TLR2、 3、 4、 5、 7、 8、 9 和 / 或其组合 ) 的激动剂。在其他实施方案 中， 佐剂包括用于 Toll 样受体 3 的激动剂、 用于 Toll 样受体 7 和 8 的激动剂、 或用于 Toll 样受体 9 的激动剂 ； 优选这些列举的佐剂包括咪唑并喹啉 ； 例如瑞喹莫德 ( 也称为 R848) ； 腺嘌呤衍生物 ( 例如在美国专利 6,329,381(Sumitomo Pharmaceutical Company) 中披露 的那些 ) ； 免疫刺激 DNA ； 或免疫刺激 RNA。在特定的实施方案中， 合成纳米载体合并了作 为佐剂化合物的对于 toll 样受体 (TLR)7&8 的激动剂 (“TLR 7/8 激动剂” )。它的效用 包括但是不局限 是 Tomai 等人的美国专利 6,696,076 中披露的 TLR 7/8 激动剂化合物， 于咪唑并喹啉胺、 咪唑并吡啶胺、 6， 7- 稠合环烷基咪唑并吡啶胺、 以及 1， 2- 桥接咪唑并喹 啉胺。优选佐剂包括咪喹莫特和瑞喹莫德。在特定的实施方案中， 佐剂可以是 DC 表面分 子 CD40 的激动剂。在某些实施方案中， 合成纳米载体合并了促进 DC 成熟 ( 需要有效启动 幼稚 T 细胞 ) 并且产生细胞因子的佐剂， 例如类型 I 干扰素， 它依次刺激针对希望的抗原 的抗体和细胞毒性的免疫应答。在实施方案中， 佐剂还可以包括免疫刺激 RNA 分子 ( 例如 但并不局限于 dsRNA 或聚 I:C(TLR3 刺激剂 )、 和 / 或在 F.Heil 等人， “Species-Specific Recognition of Single-Stranded RNA via Toll-like Receptor 7 and 8” Science 303(5663)， 1526-1529(2004) ； J.Vollmer 等 人， “Immune modulation by chemically modified ribonucleosides and oligoribonucleotides” WO 2008033432 A2 ； A.Forsbach 等 人， “Immunostimulatory oligoribonucleotides containing specific sequence motif(s)and targeting the Toll-like receptor 8 pathway” WO2007062107A2 ； E.Uhlmann 等 人， “Modified oligoribonucleotide analogs with enhanced immunostimulatory activity” U.S.Pat.Appl.Publ.US2006241076 ； G.Lipford 等 人， “Immunostimulatory viral RNA oligonucleotides and use for treating cancer and infections” WO 2005097993A2 ； G.Lipford 等 人， “Immunostimulatory G， U-containing oligoribonucleotides， compositions， and screening methods” WO 2003086280A2 中 披露的那些。在一些实施方案中， 佐剂可以是 TLR-4 激动剂 ( 例如细菌的脂多糖 (LPS)、 VSV-G、 和 / 或 HMGB-1。在一些实施方案中， 佐剂可以包括 TLR-5 激动剂 ( 例如鞭毛蛋 白、 或它的一部分或衍生物 )， 包括但并不局限于在美国专利 6,130,082、 6,585,980、 和 7,192,725 中披露的那些。在特定的实施方案中， 合成纳米载体合并了用于 Toll 样受体 (TLR)-9 的配体 ( 例如包括 5’ -CG-3’ 基序的免疫刺激寡核苷酸分子， 其中 C 是未甲基化 的 )， 它诱导类型 I 干扰素分泌， 并且刺激 T 细胞和 B 细胞活化， 导致增加的抗体生产和 细胞毒性的 T 细胞应答 (Krieg 等人， CpG motifs in bacterial DNA trigger direct B cell activation.Nature.1995.374 ： 546-549 ； Chu 等 人， CpG oligodeoxynucleotidesact as adjuvants that switch on T helper 1(Th1)immunity.J.Exp.Med.1997.186 ： 1623-1631 ； Lipford 等人， CpG-containing synthetic oligonucleotides promote B and cytotoxic T cell responses to protein antigen ： a new class of vaccine adjuvants. Eur.J.Immunol.1997.27 ： 2340-2344 ； Roman 等 人， Immunostimulatory DNA sequences function as T helper-1-promoting adjuvants.Nat.Med.1997.3 ： 849-854 ； Davis 等 人， CpG DNA is a potent enhancer of specific immunity in mice immunized with recombinant hepatitis B surface antigen.J.Immunol.1998.160 ： 870-876 ； Lipford 等 人， Bacterial DNA as immune cell activator.Trends Microbiol.1998.6 ： 496-500)。 在 一些实施方案中， 佐剂可以是从坏死细胞释放的促炎刺激物 ( 例如尿酸盐晶体 )。 在一些实 施方案中， 佐剂可以是补体级联的活化组分 ( 例如 CD21、 CD35、 等 )。在一些实施方案中， 佐 剂可以是免疫复合物的活化组分。这些佐剂还包括补体受体激动剂 ( 例如结合到 CD21 或 CD35 上的分子 )。在一些实施方案中， 该补体受体激动剂诱导了合成纳米载体的内源补体 调理素作用。 在一些实施方案中， 佐剂是细胞因子， 它是由细胞释放的小的蛋白或生物因子 ( 在 5kD-20kD 的范围内 )， 并且具相关于细胞 - 细胞相互作用、 通讯以及其他细胞的行为的 特定效应。在一些实施方案中， 该细胞因子受体激动剂是小分子、 抗体、 融合蛋白、 或适体。 “给予” 或 “给药” 是指以一种药理学上有用的方式， 将药物提供给患者。
     “APC 靶向特征” 是指本发明的合成纳米载体所包括的一个或多个部分， 这一个或 多个部分靶向合成纳米载体至专职抗原递呈细胞 ( “APCs” )( 例如但并不局限于树突细胞、 SCS 巨噬细胞、 滤泡树突细胞、 以及 B 细胞 )。在实施方案中， APC 靶向特征可以包括一个或 多个免疫特征表面和 / 或多个靶向部分， 这些靶向部分将已知靶结合在 APCs 上。在实施方 案中， APC 靶向特征可以包括存在于合成纳米载体表面上的一个或多个 B 细胞抗原。在实 施方案中， APC 靶向特征还可以包括选择的一个或多个尺寸的这些合成纳米颗粒用来通过 APCs 促进摄入。
     在实施方案中， 用于在巨噬细胞 (“Mphs” ) 上的已知靶的靶向部分包括特异性地 结合任何实体 ( 例如蛋白、 脂类、 碳水化合物、 小分子、 等 ) 的任何靶向部分， 这些实体显著 表达和 / 或存在于巨噬细胞上 ( 即被膜下窦 -Mph 标记 )。示例性的 SCS-Mph 标记包括， 但并不局限于， CD4(L3T4， W3/25， T4) ； CD9(p24， DRAP-1， MRP-1) ； CD11a(LFA-1α， αL 整 联蛋白链 ) ； CD11b(αM 整联蛋白链， CR3， Mo1， C3niR， Mac-1) ； CD11c(αX 整联蛋白， p150， 95， AXb2) ； CDw12(p90-120) ； CD13(APN， gp150， EC 3.4.11.2) ； CD14(LPS-R) ； CD15(X- 半 抗 原， Lewis， X， SSEA-1， 3-FAL) ； CD15s( 唾 液 酰 Lewis X) ； CD15u(3 ′ 磺 基 Lewis X) ； CD15su(6 磺基唾液酰 Lewis X) ； CD16a(FCRIIIA) ； CD16b(FcgRIIIb) ； CDw17( 乳糖酶基神经 鞘氨醇， LacCer) ； CD18( 整联蛋白 β2， CD11a， b， cβ- 亚基 ) ； CD26(DPP IV ectoeneyme， ADA 结 合 蛋 白 ) ； CD29( 血 小 板 GPIIa， β-1 整 联 蛋 白， GP) ； CD31(PECAM-1， Endocam) ； CD32(FCγRII) ； CD33(gp67) ； CD35(CR1， C3b/C4b 受 体 ) ； CD36(GpIIIb， GPIV， PASIV) ； CD37(gp52-40) ； CD38(ADP- 核 糖 基 环 化 酶， T10) ； CD39(ATP 脱 氢 酶， NTP 脱 氢 酶 -1) ； CD40(Bp50) ； CD43( 涎 蛋 白， 增白细胞蛋白 )； CD44(EMCRII， H-CAM， Pgp-1) ； CD45(LCA， T200， B220， Ly5) ； CD45RA ； CD45RB ； CD45RC ； CD45RO(UCHL-1) ； CD46(MCP) ； CD47(gp42， IAP， OA3，神 经 纤 毛 蛋 白 ) ； CD47R(MEM-133) ； CD48(Blast-1， Hulym3， BCM-1， OX-45) ； CD49a(VLA-1α， α1 整联蛋白 ) ； CD49b(VLA-2α， gpla， α2 整联蛋白 ) ； CD49c(VLA-3α，
     α3 整联蛋白 ) ； CD49e(VLA-5α， α5 整联蛋白 ) ； CD49f(VLA-6α， α6 整联蛋白， gplc) ； CD50(ICAM-3) ； CD51( 整 联 蛋 白 α， VNR-α， V 玻 连 蛋 白 -Rα) ； CD52(CAMPATH-1， HE5) ； CD53(OX-44) ； CD54(ICAM-1) ； CD55(DAF) ； CD58(LFA-3) ； CD59(1F5Ag， H19， 保护素， MACIF， MIRL， P-18) ； CD60a(GD3) ； CD60b(9-O- 乙 酰 基 GD3) ； CD61(GP IIIa， β3 整 联 蛋 白 ) ； CD62L(L- 选 择 素， LAM-1， LECAM-1， MEL-14， Leu8， TQ1) ； CD63(LIMP， MLA1， gp55， NGA， LAMP-3， ME491) ； CD64(FcγRI) ； CD65( 神 经 酰 胺， VIM-2) ； CD65s( 唾 液 酸 化 的 -CD65， VIM2) ； CD72(Ly-19.2， Ly-32.2， Lyb-2) ； CD74(Ii， 恒定链 ) ； CD75( 唾液掩蔽的乳糖胺 ) ； CD75S(α2， 6 唾液酸化的乳糖胺 ) ； CD80(B7， B7-1， BB1) ； CD81(TAPA-1) ； CD82(4F9， C33， IA4， KAI1， R2) ； CD84(p75， GR6) ； CD85a(ILT5， LIR2， HL9) ； CD85d(ILT4， LIR2， MIR10) ； CD85j(ILT2 ， LIR1 ， MIR7) ； CD85k(ILT3 ， LIR5 ， HM18) ； CD86(B7-2/B70) ； CD87(uPAR) ； CD88(C5aR) ； CD89(IgA Fc 受 体， FcαR) ； CD91(α2M-R， LRP) ； CDw92(p70) ； CDw93(GR11) ； CD95(APO-1， FAS， TNFRSF6) ； CD97(BL-KDD/F12) ； CD98(4F2， FRP-1， RL-388) ； CD99(MIC2， E2) ； CD99R(CD99Mab 限制的 ) ； CD100(SEMA4D) ； CD101(IGSF2， P126， V7) ； CD102(ICAM-2) ； CD111(PVRL1， HveC， PRR1， Nectin 1， HIgR) ； CD112(HveB， PRR2， PVRL2， 粘 合 素 2) ； CD114(CSF3R， G-CSRF， HG-CSFR) ； CD115(c-fms， CSF-1R， M-CSFR) ； CD116(GMCSFRα) ； CDw119(IFN γ R ， IFN γ RA) ； CD120a(TNFRI ， p55) ； CD120b(TNFRII ， p75 ， TNFR p80) ； CD121b( 类 型 2IL-1R) ； CD122(IL2Rβ) ； CD123(IL-3Rα) ； CD124(IL-4Rα) ； CD127(p90， IL-7R， IL-7Rα) ； CD128a(IL-8Ra， CXCR1， ( 暂 时 重 命 名 为 CD181)) ； CD128b(IL-8Rb， CSCR2， ( 暂 时 重 命 名 为 CD182)) ； CD130(gp130) ； CD131( 公 共 β 亚 基 ) ； CD132( 公 共 γ 链， IL-2Rγ) ； CDw136(MSP-R， RON， p158-ron) ； CDw137(4-1BB， ILA) ； CD139 ； CD141( 血栓调 节素， 胎儿调节素 ) ； CD147(Basigin， EMMPRIN， M6， OX47) ； CD148(HPTP-η， p260， DEP-1) ； CD155(PVR) ； CD156a(CD156， ADAM8， MS2) ； CD156b(TACE， ADAM17， cSVP) ； CDw156C(ADAM10) ； CD157(Mo5 ，BST-1) ； CD162(PSGL-1) ； CD164(MGC-24 ，MUC-24) ； CD165(AD2 ，gp37) ； CD168(RHAMM， IHABP， HMMR) ； CD169( 唾 液 酸 粘 附 素， 涎 免 凝 集 素 -1) ； CD170( 涎 免 凝 集 素 5) ； CD171(L1CAM， NILE) ； CD172(SIRP-1α， MyD-1) ； CD172b(SIRPβ) ； CD180(RP105， Bgp95， Ly64) ； CD181(CXCR1， ( 以 前 称 为 CD128a)) ； CD182(CXCR2， ( 以 前 称 为 CD128b)) ； CD184(CXCR4 ， NPY3R) ； CD191(CCR1) ； CD192(CCR2) ； CD195(CCR5) ； CDw197(CCR7( 是 CDw197)) ； CDw198(CCR8) ； CD204(MSR) ； CD205(DEC-25) ； CD206(MMR) ； CD207( 胰 岛 蛋 白 )； CDw210(CK) ； CD213a(CK) ； CDw217(CK) ； CD220( 胰 岛 素 R) ； CD221(IGF1 R) ； CD222(M6P-R， IGFII-R) ； CD224(GGT) ； CD226(DNAM-1， PTA1) ； CD230( 朊病毒蛋白 (PrP)) ； CD232(VESP-R) ； CD244(2B4， P38， NAIL) ； CD245(p220/240) ； CD256(APEIL， TALL2， TNF( 配 体 ) 超家族， 成员 13) ； CD257(BLYS， TALL1， TNF( 配体 ) 超家族， 成员 13b) ； CD261(TRAIL-R1， TNF-R 超 家 族， 成 员 10a) ； CD262(TRAIL-R2， TNF-R 超 家 族， 成 员 10b) ； CD263(TRAIL-R3， TNBF-R 超家族， 成员 10c) ； CD264(TRAIL-R4， TNF-R 超家族， 成员 10d) ； CD265(TRANCE-R， TNF-R 超家族， 成员 11a) ； CD277(BT3.1， B7 家族 ： 嗜乳脂蛋白 3) ； CD280(TEM22， ENDO180) ； CD281(TLR1， TOLL- 样 受 体 1) ； CD282(TLR2， TOLL- 样 受 体 2) ； CD284(TLR4， TOLL- 样 受 体 4) ； CD295(LEPR) ； CD298(ATP1B3， Na KATP 酶， β3 亚 基 ) ； CD300a(CMRF-35H) ； CD300c(CMRF-35A) ； CD300e(CMRF-35L1) ； CD302(DCL1) ； CD305(LAIR1) ； CD312(EMR2) ； CD315(CD9P1) ； CD317(BST2) ； CD321(JAM1) ； CD322(JAM2) ； CDw328( 涎 免 凝 集 素 7) ；CDw329( 涎免凝集素 9) ； CD68(gp 110， 巨涎蛋白 (Macrosialin)) ； 和 / 或甘露糖受体 ； 其中 在括号中列出的名字代表可替代的名字。
     在实施方案中， 用于在树突细胞 (“DCs” ) 上的已知靶的靶向部分包括特异性 地结合任何实体 ( 例如蛋白、 脂类、 碳水化合物、 小分子、 等 ) 的任何靶向部分， 这些实体 显著表达和 / 或存在于 DCs 上 ( 即一种 DC 标记 )。示例性的 DC 标记包括， 但并不局限 于， CD1a(R4， T6， HTA-1) ； CD1b(R1) ； CD1c(M241， R7) ； CD1d(R3) ； CD1e(R2) ； CD11b(αM 整 联 蛋 白 链， CR3， Mo1， C3niR， Mac-1) ； CD11c(αX 整 联 蛋 白， p150， 95， AXb2) ； CDw117( 乳 糖 酶 基 神 经 鞘 氨 醇， LacCer) ； CD19(B4) ； CD33(gp67) ； CD 35(CR1， C3b/C4b 受 体 ) ； CD 36(GpIIIb， GPIV， PASIV) ； CD39(ATP 脱 氢 酶， NTP 脱 氢 酶 -1) ； CD40(Bp50) ； CD45(LCA， T200， B220， Ly5) ； CD45RA ； CD45RB ； CD45RC ； CD45RO(UCHL-1) ； CD49d(VLA-4α， α4 整 联 蛋 白 )； CD49e(VLA-5α， α5 整 联 蛋 白 ) ； CD58(LFA-3) ； CD64(FcγRI) ； CD72(Ly-19.2， Ly-32.2， Lyb-2) ； CD73(Ecto-5’ nucloticlase) ； CD74(Ii， 恒 定 链 ) ； CD80(B7， B7-1， BB1) ； CD81(TAPA-1) ； CD83(HB15) ； CD85a(ILT5， LIR3， HL9) ； CD85d(ILT4， LIR2， MIR10) ； CD85j(ILT2 ， LIR1 ， MIR7) ； CD85k(ILT3 ， LIR5 ， HM18) ； CD86(B7-2/B70) ； CD88(C5aB) ； CD97(BL-KDD/F12) ； CD101(IGSF2， P126， V7) ； CD116(GM-CSFRα) ； CD120a(TMFRI， p55) ； CD120b(TNFRII ， p75 ， TNFR p80) ； CD123(IL-3R α ) ； CD139 ； CD148(HPTP- η， DEP-1) ； CD150(SLAM， IPO-3) ； CD156b(TACE， ADAM17， cSVP) ； CD157(Mo5， BST-1) ； CD167a(DDR1， trkE， cak) ； CD168(RHAMM， IHABP， HMMR) ； CD169( 唾 液 酸 黏 附 素，涎 免 凝 集 素 -1) ； CD170( 涎免凝集素 -5) ； CD171(L1CAM， MLE) ； CD172(SIRP-1α， MyD-1) ； CD172b(SIRPβ) ； CD180(RP105 ，Bgp95 ，Ly64) ； CD184(CXCR4 ，NPY3R) ； CD193(CCR3) ； CD196(CCR6) ； CD197(CCR7(wsCDw197)) ； CDw197(CCR7 ， EBI1 ， BLR2) ； CD200(OX2) ； CD205(DEC-205) ； CD206(MMR) ； CD207( 胰 岛 蛋 白 ) ； CD208(DC-LAMP) ； CD209(DCSIGN) ； CDw218a(IL18Rα) ； CDw218b(IL8Rβ) ； CD227(MUC1， PUM， PEM， EMA) ； CD230( 朊病毒蛋白 (PrP)) ； CD252(OX40L， TNF( 配体 ) 超家族， 成员 4) ； CD258(LIGHT， TNF( 配体 ) 超家族， 成员 14) ； CD265(TRANCE-R， TNF-R 超家族， 成员 11a) ； CD271(NGFR， p75， TNFR 超家族， 成员 16) ； CD273(B7DC， PDL2) ； CD274(B7H1， PDL1) ； CD275(B7H2， ICOSL) ； CD276(B7H3) ； CD277(BT3.1， B7 家 族 ： 嗜乳脂 蛋 白 3) ； CD283(TLR3， TOLL- 样 受 体 3) ； CD289(TLR9， TOLL- 样 受 体 9) ； CD295(LEPR) ； CD298(ATP1B3 ， Na K ATP 酶 β 3 亚 基 ) ； CD300a(CMRF-35H) ； CD300c(CMRF-35A) ； CD301(MGL1 ， CLECSF14) ； CD302(DCL1) ； CD303(BDCA2) ； CD304(BDCA4) ； CD312(EMR2) ； CD317(BST2) ； CD319(CRACC， SLAMF7) ； CD320(8D6) ； 以 及 CD68(gp110， 巨涎蛋白 ) ； II 类 MHC ； BDCA-1 ； 涎免凝集素 -H ； 其中在括号中列出的名字代表可替代的名字。
     在实施方案中， 可以通过特异性地结合任何实体 ( 例如蛋白、 脂类、 碳水化合物、 小分子、 等 ) 的任何靶向部分完成靶向， 这些实体显著表达和 / 或存在于 B 细胞上 ( 即 B 细 胞标记 )。示例性的 B 细胞标记包括， 但并不局限于， CD1c(M241， R7) ； CD1d(R3) ； CD2(E- 花 环 R， T11， LFA-2) ； CD5(T1， Tp67， Leu-1， Ly-1) ； CD6(T12) ； CD9(p24， DRAP-1， MRP-1) ； CD11a(LFA-1α， αL 整 联 蛋 白 链 ) ； CD11b(αM 整 联 蛋 白 链， CR3， Mo1， C3niR， Mac-1) ； CD11c(αX 整 联 蛋 白， P150， 95， AXb2) ； CDw17( 乳 糖 胺， LacCer) ； CD18( 整 联 蛋 白 β2， CD11a， b， cβ- 亚 基 ； CD19(B4) ； CD20(B1， Bp35) ； CD21(CR2， EBV-R， C3dR) ； CD22(BL-CAM， Lyb8， 涎免凝集素 -2) ； CD23(FceRII， B6， BLAST-2， Leu-20) ； CD24(BBA-1， HSA) ； CD25(Tac 抗原， IL-2Rα， p55) ； CD26(DPP IV ectoeneyme， ADA 结合蛋白 ) ； CD27(T14， S152) ； CD29( 血 小 板 GPIIa， β-1 整 联 蛋 白， GP) ； CD31(PECAM-1， Endocam) ； CD32(FCγRII) ； CD35(CR1， C3b/C4b 受体 ) ； CD37(gp52-40) ； CD38(ADP 核糖基环化酶， T10) ； CD39(ATP 脱氢酶， NTP 脱 氢酶 -1) ； CD40(Bp50) ； CD44(ECMRII， H-CAM， Pgp-1) ； CD45(LCA， T200， B220， Ly5) ； CD45RA ； CD45RB ； CD45RC ； CD45RO(UCHL-1) ； CD46(MCP) ； CD47(gp42， IAP， OA3， 抗人神经菌毛素 ) ； CD47R(MEM-133) ； CD48(Blast-1， Hulym3， BCM-1， OX-45) ； CD49b(VLA-2α， gpla， α2 整联 蛋白 ) ； CD49c(VLA-3α， α3 整联蛋白 ) ； CD49d(VLA-4α， α4 整联蛋白 ) ； CD50(ICAM-3) ； CD52(CAMPATH-1 ，HES) ； CD53(OX-44) ； CD54(ICAM-1) ； CD55(DAF) ； CD58(LFA-3) ； CD60a(GD3) ； CD62L(L- 选 择 素， LAM-1， LECAM-1， MEL-14， Leu8， TQ1) ； CD72(Ly-19.2， Ly-32.2， Lyb-2) ； CD73(Ecto-5 ′ - 核 苷 酸 酶 ) ； CD74(Ii， 恒定链 ) ； CD75L( 唾 液 掩 蔽 的 乳糖胺 ) ； CD75S(α2， 6 唾液酸化的乳糖胺 ) ； CD77(Pk 抗原， BLA， CTH/Gb3) ； CD79a(Igα， MB1) ； CD79b(Ig β，B29) ； CD80 ； CD81(TAPA-1) ； CD82(4F9 ，C33 ，IA4 ，KAI1 ，R2) ； CD83(HB15) ； CD84(P75， GR6) ； CD85j(ILT2， LIR1， MIR7) ； CDw92(p70) ； CD95(APO-1， FAS， TNFRSF6) ； CD98(4F2， FRP-1， RL-388) ； CD99(MIC2， E2) ； CD100(SEMA4D) ； CD102(ICAM-2) ； CD108(SEMA7A， JMH 血 型 抗 原 ) ； CDw119(IFNγR， IFNγRa) ； CD120a(TNFRI， p55) ； CD120b(TNFRII， p75， TNFR p80) ； CD121b( 类型 2IL-1R) ； CD122(IL2Rβ) ； CD124(IL-4Rα) ； CD130(gp130) ； CD132( 公共 γ 链， IL-2Rγ) ； CDw137(4-1BB， ILA) ； CD139 ； CD147(Basigin， EMMPRIN ， M6 ， OX47) ； CD150(SLAM ， IPO-3) ； CD162(PSGL-1) ； CD164(MGC-24 ， MUC-24) ； CD166(ALCAM， KG-CAM， SC-1， BEN， DM-GRASP) ； CD167a(DDR1， trkE， cak) ； CD171(L1CMA， NILE) ； CD175s( 唾 液 酰 -Tn(S-Tn)) ； CD180(RP105， Bgp95， Ly64) ； CD184(CXCR4， NPY3R) ； CD185(CXCR5) ； CD192(CCR2) ； CD196(CCR6) ； CD197(CCR7(was CDw197)) ； CDw197(CCR7， EBI1 ， BLR2) ； CD200(OX2) ； CD205(DEC-205) ； CDw210(CK) ； CD213a(CK) ； CDw217(CK) ； CDw218a(IL18Rα) ； CDw218b(IL18Rβ) ； CD220( 胰岛素 R) ； CD221(IGF1 R) ； CD222(M6P-R， IGFII-R) ； CD224(GGT) ； CD225(Leu13) ； CD226(DNAM-1， PTA1) ； CD227(MUC1， PUM， PEM， EMA) ； CD229(Ly9) ； CD230( 朊 病 毒 蛋 白 (Prp)) ； CD232(VESP-R) ； CD245(p220/240) ； CD247(CD3Zeta 链 ) ； CD261(TRAIL-R1， TNF-R 超家族， 成员 10a) ； CD262(TRAIL-R2， TNF-R 超家族， 成员 10b) ； CD263(TRAIL-R3， TNF-R 超家族， 成员 10c) ； CD264(TRAIL-R4， TNF-R 超 家族， 成员 10d) ； CD265(TRANCE-R， TNF-R 超家族， 成员 11a) ； CD267(TACI， TNF-R 超家族， 成员 13B) ； CD268(BAFFR， TNF-R 超家族， 成员 13C) ； CD269(BCMA， TNF-R 超家族， 成员 16) ； CD275(B7H2， ICOSL) ； CD277(BT3.1.B7 家族 ： 嗜乳脂蛋白 3) ； CD295(LEPR) ； CD298(ATP1B3 Na KATP 酶 β 3 亚 基 ) ； CD300a(CMRF-35H) ； CD300c(CMRF-35A) ； CD305(LAIR1) ； CD307(IRTA2) ； CD315(CD9P1) ； CD316(EW12) ； CD317(BST2) ； CD319(CRACC ， SLAMF7) ； CD321(JAM1) ； CD322(JAM2) ； CDw327( 涎 免 凝 集 素 6， CD33L) ； CD68(gp 100， 巨涎蛋白 ) ； CXCR5 ； VLA-4 ； II 类 MHC ； 表面 IgM ； 表面 IgD ； APRL ； 和 / 或 BAFF-R ； 其中在括号中列出的名 字代表可替代的名字。标记的实例包括在其他地方提供的那些。
     在一些实施方案中， 可以通过特异性地结合任何实体 ( 例如蛋白、 脂类、 碳水化 合物、 小分子、 等 ) 的任何靶向部分完成 B 细胞靶向， 这些实体显著表达和 / 或存在于经 活化的 B 细胞上 ( 即活化的 B 细胞标记 )。示例性的活化的 B 细胞标记包括， 但并不局限 于， CD1a(R4， T6， HTA-1) ； CD1b(R1) ； CD15s( 唾液酰 Lewis X) ； CD15u(3′磺基 Lewis X) ；CD15su(6 磺基 - 唾液酰 Lewis X) ； CD30(Ber-H2， Ki-1) ； CD69(AIM， EA1， MLR3， gp34/28， VEA) ； CD70(Ki-24， CD27 配体 ) ； CD80(B7， B7-1， BB1) ； CD86(B7-2/B70) ； CD97(BLKDD/F12) ； CD125(IL-5Rα) ； CD126(IL-6Rα) ； CD138( 多 配 体 聚 糖 -1， 硫酸乙酰肝素蛋白聚糖 ) ； CD152(CTLA-4) ； CD252(OX40L， TNF( 配体 ) 超家族， 成员 4) ； CD253(TRAIL， TNF( 配体 ) 超家 族， 成员 10) ； CD279(PD1) ； CD289(TLR9， TOLL- 样受体 9) ； 以及 CD312(EMR2) ； 其中在括号中 列出的名字代表可替代的名字。标记的实例包括在其他地方提供的那些。
     “B 细胞抗原” 是指天然地或者可以被构建为被 B 细胞识别的任何抗原， 并且触发 ( 天然地或如本领域中已知那样被构建 ) 在 B 细胞中的免疫应答 ( 例如被 B 细胞上的 B 细 胞受体特异性识别的抗原 )。在一些实施方案中， 是 T 细胞抗原的抗原也是 B 细胞抗原。在 其他实施方案中， T 细胞抗原并不也是 B 细胞抗原。B 细胞抗原包括， 但并不局限于蛋白、 肽、 小分子、 以及碳水化合物。在一些实施方案中， B 细胞抗原是非蛋白抗原 ( 即不是蛋白 或肽抗原 )。在一些实施方案中， B 细胞抗原是与传染物相关的碳水化合物。在一些实施方 案中， B 细胞抗原是与传染物相关的糖蛋白或糖肽。这些传染物可以是细菌、 病毒、 真菌、 原 生动物、 寄生虫或朊病毒。在一些实施方案中， B 细胞抗原是免疫原性差的抗原。在一些实 施方案中， B 细胞抗原是滥用的物质或其一部分。在一些实施方案中， B 细胞抗原是上瘾的 物质或其一部分。上瘾的物质包括， 但并不局限于烟碱、 麻醉剂、 止咳剂、 镇静剂、 以及安神 剂。在一些实施方案中， B 细胞抗原是毒素 ( 例如来自化学武器或天然来源的毒素 ) 或污 染物。B 细胞抗原还可以是危险的环境因素。在其他实施方案中， B 细胞抗原是异体抗原、 变应原、 接触性致敏原、 退行性疾病抗原、 半抗原、 传染病抗原、 癌抗原、 特应性疾病抗原、 上 瘾的物质、 异种抗原、 或代谢病酶或其酶产物。
     “可生物降解的聚合物” 是指在引入受试者体内时， 随时间降解的聚合物。生物可 降解的聚合物包括但并不局限于聚酯、 聚碳酸酯、 聚缩酮、 或聚酰胺。这样的聚合物可以包 括聚 ( 乳酸 )、 聚 ( 乙醇酸 )、 聚 ( 乳酸乙醇酸 ) 共聚物、 或聚己酸内酯。在一些实施方案 中， 该生物可降解的聚合物包括聚醚的嵌段共聚物 ( 例如聚 ( 乙二醇 ))、 以及聚酯、 聚碳酸 酯、 或聚酰胺、 或其他生物可降解的聚合物。在实施方案中， 该生物可降解的聚合物包括聚 ( 乙二醇 ) 和聚 ( 乳酸 ) 的嵌段共聚物、 聚 ( 乙醇酸 )、 聚 ( 乳酸乙醇酸 ) 共聚物、 或聚己酸 内酯。 然而在一些实施方案中， 该生物可降解的聚合物并不包括聚醚 ( 例如聚 ( 乙二醇 ))， 或单独由聚醚组成。 一般地， 在 pH ＝ 7.4 并且在 25℃下， 对于用作合成纳米载体的一部分， 该生物可降解的聚合物在水中是不可溶的。在实施方案中， 如使用凝胶渗透色谱法确定的 那样， 该生物可降解的聚合物具有范围从约 800 道尔顿至约 50,000 道尔顿的重均分子量。 在一些实施方案中， 如使用凝胶渗透色谱法确定的那样， 该重均分子量是从约 800 道尔顿 至约 10,000 道尔顿， 优选从 800 道尔顿至 10,000 道尔顿。在其他实施方案中， 如使用凝胶 渗透色谱法确定的那样， 该重均分子量是从 1000 道尔顿至 10,000 道尔顿。在一个实施方 案中， 该可生物降解的聚合物并不包括聚缩酮。
     “同时给予” 是指以一种时间相关的方式， 将两种或更多种药物给予受试者。在实 施方案中， 通过以相同剂型给予两种或更多种药物， 可以发生同时给予。在其他实施方案 中， 同时给予可以包括给予两种或更多种以不同剂型存在的药物， 但是给予是在特定时段 内， 优选在 1 个月内， 更优选在 1 周内， 仍更优选是在 1 天内， 并且甚至更优选是在 1 个小时 内。
     “偶合” 或 “偶接” 或 “偶联” ( 以及类似表述 ) 是附着到或包含在合成纳米载体内。在一些实施方案中， 该偶合是共价的。在一些实施方案中， 通过一个或多个连接物、 聚合物 或其单元介导共价偶合。在一些实施方案中， 该偶合是非共价的。在一些实施方案中， 通过 电荷相互作用、 亲和相互作用、 金属配位、 物理吸附、 主客体相互作用、 疏水相互作用、 TT 堆 积相互作用、 氢键相互作用、 范德华相互作用、 磁相互作用、 静电相互作用、 偶极 - 偶极相互 作用、 和 / 或它们的组合来介导该非共价偶合。在实施方案中， 使用常规技术， 在合成纳米 载体内的胶囊化的背景中， 可能出现该偶合。任何以上提到的偶合可以安排在一个表面上 或安排在本发明的合成纳米载体内。
     “衍生的” 是指从原始的源改变或改性。例如， 作为一个非限制性实例， 衍生自传染 性菌株的肽抗原可以具有取代在原始抗原中发现的天然氨基酸残基的若干非天然氨基酸 残基， 以上原始抗原是在传染性菌株中发现的。 这些改变或改性可以是为了多种原因， 包括 但并不局限于增加的特异性、 更容易的抗原加工、 或改进的安全性。
     “剂型” 是指药物在适合给予受试者的一种介质、 载体、 媒介物、 或装置中。
     一种本发明的组合物的 “有效量” 是对于某些目的有效的量。例如， 在该有效量是 对于一个治疗目的时， 那么该量对于治疗、 减轻、 改善、 救治、 延迟其发病、 抑制其进展、 减少 其严重性、 和 / 或减少在此提供的一种疾病、 失调、 和 / 或病情的一种或多种症状或特征的 发病率是有效的。
     “胶囊化” 是指胶囊化在合成纳米载体内， 优选完全胶囊化在合成纳米载体内。多 数或所有胶囊化的物质并不暴露于合成纳米载体外的局部环境。胶囊化不同于吸收， 后者 将多数或所有物质放置在合成纳米载体表面上， 并且使该物质暴露于合成纳米载体外的局 部环境。
     “表现出一种 pH 敏感的解离” 是指环境 pH 中的改变显著减少或消除在两个实体 ( 例如免疫调节剂和合成纳米载体或免疫调节剂偶合部分 ) 之间的偶合。 在实施方案中， 相 关的 pH 敏感的解离可以满足在此提供的任何关系或其组合。
     “IArel(4.5)t％” 被定义为在 pH ＝ 4.5， 将合成纳米载体暴露于体外水环境 t 小 时， 释放的免疫调节剂的重量除以在 pH ＝ 4.5， 将合成纳米载体暴露于体外水环境 t 小时， 释放的免疫调节剂的重量加上在 pH ＝ 4.5， 将合成纳米载体暴露于体外水环境 t 小时， 保留 在合成纳米载体中的免疫调节剂的重量之和， 表示为重量百分数， 并且被取作跨合成纳米 载体样品的平均数。在实施方案中， t 是 2、 4、 6、 8、 10、 12、 14、 16、 18、 20、 22、 24、 26、 28、 或 30 小时。在优选实施方案中， t 是 24 小时。
     “IArel(7.4)t％” 被定义为在 pH ＝ 7.4， 将合成纳米载体暴露于体外水环境 t 小 时， 释放的免疫调节剂的重量除以在 pH ＝ 7.4， 将合成纳米载体暴露于体外水环境 t 小时， 释放的免疫调节剂的重量加上在 pH ＝ 7.4， 将合成纳米载体暴露于体外水环境 t 小时， 保留 在合成纳米载体中的免疫调节剂的重量之和， 表示为重量百分数， 并且被取作跨合成纳米 载体样品的平均数。在实施方案中， t 是 2、 4、 6、 8、 10、 12、 14、 16、 18、 20、 22、 24、 26、 28、 或 30 小时。在优选实施方案中， t 是 24 小时。
     “IA(4.5)t1” 被定义为在 pH ＝ 4.5， 将合成纳米载体暴露于体外水环境 t1 小时， 取 作跨合成纳米载体样品的平均数的释放的免疫调节剂的重量。 “IA(4.5)t2” 被定义为在 pH ＝ 4.5， 将合成纳米载体暴露于体外水环境 t2 小时， 取作跨合成纳米载体样品的平均数的释放的免疫调节剂的重量。t1 是 4、 6、 8、 10、 12、 14、 16、 18、 20、 22、 24、 26、 28 或 30 小时 ； t2 是 2、 4、 6、 8、 10、 12、 14、 16、 18、 20、 22、 24、 26、 或 28 小时 ； 并且 t1 ＞ t2。在优选实施方案中， t1 是 24 小时， 并且 t2 是 6 小时。
     ‘免疫调节剂” 是指调节免疫应答的媒介物。如在此使用的那样， “调节” 是指诱 导、 增强、 刺激、 或指导免疫应答。这样的媒介物包括刺激 ( 或促进 ) 对抗原的免疫应答的 佐剂， 但不是抗原或衍生自抗原。 在一些实施方案中， 该免疫调节剂在合成纳米载体的表面 上， 和 / 或合并在合成纳米载体内。在实施方案中， 免疫调节剂经由一种聚合物或其单元被 偶合到合成纳米载体上。
     在一些实施方案中， 所有合成纳米载体的免疫调节剂都是彼此相同的。在一些实 施方案中， 合成纳米载体包括大量不同类型的免疫调节剂。 在一些实施方案中， 合成纳米载 体包括多种独自的免疫调节剂， 所有这些都是彼此相同的。 在一些实施方案中， 合成纳米载 体正好包括一个类型的免疫调节剂。在一些实施方案中， 合成纳米载体正好包括两个不同 类型的免疫调节剂。在一些实施方案中， 合成纳米载体包括多于两个的不同类型的免疫调 节剂。
     “免疫调节剂偶合部分” 可以是任何部分， 免疫调节剂通过它被键合到合成纳米载 体上。这样的部分包括共价键 ( 例如酰胺键或酯键 )， 连同键合 ( 共价地或非共价地 ) 免 疫调节剂至合成纳米载体的分离分子。这样的分子包括连接物或聚合物或它们的单元。例 如， 免疫调节剂偶合部分可以包括免疫调节剂 ( 例如一种免疫刺激核酸 ) 静电结合的一种 带电聚合物。如另一个实例， 免疫调节剂偶合部分可以包括免疫调节剂共价结合的一种聚 合物或其单元。在一些实施方案中， 该部分包括一种聚酯。在其他实施方案中， 该部分包括 聚 ( 乙二醇 )、 聚 ( 乳酸 )、 聚 ( 乙醇酸 )、 聚 ( 乳酸 - 乙醇酸 ) 共聚物、 或聚己酸内酯。该部 分还可以包括任何以上聚合物的一个单元， 例如丙交酯或乙交酯。
     “一种或多种不稳定的免疫调节剂” 是指在生理条件下不稳定的免疫调节剂或媒 介物， 并且退化至它们不再是药理学上有活性的点。 在实施方案中， 观察到不稳定的免疫调 节剂具有小于 24 小时的全身消除半衰期， 优选小于 12 小时， 更优选小于 10 小时， 甚至更优 选小于 8 小时， 并且仍更优选小于 6 小时。在实施方案中， 不稳定的免疫调节剂包括咪唑并 喹啉、 腺嘌呤衍生物、 或包括 5’ -CG-3’ 的寡核苷酸， 其中 C 未甲基化并且其中该寡核苷酸包 括一个主链， 该主链包括一个或多个不稳定的核苷酸间连键。 在实施方案中， 咪唑并喹啉包 括咪唑并喹啉胺、 咪唑并吡啶胺、 6， 7- 稠合的环烷基咪唑并吡啶胺、 咪唑并喹啉胺、 咪喹莫 特、 或瑞喹莫德。
     “合成纳米载体的最大尺寸” 是指沿合成纳米载体的任何轴测量的纳米载体的最 大尺寸。 “合成纳米载体的最小尺寸” 是指沿合成纳米载体的任何轴测量的合成纳米载体 的最小尺寸。例如， 对于球形合成纳米载体， 合成纳米载体的最大和最小尺寸会是基本相 同的， 并且会是它的直径的大小。类似地， 对于立方体合成纳米载体， 合成纳米载体的最小 尺寸会是它的高、 宽、 或长中最小的， 同时合成纳米载体的最大尺寸会是它的高、 宽、 或长中 最大的。在一个实施方案中， 基于样品中合成纳米载体的总数， 样品中至少 75％、 优选至少 80％、 更优选至少 90％的合成纳米载体的最小尺寸是大于 100nm。在一个实施方案中， 基于 样品中合成纳米载体的总数， 样品中至少 75％、 优选至少 80％、 更优选至少 90％的合成纳 米载体的最大尺寸是等于或小于 5μm。 优选地， 基于样品中合成纳米载体的总数， 样品中至少 75％、 优选至少 80％、 更优选至少 90％的合成纳米载体的最小尺寸是等于或大于 110nm、 更优选等于或大于 120nm、 更优选等于或大于 130nm、 并且仍更优选等于或大于 150nm。优 选地， 基于样品中合成纳米载体的总数， 样品中至少 75％、 优选至少 80％、 更优选至少 90％ 的合成纳米载体的最大尺寸是等于或小于 3μm、 更优选等于或小于 2μm、 更优选等于或 小于 1μm、 更优选等于或小于 800nm、 更优选等于或小于 600nm、 并且仍更优选等于或小于 500nm。在优选的实施方案中， 基于样品中合成纳米载体的总数， 样品中至少 75％， 优选至 少 80％， 更优选至少 90％的合成纳米载体的最大尺寸是等于或大于 100nm、 更优选等于或 大于 120nm、 更优选等于或大于 130nm、 更优选等于或大于 140nm、 并且仍更优选等于或大于 150nm。通过将这些合成纳米载体悬浮在一种液体 ( 通常是水性 ) 介质中， 并且使用动态光 散射 ( 例如使用一台 Brookhaven ZetaPALS 仪器 ) 获得合成纳米载体大小的测量值。
     “获得的” 是指取自原始源， 没有改变或改性。例如， 在实施方案中， 从一个源获得 的抗原可以包括在该源发现的原始氨基酸残基序列。在其他实施方案中， 从一个源获得的 抗原可以包括在该源发现的原始分子结构。
     “寡核苷酸” 是指一个具有从 6 至 100 个核苷酸的核苷酸分子， 优选从 8 至 75 个 核苷酸， 更优选从 10 至 50 个核苷酸， 仍更优选从 15 至 25 个核苷酸， 甚至仍更优选 20 个核 苷酸。在一个根据本发明的实施方案中， 寡核苷酸包括小于 100 个核苷酸， 优选小于 50 个 核苷酸， 更优选小于 25 个核苷酸， 并且仍更优选小于 10 个核苷酸。存在于寡核苷酸所包括 的一个 5’ -CG-3’ 序列中的任何胞嘧啶核苷酸 (“C” ) 是未甲基化的， 存在于部分寡核苷酸 ( 除了在寡核苷酸所包括的 5’ -CG-3’ 序列中的 ) 中的 C 可以是甲基化的， 或者可以是未甲 基化的。 在实施方案中， 本发明的寡核苷酸包括一个主链， 该主链包括一个或多个不稳定核 苷酸间连键 ( 是指在生理条件下不稳定的核苷酸间连键 )。 “不稳定核苷酸间连键” 是指在 寡核苷酸所包括的两个核苷酸之间的、 未被化学修饰以稳定化主链的连键， 或者被化学修 饰来使在生理条件下的寡核苷酸的主链去稳定的连键。 不稳定核苷酸间连键的实例是磷酸 二酯核苷酸间连键。 在实施方案中， 本发明的寡核苷酸的主链不包括稳定化的化学修饰， 这 些修饰的功能是在生理条件下稳定化主链。在实施方案中， 本发明的寡核苷酸的主链包括 一个未被修饰以结合稳定化学修饰的硫代磷酸酯的主链。
     “药学上可接受的赋形剂” 是指一种药理学上无活性的物质， 该物质被添加到一种 本发明的组合物中来进一步协助该组合物的给药。没有限制， 药学上可接受的赋形剂的实 例包括碳酸钙、 磷酸钙、 不同的稀释剂、 不同的糖和各种类型的淀粉、 纤维素衍生物、 明胶、 植物油以及聚乙二醇。
     “释放速率” 是指在体外释放测试中， 封存的免疫调节剂从组合物 ( 例如合成纳米 载体 ) 流入周围介质的速率。首先， 通过置入适当的体外释放介质中， 制备合成纳米载体用 于释放测试。这一般通过在离心使合成纳米载体成小粒以后交换缓冲剂， 并且使用温和条 件重建合成纳米载体来实现。通过将样品置于一台适当的温度控制装置中， 在 37℃开始测 定。在不同的时间点移出样品。
     通过离心使合成纳米载体成小粒从释放介质分离合成纳米载体。 测定从合成纳米 载体分散的免疫调节剂的释放介质。使用 HPLC 测量免疫调节剂以确定免疫调节剂的含量 和质量。将包含剩余封存的免疫调节剂的小粒溶解在溶剂中， 或用碱水解来从合成纳米载 体解脱封存的免疫调节剂。然后还通过 HPLC 测量包含免疫调节剂的小粒以确定在给定时间点， 仍未释放的免疫调节剂的含量和质量。
     已经释放至释放介质中的和剩余在合成纳米载体中的免疫调节剂间的质量平衡 被关闭。数据表示为释放部分或净释放， 都表示为随时间释放的微克数。
     “受试者” 是指一种动物， 包括哺乳动物例如人和灵长目动物 ； 鸟； 家养动物或家畜 ( 例如猫、 狗、 绵羊、 山羊、 牛、 马和猪 ) ； 实验动物 ( 例如小鼠、 大鼠和豚鼠 ) ； 鱼； 以及类似动 物。
     “一种或多种合成纳米载体” 是指在自然界不能找到的并且至少拥有在大小上小 于或等于 5 微米的尺寸的离散物。白蛋白纳米颗粒清楚地包括在合成纳米载体内。
     合成纳米载体包括聚合物纳米颗粒。在一些实施方案中， 合成纳米载体可以包括 一种或多种聚合物基质。 然而， 合成纳米载体还可以包括其他纳米材料， 并且可以是例如脂 类聚合物纳米颗粒。在一些实施方案中， 可以由包被层 ( 例如脂质体、 脂质单分子层、 微胶 粒、 等 ) 环绕聚合物基质。在一些实施方案中， 合成纳米载体不是微胶粒。在一些实施方案 中， 合成纳米载体可以包括一个核， 该核包括被一个脂质层 ( 例如脂质双分子层、 脂质单分 子层、 等 ) 环绕的聚合物基质。在一些实施方案中， 合成纳米载体的不同元件可以与该聚合 物基质偶合。
     合成纳米载体可以包括一种或多种脂类。在一些实施方案中， 合成纳米载体可以 包括一种脂质体。在一些实施方案中， 合成纳米载体可以包括一个脂质双分子层。在一些 实施方案中， 合成纳米载体可以包括一个脂质单分子层。 在一些实施方案中， 合成纳米载体 可以包括一种微胶粒。在一些实施方案中， 合成纳米载体可以包括被一个脂质层 ( 例如脂 质双分子层、 脂质单分子层、 等 ) 环绕的非聚合物核 ( 例如金属颗粒、 量子点、 陶瓷颗粒、 骨 颗粒、 病毒性颗粒、 蛋白、 核酸、 碳水化合物、 等 )。
     合成纳米载体可以包括脂基纳米颗粒、 金属纳米颗粒、 表面活性剂基乳液、 树枝状 化合物、 巴奇球， 纳米线、 病毒状颗粒、 肽或蛋白基颗粒 ( 例如白蛋白纳米颗粒 )。合成纳 米载体可以具有多种不同的形状， 包括但并不局限于球形、 立方形、 锥形、 长方形、 圆柱形、 环形、 以及类似形状。根据本发明的合成纳米载体包括一个或多个表面。可以适合用于 实践本发明的示例性的合成纳米载体包括 ： (1)Gref 等人的美国专利 5,543,158 中披露的 生物可降解纳米颗粒， (2)Saltzman 等人的美国专利申请 20060002852 公开的聚合物纳米 颗粒， (3)DeSimone 等人的美国专利申请 20090028910 公开的石版印刷构建的纳米颗粒， (4)Andrian 等人的 WO 2009/051837 的披露， 或 (5)Penades 等人的公开的美国专利申请 2008/0145441 中披露的纳米颗粒。
     根据本发明的合成纳米载体具有等于或小于约 100nm、 优选地等于或小于 100nm 的最小尺寸， 并不包括具有使补体活化的羟基的表面， 或者可替代地包括基本由不是使补 体活化的羟基的部分组成的表面。在一个优选的实施方案中， 根据本发明的合成纳米载体 具有等于或小于约 100nm、 优选地等于或小于 100nm 的最小尺寸， 并不包括实质上使补体活 化的表面， 或者可替代地包括基本由不实质上活化补体的部分组成的表面。在更优选的实 施方案中， 根据本发明的合成纳米载体具有等于或小于约 100nm、 优选地等于或小于 100nm 的最小尺寸， 并不包括使补体活化的表面， 或者可替代地包括基本由不使补体活化的部分 组成的表面。在实施方案中， 合成纳米载体可以拥有大于 1 ∶ 1、 1 ∶ 1.2、 1 ∶ 1.5、 1 ∶ 2、 1 ∶ 3、 1 ∶ 5、 1 ∶ 7、 或大于 1 ∶ 10 的长径比。在一些实施方案中， 合成纳米载体是球体或扁球体。 在一些实施方案中， 合成纳米 载体是扁平的或盘状的。 在一些实施方案中， 合成纳米载体是立方体或立方形的。 在一些实 施方案中， 合成纳米载体是卵形或椭圆形的。在一些实施方案中， 合成纳米载体是圆柱体、 椎体、 或锥形。
     通常希望使用一群在大小、 形状、 和 / 或构成方面较一致的合成纳米载体， 这样每 一合成纳米载体具有类似特性。 例如， 至少 80％、 至少 90％、 或至少 95％的合成纳米载体可 以具有落在 5％、 10％或 20％的平均直径或平均尺寸内的最小尺寸或最大尺寸。在一些实 施方案中， 一群合成纳米载体可以关于大小、 形状、 和 / 或构成是不均匀的。
     合成纳米载体可以是实心的或空心的， 并且可以包括一个或多个层。在一些实施 方案中， 相对于其他一层或多层， 每一层具有独特的构成和独特的特性。 为了给出但是一个 实例， 合成纳米载体可以具有一个核 / 壳结构， 其中核是一层 ( 例如一个聚合物核 ) 并且壳 是一个第二层 ( 例如一个脂质双分子层或单分子层 )。合成纳米载体可以包括多个不同的 层。
     “T 细胞抗原” 是指通过 T 细胞中的免疫应答来识别的并且触发 T 细胞中的免疫应 答的任何抗原 ( 例如， 经由递呈结合到 I 类或 II 类主要组织相容性复合物分子 (MHC) 上的、 或者结合到 CD1 复合物上的抗原或其一部分， 通过在 T 细胞或 NKT 细胞上的 T 细胞受体来 特异性识别的抗原 )。在一些实施方案中， 是 T 细胞抗原的抗原也是 B 细胞抗原。在其他实 施方案中， T 细胞抗原并不也是 B 细胞抗原。T 细胞抗原一般是蛋白或多肽。T 细胞抗原可 以是刺激 CD8+T 细胞应答、 CD4+T 细胞应答、 或二者的抗原。因此， 在一些实施方案中， 这些 T 细胞抗原可以有效刺激这两种类型的应答。
     在一些实施方案中， T 细胞抗原是 T 辅助细胞抗原， 它是通过刺激 T 细胞辅助细胞， 可以产生对无关的 B 细胞抗原的增强的应答的 T 细胞抗原。在实施方案中， T 辅助细胞抗 原可以包括一种或多种衍生自破伤风类毒素、 EB 病毒、 流行性感冒病毒、 呼吸道合胞病毒、 麻疹病毒、 腮腺炎病毒、 风疹病毒、 巨细胞病毒、 腺病毒、 白喉类毒素、 或 PADRE 肽的肽。在其 他实施方案中， T 辅助细胞抗原包括一种或多种脂类、 或糖脂类， 包括但并不局限于 ： α- 半 乳糖基神经酰胺 (α-GalCer)、 α- 连接的糖鞘脂 ( 来自鞘氨醇单胞菌属 )、 半乳糖基二酰 基甘油 ( 来自伯氏疏螺旋体 )、 Lypophosphoglycan( 来自杜氏利什曼原虫 )、 和磷脂酰肌醇 四甘露糖苷 (PIM4)( 来自麻风分枝杆菌 )。对于作为 T 辅助细胞抗原有用的添加的脂类和 / 或糖脂类， 参见 V.Cerundolo 等人， “Harnessing invariant NKT cells in vaccination strategies.” Nature Rev Immun， 9： 28-38(2009)。在实施方案中， CD4+T 细胞抗原可以 是从一个来源 ( 例如天然来源 ) 获得的 CD4+T 细胞抗原的衍生物。在这样的实施方案中， CD4+T 细胞抗原序列 ( 例如结合到 MHC II 的那些肽 ) 可以具有与从该来源获得的抗原的 至少 70％、 80％、 90％、 或 95％的同一性。在实施方案中， T 细胞抗原， 优选是 T 辅助细胞抗 原， 可以偶合到合成纳米载体， 或者从合成纳米载体解偶合。
     “其单元” 是指聚合物的单体单元， 该聚合物一般由一系列的连接的单体构成。
     “疫苗” 是指改进对具体的病原体或疾病的免疫应答的物质的组合物。疫苗典型地 包含刺激受试者的免疫系统以识别特异性抗原为外来并且将它从受试者身体消除的因子。 疫苗还建立免疫 “记忆” ， 这样如果人被再攻击， 那么抗原将被迅速识别并响应。 疫苗可以是 预防性的 ( 例如阻止由任何病原体引起的未来感染 )， 或治疗的 ( 例如为了治疗癌症， 针对肿瘤特异抗原的疫苗 )。根据本发明的疫苗可以包括一种或多种在此提供的合成纳米载体 或组合物。
     制造本发明的化合物、 结合物、 或合成纳米载体的方法
     免疫调节剂可以按任何方式被偶合到合成纳米载体上， 这样免疫调节剂从合成纳 米载体的解离满足在此提供的解离关系。 在以上的其他地方和在实例中提供了用于确定合 成纳米载体的免疫调节剂是否满足在此提供的解离关系的方法。
     可 以 使 用 多 种 方 法 将 根 据 本 发 明 的 寡 核 苷 酸 胶 囊 化 到 合 成 纳 米 载 体 中， 包 括 但 并 不 局 限 于 C.Astete 等 人， “Synthesis and characterization of PLGA nanoparticles” ， J.Biomater.Sci.Polymer Edn ， Vol.17 ， No.3 ， pp.247-289(2006) ； K.Avgoustakis“Pegylated Poly(Lactide)and Poly(Lactide-Co-Glycolide) Nanoparticles ： Preparation ， Properties and Possible Applications in Drug Delivery” ， Current Drug Delivery 1 ： 321-333(2004) ； C.Reis 等人， “Nanoencapsulation I.Methods for preparation of drug-loaded polymeric nanoparticles” ， Nanomedicine 2： 8-21(2006)。可以使用适合将寡核苷酸胶囊化到合成纳米载体中的其他方法， 无限制地 包括在 Unger 的美国专利 6,632,671(2003 年 10 月 14 日 ) 中披露的方法。
     在一些实施方案中， 免疫调节剂经由免疫调节剂偶合部分 ( 例如一种聚合物或其 单元 ) 共价偶合到合成纳米载体上。通常， 聚合物或其单元可以按若干方式与免疫调节剂 共价偶合。
     提供的以下方法或这些方法的任何步骤都是示例性的， 并且可以在任何合适的条 件下进行。在一些情况下， 提供的这些方法的反应或任何步骤可以在溶剂或溶剂的混合 物存在的条件下进行。适合用于本发明的溶剂的非限制性实例包括， 但并不局限于 ： 对苯 甲酚、 甲苯、 二甲苯、 均三甲苯、 二乙醚、 二醇、 石油醚、 己烷、 环己烷、 戊烷、 二氯甲烷 ( 或亚 甲基氯 )、 氯仿、 二噁烷、 四氢呋喃 (THF)、 二甲亚砜 (DMSO)、 二甲基甲酰胺 (DMF)、 乙酸乙 酯 (EtOAc)、 三乙胺、 乙腈、 甲基叔丁基醚 (MTBE)、 N- 甲基吡咯烷酮 (NMP)、 二甲基乙酰胺 (DMAC)、 异丙醇 (IPA)、 它们的混合物、 或类似物质。 在一些情况下， 该溶剂选自下组， 该组由 以下各项组成 ： 乙酸乙酯、 亚甲基氯、 THF、 DMF、 NMP、 DMAC、 DMSO、 和甲苯、 或它们的混合物。
     可以在任何合适的温度下进行所提供的方法的反应或任何步骤。在一些情况下， 在约室温下 ( 例如约 25℃、 约 20℃、 在约 20℃和约 25℃之间、 或类似温度 ) 进行所提供的 方法的反应或任何步骤。 然而， 在一些情况下， 可以在低于或高于室温的温度下进行所提供 的方法的反应或任何步骤， 例如在约 -20℃、 在约 -10℃、 在约 0℃、 在约 10℃、 在约 30℃、 约 40℃、 约 50℃、 约 60℃、 约 70℃、 约 80℃、 约 90℃、 约 100℃、 约 120℃、 约 140℃、 约 150℃或 更高温度。在具体的实施方案中， 在 0℃和 120℃之间的温度进行所提供的方法的反应或任 何步骤。在一些实施方案中， 可以在多于一个温度下进行所提供的方法的反应或任何步骤 ( 例如在一个第一温度下添加反应物， 并且在一个第二温度下搅拌该反应混合物， 其中从第 一温度至第二温度的转变可以是逐渐的或迅速的 )。
     可以允许所提供的方法的反应或任何步骤进行任何合适的一段时间。 在一些情况 下， 允许所提供的方法的反应或任何步骤进行约 10 分钟、 约 20 分钟、 约 30 分钟、 约 40 分钟、 约 50 分钟、 约 1 小时、 约 2 小时、 约 4 小时、 约 8 小时、 约 12 小时、 约 16 小时、 约 24 小时、 约 2 天、 约 3 天、 约 4 天、 或更长时间。在一些情况下， 可以在一个中间时间移出并分析反应混合物的等分部分以确定所提供的方法的反应或任何步骤的进展。在一些实施方案中， 可以 在惰性气氛在无水条件下 ( 例如在氮气或氩气气氛、 无水溶剂、 等条件下 ) 进行所提供的方 法的反应或任何步骤。
     可以使用普遍已知的技术分离 ( 例如经由蒸馏、 柱色谱法、 萃取、 沉淀、 等)和/或 分析 ( 例如气液色谱法、 高效液相色谱法、 核磁共振波谱法、 等 ) 反应产物和 / 或中间产物。 在一些情况下， 可以例如使用反相高效液相色谱法分析合成纳米载体， 以确定免疫调节剂 的加载。
     这些聚合物可以具有任何合适的分子量。例如这些聚合物可以具有低或高分子 量。非限制性的分子量值包括 100Da、 200Da、 300Da、 500Da、 750Da、 1000Da、 2000Da、 3000Da、 4000Da、 5000Da、 6000Da、 7000Da、 8000Da、 9000Da、 10,000Da、 或更大。 在一些实施方案中， 这 些聚合物具有约 800Da 至约 10,000Da 的重均分子量。可以使用凝胶渗透色谱法确定聚合 物的分子量。
     以下提供的是并不旨在限制的示例性反应。
     方法 1
     使用在酰胺合成中普遍使用的活化试剂， 将一种聚合物 ( 例如 PLA、 PLGA) 或其单 元与至少一种酸端基转化为一种反应性酰化剂， 例如卤化酰基、 酰基咪唑、 活性酯、 等。 在这一两步法中， 分离生成的活化聚合物或其单元 ( 例如 PLA、 PLGA)， 并且然 后在一种碱存在下， 与一种免疫调节剂 ( 例如 R848) 反应以给出希望的结合物 ( 例如 PLA-R848)， 例如像以下图解示出的那样 ：
     活化试剂可以被用来将聚合物或其单元 ( 例如 PLA 或 PLGA) 转化为活化的酰化形 式， 包括但并不局限于 ： 氰尿酰氟、 N， N- 四甲基氟代甲酰胺六氟磷酸酯 (TFFH) ； 酰基咪唑 ( 例如碳酰二咪唑 (CDI))、 N， N’ - 碳酰双 (3- 甲基咪唑鎓 ) 三氟甲磺酸酯 (CBMIT) ； 以及活 性酯 ( 例如 N- 羟基丁二酰亚胺 (NHS 或 HOSu))， 在碳二亚胺 ( 例如 N， N’ - 二环己基碳二亚 胺 (DCC)、 N- 乙基 -N’ -(3-( 二甲氨基 ) 丙基 ) 碳二亚胺盐酸盐 (EDC) 或 N， N′ - 二异丙基 碳二亚胺 (DIC)) 存在下 ； N， N′ - 二丁二酰亚胺碳酸酯 (DSC) ； 五氟苯酚， 在 DCC 或 EDC 或 DIC 存在下 ； 五氟苯基三氟醋酸酯。
     可以分离 ( 例如经由沉淀、 萃取、 等 ) 活化的聚合物或其单元， 和 / 或在活化以后， 在合适的条件 ( 例如在低温， 在氩气下 ) 储存， 或可以立即使用。活化的聚合物或其单元
     可以与免疫调节剂在任何合适的条件下反应。在一些情况下， 在碱和 / 或催化剂存在下进 行该反应。碱 / 催化剂的非限制性实例包括二异丙基乙胺 (DIPEA) 和 4- 二甲基氨基吡啶 (DMAP)。
     方法 2
     在活化试剂或偶联试剂存在下， 将一种具有酸端基的聚合物或其单元 ( 例如具有 任何合适的分子量的 PLA、 PLGA) 与一种免疫调节剂 ( 例如 R848) 反应， 这在原位将该聚合 物或其单元 ( 例如 PLA、 PLGA) 转化为反应性酰化剂， 以给出希望的结合物 ( 例如 PLA-R848、 PLGA-R848)。
     偶联剂或活化剂包括但并不局限于 ： 在碳二亚胺 ( 例如 EDC 或 DCC 或 DIC) 存在 下使用的活化剂， 例如 1- 羟基苯并三唑 (HOBt)、 1- 羟基 -7- 氮杂苯并三唑 (HOAt)、 3， 4- 二 氢 -3- 羟基 -4- 氧代 -1， 2， 3- 苯并三嗪 (HO-Dhbt)、 N- 羟基丁二酰亚胺 (NHS 或 HOSu)、 五 氟苯酚 (PFP) ； 无碳二亚胺的活化剂 ： 鏻盐 ( 例如 O- 苯并三唑 -1- 基氧基三 ( 二甲氨基 ) 鏻六氟磷酸盐 (BOP)、 O- 苯并三唑 -1- 基氧基三 ( 吡咯烷基 ) 鏻六氟磷酸盐 (PyBOP)、 7- 氮 杂苯并三唑 -1- 基氧基三 ( 吡咯烷基 ) 鏻六氟磷酸盐 (PyAOP)) ； 脲鎓盐类 ( 例如 O- 苯 并三唑 -1- 基氧基三 -1， 1， 3， 3- 四甲基脲鎓四氟硼酸盐 (TBTU) 和六氟磷酸盐 (HBTU)、 O-(7- 氮杂苯并三唑 -1- 基 )-1， 1， 3， 3- 四甲基脲鎓六氟磷酸盐 (HATU)、 O-(1， 2- 二氢 -2- 氧 代 -1- 吡啶基 )-1， 1， 3， 3- 四甲基 - 脲鎓四氟硼酸盐 (TPTU)) ； 卤脲和卤鏻盐类 ( 例如二 ( 四亚甲基 ) 氟代甲酰胺六氟磷酸盐 (BTFFH)、 溴三 ( 二甲氨基 ) 鏻六氟磷酸盐 (BroP)、 溴 三吡咯烷基鏻六氟磷酸盐 (PyBroP) 和氯三吡咯烷基鏻六氟磷酸盐 (PyClop)) ； 苯并三嗪衍 生物 ( 例如 O-(3， 4- 二氢 -4- 氧代 -1， 2， 3- 苯并三嗪 -3- 基 )N， N， N’ ， N’ - 四甲基脲鎓四 氟硼酸盐 (TDBTU) 和 3-( 二乙氧基磷酰基氧 )-1， 2， 3- 苯并三嗪 -4(3H)- 酮 (DEPBT))。如 在此说明的那样， 合适溶剂的非限制性实例包括 DMF、 DCM、 甲苯、 乙酸乙酯、 等。
     方法 3
     免疫调节剂 ( 例如 R848) 还可以被偶合到羟基封端的聚合物或其单元上。这样的 聚合物或其单元包括聚乙二醇、 聚丙交酯、 聚丙交酯乙交酯共聚物、 聚己酸内酯、 以及其他 类似聚酯、 或其单元。 通常， 如以下进行反应， 使用在内酯开环聚合中使用的催化剂， 其中具 有一般结构 (IV) 的酰亚胺将与以上提到的聚合物或其单元的末端羟基反应。生成的反应 产物 (II) 经由酯键将媒介物的酰胺连接到聚合物或其单元上。化学式 (IV) 和 (II) 的化 合物如下 ：
     其中 R1 ＝ H、 OH、 SH、 NH2， 或者取代的或未取代的烷基、 烷氧基、 烷硫基、 或烷氨基 ； R2 ＝ H、 烷基、 或取代的烷基 ； Y＝N或C； 如果 Y ＝ N 那么 R3 不存在 ； 或者如果 Y ＝ C， 那么 R3 是 H、 烷基、 取代的烷基、 或者与 R4 结合以与它们所连接的吡啶环上的碳原子形成碳环或 杂环 ； 在不与 R3 结合以与它们所连接的吡啶环上的碳原子形成碳环或杂环时， R4 是 H、 或取 代的或未取代的烷基、 烷氧基、 烷硫基、 或烷氨基 ； R4 或者与 R3 结合以与它们所连接的吡啶 环上的碳原子形成碳环或杂环 ； R5 是聚合物或其单元 ； X ＝ C、 N、 O、 或S； R6 和 R7 每一个独立 地是 H 或被取代 ； 并且 R9、 R10、 R11、 和 R12 每一个独立地是 H、 卤素、 OH、 硫、 NH2、 或取代的或未 取代的烷基、 芳基、 杂环的、 烷氧基、 芳氧基、 烷硫基、 芳硫基、 烷氨基、 或芳氨基。
     催 化 剂 包 括， 但 并 不 局 限 于 膦 嗪 碱、 1， 8- 二 氮 杂 二 环 十 一 碳 -7- 烯 (DBU)、 1， 4， 7- 三氮杂二环癸烯 (TBD)、 以及 N- 甲基 -1， 4， 7- 三氮杂二环癸烯 (MTDB)。其他催化 剂 在 本 领 域 是 已 知 的 并 已 提 供， 例 如 在 Kamber 等 人， Organocatalytic Ring-Opening Polymerization， Chem.Rev.2007， 107， 58-13-5840。合适的溶剂的非限制性实例包括亚甲 基氯、 氯仿、 和 THF。
     在此示出通过这样一种方法完成的反应的一个具体实例 ：其中 R5-OH 包含两个羟基 ( 例如一种二醇， HO-R5-OH)， 其中每一个都通过与 R848 相关的酰亚胺的反应功能化。在一些情况下， HO-R5-OH 是一种聚二醇 ( 例如聚 ( 碳酸六甲 基酯 ) 二醇或聚己酸内酯二醇。
     在其中使用聚二醇的实施方案中， 可以用一个保护基团 ( 例如叔丁氧羰基 ) 保护 二醇基团之一， 因此该聚二醇会是具有化学式 HO-R5-OP 的化合物， 其中 P 是保护基团。与 免疫调节剂进行反应从而形成免疫调节剂 -R5-OP 结合物之后， 该保护基团可以被除去， 并 且这第二个二醇基团可以与任何合适的试剂 ( 例如 PLGA， PLA) 反应。
     方法 4
     例如像以下图解示出的那样， 在一种催化剂存在下， 可以经由一种免疫调节剂 ( 例如 R848) 与一种聚合物或其单元 ( 例如 D/L- 丙交酯 ) 的一锅法开环聚合形成结合物 ( 例如 R848-PLA) ：
     在一个一步方法中， 该免疫调节剂和该聚合物或其单元可以结合到包括一种催化 剂的单反应混合物中。 可以在合适的温度 ( 例如在约 150℃ ) 进行该反应， 并且可以使用普 遍已知的技术分离生成的结合物。合适的催化剂的非限制性实例包括 DMAP 和乙基己酸锡。
     方法 5
     例如像以下图解示出的那样， 在催化剂存在下， 可以经由一种免疫调节剂 ( 例如 R848) 与一种或多种聚合物或其单元 ( 例如 D/L- 丙交酯和乙交酯 ) 的两步开环聚合形成结 合物 ：
     可以首先结合该聚合物或其单元， 并且在一些情况下， 加热 ( 例如至 135℃ ) 以形成一种溶液。可以添加该免疫调节剂到包括聚合物或其单元的溶液中， 随后添加一种催化 剂 ( 例如乙基己酸锡 )。可以使用普遍已知的技术分离生成的结合物。合适的催化剂的非 限制性实例包括 DMAP 和乙基己酸锡。
     在一些实施方案中， 该免疫调节剂、 抗原、 和 / 或靶向部分可以与聚合物基质共价 缔合。在一些实施方案中， 由一个连接物介导共价缔合作用。在一些实施方案中， 该免疫调 节剂、 抗原、 和 / 或靶向部分可以与聚合物基质非共价缔合。例如， 在一些实施方案中， 该免 疫调节剂、 抗原、 和 / 或靶向部分被胶囊化在聚合物基质内、 被聚合物基质环绕、 和 / 或被分 散遍及聚合物基质。可替代地或额外地， 该免疫调节剂、 抗原、 和 / 或靶向部可以通过疏水 性相互作用、 电荷相互作用、 范德华力、 等与聚合物基质缔合。
     这些免疫调节剂还可以被胶囊化在纳米载体内。如果生成的本发明的合成纳米 载体满足在此提供的解离关系， 那么因此这些纳米载体可以由 pH 敏感的任何材料构成。 这样的合成纳米载体在本领域是熟知的， 并且包括聚缩酮纳米载体， pH 敏感的脂质体， 酸 膨胀的、 交联的纳米颗粒 ( 例如 Griset 等人， J.Am.Chem.Soc.2009， 131， 2469-2471 的那 些 )， 这在它们的初始状态是疏水的， 但是在细胞内摄作用时转化为亲水结构 ( 一种水凝胶 颗粒 )， 以及聚合物纳米颗粒， 例如 Griset 的那些， 论文题目为 ： Delivery of Paclitaxel via pH-Responsive Polymeric Nanoparticles for Prevention of Lung Cancer and Mesothelioma Recurrence， Ohio State University， 2003。pH 敏感的合成纳米载体还包 括以下那些， 它们包括在低于 6 的 pH 溶解的聚合物， 或在酸性 pH 膨胀的聚合物。在一些实 施方案中， 这些合成纳米载体是由非聚缩酮材料构成的。 在其他实施方案中， 这些合成纳米 载体不是微胶粒。
     多种多样的聚合物和用于从此形成聚合物基质的方法是常规已知的。通常， 一种 聚合物基质包括一种或多种聚合物。聚合物可以是天然的或非天然的 ( 合成的 ) 聚合物。 聚合物可以是均聚物或包括两种或更多种单体的共聚物。在序列方面， 共聚物可以是随机 的、 嵌段的， 或者包括随机序列和嵌段序列的组合。典型地， 根据本发明的聚合物是有机聚 合物。
     适合用于本发明的聚合物的实例包括， 但并不局限于聚乙烯、 聚碳酸酯 ( 例如聚 (1， 3- 二噁烷 -2 酮 ))、 聚酐 ( 例如聚 ( 癸二酸酐 ))、 聚羟基酸 ( 例如聚 (β- 羟基烷酸酯 ))、 聚丙基延胡索酸酯 (polypropylfumerate)、 聚己内酯、 聚酰胺 ( 例如聚己内酰胺 )、 聚缩醛、 聚醚、 聚酯 ( 例如聚丙交酯、 聚乙二醇 )、 聚 ( 原酸酯 )、 聚氰基丙烯酸酯、 聚乙烯醇、 聚氨酯、 聚磷腈、 聚丙烯酸酯、 聚甲基丙烯酸酯、 聚脲、 聚苯乙烯、 聚胺、 以及多糖类 ( 例如壳聚糖 )。
     在一些实施方案中， 根据本发明的聚合物包括在 21C.F.R.§177.2600 下已经由 美国食品与药品管理局 (FDA) 批准用于人的聚合物， 包括但并不局限于聚酯 ( 例如聚乳酸、 聚 ( 乳酸乙醇酸共聚物 )、 聚己内酯、 聚戊内酯、 聚 (1， 3- 二噁烷 -2 酮 )) ； 聚酐 ( 例如聚 ( 癸 二酸酐 )) ； 聚醚 ( 例如聚乙二醇 ) ； 聚氨酯 ； 聚甲基丙烯酸酯 ； 聚丙烯酸酯 ； 以及聚氰基丙烯 酸酯。
     在一些实施方案中， 聚合物可以是亲水的。例如， 聚合物可以包括阴离子基团 ( 例 如磷酸根、 硫酸根、 羧酸根 ) ； 阳离子基团 ( 例如季胺基团 ) ； 或极性基团 ( 例如羟基、 硫醇基 团、 胺基团 )。在一些实施方案中， 包括亲水的聚合物基质的合成纳米载体在合成纳米载体 内产生亲水环境。在一些实施方案中， 聚合物可以是疏水的。在一些实施方案中， 包括疏水的聚合物基质的合成纳米载体在合成纳米载体内产生疏水环境。在合成纳米载体内， 选择 亲水性或疏水性聚合物可以影响要合并 ( 例如偶合 ) 材料的性质。
     在一些实施方案中， 聚合物可以用一个或多个部分和 / 或官能团改性。根据本发 明， 可以使用多个部分或官能团。在一些实施方案中， 可以用 PEG、 用碳水化合物、 和 / 或用 衍生自多糖类的非环状聚缩醛来将聚合物 (Papisov， 2001， ACS Symposium Series， 786 ： 301) 改性。
     在一些实施方案中， 可以用脂类或脂肪酸基团改性聚合物。在一些实施方案中， 脂肪酸基团可以是丁酸、 己酸、 辛酸、 癸酸、 月桂酸、 肉豆蔻酸、 棕榈酸、 硬脂酸、 花生酸、 山嵛 酸、 或廿四烷酸中的一种或多种。 在一些实施方案中， 脂肪酸基团可以是棕榈烯酸、 油酸、 异 油酸、 亚麻酸、 α- 亚麻酸、 γ- 亚麻酸、 花生四烯酸、 二十碳烯酸、 花生四烯酸、 二十碳五烯 酸、 二十二碳六烯酸、 或芥酸中的一种或多种。
     在一些实施方案中， 聚合物可以是聚酯， 包括共聚物， 这些共聚物包括乳酸和乙 醇酸单元 ( 例如聚 ( 乳酸乙醇酸共聚物 ) 和聚 ( 聚丙交酯乙交酯共聚物 ))， 在此统称为 “PLGA” ； 以及包括乙醇酸单元的均聚物， 在此称为 “PGA” ， 以及乳酸单元 ( 例如聚 -L- 乳酸、 聚 -D- 乳酸、 聚 -D， L- 乳酸、 聚 -L- 丙交酯、 聚 -D- 丙交酯、 以及聚 -D， L- 丙交酯 )， 在此统 称为 “PLA” 。 在一些实施方案中， 示例性的聚酯包括， 例如多羟基酸 ； PEG 共聚物和丙交酯与 乙交酯的共聚物 ( 例如 PLA-PEG 共聚物、 PGA-PEG 共聚物、 PLGA-PEG 共聚物 )， 以及它们的 衍生物 )。在一些实施方案中， 聚酯包括， 例如聚酐、 聚 ( 原酸酯 )、 聚 ( 原酸酯 )-PEG 共聚 物、 聚 ( 己内酯 )、 聚 ( 己内酯 )-PEG 共聚物、 聚赖氨酸、 聚赖氨酸 -PEG 共聚物、 聚 ( 亚乙基 亚胺 )、 聚 ( 亚乙基亚胺 )-PEG 共聚物、 聚 (L- 丙交酯赖氨酸共聚物 )、 聚 ( 丝氨酸酯 )、 聚 (4- 羟基 -L- 脯氨酸酯 )、 聚 [α-(4- 氨基丁基 )-L- 乙醇酸 ]、 以及它们的衍生物。
     在一些实施方案中， 聚合物可以是 PLGA。PLGA 是一种生物相容的并且生物可降解 的乳酸和乙醇酸的共聚物， 并且多种形式的 PLGA 特征在于乳酸∶乙醇酸的比率。乳酸可以 是 L- 乳酸、 D- 乳酸、 或 D， L- 乳酸。可以通过改变乳酸∶乙醇酸的比率调整 PLGA 的降解速 率。在一些实施方案中， 根据本发明， 将使用的 PLGA 特征在于约 85 ∶ 15、 约 75 ∶ 25、 约 60 ∶ 40、 约 50 ∶ 50、 约 40 ∶ 60、 约 25 ∶ 75、 或者约 15 ∶ 85 约的乳酸∶乙醇酸比率。
     在一些实施方案中， 聚合物可以是一种或多种丙烯酸聚合物。 在某些实施方案中， 丙烯酸聚合物包括， 例如丙烯酸和甲基丙烯酸的共聚物、 甲基丙烯酸甲酯共聚物、 甲基丙烯 酸乙氧基乙酯、 甲基丙烯酸氰基乙基酯、 甲基丙烯酸氨基烷基酯共聚物、 聚 ( 丙烯酸 )、 聚 ( 甲基丙烯酸 )、 甲基丙烯酸烷基酰胺共聚物、 聚 ( 甲基丙烯酸甲酯 )、 聚 ( 甲基丙烯酸酸 酐 )、 甲基丙烯酸甲酯、 聚甲基丙烯酸酯、 聚 ( 甲基丙烯酸甲酯 ) 共聚物、 聚丙烯酰胺、 甲基丙 烯酸氨基烷基酯共聚物、 甲基丙烯酸缩水甘油酯共聚物、 聚腈基丙烯酸酯、 以及包括一种或 多种以上聚合物的组合。 该丙烯酸聚合物可以包括具有低含量的季铵基团的丙烯酸酯和甲 基丙烯酸酯的充分聚合的共聚物。
     在一些实施方案中， 聚合物可以是阳离子聚合物。通常， 阳离子聚合物能够缩合 和 / 或保护核酸 ( 例如 DNA、 RNA、 或它们的衍生物 ) 带负电的链。含有胺的聚合物 ( 例如 聚 ( 赖氨酸 )(Zauner 等人， 1998， Adv.Drug Del.Rev.， 30 ： 97 ； 以及 Kabanov 等人， 1995， Bioconjugate Chem.， 6： 7)、 聚 ( 亚乙基亚胺 )(PEI ； Boussif 等人， 1995， Proc.Natl.Acad. Sci.， USA， 1995， 92 ： 7297)、 以及聚 ( 酰胺基胺 ) 树枝状化合物 (Kukowska-Latallo 等人，1996， Proc.Natl.Acad.Sci.， USA， 93 ： 4897 ； Tang 等人， 1996， Bioconjugate Chem.， 7： 703 ； 以及 Haensler 等人， 1993， Bioconjugate Chem.， 4： 372)) 在生理 pH 下是带正电的， 在多种 细胞系中与核酸形成离子对， 并且介导转染。
     在一些实施方案中， 聚合物可以是带有阳离子侧链的可降解的聚酯 (Putnam 等 人， 1999， Macromolecules， 32 ： 3658 ； Barrera 等 人， 1993， J.Am.Chem.Soc.， 115 ： 11010 ； Kwon 等 人， 1989， Macromolecules， 22 ： 3250 ； Lim 等 人， 1999， J.Am.Chem.Soc.， 121 ： 5633 ； 以及 Zhou 等人， 1990， Macromolecules， 23 ： 3399)。这些聚合物的实例包括聚 (L- 丙交 酯 L- 赖氨酸共聚物 )(Barrera 等人， 1993， J.Am.Chem.Soc.， 115 ： 11010)、 聚 ( 丝氨酸酯 ) (Zhou 等人， 1990， Macromolecules， 23 ： 3399)、 聚 (4- 羟基 -L- 脯氨酸酯 )(Putnam 等人， 1999， Macromolecules， 32 ： 3658 ； 以及 Lim 等人， 1999， J.Am.Chem.Soc.， 121 ： 5633)、 以及 聚 (4- 羟基 -L- 脯氨酸酯 )(Putnam 等人， 1999， Macromolecules， 32 ： 3658 ； 以及 Lim 等人， 1999， J.Am.Chem.Soc.， 121 ： 5633)。
     在本领域， 这些和其他聚合物的特性以及用于制备它们的方法是熟知的 ( 参见， 例 如 美 国 专 利 6,123,727 ； 5,804,178 ； 5,770,417 ； 5,736,372 ； 5,716,404 ； 6,095,148 ； 5,837,752 ； 5,902,599 ； 5,696,175 ； 5,514,378 ； 5,512,600 ； 5,399,665 ； 5,019,379 ； 5,010,167 ； 4,806,621 ； 4,638,045 ； 以 及 4,946,929 ； Wang 等 人， 2001， J.Am.Chem.Soc.， 123 ： 9480 ； Lim 等 人， 2001， J.Am.Chem.Sov.， 123 ： 2460 ； Langer， 2000， Acc.Chem.Res.， 33 ： 94 ； Langer， 1999， J.Control.Release， 62 ： 7； 以及 Uhrich 等人， 1999， Chem.Rev.， 99 ： 3181)。 更一般地， 在 Concise Encyclopedia of Polymer Science and Polymeric Amines and Ammonium Salts， Ed.by Goethals， Pergamon Press， 1980 中 ； 在 Principles of Polymerization by Odian， John Wiley & Sons， Fourth Edition， 2004 中 ； 在 Contemporary Polymer Chemistry by Allcock et al.， Prentice-Hall， 1981 中 ； 在 Deming et al.， 1997， Nature， 390 ： 386 中 ； 以及在美国专利 6,506,577、 6,632,922、 6,686,446、 以及 6,818,732 中说明了用于合成某些合适的聚合物的多种方法。
     在一些实施方案中， 聚合物可以是直链的或分支的聚合物。 在一些实施方案中， 聚 合物可以是树枝状化合物。在一些实施方案中， 聚合物可以是实质上彼此交联的。在一些 实施方案中， 聚合物可以实质上不交联。 在一些实施方案中， 聚合物可以根据本发明进行使 用而不经过交联步骤。 进一步理解， 本发明的化合物合成纳米载体可以包括嵌段共聚物、 接 枝共聚物、 共混物、 混合物、 和 / 或任何以上及其他聚合物的加合物。本领域的那些技术人 员将认识到， 在此列出的聚合物代表根据本发明可以使用的聚合物的示例性的、 而不是全 面的清单。
     在一些实施方案中， 合成纳米载体可以包括金属颗粒、 量子点、 陶瓷颗粒、 等。
     在一些实施方案中， 合成纳米载体可以任选地包括一种或多种两亲实体。在一 些实施方案中， 两亲实体可以促进产生具有增加的稳定性、 改进的均匀性、 或增加的粘度 的合成纳米载体。在一些实施方案中， 两亲实体可以与脂质膜 ( 例如脂质双分子层、 脂质 单分子层、 等 ) 的内表面相关。根据本发明， 在本领域已知的很多两亲实体可以适合用于 制造合成纳米载体。这样的两亲实体包括， 但并不局限于， 磷酸甘油酯 ； 磷脂酰胆碱 ； 二 棕榈酰磷脂酰胆碱 (DPPC) ； 二油烯基磷脂酰基乙醇胺 (DOPE) ； 二油烯基氧丙基三乙基铵 (DOTMA) ； 二油酰基磷脂酰胆碱 ； 胆固醇 ； 胆固醇酯 ； 二酰基甘油 ； 二酰基甘油琥珀酸酯 ； 二磷脂酰基甘油 (DPPG) ； 十六烷醇 ； 脂肪醇 ( 例如聚乙二醇 (PEG)) ； 聚氧乙烯 -9- 月桂基 醚； 表面活性脂肪酸 ( 例如棕榈酸或油酸 ) ； 脂肪酸 ； 脂肪酸甘油单酯 ； 脂肪酸甘油二酯 ； 脂 肪酸酰胺 ； 脱水山梨糖醇三油酸酯 聚山梨醇酯 20 65 聚山梨醇酯 80 甘氨胆酸酯 ； 脱水山梨糖醇单月桂酸酯 聚山梨醇酯 60 聚山梨醇酯 85 聚山梨醇酯 聚氧乙烯单硬脂酸酯 ； 表面活性素 ； poloxomer ； 脱水山梨糖醇脂肪酸酯 ( 例如脱水山梨糖醇三 油酸酯 ) ； 卵磷脂 ； 溶血卵磷脂 ； 磷脂酰丝氨酸 ； 磷脂酰肌醇 ； 鞘磷脂 ； 磷脂酰乙醇胺 ( 脑磷 脂)； 心磷脂 ； 磷脂酸 ； 脑苷脂 ； 双十六烷基磷酸酯 ； 二棕榈酰磷脂酰甘油 ； 硬脂酰胺 ； 十二 烷胺 ； 十六烷胺 ； 乙酰基棕榈酸酯 ； 蓖麻油酸甘油酯 ； 十八酸十六烷基酯 ； 肉豆蔻酸异丙酯 ； 四丁酚醛 (tyloxapol) ； 聚 ( 乙二醇 )5000 磷脂酰乙醇胺 ； 聚 ( 乙二醇 )400- 单硬脂酸酯 ； 磷脂 ； 具有高表面活性剂特性的合成的和 / 或天然的洗涤剂 ； 脱氧胆酸酯 ； 环糊精 ； 离液序 列高的盐 ； 离子对试剂 ； 以及它们的组合。 两亲实体组分可以是不同两亲实体的混合物。 本 领域的那些技术人员将认识到， 这是具有表面活性剂活性的物质的示例性的、 而不是全面 的清单。在产生根据本发明将被使用的合成纳米载体中可以使用任何两亲实体。 在一些实施方案中， 合成纳米载体可以任选地包括一种或多种碳水化合物。碳水 化合物可以是天然的或合成的。碳水化合物可以是衍生的天然碳水化合物。在某些实施 方案中， 碳水化合物包括单糖或二糖， 包括但并不局限于葡萄糖、 果糖、 半乳糖、 核糖、 乳糖、 蔗糖、 麦芽糖、 海藻糖、 纤维二糖 (cellbiose)、 甘露糖、 木糖、 阿拉伯糖、 葡糖醛酸、 半乳糖醛 酸、 甘露糖醛酸、 葡糖胺、 半乳糖胺、 以及神经氨酸。在某些实施方案中， 碳水化合物是一种 多糖， 包括但并不局限于支链淀粉、 纤维素、 微晶纤维素、 羟丙基甲基纤维素 (HPMC)、 羟基纤 维素 (HC)、 甲基纤维素 (MC)、 右旋糖酐、 环葡聚糖、 糖原、 淀粉、 羟乙基淀粉、 角叉菜聚糖、 多 聚糖 (glycon)、 直链淀粉、 壳聚糖、 N， O- 羧甲基壳聚糖、 褐藻胶和海藻酸、 淀粉、 甲壳质、 肝 素、 魔芋、 葡萄甘露聚糖 (glucommannan)、 石脐素、 肝素、 透明质酸、 凝胶多糖、 以及黄原胶。 在某些实施方案中， 该碳水化合物是一种糖醇， 包括但并不局限于甘露醇、 山梨醇、 木糖醇、 赤藓糖醇、 麦芽糖醇、 以及乳糖醇。
     可以使用多种多样的本领域已知的方法制备合成纳米载体。例如， 可以通过如纳 米沉淀、 使用流体通道的流动聚焦、 喷雾干燥、 单和双乳液溶剂蒸发、 溶剂萃取、 相分离、 研 磨、 微乳液步骤、 微型品制造、 纳米制造、 牺牲层、 简单和复杂凝聚法的方法， 以及本领域的 那些普通技术人员熟知的其他方法形成合成纳米载体。可替代地或额外地， 已经说明了 用于单分散半导体， 传导性的、 磁性的、 有机的、 以及其他纳米材料的水性和有机溶剂合成 (Pellegrino 等人， 2005， Small， 1： 48 ； Murray 等人， 2000， Ann.Rev.Mat.Sci.， 30 ： 545 ； 以 及 Trindade 等人， 2001， Chem.Mat.， 13 ： 3843)。在文献中已经说明了附加方法 ( 参见， 例 如 Doubrow， Ed.， “Microcapsules and Nanoparticles in Medicine and Pharmacy， ” CRC Press， Boca Raton， 1992 ； Mathiowitz 等人， 1987， J.Control.Release， 5： 13 ； Mathiowitz 等 人， 1987， Reactive Polymers， 6： 275 ； 以 及 Mathiowitz 等 人， 1988， J.Appl.Polymer Sci.， 35 ： 755， 以及还有美国专利 5578325 和 6007845)。
     在某些实施方案中， 通过纳米沉淀工艺或喷雾干燥来制备合成纳米载体。可以改 变在制备合成纳米载体中使用的条件以产生具有希望的大小和特性 ( 例如疏水性、 亲水 性、 外部形态学、 “粘性” 、 形状、 等 ) 的颗粒。制备合成纳米载体的方法和使用的条件 ( 例如
     溶剂、 温度、 浓度、 空气流速、 等 ) 可以取决于有待偶合到合成纳米载体上的材料和 / 或该聚 合物基质的构成。
     如果通过任何以上方法制备的颗粒具有在希望的范围外的大小范围， 那么可以按 大小分类这些颗粒， 例如使用一个筛。
     可以按多种不同的方式达到偶合， 并且可以是共价的或非共价的。这些偶合可以 安排在一个表面上或安排在本发明的纳米载体内。本发明的合成纳米载体的元件 ( 例如免 疫特征表面所包括的部分、 靶向部分、 聚合物基质、 以及类似物质 ) 可以直接彼此偶合， 例 如通过一个或多个共价键， 或者可以借助一个或多个连接物进行偶合。可以从 Saltzman 等 人的公开美国专利申请 2006/0002852、 DeSimone 等人的公开美国专利申请 2009/0028910、 或 Murthy 等人的公开国际专利申请 WO/2008/127532A1 改变官能化合成纳米载体的附加方 法。
     根据本发明， 可以使用任何合适的连接物。连接物可以用于形成酰胺键、 酯键、 二 硫键、 等。连接物可以含有碳原子或杂原子 ( 例如氮、 氧、 硫、 等 )。在一些实施方案中， 连接 物是脂肪族的或杂脂肪族的连接物。在一些实施方案中， 该连接物是聚烷基连接物。在某 些实施方案中， 该连接物是聚醚连接物。在某些实施方案中， 该连接物是聚乙烯连接物。在 某些特定实施方案中， 该连接物是聚乙二醇 (PEG) 连接物。
     在一些实施方案中， 该连接物是可切割的连接物。 为了给出但是一些实例， 可切割 的连接物包括蛋白酶可切割的肽连接物、 核酸酶敏感的核酸连接物、 脂肪酶敏感的脂质连 接物、 糖苷酶敏感的碳水化合物连接物、 pH 敏感的连接物、 低氧敏感的连接物、 可以光切割 的连接物、 不耐热的连接物、 可以酶切割的连接物 ( 例如可以酯酶切割的连接物 )、 超声波 敏感的连接物、 可以 X 射线切割的连接物、 等。在一些实施方案中， 该连接物不是可切割的 连接物。
     多种方法可以用于偶合连接物或合成纳米载体的其他元件与该合成纳米载体。 一 般的策略包括被动吸附 ( 例如经由静电相互作用 )、 多价螯合作用、 特异性结合对的成员之 间的高亲和力非共价结合、 共价键形成、 等 (Gao 等， 2005， Curr.Op.Biotechnol.， 16 ： 63)。 在一些实施方案中， 可以使用点击化学来缔合材料与合成纳米载体。
     可以采用非共价特异结合相互作用。 例如， 可以用生物素官能化一种颗粒、 亦或一 种生物分子， 该生物素具有其他被链霉亲和素官能化的物质。这两部分彼此非共价特异性 结合并且具有高亲和力， 因此缔合颗粒和生物分子。 可以类似地使用其他特异性结合对。 可 替代地， 组氨酸标记的生物分子可以与结合镍 - 次氮基三乙酸 (Ni-NTA) 的颗粒缔合。
     对 于 关 于 偶 合 的 额 外 综 合 信 息， 参 见 期 刊 Bioconjugate Chemistry， 由 American Chemical Society 出 版， Columbus OH， PO Box 3337， Columbus， OH， 43210 ； “Cross-Linking， ” Pierce Chemical Technical Library，在 Pierce 网 址 和 1994-95 Pierce Catalog 中的初次出版中可得， 以及其中引用的参考文献 ； Wong SS， Chemistry of Protein Conjugation and Cross-linking， CRCPress Publishers， Boca Raton， 1991 ； 以 及 Hermanson， G.T.， Bioconjugate Techniques， Academic Press， Inc.， San Diego， 1996。
     已理解可以按任何合适的方式制造这些本发明的组合物， 并且本发明绝不局限于 可以使用在此说明的方法生产的组合物。 选择适当方法可以要求关注相关的具体部分的特 性。药物组合物和使用方法
     根据本发明的组合物包括与药学上可接受的赋形剂结合的本发明的合成纳米载 体。可以使用常规药学制造和配料技术制造该组合物， 以达到有用的剂型。在一个实施方 案中， 本发明的合成纳米载体悬浮在无菌盐溶液中， 用于与防腐剂一起注射。
     在一些实施方案中， 在无菌条件下制造本发明的合成纳米载体， 或将其最终灭菌。 这可以确保生成的组合物是无菌的并且非传染性的， 因此在与非无菌组合物比较时改进了 安全性。 这提供了有价值的安全措施， 特别是当接受合成纳米载体的受试者具有免疫缺陷、 遭受感染， 和 / 或对感染敏感时。在一些实施方案中， 本发明的合成纳米载体可以被冻干并 储存在悬浮液中、 或作为冻干的粉末， 这取决于针对不失活的延长时段的配制策略。
     本发明的组合物可以通过多种给药途径给予， 包括但并不局限于 ： 皮下的、 肌内、 真皮内的、 口服、 肠胃外的、 鼻内的、 经粘膜的、 直肠 ； 眼的、 经皮的、 经皮肤的、 或者通过这些 途径的组合。
     在此说明的组合物和方法可以用于诱导、 增强、 刺激、 调节、 或指导免疫应答。 在此 说明的组合物和方法可以用于诊断、 预防和 / 或治疗病情， 例如癌、 传染病、 代谢病、 退行性 疾病、 炎性疾病、 免疫疾病、 或其他失调和 / 或病情。在此说明的组合物和方法还可以用于 预防或治疗依赖症， 例如对烟碱或那可丁的依赖症。在此说明的组合物和方法还可以用于 预防和 / 或治疗由于暴露于毒素、 危险物质、 环境毒素、 或其他有害媒介物而导致的病情。
     实例
     实例 1 ： 制备活化聚合物
     将 PLA(dl- 聚 丙 交 酯 )( 来 自 Boehringer-Ingelheim 的 Resomer R202H， 0.21mmol/g 的 KOH 当量酸值， 特性粘度 ： (iv) ： 0.21dl/g)(10g， 2.1mmol， 1.0eq) 溶解在二 氯甲烷 (DCM)(35mL) 中。添加 EDC(2.0g， 10.5mmol， 5eq) 和 NHS(1.2g， 10.5mmol， 5eq)。用 超声处理的助剂溶解这些固体。在室温下搅拌生成的溶液 6 天。浓缩该溶液以除去多数 DCM， 并且将剩余物添加至 250mL 的乙醚和 5mL 的 MeOH 的溶液中， 以沉淀出活化的 PLA-NHS 酯。 除去溶剂并且用醚 (2x200mL) 洗涤该聚合物两次， 并且在真空下干燥以给出 PLA-NHS 活 化酯， 为一种白色泡沫状固体 ( 回收约 8g， 使用 H NMR 来证实 NHS 酯的存在 )。在使用前， 在低于 -10℃冷冻箱中， 在氩气下储存该 PLA-NHS 酯。
     可替代地， 可以取代 DCM， 在 DMF、 THF、 二噁烷或 CHCl3 中进行该反应。 可以使用 DCC 取代 EDC( 在从醚沉淀 PLA-NHS 酯前， 过滤出生成的 DCC- 脲 )。EDC 或 DCC 和 NHS 的量可以 在 2-10eq 的 PLA 的范围内。
     以 相 同 的 方 式， 将 具 有 0.33dl/g 的 iv 并 且 酸 值 为 0.11mmol/g 的 PLA 或 PLGA(Resomer RG653H， 65％丙交酯 -35％乙交酯， iv ： 0.39dl/g 并且酸值 0.08mmol/g) 或 PLGA(Resomer RG752H， 75％丙交酯 -25％乙交酯， iv ： 0.19dl/g 并且酸值为 0.22mmol/g) 转 化为对应的 PLA-NHS 或 PLGA-NHS 活化酯， 并且在使用前， 在低于 -10℃冷冻箱中， 在氩气下 储存。
     实例 2 ： 制备活化聚合物
     在 10mL 的 干 乙 腈 中 溶 解 PLA(R202H， 0.21mmol/g 的 酸 值 )(2.0g， 0.42mmol， 1.0eq)。添加 N， N’ - 二琥珀酰亚胺碳酸酯 (DSC)(215mg， 1.26mmol， 3.0eq) 和催化剂量的 4-(N， N- 二甲氨基 ) 吡啶 (DMAP)。在氩气下， 搅拌生成的混合物 1 天。浓缩生成的溶液至几乎干燥。然后添加剩余物至 40mL 的醚中以沉淀出用醚 (2x30mL) 洗涤两次的聚合物， 并 且在真空下干燥以给出 PLA-NHS 活化酯 (1H NMR 示出 NHS 酯的量在约 80％ )。
     实例 3 ： 制备活化聚合物
     在 25mL 的无水 DCM 和 2.5mL 的无水 DMF 中溶解 PLA(R202H)(5.0g， 1.05mmol)。添 加 DCC(650mg， 3.15mmol， 5.0eq) 和五氟苯酚 (PFP)(580mg， 3.15mmol， 5.0eq)。在室温下搅 拌生成的溶液 6 天， 并且然后浓缩以除去 DCM。 生成的剩余物被添加至 250mL 的醚中以沉淀 出用醚 (2x100mL) 洗涤的活化 PLA 聚合物， 并且在真空下干燥以给出 PLA-PFP 活化酯， 为一 种白色泡沫状固体 (4.0g)。
     实例 4 ： 结合免疫调节剂
     在氩气下， 在 2mL 的干 DMF 中溶解 PLA-NHS(1.0g)、 R848(132mg， 0.42mmol)、 和二 异丙基乙胺 (DIPEA)(0.073mL， 0.42mmol)。在 50℃ -60℃加热生成的溶液 2 天。冷却该溶 液至室温并且添加 40mL 的去离子 (DI) 水以沉淀出聚合物产物。然后用 DI 水 (40mL) 和醚 (2x40mL) 洗涤该聚合物， 并且在 30℃， 在真空下干燥以给出 R848-PLA 结合物， 为一种白色 泡沫状固体 (0.8g， H NMR 示出 R848 经由酰胺键结合至 PLA)。R848 在聚合物上的结合 ( 加 载 ) 程度通过如下 HPLC 分析证实 ： 称出重量的聚合物在 THF/MeOH 中溶解， 并且用 15％ NaOH 处理。通过与标准曲线比较的 HPLC， 分析生成的水解聚合物产物的 R848 的量。
     实例 5 ： 结合免疫调节剂
     在氩气下， 在 2mL 的干 DMF 中溶解 PLA-NHS(1.0g， 0.21mmol， 1.0eq)、 R848(132mg， 0.42mmol， 2.0eq)、 DIPEA(0.15mL， 0.84mmol， 4.0eq) 和 DMAP(25mg， 0.21mmol， 1.0eq)。 在 50℃ -60℃加热生成的溶液 2 天。冷却该溶液至室温并且添加 40mL 的去离子 (DI) 水以沉 淀出聚合物产物。然后用 DI 水 (40mL) 和醚 (2x40mL) 洗涤该聚合物， 并且在 30℃， 在真空 下干燥以给出 PLA-R848 结合物， 为一种白色泡沫状固体 (0.7g， 20mg 的聚合物在 0.2mL 的 THF、 0.1mL 的 MeOH 和 0.1mL 的 15％ NaOH 的溶液中水解 )。通过反相高效液相色谱法分析 (C18 柱， 流动相 A ： 在水中 0.1％ TFA， 流动相 B ： 在 CH3CN 中 0.1％ TFA， 梯度 ) 确定在聚合 物上的 R848 的量为约 35mg/g。
     实例 6 ： 结合免疫调节剂
     在 4mL 的 干 DMF 中 溶 解 PLA(R202H)(2.0g， 0.42mmol， 1.0eq)、 DCC(260mg， 1.26mmol ， 3.0eq) 、NHS(145mg ， 1.26mmol ， 3.0eq) 、R848(200mg ， 0.63mmol ， 1.5eq) 、 DMAP(77mg， 0.63mmol， 1.5eq) 和 DIPEA(0.223mL， 1.26mmol， 3.0eq)。 在 50℃ -55℃加热该混 合物 3 天。 冷却该混合物至室温并且用 DCM 稀释。 过滤掉 DCC- 脲， 并且浓缩滤液以除去 DCM。 将在 DMF 中的生成的剩余物添加至水 (40mL) 中以沉淀出用水 (40mL)、 醚 /DCM(40mL/4mL) 和醚 (40mL) 洗涤的聚合物产物。在 30℃， 在真空下干燥后， 获得希望的 PLA-R848 结合物， 为一种白色泡沫状固体 (1.5g)。
     实例 7 ： 结合免疫调节剂
     在 4mL 的 干 DMF 中 溶 解 PLA(R202H)(2.0g， 0.42mmol， 1.0eq)、 EDC(242mg， 1.26mmol ， 3.0eq) 、 HOAt(171mg ， 1.26mmol ， 3.0eq) 、 R848(200mg ， 0.63mmol ， 1.5eq) 和 DIPEA(0.223mL， 1.26mmol， 3.0eq)。在 50℃ -55℃加热该混合物 2 天。冷却该溶液至室温， 并且添加至水 (40mL) 中以沉淀出用水 (40mL)、 醚 /MeOH(40mL/2mL) 和醚 (40mL) 洗涤的聚 合物产物。在 4mL 的 DCM 中溶解橙色聚合物， 并且添加生成的溶液至 40mL 的醚中以沉淀出没有主要橙色的聚合物。用醚 (40mL) 洗涤浅色聚合物。在 30℃， 在真空下干燥后， 获得希 望的 PLA-R848 结合物， 为一种浅褐色泡沫状固体 (1.5g)。
     实例 8 ： 结合免疫调节剂
     在 2mL 的 干 DMF 中 溶 解 PLA(R202H)(1.0g， 0.21mmol， 1.0eq)、 EDC(161mg， 0.84mmol， 4.0eq)、 HOAt.H2O(65mg， 0.42mmol， 2.0eq)、 R848(132mg， 0.42mmol， 2.0eq) 和 DIPEA(0.150mL， 0.84mmol， 4.0eq)。在 50℃ -55℃加热该混合物 2 天。冷却该溶液至室温 并且添加至水 (40mL) 中以沉淀出聚合物产物。在 2mL 的 DCM 中溶解该橙色聚合物并且添 加生成的溶液至 40mL 的醚中以沉淀出用水 / 丙酮 (40mL/2mL) 和醚 (40mL) 洗涤的聚合物。 在 30℃， 在真空下干燥后， 获得希望的 PLA-R848 结合物， 为一种灰白色泡沫状固体 (1.0g， 基于 HPLC 分析并且通过 1H NMR 证实， 在聚合物上加载的 R848 为约 45mg/g)。以相同的方 式， 制备 PLGA(75％丙交酯 )-R848 和 PLGA(50％丙交酯 )-R848。
     实例 9 ： 结合免疫调节剂
     向装备有搅拌棒和冷凝器的双颈圆底烧瓶添加咪唑并喹啉瑞喹莫德 (R-848、 218mg， 6.93X10-4 摩尔 )、 D/L 丙交酯 (1.0g， 6.93X10-3 摩尔 ) 和无水硫酸钠 (800mg)。在 55℃， 真空下干燥该烧瓶和内容物 8 小时。在冷却后， 然后用氩气冲洗该烧瓶并且添加甲苯 (50mL)。 在设定在 120℃的油浴中搅拌该反应直至丙交酯已经溶解， 然后经由移液管添加乙 基己酸锡 (19mg， 15μL)。然后在氩气下持续加热 16 小时。冷却后， 用醚 (200mL) 稀释该反 应， 并且然后用水洗涤 (200mL) 该溶液。在硫酸镁上干燥该溶液， 过滤并在真空下蒸发以给 出 880mg 粗聚乳酸 -R-848 结合物。 使用在亚甲基氯中的 10％甲醇作为洗脱液， 在硅石上用 色谱法分析粗聚合物。收集含有该结合物的部分， 并且蒸发以给出纯化的结合物。在高真 空下将其干燥以提供结合物， 为一种产量为 702mg(57.6％ ) 的固体泡沫。通过整合该喹啉 的芳香族质子的 NMR 信号， 并且将它与乳酸 CH 质子的整合强度比较， 确定该结合物的分子 量为约 2KD。GPC 示出该结合物含有小于 5％的游离 R848。
     实例 10 ： 制备低 MW PLA-R848 结合物
     在室温， 在氩气下搅拌在 EtOAc(120mL) 中的 PLA-CO2H( 平均 MW ： 950， DPI ： 1.32 ； 5.0g， 5.26mmol) 和 HBTU(4.0g， 10.5mmol) 的 溶 液 45 分 钟。 添 加 化 合 物 R848(1.65g， 5.26mmol)， 随后添加 DIPEA(5.5mL， 31.6mmol)。在室温下搅拌该混合物 6h， 并且然后在
     50 ℃ -55 ℃搅拌 15h。在冷却后， 用 EtOAc(150mL) 稀释该混合物， 并且用 1 ％柠檬酸溶液 (2x40mL)、 水 (40mL) 和盐水溶液 (40mL) 洗涤。在 Na2SO4(10g) 上干燥该溶液并且浓缩至 凝胶状剩余物。然后添加甲基叔丁基醚 (MTBE)(150mL) 并且从溶液中沉淀出该聚合物结合 物。然后用 MTBE(50mL) 洗涤该聚合物， 并且在室温， 在真空下干燥 2 天， 为一种白色泡沫 (5.3g， 通过 GPC， 平均 MW 为 1200， PDI ： 1.29 ； 通过 HPLC， R848 加载为 20％ )。
     实例 11 ： 制备低 MW PLA-R848 结合物
     在室温， 在氩气下搅拌在 EtOAc(120mL) 中的 PLA-CO2H( 平均 MW ： 1800， DPI ： 1.44 ； 9.5g， 5.26mmol) 和 HBTU(4.0g， 10.5mmol) 的 溶 液 45 分 钟。 添 加 化 合 物 R848(1.65g， 5.26mmol)， 随后添加 DIPEA(5.5mL， 31.6mmol)。在室温下搅拌该混合物 6h， 并且然后在 50 ℃ -55 ℃搅拌 15h。在冷却后， 用 EtOAc(150mL) 稀释该混合物， 并且用 1 ％柠檬酸溶液 (2x40mL)、 水 (40mL) 和盐水溶液 (40mL) 洗涤。在 Na2SO4(10g) 上干燥该溶液并且浓缩至
     凝胶状剩余物。然后添加甲基叔丁基醚 (MTBE)(150mL) 并且从溶液中沉淀出该聚合物结合 物。然后用 MTBE(50mL) 洗涤该聚合物， 并且在室温， 在真空下干燥 2 天， 为一种白色泡沫 (9.5g， 通过 GPC， 平均 MW 为 1900， PDI ： 1.53 ； 通过 HPLC， R848 加载为 17％ )。
     实例 12 ： 经由酰亚胺开环作用结合 R848 至 PCADK
     根据在 Pulendran 等人， WO 2008/127532 中提供的、 在以下步骤 1 说明的方法， 以 下实例说明了一种聚缩酮 PCADK 的合成。
     在连接短程蒸馏头的 50mL 双颈烧瓶中合成 PCADK。 首先， 在 6.82mL 的乙酸乙酯中 溶解 5.5mg 的重结晶的对甲苯磺酸 (0.029mmol， Aldrich， St.Louis， MO)， 并且添加至 30mL 苯溶液 ( 保持在 100℃ )， 它含有 1， 4- 环己烷二甲醇 (12.98g， 90.0mmol， Aldrich)。允许乙 酸乙酯汽化， 并且添加蒸馏的 2， 2- 二甲氧基丙烷 (10.94mL， 90.0mmol， Aldrich) 至苯溶液， 引发聚合反应。在 6 小时内， 每小时经由一个计量漏斗随后添加额外剂量的 2， 2- 二甲氧基 丙烷 (5mL) 和苯 (25mL) 至该反应， 以补偿蒸发掉的 2， 2- 二甲氧基丙烷和苯。8 小时后， 通 过添加 500μL 三乙胺停止反应。通过在冷己烷 ( 储存在 -20℃ ) 中沉淀， 随后进行真空过 滤， 分离该聚合物。 通过装备有紫外线分光光度检测器的凝胶渗透色谱法 (GPC)(Shimadzu， Kyoto， Japan) 确定 PCADK 的分子量。在 1ml/min 的流速下， 将 THF 用作流动相。将来自 Polymer Laboratories(Amherst， MA) 的聚苯乙烯标准用于建立分子量校准曲线。在所有 随后的实验中， 这一化合物用于产生 PCADK 颗粒。
     经由酰亚胺开环作用， 根据以下示出的步骤 2， 可以将 R848 结合至具有 6000 分子 量的 PCADK 的末端醇基。
     步骤 1 ： 制备 PCADK
     步骤 2 ： 结合 PCADK 至 R848在步骤 2， 在 100mL 亚甲基氯中溶解来自步骤 1 的聚合物 (12g， 2.0x10-3 摩尔 )， 并 -3 且添加 R848 的内酰胺 (3.3g， 8.0x10 摩尔 )。搅拌这一浆料， 同时以单独的一份添加 1， 5， -3 7- 三氮杂二环 -[4， 4， 0]-5- 癸烯 (TBD， 0.835g， 6X10 摩尔 )。在室温下搅拌过夜后， 形成 澄清溶液。用亚甲基氯 (100mL) 稀释该溶液， 并且用 5％柠檬酸洗涤该溶液。在硫酸钠上干 燥这一溶液， 在这以后， 过滤并在真空下蒸发。在高真空下干燥后， 获得 11.3 克 (81％ ) 的 聚合物。在酸中水解一部分， 并且确定 R848 含量为按重量计 9％。
     实例 13 ： 经由酰亚胺开环作用结合 R848 至聚己酸内酯二醇
     酰亚胺开环作用被用于附连 R854 至具有 2000 分子量的聚己酸内酯二醇的末端醇 基。从 Aldrich Chemical Company 购买聚己酸内酯二醇， Cat.#189421， 并且具有以下结 构：
     聚己酸内酯二醇 -R854 结合物具有以下结构 ：
     在 25mL 亚甲基氯中溶解该聚合物 (5g， 2.5x10-3 摩尔 )， 并且添加 R854 的内酰胺 -3 (2.4g， 5.0x10 摩尔 )。搅拌这一浆料， 同时以单独的一份添加 1， 5， 7- 三氮杂二环 -[4， 4， -3 0]-5- 癸烯 (TBD， 0.557g， 4X10 摩尔 )。 在室温下搅拌 15 分钟后， 形成澄清淡黄色溶液。 用 亚甲基氯 (100mL) 稀释该溶液， 并且用 5％柠檬酸洗涤该溶液。在硫酸钠上干燥这一溶液， 在这以后， 过滤并在真空下蒸发。在高真空下干燥后， 获得 5.2 克 (70％ ) 的聚合物。在酸中水解一部分， 并且确定 R848 含量为按重量计 18.5％。
     实例 14 ： 经由酰亚胺开环作用结合 R848 至聚 ( 碳酸六亚甲基酯 ) 二醇
     酰 亚 胺 开 环 作 用 被 用 于 附 连 R848 至 具 有 2000 分 子 量 的 聚 ( 碳 酸 六 亚 甲 基 酯 ) 二醇的末端醇基。从 Aldrich Chemical Company 购买聚 ( 碳酸六亚甲基酯 ) 二醇， Cat#461164， 并且具有以下结构 ：
     HO-[CH2(CH2)4CH2OCO2]nCH2(CH2)4CH2-OH.
     聚 ( 碳酸六亚甲基酯 ) 二醇 -R848 结合物具有以下结构 ：
     在 25mL 亚甲基氯中溶解该聚合物 (5g， 2.5x10-3 摩尔 )， 并且添加 R848 的内酰胺 -3 (2.06g， 5.0x10 摩尔 )。 搅拌这一浆料， 同时以单独的一份添加 1， 5， 7- 三氮杂二环 -[4， 4， -3 0]-5- 癸烯 (TBD， 0.557g， 4X10 摩尔 )。在室温下搅拌过夜后， 形成澄清淡黄色溶液。用亚 甲基氯 (100mL) 稀释该溶液， 并且用 5％柠檬酸洗涤该溶液。在硫酸钠上干燥这一溶液， 在 这以后， 过滤并在真空下蒸发。在高真空下干燥后， 获得 5.9 克 (84％ ) 的聚合物。NMR 用 于确定 R848 含量， 确定 R848 含量为 21％。
     实例 15 ： 使用一种乙基己酸锡催化剂的咪唑并喹啉的聚乳酸结合物
     向装备有搅拌棒和冷凝器的双颈圆底烧瓶添加咪唑并喹啉瑞喹莫德 (R-848、 100mg， 3.18X10-4 摩尔 )、 D/L 丙交酯 (5.6gm， 3.89X10-2 摩尔 ) 和无水硫酸钠 (4.0g)。在 50℃， 真空下干燥该烧瓶和内容物 8 小时。然后用氩气冲洗该烧瓶并且添加甲苯 (100mL)。 在设定在 120℃的油浴中搅拌该反应直至所有丙交酯已经溶解， 然后经由移液管添加乙基 己酸锡 (75mg， 60μL)。然后在氩气下持续加热 16 小时。在冷却以后， 添加水 (20mL) 并且 持续搅拌 30 分钟。用添加的甲苯 (200mL) 稀释该反应， 并且然后用水洗涤 (200mL)。然后 依次用含有 5％浓盐酸的 10％氯化钠溶液 (200mL) 洗涤该甲苯溶液， 随后用饱和碳酸氢钠 (200mL) 洗涤。 TLC( 硅石， 在亚甲基氯中的 10％甲醇 ) 示出该溶液不含有游离的 R-848。 在 硫酸镁上干燥该溶液， 过滤并在真空下蒸发以给出 3.59 克聚乳酸 -R-848 结合物。在碱中
     水解一部分聚合物， 并且通过 HPLC 检查 R-848 含量。通过与 R-848 浓度相对 HPLC 反应的 标准曲线比较， 确定该聚合物含有 4.51mg R-848 每克聚合物。通过 GPC 确定该聚合物的分 子量为约 19,000。
     实例 16 ： 咪唑并喹啉的低分子量聚乳酸结合物
     向装备有搅拌棒和冷凝器的双颈圆底烧瓶添加咪唑并喹啉瑞喹莫德 (R-848、 218mg， 6.93X10-4 摩尔 )、 D/L 丙交酯 (1.0g， 6.93X10-3 摩尔 ) 和无水硫酸钠 (800mg)。在 55℃， 真空下干燥该烧瓶和内容物 8 小时。在冷却后， 然后用氩气冲洗该烧瓶并且添加甲苯 (50mL)。 在设定在 120℃的油浴中搅拌该反应直至丙交酯已经溶解， 然后经由移液管添加乙 基己酸锡 (19mg， 15μL)。然后在氩气下持续加热 16 小时。冷却后， 用醚 (200mL) 稀释该反 应， 并且然后用水洗涤 (200mL) 该溶液。在硫酸镁上干燥该溶液， 过滤并在真空下蒸发以给 出 880mg 粗聚乳酸 -R-848 结合物。 使用在亚甲基氯中的 10％甲醇作为洗脱液， 在硅石上用 色谱法分析粗聚合物。收集含有该结合物的部分， 并且蒸发以给出纯化的结合物。在高真 空下将其干燥以提供结合物， 为一种产量为 702mg(57.6％ ) 的固体泡沫。通过整合该喹啉 的芳香族质子的 NMR 信号， 并且将它与乳酸 CH 质子的整合强度比较， 确定该结合物的分子 量为约 2KD。GPC 示出该结合物含有小于 5％的游离 R848。
     实例 17 ： 咪唑并喹啉的低分子量聚乳酸乙醇酸共聚物结合物
     向装备有搅拌棒和冷凝器的双颈圆底烧瓶添加咪唑并喹啉瑞喹莫德 (R-848， 436mg， 1.39X10-3 摩尔 )、 乙交酯 (402mg， 3.46X10-3 摩尔 )、 D/L 丙交酯 (2.0g， 1.39X10-2 摩 尔 ) 和无水硫酸钠 (1.6g)。在 55℃， 真空下干燥该烧瓶和内容物 8 小时。在冷却后， 然后 用氩气冲洗该烧瓶并且添加甲苯 (60mL)。在设定在 120℃的油浴中搅拌该反应直至所有 R848、 乙交酯和丙交酯已经溶解， 并且然后经由移液管添加乙基己酸锡 (50mg， 39μL)。然 后在氩气下持续加热 16 小时。在冷却后， 用乙酸乙酯 (200mL) 稀释该反应， 并且用水洗涤 (200mL) 该溶液。在硫酸镁上干燥该溶液， 过滤并在真空下蒸发以给出粗 PLGA-R-848 结合 物。使用在亚甲基氯中的 10％甲醇作为洗脱液， 在硅石上用色谱法分析粗聚合物。收集含 有该结合物的部分， 并且蒸发以给出纯化的结合物。 在高真空下将其干燥以提供结合物， 为 一种产量为 1.55g(54.6％ ) 的固体泡沫。通过整合该喹啉的芳香族质子的 NMR 信号， 并且 将它与乳酸 CH 质子的整合强度比较， 确定该结合物的分子量为约 2KD。GPC 示出该结合物 含有不可检出的游离 R848。
     实例 18 ： 使用一种二异丙氨基锂催化作用的咪唑并喹啉的聚乳酸结合
     在使用前， 咪唑并喹啉 (R-848)、 D/L 丙交酯和相关玻璃器皿都在 50℃， 在真空下 -4 干燥 8 小时。向装备有搅拌棒和冷凝器的圆底烧瓶添加 R-848(33mg， 1.05X10 摩尔 )、 和 干甲苯 (5mL)。加热它至回流以溶解所有的 R-848。在氮气下搅拌该溶液， 并且冷却至室温 以提供精细分散的 R-848 悬浮液。向这一悬浮液添加二异丙氨基锂溶液 ( 在 THF 中 2.0M，
     50μL， 1.0x10-4 摩尔 )， 此后在室温下持续搅拌 5 分钟。在氮气下， 经由注射器将已经形成 -2 的淡黄色溶液添加至 D/L 丙交酯热 (120℃ ) 溶液 (1.87g， 1.3x10 摩尔 )。移去加热， 并且 在室温下搅拌该淡黄色溶液一小时。 用亚甲基氯 (200mL) 稀释该溶液， 并且然后用 1％盐酸 (2x50mL) 洗涤它， 随后用饱和碳酸氢钠溶液 (50mL) 洗涤。在硫酸镁上干燥该溶液， 过滤并 在真空下蒸发以给出聚乳酸 -R-848 结合物。TLC( 硅石， 在亚甲基氯中的 10％甲醇 ) 示出 该溶液不含有游离的 R-848。在亚甲基氯 (10mL) 中溶解聚合物并且将这一溶液滴入搅拌 的己烷 (200mL) 中。通过倾析法分离沉淀的聚合物， 并且在真空下干燥以给出 1.47 克聚乳 酸 -R-848 结合物， 为一种白色固体。在碱中水解一部分聚合物， 并且通过 HPLC 检查 R-848 含量。 通过与 R-848 浓度相对 HPLC 反应的标准曲线比较， 确定该聚合物含有 10.96mg R-848 每克聚合物。
     实例 19 ： 附着免疫调节剂至低 MW PLA
     在 二 氯 甲 烷 (DCM)(35mL) 中 溶 解 具 有 MW5000 的 PLA(D/L- 聚 丙 交 酯 )(10.5g， 2.1mmol， 1.0eq)。添加 EDC(2.0g， 10.5mmol， 5eq) 和 NHS(1.2g， 10.5mmol， 5eq)。在室温下 搅拌生成的溶液 3 天。浓缩该溶液以除去多数 DCM， 并且将剩余物添加至 250mL 的乙醚和 5mL 的 MeOH 的溶液中， 以沉淀出活化的 PLA-NHS 酯。 除去溶剂并且用醚 (2x200mL) 洗涤该聚 合物两次， 并且在真空下干燥以给出 PLA-NHS 活化酯， 为一种白色泡沫状固体 ( 回收约 8g， 1 可以使用 H NMR 证实 NHS 酯的存在 )。在使用前， 在低于 -10℃冷冻箱中， 在氩气下储存该 PLA-NHS 酯。
     可替代地， 可以取代 DCM， 在 DMF、 THF、 二噁烷或 CHCl3 中进行该反应。 可以使用 DCC 取代 EDC( 在从醚沉淀 PLA-NHS 酯前， 过滤出生成的 DCC- 脲 )。EDC 或 DCC 和 NHS 的量可以 在 2-10eq 的 PLA 的范围内。
     实例 20 ： 附着免疫调节剂至低 MW PLGA
     以与以上提供的用于聚合物活化的相同方式， 将具有 50％至 75％乙交酯的低 MW PLGA 转化为对应 PLGA-NHS 活化酯， 并且在使用前， 在低于 -10℃冷冻箱中， 在氩气下储存。
     实例 21 ： 在催化剂存在下， R848 与 D/L- 丙交酯的一锅法开环聚合
     缓慢加热在 2mL 无水甲苯中的 R848(0.2mmol， 63mg)、 D/L- 丙交酯 (40mmol， 5.8g) 和 4- 二甲基氨基吡啶 (DMAP)(50mg， 0.4mmol) 的混合物至 150℃ ( 油浴温度 )， 并且保持在 这一温度 18h( 在 3hr 以后， 无 R848 剩余 )。冷却该混合物至环境温度， 并且用水 (50mL) 骤 冷生成的混合物以沉淀出生成的聚合物， R848-PLA。然后依次用每次 45mL 的 MeOH、 iPrOH、 和乙醚洗涤该聚合物。在 30℃， 在真空下干燥该聚合物以给出灰白色膨突固体 (5.0g)。通 1 过在 CDCl3 中的 H NMR 证实聚合物结构。通过反相高效液相色谱法， 用 THF/MeOH 中的 2N NaOH aq 处理小样品的聚合物以确定在聚合物上加载的 R848。加载的 R848 为 3mg 每克聚
     合物 (0.3％加载 - 理论上的 27.5％ )
     实例 22 ： R848 与 D/L- 丙交酯和乙交酯的两步开环聚合
     在氩气下， 加热 D/L- 丙交酯 (10.8g， 0.075 摩尔 ) 和乙交酯 (2.9g， 0.025 摩尔 ) 混合物至 135℃。 一旦所有材料已经融化并且生成澄清溶液， 添加 R848(1.08g， 3.43X10-3 摩 尔 )。在 135℃， 在缓慢的氩气流下搅拌这一溶液一小时。添加乙基己酸锡 (150μL) 并且 持续加热 4 小时。冷却以后， 将固体淡褐色块溶解在亚甲基氯 (250mL) 中， 并且用 5％酒石 酸溶液 (2x200mL) 洗涤该溶液。在硫酸镁上干燥该亚甲基氯溶液， 过滤， 并且然后在真空下 浓缩。在亚甲基氯 (20mL) 中溶解剩余物， 并且在搅拌下添加 2- 丙醇 (250mL)。通过倾析 2- 丙醇分离分开的聚合物， 并且在高真空下干燥。NMR 示出该聚合物是具有 4000 的分子量 的 71.4％丙交酯和 28.6％乙交酯。通过 NMR， 加载的 R848 接近理论值。
     实例 23 ： 制备 PLGA-R848 结合物
     在室温， 在氩气下搅拌在无水 EtOAc(160mL) 中的 PLGA(Lakeshores 聚合物， MW 约 5000， 7525DLG1A， 酸 值 0.7mmol/g， 10g， 7.0mmol) 和 HBTU(5.3g， 14mmol) 混 合 物 50 分 钟。添加化合物 R848(2.2g， 7mmol)， 随后添加二异丙基乙胺 (DIPEA)(5mL， 28mmol)。在室 温下搅拌该混合物 6h， 并且然后在 50℃ -55℃过夜 ( 约 16h)。在冷却后， 用 EtOAc(200mL) 稀释该混合物， 并且用饱和 NH4Cl 溶液 (2x40mL)、 水 (40mL) 和盐水溶液 (40mL) 洗涤。在 Na2SO4(20g) 上干燥该溶液并且浓缩至凝胶状剩余物。然后添加异丙醇 (IPA)(300mL) 并且 从溶液中沉淀出该聚合物结合物。然后用 IPA(4x50mL) 洗涤该聚合物以除去残留试剂， 并 且在 35℃ -40℃， 在真空下干燥 3 天， 为一种白色粉末 (10.26g， 通过 GPC， MW 为 5200， 通过 HPLC， R848 加载为 12％ )。
     实例 24 ： 制备 PLGA-854A 结合物
     在室温， 在氩气下搅拌在无水 EtOAc(20mL) 中的 PLGA(Lakeshores 聚合物， MW 约 5000， 7525DLG1A， 酸值 0.7mmol/g， 1.0g， 7.0mmol) 和 HBTU(0.8g， 2.1mmol) 混合物 45 分钟。 添加化合物 845A(0.29g， 0.7mmol)， 随后添加二异丙基乙胺 (DIPEA)(0.73mL， 4.2mmol)。在 室温下搅拌该混合物 6h， 并且然后在 50℃ -55℃过夜 ( 约 15h)。 在冷却后， 用 EtOAc(100mL) 稀释该混合物， 并且用饱和 NH4Cl 溶液 (2x20mL)、 水 (20mL) 和盐水溶液 (20mL) 洗涤。在 Na2SO4(10g) 上干燥该溶液并且浓缩至凝胶状剩余物。然后添加异丙醇 (IPA)(40mL) 并且 从溶液中沉淀出该聚合物结合物。然后用 IPA(4x25mL) 洗涤该聚合物以除去残留试剂， 并 且在 35℃ -40℃， 在真空下干燥 2 天， 为一种白色粉末 (1.21g， 通过 GPC， MW 为 4900， 通过 HPLC， 854A 加载为 14％ )。
     实例 25 ： 制备 PLGA-BBHA 结合物
     在室温， 在氩气下搅拌在无水 EtOAc(30mL) 中的 PLGA(Lakeshores 聚合物， MW 约 5000， 7525DLG1A， 酸值 0.7mmol/g， 1.0g， 7.0mmol) 和 HBTU(0.8g， 2.1mmol) 混合物 30 分钟。 添加在 2mL 干 DMSO 中的化合物 BBHA(0.22g， 0.7mmol)， 随后添加二异丙基乙胺 (DIPEA) (0.73mL， 4.2mmol)。在室温下搅拌该混合物 20h。添加额外量的 HBTU(0.53g， 1.4mmol) 和 DIPEA(0.5mL， 2.8mmol)， 并且在 50℃ -55℃加热该混合物 4h。在冷却后， 用 EtOAc(100mL) 稀释该混合物， 并且用饱和 NH4Cl 溶液 (20mL)、 水 (2x20mL) 和盐水溶液 (20mL) 洗涤。在 Na2SO4(10g) 上干燥该溶液并且浓缩至凝胶状剩余物。 然后添加异丙醇 (IPA)(35mL) 并且从 溶液中沉淀出该褐色聚合物结合物。然后用 IPA(2x20mL) 洗涤该聚合物以除去残留试剂， 并且在 35℃ -40℃， 在真空下干燥 2 天， 为一种褐色粉末 (1.1g)。
     实例 26 ： 结合 R848 至聚甘氨酸， 一种聚酰胺
     通过 Aliferis 等人的方法 (Biomacromolecules， 5， 1653， (2004))， 使用 6- 氨基 己酸苯甲基酯 (Aldrich cat#S33465)， 通过甘氨酸 N- 羧酸酐 (Aldrich cat#369772) 的开 环聚合制备叔丁氧羰基 (tBOC) 保护的聚甘氨酸羧酸 (I)。端氨基的保护， 如 t-BOC 氨基甲
     酸酯， 随后在钯碳上氢化以除去苯甲基酯， 完成 BOC 保护的聚甘氨酸羧酸 (I) 的合成。
     在室温， 在氩气下， 搅拌在无水 DMF(100mL) 中的 BOC 保护的聚甘氨酸羧酸的混 合物 (5gm， MW ＝ 2000， 2.5x10-3 摩尔 ) 和 HBTU(3.79gm， 1.0x10-2 摩尔 )50 分钟。然后添 加 R848(1.6gm， 5.0X10-3 摩尔 )， 随后添加二异丙基乙胺 (4mL， 2.2x10-2 摩尔 )。在 RT 搅 拌该混合物 6h， 并且然后在 50℃ -55℃过夜 ( 约 16h)。冷却后， 在真空下蒸发 DMF 并且在 EtOAc(100mL) 中研磨剩余物。通过过滤分离该聚合物， 并且然后用 2- 丙醇 (4x25mL) 洗涤 该聚合物以除去残留试剂， 并且在 35℃ -40℃， 在真空下干燥 3 天。分离该聚合物， 为一种 灰白色固体， 产量为 5.1g(88％ )。可以通过 NMR 确定 R848 加载为 10.1％。
     使用三氟乙酸除去 t-BOC 保护基， 并且通过常规方法， 将生成的聚合物接枝到具 有羧基端基的 PLA。
     实例 27 ： 制备聚甘氨酸 /R848 聚合物的一种 PLGA 结合物
     步骤 1 ： 在三氟乙酸 (25mL) 中溶解 t-BOC 保护的聚甘氨酸 /R848 结合物 (5g)， 并 且在 50℃加热这一溶液一小时。冷却后， 在真空下除去三氟乙酸， 并且在乙酸乙酯 (25mL) 中研磨剩余物。通过过滤分离该聚合物， 并且用 2- 丙醇很好地洗涤。在真空下干燥后， 获 得 4.5 克的聚合物， 为一种灰白色固体。
     步骤 2 ： 在 RT， 在氩气下搅拌在无水 DMF(100mL) 中的 PLGA(Lakeshores 聚合物， MW 约 5000， 7525DLG1A， 酸值 0.7mmol/g， 10g， 7.0mmol) 和 HBTU(5.3g， 14mmol) 混合物 50 分 钟。添加来自以上溶解在干 DMF(20mL) 中的聚合物 (1.4g， 7mmol)， 随后添加二异丙基乙胺 (DIPEA)(5mL， 28mmol)。在 RT 搅拌该混合物 6h， 并且然后在 50℃ -55℃过夜 ( 约 16h)。冷 却后， 在真空下蒸发 DMF， 并且在亚甲基氯 (50mL) 中溶解剩余物。 通过添加 2- 丙醇 (200mL) 沉淀该聚合物。通过倾析法分离该聚合物， 并且然后用 2- 丙醇 (4x50mL) 洗涤以除去残留 试剂， 并且然后在 35℃ -40℃， 在真空下干燥过夜。获得 9.8g(86％ ) 的嵌段共聚物。
     实例 28 ： 制备 PLGA-2- 丁氧基 -8- 羟基 -9- 苯甲基腺嘌呤结合物
     在 RT， 在氩气下搅拌在无水 EtOAc(30mL) 中的 PLGA(Lakeshores 聚合物， MW 约 5000， 7525DLG1A， 酸 值 0.7mmol/g， 1.0g， 7.0mmol) 和 HBTU(0.8g， 2.1mmol) 混 合 物 30 分 钟。添加在 2mL 干 DMSO 中的化合物 (I)(0.22g， 0.7mmol)， 随后添加二异丙基乙胺 (DIPEA) (0.73mL， 4.2mmol)。在室温下搅拌该混合物 20h。添加额外量的 HBTU(0.53g， 1.4mmol) 和 DIPEA(0.5mL， 2.8mmol)， 并且在 50℃ -55℃加热该混合物 4h。在冷却后， 用 EtOAc(100mL) 稀释该混合物， 并且用饱和 NH4Cl 溶液 (20mL)、 水 (2x20mL) 和盐水溶液 (20mL) 洗涤。在 Na2SO4(10g) 上干燥该溶液并且浓缩至凝胶状剩余物。 然后添加异丙醇 (IPA)(35mL) 并且从 溶液中沉淀出该褐色聚合物结合物。然后用 IPA(2x20mL) 洗涤该聚合物以除去残留试剂， 并且在 35℃ -40℃， 在真空下干燥 2 天， 为一种褐色粉末 (1.0g)。
     实例 29 ： 制备 PLGA-2， 9- 二苄基 -8- 羟基腺嘌呤结合物
     在 RT， 在氩气下搅拌在无水 EtOAc(30mL) 中的 PLGA(Lakeshores 聚合物， MW 约 5000， 7525DLG1A， 酸值 0.7mmol/g， 1.0g， 7.0mmol) 和 HBTU(0.8g， 2.1mmol) 混合物 30 分钟。 添加在 2mL 干 DMSO 中的化合物 (II)(0.24g， 0.7mmol)， 随后添加二异丙基乙胺 (DIPEA) (0.73mL， 4.2mmol)。在 RT 下搅拌该混合物 20h。添加额外量的 HBTU(0.53g， 1.4mmol) 和 DIPEA(0.5mL， 2.8mmol)， 并且在 50℃ -55℃加热该混合物 4h。在冷却后， 用 EtOAc(100mL) 稀释该混合物， 并且用饱和 NH4Cl 溶液 (20mL)、 水 (2x20mL) 和盐水溶液 (20mL) 洗涤。在 Na2SO4(10g) 上干燥该溶液并且浓缩至凝胶状剩余物。 然后添加异丙醇 (IPA)(35mL) 并且从 溶液中沉淀出该褐色聚合物结合物。然后用 IPA(2x20mL) 洗涤该聚合物以除去残留试剂， 并且在 35℃ -40℃， 在真空下干燥 2 天， 为一种褐色粉末 (1.2g)。
     实例 30 ： 使用酰亚胺开环作用来附连 2- 戊基 -8- 羟基 -9- 苄基腺嘌呤至分子量 2000 的聚 ( 碳酸六亚甲基酯 ) 二醇的末端醇基
     从 Aldrich Chemical Company 购买聚 ( 碳酸六亚甲基酯 ) 二醇， Cat#461164。
     聚 ( 碳酸六亚甲基酯 ) 二醇 ：
     HO-[CH2(CH2)4CH2OCO2]nCH2(CH2)4CH2-OH
     聚 ( 碳酸六亚甲基酯 ) 二醇 -8- 氧代腺嘌呤结合物 ：
     在 25mL 亚甲基氯中溶解该聚合物 (5g， 2.5x10-3 摩尔 )， 并且添加 2- 戊基 -8- 羟 -3 基 -9- 苄基腺嘌呤的内酰胺 (2.05g， 5.0x10 摩尔 )。搅拌这一浆料， 同时以单独的一份添 加 1， 5， 7- 三氮杂二环 -[4， 4， 0]-5- 癸烯 (TBD， 0.557g， 4x10-3 摩尔 )。在室温下搅拌过夜 后， 形成澄清淡黄色溶液。 用亚甲基氯 (100mL) 稀释该溶液， 并且用 5％柠檬酸洗涤该溶液。 在硫酸钠上干燥这一溶液， 在这以后， 过滤并在真空下蒸发。在高真空下干燥后， 获得 5.5 克 (78％ ) 的聚合物。使用 NMR 来确定苄基腺嘌呤含量为 18％。
     实例 31 ： 烟碱 -PEG-PLA 结合物
     按以下步骤合成 3- 烟碱 -PEG-PLA 聚合物 ：
     首先， 将来自 的具有 3.5KD 分子量的单氨基聚 ( 乙二醇 )(0.20gm，
     5.7X10-5 摩尔 ) 和过量的 4- 羧基可替宁 (0.126gm， 5.7X10-4 摩尔 ) 溶解于二甲基甲酰胺 (5.0mL) 中。搅拌该溶液并且添加二环己基碳二亚胺 (0.124gm， 6.0X10-4 摩尔 )。在室温下 搅拌这一溶液过夜。添加水 (0.10mL) 并且继续搅拌额外的 15 分钟。通过过滤除去二环己 基脲的沉淀， 并且在真空下蒸发滤液。在亚甲基氯 (4.0mL) 中溶解剩余物并且将这一溶液 添加到乙醚 (100mL) 中。 在冰箱中冷却该溶液 2 小时， 并且通过过滤分离沉淀的聚合物。 在 用乙醚洗涤以后， 在高真空下干燥该固体白色聚合物。产量为 0.188gm。不经进一步纯化， 将这一聚合物用于下一步。
     在氮气下将该可替宁 /PEG 聚合物 (0.20gm， 5.7X10-5 摩尔 ) 溶解于干四氢呋喃 (10mL) 中， 并且搅拌该溶液， 同时添加在四氢呋喃中的氢化铝锂溶液 (1.43mL 的 2.0M， -3 2.85X10 摩尔 )。添加氢化铝锂引起该聚合物沉淀为凝胶状块。在缓慢流的氮气下， 加热 该反应至 80℃， 并且允许四氢呋喃蒸发。然后在 80℃下加热剩余物 2 小时。冷却以后， 小 心添加水 (0.5mL)。 一旦氢释放已经停止， 添加在亚甲基氯中的 10％甲醇 (50mL)， 并且搅拌 该反应混合物直至该聚合物溶解。通过 牌硅藻土 ( 从 EMD Inc. 可得， 如 545， 区域 #CX0574-3) 过滤这一混合物， 并且将滤液在真空下蒸干。在亚甲基氯 (4.0mL) 中 溶解剩余物并且将这一溶液缓慢添加到乙醚 (100mL) 中。聚合物分离为白色絮凝固体， 并 且通过离心分离。在用乙醚洗涤以后， 在真空下干燥该固体。产量为 0.129gm。
     接下来， 将 PEG/ 烟碱聚合物 (0.081gm， 2.2X10-5 摩尔 )、 D/L 丙交酯 (0.410gm， -3 2.85X10 摩尔 ) 和无水硫酸钠 (0.380gm) 加料至一个装备有搅拌棒和回流冷凝器的 100mL 圆底烧瓶。在 55℃， 在真空下干燥这些反应物 8 小时。然后用氩气冷却并冲洗该烧瓶并且 然后添加干燥的甲苯 (10mL)。将该烧瓶置于设定在 120℃的油浴中， 并且一旦丙交酯已经 -5 溶解， 添加乙基己酸锡 (5.5mg， 1.36X10 摩尔 )。允许该反应在 120℃继续进行 16 小时。 在冷却至室温以后， 添加水 (15mL) 并且持续搅拌 30 分钟。添加亚甲基氯 (200mL)， 并且在 分液漏斗中搅动以后， 允许这些相沉降。分离亚甲基氯层， 并且在无水硫酸镁上干燥。在过 滤以除去干燥剂以后， 在真空下蒸发滤液以给出作为一种无色泡沫的聚合物。在四氢呋喃 (10mL) 中溶解该聚合物， 并且在搅拌下将这一溶液缓慢添加到水 (150mL) 中。通过离心分 离沉淀的聚合物， 并且在亚甲基氯 (10mL) 中溶解该固体。在真空下除去亚甲基氯， 并且在 真空下干燥剩余物。3- 烟碱 -PEG-PLA 聚合物产量为 0.38gm。
     实例 32 ： 合成纳米载体配制品
     为了胶囊化佐剂配制品， 根据 Gerster 等人的美国专利 5,389,640 的实例 99 中提 供的合成， 合成瑞喹莫德 (aka R848)。
     通过以上提供的方法将 R848 结合至 PLA， 并且通过 NMR 证实 PLA 结构。
     根据实例 31 制备 PLA-PEG- 烟碱结合物。
     购买 PLA(Boehringer Ingelheim Chemicals， Inc.， 2820 North Normandy Drive， Petersburg， VA 23805)。从 VWR scientific 购买聚乙烯醇 (Mw ＝ 11KD-31KD， 85-89％水 解 )。 从 Bachem Americas Inc.(3132Kashiwa Street， Torrance CA 90505. 区域 #4064565) 获得卵清蛋白肽 323-339。
     以上材料用于制备以下溶液 ：
     1. 在亚甲基氯中瑞喹莫德 (R848)@10mg/mL 并且 PLA@100mg/mL， 或者在亚甲基氯 中 PLA-R848 结合物 @100mg/mL2. 在亚甲基氯中的 PLA-PEG- 烟碱 @100mg/mL
     3. 在亚甲基氯中的 PLA@100mg/mL
     4. 在水中的卵清蛋白肽 323-339@10 或 69mg/mL
     5. 在水中的聚乙烯醇 @50mg/mL。
     在 小 管 形 瓶 中 结 合 溶 #1(0.25 至 0.75mL)、 溶 液 #2(0.25mL)、 溶 液 #3(0.25 至 0.5mL) 和溶液 #4(0.1mL)， 并且使用一台 Branson 数字超声波仪 250 在 50％振幅声处理该 混合物 40 秒。向这一乳液添加溶液 #5(2.0mL)， 并且使用一台 Branson 数字超声波仪 250 在 35％振幅声处理 40 秒， 形成第二乳液。 添加这一乳液至一个含有磷酸盐缓冲溶液 (30mL) 的烧杯， 并且在室温下搅拌这一混合物 2 小时以形成纳米载体。
     为了洗涤这些颗粒， 将一部分纳米载体分散体 (7.4mL) 转移至一个离心管中， 并 且在 5,300g 旋转一小时， 除去上清液， 并且在 7.4mL 的磷酸盐缓冲盐水中重新悬浮小粒。 重 复该离心步骤， 并且在 2.2mL 的磷酸盐缓冲盐水中重新悬浮小粒， 用于约 10mg/mL 的最终纳 米颗粒分散体。
     实例 33 ： 具有多种初级乳液的复乳液
     材料
     从 Bachem Americas Inc.(3132 Kashiwa Street， Torrance CA 90505) 购买的卵 清蛋白肽 323-339， 已知是卵清蛋白蛋白质的 T 细胞表位的一种 17 氨基酸肽。
     根据美国专利 6,608,201 提供的方法合成瑞喹莫德 (aka R848)。
     根据以上提供的方法， 将 PLA-R848 瑞喹莫德结合至具有约 2,500Da 的分子量的 PLA。
     根据以上提供的方法， 将 PLGA-R848 瑞喹莫德结合至具有约 4,100Da 的分子量的 PLGA。
     从 Oligos Etc(9775SW Commerce Circle C-6， Wilsonville， or 97070) 购 买 具有全硫代磷酸化的主链的、 具有钠平衡离子的 PS-1826DNA 寡核苷酸， 具有核苷酸序列 5′ -TCC ATG ACG TTC CTG ACG TT-3′。
     从 Oligos Etc(9775SW Commerce Circle C-6， Wilsonville， or 97070) 购买具有 磷酸二酯主链的、 具有钠平衡离子的 PO-1826DNA 寡核苷酸， 具有核苷酸序列 5′ -TCC ATG ACG TTC CTG ACG TT-3′。
     从 SurModics Pharmaceuticals(756 Tom Martin Drive， Birmingham， AL 35211. 产品编号 100DL 2A) 购买的具有 0.21dL/g 的固有粘度的 PLA。
     从 SurModics Pharmaceuticals(756Tom Martin Drive， Birmingham， AL 35211. 产品编号 100DL 7A) 购买的具有 0.71dL/g 的固有粘度的 PLA。
     从 Boehringer Ingelheim Chemicals， Inc.(Petersburg， VA. 产品编号 R202H) 购 买的具有 0.19dL/g 的固有粘度的 PLA。
     根据以上提供的方法制备具有约 18,500 至 22,000Da 的分子量的 PLA-PEG- 烟碱。
     根据以上提供的方法制备 ( 合成 ) 具有约 15,000Da 的分子量的 PLA-PEG-R848。
     从 J.T.Baker( 产 品 型 号 U232-08) 购 买 的 聚 乙 烯 醇 (Mw ＝ 11,000-31,000， 87-89％水解 )。
     使用具有多种初级乳液的复乳液方法生产各批次。下表引用溶液溶液后缀 ( 例如在溶液 #1 栏中 B 表明使用溶液 #1B) 和使用的溶液体积。
     溶液 1A ： 在稀释盐酸水溶液中的卵清蛋白肽 323-339@35mg/mL。在室温， 通过在 0.13N 盐酸溶液中溶解卵清蛋白肽制备该溶液。
     溶液 1B ： 在稀释盐酸水溶液中的卵清蛋白肽 323-339@70mg/mL。在室温， 通过在 0.13N 盐酸溶液中溶解卵清蛋白肽制备该溶液。
     溶液 2A ： 在亚甲基氯中的 0.21-IV PLA@75mg/mL 和 PLA-PEG- 烟碱 @25mg/ml。在 室温， 通过首先制备两种分开的溶液制备该溶液 ： 在纯亚甲基氯中 0.21-IV PLA@100mg/mL 和在纯亚甲基氯中 PLA-PEG- 烟碱 @100mg/mL。添加用于每一部分 PLA-PEG- 烟碱溶液的三 部分 PLA 溶液制备最终溶液。
     溶液 2B ： 在亚甲基氯中的 0.71-IV PLA@75mg/mL 和 PLA-PEG- 烟碱 @25mg/ml。在 室温， 通过首先制备两种分开的溶液制备该溶液 ： 在纯亚甲基氯中 0.71-IV PLA@100mg/mL 和在纯亚甲基氯中 PLA-PEG- 烟碱 @100mg/mL。添加用于每一部分 PLA-PEG- 烟碱溶液的三 部分 PLA 溶液制备最终溶液。
     溶液 2C ： 在亚甲基氯中的 0.19-IV PLA@75mg/mL 和 PLA-PEG- 烟碱 @25mg/ml。在 室温， 通过首先制备两种分开的溶液制备该溶液 ： 在纯亚甲基氯中 0.19-IV PLA@100mg/mL 和在纯亚甲基氯中 PLA-PEG- 烟碱 @100mg/mL。添加用于每一部分 PLA-PEG- 烟碱溶液的三 部分 PLA 溶液制备最终溶液。
     溶液 3A ： 在净化水中的寡核苷酸 (PS-1826 亦或 PO-1826)@200mg/ml。在室温下， 通过在净化水中溶解寡核苷酸制备该溶液。
     溶液 4A ： 与溶液 #2A 相同。
     溶液 4B ： 与溶液 #2B 相同。
     溶液 4C ： 与溶液 #2C 相同。
     溶液 5A ： 在 100mM pH8 磷酸盐缓冲液中聚乙烯醇 @50mg/mL。
     制备两种分开的初级油包水乳液。通过在小压力管中合并溶液 1 和溶液 2 制备 W1/O2， 并且使用一台 Branson 数字超声波仪 250 在 50％振幅超声处理 40 秒。通过在小压 力管中合并溶液 3 和溶液 4 制备 W3/O4， 并且使用一台 Branson 数字超声波仪 250 在 50％振 幅超声处理 40 秒。通过合并 0.5ml 的每一种初级乳液 (W1/O2 和 W3/O4) 和溶液 5 制备具 有两种内乳液 ([W1/O2， W3/O4]/W5) 乳液的第三乳液， 并且使用 Branson 数字超声波仪 250 在 30％振幅超声处理 40 秒至 60 秒。
     将该第三乳液添加至一个含有 70mM 磷酸盐缓冲溶液 (30mL) 的烧杯， 并且在室温 搅拌 2 小时， 来允许亚甲基氯蒸发并且允许形成纳米载体。通过转移纳米载体悬浮液至离 心管并且在 13,823g 旋转一小时来洗涤一部分纳米载体， 除去上清液， 并且在磷酸盐缓冲 盐水中重新悬浮小粒。重复该洗涤步骤， 并且在磷酸盐缓冲盐水中重新悬浮小粒， 用于约 10mg/mL 的最终纳米载体分散体。
     通过 HPLC 分析确定该纳米载体中寡核苷酸和肽的量。
     实例 34 ： 标准复乳液
     材料
     如在以上实例 33 中提供的那样。
     使用标准复乳液方法生产各批次。下表引用溶液溶液后缀 ( 例如在溶液 #1 栏中 B 表明使用溶液 #1B) 和使用的溶液体积。
     溶液 1A ： 在去离子水中的卵清蛋白肽 323-339@69mg/mL。通过缓慢添加卵清蛋白 肽至水中同时在室温混合制备该溶液。
     溶液 1B ： 在稀释盐酸水溶液中的卵清蛋白肽 323-339@70mg/mL。在室温， 通过在 0.13N 盐酸溶液中溶解卵清蛋白肽制备该溶液。
     溶液 1C ： 在净化水中的寡核苷酸 (PS-1826)@50mg/ml。 在室温下， 通过在净化水中 溶解寡核苷酸制备该溶液。
     溶液 1D ： 在稀释盐酸水溶液中的卵清蛋白肽 323-339@17.5mg/mL。通过在室温在 0.13N 盐酸溶液中溶解卵清蛋白肽 @70mg/ml， 并且然后用 3 份净化水每一份起始溶液稀释 该溶液制备溶液。
     溶液 2A ： 在室温制备的在纯亚甲基氯中的 R848@10mg/ml 和 0.19-IV PLA@100mg/ mL。
     溶液 2B ： 在室温制备的在纯亚甲基氯中的 PLA-R848@100mg/ml。
     溶液 2C ： 在室温制备的在纯亚甲基氯中的 PLGA-R848@100mg/ml。
     溶液 2D ： 在室温制备的在纯亚甲基氯中的 PLA-PEG-R848@100mg/ml。
     溶液 3A ： 在室温制备的在纯亚甲基氯中的 PLA-PEG- 烟碱 @100mg/ml。
     溶液 4A ： 在室温制备的在纯亚甲基氯中的 0.19-IV PLA@100mg/mL。
     溶液 5A ： 在去离子水中的聚乙烯醇 @50mg/mL。
     溶液 5B ： 在 100mM pH8 磷酸盐缓冲液中聚乙烯醇 @50mg/mL。
     通过在小压力管中合并溶液 1 和溶液 2、 溶液 3、 和溶液 4 制备油包水 (W/O) 初级 乳液， 并且使用一台 Branson 数字超声波仪 250 在 50％振幅超声处理 40 秒。通过添加溶液 5 至该初级乳液制备水 / 油 / 水 (W/O/W) 复乳液， 并且使用 Branson 数字超声波仪 250 在 30％至 35％振幅超声处理 40 秒。
     将该复乳液添加至一个含有磷酸盐缓冲溶液 (30mL) 的烧杯， 并且在室温搅拌 2 小 时， 来允许亚甲基氯蒸发并且允许形成纳米载体。通过转移纳米载体悬浮液至离心管并且 在 5,000 至 9,500RPM 旋转一小时来洗涤一部分纳米载体， 除去上清液， 并且在磷酸盐缓冲 盐水中重新悬浮小粒。重复该洗涤步骤， 并且在磷酸盐缓冲盐水中重新悬浮小粒， 用于约 10mg/mL 的最终纳米载体分散体。
     实例 35 ： 确定媒介物的量
     用于 R848 和肽 ( 例如卵清蛋白肽、 人类肽、 TT2pDT5t) 的方法
     在装备有 Agilent Zorbax SB-C18 柱 (3.5m。75x4.6mm。柱温＝ 40 ℃ ( 零件号 866953-902)) 的 Agilent 1100 系统上， 在适当波长 (λ ＝ 254nm 用于 R848 以及 215nm 用 于卵清蛋白肽 ) 使用反相高效液相色谱法测量 R848( 免疫刺激剂 ) 和卵清蛋白肽 (T 细胞抗 原 ) 的量， 使用 95％水 /5％乙腈 /0.1％ TFA 的流动相 A(MPA) 和 90％乙腈 /10％水 /0.09％ TFA 的流动相 B(MPB)( 梯度 ： 在 7 分钟内 B ＝ 5％至 45％ ； 至 9 分钟渐变至 95％ B ； 至 9.5 分钟退回 5％ B， 并且保持平衡至结束。总运行时间为 13 分钟， 流速为 1mL/min)。
     用于 CpG 的方法
     在装备有 Waters XBridge C-18(2.5 微米颗粒， 50x4.6mm ID( 零件号 186003090)， 柱温 600℃ ) 的 Agilent 1100 系统上， 在 260nm 使用反相高效液相色谱法测量 CpG( 免疫 刺激剂 ) 的量， 使用在 100mM TEA- 乙酸缓冲液中的 2％乙腈的、 pH 约 8.0 的流动相 A， 和如 90％乙腈、 10％水的流动相 B( 在 5％ B 平衡柱， 在 8.5 分钟内增加至 55％ B， 然后至 12 分钟 渐变至 90％ B。在一分钟内 B 的浓度迅速减少至 5％并且平衡直至停止时间， 16 分钟。流 速为 1mL/min 直至本方法结束， 16 分钟 )。
     用于烟碱类似物的方法
     在装备有 Waters X-Bridge C-18(5 微米颗粒， 100x4.6mm ID， 柱温在 400℃ ) 的 Agilent 1100 系统上， 在 254nm 使用反相高效液相色谱法测量烟碱类似物， 使用 95 ％水 /5％乙腈 /0.1％ TFA 的流动相 A(MPA) 和 90％乙腈 /10％水 /0.09％ TFA 的流动相 B(MPB) ( 梯度 ： 在 5％ B 平衡柱， 在 14 分钟内增加至 45％ B。然后从 14 至 20 分钟渐变至 95％ B。 流动相 B 浓度迅速退回 5％并且重新平衡直至本方法结束。本方法的流速保持在 0.5ml/ min， 总运行时间 25 分钟 )。取决于颗粒大小， 离心该 NC 悬浮液 @14000rpm 约 15-30 分钟。 在搅拌下， 用 200uL 浓 NH4OH(8M) 处理收集的小粒 2h， 直至溶液转为澄清。添加 200uL 的 1％ TFA 来中和该混合物溶液， 这使该小粒溶液的体积达到 200uL。用 MPA( 或水 ) 稀释等分 部分的 50uL 的溶液至 200uL， 并且如以上在 HPLC 上分析以确定存在于小粒中的量。在纳米载体中的胶囊化的游离 R848
     离心 0.5mL 的 NC 悬浮液 @14000rpm 约 15 分钟。用 0.3mL 的乙腈溶解收集的小粒 并且简单离心 @14000rpm 以除去任何残留的不溶物。用 4 倍当量体积的 MPA 进一步稀释该 澄清溶液并在以上说明的反相高效液相色谱法上测定。
     在纳米载体中胶囊化的 CpG
     取决于颗粒大小， 来自该制造的 330uL 的 NC 悬浮液 ( 在 PBS 中约 10mg/mL 悬浮液 ) 在 14000rpm 旋转减慢 15 至 30 分钟。用 500uL 的水重新悬浮收集的小粒并且超声处理 30 分钟以完全分散这些颗粒。然后在 600℃下加热 NC10 分钟。添加额外的 200uL 的 1N NaOH 至该混合物， 再加热 5 分钟， 其中混合物变得澄清。在 14000rpm 简单离心水解的 NC 溶液。 然后制造用水最终 2x 稀释的澄清溶液， 并且在以上说明的反相高效液相色谱法上测定。
     胶囊化的 T 细胞抗原 ( 例如卵清蛋白肽、 或人类肽， TT2pDT5t)
     来自该制造的 330uL 的 NC 悬浮液 ( 在 PBS 中约 10mg/mL 悬浮液 ) 在 14000rpm 旋 转减慢 15 至 30 分钟。添加 100uL 的乙腈至这些小粒以溶解 NC 的聚合组分。振荡并超声 处理该混合物 1 至 5 分钟。添加 100uL 0.2％ TFA 至该混合物来提取这些肽， 并且再超声处 理 5 分钟以确保分解这些聚集体。在 14000rpm 离心该混合物 15 分钟来分离任何不溶解的 材料 ( 例如聚合物 )。取出 50uL 等分部分的用 150uL 的 MPA( 或水 ) 稀释的上清液， 并且在 以上说明的反相高效液相色谱法上测定。
     在纳米载体中结合的烟碱类似物 (B 细胞抗原 ) 的量
     旋转减慢 1.5mL 的 NC 悬浮液 @14000rpm 约 15 分钟， 使用 150uL 的浓 NH4OH(8M) 水解这些小粒约 2-3h 直至溶液转为澄清。添加 150uL 的 2％ TFA( 水性 ) 溶液至该小粒混 合物来中和该溶液。用 200uL 的水稀释 100uL 等分部分的该混合物， 并且在以上说明的反 相高效液相色谱法上测定， 并且基于使用在该制造中使用的 PLA-PEG- 烟碱的前体 (PEG- 烟 碱 ) 建立的标准曲线定量。
     实例 36 ： 释放速率测试
     在 37 ℃， 如下进行 T 细胞抗原、 卵清蛋白肽和佐剂、 R848 从在 PBS(100mM， pH ＝ 7.4) 和柠檬酸盐缓冲液 (100mM， pH ＝ 4.5) 中的合成纳米载体 ( 纳米颗粒 ) 的释放 ：
     分析方法 ： 在装备有一个 Agilent Zorbax SB-C18 柱 (3.5μm。75x4.6mm。柱温 ＝ 40℃ ( 零件号 866953-902)) 的 Agilent 1100 系统上， 在 λ ＝ 215nm， 使用反相高效液 相色谱法测量释放的 R848 和卵清蛋白肽的量， 使用 98％水 /2％乙腈 /0.1％ TFA 的流动相 A(MPA) 和 90％乙腈 /10％水 /0.09％ TFA 的流动相 B(MPB)， 具有梯度 ： 在 7 分钟内 B ＝ 5％ 至 45％ ； 至 9 分钟渐变至 95％ B ； 至结束重新平衡。运行时间 13 分钟。流＝ 1mL/min。
     如在表 1 中示出的那样， 在纳米颗粒中存在的 R848 和卵清蛋白肽的总量。然后用 PBS 稀释测试合成纳米载体的水悬浮液至 4.4mL 的最终蓄积量。
     (A) 在 PBS(pH ＝ 7.4) 中的体外释放速率测量 ：
     对于 T0 样品， 立即从每一 NP 样品除去 200μL 等分部分， 并且使用一台微量离心 机 ( 模型 ： Galaxy 16)， 在微量离心管中离心 @14000rpm。 除去 100μL 的上清液并且在 HPLC 流动相 A(MPA) 中稀释至 200μL， 并且在反相高效液相色谱法上测定 R848 和卵清蛋白肽释 放的量。
     对于时间点测量 ： 将 9x200μL 的每一样品添加至微量离心管 ( 对于非结合的3x200)， 并且将 300μL 的 37 ℃ PBS 添加至每一以上等分部分， 并且立即将这些样品置于 37 ℃烘箱中。在以下时间点 ： 24hr、 48hr、 96hr 和 144hr( 对于结合的 R848) 或 2h、 16h 和 24h( 对于非结合的 ( 胶囊化的 )R848)， 离心这些样品， 并且如以上对于 T0 样品那样测定释 放的 R848 和卵清蛋白肽的量。
     (B) 在柠檬酸盐缓冲液 (pH ＝ 4.5) 中的体外释放速率测量 ：
     对于 T0 样品， 从每一样品除去 200μL 等分部分， 并且离心 @6000rpm 20 分钟， 并 且除去上清液。 在 200uL 的柠檬酸盐缓冲液中重新悬浮剩余纳米颗粒， 并且离心 @14000rpm 15 分钟。除去 100uL 的上清液并且用 MPA 稀释至 200uL， 并且如以上那样测定 R848 和肽。
     对于时间点测量 ： 将 9x200uL 的每一样品添加至微量离心管 ( 对于非结合的 3x200)， 并且离心 20 分钟 @6000rpm， 并且除去上清液。然后在 500uL 的柠檬酸盐缓冲液重 新悬浮剩余 NPs， 并且置于 37℃烘箱中。在以下时间点 ： 24hr、 48hr、 96hr 和 144hr( 对于结 合的 R848) 或 2h、 16h 和 24h( 对于非结合的 ( 胶囊化的 )R848)， 离心这些样品， 并且如以上 对于 T0 样品那样测定释放的 R848 和卵清蛋白肽的量。
     为了完成来自以上在 PBS 和柠檬酸盐缓冲液中的测量的质量平衡， 不断混合并用 200uL 的浓 NH4OH(8M) 处理来自每一样品的剩余小粒 ( 只有结合的 R848 样品 )3h。在该混 合物沉降以后， 添加 200uL 的 1％ TFA 来使该小粒的总体积达到 400uL。用 MPA 稀释等分部 分的 50uL 的溶液至 200uL， 并且如以上那样在 HPLC 上分析以确定在体外释放至接近质量平 衡后， 剩余在该小粒中的 R848 和卵清蛋白肽的量。对于非结合的样品， 用在乙腈中的 TFA 稀释该样品， 并且如以上那样测定 R848 和肽。
     在图 1-3 中总结了这些结果。
     材料和方法
     HPLC-Agilent 1100。λ ＝ 215nm。柱温＝ 40℃
     柱 -Agilent Zorbax SB-C18， 3.5μm。75x4.6mm。( 零件号 866953-902)
     C18 保护柱
     流动相 A(MPA) -98％水 /2％乙腈 /0.1％ TFA
     流动相 B(MPB) -90％乙腈 /10％水 /0.09％ TFA
     梯度 ： 在 7 分钟内 B ＝ 5％至 45％； 至 9 分钟渐变至 95％； 至结束重新平衡。运行 时间 13 分钟。流速＝ 1mL/min。
     PBS-100mM， pH ＝ 7.4。
     柠檬酸盐缓冲液 100mM， pH ＝ 4.5。
     烘箱
     微量离心机 -Galaxy 16
     微量离心管
     超声波仪
     移液管 -20μL， 200μL， 1000μL 可调整的
     HPLC 级水 -EMD-#WX0008-1。
     NH4OH- 约 8M。Mallinkcrodt。
     TFA， 0.2％。Prep 4/27/09。
     TFA， 1％。Prep 5/13/09。温度计
     SAMPLES-“6-1” 和 “6-2” 具有封存的 R848。所有剩余的都具有结合的 R848。估 算值基于生成自 “62” 系列的加载。
     表 2. 估算的在合成纳米载体中的 R848 和卵清蛋白肽 ：
     样品体积略低于计划值。为了确保对于所有时间点可得的足够材料， 添加以下体 积的 PBS 至样品来使它们都达到 4.4mL。
     表 3.
     步骤 1)T ＝ 0 样品制备 a.PBSi. 从每一样品除去 200μL 等分部分。微量离心 @14000rpm。除去上清液。 ii. 在 MPA 中稀释上清液 100μL ＞ 200μL。(DF ＝ 2)。 iii. 测定肽和 R848。 b. 柠檬酸盐 i. 从每一样品除去 200μL 等分部分。微量离心 @6000rpm 20 分钟。除去上清液。 ii. 添加 200uL 的柠檬酸盐缓冲液并且充分重新悬浮。 iii. 微量离心 @14000rpm 15 分钟。除去上清液。 iv. 在 MPA 中稀释上清液 100μL ＞ 200μL。(DF ＝ 2)。 v. 测定肽和 R848。 2)PBS IVR a. 添加 9x200μL 的每一样品至微量离心管。( 对于非结合的 3x200) b. 对每一等分部分添加 300μL 的 37℃ PBS。 c. 立即将样品置于 37℃烘箱。 3) 柠檬酸盐 IVR a. 添加 9x200μL 的每一样品至微量离心管。( 对于非结合的 3x200) b. 离心 20 分钟 @6000rpm。 c. 除去上清液。 d. 添加 500μL 的柠檬酸盐缓冲液至每一管， 并且充分重新悬浮。 e. 将样品置于 37℃烘箱。 4) 对于批次 1-4 和 8， 在以下时间点移开样品 ( 参见步骤 6) ： a. 结合的 i.24hr ii.48hr(2 天 ) iii.96hr(4 天 ) iv 144hr(6 天 ) v. 基于以上数据的其他时间点 TBD。 b. 非结合的 i.2hr ii.16hr iii.24hr 5) 对于批次 6 和 7， 在以下时间点移开样品 ： a.PBS i.24hr ii.48hr(2 天 ) iii.96hr(4 天 ) iv.144hr(6 天 ) v. 基于以上数据的其他时间点 TBD。 b. 柠檬酸盐 i.2hrii.16hr
     iii.24hr
     iv.48hr(2 天 )
     v.72hr(3 天 )
     vi.96hr(4 天 )
     vii.120hr(5 天 )
     viii. 基于以上数据的其他时间点 TBD。
     6) 取样如下 ：
     a. 微量离心 @14000rpm 15 分钟。
     b. 除去上清液。
     c. 在 MPA 中稀释上清液 100μL 至 200μL。(DF ＝ 2)。
     7) 测定肽和 R848。这将提供在每一时间点释放的量。
     为了完成质量平衡， 进行以下步骤 ：
     8) 添加 200uL NH4OH 至剩余小粒 ( 只有结合的 )。
     9) 简单振荡并超声处理至分散。
     10) 添加搅拌棒。允许静置直至澄清 ( 至少 3 小时 )。
     11) 添加 200uL 的 1％ TFA( 总小粒体积＝ 400μL)。
     12) 在 MPA 中稀释 50μL 至 200μL。用 HPLC 分析来确定在小粒中剩余的肽和 R848。(DF ＝ 4)。
     13) 对于结合的批次， 用典型的 AcN/TFA 法测定肽和 R848。
     实例 37 ： 释放速率测试
     按以下方法确定在 37℃， 在磷酸盐缓冲盐水溶液 (PBS)(100mM， pH ＝ 7.4) 和柠檬 酸盐缓冲液 (100mM， pH ＝ 4.5) 中， 抗原 ( 例如卵清蛋白肽、 T 细胞抗原 ) 和免疫刺激剂 ( 例 如 R848、 CpG) 从合成纳米载体的释放 ：
     通过经离心和重新悬浮， 交换希望的量的从该制造获得的测试合成纳米载体的水 悬浮液 ( 例如在 PBS 中约 10mg/mL) 至相同体积的适当释放介质 ( 柠檬酸盐缓冲液 100mM)， 达到 R848 从由结合的 R848 和卵清蛋白肽构成的纳米载体释放。
     在 PBS(pH ＝ 7.4) 中的体外释放速率测量
     取决于颗粒大小， 一般离心在微量离心管中的 1mL 的 PBS 悬浮液 NC@14000rpm 从 15-30 分钟。然后用等体积的流动相 A(MPA) 或水稀释收集的上清液， 并且在反相高效液相 色谱法上测定在储存期间释放的 R848 的量。在 1mL 的 PBS 中重新悬浮剩余小粒至均匀的 悬浮液， 并且在不断轻轻搅拌下置于 37℃温箱。
     对于 T0 样品， 在将 NC 悬浮液置于 37℃温箱以前， 立即从 NC 悬浮液移出 150μL 等 分部分， 并且在微量离心管中， 使用微量离心机 ( 模型 ： Galaxy 16) 离心 @14000rpm。除去 100μL 的上清液并且在 HPLC 流动相 A(MPA) 或水中稀释至 200μL， 并且在反相高效液相色 谱法上测定释放的 R848 和卵清蛋白肽的量。
     对于时间点测量， 从 37℃ NC 样品悬浮液移出 150μL 等分部分， 离心这些样品， 并 且以与 T0 样品相同的方式测定释放的 R848 和卵清蛋白的量。在 6h、 24h 测试释放的 R848 和卵清蛋白肽用于日常监测， 与额外的 2h、 48h、 96h 和 144h 用于完整的释放曲线建立。在柠檬酸盐缓冲液 (pH ＝ 4.5) 中的体外释放速率测量
     施用 100mM 柠檬酸钠缓冲液 (pH ＝ 4.5) 来交换原始 NC 储存溶液 ( 例如 PBS) 代 替 PBS 缓冲液， pH ＝ 7.4。为了完成来自以上在 PBS 和柠檬酸盐缓冲液中的测量的质量平 衡， 用 100uL 的 NH4OH(8M) 处理来自每一时间点的剩余小粒 2h( 或更长 )， 同时搅拌直至溶 液转为澄清。添加 100uL 的 1％ TFA 来中和该混合物， 这使该小粒溶液的体积达到 200uL。 用 MPA( 或水 ) 稀释等分部分的 50uL 的混合物至 200uL， 并且如以上那样在 HPLC 上分析以 确定在体外释放至接近质量平衡后， 剩余在该小粒中的未释放的 R848 的量。对于非结合的 样品， 用在乙腈中的 TFA 稀释该样品， 并且如以上那样测定 R848。
     确定 CpG 的释放类似于按照制备和检测时间点的 R848 和卵清蛋白肽的测量。然 而， 通过以上说明的反相高效液相色谱方法测定在释放介质中的 CpG 的量。
     实例 38 ： 用携带 CpG 佐剂的 NC-Nic 免疫
     按 2 周间隔 ( 第 0、 14 和 28 天 )， 用 100μg 的 NC-Nic 免疫具有五只小鼠的组三 次 ( 皮下地， 后肢 )。NC-Nic 是在外表面上表现出烟碱的纳米载体的一种组合物， 并且对于 除了组 1 的所有组小鼠， 携带 CpG-1826( 硫代的 ) 佐剂， 它以不同的速率从这些纳米载体释 放。根据以上提供的方法制备这些纳米载体。然后在第 26 和 40 天测量血清抗烟碱抗体。 在图 4 中示出， 如在针对聚赖氨酸 - 烟碱的标准 ELISA 中测量， 抗烟碱抗体的 EC50。
     将含有卵清蛋白肽和聚合物的 NC-Nic w/o CpG-1826 给予组 1 的小鼠， 它的 75％ 是 PLA 和 25％是 PLA-PEG-Nic。将含有卵清蛋白肽、 聚合物的 NC-Nic 给予组 2 的小鼠， 它 的 75％是 PLA 和 25％是 PLA-PEG-Nic， 以及 3.2％ CpG-1826 ； 在 24 小时的释放速率 ： 4.2μg CpG 每 mg 的 NC。将含有聚合物的 NC-Nic 给予组 3 的小鼠， 它的 75 ％是 PLA 和 25 ％是 PLA-PEG-Nic， 以及 3.1％ CpG-1826 ； 在 24 小时的释放速率 ： 15μg CpG 每 mg 的 NC。在 4.5 的 pH 确定释放。
     在图 4 中示出的结果证明对于针对 NC- 相关抗原的免疫应答， 封存佐剂至纳米载 体中是有益的， 并且， 此外， 证明与由具有更慢释放速率的 CpG 佐剂 ( 一种 TLR9 激动剂 ) 的 NC 诱导的免疫应答相比， 在 24 小时， 更高释放速率的来自纳米载体 (NC) 内的封存的 CpG 佐 剂产生升高的免疫应答。
     实例 39 ： 用携带两种形式的 CpG 佐剂的 NC-Nic 免疫
     按 4 周间隔 ( 第 0、 和 28 天 )， 用 100μg 的 NC-Nic 免疫具有五只小鼠的组两次 ( 皮下地， 后肢 )， 并且然后在第 12、 24 和 40 天测量血清抗烟碱抗体。NC-Nic 是在外表面上 表现出烟碱的纳米载体的一种组合物， 并且携带两种形式的 CpG-1826 佐剂之一。根据以上 提供的方法制备这些纳米载体。在图 5 中示出， 如在针对聚赖氨酸 - 烟碱的标准 ELISA 中 测量， 抗烟碱抗体的 EC50。
     将含有卵清蛋白肽、 聚合物的 NC-Nic 给予组 1 的小鼠， 它的 75 ％是 PLA 和 25 ％ 是 PLA-PEG-Nic， 以及 6.2％ CpG-1826( 硫代的 ) ； 在 24 小时的释放速率 ： 16.6μg CpG 每 mg 的 NC。将含有卵清蛋白肽、 聚合物的 NC-Nic 给予组 2 的小鼠， 它的 75％是 PLA 和 25％ 是 PLA-PEG-Nic， 以及 7.2％ CpG-1826( 硫代的 ) ； 在 24 小时的释放速率 ： 13.2μg CpG 每 mg 的 NC。将含有卵清蛋白肽、 聚合物的 NC-Nic 给予组 3 的小鼠， 它的 75％是 PLA 和 25％ 是 PLA-PEG-Nic， 以及 7.9％ CpG-1826( 磷酸二酯或 PO， 非硫代的 ) ； 在 24 小时的释放速率 ： 19.6μg CpG 每 mg 的 NC。将含有卵清蛋白肽、 聚合物的 NC-Nic 给予组 4 的小鼠， 它的 75％是 PLA 和 25％是 PLA-PEG-Nic， 以及 8.5％ CpG-1826(PO， 非硫代的 ) ； 在 24 小时的释放速 率： 9.3μg CpG 每 mg 的 NC。在 4.5 的 pH 确定释放。
     图 5 中示出的结果证明封存的佐剂 (CpG， TLR9) 从纳米载体的释放速率影响针对 NC- 结合抗原 ( 烟碱 ) 的抗体的产生， 同时在 24 小时表现出更高释放速率的纳米载体诱导 更强的体液免疫反应 ( 组 1 ＞组 2 和组 3 ＞组 4)。 不论使用的 CpG 形式， 这都是真实的 ( 更 稳定， 硫代的或者更不稳定， 非硫代的 )。
     实例 40 ： 用携带 R848 的 NC-Nic 免疫
     按 2 周间隔 ( 第 0、 14 和 28 天 )， 用 100μg 的 NC-Nic 免疫具有五只小鼠的组三次 ( 皮下地， 后肢 )， 并且然后在第 26、 40 和 54 天测量血清抗烟碱抗体。根据以上提供的方法 制备这些纳米载体。在图 6 中示出， 如在针对聚赖氨酸 - 烟碱的标准 ELISA 中测量， 抗烟碱 抗体的 EC50。
     将含有卵清蛋白肽和聚合物的 NC-Nic 给予组 1 的小鼠， 它的 75％是 PLA 和 25％ 是 PLA-PEG-Nic， 但是没有佐剂。将含有卵清蛋白肽、 聚合物的 NC-Nic 给予组 2 的小鼠， 它 的 75 ％是 PLA 和 25 ％是 PLA-PEG-Nic， 以及 1.0 ％ R848 ； 在 2 小时释放它的 92 ％， 并且在 6 小时释放多于 96 ％。将含有卵清蛋白肽、 聚合物的 NC-Nic 给予组 3 的小鼠， 它的 75 ％ 是 PLA-R848 和 25 ％是 PLA-PEG-Nic， 以及 1.3 ％ R848， 在 6 小时释放它的 29.4 ％， 并且 在 24 小时释放 67.8％。将含有卵清蛋白肽、 聚合物的 NC-Nic 给予组 4 的小鼠， 它的 75％ 是 PLA-R848 和 25％是 PLA-PEG-Nic， 以及 1.4％ R848， 在 6 小时释放它的 20.4％， 并且在 24 小时释放 41.5％。将含有卵清蛋白肽、 聚合物的 NC-Nic 给予组 5 的小鼠， 它的 25％是 PLA-PEG-R848， 50％ PLA， 和 25％是 PLA-PEG-Nic， 以及 0.7％ R848 ； 在 24 小时释放小于它 的 1％。在 4.5 的 pH 确定释放。
     在图 6 中示出的结果证明包含在 NC 中的 R848 佐剂 ( 一种 TLR 7/8 激动剂 ) 增强 针对 NC- 相关抗原的体液免疫反应 ( 组 2-5 ＞＞组 1)。此外， R848 的快释放 ( 组 2) 亦或 慢释放 ( 组 5) 没有提高免疫应答至与以中间速率的 NC 释放 R848 相同的水平 ( 组 3 ≈组 4 ＞组 2 ≈组 5)。
     实例 41 ： 用携带封存的 PO CpG 的 NC-Nic 免疫
     按 2 周间隔 ( 第 0、 14 和 28 天 )， 用 100μg 的 NC-Nic( 表现出在外表面上的烟碱 的纳米载体 ) 免疫具有五只小鼠的组三次 ( 皮下地， 后肢 )， 该 NC-Nic 具有封存的 PO-CpG 或不含有与游离 PO-CpG 混合的封存的 PO-CpG。根据以上提供的方法制备这些合成纳米载 体。然后在第 26 和 40 天在全部两个组中测量血清抗烟碱抗体。在图 7 中示出， 如在针对 聚赖氨酸 - 烟碱的标准 ELISA 中确定抗烟碱抗体的 EC50。
     用具有 1826PO-CpG 和来自胶囊化的卵白蛋白 (Ov-II) 的 MHC-II 辅助细胞肽的 NC-Nic(6.6％ PO-CpG ； 2.3％ Ov-II) 免疫组 1 的小鼠。 用 NC-Nic 免疫组 2 的小鼠， 该 NC-Nic 具有 0.7％的与 20μg 的游离 1826PO-CpG 混合的封存的 Ov-II。
     该实验证明在纳米载体 (NC) 内封存的 PO-CpG 产生体液免疫反应， 它优于在约 3 倍更高剂量的游离 PO-CpG 与 NC 混合而没有封存 PO-CpG 时诱导的免疫反应 ( 组 1 中的抗 体效价＞组 2 中的抗体效价 )。

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1、10申请公布号CN102481374A43申请公布日20120530CN102481374ACN102481374A21申请号201080028109622申请日2010052661/217,12420090527US61/217,11720090527US61/217,11620090527US61/217,12920090527USA61K47/48200601A61K39/385200601A61K39/39200601A61P37/04200601A61K9/1620060171申请人西莱克塔生物科技公司地址美国马萨诸塞州72发明人查尔斯泽普高云马克J基根萨姆鲍德温付芬妮洛伊德约翰斯顿。

2、格雷森B利甫福德74专利代理机构北京集佳知识产权代理有限公司11227代理人顾晋伟彭鲲鹏54发明名称具有免疫调节剂的PH敏感释放的靶向合成纳米载体57摘要本发明涉及靶向细胞中作用位点的合成纳米载体的组合物、以及相关方法，这些细胞例如抗原递呈细胞APC，并且包括以一种PH敏感方式从合成纳米载体离解的免疫调节剂。还披露了多种组合物和方法，这些组合物和方法涉及胶囊化不稳定的免疫调节剂的合成纳米载体，这些免疫调节剂以一种PH敏感的方式从这些合成纳米载体解离。30优先权数据85PCT申请进入国家阶段日2011122386PCT申请的申请数据PCT/US2010/0015602010052687PCT申请。

3、的公布数据WO2010/138193EN2010120251INTCL权利要求书4页说明书55页附图4页19中华人民共和国国家知识产权局12发明专利申请权利要求书4页说明书55页附图4页1/4页21一种组合物，包括合成纳米载体，包括一种偶合到该合成纳米载体上的免疫调节剂；其中该免疫调节剂根据以下关系从该合成纳米载体解离IAREL4524/IAREL742412；其中IAREL4524被定义为在PH45，将该合成纳米载体暴露于体外水环境24小时，释放的免疫调节剂的重量除以在PH45，将该合成纳米载体暴露于体外水环境24小时，释放的免疫调节剂的重量加上在PH45，将该合成纳米载体暴露于体外水环境2。

4、4小时，保留在该合成纳米载体中的免疫调节剂的重量之和，表示为重量百分数，并且被取作跨合成纳米载体样品的平均数；并且其中IAREL7424被定义为在PH74，将该合成纳米载体暴露于体外水环境24小时，释放的免疫调节剂的重量除以在PH74，将该合成纳米载体暴露于体外水环境24小时，释放的免疫调节剂的重量加上在PH74，将该合成纳米载体暴露于体外水环境24小时，保留在该合成纳米载体中的免疫调节剂的重量之和，表示为重量百分数，并且被取作跨合成纳米载体样品的平均数。2如权利要求1所述的组合物，其中该免疫调节剂经由一个免疫调节剂偶合部分偶合到该合成纳米载体上。3如权利要求1所述的组合物，其中该免疫调节剂被。

5、胶囊化在该合成纳米载体内。4如权利要求3所述的组合物，其中该免疫调节剂包括一种不稳定的免疫调节剂。5如权利要求4所述的组合物，其中该不稳定的免疫调节剂包括一种咪唑并喹啉、一种腺嘌呤衍生物、或包括5CG3的一种寡核苷酸，其中C未甲基化并且其中该寡核苷酸包括一个主链，该主链包括一个或多个不稳定的核苷酸间连键。6如权利要求5所述的组合物，其中该咪唑并喹啉包括一种咪唑并喹啉胺、一种咪唑并吡啶胺、一种6，7稠合的环烷基咪唑并吡啶胺、一种咪唑并喹啉胺、咪喹莫特、或瑞喹莫德。7如权利要求5所述的组合物，其中该寡核苷酸的主链不包括稳定化的化学修饰，这些修饰的功能是在生理条件下稳定化该主链。8如权利要求7所述的。

6、组合物，其中该寡核苷酸的主链包括一个未被修饰以结合稳定化学修饰的硫代磷酸酯的主链。9如权利要求13中任意一项所述的组合物，其中该免疫调节剂是一种佐剂。10如权利要求9所述的组合物，其中该佐剂包括一种TOLL样受体TLR激动剂。11如权利要求10所述的组合物，其中该TLR激动剂是一种TLR3激动剂、TLR7激动剂、TLR8激动剂、TLR7/8激动剂或一种TLR9激动剂。12如权利要求10或11所述的组合物，其中该TLR激动剂是一种免疫刺激核酸。13如权利要求12所述的组合物，其中该免疫刺激核酸是一种免疫刺激DNA或免疫刺激RNA。14如权利要求12或13所述的组合物，其中该免疫刺激核酸是一种含有。

7、CPG的免疫刺激核酸，它包括一种或多种稳定化学修饰，这些修饰的功能是在生理条件下稳定化该主链。15如权利要求9所述的组合物，其中该佐剂包括一种通用T细胞抗原。16如权利要求115中任意一项所述的组合物，其中这些合成纳米载体进一步包括一权利要求书CN102481374A2/4页3种B细胞抗原和/或一种T细胞抗原。17如权利要求116中任意一项所述的组合物，其中这些合成纳米载体进一步包括一种抗原递呈细胞APC靶向特征。18如权利要求117中任意一项所述的组合物，其中这些合成纳米载体包括一种或多种可生物降解的聚合物。19如权利要求18所述的组合物，其中该免疫调节剂经由该免疫调节剂偶合部分偶合到这一种。

8、或多种可生物降解的聚合物上。20如权利要求18或19所述的组合物，其中该可生物降解的聚合物包括聚丙交酯、聚乙交酯、或聚丙交酯乙交酯共聚物。21如权利要求1820中任意一项所述的组合物，其中如使用凝胶渗透色谱法确定的那样，这些可生物降解的聚合物具有范围从800道尔顿至10,000道尔顿的重均分子量。22如权利要求2和921中任意一项所述的组合物，其中该免疫调节剂偶合部分包括一个酰胺键。23如权利要求2和921中任意一项所述的组合物，其中该免疫调节剂偶合部分包括一个酯键。24如权利要求123中任意一项所述的组合物，其中这些合成纳米载体包括脂基纳米颗粒，聚合物纳米颗粒，金属纳米颗粒，表面活性剂基乳液。

9、，树枝状化合物，巴奇球，纳米线，病毒状颗粒，肽或蛋白基颗粒，包括纳米材料、球状纳米颗粒、立方纳米颗粒、锥形纳米颗粒、长方形纳米颗粒、圆柱形纳米颗粒、或环形纳米颗粒的一种组合的纳米颗粒。25一种组合物，包括合成纳米载体，包括一种偶合到该合成纳米载体上的免疫调节剂；其中该免疫调节剂根据以下关系从该合成纳米载体解离IA4524/IA45612；其中IA4524被定义为在PH45，将该合成纳米载体暴露于体外水环境24小时，取作跨合成纳米载体样品的平均数的释放的免疫调节剂的重量；并且其中IA456被定义为在PH45，将该合成纳米载体暴露于体外水环境6小时，取作跨合成纳米载体样品的平均数的释放的免疫调节剂。

10、的重量。26如权利要求25所述的组合物，其中该免疫调节剂包括胶囊化在该合成纳米载体内的一种不稳定的免疫调节剂。27如权利要求26所述的组合物，其中该不稳定的免疫调节剂包括一种咪唑并喹啉、一种腺嘌呤衍生物、或包括5CG3的一种寡核苷酸，其中C未甲基化并且其中该寡核苷酸包括一个主链，该主链包括一个或多个不稳定的核苷酸间连键。28如权利要求27所述的组合物，其中该咪唑并喹啉包括一种咪唑并喹啉胺、一种咪唑并吡啶胺、一种6，7稠合的环烷基咪唑并吡啶胺、一种咪唑并喹啉胺、咪喹莫特、或瑞喹莫德。29如权利要求27所述的组合物，其中该寡核苷酸的主链不包括稳定化的化学修饰，这些修饰的功能是在生理条件下稳定化该主。

11、链。30如权利要求29所述的组合物，其中该寡核苷酸的主链包括一个未被修饰以结合稳定化学修饰的硫代磷酸酯的主链。权利要求书CN102481374A3/4页431一种组合物，包括合成纳米载体，包括一种偶合到该合成纳米载体上的免疫调节剂；其中该免疫调节剂根据以下关系从该合成纳米载体解离6IA4524/IA45612；其中IA4524被定义为在PH45，将该合成纳米载体暴露于体外水环境24小时，取作跨合成纳米载体样品的平均数的释放的免疫调节剂的重量；并且其中IA456被定义为在PH45，将该合成纳米载体暴露于体外水环境6小时，取作跨合成纳米载体样品的平均数的释放的免疫调节剂的重量。32如权利要求31所。

12、述的组合物，其中该免疫调节剂包括胶囊化在该合成纳米载体内的一种不稳定的免疫调节剂。33如权利要求32所述的组合物，其中该不稳定的免疫调节剂包括一种咪唑并喹啉、一种腺嘌呤衍生物、或包括5CG3的一种寡核苷酸，其中C未甲基化并且其中该寡核苷酸包括一个主链，该主链包括一个或多个不稳定的核苷酸间连键。34如权利要求33所述的组合物，其中该咪唑并喹啉包括一种咪唑并喹啉胺、一种咪唑并吡啶胺、一种6，7稠合的环烷基咪唑并吡啶胺、一种咪唑并喹啉胺、咪喹莫特、或瑞喹莫德。35如权利要求33所述的组合物，其中该寡核苷酸的主链不包括稳定化的化学修饰，这些修饰的功能是在生理条件下稳定化该主链。36如权利要求35所述的。

13、组合物，其中该寡核苷酸的主链包括一个未被修饰以结合稳定化学修饰的硫代磷酸酯的主链。37如权利要求25或31所述的组合物，其中该免疫调节剂经由一个免疫调节剂偶合部分偶合到该合成纳米载体上。38如权利要求25或31所述的组合物，其中该免疫调节剂被胶囊化在该合成纳米载体内。39如权利要求25、31、或37所述的组合物，其中该免疫调节剂是一种佐剂。40如权利要求39所述的组合物，其中该佐剂包括一种TOLL样受体TLR激动剂。41如权利要求40所述的组合物，其中该TLR激动剂是一种TLR3激动剂、TLR7激动剂、TLR8激动剂、TLR7/8激动剂或一种TLR9激动剂。42如权利要求40或41所述的组合物。

14、，其中该TLR激动剂是一种免疫刺激核酸。43如权利要求42所述的组合物，其中该免疫刺激核酸是一种免疫刺激DNA或免疫刺激RNA。44如权利要求42或43所述的组合物，其中该免疫刺激核酸是一种含有CPG的免疫刺激核酸，它包括一种或多种稳定化学修饰，这些修饰的功能是在生理条件下稳定化该主链。45如权利要求39所述的组合物，其中该佐剂包括一种通用T细胞抗原。46如权利要求2545中任意一项所述的组合物，其中该合成纳米载体进一步包括一种B细胞抗原和/或一种T细胞抗原。47如权利要求2546中的任意一项所述的组合物，其中该合成纳米载体进一步包括一种抗原递呈细胞APC靶向特征。48如权利要求2547中任意。

15、一项所述的组合物，其中这些合成纳米载体包括一种或权利要求书CN102481374A4/4页5多种可生物降解的聚合物。49如权利要求48所述的组合物，其中该免疫调节剂经由该免疫调节剂偶合部分偶合到这一种或多种可生物降解的聚合物上。50如权利要求48或49所述的组合物，其中该可生物降解的聚合物包括聚丙交酯、聚乙交酯、或聚丙交酯乙交酯共聚物。51如权利要求4850中任意一项所述的组合物，其中如使用凝胶渗透色谱法确定的那样，这些可生物降解的聚合物具有范围从800道尔顿至10,000道尔顿的重均分子量。52如权利要求37和3951中任意一项所述的组合物，其中该免疫调节剂偶合部分包括一个酰胺键。53如权利。

16、要求37和3951中任意一项所述的组合物，其中该免疫调节剂偶合部分包括一个酯键。54如权利要求2553中任意一项所述的组合物，其中这些合成纳米载体包括脂基纳米颗粒，聚合物纳米颗粒，金属纳米颗粒，表面活性剂基乳液，树枝状化合物，巴奇球，纳米线，病毒状颗粒，肽或蛋白基颗粒，包括纳米材料、球状纳米颗粒、立方纳米颗粒、锥形纳米颗粒、长方形纳米颗粒、圆柱形纳米颗粒、或环形纳米颗粒的一种组合的纳米颗粒。55如权利要求154中任意一项所述的组合物，进一步包括一种药学上可接受的赋形剂。56一种组合物，包括一种疫苗，该疫苗包括如权利要求155中任意一项所述的组合物。57一种方法，包括将如权利要求156中任意一项。

17、所述的组合物给予一个受试者。58如权利要求57所述的方法，其中该组合物以一个有效诱导或增强免疫应答的量存在。59如权利要求58所述的方法，其中该受试者患有癌、一种传染病、一种非自身免疫性代谢病、一种退行性疾病、或一种依赖症。权利要求书CN102481374A1/55页6具有免疫调节剂的PH敏感释放的靶向合成纳米载体0001相关申请0002本申请要求在美国临时申请61/217129、61/217117、61/217124、和61/217116的35USC119下的权益，这几项申请中的每一件都是2009年5月27日提交的，其中每一件的内容都通过引用以其全文结合在此。发明领域0003发明领域本发明涉。

18、及靶向细胞中作用位点的合成纳米载体的组合物、以及相关方法，这些细胞例如抗原递呈细胞APC，并且包括以一种PH敏感方式从合成纳米载体解离的免疫调节剂。本发明额外涉及保护不稳定的免疫调节剂，借助它们在合成纳米载体中的胶囊化。0004发明背景0005免疫调节剂被用于在受试者中产生免疫应答。免疫系统的刺激，它包括先天性免疫和获得性免疫之一或全部，是一种可以导致宿主的保护性亦或不良生理结果的复杂现象。近年对先天性免疫的机制已经存在增加的兴趣，它被认为启动并支持获得性免疫。这一兴趣部分地出于近期发现的称为TOLL样受体TLR的高度保守模式识别受体蛋白的一个家族，这些受体被认为涉及先天性免疫，作为用于病原相。

19、关分子模式PAMP的受体。0006因此对于调节先天性免疫有用的组合物和方法是具有很大兴趣的，因为它们可以影响对涉及炎症、过敏症、哮喘、感染、癌、以及免疫缺陷等症状的治疗方法。0007有时偶合这样的媒介物至递送载体是有利的。然而，这样的信息还是缺乏关于这样的媒介物特别是不稳定的免疫调节剂从递送载体的释放如何被控制，以及什么种类的释放提供最佳体内效果。0008对于用于递送免疫调节剂的、允许最佳释放的新递送载体连同相关方法存在需要。0009发明概述0010本发明的多个方面涉及包括合成纳米载体的组合物，这些合成纳米载体包括偶合到合成纳米载体的免疫调节剂，其中根据以下关系，该免疫调节剂从合成纳米载体解离。

20、IAREL4524/IAREL742412，其中IAREL4524被定义为在PH45，将合成纳米载体暴露于体外水环境24小时，释放的免疫调节剂的重量除以在PH45，将合成纳米载体暴露于体外水环境24小时，释放的免疫调节剂的重量加上在PH45，将合成纳米载体暴露于体外水环境24小时，保留在合成纳米载体中的免疫调节剂的重量之和，表示为重量百分数，并且被取作跨合成纳米载体样品的平均数，并且其中IAREL7424被定义为在PH74，将合成纳米载体暴露于体外水环境24小时，释放的免疫调节剂的重量除以在PH74，将合成纳米载体暴露于体外水环境24小时，释放的免疫调节剂的重量加上在PH74，将合成纳米载体暴。

21、露于体外水环境24小时，保留在合成纳米载体中的免疫调节剂的重量之和，表示为重量百分数，并且被取作跨合成纳米载体样品的平均数。0011在一些实施方案中，免疫调节剂经由免疫调节剂偶合部分偶合到合成纳米载体说明书CN102481374A2/55页7上。在某些实施方案中，免疫调节剂被胶囊化在合成纳米载体内。在一些实施方案中，免疫调节剂包括不稳定的免疫调节剂，例如咪唑并喹啉、腺嘌呤衍生物、或包括5CG3的寡核苷酸，其中C未甲基化并且其中该寡核苷酸包括一个主链，该主链包括一个或多个不稳定的核苷酸间连键。在某些实施方案中，该咪唑并喹啉包括咪唑并喹啉胺、咪唑并吡啶胺、6，7稠合的环烷基咪唑并吡啶胺、咪唑并喹啉。

22、胺、咪喹莫特、或瑞喹莫德。0012在一些实施方案中，该寡核苷酸的主链不包括稳定化的化学修饰，这些修饰的功能是在生理条件下稳定化主链。在一些实施方案中，该寡核苷酸的主链包括一个未被修饰以结合稳定化学修饰的硫代磷酸酯的主链。在一些实施方案中，免疫调节剂是一种佐剂。在某些实施方案中，佐剂包括TOLL样受体TLR激动剂例如TLR3激动剂、TLR7激动剂、TLR8激动剂、TLR7/8激动剂、或TLR9激动剂。0013在一些实施方案中，TLR激动剂是一种免疫刺激核酸例如免疫刺激DNA或免疫刺激RNA。在某些实施方案中，免疫刺激核酸是一种含有CPG的免疫刺激核酸，它包括一种或多种稳定化学修饰，这些修饰的功能。

23、是在生理条件下稳定化主链。在一些实施方案中，佐剂包括一种通用T细胞抗原。0014在一些实施方案中，合成纳米载体进一步包括一种B细胞抗原和/或一种T细胞抗原。在某些实施方案中，该合成纳米载体进一步包括一种抗原递呈细胞APC靶向特征。在一些实施方案中，合成纳米载体包括一种或多种可生物降解的聚合物。在一些实施方案中，免疫调节剂经由免疫调节剂偶合部分偶合到一种或多种可生物降解的聚合物上。在某些实施方案中，可生物降解的聚合物包括聚丙交酯、聚乙交酯、或聚丙交酯乙交酯共聚物。0015在一些实施方案中，如使用凝胶渗透色谱法确定的那样，该可生物降解的聚合物具有范围从800道尔顿至10,000道尔顿的重均分子量。。

24、在某些实施方案中，免疫调节剂偶合部分包括一个酰胺键。在一些实施方案中，免疫调节剂偶合部分包括一个酯键。0016在一些实施方案中，合成纳米载体包括脂基纳米颗粒、聚合物纳米颗粒，金属纳米颗粒，表面活性剂基乳液，树枝状化合物，巴奇球，纳米线，病毒状颗粒，肽或蛋白基颗粒，包括纳米材料、球状纳米颗粒、立方纳米颗粒、锥形纳米颗粒、长方形纳米颗粒、圆柱形纳米颗粒、或环形纳米颗粒的一种组合的纳米颗粒。0017本发明的多个方面涉及包括合成纳米载体的组合物，这些合成纳米载体包括偶合到合成纳米载体的免疫调节剂，其中根据以下关系，该免疫调节剂从合成纳米载体解离IA4524/IA45612，其中IA4524被定义为当合。

25、成纳米载体暴露于PH45的体外水环境24小时，取作跨合成纳米载体样品的平均数的释放的免疫调节剂的重量，并且其中IA456被定义为当合成纳米载体暴露于PH45的体外水环境6小时，取作跨合成纳米载体样品的平均数的释放的免疫调节剂的重量。0018在一些实施方案中，免疫调节剂包括胶囊化在合成纳米载体内的不稳定的免疫调节剂。在某些实施方案中，不稳定的免疫调节剂包括咪唑并喹啉、腺嘌呤衍生物、或包括5CG3的寡核苷酸，其中C未甲基化并且其中该寡核苷酸包括一个主链，该主链包括一个或多个不稳定的核苷酸间连键。在某些实施方案中，该咪唑并喹啉包括咪唑并喹啉胺、咪唑并吡啶胺、6，7稠合的环烷基咪唑并吡啶胺、咪唑并喹啉。

26、胺、咪喹莫特、或瑞喹莫德。在一些实施方案中，该寡核苷酸的主链不包括稳定化的化学修饰，这些修饰的功能是在生理条说明书CN102481374A3/55页8件下稳定化主链。在一些实施方案中，该寡核苷酸的主链包括一个未被修饰以结合稳定化学修饰的硫代磷酸酯的主链。0019本发明的其他方面涉及包括合成纳米载体的组合物，这些合成纳米载体包括偶合到合成纳米载体的免疫调节剂，其中根据以下关系，该免疫调节剂从合成纳米载体解离6IA4524/IA45612，其中IA4524被定义为当合成纳米载体暴露于PH45的体外水环境24小时，取作跨合成纳米载体样品平均数的释放的免疫调节剂的重量，并且其中IA456被定义为当合成。

27、纳米载体暴露于PH45的体外水环境6小时，取作跨合成纳米载体样品的平均数的释放的免疫调节剂的重量。0020在一些实施方案中，免疫调节剂包括胶囊化在合成纳米载体内的不稳定的免疫调节剂。在一些实施方案中，不稳定的免疫调节剂包括咪唑并喹啉、腺嘌呤衍生物、或包括5CG3的寡核苷酸，其中C未甲基化并且其中该寡核苷酸包括一个主链，该主链包括一个或多个不稳定的核苷酸间连键。在某些实施方案中，该咪唑并喹啉包括咪唑并喹啉胺、咪唑并吡啶胺、6，7稠合的环烷基咪唑并吡啶胺、咪唑并喹啉胺、咪喹莫特、或瑞喹莫德。0021在一些实施方案中，该寡核苷酸的主链不包括稳定化的化学修饰，这些修饰的功能是在生理条件下稳定化主链。在。

28、一些实施方案中，该寡核苷酸的主链包括一个未被修饰以结合稳定化学修饰的硫代磷酸酯的主链。在某些实施方案中，免疫调节剂经由免疫调节剂偶合部分偶合到合成纳米载体上。在一些实施方案中，免疫调节剂被胶囊化在合成纳米载体内。0022在一些实施方案中，免疫调节剂是一种佐剂。在某些实施方案中，佐剂包括TOLL样受体TLR激动剂例如TLR3激动剂、TLR7激动剂、TLR8激动剂、TLR7/8激动剂、或TLR9激动剂。在某些实施方案中，TLR激动剂是一种免疫刺激核酸例如免疫刺激DNA或免疫刺激RNA。0023在一些实施方案中，免疫刺激核酸是一种含有CPG的免疫刺激核酸，它包括一种或多种稳定化学修饰，这些修饰的功能。

29、是在生理条件下稳定化主链。在某些实施方案中，佐剂包括一种通用T细胞抗原。在一些实施方案中，合成纳米载体进一步包括一种B细胞抗原和/或一种T细胞抗原。0024在一些实施方案中，该合成纳米载体进一步包括一种抗原递呈细胞APC靶向特征。在某些实施方案中，合成纳米载体包括一种或多种可生物降解的聚合物。在一些实施方案中，免疫调节剂经由免疫调节剂偶合部分偶合到一种或多种可生物降解的聚合物上。在某些实施方案中，可生物降解的聚合物包括聚丙交酯、聚乙交酯、或聚丙交酯乙交酯共聚物。0025在一些实施方案中，如使用凝胶渗透色谱法确定的那样，该可生物降解的聚合物具有范围从800道尔顿至10,000道尔顿的重均分子量。。

30、在某些实施方案中，免疫调节剂偶合部分包括一个酰胺键。在一些实施方案中，免疫调节剂偶合部分包括一个酯键。0026在一些实施方案中，合成纳米载体包括脂基纳米颗粒、聚合物纳米颗粒，金属纳米颗粒，表面活性剂基乳液，树枝状化合物，巴奇球，纳米线，病毒状颗粒，肽或蛋白基颗粒，包括纳米材料、球状纳米颗粒、立方纳米颗粒、锥形纳米颗粒、长方形纳米颗粒、圆柱形纳米颗粒、或环形纳米颗粒的一种组合的纳米颗粒。在某些实施方案中，本发明相关的组合物进一步包括一种药学上可以接受的赋形剂。说明书CN102481374A4/55页90027本发明的其他方面涉及包括一种疫苗的组合物，该疫苗包括任何本发明相关的组合物。0028本发。

31、明的其他方面涉及包括将本发明相关的任何组合物给予受试者的方法。在一些实施方案中，组合物以有效诱导或增强免疫应答的量存在。在一些实施方案中，受试者患有癌、传染病、非自身免疫性代谢病、退行性疾病、或依赖症。0029附图简要说明0030图1证明了在PH74、37条件下，从合成纳米载体配制品释放瑞喹莫德R848。0031图2证明了在PH45、37条件下，从合成纳米载体配制品释放R848。0032图3证明了在PH74和PH45，在24小时条件下，从合成纳米载体配制品释放R848。0033图4示出与用不具有含CPG免疫刺激核酸的合成纳米载体的抗体诱导水平组1比较，用具有含CPG免疫刺激核酸的合成纳米载体的。

32、抗体诱导水平组2和3。0034图5示出用释放磷酸二酯、非硫代的含CPG免疫刺激核酸或硫代的含CPG免疫刺激核酸的合成纳米载体的抗体诱导水平。0035图6示出用按不同速率释放R848的纳米载体的抗体诱导水平。0036图7示出由携带封存的磷酸二酯POCPG的合成纳米载体指定为NCNIC/POCPG诱导的抗体水平。0037图8示出在PH45，封存的POCPG从合成纳米载体的释放与在PH75的对比。数据证明通过胶囊化，不稳定的免疫调节剂例如POCPG被保护在合成纳米载体内。在PH45例如在内含体/溶酶体中，这样一种不稳定的媒介物可以在希望的作用点释放，同时在PH74例如在内含体/溶酶体外的一般PH值发。

33、生低水平的释放。0038详细说明0039在详细说明本发明以前，已理解本发明并不局限于具体举例说明的材料或工艺参数，因为这些当然可以变化。还已理解在此使用的术语只是为了说明本发明的具体实施方案的目的，并不旨在限制使用可替代的术语来说明本发明。0040在此引用的所有出版物、专利和专利申请，无论在前或在后，都出于所有目的通过引用以其全文结合在此。0041如在本说明书和附加权利要求中使用的那样，单数形式“一个”、“一种”和“该”包括复数指示物，除非该内容清楚地另外指明。例如，引用“一种聚合物”包括两种或更多种这样的分子的混合物，引用“一种溶剂”包括两种或更多种这样的溶剂的混合物，引用“一种粘合剂”包括。

34、两种或更多种这样的材料的混合物，并且以此类推。0042序论0043在感兴趣的细胞，特别是抗原递呈细胞的作用点，提供一种更直接地释放免疫调节剂的方式方面，本发明是有用的，它会导致有益的免疫应答和/或减少脱靶效应和毒性，因为免疫调节剂的释放多数会在感兴趣的细胞的作用点。对于递送佐剂，这具有特别的兴趣。控制释放特性第一次给感兴趣的免疫细胞提供递送免疫调节剂的受控方式，并且允许在免疫系统上的更精确的干涉，包括在延长的时段释放免疫调节剂的能力。所有这些导致一个非常可调的系统以获得免疫调节剂的最佳释放，这样它将主要在所希望的细胞的作用点释放。说明书CN102481374A5/55页100044本发明的诸位。

35、发明人已经进一步认识到通过将不稳定的免疫调节剂胶囊化在本发明的合成纳米载体内，将不稳定的免疫调节剂偶合在本发明的合成纳米载体内，并且提供了递送不稳定的免疫调节剂至感兴趣的免疫细胞的受控方式，优选地在一个延长的时段，导致不稳定的免疫调节剂的靶向递送，同时最小化免疫调节剂的脱靶效应，特别是与免疫调节剂的全身给药相关的脱靶效应。此外，这一方法还增强了具有短的消除半衰期的不稳定的免疫调节剂的性能，该免疫调节剂可能另外不具有希望水平的药理学活性。0045在一个实施方案中，本发明涉及某些寡核苷酸。最近，已经存在很多说明某些类型的核酸分子包括CPG核酸、富含GU的SSRNA和双链RNA的免疫刺激作用的报告。。

36、值得注意的是，最近报告了TOLL样受体9TLR9识别细菌DNA和含有一个CPG基序的寡核苷酸，其中胞嘧啶是未甲基化的。HEMMIH等人2000NATURE4087405；BAUERSETAL2001PROCNATLACADSCIUSA98923742。在多个美国专利例如美国专利号6,194,388；6,207,646；6,239,116；和6,218,371，以及公开的国际专利申请例如W098/37919、W098/40100、W098/52581、和W099/56755中已经广泛说明了含有CPG的寡核苷酸在免疫调节上的作用。完整的免疫刺激剂核酸可以是未甲基化的或部分可以是未甲基化的，但是至少。

37、5CG3的C是未甲基化的。0046天然DNA寡核苷酸含有被在细胞外环境中发现的核酸酶迅速切割的磷酸二酯键。YU，D，等人，POTENTCPGOLIGONUCLEOTIDESCONTAININGPHOSPHODIESTERLINKAGESINVITROANDINVIVOIMMUNOSTIMULATORYPROPERTIESBIOCHEMBIOPHYSRESCOMMUN，20022971P8390“YUETAL”；HEEG，K，等人，STRUCTURALREQUIREMENTSFORUPTAKEANDRECOGNITIONOFCPGOLIGONUCLEOTIDESINTJMEDMICROBIOL，。

38、200829812P338“HEEGETAL”这样的天然寡核苷酸可以被认为是不稳定的免疫调节剂。因此，在文献中已经广泛报告了通过用硫代磷酸酯基团取代磷酸二酯连接基团，化学地稳定这些键的方法。参见美国专利6811975PHOSPHOROTHIOATEOLIGONUCLEOTIDESHAVINGMODIFIEDINTERNUCLEOSIDELINKAGES。0047作为疫苗佐剂，含有硫代磷酸酯CPG的寡核苷酸已经被全身给药。YU等人。然而，稳定的CPG寡核苷酸的全身给药可以导致脱靶免疫刺激效应，例如一般的炎症、淋巴细胞的非特异活化、以及类似流感的症状。HAAS，T，等人，SEQUENCEINDEP。

39、ENDENTINTERFERONALPHAINDUCTIONBYMULTIMERIZEDPHOSPHODIESTERDNADEPENDSONSPATIALREGULATIONOFTOLLLIKERECEPTOR9ACTIVATIONINPLASMACYTOIDDENDRITICCELLSIMMUNOLOGY，20091262P2908“HAASETAL”因此，在实践本发明中，这样的寡核苷酸可以被有用地结合，如在以下更详细地说明的那样。0048本发明的诸位发明人已经意外地并且令人惊讶地发现，通过实践在此披露的本发明，可以克服以上提到的问题和限制。特别是，本发明的诸位发明人已经意外地发现可能与相关。

40、方法一起提供一种组合物，包括包括偶合到合成纳米载体上的免疫调节剂的合成纳米载体；其中该免疫调节剂，优选是不稳定的免疫调节剂，根据以下关系从合成纳米载体解离0049IAREL45T/IAREL74T12；0050其中IAREL45T被定义为在PH45，将合成纳米载体暴露于体外水环境T小时，释放的免疫调节剂的重量除以在PH45，将合成纳米载体暴露于体外水环境T小时，说明书CN102481374A106/55页11释放的免疫调节剂的重量加上在PH45，将合成纳米载体暴露于体外水环境T小时，保留在合成纳米载体中的免疫调节剂的重量之和，表示为重量百分数，并且被取作跨合成纳米载体样品的平均数；并且其中IA。

41、REL74T被定义为在PH74，将合成纳米载体暴露于体外水环境T小时，释放的免疫调节剂的重量除以在PH74，将合成纳米载体暴露于体外水环境T小时，释放的免疫调节剂的重量加上在PH74，将合成纳米载体暴露于体外水环境T小时，保留在合成纳米载体中的免疫调节剂的重量之和，表示为重量百分数，并且被取作跨合成纳米载体样品的平均数；并且其中T为2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、或30小时。0051在一些实施方案中，免疫调节剂，优选是不稳定的免疫调节剂，根据以下关系从合成纳米载体解离IAREL45T/IAREL74T13，IAREL45T/IAREL74T14，IA。

42、REL45T/IAREL74T15，IAREL45T/IAREL74T16，IAREL45T/IAREL74T17，IAREL45T/IAREL74T18，IAREL45T/IAREL74T19，IAREL45T/IAREL74T2，IAREL45T/IAREL74T22，IAREL45T/IAREL74T25，IAREL45T/IAREL74T27，IAREL45T/IAREL74T3，IAREL45T/IAREL74T35，IAREL45T/IAREL74T4，IAREL45T/IAREL74T45，IAREL45T/IAREL74T5，IAREL45T/IAREL74T55，IAREL4。

43、5T/IAREL74T6，IAREL45T/IAREL74T65，IAREL45T/IAREL74T7，IAREL45T/IAREL74T75，IAREL45T/IAREL74T8，IAREL45T/IAREL74T85，IAREL45T/IAREL74T9，IAREL45T/IAREL74T95，IAREL45T/IAREL74T10，IAREL45T/IAREL74T105，ORIAREL45T/IAREL74T11，其中IAREL45T，IAREL74T，并且T如以上定义的那样。0052在其他实施方案中，免疫调节剂，优选是不稳定的免疫调节剂，根据以下关系从合成纳米载体解离2IAREL45。

44、T/IAREL74T12，25IAREL45T/IAREL74T12，3IAREL45T/IAREL74T12，35IAREL45T/IAREL74T12，4IAREL45T/IAREL74T12，45IAREL45T/IAREL74T12，5IAREL45T/IAREL74T12，6IAREL45T/IAREL74T12，7IAREL45T/IAREL74T12，8IAREL45T/IAREL74T12，9IAREL45T/IAREL74T12，10IAREL45T/IAREL74T12，10IAREL45T/IAREL74T2，10IAREL45T/IAREL74T25，10IAREL45。

45、T/IAREL74T3，10IAREL45T/IAREL74T35，10IAREL45T/IAREL74T4，10IAREL45T/IAREL74T45，10IAREL45T/IAREL74T5，10IAREL45T/IAREL74T6，10IAREL45T/IAREL74T7，10IAREL45T/IAREL74T8，10IAREL45T/IAREL74T9，3IAREL45T/IAREL74T2，4IAREL45T/IAREL74T3，5IAREL45T/IAREL74T4，6IAREL45T/IAREL74T5，7IAREL45T/IAREL74T6，8IAREL45T/IAREL74T。

46、7，OR9IAREL45T/说明书CN102481374A117/55页12IAREL74T8，其中IAREL45T，IAREL74T，并且T如以上定义的那样。在一些实施方案中，T是24小时。0053因此，本发明涉及包括在中性和酸性PH以显著不同的速率释放免疫调节剂的合成纳米载体的组合物和方法。在递送免疫调节剂中，为了具有最有效的作用，希望使得多数免疫调节剂在它们可以具有希望的作用的APC内释放。在以游离态注射免疫调节剂时，或者在它们从APC外的合成纳米颗粒释放时，只有小部分免疫调节剂找到它们通往APC的路，同时剩余的通过身体扩散，其中免疫刺激会更少并且会导致有害效果。在此提供的本发明的合成纳。

47、米载体优先地被APC接收。在被APC接收时，假定合成纳米载体被内吞到内含体/溶酶体区室，那里PH变得更酸，和细胞外的中性PH相反。在这些条件下，免疫调节剂表现出从合成纳米载体例如从免疫调节剂偶合部分的PH敏感的解离并且从合成纳米载体释放。然后免疫调节剂与内含体/溶酶体相关受体自由地相互作用，并且刺激希望的免疫应答。在或约中性PH下，或者在或约生理PH即PH74的实施方案中，本发明的合成纳米载体具有免疫调节剂的更低释放的特性，但是对于它靶向免疫调节剂至合成纳米载体靶向的APC的内含体/溶酶体区室，在或约45的PH的增加的释放是希望的。0054通过很多方法中的任何一种，免疫调节剂可以被偶合到合成纳。

48、米载体。一般地，偶合可以是免疫调节剂和合成纳米载体之间的键合的结果。该键合可以导致免疫调节剂被附着到合成纳米载体表面和/或被包含胶囊化在合成纳米载体内。然而在一些实施方案中，由于合成纳米载体的结构，免疫调节剂被合成纳米载体胶囊化而不是键合到合成纳米载体。0055在由于免疫调节剂和合成纳米载体之间的键合而发生偶合时，经由一个免疫调节剂偶合部分发生偶合。免疫调节剂偶合部分可以是任何部分，免疫调节剂通过它被键合到合成纳米载体上。这样的部分包括共价键例如酰胺键或酯键，连同键合共价地或非共价地免疫调节剂至合成纳米载体的分离分子。这样的分子包括连接物或聚合物或它们的单元。例如，免疫调节剂偶合部分可以包括免。

49、疫调节剂例如一种免疫刺激核酸静电结合的一种带电聚合物。如另一个实例，免疫调节剂偶合部分可以包括免疫调节剂共价结合的一种聚合物或其单元。0056在一些实施方案中，该聚合物或其单元包括聚酯、聚碳酸酯、聚酰胺、或聚醚、或其单元。在其他实施方案中，该聚合物或其单元包括聚乙二醇PEG、聚乳酸、聚乙醇酸、聚乳酸乙醇酸共聚物、或聚己酸内酯、或其单元。在一些实施方案中，优选该聚合物是生物可降解的。因此，在这些实施方案中，优选如果该聚合物包括聚醚例如聚乙二醇或其单元，那么该聚合物包括聚醚和生物可降解聚合物的嵌段共聚物，这样该聚合物是生物可降解的。在其他实施方案中，该聚合物并不单独包括聚醚或其单元例如聚乙二醇或其单元。因此如在此提供的免疫调节剂偶合部分可以包括一个以。

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