细菌群体感应的共价抑制 发明领域 本发明涉及细菌通讯的抑制剂、 及其使用方法和制备方法。
发明背景
作 为 群 体 密 度 的 函 数， 细 菌 之 间 的 基 因 表 达 的 化 学 协 调 (chemical coordination) 是通过已知为 “群体感应” (QS) 的机制来调节。细胞间的通讯使得单细胞 有机体能够协调它们的行为以适应改变的环境， 允许其与多细胞有机体竞争及共存。由 QS- 控制的行为的实例包括生物膜的形成、 毒力因子的表达、 抗生素的产生及生物荧光的诱 导。 只有同时进行时， 这些过程对细菌群体才是有益的。 例如， 由海洋细菌费氏弧菌 (Vibrio fischeri) 所产生的生物荧光对许多寄宿这种物种的有机体是有益的， 但是只有在足够数 量的细菌使其发光同步的时候。尽管已经发现了多种 QS 信号传导系统， 在 QS 中所涉及的 更多的蛋白和小分子仍有待描述 (1-4)。
在细菌中 QS 的重要性及其对人类健康的影响是显著的， 尤其是当认为， 估计在成 年人中的总微生物种群至少比哺乳动物细胞的数量多九倍时。仅胃肠道就含有 500-1000 种代表很大的遗传多样性的不同种类， 且由于这些种类的大多数还未在体外培养， 这个群 体几乎还未表征。在协同重要过程方面， 种内及种间的 QS 可很好地帮助这个共生群体， 比 如种群大小的维持及帮助或防止病原细菌的建群 (5， 6)。
QS 由自诱导物 (autoinducer) 调节， 根据共享的分子特征， 自诱导物可分成几个 类别 ( 图 1a， 2-4)。超过 70 种的革兰氏阴性细菌采用 N- 酰基高丝氨酸内酯类 (AHL) 作为 自诱导物， 这个类别的 QS 信号内的差异出现在酰基侧链的长度与氧化状态方面。已表明来 自不同种类的不同 AHL 在细菌感染中发挥着重要的作用。一个重要的实例是革兰氏阴性 细菌， 绿脓假单胞菌 (Pseudomonas aeruginosa)。这种常见的环境微生物是一种条件性人 病原体， 例如， 在患有囊性纤维化 (CF， 一种常见且致命的遗传性遗传疾病 ) 的患者中是显 著的， 在该疾病中患者通常死于受损的肺防御功能。引起绿脓假单胞菌的发病机理及抗生 素耐药性的一个重要因素在于其形成生物膜 ( 微生物源的粘着到界面或相互粘着的固着 细胞群 )， 占据胞外聚合物基体， 并表现出在生长、 基因表达及蛋白产生方面区别于浮游细 胞的表型的能力。尽管生物膜的形成与特定的结构由不同 QS 系统 (7) 及其它因素比如环 双 -GMP 来调节， 已表明即使单一 QS 调节子的抑制可导致整体生物膜形成的显著降低。
在绿脓假单胞菌中的主要 QS 系统是通过 3- 氧代 -C12-HSL 的合成和分泌来调节 的， 当 3- 氧代 -C12-HSL 达到阈值浓度时， 结合转录激活因子 LasR。已提出， 这种相互作 用引起正确的折叠， 之后二聚化且 LasR 二聚体结合到其靶 DNA， 导致基因表达。此外， 已 发现几个其他小分子在基因表达的调节中发挥着作用 ( 例如， C4-HSL， PQS)， 尽管由 3- 氧 代 -C12-HSL 识别所发起的信号传导事件似乎处于 QS 序位 (hierarchy) 的上端 (8-10)。由 于其医学的重要性， 在绿脓假单胞菌中的 QS 已被广泛研究。在这个领域中一个著名的突破 性进展是伴随着 LasR 结合到其天然配体 (3- 氧代 -C12-HSL) 的晶体结构的测定而发生的， 最近由 BottomLey 等报道 (11)。
在最近几年， 已经将 QS 信号传导的干预发展成战胜发病的新方法。几个小组已经
鉴定出在绿脓假单胞菌中表现出显著抑制 QS 的化合物， 尽管这些努力所得到的强效抑制 剂的数量仍然很低。效力中等的抑制剂的实例及其 IC50 值如表 1b 所示。
概述
背景技术未教导或表明充分有效的细菌通讯抑制剂、 及其使用方法和制备方法。
通过提供细菌通讯的共价抑制剂及其使用方法和制备方法， 本发明在至少某些实 施方式中克服了这些背景技术的缺陷。抑制剂可任选地直接或间接地作用以抑制细菌通 讯， 且还可任选地作用于细菌通讯的任意阶段。
根据至少某些实施方式， 这些抑制剂是包括反应性基团的抑制性化合物 ( 小分 子 )， 优选地是能与其靶蛋白的活性位点中的亲核体形成共价键且不与其它蛋白非特异性 地相互作用的亲电体。 反应性基团优选地连接到能与靶蛋白以允许反应性基团与亲核体相 互作用并因此形成共价键的方式相互作用的部分上。这样的抑制剂优选地具有式 A-B， 其 中 A 是亲电官能团且 B 是靶蛋白的天然配体或其一部分， 使得抑制剂可与靶蛋白以如下方 式相互作用， 该方式使得 A 官能团能共价地结合到靶蛋白并因此抑制天然配体的结合。
根据某些实施方式， 提供设计用于共价结合到蛋白的一组亲电探针 ( 抑制剂 )， 该蛋白的天然配体是在群体感应中起作用的高丝氨酸内酯。已知， 高丝氨酸内酯作为革 兰氏阴性细菌的群体感应的配体。群体感应可任选地被一种或多种本发明的化合物抑 制的细菌的非限制性实例包括以下中的一种或多种 ： 不动杆菌属 (Acinetobacter)、 放线 杆 菌 属 (Actinobacillus)、 土 壤 杆 菌 属 (Agrobacter)、 博 德 特 氏 菌 属 (Bordetella)、 布 鲁 氏 菌 属 (Brucella)、 弯 曲 杆 菌 属 (Campylobacter)、 蓝 细 菌 属 (Cyanobacteria)、 肠杆 菌属 (Enterobacter)、 欧文氏菌属 (Erwinia)、 大肠埃希杆菌属 (Escherichia coli)、 弗 朗 西 斯 氏 菌 属 (Franciscella)、 螺 杆 菌 属 (Helicobacter)、 嗜 血 杆 菌 属 (Hemophilus)、 克 雷 白 氏 杆 菌 属 (Klebsiella)、 军 团 杆 菌 属 (Legionella)、 莫 拉 氏 菌 属 (Moraxella)、 奈 瑟 氏 菌 属 (Neisseria)、 巴 斯 德 菌 属 (Pasteurella)、 变 形 菌 属 (Proteus)、 假单胞菌 属 (Pseudomonas)、 沙 门 氏 菌 属 (Salmonella)、 沙 雷 氏 菌 属 (Serratia)、 志贺氏杆菌属 (Shigella)、 密螺旋体属 (Treponema)、 弧菌属 (Vibrio) 及耶尔森氏菌属 (Yersinia)。
作为非 - 限制性的实例， 关于绿脓假单胞菌的蛋白可任选地以 LasR 结合袋为特 征， 但是任选地蛋白可以是其天然配体是高丝氨酸内酯的任意类型的蛋白， 只要蛋白活性 的抑制导致由 QS- 调节的基因表达的特异性抑制及毒力因子分泌与生物膜形成的伴随减 少。因此， B 任选地是任意的高丝氨酸内酯部分。
不想被单一假设或单一实例限制， 认为这些化合物共价地结合到 LasR 结合袋的 Cys79 上。对于这个非限制性的实例， B 是 3- 氧代 -C(n+2)-N- 酰基高丝氨酸内酯部分， 其中 n 至少是 2 及任选地多达 14， 及 A 是任意合适的亲电官能团。除非另外的明确说明， 假定所 有的分子是 S 对映体。
根据至少某些实施方式， 提供式 I 的化合物 ：
其中 n 代表碳的个数 ( 任选地 n ＝ 1-18， 尽管在不同的实施方式中， 这个范围可以改变 ； 如下文更为详细地描述， 术语 “n ＝ a-b” 是指 n 是选自由 a， a+1...b 组成的组的任意 数字 ； 本文所用的术语 “m” 对于所提供的数字的范围被赋予相似的含义 )， 且 R1 是任意合适 的反应性亲电官能团。任选地， R1 选自由硫醇、 异氰酸酯、 异硫氰酸酯、 异硒氰酸酯、 取代的 或未取代的反应性酰胺官能团、 NHC( ＝ O)C ＝ N-NH2、 反应性的取代的环部分、 反应性的取 代或未取代的杂环 ( 其任选地具有至少一个不饱和键 )、 烷基磺酸酯 ( 其中烷基磺酸酯与 B 部分结合形成烷基磺酸酯 )、 未取代的烯烃、 反应性的胺及 R3。如本文所用的， 环包含芳族 环和非芳族环。
如果存在硫醇， 则 n ＝ 5-12。 根据本发明的至少某些实施方式， 以硫醇为特征的结 构的非限制性实例显示在结构 -D 中。
异氰酸酯任选地是取代的或未取代的。优选地， 异氰酸酯是未取代的。作为特定 的非限制性实例， n ＝ 9( 如在下面的结构 -Q 所示 )。
异硫氰酸酯任选地是取代的或未取代的， 其中取代的异硫氰酸酯任选地具有结构 R2N ＝ C ＝ S， 其中 R2 选自由取代的烷基、 取代的异烷基、 取代的烯烃及取代的异烯烃组成的 组， 其中每一个都是任选地及优选地被选自由卤素、 杂环胺及烷基胺组成的组的部分所取 代。如果取代基 (substitution) 是杂环胺， 则其优选地选自由吡啶基、 吡咯基、 吡咯烷、 芳 基胺、 咪唑基及哌啶组成的组。 根据至少某些实施方式， R2 选自由取代的乙烯、 取代的丙烯、 取代的丁烯及取代的 戊烯组成的组， 任选地包括其任意的异构体， 它们可任选地如上述地取代 ； 更优选地， R2 是 取代的 2- 戊烯， 其更优选地是被烷基胺、 吡啶基、 吡咯基、 芳基胺或咪唑基中的一个所取代 的； 最优选地 n ＝ 1-15( 如下文的结构 -Y 所示 )。
根据至少某些实施方式， R2 选自由取代的乙基或取代的甲基组成的组， 其任选地 如上所述地取代， 但优选地是被烷基胺、 吡啶基、 吡咯基、 芳基胺、 哌啶或咪唑基中的一个 所取代的 ； 且更优选地是被哌啶取代的。最优选地， 被哌啶取代， 且 n ＝ 1-5( 如下文的结 构 -Z1、 结构 -Z2 及结构 Z-3 所示 )。
如果根据至少某些实施方式被卤素取代， 优选地卤素是溴或氯。 最优选地， R2 是溴 代烷基或氯代烷基， 且 n ＝ 7-9 ； 最优选地 n ＝ 8( 对应于结构 -3)。如果异硫氰酸酯是未取 代的， 那么优选地 n ＝ 8-10( 对应于结构 itc-11、 itc-12 及 itc-13)。
反应性的酰胺官能团任选地是优选地选自由溴代羧酰胺和氯代羧酰胺组成的 组的卤代羧酰胺， 其中酰胺官能团的碳链的长度是 1-16 碳 ； 优选地 n ＝ 5-16。更优选 地， 卤代羧酰胺是最优选地选自由溴乙酰胺和氯乙酰胺组成的组的卤代乙酰胺， 其中优选 地 n ＝ 5-16( 对 应 于 结 构 hal-11-Br、 hal-12-Br、 hal-13-Br、 hal-11-Cl、 hal-12-Cl 及 hal-13-Cl)。
如果 R1 是 NHC( ＝ O)C ＝ N-NH2， 优选地 n ＝ 5-16( 如例如结构 -4 所示 )。
反应性的取代的环部分优选地选自由取代的烯化环丁烷、 取代的烯化环戊烷及取 代的烯化环己烷组成的组， 更优选地选自由烯化环丁烷二酮、 烯化环戊烷二酮及烯化环己 烷二酮组成的组， 及最优选地是烯化环丁烷 -2， 4- 二酮、 烯化环戊烷 -2， 4- 二酮及烯化环 己烷 -2， 4- 二酮 ； 烯化部分任选地是亚甲基、 乙烯、 丁烯或戊烯且优选地是亚甲基。最优选 地， 反应性的取代的环部分是亚甲基环戊烷 -2， 4- 二酮及任选地 n ＝ 5-16， 但更优选地 n ＝ 8-10( 如结构 -8 所示 )。
如果未取代， 则反应性的杂环优选地是氧化乙烯及 n ＝ 5-16 ； 更优选地 n ＝ 8-12 ； 最优选地 n ＝ 9-11( 如结构 -12 所示 )。
如果取代， 则反应性的杂环优选地具有至少一个不饱和碳键， 且选自由 2- 呋喃酮 和吡喃酮 ( 其可任选地是 2- 吡喃酮或 4- 吡喃酮 ) 组成的组。如果反应性的杂环是 2- 呋 喃酮， 任选地 n ＝ 5-16， 优选地 n ＝ 8-12 ； 更优选地 n ＝ 9-11( 如结构 -13 所示 )。如果 反应性的杂环是 2- 吡喃酮， 任选地 n ＝ 5-16 ； 优选地 n ＝ 8-12 ； 更优选地 n ＝ 9-11( 如结 构 -14 所示 )。
烷基磺酸酯选自由取代和未取代的烷基磺酸酯组成的组 ； 优选地烷基磺酸酯选自 由甲基磺酸酯、 乙基磺酸酯、 丙基磺酸酯及丁基磺酸酯组成的组 ； 更优选地烷基磺酸酯是丙 基磺酸酯且 n ＝ 1-14， 更优选地 n ＝ 5-9 ； 最优选地烷基磺酸酯是丙基磺酸酯且 n ＝ 6-8( 如 结构 -9 所示 )。 如果取代， 则烷基磺酸酯优选地是卤代烷基磺酸酯。 更优选地选自由溴代烷 基磺酸酯、 氟代烷基磺酸酯及氯代烷基磺酸酯组成的组 ； 且最优选地选自由溴代甲基磺酸 酯、 氯代甲基磺酸酯及氟代甲基磺酸酯组成的组， 其中优选地 n ＝ 1-14， 更优选地 n ＝ 5-9 ； 最优选地 n ＝ 6-8( 如结构 -X 所示， 其还显示未取代的烷基磺酸酯 ) ； 或可选择地， 最优选 地选自由 3- 溴丙基磺酸酯、 2- 溴丙基磺酸酯、 3- 氯丙基磺酸酯及 2- 氯丙基磺酸酯组成的 组， 其中优选地 n ＝ 1-14， 更优选地 n ＝ 5-9 ； 最优选地 n ＝ 6-8( 如结构 -7 所示 )。
取代的烯烃优选地选自由取代的乙烯 ( 优选地被卤素取代， 卤素更优选地是溴 ) 和 C ＝ C ＝ CH2R5( 其中 R5 是卤素， 优选地是溴 ) 组成的组。如果取代的烯烃是 C ＝ C ＝ CH2R5， 则 R5 优选地是溴且优选地 n ＝ 1-14， 更优选地 n ＝ 5-9 ； 最优选地 n ＝ 8-10( 如下文 的结构 -10 所示 )。
在某些实施方式中， 反应性的胺是烷基胺或二烷基胺， 其中的烷基部分优选地被 取代， 更优选地被卤素取代。 烷基部分优选地选自由甲基、 乙基、 丙基及丁基组成的组 ； 更优 选地， 反应性的胺是卤素取代的二乙胺。 最优选地， 反应性的胺是氯取代的二乙胺且优选地 n ＝ 1-14 ； 更优选地 n ＝ 5-9 ； 最优选地 n ＝ 8-11( 如结构 -16 所示 )。
R3 任选地选自由 ：
其中 m ＝ 1-6 ； 优选地 m ＝ 1 ； 组成的组。
如 果 R3 是则 任 选 地 n ＝ 1-14， 更 优 选 地 n ＝ 7-11， 且最优选地 n ＝8-10( 如结构 -5 所示 )。
如果 R3 是则优选地 n ＝ 3-7 且更优选地 n ＝ 4-6 ； 最优选地 n＝ 4-6 及 m ＝ 1( 如结构 -6 所示 )。
如果 R3 是则优选地 n ＝ 9-11( 如结构 -15 所示 )。
根据本发明的其它实施方式， 提供式 II 的化合物 ：其中 R1 任选地是如上文所列举的任意基团， R6 可以是烷基胺、 吡啶基、 吡咯基、 芳 基胺、 咪唑基或哌啶 ； n1 ＝ 0-8 ； 且 n2 ＝ 0-8(n1 和 n2 分别独立选择 )。示例性的结构如结 构 -P1、 结构 -P2、 结构 -P3、 结构 -P4 和结构 -P5 所示。
上文的任意化合物在主链的碳链上可任选地包括二硫键， 如例如关于结构 -C 所 示。
上文的化合物的任意一个或多个可任选地用于根据本发明的不同实施方式的需 要群体感应的抑制的不同应用中， 包括但不限于植物疾病或动物疾病的治疗 ( 其中可任 选地包括任意的哺乳动物、 鱼、 爬行动物或鸟 ； 优选地， 动物是哺乳动物， 且任选地， 动物是 人)； 医疗设备， 包括可植入的医疗设备及体外的医疗设备， 或与身体和外部环境界面接触 的医疗设备 ； 负载水性液体或置于水性液体的任意类型的结构 ； 膜、 织品、 包装材料， 或用 于阻止或减少任意类型的生物膜的形成。
如本文所用的术语 “生物膜” 是指粘附到结构的表面的微生物薄层 ( 可以是有机 的或无机的 ) 及它们分泌的聚合物。
医疗器械的非限制性实例包括天然组织 ( 包括牙齿 ) 上的涂层、 导管、 起搏器、 隐 形眼镜、 支架、 心脏瓣膜替换件或增强设备、 可植入的自动除颤器、 人造心脏辅助设备、 可植 入的输液泵、 引流装置、 人造关节、 骨针、 螺丝和其它矫形外科设备、 齿冠、 牙科填料、 牙科植 入体、 其它的牙科或矫形外科的设备、 牙内科器具、 手术缝线、 夹子和 U 形针或其它紧固件、 心脏修补网状织物、 眼内透镜、 支撑物、 有缝带环 (lapband)、 绷带、 移植物、 支架 / 移植物、 无结伤口缝合物、 密封剂、 粘合剂、 组织支架、 软组织替换件或增强植入物 ( 包括但不限于 乳房、 面颊及臀部植入物 ) 及类似物。
如本文所用的术语 “导管” 包括但不限于导尿管、 导管线、 端口、 分流器、 饲管、 气管
内导管及外周置入中心静脉导管 (PICC) 线。
负载水性液体的结构的非限制性实例包括管、 滤水器及其它纯化设备、 这些液体 的容器、 以接触水性液体的表面为特征的生产设备 ( 包括但不限于管道、 管、 容器、 机器 )、 洁净室表面、 在可能存在人的建筑中的任意类型的管道、 管、 容器及机器， 及类似物。
置于水性液体中的结构的非限制性实例包括过滤器、 机器、 水下结构、 船舶及位于 海洋环境 ( 且特别是但不排除没入海洋环境 ) 的任意结构。
根据至少某些实施方式， 提供包括在合适的载体中的根据上述权利要求中任一项 的化合物的组合物。任选地， 组合物还包括染料、 抗微生物剂、 生长因子或抗炎剂中的一种 或多种。同时任选地， 组合物还可包括额外的赋形剂。
附图简述
从以下的详细描述以及附图， 将更完全地理解并领会本发明， 其中 ：
图 1 显示了 a) 属于不同结构类别的细菌自诱导物的实例 ； b) 在绿脓假单胞菌中 合成的 QS 抑制剂的实例 (11-15)。在化合物的下面列出了近似的 IC50 值 ( 来自不同的报 告基因测定 )。
图 2 显示了绿脓假单胞菌的天然自诱导物 3- 氧代 -C12-N- 酰基高丝氨酸内酯 (3- 氧代 -C12-HSL) 的结构， 及分类为异硫氰酸酯类 (1)、 溴乙酰胺类 (2) 或氯乙酰胺类 (3) 的 9 个合成类似物的非限制性实例。标记每一个反应性基团的亲电碳 ( 灰色圆圈 )。 图 3 显示了某些抑制性化合物的非限制性的示例性合成方案。DMF， 二甲基甲酰 胺； DCC， N， N′ - 二环己基碳二亚胺 ； DMAP， 4- 二甲基氨基吡啶 ； DCM， 二氯甲烷 ； TFA， 三氟乙 酸。
图 4 显 示 了 itc-11 和 itc-12 共 价 结 合 到 LasR-LBD ； a) 纯 化 的 LasR-LBD 的 SDS-PAGE， 在 3- 氧代 -C12-HSL 和九个反应性探针的存在下表达 ； b) 在 3- 氧代 -C12-HSL 的 存在下所表达的 LasR-LBD 的退卷积质谱 ； c) 在 itc-11 的存在下所表达的 LasR-LBD 的退 卷积质谱 ； d) 在 itc-12 的存在下所表达的 LasR-LBD 的退卷积质谱。插图显示在退卷积之 前的光谱数据。
图 5 报告基因测定。通过异硫氰酸酯类 (a) 和卤代乙酰胺类 (b) 的 PAO1 QS 抑制 作用 ； 通过异硫氰酸酯类 (c) 和卤代乙酰胺类 (d) 对在大肠杆菌中 ( 这个报道菌株不产生 3- 氧代 -C12-HSL) 由 50nM 3- 氧代 -C12-HSL 激活的 LasR 活性的拮抗作用。每一个点代表 三个实验的平均值 ± 标准偏差 (SD)。
图 6 以 PAO-JP2 为基础的拮抗剂 (a 和 b)、 激动剂 (c) 和部分激动剂 (d) 的测定。 在部分激动剂测定中， 曲线形状可归因于 itc-12 的共价结合模式， 如在补充信息中进一步 所描述。每一个点代表三个实验的平均值 ± 标准偏差 (SD)。
图 7 当用 50μM 4-Br-PHL、 itc-12 或 DMSO 孵育野生型绿脓假单胞菌菌株 PAO1 时， 24 小时后生物膜形成的抑制 (a) 及 36 小时后绿脓菌素产生的抑制 (b)。每一个柱代表三 个实验的平均值 ± 标准偏差 (SD)。
图 8 显示了含有硫醇的化合物的合成方法， 包括结构 -D 的化合物 ( 本文也称为 “硫醇 -11” )。
图 9 显示了硫醇 -11 和 itc-12 两者都以剂量依赖方式抑制绿脓假单胞菌的毒力。
某些示例性实施方式的描述
在至少某些实施方式中， 本发明提供细菌通讯的共价抑制剂、 及其使用方法和制 备方法。不期望缩小如所描述和所要求保护的本发明的范围或适用性， 以下的描述集中于 与式 I 和式 II 的化合物相关的那些实施方式、 它们的用途及其合成方法。
如上所述， 这些抑制剂抑制细菌 ( 包括但不限于绿脓假单胞菌 ) 的细菌通讯， 包 括群体感应。不期望被单一假设限制， 这些抑制性化合物中的至少一些可能具有充分类似 于激活 LasR 或等价蛋白的天然高丝氨酸内酯化合物 ( 比如例如对于绿脓假单胞菌， 3- 氧 代 -C12-HSL) 的结构， 因此排除以下过去的观点 ： 3- 氧代 -C12-HSL 结构的微小变化可导致 亲和力的极大降低。这些抑制性化合物被认为只存在与母体自诱导物的最小偏离， 且包含 可共价结合到 LasR 结合袋或等价蛋白中的残基的小的反应性部分。期望这样的共价探针 可有效地与结合 LasR 或等价蛋白的天然化合物竞争， 使得在接合时其对结合袋稍微改变 的占据 (occupation) 将可能导致对于将转录激活子有效地结合到其靶 DNA 来说次于最佳 的构象改变。这一类探针的使用还可严重地影响 LasR 或等价蛋白和天然配体比如 3- 氧 代 -C12-HSL 的调节与再循环。
与天然配体相比， 这些具有不同官能团和不同烷基链长度的亲电体的一些非限制 性实例 ( 异硫氰酸酯类 1， 溴乙酰胺类 2， 氯乙酰胺类 3) 如图 2 所示。众多的挑战之一是设 计这样的探针， 其具有充分反应性以与亲核的半胱氨酸反应但没有过度的反应性使得探针 在到达结合袋之前与其它残基发生反应。
式 I 和式 I 的化合物的进一步特定的非限制性实例如下所示。
结构 -1结构 -3
X ＝ Br、 Cl结构 -2结构 -4
结构 -5X ＝ Br Cl 结构 -7
结构 -6结构 -8
结构 -9结构 -11
结构 -10结构 -12
结构 -13结构 -14
结构 -16结构 -15
结构 -X
结构 -Y
结构 -Z1
结构 -Z2
结构 -Z3
对于如上所示的结构 -Y 及结构 -Z1-Z3， 选择 n3 使得对于结构 -Yn3 ＝ n-1， 对于结 构 -Z1 和结构 Z3 n3 ＝ n-3， 及对于结构 -Z2 n3 ＝ n-5 ； 其中 n 是如上所述的集合。 结构 -Q
结构 P-1
结构 -P2
结构 -P3
结构 -P4
15结构 -P5对于以上所示的结构 -P1-P5， 选择 n4 使得对于结构 -P1 及结构 -P3-P5n4 ＝ n-5， 且对于结构 -P2 n4 ＝ n-3 ； 其中 n 是如上所述的集合。CN 102482244 A说明书10/26 页
结构 -C 结构 -D
实施例
参考随附的说明书， 可更好地理解根据本发明的组合物和方法的原理和操作。
在详细解释本发明的至少一个实施方式之前， 应理解本发明不限于以下的说明书 列举的或通过实施例示例的详细的应用。本发明能够具有其他实施方式， 或能够以多种方 式实行或实现。同时， 应理解， 本文所采用的词组和术语是出于说明的目的， 且不应认为是 限制性的。
在查阅以下实施例中， 本发明的各种实施方式、 优势及新的特征对本领域的技术 人员来说将变得明显， 所述实施例无意限制。 此外， 在上文实施例中所描绘的及在下面的权 利要求部分中所要求保护的本发明的各种实施方式和方面的每一种可在以下的实施例中 找到试验支持。
实施例 1
式 I 的异硫氰酸酯类和卤代乙酰胺类化合物的合成
这 个 非 限 制 性 的 实 施 例 涉 及 异 硫 氰 酸 酯 类 itc-11、 12、 13 及 卤 代 乙 酰 胺 类 hal-11， 12， 13-Br 和 hal-11， 12， 13-Cl 的合成。 合成的图解概述如图 3A 所示 ； 图 3b 显示了 用于式 I 的异硫氰酸酯化合物的更为具体的合成 (DCM 是二氯甲烷， DMF 是二甲基甲酰胺， DCC 是 N， N′ - 二环己基碳二亚胺 ； DMAP， 4- 二甲基氨基吡啶 ) ； 图 3c 显示了式 I 的卤代乙 酰胺化合物的更为具体的合成 (DCM 是二氯甲烷， DMF 是二甲基甲酰胺， DCC 是 N， N′ - 二环 己基碳二亚胺 ； DMAP， 4- 二甲基氨基吡啶 ； TCA， 三氟乙酸 )。
通用 . 所有的化学试剂是从 Aldrich 或 Acros 购得且未进一步纯化就使用。胰蛋 白酶购自 Promega industries(V5280)。用 F254 指示剂的 TLC 铝板硅胶 60(Merck) 上进 行薄层色谱。快速色谱是在 Merck 40-63μm 硅胶上进行。化合物通过快速色谱纯化的溶 剂比以百分体积 (v/v) 报告。使用 NuPAGE Surelock Xcell 在购自 Invitrogen(NP0342) 的 NuPAGE Novex 双 - 三羟甲基氨基甲烷预制 (Bis-Tris Pre-Cast) 胶体上完成 SDS page。 使用 Ni-NTA 离心柱 (spin column)1314(QIAGEN) 来完成小规模的表达， 或使用适合于 AKTAprime 加 上 纯 化 系 统 (GE Healthcare) 的 Ni2+ 预 先 包 装 的 短 柱 (Bio-Scale， 微型 Profinity AC 短柱， 732-4612， BIO-RAD) 来完成大规模的表达。 使用 Bruker Avance DPX200 或可选择地使用 Bruker Avance DMX500 来进行 NMR 分析。谱图根据残余溶剂信号校正。 分析型 HPLC 分析是在 Surveyor Plus HPLC 系统 (Thermo Scientific) 上使用 Luna C18， 10μm(150×4.6mm) 柱以 1mL/min 的流速来进行。制备型 HPLC 通常在 Sapphire 600 装置
(ECOM) 上使用 Luna C18 柱， 10μm(250×21.20 m) 以 20mL/min 的流速来进行。所有的试 验均使用 0.1％ TFA 水溶液 ( 溶剂 A) 含有 0.1％ TFA 的 90％乙腈 ( 溶剂 B) 的线性梯度。 通过双波长 (230nm， 260nm) 的紫外检测来鉴定化合物。所有 MS 分析在具有 ESI 源的 LCQ Fleet 质谱 (Thermo Scientific) 上进行。 光谱是以正离子模式收集并通过 Xcalibur 软件 (Thermo Scientific) 分析。基于微量滴定板的生物测定使用 SpectraMax M2 分光光度计 (Molecular Devices) 来评价。按照由 Chhabra 等人 1 和 Geske 等人 2 所描述的方法的改 良 ( 通过 EDC/NHS 介导的偶联， 4- 溴苯基乙酸与高丝氨酸内酯氢溴酸盐反应 ) 分别合成化 合物 3- 氧代 -C12-SL 和 4-Br-PHL。
详细的合成方法
9- 溴壬酸 (4a)
保持 25-30℃的温度， 在 30 分钟的期间内， 向浓硝酸 (10mL， 258mmol) 溶液中加入 9- 溴壬醇 (1 克， 4.48mmol)。溶液室温搅拌 4 小时， 然后加热至 80℃并搅拌额外的 1 小时。 然后， 将反应混合物冷却至室温并小心地用 100mL 的蒸馏水稀释。用乙醚 (4×25mL) 萃取 产物， 之后合并有机相并经由硫酸镁干燥。然后过滤混合物并真空浓缩以定量地得到产物 1 4a。H-NMR(200MHz， CDCl3) ： 1.3-1.5(m ； 8H)， 1.59-1.71(m ； 2H)， 1.78-1.92(m ； 2H)， 2.36(t ； J ＝ 7.4Hz ； 2H)， 3.40(t ； J ＝ 6.8Hz ； 2H)， 9.8(m， 1H)。
9- 叠氮基壬酸 (5a)
将 9- 溴壬酸 (4a)(1.062 克， 4.48mmol) 溶解在 15mL 的干燥二氯甲烷中。然后加 入叠氮化钠 (914mg， 14mmol)， 混合物在 60℃下搅拌 6 小时。将溶液冷却并用 50mL 的二氯 甲烷稀释， 然后用 1M HCl(5×50mL)、 盐水 (2×50mL) 洗涤并经由硫酸镁干燥。然后过滤混 合物并真空浓缩以得到 90％的白色固体产物 5a。1H-NMR(200MHz， CDCl3) ： 1.3-1.5(m ； 8H)， 1.5-1.7(m ； 4H)， 2.33(t ； J ＝ 7.4Hz ； 2H)， 3.25(t ； J ＝ 6.86Hz ； 2H)。
10- 叠氮癸酸 (5b)
10- 溴癸酸 (1.125 克， 4.48mmol) 按照对产物 5a 所描述地反应以得到 91％的产物 1 5b。 H-NMR(200MHz， CDCl3) ： 1.2-1.5(m ； 10H)， 1.5-1.7(m ； 4H)， 2.35(t ； J ＝ 7.41Hz ； 2H)， 3.24(t ； J ＝ 6.81Hz ； 2H)。
11- 叠氮十一烷酸 (5c)将叠氮化钠 (2.38 克， 44.3mmol) 溶解于 7.5mL 的水中并加入到含有 15mL 二氯 甲烷的圆底烧瓶中。将烧瓶冷却至 0 ℃并滴加三氟甲磺酸酐 (1.5mL， 8.9mmol)。允许所 得到的溶液温至室温并搅拌 2 小时。用二氯甲烷 (3×8mL) 萃取水层， 用碳酸钠的饱和 溶液洗涤合并的有机相。然后， 将得到的溶液缓慢地加入到 11- 氨基十一烷酸 (892mg， 4.43mmol)、 K2CO3(915mg， 6.62mmol) 和 CuSO4· 5H2O(11mg， 0.0044mmol) 在 15mL 水和 22.5mL 甲醇中的混悬液中。混合物搅拌过夜并真空浓缩。溶液用 1MHCl 溶液酸化， 并用二氯甲 烷萃取 (4×50mL)。合并有机相， 用硫酸镁干燥， 过滤并真空浓缩， 得到收率 92 ％的 5c。 1 H-NMR(200MHz， CDCl3) ： 1.25-1.4(m ； 12H)， 1.5-1.7(m ； 4H)， 2.35(t ； J ＝ 7.43Hz ； 2H)， 3.25(t ； J ＝ 6.88Hz ； 2H)。
用于胺的 Boc- 保护的通用方法
向 含 有 水 (9mL)、 NaOH(800mg， 19.5mmol)、 叔 丁 醇 (9mL) 和 Boc 酸 酐 (4.3 克， 19.5mmol) 的圆底烧瓶中， 加入所需的胺 (18.55mmol)。 然后， 混合物室温搅拌 16 小时， 之后 用水 (20mL) 和 1M HCl(10mL) 稀释。所得到的溶液用乙酸乙酯 (1×60mL+2×20mL) 萃取， 用盐水洗涤并经由硫酸镁干燥。过滤粗混合物并真空浓缩。
9- 氨基壬酸 (8a)
将 9- 溴癸酸 (2.0052 克， 8.46mmol) 加入到含有 80mL 氢氧化铵水溶液 (25％ NH3) 的圆底烧瓶中。得到的混合物室温搅拌 24 小时， 之后减压蒸发水溶液， 以定量收率得到白 1 色 固 体 产 物 8a。 H-NMR(200MHz， CD3OD) ： 1.25-1.4(m ； 8H)， 1.5-1.7(m ； 4H)， 2.23(t ； J＝ 7.31Hz ； 2H)， 2.87(t ； J ＝ 7.45Hz ； 2H)。
10- 氨基癸酸 (8b)
将 10- 溴癸酸 (2.51 克， 10mmol) 加入到含有 80mL 氢氧化铵水溶液 (25 ％ NH3) 的圆底烧瓶中。得到的混合物室温搅拌 24 小时， 之后减压蒸发水溶液， 以定量收率得到白 1 色固体产物 8b。 H-NMR(200MHz， CD3OD) ： 1.25-1.4(m ； 10H)， 1.5-1.7(m ； 4H)， 2.15(t ； J＝ 7.38Hz ； 2H)， 2.89(t ； J ＝ 7.48Hz ； 2H)。
9-( 叔丁氧羰基氨基 ) 壬酸 (9a)
如 上 所 述， 用 Boc- 保 护 9- 氨 基 壬 酸 (8.46mmol)， 得 到 收 率 86 ％ 的 净 产 物 1 7.26mmol。 H-NMR(200MHz， CDCl3) ： 1.25-1.7(m ； 21H)， 2.30(t ； J ＝ 7.4Hz， 2H)， 3.05(t ； J ＝ 6.8Hz， 2H)， 4.53(s， 1H)。
10-( 叔丁氧羰基氨基 ) 癸酸 (9b)
如 上 所 述， 用 Boc- 保 护 10- 氨 基 癸 酸 (5.57mmol)， 得 到 收 率 77 ％ 的 净 产 物 1 4.27mmol。 H-NMR(200MHz， CDCl3) ： 1.25-1.7(m ； 23H)， 2.34(t ； J ＝ 7.33Hz， 2H)， 3.07(t ； J ＝ 6.25Hz， 2H)， 4.53(s， 1H)。
11-( 叔丁氧基酰氨基 ) 十一烷酸 (9c)
如上所述， 用 Boc- 保护 11- 氨基十一烷酸 (18.55mmol)， 得到收率 98％的净产物 1 17.4mmol。 H-NMR(200MHz， CDCl3) ： 1.25-1.7(m ； 25H)， 2.34(t ； J ＝ 7.35Hz， 2H)， 3.1(t ； J ＝ 6.2Hz， 2H)， 4.52(s， 1H)。
使用 Meldrum 酸偶联高丝氨酸内酯的通用方法
将 N-( 二甲氨基 ) 吡啶 (DMAP)(0.257 克， 2.1mmol)、 N， N- 二环己基碳二亚胺 (DCC) (0.454 克， 2.2mmol)、 期望的烷基羧酸 (2mmol) 和 Meldrum 酸 (0.288 克， 2mmol) 溶解在 20mL 的二氯甲烷中。得到的溶液搅拌过夜， 然后过滤以除去反应中所形成的 N， N- 二环己基脲。 滤液真空浓缩。将得到的残余物溶解在 DMF(15mL) 中， 并加入 α- 氨基 -γ- 丁内酯氢溴酸 盐 (0.364 克， 2mmol)。混合物室温搅拌 1 小时， 并在 60℃下搅拌额外的 4 小时。用乙酸乙 酯 50mL 稀释得到的溶液， 用饱和碳酸氢钠溶液、 1M 硫酸氢钠溶液及盐水洗涤。有机相经由 硫酸镁干燥， 过滤并真空浓缩。通过快速色谱完成进一步的纯化。
11- 叠氮基 -3- 氧代 -N-(2- 氧代四氢呋喃 -3- 基 ) 十一烷酰胺 (6a) ： 如上所述， 产物 5a 与 Meldrum 酸反应， 得到的粗混合物通过柱色谱纯化以得到收率 66％的产物 6a。 1
H-NMR(200MHz ， CDCl 3) ： 1.2-1.4(m ； 8H) ， 1.5-1.7(m ； 4H) ， 2.1-2.3(m ； 1H) ， 2.51(t ； J ＝ 7.3 ； 2H) ， 2.6-2.75(m ； 1H) ， 3.21(t ； J ＝ 6.85Hz ； 2H) ， 3.44(s ； 2H) ， 4.2-4.3(m ； 1H)， 4.4(dt ； J 1 ＝ 9Hz， J 2 ＝ 1.4Hz ； 1H)， 4.5-4.65(m ； 1H)， 7.7(d ； J ＝ 6.6Hz ；
1H)。
12- 叠氮基 -3- 氧代 -N-(2- 氧代四氢呋喃 -3- 基 ) 十二烷酰胺 (6b) ： 如上所述， 产物 5b 与 Meldrum 酸反应， 得到的粗混合物通过柱色谱纯化以得到总收率 38 ％的产物 1 6b。 H-NMR(200MHz， CDCl3) ： 1.2-1.4(m ； 10H)， 1.5-1.7(m ； 4H)， 2.1-2.3(m ； 1H)， 2.50(t ； J ＝ 7.2Hz ； 2H)， 2.6-2.75(m ； 1H)， 3.20(t ； J ＝ 6.85Hz ； 2H)， 3.44(s ； 2H)， 4.2-4.3(m ； 1H)， 4.4(dt ； J1 ＝ 9Hz， J2 ＝ 1.4Hz ； 1H)， 4.5-4.7(m ； 1H)， 7.75(d ； J ＝ 6.7 ； 1H)。13- 叠氮基 -3- 氧代 -N-(2- 氧代四氢呋喃 -3- 基 ) 十三烷酰胺 (6b) ： 如上所述， 产物 5c 与 Meldrum 酸反应， 得到的粗混合物通过柱色谱纯化以得到收率 66％的产物 6c。 1
H-NMR(200MHz ， CDCl 3) ： 1.2-1.4(m ； 12H) ， 1.5-1.7(m ； 4H) ， 2.1-2.3(m ； 1H) ， 2.52(t ； J ＝ 7.3Hz ； 2H) ， 2.6-2.8(m ； 1H) ， 3.24(t ； J ＝ 6.8Hz ； 2H) ， 3.46(s ； 2H) ， 4.2-4.3(m ； 1H)， 4.4(dt ； J1 ＝ 9Hz， J2 ＝ 1.4Hz ； 1H)， 4.5-4.65(m ； 1H)， 7.85(d ； J ＝ 6.9 ； 1H)。
11- 异硫氰基 -3- 氧代 -N-(2- 氧代四氢呋喃 -3- 基 ) 十一烷酰胺 (7a， itc-11) ：
室 温 下， 向 6a(0.24mmol) 的 甲 苯 (10mL) 溶 液 中 一 次 性 加 入 三 苯 基 膦 (69mg， 0.26mmol)。 将溶液加热至 50℃并搅拌 1 小时。 将溶液冷却至室温后， 滴加二硫化碳 (30μL， 0.48mmol)。然后， 将溶液再次加热至 50℃并搅拌额外的 2 小时。粗混合物真空浓缩并通过 1 柱色谱纯化以得到收率 93％的 7a。 H-NMR(500MHz， CDCl3) ： 1.22-1.31(m ； 6H)， 1.32-1.4(m ； 2H) ， 1.52-1.57(m ； 2H) ， 1.62-1.68(m ； 2H) ， 2.3-2.3(m ； 1H) ， 2.52(t ； J ＝ 7.3Hz ； 2H) ， 2.66-2.72(m ； 1H)， 3.45(s ； 2H)， 3.48(t ； J ＝ 6.82Hz ； 2H)， 4.22-4.28(m ； 1H)， 4.45(t ； J＝ 13 8.9Hz ； 1H)， 4.52-4.61(m ； 1H)， 7.7(d ； J ＝ 6.3 ； 1H). C-NMR(500MHz， CDCl3) ： 23.2， 26.4， 28.5， 28.7， 29.1， 29.5， 29.8， 43.7， 45.0， 48.4， 49.0， 66.0， 129.3， 166.6， 175.1， 206.4。 + + MS(ESI)m/z ： 计算值 ： [M ]341.2， 测定值 ： [M ]341.06。
12- 异硫氰基 -3- 氧代 -N-(2- 氧代四氢呋喃 -3- 基 ) 十二烷酰胺 (7b， itc-12) ：
室 温 下， 向 6b(0.24mmol) 的 10mL 甲 苯 溶 液 中 一 次 性 加 入 三 苯 基 膦 (69mg， 0.26mmol)。将溶液加热至 50 ℃并搅拌 1 小时。将溶液冷却至室温后， 滴加二硫化碳 (30μL， 0.48mmol)。然后， 将溶液再次加热至 50 ℃并搅拌额外的 2 小时。粗混合物真空 浓 缩 并 通 过 柱 色 谱 纯 化 以 得 到 收 率 66 ％ 的 7b。1H-NMR(500MHz， CDCl3) ： 1.25-1.32(m ； 8H)， 1.33-1.41(m ； 2H)， 1.53-1.59(m ； 2H)， 1.64-1.7(m ； 2H)， 2.2-2.28(m ； 1H)， 2.52(t ； J ＝ 7.3Hz ； 2H)， 2.7-2.76(m ； 1H)， 3.46(s ； 2H)， 3.49(t ； J ＝ 6.82Hz ； 2H)， 4.24-4.3(m ； 13 1H)， 4.46(t ； J ＝ 8.9Hz ； 1H)， 4.55-4.61(m ； 1H)， 7.6(d ； J ＝ 6.3Hz ； 1H). C-NMR(500MHz， CDCl 3) ： 23.2 ， 26.4 ， 28.6 ， 28.8 ， 29.1 ， 29.7 ， 29.8 ， 43.8 ， 45.0 ， 48.2 ， 49.0 ， 65.9 ， 129.3 ， + + 166.4， 174.9， 206.5。MS(ESI)m/z ： 计算值 ： [M ]355.1， 测定值 ： [M ]355.05。
13- 异硫氰基 -3- 氧代 -N-(2- 氧代四氢呋喃 -3- 基 ) 十三烷酰胺 (7c， itc-13) ：
室 温 下， 向 6c(0.24mmol) 的 10mL 甲 苯 溶 液 中 一 次 性 加 入 三 苯 基 膦 (69mg， 0.26mmol)。将溶液加热至 50 ℃并搅拌 1 小时。将溶液冷却至室温后， 滴加二硫化碳 (30μL， 0.48mmol)。然后， 将溶液再次加热至 50 ℃并搅拌另外的 2 小时。粗混合物真空 浓 缩 并 通 过 柱 色 谱 纯 化 以 得 到 收 率 57 ％ 的 7c。1H-NMR(500MHz， CDCl3) ： 1.22-1.30(m ； 10H)， 1.34-1.40(m ； 2H)， 1.51-1.58(m ； 2H)， 1.63-1.7(m ； 2H)， 2.2-2.28(m ； 1H)， 2.51(t ； J ＝ 7.35Hz ； 2H)， 2.67-2.73(m ； 1H)， 3.45(s ； 2H)， 3.48(t ； J ＝ 6.66Hz ； 2H)， 4.22-4.28(m ； 13 1H)， 4.45(t ； J ＝ 8.97Hz ； 1H)， 4.55-4.61(m ； 1H)， 7.7(d ； J ＝ 6.3Hz ； 1H). C-NMR(500MHz， CDCl 3) ： 23.2 ， 26.5 ， 28.7 ， 28.9 ， 29.2 ， 29.5 ， 29.8 ， 43.7 ， 45.0 ， 48.3 ， 49.0 ， 65.9 ， 129.3 ， + + 166.5， 175.0， 206.5。MS(ESI)m/z ： 计算值 ： [M ]367.2， 测定值 ： [M ]369.06
9， 11- 二氧代 -11-(2- 氧代四氢呋喃 -3- 基氨基 )- 十一烷基氨基甲酸叔丁酯 (10a) ： 如上所述， 产物 9a 与 Meldrum 酸反应， 得到的粗混合物通过柱色谱纯化以得到收率 1 36 ％ 的 产 物 10a。 H-NMR(200MHz， CDCl3) ： 1.24-1.32(m ； 10H)， 1.27(s ； 9H)， 1.58-1.7(m ； 2H) ， 2.10-2.29(br s ； 1H) ， 2.52(t ； J ＝ 7.31 ； 2H) ， 2.62-2.80(br s ； 1H) ， 3.07(t ； J ＝ 6.90Hz ； 2H)， 3.46(s ； 2H)， 4.23-4.34(m ； 1H)， 4.46(dt ； J1 ＝ 9.15， J2 ＝ 0.9 ； 1H)， 4.54-4.64(m ； 1H)， 7.7(d ； J ＝ 4.81 ； 1H)。
10， 12- 二氧代 -12-(2- 氧代四氢呋喃 -3 基氨基 )- 十二烷基氨基甲酸叔丁酯 (10b) ： 如上所述， 产物 9b 与 Meldrum 酸反应， 得到的粗混合物通过柱色谱纯化以得到收率 32 ％ 的 产 物 10b。1H-NMR(200MHz， CDCl3) ： 1.24-1.32(m ； 12H)， 1.43(s ； 9H)， 1.5-1.62(m ； 2H)， 2.10-2.30(br s ； 1H)， 2.52(t ； J ＝ 7.27Hz ； 2H)， 2.66-2.82(br s ； 1H)， 3.07(t ； J ＝ 6.91Hz ； 2H)， 3.46(s ； 2H)， 4.22-4.34(m ； 1H)， 4.47(dt ； J1 ＝ 9.15Hz， J2 ＝ 1.4Hz ； 1H)，
4.54-4.64(m ； 1H)， 7.6(d ； J ＝ 4.84Hz ； 1H)。
11， 13- 二氧代 -13-(2- 氧代四氢呋喃 -3- 基氨基 )- 十三烷基氨基甲酸叔丁酯 (10c) ： 如上所述， 产物 9c 与 Meldrum 酸反应， 得到的粗混合物通过柱色谱纯化以得到收率 1 59 ％的产物 10c。 H-NMR(200MHz， CDCl3) ： 1.22-1.32(m ； 14H)， 1.43(s ； 9H)， 1.53-1.62(m ； 2H)， 2.10-2.30(br s ； 1H)， 2.51(t ； J ＝ 7.27Hz ； 2H)， 2.66-2.8(br ； 1H)， 3.08(t ； J ＝6.91Hz ； 2H)， 3.45(s ； 2H)， 4.22-4.33(m ； 1H)， 4.46(dt ； J1 ＝ 9.16Hz， J2 ＝ 0.56Hz ； 1H)， 4.54-4.64(m ； 1H)， 7.7(d ； J ＝ 4.93 ； 1H)。
产物 11a-g 的通用方法 ： 将化合物 10a-c(0.705mmol) 溶解在 4mL 二氯甲烷中。 一次性加入三氟乙酸， 得到的溶液室温搅拌 20 分钟， 之后完全除去 Boc 部分 ( 通过 NMR 确 认 )。蒸发溶剂并将二氯甲烷 (5mL) 加入到得到的残余物中。通过加入三乙胺， 将 pH 调节 至～ 7， 并加入嘧啶 (62μL， 0.785mmol)。在冰浴中， 将反应混合物冷却至 0℃， 在 5 分钟内 滴加溴乙酰溴 (64μL， 0.74mmol) 的二氯甲烷 (4.5mL) 溶液 ( 对于产物 11d-g， 使用氯乙酰 氯 )。 反应混合物在冰上保持 1 小时， 之后用饱和碳酸氢钠溶液稀释 (100mL) 并用氯仿萃取 (3×30mL)。合并有机相， 用盐水洗涤， 硫酸镁干燥， 过滤并真空浓缩。通过 RP-HPLC 纯化终 产物 (11a-g)。
11a(hal-11-Br)- 1H-NMR(500MHz ， CDCl 3) ： 1.22-1.32(br ； 8H) ， 1.51(t ； J ＝ 6.81Hz ； 2H)， 1.56(t ； J ＝ 6.78Hz ； 2H)， 2.18-2.28(m ； 1H)， 2.51(t ； J ＝ 7.25Hz ； 2H)， 2.7-2.76(m， 1H)， 3.25(q ； J ＝ 6.71Hz ： 2H)， 3.45(s ； 2H)， 3.86(s ； 2H)， 4.22-4.29(m ； 1H)， 13 4.46(t， J ＝ 8.93Hz ； 1H)， 4.55-4.61(m ； 1H)， 6.49(br， 1H)， 7.67(br ； 1H). C-NMR(500MHz， CDCl 3) ： 23.20 ， 26.56 ， 28.74 ， 28.85 ， 29.04 ， 29.16 ， 29.34 ， 29.86 ， 40.20 ， 43.81 ， 48.14 ， + 49.08， 65.91， 165.38， 166.39， 174.78， 206.51.MS(ESI)m/z ： 计算值： [M ]419.3， 测定值： + [M ]419.04.
11b(hal-12-Br)- 1H-NMR(500MHz ， CDCl 3) ： 1.23-1.31(br ； 10H) ， 1.51(t ； J ＝ 7.13Hz ； 2H)， 1.55(t ； J ＝ 7.31Hz ； 2H)， 2.18-2.28(m ； 1H)， 2.51(t ； J ＝ 7.33Hz ； 2H)， 2.69-2.75(m， 1H)， 3.25(q ； J ＝ 6.75Hz ： 2H)， 3.45(s ； 2H)， 3.86(s ； 2H)， 4.23-4.29(m ； 1H)， 4.45(dt， J1 ＝ 9.08Hz， J2 ＝ 1.44Hz ； 1H)， 4.55-4.61(m ； 1H)， 6.54(br， 1H)， 7.73(d ； J ＝ 13 6.47Hz ； 1H). C-NMR(500MHz， CDCl3) ： 23.24， 26.67， 28.83， 29.02， 29.13， 29.39， 29.70， 40.21， 43.77， 48.30， 49.04， 65.93， 165.39， 166.48， 174.92， 206.47.MS(ESI)m/z ： 计算值： + + [M ]433.3， 测定值 ： [M ]435.03.
11c(hal-13-Br)- 1H-NMR(500MHz ， CDCl 3) ： 1.22-1.32(br ； 12H) ， 1.52(t ； J ＝ 7.02Hz ； 2H)， 1.57(t ； J ＝ 7.03Hz ； 2H)， 2.18-2.28(m ； 1H)， 2.52(t ； J ＝ 7.34Hz ； 2H)， 2.71-2.78(m， 1H)， 3.27(q ； J ＝ 6.75Hz ： 2H)， 3.46(s ； 2H)， 3.87(s ； 2H)， 4.23-4.30(m ； 1H)， 4.47(dt， J1 ＝ 9.07Hz， J2 ＝ 1.27Hz ； 1H)， 4.55-4.61(m ； 1H)， 6.51(br， 1H)， 7.70(d ； J ＝ 13 5.76Hz ； 1H). C-NMR(500MHz， CDCl3) ： 23.29， 26.73， 28.88， 29.11， 29.21， 29.30， 29.40， 29.82， 40.26， 43.87， 48.12， 49.06， 65.89， 165.30， 166.39， 174.79， 206.54.MS(ESI)m/z ： 计 + + 算值 ： [M ]447.1， 测定值 ： [M ]447.17.
11d(hal-11-Cl)-1H-NMR(500MHz， CDCl3) ： 1.25-1.33(br ； 10H)， 1.5-1.59(br ； 4H)， 2.19-2.29(m ； 1H)， 2.52(t ； J ＝ 7.29Hz ； 2H)， 2.70-2.76(m， 1H)， 3.28(q ； J ＝ 6.75Hz ： 2H)， 3.46(s ； 2H)， 4.04(s ； 2H)， 4.24-4.30(m ； 1H)， 4.47(t， J1 ＝ 9.00Hz ； 1H)， 4.56-4.62(m ； 13 1H)， 6.61(br， 1H)， 7.72(br ； 1H). C-NMR(500MHz， CDCl3) ： 23.17， 26.59， 28.72， 28.84， 29.03， 29.19， 29.69， 39.80， 42.67， 43.69， 48.25， 49.02， 65.88， 165.83， 166.42， 174.85， + + 206.37.MS(ESI)m/z ： 计算值 ： [M ]375.8， 测定值 ： [M ]375.07. 1
11e(hal-12-Cl)- H-NMR(500MHz， CDCl3) ： 1.22-1.30(br ； 12H)， 1.48-1.58(br ； 4H)， 2.17-2.27(m ； 1H)， 2.50(t ； J ＝ 7.35Hz ； 2H)， 2.68-2.75(m， 1H)， 3.26(q ； J ＝ 6.78Hz ：2H)， 3.44(s ； 2H)， 4.02(s ； 2H)， 4.22-4.29(m ； 1H)， 4.45(dt， J1 ＝ 9.06Hz， J2 ＝ 1.30Hz ； 1H)， 13 4.54-4.61(m ； 1H)， 6.58(br， 1H)， 7.71(d ； J ＝ 6.20Hz ； 1H). C-NMR(500MHz， CDCl3) ： 23.25， 26.71 ， 28.86 ， 29.08 ， 29.19 ， 29.70 ， 39.85 ， 42.67 ， 43.78 ， 48.22 ， 48.99 ， 65.87 ， 165.77 ， + + 166.40， 174.85， 206.46.MS(ESI)m/z ： 计算值 ： [M ]388.9， 测定值 ： [M ]389.1. 1
11g(hal-13-Cl)- H-NMR(500MHz， CDCl3) ： 1.22-1.30(br ； 12H)， 1.48-1.58(br ； 4H)， 2.17-2.27(m ； 1H)， 2.50(t ； J ＝ 7.35Hz ； 2H)， 2.68-2.75(m， 1H)， 3.26(q ； J ＝ 6.78Hz ： 2H)， 3.44(s ； 2H)， 4.02(s ； 2H)， 4.22-4.29(m ； 1H)， 4.45(dt， J1 ＝ 9.06， J2 ＝ 1.30 ； 1H)， 13 4.54-4.61(m ； 1H)， 6.58(br， 1H)， 7.71(d ； J ＝ 6.20 ； 1H). C-NMR(500MHz， CDCl3) ： 23.25， 26.71 ， 28.86 ， 29.08 ， 29.19 ， 29.70 ， 39.85 ， 42.67 ， 43.78 ， 48.22 ， 48.99 ， 65.87 ， 165.77 ， + + 166.40， 174.85， 206.46.MS(ESI)m/z ： 计算值 ： [M ]402.9， 测定值 ： [M ]403.08.。 1 13
图 3D 显示了化合物 7a( 上文 ) 的 H-NMR 和 C-NMR 的分析结果。
图 3E 显示了化合物 7b( 上文 ) 的 1H-NMR 和 13C-NMR 的分析结果。
图 3F 显示了化合物 7c( 上文 ) 的 1H-NMR 和 13C-NMR 的分析结果。
图 3G 显示了化合物 7c( 上文 ) 的 13C-DEPT-NMR 和 2D COSY NMR 的分析结果。
这些结果只作为从上文的化合物的分析中所获得的一些数据的非限制性实例显 示。 实施例 2
通过实施例 1 的化合物抑制细菌通讯
材料和方法
化学合成 . 如上所述， 进行异硫氰酸酯类 itc-11、 12、 13 及卤代乙酰胺类 hal-11、 12、 13-Br&hal-11、 12、 13-Cl 的合成。
质 谱 分 析 . 所 有 MS 分 析 都 在 具 有 ESI 源 的 LCQ Fleet 质 谱 仪 (Thermo Scientific) 上进行。光谱是以正离子模式收集并通过 Xcalibur 和 Promass 软件 (Thermo Scientific) 进行分析。对于 LC/MS 分析， 使用装配有 LunaC18， 5μm(150×4.6mm) 柱的 Surveyor Plus HPLC 系统 (Thermo Scientific)， 流速为 0.5mL/min， 使用 0.1％甲酸水溶 液 ( 溶剂 A) 和含有 0.1％甲酸的 CH3CN( 溶剂 B) 的流动相线性梯度。
LasR-LBD 的表达 . 之前发现， 在天然配体 3- 氧代 -C12-HSL 的存在或缺失的情况 下， 全长 LasR 的表达得到大部分不可溶解的蛋白 (BottomLey， MJ.， Muraglia， E.， Bazzo， R.& Carfi， A.Molecular insights into quorum sensing in the human pathogen Pseudomonas aeruginosa from the structure of the virulence regulator LasR bound 从分子的角度 to its autoinducer.( 由结合到其自诱导物的毒力调节基因 LasR 的结构， 考察人病原体绿脓假单胞菌中的群体感应 )J Biol Chem 282， 13592-600(2007))。因此， 用编码缩短的 His6- 标记的 LasR 构建体 LasR-LBD( 配体结合结构域 )， 横跨残基 Met-1 到 Lys-173p 的 pETM-11 载体转化的菌株进行表达。 将质粒转运到大肠杆菌 (E.coli)BL21 中， 且细胞在 1mL 富含 LB 的培养基中孵育 1 小时。 然后， 细胞在含有卡那霉素 (50 微克 /mL) 的 LB 琼脂板上生长。对于表达， 选择单个菌落并转移到 5mL 含有卡那霉素的富含 LB 的培养 基中并生长过夜。在天然 3- 氧代 -C12-HSL 或不同的抑制剂的存在下， 表达蛋白， 并如上所 2+ 述通过 Ni 亲和色谱纯化 (BottomLey， MJ.， Muraglia， E.， Bazzo， R.& Carfi， A.Molecular insights into quorum sensing in the human pathogen Pseudomonas aeruginosa from
the structure of the virulence regulator LasR bound to its autoinducer.J Biol Chem 282， 13592-600(2007))， 使用大规模表达的条件， 得到每升 LB 培养基～ 70mg 的纯 化蛋白， 使用小规模表达的条件， 每 50mL LB 培养基得到～ 0.5-1mg 的纯化蛋白。通过 SDS-PAGE 电泳监控纯化过程且通过质谱确认纯化蛋白的分子量。
大规模表达 ： 用 1mL 过夜生长的细胞培养基接种 1 升含有卡那霉素 (50 微克 /mL) 和 10-100 微摩尔的 3- 氧代 -C12-HSL 或抑制剂 7a-c 和 11a-g 的富含 LB 的培养基。细胞生 长至 0.4 的光密度 (OD600nm)， 之后在 21℃下通过加入 0.2mM 异丙基 1- 硫代 -β- 吡喃半乳 糖苷 (IPTG) 诱导表达， 并将额外量的配体 / 抑制剂加入到培养基中。在达到 1.4 的 OD600nm 后 ( 大约 6-8 小时 )， 细胞以 6000rpm 离心， 洗涤并重新悬浮在含有 5mM 咪唑、 300mMNaCl、 50mM Tris-HCl 的 pH 8 的裂解液中。细胞以 70％振幅超声两分钟， 进行两个循环。溶解产 2+ 物以 12000rpm 离心 30 分钟， 且上清液通过 Ni 亲和色谱纯化。
小规模的表达是按照之前的方法在 50mL 体积中进行。通过化学裂解收集细胞， 加 入 1mL 的 裂 解 液 (5mM 咪 唑， 300mM NaCl， 0.2 ％ (v/v)Triton X-100， 0.75μg/mL DNA 酶 -I， 0.05mM MgCl2， 0.01mM CaCl2， 50mMTris-HCl， pH8， 及 0.01％ (v/v) 蛋白抑制剂混合物 (cocktail))， 并在 37℃下孵育 60 分钟。通过 4000rpm 离心分离 15 分钟， 除去细胞碎片。 用 Ni-NTA 离心柱 (QIAGEN) 纯化上清液。
绿脓假单胞菌野生型菌株 (PAO1)QS 抑制测定 . 偶合到 luxCDABE 发光系统包含 含有 LasI 报告基因的质粒 pKD201 的绿脓假单胞菌 PAO1 野生型菌株 (Duan， K.& Surette， M.G.Environmental regulation of Pseudomonas aeruginosa PAO1 Las and Rhl quorum-sensing systems.( 绿脓假单胞菌 PAO1 Las 和 Rhl 群体感应系统的环境调节 )J Bacterid 189， 4827-36(2007))， 在含有 300 微克 /mL 的甲氧苄胺嘧啶的 LB 培养基中孵育 过夜。用期望浓度的抑制剂 ( 多达 1mM， 高于这个值， 观察到生长抑制 ) 准备 96 孔黑色微量 滴定板 (Greiner)， 并加入细菌以达到 0.015 的最终吸光度密度 (OD 600nm)。然后， 在 37℃下 将板培养 12 小时。在这个时间过程中， 以 10 分钟的间隔进行发光测量。然后， 将相对发光 针对所加入的抑制剂浓度作图 ； 使用 Grafit 6.0(Erithacus Software)， 计算 IC50 值。
绿脓假单胞菌 PAO-JP2 的 QS 激动剂 / 拮抗剂测定 . 偶合到 luxCDABE 发光系统 ( 参见上文 ) 的包含含有 LasI 报告基因的质粒 pKD201 的 PAO-JP2 lasI/rhlI- 删除菌株， 在含有 300 微克 /mL 的甲氧苄胺嘧啶的 LB 培养基中孵育过夜。如 PAO1 抑制试验所描述， 准备 96 孔黑色微量滴定板 (Greiner)。 然后， 将相对发光针对所加入的抑制剂浓度数作图 ； 使用 Grafit 6.0(Erithacus Software) 计算 IC50 值。对于拮抗剂实验， 使用 50nM 最终浓 度的 3- 氧代 -C12-HSL。
大肠杆菌 DH5-αLasR 激动剂 / 拮抗剂测定 . 通过测量 - 半乳糖苷酶的表达水 平， 用包含 LasR 表达载体 pJN105L 及质粒携带 PlasI-lacZ 融合物 (pSCll)(Lee， J.H.， Lequette， Y.& Greenberg， E.P.Activity of purified QscR， a Pseudomonas aeruginosa orphan quorum-sensing transcription factor.( 纯化的绿脓假单胞菌孤儿群体感应转 录因子 QscR 的活性 )Mol Microbiol 59， 602-9(2006)) 来定量群体感应抑制。细菌在含有 100 微克 /mL 氨苄青霉素和 15 微克 /mL 庆大霉素的 LB 培养基中孵育过夜。用新鲜培养基 以 1 ∶ 10 的体积比稀释培养物， 并进一步孵育直到达到 0.3 的 OD600nm。用期望浓度的抑制 剂准备 96 孔的微量滴定板 (Greiner)， 并加入细菌以达到 0.3 的最终吸光度密度 (OD600nm)。在 L-(+)- 阿拉伯糖 (4mg/mL) 的版本中诱导表达， 并在 37℃下将板孵育 4 小时 (0.45-0.5 的 46 OD600nm)。 然后根据 Miller 测定方法 ， 分析培养物的 β- 半乳糖苷酶的活性 ： 将 200mL 的等 分试样转移至干净的 96- 孔微量滴定板并记录 OD600。然后以 100mL 每孔加入到基于聚丙烯 的含有 200mL Z- 缓冲液、 10mL 氯仿和 5mL 0.1％ SDS(w/v) 的 96 孔微量滴定板中。通过吸 液彻底冲洗孔， 之后允许氯仿沉降。 将 100mL 的含水上层转移至新的 96 孔微量定量板， 并加 入 20mL 的邻硝基苯 -β-D- 吡喃半乳糖苷 (ONPG， 在 pH7 的磷酸缓冲液中的 4mg/mL)。28℃ 下， 将板孵育 35 分钟。加入 80mL 的 1M 碳酸钠溶液使反应终止， 记录 2 个波长下 (550nm， 429nm) 的吸收。使用标准方法计算 Miller 单位 (Miller， J.H.Experiments in Molecular Genetics.( 分子遗传学中的试验 )352-355(Cold Spring Harbor Laboratories( 冷泉港实 验室 )， 1972))。对于拮抗剂测定， 使用 50nM 最终浓度的 3- 氧代 -C12-HSL。
LasR-LBD 和 LasR-LBD-itc-11/12 的胰蛋白酶消化
以 1 ∶ 100 的酶∶ LasR 质量比， 将胰蛋白酶 (Promega industries) 溶解在含有 0.1％ SDS、 3mM β- 巯基乙醇和 10％乙腈的 50mM Tris 缓冲液中 (pH ＝ 8)。加入期望量的 LasR， 并且溶液在 37℃下孵育 2 小时。通过在 -20℃下存放混合物， 使胰蛋白酶失效。如下 2 所述， 通过 LC-MS 分析样品， 将期望的峰进行 MS 来测序。
与 QS 抑制剂相互作用的结构分析及建模 . 用 PyMOL 准备蛋白 - 配体成像。对于 LasR-LBD-QSI 相互作用的建模， 将氢原子加入到 LasR 中以模拟 7.4 的 pH。通过能量最小 化 (5000 最速下降步骤 ) 优化这些氢的位置和蛋白侧链的位置， 这是使用在 Macromodel 版
本 9.0(LLC software) 实施的默克分子力场 (MMFF-S)， 首先保持蛋白主链的刚性， 然后保持 AHL 结构的刚性。
结果
当表达 LasR 的细菌与式 I 的化合物的一些非限制性实例 ( 尤其是如例如图 2 所 示的式 I 的卤代乙酰胺化合物 ) 一起培养时， 可得到可溶解的 LasR-LBD( 图 4a)。重要地， 在缺乏探针或 3- 氧代 -C12-HSL 的情况下， 未观察到可溶解的 LasR-LBD， 而在大多数卤代乙 酰胺类的存在下 LasR 的过表达导致仅少量可溶解的 LasR-LBD 的出现。类似地， 当细胞与 4-Br-PHL 一起孵育时， 未观察到可溶解的 LasR( 未显示数据 )， 证实了 BottomLey 等之前的 发现 ( 参考文献在上文给出 )。
LC-MS 测量结果显示纯化的 LasR-LBD( 分子量 22， 430Da， 图 4b) 可用 itc-11( 分 子量 340Da) 和 itc-12( 分子量 itc-12354Da) 共价修饰 ( 图 4c， 4d)， 且计算质量与测量质 量 ( 分别地， 22,770Da 相对 22,770Da 及 22,784Da 相对 22,783Da) 非常一致。重要地， 即 使使用了大量过量的式 I 的示例性化合物 ( 在细菌生长培养物中使用 10-100 微摩尔， 导致 0.5-3.5 微摩尔的 LasR-LBD 表达 )， 但是未观察到多于一个单位的共价连接化合物， 表明在 所用的浓度下反应是充分特异性的。在来自用任意卤代乙酰胺类孵育的细胞的 LasR-LBD的纯化中， 未观察到这样的共价修饰。根据这些结果， 但不想被单一假设限制， 可能在卤代 乙酰胺类与 LasR 之间未发生共价反应， 意味着其抑制作用以类似于其它强非共价抑制剂 的方式介导 ( 即， 结合初期的 LasR， 然后错折叠并沉淀 )， 或发生了共价反应， 但是由于蛋白 的不溶性， 不能观察到产物。
式 I 的共价抑制性化合物与 LasR 结合袋中的 Cys79 特异性反应
在 3- 氧代 -C12-HSL 或 itc-12( 或 itc-11) 的存在下， 表达 LasR-LBD， 随后纯化 蛋白并用胰蛋白酶消化。通过 LC-MS 以单一峰 (2903.4Da) 鉴定含 Cys 的片段 (72-VDPTV SHCTQSVLPIFWEPSIYQTR-96)， 同时也鉴定了具有延长的保留时间的修饰肽及与 itc-12( 或 itc-11) 连接相对应的质量增加 ( 未显示数据 )。修饰和未修饰的 LasR-LBD 的串联 MS/MS 测量结果证实 Cys79 确实与共价探针反应 ( 未显示数据 )。
另 外， 将 两 个 点 突 变 (Cys → Ala 或 Cys → Ser) 引 入 到 天 然 蛋 白 中， 以检验 LasR-LBD 在其结合袋缺乏反应性硫醇部分时是否还能被共价修饰。正如预期的， 在与 itc-12 一起孵育的细菌中， LasR-LBD Cys79Ala 突变体过度表达时， 未检测到共价修饰 ( 未 显示数据 )。然而， 获得可溶解的蛋白， 表明突变体 LasR 能将异硫氰酸酯探针识别为底物， 诱导正确的折叠。同样， 尽管未观察到共价修饰， 在 itc-12 的存在下 Cys79Ser 突变产生了 可溶解蛋白的表达。
尤其， 当天然 LasR-LBD 在 itc-11 和 itc-12 的存在下被表达时， 共价标记通常出 现不完整， 并且产生大量可溶解、 未标记的 LasR-LBD(25-40％， 取决于条件 )， 表明可能存 在异硫氰酸酯类的可选择的结合模式， 其中反应性的碳原子位于离 Cys79 足够远的位置， 以防止反应。
LasR- 异硫氰酸酯相互作用的计算机分析
为了补充以上的试验数据， 进行了计算机构象分析并进行了模拟异硫氰酸酯类结 合到 LasR 的对接运算 (docking calculation)。作为验证对接方法的对照， 将天然 3- 氧 代 -C12-HSL 配体从其结合位点移除， 随后成功地重新对接， 即， 与晶体结构中的配体相对应 的构象在输出姿态 (output pose) 中排名非常高， 对于所有非氢原子的 然 后， 将三个异硫氰酸酯化合物对接到 LasR 结合位点。然后， 在被视为刚性体的蛋白的环境 下， 使对于每一个配体排名最高的姿态经过大量构象分析。 这一分析显示， 在不破坏极性首 基与蛋白的相互作用的情况下， 结合位点不能容纳最长的异硫氰酸酯即 itc-13。 相反， 可以 容纳较短的化合物， 即 itc-11 和 itc-12， 同时保持与蛋白的所有有利的极性相互作用。有 趣地， 观察到 itc-11 和 itc-12 的能量最小化的构象异构体聚成两个组， 只在其异硫氰酸酯 基团的取向上显著不同 ( 图 5)。一种取向代表了 Cys79 的硫原子亲核进攻的理想的预结 构 (pre-organization)， 而另一种取向对于这个反应是次佳的。对于 itc-11， 构象异构体 群体均等划分 (50/50)， 而对于 itc-12， 群体的大约 66％采用适合反应的构象。通过 Cys79 侧链针对 itc 化合物重新定向， 可提高亲核进攻 ； LasR 晶体结构表明这种旋转异构体是允 许的。
在绿脓假单胞菌中反应性探针抑制 QS
用几个报道菌株来评价共价探针的活性， 所述菌株是发光 PAO1-luxABCDE 野生 型菌株和 PAO1 lasl-rhll 双突变体 (PAO-JP2-luxABCDE)， 及大肠杆菌基于 β- 半乳糖苷 酶 -LasR 的报道菌株。几种异硫氰酸酯和溴乙酰胺强烈抑制野生型菌株的发光 ( 图 6a，6b)， 而在用 PAO-JP2- 和大肠杆菌菌株进行的测定中， 一些探针同时表现出激动剂和拮抗 剂的活性 ( 图 6c， 6d)。 为了将这个数据与所报道的已知的强 QS 抑制剂的数据进行比较， 合 成对照拮抗剂 2-(4- 溴苯基 )-N-(2- 氧代 - 四氢呋喃 -3- 基 )- 乙酰胺 (4-Br-PHL)， 该抑 制剂被 Blackwell 及其同事鉴定为活性最强的绿脓假单胞菌 QS 拮抗剂之一 (Geske， G.D.， O′ Neill， J.C.， Miller， D.M.， Mattmann， M.E.& Blackwell， H.E.Modulation of bacterial quorum sensing with synthetic ligands ： systematic evaluation of N-acylated homoserine lactones in multiple species and new insights into their mechanisms of action.( 用合成的配体调节细菌群体感应 ： 在多个物种中系统评价 N- 酰化高丝氨酸内 酯并考察其新的作用机制。)J Am Chem Soc129， 13613-25(2007))。
在基于大肠杆菌的 LasR 拮抗剂研究 ( 图 6c， 6d) 中， 获得了与 Geske 等所报道的 (3.9 微摩尔 ； 参考文献如上所给出 ) 相类似的 4-Br-PHL 的 IC50 值 (4.8±0.5 微摩尔 )。 在这 些测定所筛选的 9 个探针中， 氯乙酰胺 hal-12-Cl 显示出是最好的拮抗剂 (IC50 ： 1.1±0.1 微摩尔 )， 其次是 hal-11-Cl 和 hal-11-Br(IC50 分别为 3.1±0.1 微摩尔和 26.8±1.3 微摩 尔 )， 及三个异硫氰酸酯 itc-11-13(IC50 分别为 39.1±9.4、 29.8±0.5 和 19.2±3.9 微摩 尔 )。 出乎意料地， 在这个测定中， 溴乙酰胺类中的一个 ( 即 hal-13-Br) 在较高的浓度下显 示出 LasR 激活的有力增强， 而其较短的类似物用作强抑制剂 ； 不想被单一假设限制， 认为 hal-13Br 的作用对于这个测定是特异性的， 且在其它条件下， 这个分子将是抑制性的。
在依赖于野生型 PAO1 报道菌株的抑制测定中， 观察到所测试的类似物的极为不 同的情况。最强的发光抑制剂显示出是 itc-13 和 hal-12-Br， 其次是 itc-12、 itc-11 和 4-Br-PHL( 图 6a， 6b ； IC50 ： itc-13 ： 45.2±0.7 微摩尔， hal-12-Br ： 100±7 微摩尔 ； itc-12， 113±19 微摩尔 ； itc-11 ： ～ 300 微摩尔 )。显著地， 4-Br-PHL 在野生型 PAO1 报道菌株中 表现出比在大肠杆菌中弱得多的 LasR 拮抗作用 (IC50 ： ～ 250 微摩尔 )。
除 了 依 赖 于 大 肠 杆 菌 报 道 菌 株 的 研 究， 使 用 不 产 生 3- 氧 代 -C12-HSL 的 PAO1 突 变 体 ( 即 菌 株 PAO-JP2) 进 行 实 验 以 证 实 各 种 抑 制 剂 是 否 都 能 表 现 出 特 异 性 3- 氧 代 -C12-HSL 拮抗剂活性 ( 图 7a， 7b)。在所考虑的九个探针中， itc-13(IC50 ： 30±7 微摩 尔 )、 hal-12-Cl(70±27 微摩尔 )、 hal-12-Br(85±1 微摩尔 )、 itc-12(134±6 微摩尔 ) 及 4-Br-PHL( ～ 200 微摩尔 ) 表现出显著的拮抗作用。 在有效抑制的模式是非共价的情况下， 用不能与 Cys79 反应的 itc-12 的叠氮基等排体类似物 (azido-C12) 进行实验。这种类似 物的抑制活性显著低于 itc-12 的抑制活性 ( 未显示数据 )， 在叠氮 -C12 存在下所表达的纯 化的 LasR-LBD 的 MS 测定中， 未观察到共价标记的产物 ( 未显示数据 )。
还考虑共价 QS 抑制剂的抑制作用是否可以归因于部分的激动作用， 因为使用基 于 PAO-JP2 的报告基因时， 几种抑制剂 ( 尤其是异硫氰酸酯 ) 表现出激动作用 ( 图 7c)， 尽 管与天然自诱导物相比是显著降低的水平。随后的实验使用 itc-12， 因为这个探针在所有 的测定中始终表现出强的活性。与其它抑制剂相比时， itc-12 显示出诱导更大量的可溶解 性 LasR-LBD 的表达。最近 Blackwell 及其同事表示他们的几种抑制剂表现出典型的部分 激动模式 27。我们的数据也显示出部分激动模式 ( 图 7d)， 尽管在 itc-12 的高浓度下， 记录 了由这些其它抑制剂和 itc-12 所诱导的作用的显著差异。不想被单一假设限制， 所观察到 的不同可能通过反应性的 itc-12 探针的共价结合模式来解释。
基于异硫氰酸酯的探针抑制由 QS- 调节的活性为了评价反应性的探针是否抑制 QS- 调节的活性， 比如生物膜的形成和绿脓菌素 的生成， 在允许 24h 生物膜形成的分析的微量滴定板上和在允许 36h 绿脓菌素的生成测 定的小瓶中， 野生型绿脓假单胞菌 PAO1 菌株在 itc-12 和 4-Br-PHL( 均为 50 微摩尔 ) 或 DMSO( 作为对照 ) 的存在下孵育。如图 8a、 8b 所示， 在异硫氰酸酯探针以及已知的 QS 抑制 剂 4-Br-PHL 的存在下， 两种活性都被显著抑制。很少看见任一表型的完全抑制， 表明通过 与 QS 相关的机制的调节只是部分的。然而， 即使生物膜形成的部分减少可足以使细菌易受 宿主响应损伤， 因为不仅总的生物膜质量受到 QS 破坏的影响， 而且其结构、 其多孔性的程 度及其柔韧性和强壮性的程度也受到了影响。
讨论
用根据本发明的至少某些实施方式的一组化合物， 能够靶向绿脓假单胞菌 QS 调 节基因 LasR 并验证通过共价结合这种蛋白是否能抑制 QS。 确定了， 基于异硫氰酸酯的探针 共价地且可选择地结合在 LasR 结合袋中发现的 Cys79。而且， 通过使用几个已经很好地表 征了的报道菌株， 可以评价 9 个合成抑制剂对与绿脓假单胞菌群体感应相关的基因表达的 作用。尽管记录了在报告基因测定之间所测定的活性的差异， 但是观察到了异硫氰酸酯类 似物对 QS 的强抑制。 在溴乙酰胺 hal-12-Br 表现出强活性的同时， 观察到卤代乙酰胺类的不确定的作 用。然而， 未观察到任意卤代乙酰胺类与 LasR 之间的共价相互作用。根据这些结果， 在卤 代乙酰胺类与 LasR 之间可能未发生共价反应， 意味着其抑制作用可能是以类似于其它强 抑制剂的方式介导， 也就是通过结合天然的 LasR， 之后蛋白错折叠并沉淀。当与 4-Br-PHL 相比较时， 异硫氰酸酯类表现出整体类似的活性， 且在使用大肠杆菌报道菌株的测定中测 定出 itc-12 和 itc-13 的低微摩尔 IC50 值。可能最引人注目的是， 在基于 PAO-JP2 的拮抗 剂测定中， itc-13 与 4-Br-PHL 之间活性的较大差异。然而应注意， 通过不同菌株和报告基 因测定的使用所获得的不同化合物的 IC50 值的比较是可疑的， 因为膜的成分、 基因表达的 次级调节、 竞争配体等的不同可能都对所观察到的抑制具有较大的影响。 因此， 通过某些化 合物很难得出关于特定 QS 系统的抑制程度的绝对结论。不过， 可以将在报告基因测定中表 现出良好且特异性的抑制作用以及在野生型菌株中表现出表型抑制的化合物看作是进一 步 QS 抑制和机制研究的良好候选物。在所有测定中， 异硫氰酸酯类在低浓度下表现出显著 的 QS 抑制。就这点而论， 决定更详细地研究一个这样的化合物 itc-12 的效力和作用模式。 在用野生型 PAO1 菌株的测定中， itc-12 表现出对由 QS- 控制的毒力因子表达以及生物膜 形成的显著抑制。
由于细菌对新抗生素的耐受性增加， 已提出将细菌毒力的抑制作为可行的新的治 疗靶标。这样的策略可产生期望的结果而未诱导靶向毒力的耐药性 - 与靶向细菌生长的药 物相反。 而且， 可使用靶向 LasR( 或其在其它细菌中的同系物， 以及从结构上表征的用于 QS 分子的其它类别的受体 ) 的共价探针作为分子工具， 以为细菌群体感应的活化和去活化的 机制提供新的理解。
实施例 3
含有二硫键的化合物的合成
这个非限制性实例涉及根据本发明的至少某些实施方式的含有二硫键的化合物 的合成， 包括结构 -C 的化合物。通用合成如对于上文的实施例 1 的通用合成。合成方法的
非限制性特定实例如下所给出。
10- 巯基癸酸
硫脲 (282mg， 3.54mmol， 1.5 当量 ) 和 10- 溴癸酸 (641mg， 2.4mmol) 的混合物在 EtOH(5mL) 中回流 20 小时。 真空除去溶剂并加入 7.5M NaOH( 水溶液 )(5mL， 1.4g， 3.54mmol， 1.5 当量 )。在氮气下， 混合物在 90℃下搅拌额外的 16 小时。然后， 在冰浴上冷却并在搅拌 下缓慢加入 2MH2SO4。用 CH2Cl2(2×50mL) 萃取有机产物， 用 MgSO4 干燥， 并真空浓缩。通过 i 快速色谱纯化油状粗品 (CH2Cl2 ∶ PrOH ＝ 99 ∶ 1)， 得到中间体硫醇的白色固体 (398mg， 1 81 ％收率 ： H NMR(CDCl3， 200MHz)δ1.29-1.40(m， 10H)， 1.53-1.66(m， 4H)， 2.34(t， 7.6Hz， 2H)， 2.51(q， 7.4Hz， 2H)。
10， 10′ - 二硫烷二基双 ( 癸酸 )
将 10- 硫醇癸酸 (122mg， 0.56mmol) 滴入到 NaOH(24mg， 0.6mmol) 和 KI(29.8mg， 0.18mmol) 在 4mL 的 H2O ∶ DMF(1 ∶ 1) 中的溶液中。将 I2(75.8mg， 0.29mmol) 分次加入， 直到黄色持续， 然后加入 Na2SO3 直到发生溶液的完全褪色。得到的悬浮液用 HCl(1N) 酸化， 用 CHCl3(4×20mL) 萃取水相。用盐水洗涤有机相， MgSO4 干燥， 并真空蒸发溶剂。以定量的 1 收率得到白色固体中间体二硫化物化合物。 H NMR(CDCl3， 400MHz)δ1.25-1.40(m， 10H)， 1.55-1.70(m， 4H)， 2.33(t， 6.4Hz， 2H)， 2.66(t， 7.4Hz， 2H)。
12， 12′ - 二硫烷二基双 (3- 氧代 -N-(2- 氧代四氢呋喃 -3- 基 ) 十二烷酰胺 )
将 N-( 二甲基氨基 ) 吡啶 (DMAP)(77mg， 0.62mmol)、 N， N- 二环己基碳二亚胺 (DCC) (136mg， 0.65mmol)、 二羧酸 (121mg， 0.3mmol) 及 Meldrum 酸 (85mg， 0.6mmol) 溶解在 6mL 的 二氯甲烷中。得到的溶液搅拌过夜， 然后过滤以除去反应中形成的 N， N- 二环己基脲。滤 液真空浓缩。将得到的残余物溶解在 DMF(5mL) 中并加入 α- 氨基 -γ- 丁内酯氢溴酸盐 (109mg， 0.6mmol)。混合物室温搅拌 1 小时并在 60 ℃下搅拌额外的 4 小时。用乙酸乙酯 30mL 稀释得到的溶液， 用饱和碳酸氢钠溶液、 1M 硫酸氢钠溶液及盐水洗涤。有机相经由硫 酸镁干燥， 过滤并真空浓缩。通过快速色谱完成进一步的纯化。( 收率 33％ )。MS(ESI)m/ z： 计算值 ： [M+H+]657.32， 测定值 ： [M+H+]657.22。
实施例 4
含有硫醇的化合物的合成
这个非限制性实例涉及含有硫醇的化合物的合成， 包括结构 -D 的化合物 ( 也称为 “硫醇 -11” )。
通用合成如用于上文的实施例 1 的通用合成。合成方法如图 8 所示。合成方法的 非限制性特定实例如下所给出， 始于实施例 3 的最终化合物 ( 例如， 结构 -C)。
12- 巯基 -3- 氧代 -N-(2- 氧代四氢呋喃 -3- 基 ) 十二烷酰胺
将 12- 巯基 -3- 氧代 -N-(2- 氧代四氢呋喃 -3- 基 ) 十二烷酰胺的二聚体 (29mg， 0.04mmol) 溶解在 0.5mL 的 THF 中， 并加入在水 (0.5mL) 中的三 (2- 羧乙基 ) 膦盐酸盐 (50mg， 0.17mmol)。混合物在氮气下搅拌过夜， 用 5mL 的水稀释， 并用 Et2O(2×5mL) 萃取。 用盐水洗涤有机相， 用 MgSO4 干燥， 过滤， 浓缩并通过快速色谱纯化以得到期望的白色固体 化合物 (70％收率 )。MS(ESI)m/z ： 计算值 ： [M+H+]330.17， 测定值 ： [M+H+]330.06。
随后以类似的方法产生其中碳链少一个碳和多一个碳的分子， 唯一的改变是起始 原料不是 10- 溴癸酸 ( 如实施例 3 所述 ) 而分别是 9- 溴 - 壬酸或 11- 溴十一烷酸。实施例 5
通过硫醇 -11 和 itc-12 抑制细菌通讯
在上述的体系中， 实施例 4 的硫醇 -11 化合物与式 I 的化合物 itc-12 一起测试 ( 以上显示 )， 以验证在 PAO1-luxCDABE 中 lasl 表达的抑制。 如图 9 所示， 硫醇 -11 和 itc-12 均以剂量依赖方式抑制绿脓假单胞菌的毒力， 因此证明了这些化合物的特异性。
实施例 6
用于抗 - 生物膜的组合物的化合物的用途
在至少某些实施方式中， 根据本发明的至少某些实施方式的化合物可任选地用于 抑制或减少生物膜形成的抗 - 生物膜组合物。
这样的组合物可任选地包括在合适的载体中的根据本发明的至少某些实施方式 的化合物。 本公开内容的组合物可任选地包括额外的组分， 例如， 染料、 抗微生物剂、 生长因 子、 抗炎剂及类似物 ( 不期望提供封闭的列表 )。 在本公开内容中所用的术语 “抗微生物剂” 包括抗生素、 防腐剂、 消毒剂及其组合。 在一个实施方式中， 抗微生物剂可以是防腐剂， 比如 三氯生。
可用于组合物的抗生素类别包括四环素类如米诺环素 ； 利福霉素类如利福平 ； 大 环内酯类如红霉素 ； 青霉素类如萘夫西林 ； 头孢菌素类如头孢唑啉 ； β- 内酰胺抗生素如亚 胺培南和氨曲南 ； 氨基糖苷类如庆大霉素和妥布霉素 .RTM ； 氯霉素 ； 磺胺类如磺胺甲噁唑 ； 糖肽类如万古霉素 ； 喹诺酮类如环丙沙星 ； 夫西地酸 ； 甲氧苄啶 ； 甲硝唑 ； 克林霉素 ； 莫匹 罗星 ； 多烯类如两性霉素 B ； 唑类如氟康唑 ； 及 β- 内酰胺抑制剂如舒巴坦。
在其它实施方式中， 银盐， 包括离子呋喃酮的银盐， 由于其抗微生物性质可加入。
可用于组合物的防腐剂和消毒剂的实例包括但不限于六氯酚 ； 阳离子双胍类如氯 己定和环己定 ； 碘和载碘化合物如聚乙烯吡咯酮碘 ； 卤取代的酚类化合物如 PCMX( 即， 对氯 间二甲酚 ) 和三氯生 ( 即 2， 4， 4′ - 三氯 -2′羟基二苯基醚 ) ； 呋喃药物制剂产品如呋喃 妥英和呋喃西林 ； 乌洛托品 ； 醛类如戊二醛和甲醛 ； 及醇类。在某些实施方式中， 抗微生物 剂中的至少一种可以是防腐剂， 比如三氯生。
本公开内容的抗微生物组合物可包括各种任选的成分， 比如稳定剂、 增稠剂、 颜料 及类似物。任选的成分可以多达抗微生物组合物的总重量的约 10％的量存在。
实施例 7
用于医疗设备的化合物的用途
在至少某些实施方式中， 根据本发明的至少某些实施方式的化合物可任选地用于 医疗设备的处理以抑制生物膜的形成。医疗设备可任选地由可吸收性材料、 非吸收性材料 及其组合形成。 可用于形成医疗设备的合适的可吸收的材料包括三亚甲基碳酸酯、 己内酯、 二氧环己酮、 乙醇酸、 乳酸、 乙交酯、 丙交酯、 其均聚物、 其共聚物及其组合， 其中化合物被任 选地吸收到材料中或与材料一起形成。 可用于形成医疗设备的合适的不可吸收的材料包括 聚烯烃， 比如聚乙烯、 聚丙烯、 聚乙烯和聚丙烯的共聚物及聚乙烯和聚丙烯的混合物， 其中 化合物任选地涂覆于设备上。当然， 任意其它合适的聚合物可任选地用于医疗设备。
如果本发明的化合物与涂层一起应用于医疗设备， 适合用于涂层涂覆的任意聚合 物可根据本公开内容使用。聚合物可以是生物可吸收的或不可吸收的。在至少某些实施方 式中， 生物可吸收的形成膜的聚合物可应用于本公开内容的设备或涂层中。可应用于涂层的形成膜的聚合物是在本领域的技术人员的权限之内且包括包含源自包括例如乙交酯、 丙 交酯、 乙醇酸、 乳酸、 己内酯、 三亚甲基碳酸酯、 二氧环己酮、 二氧己内酯 (dioxepanone) 及 类似物的单体， 及均聚物、 共聚物及其组合的键的聚合物。
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将理解， 为了清楚， 在本文分开的实施方式中所描述的本发明的各种特征还可以 单一实施方式的组合来提供。 反之， 为了简洁， 在本文单个实施方式中所描述的本发明的各 种特种还可以分开的或任意合适的亚组合来提供。本领域的技术人员还将理解， 本发明不 被上文所特别显示和描述的内容所限制。相反， 本发明的范围只由以下的权利要求界定。