包含亚氨基脂质的两性脂质体 【技术领域】
本发明涉及能够克服脂蛋白介导的摄取阻滞的脂质装配体 (assembly) 或脂质 体。 更具体地， 本发明涉及脂质体或其衍生物在各极性区域的改善， 所述脂质体既包含具有 羧酸或磷酸头基的带负电荷的脂质也包含具有亚氨基或胍基的带正电荷的脂质。背景技术
脂质体作为活性成分的载体具有广泛的应用。中性的或带负电荷的脂质体通常 用于小分子药物的递送， 而带正电荷的 ( 阳离子 ) 或近期引进的两性类脂质体主要用于核 酸例如质粒或寡核苷酸的递送。用于递送核酸 “货物” 的阳离子脂质体的重要实例包括但 不 限 于 Semple 等， Nat.Biotech.(2010)28 ： 172-176 ； Akinc 等， Nat.Biotech.(2008)26 ： 561-569 ； Chien 等， Cancer Gene Ther.(2005)12 ： 321-328 ； de Fougerolles， Nat.Rev. Drug Discov.(2007)6 ： 443-453 ； Kim 等， Mol.Ther.(2006)14 ： 343-350 ； Morrissey， Nat. Biotech.(2005)23 ： 1002-1007 ； Peer， Science(2008)319 ： 627-630 和 Santel， Gene Ther. (2006)13 ： 1222-1234。两性脂质体用于递送核酸的应用已在 Andreakos 等， Arthritis Rheum.(2009)60 ： 994-1005 中证明。
两性脂质体属于较大一类的 pH 敏感性脂质体， 该类还包括 pH- 敏感性阴离子或阳 离子脂质体， 其原型已示于 Lai 等， Biochemistry(1985)24 ： 1654-1661 和 Budker 等， Nat. Biotech.(1996)14 ： 760-764 中。与 pH- 敏感性阴离子或阳离子脂质体不同， 两性脂质体为 复杂结构并且包含至少一对具有互补电荷的脂质。WO02/066012 公开了两性脂质体的关键 特征在于这些脂质体在低 pH 和中性 pH 下都具有稳定相。WO02/066012 和 WO07/107304 描 述了自低 pH 下开始使此类颗粒负荷核酸的方法。
Hafez 等 (Biophys.J.2000， 79(3)， 1438-1446) 和 WO 02/066012 提 供 了 关 于 如 何选择具有真正两性性质的脂质混合物的指导， 更具体地， 提供了关于如何确定它们的等 电点和融合开始的指导。中性脂质可以为两性脂质体的额外成分。一种或多种此类中性 脂质的引入显著增加了混合物的复杂度， 特别是由于所有成分的单独的量都可能变化。 脂质体的极大数量的可能组合显示出更快速地优化两性脂质体的实践障碍。就此而言， WO08/043575 揭示出优化两性脂质体的稳定性、 融合性 (fusogenicity) 和细胞转染的策 略， 特别是预测何种脂质体混合物在高 pH 和低 pH 下形成令人满意的稳定层状相， 同时在中 间 pH 下形成融合性的六边形相的方法。
根据上述参考文献的两性脂质体是有效的细胞转染子。然而， 观察到通过添加某 种血清而能够阻滞这些脂质体中的一些的功能， 由此可能限制了这些脂质体体内靶向某种 细胞的活性。这进一步在本文中所示的实施例 ( 例如实施例 3) 中进行了说明。
在不同血清中观察到的两性脂质体的摄取的抑制显然与近期公开的通过与脂蛋 白形成复合物而活化阳离子载体 ( 如 Akinc 等， Mo1.Ther.(2010)， 印刷之前于 5 月 11 日电 子公开， DOI ： 10.1038/mt.2010.85 所证明的， 在此情况下脂蛋白为 ApoE) 相反。
更详细的研究揭示了脂蛋白介导此抑制作用。如本文中实施例 4 所述， 根据siRNA 至受刺激细胞的功能递送表明缺乏脂蛋白的人血清不能够再抑制脂质体的摄取。 目前， 发明人已出人意料地发现某类阳离子脂质与在极性头基中具有羧基或磷酸根的阴 离子脂质的组合在存在血清的情况下在保持转染活性方面是特别有利的。当根据本文和 WO08/043575 中描述的方法配制由所述脂质混合物产生的脂质装配体或脂质体时， 经常观 察到特别的益处。
发明目的
因此， 发明的目的是提供可以在存在各种血清的情况下转染细胞的脂质装配体或 脂质体。
发明的另一个目的是提供包含此类脂质体的药物组合物， 所述脂质体作为用于将 活性剂或活性成分递送至细胞或组织的载体， 所述活性剂或活性成分包括药物例如核酸药 物， 如寡核苷酸或质粒。
发明概述
本发明提供了脂质装配体、 脂质体及其用于细胞转染的应用， 其中所述脂质装配 体包含阴离子和阳离子两性分子并且其中阳离子两性分子的至少一部分是在 pH7.5 下基 本上 (substantially) 带电荷的亚氨基脂质， 其中阴离子两性分子是羧基脂质或磷酸脂质 (phosphate lipid)， 并且此外其中阳离子和阴离子两性分子之间的电荷比例是 1.5 或更 低。 在本发明的各实施方案中， 提供了包含阴离子和阳离子两性分子的脂质装配体， 其中阳离子两性分子的至少一部分是在生理条件下基本上带电荷的亚氨基脂质， 此外其中 阴离子两性分子的至少一部分是羧基脂质， 并且其中阳离子和阴离子两性分子之间的比例 小于或等于 1.5。
在本发明的更具体的方面中， 提供了包含脂质的组合的脂质装配体， 其中所述组 合的阳离子脂质包含胍基部分且所述组合的阴离子脂质包含羧基基团， 进一步的特征在于 胍基部分和羧基基团的比例小于或等于 1.5。
在本发明的其他实施方案中， 提供了包含阴离子和阳离子两性分子的脂质装配 体， 其中阳离子两性分子的至少一部分是在生理条件下基本上带电荷的亚氨基脂质， 此外 其中阴离子两性分子的至少一部分是磷酸脂质， 并且其中阳离子两性分子和阴离子两性分 子之间的比例小于或等于 1.5。 在这样的实施方案的进一步优选的方面， 亚氨基脂质为胍基 脂质。
本发明的阳离子两性分子的带电荷的亚氨基基团的 pK 大于 7.5， 并且选自亚胺、 脒、 吡啶、 2- 氨基吡啶、 杂环氮基、 胍基部分、 异脲或硫代异脲。 在优选的实施方案中， 阳离子 脂质选自 PONA、 CHOLGUA、 GUADACA、 MPDACA 或 SAINT-18。
在优选的实施方案中， 所述阴离子脂质选自 CHEMS、 DMGS、 DOGS、 DOPA 或 POPA。
在许多实施方案中， 本发明的脂质装配体是脂质体。
在进一步的实施方案中， 脂质装配体还包括中性脂质例如胆固醇、 磷脂酰胆碱、 磷 脂酰乙醇胺或鞘磷脂或其混合物。
在优选的实施方案中， 中性脂质是胆固醇并且脂质混合物中的胆固醇的摩尔分数 在 10 摩尔％和 50 摩尔％之间。
在一些实施方案中， 脂质装配体还包括 PEG 化的脂质， 并且在这样的实施方案的
优选方面， 脂质体通过包括以下步骤的方法制备 ： (1) 在存在活性成分的情况下形成并密 封脂质体 ； 和 (2) 在所述步骤 (1) 之后单独添加 PEG- 脂质。
出人意料地发现， 可以使用外表面具有包含阴离子部分和阳离子部分的混合物的 脂质装配体或脂质体实现抗血清性转染 ； 其中阳离子部分的至少一部分是在生理条件下基 本上带电荷的亚氨基部分。在众多实施方案中， 使用 WO08/043575 中描述的方法以及本文 中更详细描述的方法配制本发明的脂质装配体和脂质体。
发明详述
脂质化学
“可带电荷的” 是指两性分子的 pK 在 pH4 至 pH8 的范围内。因此可带电荷的两性 分子可以是弱酸或碱。与带电荷的两性分子有关的 “稳定的” 是指 pK 在此范围之外的强酸 或碱， 其在 pH4 至 pH8 的范围内产生基本稳定的电荷。
本文中的 “两性” 是指包含阴离子特性和阳离子特性的带电基团的物质、 物质的混 合物或超分子复合物 ( 例如脂质体 )， 其中 ：
(1) 阳离子和阴离子两性分子中的至少一种是可带电荷的， 任选地， 两种都是可带 电荷的， 具有至少一个 pK 为 4-8 之间的带电荷基团，
(2) 阳离子电荷在 pH4 下占优势， 且
(3) 阴离子电荷在 pH8 下占优势。
结果， 物质或物质的混合物在 pH4 和 pH8 之间具有中性净电荷的等电点。由该定 义的两性特性与两性离子特性不同， 这是由于两性离子的 pK 不在上述范围内。结果， 两性 离子在一系列 pH 值下基本上为中性电荷 ； 磷脂酰胆碱和磷脂酰乙醇胺是具有两性离子特 性的中性脂质。
本文中的 “电荷比例” 或 “C/A” 是指通常分别分配至阳离子两性分子和阴离子两 性分子的额定电荷之间的比例的绝对值或模量。羧基基团的额定电荷为 “-1” ， 磷酸根部分 的额定电荷为 “-2” ， 且亚氨基化合物的额定电荷为 “+1” 。给定两性分子的混合物中或在脂 质装配体中的 “电荷比例” 随后由这些额定电荷和所考虑的化合物的各自摩尔分数的乘积 计算， 不考虑中性化合物例如胆固醇或两性离子两性分子例如 POPC 或 DOPE。
C/A ＝ (Xc1 ＊ Zc1+Xc2 ＊ Zc2+...Xcn ＊ Zcn)/(Xa1 ＊ Za1+Xa2 ＊ Za2+...Xan ＊ Zan)
其中 Xc1...n 表示给定阳离子化合物的摩尔分数， Xa1...n 表示阴离子化合物的摩尔分 数， Zc1...n 表示给定阳离子化合物的额定电荷， 且 Za1...n 表示阴离子化合物的额定电荷。
作为实例， 包含 42 摩尔％羧基脂质、 38％亚氨基脂质和 20 摩尔％中性脂质的混合 物的电荷比例或 C/A 为 38/42 ＝ 0.91。由于磷酸根基团的双倍额定电荷， 包含 27％磷酸脂 质、 43 摩尔％亚氨基脂质和 30 摩尔％中性脂质的另一种混合物的电荷比例或 C/A 为 43/54 ＝ 0.8。
由定义和实施例， 显然脂质之间的摩尔比例或 ( 为了简洁 ) 比例和电荷比例对于 单个电荷的物质而言具有相同的含义， 并且在此类物质中这些术语可以互换。 例如， 对于亚 氨基和羧基脂质的组合而言即是这种情况。相比之下， 对于磷酸脂质而言摩尔比例与电荷 比例不同， 这是由于这些化合物可具有双倍电荷， 例如在其中的磷酸根基团以初级磷酸酯 的形式存在 ( 例如在 DOPA 中 ) 的情况下。如上述计算实例所示， 摩尔比例或脂质比例则是 电荷比例的两倍。仅为了清楚的目的， 在整个说明书中优选使用术语 “电荷比例” 。本文中的 “生理 pH” 或 “生理条件” 是指约 7.5 的 pH。
在其极性头基中包含羧基部分的阴离子脂质是本领域技术人员公知的。 所述在其 极性头基中包含羧基部分的阴离子脂质的实例可以选自以下结构 (1)-(4) ：
其中 n 或 m 为 0-29 之间的整数， R1 和 R2 各自独立地选自具有 8-24 个碳原子和 0、 1 或 2 个不饱和键的烷基、 烯基或炔基部分， A、 B 或 D 各自独立地选自不存在、 -CH2-、 -CH ＝、 ＝ CH-、 -O-、 -NH-、 -C(O)-O-、 -O-C(O)-、 -C(O)-NH-、 -NH-C(O)-、 -O-C(O)-NH-、 -NH-C(O)O-、 磷酸或亚磷酸二酯， 且 “固醇” 可以是通过其 C3 原子连接的胆固醇。
以下列表提供了带有羧基基团的脂质的其他具体实例。
以下通式的胆固醇半二羧酸和胆固醇基氧基羰基氨基羧酸 ：
其中 Z 为 C 或 -NH- 且 n 为 0-29 之间的任意数字。
以上列举的包含二酰基基团的阴离子脂质的任何二烷基衍生物也在本发明的范围内。 优选的具有羧基的阴离子脂质可以选自 Chol-C1 至 Chol-C16， 包括所有其同系 物， 特别是 CHEMS。还优选的是阴离子脂质 DMGS、 DPGS、 DSGS、 DOGS、 POGS。
在其极性头基中包含磷酸部分的阴离子脂质是本领域技术人员公知的。 磷酸脂质 的实例可以选自以下结构 (P1)-(P4) ：
其中 n 或 m 为 0-29 之间的整数， R1 和 R2 各自独立地选自具有 8-24 个碳原子和 0、 1 或 2 个不饱和键的烷基、 烯基或炔基部分， A、 B 或 D 各自独立地选自不存在、 -CH2-、 -CH ＝、 ＝ CH-、 -O-、 -NH-、 -C(O)-O-、 -O-C(O)-、 -C(O)-NH-、 -NH-C(O)-、 -O-C(O)-NH- 或 -NH-C(O) -O-， 且 “固醇” 可以是通过其 C3 原子连接的胆固醇。
以下列表提供了带有磷脂酸基团的脂质的其他具体实例。
其中的 R1 具有 16-24 个碳原子的十六烷基磷酸酯同系物。
可以用于本发明的阳离子脂质是在其极性头基中包含亚氨基部分的两性分子， 其 中所述亚氨基部分在生理条件下基本上带电荷。 因此， 在优选的实施方案中， 此官能基团的 pK 值为 7.5 或更高， 在进一步优选的形式中， 亚氨基基团的 pK 值为 8.5 或更高。具有所述 特性的亚氨基部分可以自身为亚胺或为较大的官能基团例如脒、 吡啶、 2- 氨基吡啶、 杂环氮 基、 胍基官能团、 异脲和异硫脲等的一部分。
以下结构 (11)...(1113) 表示此类亚氨基部分的一些具体实例 ：
其中两性脂质分子的 L 表示极性区域， 并且任选地表示连接子或间隔部分。 L 的实 例可以进一步选自以下通式 (11)-(15)
其中 n 或 m 表示 0-29 之间的整数， R1 和 R2 各自独立地选自具有 8-24 个碳原子和 0、 1 或 2 个不饱和键的烷基、 烯基或炔基部分， A、 B 或 D 各自独立地选自不存在、 -CH2-、 -CH ＝、 ＝ CH-、 -O-、 -NH-、 -C(O)-O-、 -O-C(O)-、 -C(O)-NH-、 -NH-C(O)-、 -O-C(O)-NH-- 或 -NH-C(O )-O-， 且 “固醇” 可以是通过其 C3 原子连接的胆固醇。
下表 1 提供了包含 (11)-(1113) 部分的亚氨基的 pK 的计算值或数据库值。对于 季胺化的亚氨基部分， 引入 99 的假定值， 仅用于凸显该事实。
表1： 11-1113 部分的 pK 值
由此处所示数据可以明显地看出， 结构 11-1113 中的大多数包含 pK 大于 7.5 或甚 至大于 8.5 的优选的亚氨基部分。
pK 值可获自公开的数据库。 可选地， 公开领域中有能够计算、 预测或推算此类数值 的专业软件， 例如 ACD/Labs v7(Advanced Chemistry Development， Ontario， Canada) 等。
以上分析的亚氨基部分例示了本发明的教导， 但本发明并不局限于具体的实施 例。 当然可以改变取代基的位置， 当使用环体系例如吡咯或吡啶来实践本发明时特别如此。 也可以使用芳香残基或芳基部分来代替整个 11-1113 中使用的脂肪族基团。以下化合物 (A1) 至 (A21) 的列表提供了用于进一步例示所述修饰的一些实例， 其中 L 如上文所定义。
以下表 2 提供了包含 (A1) 至 (A21) 部分的亚氨基的 pK 的计算值或数据库值。对 于季胺化的亚氨基部分， 引入 99 的假定值， 仅用于凸显该事实。
表2： (A1) 至 (A21) 结构的 pK 值
结构 A1 A2 A3 A4 A5 A6 A7 A8 A9 A10 原子 环 环 环 环 环 亚氨基 亚氨基 亚氨基 亚氨基 亚氨基 pK 7,29 99 99 7,06 4,74 12,15 3,07 14,24 14,18 12,52 淀粉溶素 淀粉溶素 -0,72 -3,12 淀粉溶素 淀粉溶素 -4,95 -12,14 环 环 99 -1,31 外 外 -6,76 -6,91 原子 外 pK -7,16 原子 pK16CN 102481256 A A11 A12 A13 A14 A15 A16 A17 A18 A19 A20 A21
亚氨基 亚氨基 亚氨基 亚氨基 亚氨基 亚氨基 亚氨基 亚氨基 亚氨基 亚氨基 亚氨基 14,18 14,25 12,31 13,75 10,98 7,96 9,44 9,78 8,52 11,97 12,5说明书环14/41 页 -1,27淀粉溶素 淀粉溶素 淀粉溶素 淀粉溶素-0,71 -5 -0,76 -5,43淀粉溶素 淀粉溶素 外 淀粉溶素 淀粉溶素-8,39 0,95 -1,86 -6,3 -3,6上表 2 中所示的结构中的许多结构也包含 pK 大于 7.5 或甚至大于 8.5 的优选亚氨基。 如上所述， 带电荷的亚氨基部分可以与脂质锚定点或疏水部分组合， 以产生脂质 或两性分子， 所述脂质或两性分子能够自身形成脂质双层或能够整合入由其他脂质或两 性分子形成的脂质膜中。在一些实施方案中， 具体的脂质或两性分子选自如下所示的实例 L1-L17 ：
其中 R1 和 R2 各自独立地选自具有 8-24 个碳原子和 0、 1 或 2 个不饱和键的烷基、 烯基或炔基部分。
这 些 脂 质 中 的 一 些 已 在 早 前 示 于 文 献 中， 例 如 WO91/16024、 WO97/43363、 WO98/05678、 WO01/55098、 WO2008/137758( 氨基酸脂质 )、 EP 0685234( 基于二酰基甘油 )、 US 5965434( 同样基于二酰基甘油 ) 中的胍基脂质或 US 6726894 中的吡啶嗡化合物。此 外， 如 WO29086558 中所证明的或结构 (15) 中所例示的， 也可能使用可选的脂质主链， 例如 包含二氧戊环连接子片段同时保持各头基的官能性的那些。
脂质混合物和任选的其他脂质
本发明公开了包含阴离子两性分子和阳离子两性分子的脂质混合物 ； 其中阳离子 两性分子的至少一部分是在生理条件下基本上带电荷的亚氨基脂质， 并且此外其中阴离子 两性分子的至少一部分是羧基脂质或磷酸脂质。
阳离子脂质和阴离子脂质共同存在是本发明的核心特征， 其中在阳离子脂质的极 性头基中包含带电荷的亚氨基部分， 在阴离子脂质的头基中包含羧基或磷酸根官能团。 即，
实质上缺少这些要素中的一个要素的脂质体或脂质装配体不包含在本发明的实践中。阳 离子亚氨基脂质和阴离子脂质可以以不同的比例存在 ； 所述比例在本文中全文以 “电荷比 例” ( 阳离子∶阴离子比例， C/A， 参见定义 ) 表征。在许多实施方案中， C/A 比例大于 0.33， 在优选的实施方案中， 该比例大于 0.5， 并且在一些实施方案中， 该比例等于或大于 0.66。 在所述实施方案的优选方面， C/A 等于或小于 3， 在进一步优选的方面， 所述比例等于或小 于 2， 并且在特别优选的方面， 所述比例等于或小于 1.5。
在所述实施方案的许多方面， 所得脂质混合物都具有两性特性。pK 大于 7.5 甚至 更高并由此优选 pK 为 8.5 或更高的亚氨基脂质在生理条件下是基本上带电荷的， 它们的实 际电荷变得与其额定电荷接近， 并最终与额定电荷相同。 通常羧基脂质的 pK 为 4.5-6， 因此 这些脂质在生理 pH 下也带电荷。因此， 在 C/A 小于 1 时， 亚氨基脂质和羧基脂质两者的混 合物在生理 pH 下带净负电荷， 在 C/A ＝ 1 时净电荷为 0， 并且在 C/A ＞ 1 时净电荷为正。
在低 pH 下， 阴离子电荷在羧基脂质的 pK 附近消失， 这使得 C/A ＜ 1 的脂质混合物 首先为中性并随后带正电。电荷反转是 C/A ＜ 1 的特性， 并且定义了两性特性。C/A ＝ 1 或 C/A ＞ 1 的脂质混合物在低 pH 下同样经历负电荷的减少， 但没有电荷反转。 然而， 应注意的 是 C/A 和所得到的脂质装配体的两性特性之间的关系暗示了带电荷的部分跨越给定双层 的在统计学上基本上相等的分布。这意味着膜的内叶 (1eaflet) 和外叶必然具有相同的带 电荷脂质的组成， 以保持这些计算的完全有效性。如实施例 9 所示， 并非总是如此， 并且甚 至使用 C/A ＞ 1 的脂质混合物也能够形成两性特性的脂质体。然而， 此处公开的膜组成和 两性特性之间的关系为脂质混合物的选择提供了良好的指导。
脂质混合物还可以包含其他的阳离子、 阴离子、 中性 / 两性离子或官能化的脂质。 其他的阳离子脂质可以是已知的成分例如 DOTAP、 DODAP 和 DC-Chol 等。其他的阴离子脂质 可以选自带负电荷的磷脂例如磷脂酰甘油、 磷脂酸、 二 - 十六烷基磷酸和心磷脂等。中性或 两性离子脂质为胆固醇、 磷脂酰乙醇胺、 磷脂酰胆碱和鞘磷脂等。
在优选的实施方案中， 中性脂质为胆固醇。其他优选的为其中脂质混合物包含 10 摩尔％ -50 摩尔％胆固醇的变体， 甚至更优选的为包含约 20 摩尔％ -40 摩尔％胆固醇的变 体。
重要的一类官能化的脂质是包含聚合物延伸例如聚乙二醇 (PEG- 脂质 ) 的那些。 现有技术中已知众多 PEG 化的脂质， 主要差异可以在以下方面找到 ： (i)PEG 链的大小和支 化程度， (ii)PEG 和分子的膜插入部分之间的连接子基团的类型， 和 (iii)PEG 化脂质的疏 水性膜插入区域的大小。PEG 化的其他方面是 ： (iv) 脂质装配体中的修饰的密度和 (v) 它 们在此类脂质装配体中的定向。
在方面 (i) 的许多实施方案中， PEG 片段的分子量在 500Da 和 5000Da 之间， 在更 优选的实施方案中， 此片断的分子量为约 700Da-2500Da， 甚至更优选的是约 2000Da 的 PEG 片段。在许多这样的实施方案中， PEG 部分为单链的、 未支化的 PEG。
方面 (ii) 的典型实施方案为磷酸乙醇胺部分、 二酰基甘油部分或神经酰胺的极 性头基。
方面 (iii) 中表征的疏水性膜插入区域的大小是此类分子的其他重要特征， 原 因是其决定 PEG 脂质在双层中的膜停留时间。作为实例， 具有短的疏水区域的 PEG 化脂 质例如 DMPE-PEG2000( 二肉豆蔻酰基磷脂酰乙醇胺 -PEG 缀合物， 其中 PEG 链的分子量为2000Da) 在若干秒内自给定的膜扩散， 而 DSPE-PEG2000 同系物在双层中停留多个小时或多 天 ( 参见 Silvius， J.R. 和 Zuckermann， M.J.(1993)Biochemistry 32， 3153-3161 或 Webb， M.S. 等 (1988)， Biochim Biophys Acta 1372 ： 272-282 或 Wheeler 等 (1999)， Gene Ther6 ： 271-281)。
PEG 化同时为脂质体， 特别是如 US6,287,591 中所示的阳离子脂质体与阴离子核 酸货物的组合提供了胶性稳定性， 但也损害了脂质体的细胞摄取和 / 或内体 ( 参见 Shi. F. 等 (2002)， Biochem.J.366 ： 333-341)。瞬时 PEG 化是现有技术， 并且同时满足颗粒的胶 性稳定性和活性的需要。
PEG 化的其他方面 (iv) 是此类修饰的密度， 其应在脂质混合物的 0.5 摩尔％ -10 摩尔％之间， 在优选的实施方案中， PEG 化的程度为约 1 摩尔％ -4 摩尔％。
由于给定双层的 PEG 化稳定了脂质装配体的层状相并损害与六边形相的形成有 关的脂质融合， 因此必须使双层中残留的 PEG 部分的量最小。这可以通过所需 PEG 脂质量 的滴定而实现。因此， 在方面 (v) 的一些实施方案中， 脂质体在全部两个膜叶上均被 PEG 化 并且使 PEG 的量最小化。在另一个变体中， 尽可能完全地除去 PEG。尽管这对于与外部双层 相连的 PEG 脂质而言容易实现， 但对于与脂质结构的内部连接的 PEG 脂质而言扩散是基本 不可能的。因此本发明的方面 (v) 的优选的实施方案是提供包含带电荷的亚氨基和羧基或 进一步包含 PEG 化脂质的磷酸脂质的脂质体， 其中所述 PEG 化的脂质基本上位于外表面上。
此类脂质体的特征在于它们的制备方法， 其中脂质体在第一步骤中形成， 且该步 骤还包括 “货物” 分子的包封。随后， 在第二步骤中通过例如将 PEG 化脂质的胶束溶液添加 至脂质体悬浮液中， 而将 PEG- 脂质插入预先制作的脂质体的外部双层中。在此类方法的具 体实施方案中， 通过将核酸的水溶液与脂质的醇溶液混合而形成隔离 (sequester) 核酸的 脂质体。捕获核酸的脂质体自发形成， 并且在随后的步骤中加入 PEG 化的脂质。
特别有利地， 可以使用两性脂质体实施此方法， 这是由于这些脂质体已具有胶性 稳定性， 并且脂质体形成和 PEG 化之间的时间因素较不重要。包封核酸的两性脂质体的制 备公开于 WO 02/066012， 其继续申请 US2007/0252295 中， 或另外公开于 WO 07/107304 中。
在优选的实施方案中， 通过提供所需量的 PEG 脂质以及中和缓冲剂而将包含亚氨 基和羧基或磷酸脂质的两性脂质体在其外表面 PEG 化。为此， 可以将 PEG 脂质溶于中和缓 冲剂中。在另一个实施方案中， 形成所述脂质体并中和， 并且在 0.1 秒至若干天的时间间隔 之后单独添加 PEG 脂质。在另一个实施方案中， 形成脂质体并中和， 将脂质体悬浮液进一步 浓缩， 并在物质浓缩后添加 PEG 脂质。在另一个实施方案中， 形成脂质体并中和和浓缩， 除 去未包封的核酸， 任选地替换用于脂质体悬浮液的缓冲剂， 并随后添加 PEG 脂质。总之， 可 以在脂质体形成和闭合后的任何时间添加 PEG 脂质。
在另一个实施方案中， 包含亚氨基和羧基或磷酸脂质的脂质体具有 pH- 敏感性阳 离子特性， 并且遵循上文列举的步骤通过在所述脂质体形成和闭合时提供所需量的 PEG 脂 质而在其外表面 PEG 化。 由于在核酸存在的情况下 pH- 敏感性脂质体更易于形成聚集体， 因 此优选快速 PEG 化， 并且在脂质体闭合时 ( 例如在其产生后 0.1 秒 -1 分钟 ) 立即加入 PEG 脂质。
与产生在其外表面上基本 PEG 化的脂质体产物的上述方法相反， 在脂质体的实际 形成期间存在 PEG 化脂质 ； 其在初生的结构闭合之前， 生成不同的产物。 尽管尚未获得结构数据， 但本领域技术人员应预期在这种情况下大量的 PEG 部分也停留在膜的内叶中。这与 具有进入初生脂质体的全部两叶的通路的核酸 “货物” 的情况类似， 并且一旦这些脂质体已 闭合， 即可在脂质体内部检测到大部分核酸。
脂质装配体
本文提及的成分可以以本领域中已知的多种结构装配。 这些结构可以是包含一个 或多个单独的双层的脂质体、 其它超分子脂质装配体或具有提供水相的相当大的内部体积 的囊泡。其也可以是乳滴或 lipoplex 装配体形式的结构， 在许多实施方案中后者包含脂质 和核酸的静电复合物。在优选的实施方案中， 这些结构是脂质体或囊泡。在许多实施方案 中， 这些脂质体或囊泡具有相当大的含水内部。 在本发明的许多方面， 活性药物成分与脂质 装配体复合， 被脂质装配体包封、 隔离或与脂质装配体结合。 由于大量可用的亚氨基和羧基 或磷酸脂质和其他脂质， 确实存在极大量的可能有用的组合， 由此产生从这些变体中选择 和优化的进一步需要。WO08/043575 给出了用于优化复合物脂质装配体， 特别是脂质双层 的具体指导并提供了如本文另外详细讨论的方法。简而言之， WO08/043575 中的教导证明 两性脂质混合物在酸性和中性 pH 条件下都形成稳定的双层， 然而， 由这些脂质混合物形成 的双层可经历相变并且在其等电点下 ( 通常是在微酸性的条件下 ) 融合。WO08/043575 公 开了将中等大小的或小的脂质头基用于带电荷的脂质成分的用途。WO08/043575 还教导了 使用大的缓冲剂离子或大体积的缓冲剂离子以在装载步骤期间在低 pH 下稳定层状相， 以 及使用大的或大体积的缓冲剂离子以在储存期间在中性 pH 下稳定层状相。特别地， 参考 WO08/043575 的第 44-57 页， 其重点公开了上述基本要素。 所述参考文献还公开了使用带有 小的头基的中性脂质以使融合活性最大化。 通常用于经改善的融合的中性脂质为胆固醇或 DOPE。对于中性脂质的具体考虑和优化规则另外示于 WO09/047006 中， 特别是第 63 页 - 第 70 页。
总而言之， WO08/043575 或 WO09/047006( 在本文中一起被称为 “参考文献” ) 提供 了有关脂质装配体的优化的合理指导。所述参考文献不限于两性脂质体， 但为脂质装配体 的结构 - 活性关系提供了综合模型。
本发明由于提供了用于配制能够避免与脂蛋白或其他血清成分的细胞结合、 相互 作用或竞争的脂质体的优化方法， 而代表了现有技术的进步。尽管所述参考文献教导的方 法提供了关于脂质装配体的必需融合性的信息， 但其未公开关于脂质体的细胞结合的预测 的信息。
因此， 本发明的目的是提供通过所述参考文献中公开的方法同时组合了当使用在 生理条件下基本上带电荷的亚氨基脂质与具有羧基或磷酸根的阴离子脂质 ( 即带负电荷 的部分 ) 的组合时观察到的出人意料的性质而配制的脂质装配体、 脂质混合物和脂质体。 不期望受理论的限制， 本文配制的所述新型组合物可以更好地促进脂蛋白样细胞结合和摄 取——本领域中不知道的特征。
本文中描述的脂质混合物可以具有两性或 pH- 敏感性阳离子性质， 这两个性质通 常由形成其的脂质赋予脂质装配体或脂质体。可容易地如 WO02/066012 所述预测电荷性 质， 用于脂质朝向脂质膜或双层的两叶的对称分布。 然而， 在一些情况下最外叶的脂质分布 可能与装配体的其他部分不同。宏观地， 如实施例 9 和图 1 中所证明的， C/A 略大于 1 且包 含带电荷的亚氨基脂质以及羧基或磷酸脂质的组合的脂质混合物可能因此仍然形成具有两性特性的脂质体。
出于计算机优化和预测的目的， 认为本发明的 C/A ＜ 1 的脂质混合物是两性的并 且可以形成根据参考文献的分类被归类于 “两性子 (amphoter)I” 混合物的脂质装配体。在 其他实施方案中， 使用 C/A ＝ 1 或 C/A ＞ 1 的脂质混合物 ； 这些是 pH- 敏感性阳离子脂质混 合物， 其电荷在生理 pH 下为中性或阳离子性的， 并且随着 pH 降低而变得更阳离子性。所述 实施方案的 pH- 敏感性阳离子混合物不再具有等电点， 这是由于其两性对应物即是如此。 然而， 参考文献中提供的结构 - 活性关系是可用的， 这是由于其提供了对于脂质装配体和 溶质以及离子 ( 与其电荷无关 ) 的组合的相行为的通用理解。
为了说明， 本发明的脂质混合物包含一种或多种具有在生理 pH 下基本上带电荷 的亚氨基基团的阳离子脂质， 还包含一个或多个具有羧基或磷酸根基团的阴离子脂质， 任 选地还包含中性脂质。
脂质体的两性特性还具有其他益处。 此类脂质体或脂质装配体的负表面电荷大大 地改善了脂质体在悬浮液中的胶性稳定性。 这在与易于与阳离子脂质体生成聚集体的多阴 离子 “货物” ( 例如核酸 ) 的组合中是特别重要的。
当体内施用脂质体时， 两性脂质装配体或脂质体的阴性至中性表面电荷也是有 利的， 在此其防止了利用阳离子脂质体观察到的在内皮上的非特异性吸收或与血清成分 形成聚集体 ( 关于阳离子脂质体的内皮吸收参见 Santel 等， (2006)， Gene Therapy 13 ： 1222-1234， 或者关于防止与两性脂质体形成聚集体参见 Andreakos 等， (2009)， Arthritis and Rheumatism， 60 ： 994-1005)。 因此， 在优选的实施方案中， 本发明的脂质体具有两性特性。在该组中， 避免极低 百分比的阳离子成分以保持颗粒对多阴离子 “货物” 例如核酸的有效装载是有利的。在其 他优选的实施方案中， C/A 大于 0.5。
当全身施用， 即施用至血流中时， 脂质体在体内经历某种分布。 通常的靶点是肝和 脾， 但是也包括循环的吞噬细胞。脂质体也与围绕血管的内皮接触并可转染这些细胞。脂 质体在发炎部位和肿瘤中的聚集具有特别的治疗相关性。
技术人员应知晓将颗粒的分布引向一个或另一个部位的方法。公知具有约 150nm 或更小的小直径的脂质体可以穿透肝内皮， 由此获得进入至肝细胞和肝实质的其他细胞的 通道。在靶向肝细胞受到治疗关注的情况下， 本发明的脂质体的直径可以为 150nm 或更小， 在优选的实施方案中， 脂质体的直径可以小于 120nm。
还公知直径为 100nm 或更大的颗粒很好地被吞噬细胞识别。因此， 在巨噬细胞或 树突细胞构成受关注的靶的实施方案中， 本发明的脂质体为 120nm 或更大。在一些实施方 案中， 这些脂质体为 150nm 或更大。在其他实施方案中， 这些脂质体的大小可以为 250nm 或 大至 400nm。
还描述了表面电荷可影响循环时间， 因此影响脂质体的生物分布， 并且已明确证 明 PEG 化减少了表面电荷并导致脂质体的循环延长。通常认为循环延长使向肿瘤的分布最 大化。因此， 在其中肿瘤构成受关注的靶的方面， 本发明的脂质体具有小的净表面电荷， 并 且其特征在于 0.67-1.5 的 C/A。在此类应用的优选实施方案中， 形成所述脂质体的脂质混 合物的 C/A 为 0.8-1.25。同样， 靶向肿瘤的脂质体为小体积。在优选的实施方案中， 此类脂 质体小于 150nm， 在进一步优选的实施方案中， 脂质体小于 120nm。在一些实施方案中， 脂质
体还包括 PEG 脂质。
用于本发明脂质体的 “货物”
本发明的脂质体或脂质装配体可以隔离或包封至少一种活性剂。 所述活性剂可以 包括药物。在一些实施方案中， 所述活性剂可以包含一种或多种核酸。在优选的实施方案 中， 活性成分由核酸组成。
不限于此类应用， 本发明中所述的脂质体或脂质装配体非常适于用作基于核酸的 药物 ( 例如寡核苷酸、 多核苷酸和 DNA 质粒 ) 的载体。这些药物被归类为编码一个或多个 特定蛋白质、 多肽或 RNA 序列的核酸， 以及能够特定地调节蛋白质表达水平或特别通过干 扰剪接和人工截短而影响蛋白质结构的寡核苷酸。
因此， 在本发明的一些实施方案中， 基于核酸的治疗剂可包含能够在脊椎动物细 胞中被转录为一种或多种 RNA 的核酸， 所述 RNA 可以为 mRNA、 shRNA、 miRNA 或核酶， 其中所 述 mRNA 编码一种或多种蛋白或多肽。此类核酸治疗剂可以为环状 DNA 质粒、 线性 DNA 构建 体， 如 WO98/21322 或 DE19753182 中公开的 MIDGE 载体 ( 免疫学上最低定义的基因表达 )， 或准备用于翻译的 mRNA( 例如 EP 1392341)。
在本发明的其他实施方案中， 可以使用能够靶向现有的细胞内核酸或蛋白的寡核 苷酸。 所述核酸可以为特定基因编码， 以使所述寡核苷酸适于减弱或调节转录， 改变转录物 的加工， 或干扰蛋白质的表达。术语 “靶核酸” 包括编码具体基因的 DNA， 以及源自此类 DNA 的所有 RNA( 前 -mRNA 或 mRNA)。 靶核酸和靶向此类序列的一种或多种寡核苷酸之间的特定 杂交可能导致蛋白表达的抑制或调节。为了实现此类特定靶向， 寡核苷酸应适当地包含与 靶核酸的序列基本互补的核苷酸的连续延伸段。
可以使用多种化学物质和拓扑物质构建满足上述标准的寡核苷酸。 所述寡核苷酸 可以包含天然存在的或经修饰的核苷酸， 包括但不限于磷酸酯或磷硫酯形式的 DNA、 RNA、 锁 核酸 (LNA)、 未锁核酸 (UNA)、 2′ O- 甲基 RNA(2′ Ome)、 2′ O- 甲氧基乙基 RNA(2′ MOE) 或 吗啉代类 (Morpholinos) 或肽核酸 (PNA)。寡核苷酸可以为单链的或双链的。
寡核苷酸为具有 8-60 个电荷的多阴离子结构。在大多数情况下， 这些结构是包含 核苷酸的聚合物。本发明不限于寡核苷酸的具体作用机制， 并且对所述机制的理解对于实 施本发明而言不是必需的。寡核苷酸的作用机制可能不同， 并且其中可能包括对剪接、 转 录、 核 - 细胞质转运和翻译的特别作用。
在本发明优选的实施方案中， 可以使用单链寡核苷酸， 包括但不限于基于 DNA 的 寡核苷酸、 锁核酸和 2′ - 修饰的寡核苷酸等， 通常被认为是反义寡核苷酸。主链或碱基或 糖修饰可以包括但不限于磷硫酯 DNA(PTO)、 2′ O- 甲基 RNA(2′ Ome)、 2′氟 RNA(2′ F)、 2′ O- 甲氧基乙基 -RNA(2′ MOE)、 肽核酸 (PNA)、 N3′ -P5′氨基磷酸酯 (phosphoamidate， NP)、 2 ′氟阿拉伯核酸 (FANA)、 锁核酸 (LNA)、 未锁核酸 (UNA)、 吗啉氨基磷酸酯 ( 吗啉代 类 )、 环己烯核酸 (CeNA) 和三环 DNA(tcDNA) 等。 此外， 混合的化学物质是本领域中已知的， 由多于一种核酸种类以共聚物、 嵌段共聚物或 gapmer 的形式或以其他排列构建。
除了上述寡核苷酸以外， 也可以使用包含互补序列基序的双链化 RNA 分子抑制蛋 白表达。此类 RNA 分子在本领域被称为 siRNA 分子 ( 例如 WO99/32619 或 WO02/055693)。 其他 siRNA 包括单链 siRNA 或具有一个不连续的链的双链化 siRNA。 同样， 各种化学物质适 于此类寡核苷酸。此外， DNA/RNA 杂交体系是本领域中已知的。siRNA 的其他变体包括其中的两个较小的链杂交至一个共同的较长链上的三链结构， 即所谓的在其体系结构中具有切 口或间隙的部分双链 (meroduplex) 或 sisiRNA。
在本发明的另一个实施方案中， 可以使用诱饵寡核苷酸。这些双链 DNA 分子及其 化学修饰物不靶向核酸， 而是靶向转录因子。 这意味着诱饵寡核苷酸结合序列特异性的 DNA 结合蛋白并干扰转录 ( 例如 Cho-Chung 等， Curr.Opin.Mol.Ther.， 1999)。
在发明的另一个实施方案中， 可以使用可通过在生理条件下杂交至基因的启动子 区域而影响转录的寡核苷酸。同样， 各种化学物质可以适于此类寡核苷酸。
在发明的另一个可选方案中， 可以使用 DNAzyme。DNAzyme 是具有酶活性的单链寡 核苷酸及其化学修饰物。被称为 “10-23” 型的典型 DNA 酶能够在生理条件下在特异性位点 切割单链 RNA。DNAzyme 的 10-23 型具有 15 个高度保守的脱氧核苷酸的催化域， 侧翼为与 RNA 上的靶序列互补的两个底物识别域。靶 mRNA 的切割可能导致其受到破坏， 且 DNAzyme 回收并切割多种底物。
在发明的另一个实施方案中， 可以使用核酶。核酶是具有酶活性的单链寡核糖核 苷酸及其化学修饰物。它们可以被操作性地分为两种成分， 形成催化核心的保守的茎环结 构和与给定 RNA 转录物中的靶位点周围的序列反向互补的侧翼序列。侧翼序列可以赋予特 异性， 并且总共通常形成在所选的靶位点的两侧上延伸的 14-16nt。
在发明的其他实施方案中， 可以使用适配子以靶向蛋白质。适配子是由核酸例如 RNA 或 DNA 组成的大分子及其化学修饰物， 其紧密地结合至特定的分子靶并且长度通常为 15-60nt。核苷酸链可以形成分子内的相互作用， 其将分子折叠为复杂的三维形状。适配子 的形状使其能够紧密地结合背向其靶分子的表面， 所述靶分子包括但不限于酸性蛋白质、 碱性蛋白质、 膜蛋白、 转录因子和酶。适配子分子的结合可能影响靶分子的功能。
所有上述寡核苷酸的长度都可以在少至每条链 5 或 10 个核苷酸， 优选 15 个核苷 酸， 甚至更优选 18 个核苷酸， 并且多至 50 或 60 个核苷酸， 优选 30 个核苷酸， 更优选 25 个核 苷酸之间变化。更具体地， 所述寡核苷酸可以是 8-50 个核苷酸长度的反义寡核苷酸， 其催 化 RNAseH 介导的其靶序列的降解或阻断翻译或重新引导剪接或起 antagomir 的作用 ； 它们 可以是 15-30 个碱基对长度的 siRNA ； 或它们也可以表示 15-30 个碱基对长度的诱饵寡核 苷酸。可选地， 它们可以是影响 15-30 个核苷酸长度的基因组 DNA 的转录的互补寡核苷酸 ； 它们也可能代表 25-50 个核苷酸长度的 DNAzyme 或 25-50 个核苷酸长度的核酶或 15-60 个 核苷酸长度的适配子。 所述寡核苷酸亚类通常在功能地定义并且可以相同或不同或共有一 些但不是全部其化学性质或体系结构特征， 而基本上不影响本发明的教导。在上述数目的 寡核苷酸的连续的延伸中， 寡核苷酸和靶序列之间的配合优选是完美的， 其中寡核苷酸的 各碱基与靶核酸上的沿上述数量的寡核苷酸的连续延伸段上的其互补碱基形成碱基对。 在 碱基对的所述连续延伸段中， 所述序列配对可以包含一个或多个错配， 但这是较不优选的。 通常， 所述核酸的类型和化学组成对于本发明的脂质体在体内或体外作为运载体的性能几 乎没有影响， 并且本领域技术人员可以找到适于与本发明的两性脂质体组合的其他类型的 寡核苷酸或核酸。
在某些方面并且如本文所证明的， 本发明的脂质体可用于体外、 体内或离体转染 细胞。具体实施方式
基于胆固醇的脂质
为了说明本发明的教导， 将包含胍基部分 ( 带电荷的亚氨基基团， CHOL-GUA)、 咪 唑部分 ( 不带电荷的亚氨基基团， CHIM) 或二甲基氨基或三甲基铵部分 ( 非亚氨基但带电 荷的基团， DC-CHOL 或 TC-CHOL) 的胆固醇的阳离子衍生物系统地 (systematically) 与不 同的阴离子脂质组合。
所用的阴离子脂质为 CHEMS( 胆固醇作为疏水部分， 羧酸作为带电荷基团 )、 DMGS 或 DOGS( 二酰基甘油疏水部分， 羧酸作为带电荷基团 ) 或 DOPA( 二酰基甘油作为疏水部分， 磷酸酯作为带电荷基团 )。对于大多数阳离子 / 阴离子组合， 制备了 C/A 比例在 0.33-2 之 间的 8 个系列二元混合物， 在 C/A 为 0.75 和 1 下测试了阳离子脂质与 DOPA 的组合。如所 示， 将胆固醇加入所有脂质混合物中以构成 20-40 摩尔％。
所有脂质体都装载 PLK-1 siRNA( 能够抑制细胞周期激酶 PLK-1 的生成的寡核苷 酸 )， 并通过对测试细胞的细胞存活的抑制测定成功的转染 ( 也参见 Haupenthal 等， Int. J.Cancer(2007)， 121 ： 206-210)。通过包含相同的整体组成和相同量的非靶向 siRNA 的对 照配制物， 监测对细胞存活的非特异性抑制， 即细胞毒性作用。
随后在常规细胞培养基中或具有额外的 10％小鼠血清 ( 细胞摄取许多两性脂质 体的有效抑制剂 ) 的细胞培养基中进行细胞转染。 转染效率以 IC50( 达到细胞存活的 50％ 抑制所需的浓度 ) 表示。
将常规培养基中的 IC50 与添加小鼠血清的 IC50 之间的比例用作小鼠血清抑制细 胞摄取的度量。对于没有特异靶向性质的脂质体而言， 此比例为 5 或更高。对于本发明的 脂质体 ( 即包含带电荷的亚氨基基团和带负电荷的脂质的组合的脂质体 ) 而言， 其为 5 或 更低。
如实施例 14 中进一步证明的， 通过 CHOLGUA 与羧基脂质 DOGS 的组合可以获得对
HeLa 细胞的最佳抗血清转染。在存在少于 40％胆固醇的情况下， C/A 为 0.5-1.5 的混合物 获得特别好的结果。如果所有其他成分例如 DOGS 或胆固醇保持不变， 并如 DC-CHOL 中用二 甲基胺与 GUA 头基交换， 则在不存在小鼠血清的情况下脂质体仍然具有活性， 但在存在小 鼠血清的情况下不再具有活性。对于 CHIM 和 DMGS 的组合， 可以观察到相同的情况。
基于胆固醇阳离子脂质与磷酸脂质 DOPA 的组合与所述结果的相似之处在于亚氨 基脂质 CHOLGUA 观察到最佳活性。此外， 虽然与不存在血清的情况相比较有大量抑制， 但 可能观察到 CHOLGUA:DOPA 脂质体的抗血清转染。在存在血清的情况下， DOPA 与 CHIM 或 DC-CHOL 的组合不产生任何转染。
基于 DACA 的脂质
为了进一步研究抗血清转染与头基化学的相关性， 使用普通的二烷基羧酸 (DACA) 锚定作为其疏水域合成以下脂质 ：
其中 DACA 部分通过如实施例 10 中所述将油基碘化物添加至油酸中而获得， 生成 的化合物为 ：在阳离子脂质之外， GUADACA、 MPDACA 或 BADACA 在其极性头基中具有带电荷的亚 氨基部分。由于吡啶部分的低 pK( 计算的 pK 为 5.9)， PDACA 的头基基本上不带电荷， 而甲
基化的变体导致带恒定电荷的吡啶鎓化合物 MPDACA 的生成。 ADACA 具有约为 9 的足够高的 pK， 但缺少亚氨基成分。然而， 当氨基基团位于酰胺的□ - 位时少量的各烯胺可以由此成分 形成， 使得亚氨基形式内消旋稳定化。
如以上关于基于胆固醇的脂质所述， 制备与阴离子脂质 CHEMS、 DMGS、 DOGS 和 DOPA 的组合， 产生具有 0.33-2( 或对于磷酸脂质为 0.75-1) 的各 C/A 比例的相似系列的不同脂 质体。
此外， 用靶向 PLK-1 或不相关序列的 siRNA 装载脂质体， 并在存在小鼠血清的情况 下或不存在小鼠血清的情况下在 HeLa 细胞上测试转染性质。
如在实施例 14 和 15 中进一步证明的， 通过 GUADACA 或 MPDACA 与羧基脂质或磷酸 脂质的组合， 可以获得 HeLa 细胞的抗血清转染。此外， 这些脂质还在不存在血清的情况下 产生非常高效的 PLK-1 siRNA 转染。这意味着没有出现如近期描述的与具有二甲基氨基头 基的脂质体有关的所述脂质体被血清成分的活化 (Akinc 等， Mol.Ther.(2010)， 印刷之前 于 5 月 11 日电子公开， DOI ： 10.1038/mt.2010.85)。与羧酸脂质的组合在 0.5-1.5 的 C/A 值也观察到极高水平的载体活性， 磷酸脂质在 C/A 0.75 或 1 观察到极高水平的载体活性。 在这些情况中的一些的情况下， 制剂具有两性电荷性质。 吡啶鎓化合物 MPDACA 的甲基化缺乏产生了相关 PDACA。尽管仍然带有亚胺官 能团， 但此官能团不再如在 MPDACA 中那样带电荷 ； PDACA 不具有出于转染目的的阳离子 脂质的活性。在另一个变体中， 保留头基的芳香环， 但带电荷的亚胺则以额外的环形胺 (aminide) 基团的一部分的形式存在。 发现此化合物具有作为用于转染的脂质的活性， 例如 与 CHEMS 或 DMGS 组合 ( 其中其也产生抗血清转染 )。
基于二烷基羧酸的其他脂质
使用如 US 6726894 中所述的吡啶鎓脂质 SAINT-18( 结构 31) 得到了相似的结果。
将 SAINT-18 与各种脂质阴离子例如 CHEMS、 DMGS 或 DOGS 组合。阳离子脂质和阴 离子脂质的比例以系统的方式变化， 并且所得到的二元混合物任选地还补充有 20 或 40 摩 尔％胆固醇。将单独的脂质混合物转化为脂质体并用于活性 siRNA 和对照 siRNA 的包封。 如实施例 8 中所证明的， 当在存在普通细胞培养基的情况下在 HeLa 细胞上进行测试时， 大 量测试制剂都观察到了细胞存活的有效和特异性抑制。然而， C/A ＞＝ 1 的脂质体均没有 在存在小鼠血清的情况下产生细胞转染。形成鲜明对照的是， 大量的两性制剂抵抗血清并 确实有效地转染细胞。 此外， 此作用特异性于 PLK-1siRNA， 并且需要浓度高得多的且装载有 不相关的 siRNA(SCR) 的脂质体以非特异性地抑制细胞增殖。使用 SAINT18 与 DMGS 的组合 获得了最佳结果。因此， 包含 SAINT-18 和 DMGS 且其他特征在于 C/A ＜ 1 的脂质体在本发 明的范围内。
基于氨基酸的脂质
为了进一步说明本发明的教导， 将阳离子胍基脂质 PONA( 棕榈酰基 - 油酰基 - 去 甲 - 精氨酸， 结构 21) 与各种脂质阴离子例如 CHEMS 或 DMGS 组合。阳离子脂质和阴离子脂 质的比例以系统的方式变化， 并且所得到的二元混合物任选地还补充有 20 摩尔％胆固醇。
将单独的脂质混合物转化为脂质体并用于包封活性 siRNA 和对照 siRNA。 当在 HeLa 细胞上 进行测试时， 如实施例 5 中所证明的， 大多数测试制剂都观察到了细胞存活的有效和特异 性抑制。活性不受存在的人或小鼠血清的影响， 或仅略微 (marginally) 受存在的人或小鼠 血清的影响。
在实施例 6 中， 将阴离子脂质 CHEMS 与 PONA 的衍生物组合， 其中如结构 (21) 和 (23) 中所示， 胍基部分被氨基基团取代 (POAamine) 或季胺化的铵基团 (POAammouium) 取 代。
同样， 系统地改变阴离子和阳离子脂质成分之间的比例， 并且在所有脂质混合物 中都存在 20％胆固醇。将原料配制成脂质体并用于包封活性 siRNA 和对照 siRNA。当在 HeLa 细胞上测试时， 所有包含摩尔过量的阳离子脂质的制剂都观察到了细胞存活的有效和 特异性抑制。对于包含较高摩尔量的阴离子脂质 CHEMS 的混合物， 在与 PONA 的组合中观察 到最佳活性， 而 POAamine ∶ CHEMS 组合仅在一些情况下有效。 当使用过量的阴离子脂质时， PONammonium ∶ CHEMS 组合无效。
此外， 在包含过量阴离子脂质 CHEMS 的混合物之外， PONA ∶ CHEMS 组合的转染活 性仅略微受存在的人或小鼠血清的影响， 而在存在小鼠血清的情况下 PONamine ∶ CHEMS 组 合的活性被完全抑制。在存在血清的情况下， PONammonium 制剂保持无活性。
如实施例 15 中进一步描述的， 还测试了 PONA、 PONamine 或 POAammonium 与磷酸脂 质 DOPA 的组合。PONA 和 POAamine 都导致 HeLa 细胞的抗血清转染， 而 POAammonium 未导致 HeLa 细胞的抗血清转染。
组合的数据支持了包含胍基脂质与带负电荷的脂质例如羧基脂质或磷酸脂质的 组合的脂质组合物的优选摄取。这可能涉及以下进一步的力学考虑。具有过量阳离子脂质 成分的制剂的恒定高活性可能是由于这些颗粒和细胞表面之间的静电相互作用， 然而这种 相互作用是非特异性的。 与此观点一致的是阳离子制剂的活性不取决于阴离子或阳离子脂 质的性质这一事实。
在进一步的实验中， 将胍基脂质 PONA 与 CHEMS、 DMGS 或 DOGS 组合。同样， 在各二
元混合物中进行阴离子和阳离子脂质化合物的比例的系统变化， 并且制剂进一步补充有 0、 20 或 40 摩尔％胆固醇。当如上所示进行测试时， 大多数制剂具有抑制 HeLa 细胞的细胞增 殖的活性， IC50 低于 6nM( 参见实施例 7)。然而， 活性和无活性 siRNA 的效率所需的浓度之 间的比较揭示了制剂之间的实质差异。此类比较的度量是两种 siRNA 的 IC50 之比， 在本文 中以 SCR/PLK 比表示。仅所选的制剂达到了显著高于 5 的值。甚至更优选的制剂的 SCR/ PLK ＞＝ 10。所有这些优选制剂都可以通过其阳离子脂质成分和阴离子脂质成分之间的比 例 ( 小于 1) 而表征。
本发明鉴定出在存在抑制性血清的情况下对某些细胞的摄取至关重要的特定脂 质头基化学。优选地， 包含羧基基团的阴离子脂质和包含带电的亚氨基部分的阳离子脂质 的两性组合产生了期望的性质。相比之下， 包含相同脂质的阳离子制剂不依赖于特定的头 基化学并且较不易被细胞耐受。
脂蛋白结合
根据其密度， 竞争脂质体转染的脂蛋白包括多种结构。这些结构被称为乳糜微 粒、 VLDL、 LDL、 IDL 或 HDL 颗粒。在内源途径中， 乳糜微粒在小肠的上皮内层中合成并使用 ApoB-48(ApoB 基因产物的较短变体 ) 装配。脂蛋白与 HDL 颗粒的进一步交换导致 ApoC-II 和 ApoE 被转移至乳糜微粒颗粒， ApoC-II 介导脂蛋白脂肪酶 ( 自颗粒释放脂质所需的酶 ) 的活化。水解的乳糜微粒形成所谓的残留物， 其主要在肝中通过对其 ApoE 部分的识别而 被摄取。VLDL 颗粒的合成、 熟化、 使用和再循环遵循相同的途径， 但自肝中开始并且使用 ApoB-100 蛋白作为其结构形成单元。同样， ApoE 介导 VLDL- 残留物 ( 所谓的 IDL 颗粒 ) 的 最终摄取和再循环。( 还参见 http://en.wikipedia.org/wiki/lipoprotein)
ApoE 与载脂蛋白 A 和 C 共有的结构同源性在于它们都包含 11 个氨基酸的两性串 联重复序列。 ApoA-I 和 ApoE 片段的晶体学数据确认了延长的两性螺旋结构的存在， 并且揭 示这些螺旋的极性面上的混合的电荷结构。这些数据可以公开地获自 RCSB Protein Data Bank( 可获自 www.rcsb.org/pdb/home/home.do) 并且登录号 1AV1.pdb 给出了 ApoA-I 的蛋 白结构。1lpe.pdb 的氨基酸 129-166 表示 ApoE 的 LDL- 受体结合片段。与它们的整体相似 性相反， 当分析三种载脂蛋白的氨基酸组成时它们显示出特别的偏差。在 ApoE 中， 在串联 重复序列中精氨酸是占主要地位的阳离子氨基酸。相比之下， ApoA 具有等量的赖氨酸和精 氨酸， 而 ApoC 具有过量的赖氨酸残基。
表3： 相关载脂蛋白的串联重复序列中的氨基酸组成分析 ( 序列数据获自 www. expasy.ch/sprot/sprot-top.html 的 Swiss-Protacailable)。
总之， 天然脂蛋白的极性表面被载脂蛋白覆盖， 其中 ApoE 是用于细胞摄取这些颗 粒的共有结合基序。ApoE 的暴露于水的部分代表了阴离子电荷和阳离子电荷的嵌合， 其中 阴离子电荷由天冬氨酸和谷氨酸残基的游离羧基末端产生。 阳离子电荷包括氨基和胍基基 团的混合物， 并且存在极少量的咪唑。
为了模拟脂质体表面上的 ApoE 结合组件的识别方式， 可以遵循不同的可选方案。 可能合成 ApoE 肽片段并将此类肽接枝至脂质体的表面。 这已被 Mims 等， J Biol.Chem.269， 20539(1994) ； Rensen 等， Mol Pharmacol.52， 445(1997) ； Rensen 等， J.Lipid Res.38， 1070(1997) ； Saue 等， Biochemistry 44， 2021(2005) 或 Versluis 等， J Pharmacol.Exp. Ther 289， 1(1999) 所证明。然而， 与肽合成和衍生化相关的高成本需要替代方法。
使用不同的带电荷脂质的混合物 ( 可能还包含中性脂质 ) 直接提供所需的带电 荷的部分将产生简单得多的结构， 并且消除了对高成本的肽生产和衍生化的需要。所述方 法的一个显著的难题在于带电的基团在脂质双层中的平面扩散 ； 在此之前不清楚是否这 种组织较差的装配体的亲和力是否能有效地竞争真正的脂蛋白提供的亲和力。此外， 带相 反电荷的脂质头基可能彼此会形成盐桥， 而在脂蛋白例如 ApoE 的结合组件中在官能基之 间仅检测到极少量的氢键。这可以解释亚氨基∶磷酸脂质组合例如 GUADACA ∶ DOPA 或 MPDACA ∶ DOPA 的活性。尽管 DOPA 在生理条件下提供两个负电荷， 但空间位阻使得不能由 一个 DOPA 和两个 GUADACA 脂质形成盐。因此， 在这些膜中， DOPA 和 GUADACA 之间的带负电 荷的盐必须与游离的 GUADACA 分子共同存在， 由此有利于在共同的脂质装配体中同时存在 单独的阴离子要素和阳离子要素。
上述理论的提及并不限制本发明的发现。不期望受具体理论的限制， 可以假定带 电荷的亚氨基脂质与带负电荷的羧基或磷酸脂质的组合模拟了被 ApoE 覆盖的脂蛋白的表 面性质。当然， 没有这样的知识也可以使用、 开发和优化所述颗粒。然而， 理论背景可能有 助于了解本发明各实施方案中所述的指导原则或载体的适用性。
例如， 已知脂蛋白受体在不同的细胞类型中具有不同的表达谱， 这样的知识可以 用于评价用于本发明的脂质体的靶细胞群。
LDL- 受体在肿瘤上和肺的支气管上皮细胞上高度表达 ( 参见 Su Al， Wiltshire T， Batalov S 等 (2004).Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.101(16) ： 6062-7， 也公开于 http:// en.wikipedia.org/wiki/file ： PBB_GE_LDLR_202068_s_at_tn.png)。
因此， 本发明的脂质体特别适于肿瘤学领域的应用， 但也适于特定肺细胞的转染。
尽管可通过 EPR- 作用 ( 增强的渗透性和保留 ) 而由体循环与肿瘤接触， 即通过渗漏的肿瘤 脉管系统接触， 但也可以由气道靶向支气管上皮细胞。
因此， 在本发明的具体实施方案中， 将包含带电荷的亚氨基和羧基或磷酸脂质的 脂质体的气溶胶用作用于靶向肺细胞特别是支气管上皮细胞的吸入剂型。
图注
图 1-6 显示了实施例 14 中描述的筛选试验的结果。阳离子脂质的性质示于较小 的图中， 且显示的所有项目的其他图注和坐标轴相似， 并示于以下独立的较小的图中。 两个 柱分别表示包含 20％胆固醇 ( 左柱 ) 和 40％胆固醇 ( 右柱 ) 的脂质体。
对于每张图， 柱表示各脂质体 /siRNA 组合在试验条件下 ( 即在存在小鼠血清的情 况下和在不存在小鼠血清的情况下 ) 的 IC50 值。这些 IC50 值表示细胞生长的半最大抑制 所需的浓度， 并且以 nM 表示。测试项目的最大浓度在存在小鼠血清的情况和不存在小鼠血 清的情况分别为 40nM 和 36nM。
测试项目的顺序如下 ：
图1： 阴离子脂质为 CHEMS- 未添加小鼠血清
图2： 阴离子脂质为 CHEMS+ 添加小鼠血清
图3： 阴离子脂质为 DMGS- 未添加小鼠血清
图4： 阴离子脂质为 DMGS+ 添加小鼠血清
图5： 阴离子脂质为 DOGS- 未添加小鼠血清
图6： 阴离子脂质为 DOGS+ 添加小鼠血清
实施例
通过考虑以下实施例可以更好地理解本发明的教导。然而， 这些实施例绝不应限 制本发明的教导。
实施例 1- 制备、 表征脂质体并包封 siRNA。
使用如 WO07/107304 公开的方法制备脂质体。更具体地， 将脂质溶于异丙醇并 通过将含 siRNA 的 pH 为 4.0(pH 用 HAc 调节 ) 的 NaAc 20mM、 蔗糖 300mM 溶液添加至醇性 脂质混合物中而制备脂质体， 最终的醇浓度为 30％。用两倍体积的 Na2HPO4 136mM、 NaCl 100nM(pH9) 将所形成的脂质体悬浮液调整为 pH7.5， 得到的脂质最终浓度为 3mM， 异丙醇最 终浓度为 10％。
使用动态光散射 (MALVERN 3000HSA) 表征脂质体的粒径。
活性 siRNA ： 21 聚体， 钝尾的， 靶向小鼠和人 PLK-1mRNA， 如 Haupenthal 等， Int. J.Cancer(2007)， 121 ： 206-210 中所述。
对照 siRNA(SCR) ： 21 聚体， 同一来源。
实施例 2- 通用细胞培养和增殖测定。
自 DSMZ( 德国微生物和细胞培养物保藏中心 ) 获得 HeLa 细胞并将其维持于 DMEM(Gibco-Invitrogen) 中并补充有 10％ FCS。以 2.5x104 细胞 /ml 的密度使细胞铺板并 且在 37℃、 5％ CO2 下在 100μl 培养基中培养。16 小时后将包含 siRNA 的脂质体稀释并添 加 10μl 至细胞， 以使 Plk1 或秩乱 siRNA 的最终浓度为 0.4-100nM ； 同样将 10μl 稀释缓 冲剂添加至未处理的细胞中和无细胞的孔中。将细胞培养盘在 37℃、 5％ CO2 下温育 72 小 时。根据供应商的指导， 通过使用 Celltiter-Blue Cell Viability 实验 (Promega， US) 测定细胞增殖 / 存活。
实施例 3- 血清对转染的抑制。
如 上 所 述 用 活 性 siRNA 和 对 照 siRNA 装 载 获 自 DODAP ∶ DMGS ∶ 胆 固 醇 (24 ∶ 36 ∶ 40 摩尔％ ) 的脂质体， 并使来自不同物种的 75μl 血清 (SIGMA-Aldrich) 和 25μl 所述脂质体温育 30 分钟。 随后， 将所述脂质体添加至细胞， 继续温育 72 小时， 并如上 所述测定细胞存活。
当不使用血清温育时， 活性 siRNA 的施用导致对细胞增殖的强抑制。如下表 7 中 所证明的， 该过程通过添加血清而被抑制。
表7： 细胞转染被不同来源的血清抑制
siRNA 类型 PLK1 PLK1 PLK1 PLK1 PLK1 无
siRNA 浓度 50nM 50nM 50nM 50nM 50nM 无 血清 无 人 仓鼠 大鼠 小鼠 无 细胞存活 (％ ) 7 98 80 108 102 100实施例 4- 抑制是脂蛋白依赖性的
如上所述将实施例 3 中的脂质体用缺乏某些补体因子或脂蛋白人血清 (SIGMA-Aldrich) 温育， 并分析它们介导对 HeLa 细胞的 RNAi 作用的能力。
如表 8 中所证明的， 通过除去脂蛋白可以恢复转染效率。除去补体因子是无效的。
表8： 在缺乏各种因子的血清中恢复细胞转染
siRNA 类型 PLK1 PLK1 PLK1 PLK1
siRNA 浓度 50nM 50nM 50nM 50nM 血清 无 人， 完整 人， 无 C3 补体因子 人， 无 C9 补体因子 细胞存活 (％ ) 7 98 91 9833CN 102481256 A PLK1 无
50nM 无说明书人， 缺乏脂蛋白 无 18 10031/41 页实施例 5- 使用胍基脂质的抗血清转染。
如实施例 1 所述由 PONA ∶阴离子脂质∶胆固醇 (x ∶ y ∶ 20 摩尔％ ) 构建一系 列脂质体， 并装载活性 siRNA 和对照 siRNA。如表中所示， 在该系列脂质体中， 阳离子组分 PONA 和阴离子脂质 CHEMS 或 DMGS 的比例系统地在 0.33-2 之间变化。阳离子脂质∶阴离 子脂质的比例为 1 或更高的脂质体另外补充有 2 摩尔％ DMPE-PEG2000(Nippon Oils and Fats)， 以避免颗粒的聚集。此修饰在表中以 “+” 表示。用 C/A ＜ 1 的颗粒的对照反应未显 示出转染性质在存在 PEG 脂质和不存在 PEG 脂质的情况下的变化。
如 实 施 例 2 所 述， 培 养 并 维 持 HeLa 细 胞， 并将人或小鼠来源的血清 (SIGMA-Aldrich) 直接添加至细胞， 持续 120 分钟。随后， 将脂质体以 50pM-50nM 的浓度添 加至细胞， 继续温育 72 小时， 并如上所述测定细胞存活。转染效率在此以 IC50( 抑制 50％ 细胞增殖所需的浓度 ) 表示。因此， 低 IC50 值表示高度有效的转染。 由表 9 中的结果显而易见， 添加血清仅略微影响由实施例的脂质体介导的 siRNA 转染。对于获自 PONA ∶ CHEMS 的包含少量阴离子脂质的脂质体， 仍观察到一些抑制 ( 比例 0.33 和 0.5， 用小鼠血清的抑制特别强 )。
表9： 包含胍基部分的脂质体在存在血清的情况下的转染效率
实施例 6- 胍基头基的重要性
如实施例 5 所述， 制备具有系统地变化的阳离子脂质成分和阴离子脂质成分比例 的一系列脂质体， 并装载 siRNA。阳离子脂质成分为 PONA、 PONamine 和 PONammonium， 阴离 子脂质为 CHEMS， 并将胆固醇含量固定为 20 摩尔％。阳离子∶阴离子脂质比例为 1 或大于 1 的脂质体另外补充有 2 摩尔％ DMPE-PEG2000(Nippon Oils and Fats)， 以避免颗粒的聚 集。此修饰在表中以 “+” 表示。
如 实 施 例 2 所 述， 培 养 并 维 持 HeLa 细 胞， 并将人或小鼠来源的血清 (SIGMA-Aldrich) 直接添加至细胞， 持续 120 分钟。随后， 将脂质体以 50pM-50nM 的浓度添 加至细胞， 继续温育 72 小时， 并如上所述测定细胞存活。如实施例 5 中所述， 转染效率在此
以 IC50 表示。
由表 10 中的数据显而易见， 在存在血清的情况下， 仅 PONA 介导 HeLa 细胞的转染， 而 PONamine 和 PONammonium 都不介导 HeLa 细胞的转染， 并且其中 PONammonium 的介导甚 至更低。这一点在更积极地抑制转染的小鼠血清的情况下最为显著。过量的阳离子脂质成 分在某种程度上补偿了血清导致的活性损失， 但也可能是由于这些脂质体对细胞的非特异 性静电吸附。
表 10 ： 胍基头基对于细胞的抗血清转染的重要性。
实施例 7- 脂质体组成的优化
如实施例 5 所述， 制备具有系统地变化的阳离子脂质成分和阴离子脂质成分比例 的一系列脂质体， 并装载 siRNA。阳离子脂质成分为 PONA， 阴离子脂质为 CHEMS、 DMGS 或 DOGS， 胆固醇含量在 0-40 摩尔％之间变化。阳离子脂质∶阴离子脂质比例为 1 或大于 1 的 脂质体以及一些其他脂质体另外补充有 2 摩尔％ DMPE-PEG2000(Nippon Oils and Fats)， 以避免颗粒的聚集。此修饰在表中以 “+” 表示。
如实施例 2 所述， 培养并维持 HeLa 细胞， 将脂质体以 6nM-200nM 的浓度添加至细 胞， 继续温育 72 小时， 并如上所述测定细胞存活。如以上实施例所述， 转染效率在此以 IC50 表示。 此外， 测定装载有无活性 siRNA(SCR) 的脂质体的 IC50， 并计算 IC50(SCR) 和 IC50(PLK1) 之比。此参数的数值高表示 PLK1 siRNA 对细胞存活的极特异的抑制， 载体贡献的低的非特 异性作用， 和总体的水平低的细胞毒性。
表 11 ： CHEMS 的优化结果。最低的和最高的可测 IC50 值分别为 6nM 和 200nM。
表 12 ： DMGS 的优化结果。最低的和最高的可测 IC50 值分别为 6nM 和 200nM。
表 13 ： DOGS 的优化结果。最低的和最高的可测 IC50 值分别为 6nM 和 200nM。实施例 8- 包含吡啶鎓脂质的脂质体
将 SAINT-18 用作阳离子脂质， 其甲基化的吡啶鎓结构提供了带电荷的亚氨基部 分。 将 CHEM、 DMGS 和 DOGS 单独地用作提供羧基官能团的阴离子脂质。 如实施例 5 所述， 制备 具有系统地变化的阳离子脂质成分和阴离子脂质成分比例的一系列脂质体， 并装载 siRNA。 脂质混合物另外补充有 20 或 40 摩尔％胆固醇。阳离子∶阴离子脂质比例为 1 或大于 1 的 脂质体另外补充有 2 摩尔％ DMPE-PEG2000(Nippon Oils and Fats)， 以避免颗粒的聚集。 此修饰在表中以 “+” 表示。
如实施例 2 所述， 培养并维持 HeLa 细胞。将脂质体以 50pM-50nM 的浓度添加至细 胞， 继续温育 72 小时， 并如上所述测定细胞存活。如以上实施例所述， 转染效率在此以 IC50 表示。 此外， 测定装载有无活性 siRNA(SCR) 的脂质体的 IC50， 并计算 IC50(SCR) 和 IC50(PLK1) 之比。此参数的数值高表示 PLK1 siRNA 对细胞存活的极特异的抑制， 载体贡献的低的非特 异性作用， 并且总体水平低的细胞毒性。
表 14 ： 获自 SAINT-18、 CHEMS 和胆固醇的脂质体的转染结果
表 15 ： 获自 SAINT-18、 DMGS 和胆固醇的脂质体的转染结果
表 16 ： 获自 SAINT-18、 DOGS 和胆固醇的脂质体的转染结果由表 14-16 中的数据显而易见， 大量两性脂质体即使在存在小鼠血清的情况下仍 促进细胞转染。特别有用的是包含 SAIT-18 与二酰基甘油 DMGS 和 DOGS 的组合的脂质体， 而与 CHEMS 的组合仅在 C/A ＝ 0.67 时有效。与和 PONA 的组合相同， 两性结构以高特异性 转染细胞， 而如 SCR/PLK1 低于 2 所表明的， C/A ＞ 1 的组合物不提供高特异性的转染。
通过考虑本文公开的本发明的说明书和实践， 本发明的其他实施方案和应用对本 领域技术人员而言将是显而易见的。说明书和实施例应仅被认为是示例性的， 发明的真正 范围和精神由以下权利要求书所示。
实施例 9- 动电位测量
9.1 由 PONA ∶ CHEMS ∶ CHOL 形成的脂质体的动电位分析。
将包含 x 摩尔％ PONA、 y 摩尔％ CHEMS 和 20 摩尔％胆固醇的 100μl 脂质混合物 (20mM 总脂质浓度， 溶剂为异丙醇 ) 注射入 900μl 包含 10mM 乙酸和 10mM 磷酸的缓冲剂 (pH4) 中。调节 PONA 和 CHEMS 的摩尔百分比 X 和 Y， 以获得表 17 中的 C/A 比例。
立即将悬浮液涡旋并添加 3mL 的 pH 调节缓冲剂。 缓冲剂选自以下组中 ： 50mM 乙酸 和 50mM 磷酸 ( 使用 NaOH 调节至 pH4、 5、 6.5 或 7.5)， 或 50mM Na2HPO4/50mM 乙酸钠 (pH9.4)。 记录混合 pH 并与使用 Zetasizer HSA3000 监测的所得脂质颗粒的动电位一起示于下表 17 中。
表 17 ： 获自 PONA ∶ CHEMS ∶ CHOL 的脂质颗粒的动电位
C/A 比例 最终 pH 7,56 -54,40 -58,90 -58,20 39 -61,80 -21,80 22,60 #NV 0,5 0,67 0,82 1,00 1,22 1,5 2,00CN 102481256 A 7,20 6,32 4,84 3,93
-48,47 -44,33 19,67 35,53 -46,00 -37,07 18,00 41,73说明书-50,00 0,64 31,80 46,63 -21,10 23,43 32,77 46,20 14,97 9,60 32,57 43,4037/41 页 #NV #NV 28,37 43,23-44,90 -31,37 22,15 43,75显然， 所述颗粒即使是对于 C/A 为 1.22( 即大于 1) 的混合物也显示出两性特性。 同样， 在 pH7.4 下制备 C/A 为 0.67、 0.82 或 1 的颗粒， 并随后使其暴露于较低的 pH。表 17 中所示的动电位没有明显变化。
9.2 其中的 DOPA 为阴离子脂质的组合的动电位测量
同样， 由 GUADACA 和 DOPA 的二元混合物 ( 脂质头基亚氨基 / 磷酸根的组合 ) 制备 脂质颗粒。以与 9.1 中所示的方式相同的方式制备颗粒， 记录具有不同 C/A 比例的混合物 的表 18 的动电位。
表 18 ： 获自 GUADACA ∶ DOPA 的脂质颗粒的动电位
C/A 最终 pH 4,5 5,32 6,25 7,02 7,81
21 -24 -8 -61 -67 13 22 -45 -67 -78 38 20 -30 -8 -76 46 33 2 -56 -65 51 35 24 -6 -21 0,65 0,75 0,98 1,16 1,4与 9.1 中获得的颗粒相同， 同样获得 C/A ＞ 1 的具有两性特性的颗粒。同样， 等电 点的漂移符合预期。
9.3 DOTAP ∶ CHEMS ∶ CHOL 的动电位测量。
为了比较， 对其中的 PONA 用 DOTAP 取代的脂质混合物进行相同的测量。结果示于 表 19 中。与 PONA ∶ CHEMS 相反， 仅在 C/A ＜ 1 下发现获自 DOTAP ∶ CHEMS 的两性颗粒。
表 19 ： 获自 DOTAP ∶ CHEMS ∶ CHOL 的脂质颗粒的动电位。
C/A 比例 最终 pH 7,56 -37,7 -21,63 4,9 13,25 0,67 0,82 1 1,2240CN 102481256 A 7,20 6,32 4,84 3,93
-50,17 #NV 25,6 52,13说明-24,1 #NV 32,1 43,93书#NV 11,43 20,27 47,77 12,55 7,37 9,3 12,1538/41 页实施例 10-CHOLGUA 的合成。
将 25g 胆固醇氯甲酸酯和 50 当量 (eq.) 的乙二胺溶于二氯甲烷中， 并在 20℃下反 应 6h。使用色谱法和结晶分离氨基乙基氨基甲酰 - 胆固醇。产量为 28.7g， 纯度为 90％。
由先前分离的氨基乙基氨基甲酰 - 胆固醇合成 CHOLGUA。使用 1.5eq. 的 1H- 吡 唑 -1- 甲脒盐酸盐和 4eq. 的 N， N- 二异丙基乙基胺在二氯甲烷 / 乙醇中将 30g 的所述物质 在 20℃下温育 16 小时， 之后通过色谱法分离产物。纯度为 95％， 收率为 16.5g。
实施例 11-DACA、 PDACA 和 MPDACA 的合成
将 42.4g 油醇、 2.5eq. 二异丙基偶氮二羧酸酯、 2.5eq. 三苯基膦和 5eq.LiI 在 20℃下在四氢呋喃 (THF) 中反应 24 小时。通过色谱法分离油基碘化物， 纯度为 90％， 产量 为 13.4g。
在第二步骤中， 将 10g 油酸与 2.2eq. 的二异丙基氨基锂在 20℃下在 THF 中混合 0.5 小时， 之后添加 1eq. 油基碘化物。将混合物在 20℃下温育 2 小时， 并使用色谱法自反 应混合物中纯化 DACA。纯度为 95％， 产量为 14.96g。
对于 PDACA 的合成， 将 2g DACA、 1.2eq. 的 4- 氨甲基吡啶、 1.4eq. 的 O- 苯并三 唑 -1- 基 -N， N， N′， N′ - 四甲基脲四氟硼酸盐和 4eq. 的 N- 甲基吗啉在 20℃下在 THF 中 混合 24 小时。将反应混合物纯化 ( 包括色谱法 )。PDACA 的纯度为 95％， 产量为 1.72g。
对于 MPDACA 的合成， 将 2g PDACA 与 2eq. 的硫酸二甲酯一起溶于 THF 中， 将混合物 在 20℃下温育 16 小时， 之后通过色谱法纯化 MPDACA。MPDACA 的纯度 ： 95％， 产量 ： 1.71g。
实施例 12-GUADACA 的合成。
在第一步中， 将 3.5g DACA 和 1.5eq. 的 1， 1′ - 羰基二咪唑溶于二氯甲烷中并在 20℃下温育 16 小时， 之后添加 30eq. 的乙二胺。将反应混合物在 20℃下温育 4 小时， 之后， 纯化氨基乙基 -DACA( 包括色谱法 )。纯度为 90％， 产量为 3.2g。
由氨基乙基 -DACA 合成 GUADACA， 为此， 将 3.2g 氨基乙基 -DACA、 2.5eq. 的 1H- 吡 唑 -1- 甲脒盐酸盐和 12eq. 的 N， N- 二异丙基乙胺在 20℃下温育 3 小时， 之后分离 GUADACA。 纯度 ： 95％， 产量 ： 2.24g。
实施例 13-BADACA 的合成
根据以下方法由 DACA 合成 BADACA ： 将 4.15g DACA、 1.2eq. 的对氨基苄脒、 1.2eq. 的 N， N- 二环己基碳酰二亚胺和 3eq. 的 4- 二甲基氨基吡啶在无水二甲基甲酰胺中混合， 并 在 70℃下温育 16 小时。使用色谱法自反应中分离 BADACA。纯度 ： 95％， 产量 ： 1.62g。 实施例 14- 基于 DACA 或胆固醇的阳离子脂质与羧基脂质的组合的抗血清转染
如实施例 5 所述， 制备具有系统地变化的阳离子脂质成分和阴离子脂质成分比 例的一系列脂质体， 并装载 siRNA。阳离子脂质组分为 CHOLGUA、 CHIM、 DC-CHOL、 TC-CHOL、
GUADACA、 MPDACA、 BADACA 和 PDACA。阴离子脂质为 CHEMS、 DMGS 或 DOGS， 且胆固醇含量为 20 或 40 摩尔％， 所有的脂质混合物都示于数据表中。 阳离子∶阴离子脂质比例为 1 或大于 1(C/A ＞＝ 1) 的脂质体另外补充有 1.5 摩尔％的 DMPE-PEG2000(Nippon Oils and Fats)。
如实施例 2 所述， 培养并维持 HeLa 细胞， 将小鼠血清 (SIGMA-Aldrich) 直接添加 至细胞， 持续 120 分钟。随后， 将脂质体添加至细胞， 继续温育 72 小时， 并如上所述测定细 胞存活。对于在不存在小鼠血清的情况下或存在小鼠血清的情况下的实验， 脂质体的最高 浓度分别为 40nM 和 36nM。如实施例 5 所述， 转染效率在此以 IC50(nM siRNA) 表示。该筛 选试验的所有结果都示于图 1-6 中。
如极低的 IC50 值所示， 许多转染混合物都产生了极有效的 siRNA 对 HeLa 细胞的 转染。包含亚氨基脂质 ( 例如 CHOLGUA) 的脂质组合即使在存在小鼠血清的情况下也仍保 持有效的转染子， 包含 MPDACA、 GUADACA 或 PONA 的脂质组合更是如此。
实施例 15- 若干阳离子脂质与磷酸脂质的组合的抗血清转染
如实施例 5 所述， 制备 C/A 比例为 0.75 或 1 的一系列脂质体， 并装载 siRNA。阳 离子脂质组分为 CHOLGUA、 CHIM、 DC-CHOL、 GUADACA、 MPDACA、 BADACA、 PONA、 DOTAP 或 DODAP。 阴离子脂质为 DOPA， 且胆固醇含量为 40 摩尔％， 所有的脂质混合物都示于表 20 中。 脂质体 另外补充有 1.5 摩尔％的 DMPE-PEG2000(Nippon Oils and Fats)。
如实施例 2 所述， 培养并维持 HeLa 细胞， 将小鼠血清 (SIGMA-Aldrich) 直接添加 至细胞， 持续 120 分钟。随后， 将脂质体添加至细胞， 继续温育 72 小时， 并如上所述测定细 胞存活。如实施例 5 所述， 转染效率在此以 IC50(nM siRNA) 表示。
如极低的 IC50 值所示， 许多转染混合物都产生 siRNA 对 HeLa 细胞的极有效转染。 包含亚氨基脂质 ( 例如 CHOLGUA) 的脂质组合即使在存在小鼠血清的情况下仍保持有效的 转染子， 包含 MPDACA、 GUADACA 或 PONA 的脂质组合更是如此。
表 20 ： 在存在小鼠血清的情况下和不存在小鼠血清的情况下各脂质体的 IC50 值 (nM siRNA)。血清抑制 “无效” 是指在存在小鼠血清的情况下没有最小效力， 在这些情况下 无法确定抑制因子。测试中 siRNA 的最高浓度为 146nM。
实施例 16- 在不存在带负电荷的脂质的情况下抗血清转染差
由阳离子脂质和作为中性脂质的胆固醇制备一系列脂质体。在这些配制物中未 使用阴离子脂质。阳离子脂质组分为 CHOLGUA、 CHIM、 DC-CHOL、 ADACA、 GUADACA、 MPDACA、 BADACA、 PONA、 DOTAP 和 DODAP， 并使用实施例 5 中描述的方法制备所述脂质体。胆固醇含量 为 40 摩尔％， 脂质体另外补充有 1.5 摩尔％的 DMPE-PEG2000(Nippon Oils and Fats)， 以 在存在 siRNA 的情况下避免聚集体形成。
如实施例 2 所述， 培育并维持 HeLa 细胞， 将小鼠血清 (SIGMA-Aldrich) 直接添加 至细胞， 持续 120 分钟。随后， 将脂质体添加至细胞， 继续温育 72 小时， 并如上所述测定细 胞存活。如实施例 5 所述， 转染效率在此以 IC50(nM siRNA) 表示。
获得的结果示于下表 21 中。在所有情况下， 转染效率都大大低于另外还包含阴离 子脂质的混合物的转染效率。除 GUADACA 或 PONA 以外， 在存在小鼠血清的情况下没有可检 测的活性。
表 21 ： 在存在小鼠血清的情况下和不存在小鼠血清的情况下各脂质体的 IC50 值 (nM siRNA)。血清抑制 “无效” 是指在存在小鼠血清的情况下没有最小效力， 在这些情况下 无法确定抑制因子。在不存在小鼠血清的情况下或存在小鼠血清的情况下， 测试中 siRNA 的最高浓度分别为 160 或 146nM。