免疫诱导剂 【技术领域】
本发明涉及作为癌的治疗剂和 / 或预防剂等有用的新的免疫诱导剂。背景技术 癌是占全部死亡原因的第一位的疾病， 现在进行的治疗以手术疗法为主体组合了 放射线疗法和化学疗法。 尽管近年来开发了新的手术法、 发现了新的抗癌剂， 但是现状是除 了一部分癌以外， 癌的治疗成绩没有太大提高。 近年来， 由于分子生物学、 癌免疫学的进步， 鉴定出了由与癌反应的细胞毒性 T 细胞识别的癌抗原、 编码癌抗原的基因， 对抗原特异性 免疫疗法的期待逐步提高。
在免疫疗法中， 为了减少副作用， 需要被识别为其抗原的肽或蛋白在正常细胞中 几乎不存在， 而在癌细胞中特异性地存在。1991 年， ベルギ一 Ludwig 研究所的 Boon 等 人通过使用了自体癌细胞株和癌反应性 T 细胞的 cDNA 表达克隆法而分离出了由 CD8 阳 性 T 细胞识别的人黑素瘤抗原 MAGE1( 非专利文献 1)。然后， 报告了采用基因的表达克 隆化的方法来鉴定由在癌患者的生物体内与自体癌反应而产生的抗体识别的肿瘤抗原的 SEREX( 重组体表达克隆抗原的血清学鉴定， serological identifications of antigens by recombinant expression cloning) 法 ( 专利文献 1、 非专利文献 2)， 通过该方法， 若干 癌抗原被分离。进而以其一部分为靶标开始了癌免疫疗法的临床试验。
另一方面， 与人同样地， 在狗、 猫中也已知乳腺肿瘤、 扁平上皮癌等多种肿瘤， 在 狗、 猫的疾病统计中也被列为上位。 然而， 对狗、 猫的癌有效的治疗药、 预防药和诊断药现在 还不存在。 基本上大部分的狗、 猫的肿瘤是在发展而肿瘤变大之后饲养者才觉察到， 大多即 使入院通过外科手术切除、 施用人体药 ( 抗癌剂等 ) 也已经错过时间而处置后不久就死亡。 在这样的现状中， 如果能够获得对狗、 猫有效的癌的治疗药和预防药， 则可期待开辟对狗的 癌的用途。
报告了 PDS5A(PDS5， regulator of cohesion maintenance， homolog A) 是也被 称为别名 SSC-112 的蛋白质， 被鉴定为参与染色体的分配时的细胞周期控制因子， 与正常 组织相比， 在鼻咽癌、 肾癌、 肝癌、 乳癌细胞的 1 种中表达高 ( 专利文献 2、 非专利文献 3 ～ 5)。而且报告了， 通过使用与针对 PDS5A 基因的反义核酸、 核酶、 siRNA 或 PDS5A 蛋白质特 异性结合的抗体来抑制癌细胞中的 PDS5A 的表达， 可以抑制癌细胞的增殖， 此外， 通过施用 PDS5A 全长蛋白质或 PDS5A 蛋白质的部分肽， 可以诱导癌细胞凋亡 ( 专利文献 3)。此外， 专 利文献 3 确认了癌细胞中 PDS5A 蛋白质的 mRNA 量的增加。然而还没有报告 PDS5A 蛋白质 和该蛋白质的部分肽具有对癌细胞的免疫诱导活性， 从而该蛋白质和该蛋白质的部分肽在 癌的治疗、 预防中是有用的， 对 PDS5A 蛋白质是否具有作为能够用于癌的诊断的标志物的 功能还未被确认。
现有技术文献
专利文献
专利文献 1 ： 美国专利第 5698396 号
专利文献 2 ： WO2006/109943 专利文献 3 ： WO2002/081641 非专利文献 非专利文献 1 ： Science， 254 ： 1643-1647(1991) 非专利文献 2 ： Proc.Natl.Acad.Sci.USA， 92 ： 11810-11813(1995) 非专利文献 3 ： Gene.17 ； 328 ： 187-96(2004) 非专利文献 4 ： J.Cell.Sci.15 ； 118(Pt 10) ： 2133-41(2005) 非专利文献 5 ： J.Cancer Res.Clin.Oncol. ： 134(4) ： 453-62(2008)发明内容 发明所要解决的课题
本发明的目的是， 发现癌的治疗剂和 / 或预防剂、 或对癌的检测有用的新的多肽， 提供该多肽的免疫诱导剂或对癌的检测的应用。
用于解决课题的手段
本申请发明者们深入研究的结果是， 通过使用了来源于狗乳癌的 cDNA 文库和荷 瘤狗的血清的 SEREX 法， 取得编码与来源于荷瘤生物体的血清中存在的抗体结合的蛋白质 的 cDNA， 以该 cDNA 为基础， 制作具有序列号 2 所示的氨基酸序列的狗 PDS5， regulator of cohesion maintenance， homolog A( 以下， 记为 PDS5A) 蛋白。此外， 以取得的基因的人和 小鼠同源基因为基础， 制作具有序列号 4 或 44 所示的氨基酸的人 PDS5A( 另外， 序列号 4 相 当于序列号 44 的部分序列。) 和具有序列号 6 所示的氨基酸序列的小鼠 PDS5A。然后发现 这些 PDS5A 在乳癌、 脑肿瘤、 食道癌、 肺癌、 肾癌、 大肠癌、 肛周腺癌、 神经母细胞瘤和白血病 的组织或细胞中特异性表达。此外还发现， 通过对生物体施用这些 PDS5A， 可以在生物体内 诱导针对 PDS5A 的免疫细胞， 以及可以使表达 PDS5A 的生物体内的肿瘤萎缩。此外还发现，
能够表达编码 PDS5A 的全长蛋白质或其片段的多核苷酸的重组载体对表达 PDS5A 的癌在生 物体内诱导抗肿瘤效果。
此外还发现， PDS5A 的部分肽通过抗原呈递细胞被呈递， 具有使对该肽特异性的细 胞毒性 T 细胞活化和增殖的能力 ( 免疫诱导活性 )， 因此， 该肽对癌的治疗和 / 或预防是有 用的， 而且， 与该肽接触的抗原呈递细胞、 与该抗原呈递细胞接触的 T 细胞对癌的治疗和 / 或预防是有用的， 从而完成了本发明。
因此， 本发明具有以下的特征。
(1). 一种免疫诱导剂， 其中， 作为有效成分， 含有选自以下 (a) ～ (c) 的任一多肽 类、 并且具有免疫诱导活性的至少 1 种多肽， 或者含有包含编码该多肽的多核苷酸、 并能够 在生物体内表达该多肽的重组载体，
(a) 由序列表的序列号 2、 4、 6、 8、 10、 12 或 44 所示的氨基酸序列中的连续 7 个以上 氨基酸组成的多肽，
(b) 与所述 (a) 的多肽具有 90％以上的序列同一性、 并且由 7 个以上氨基酸组成 的多肽，
(c) 包含所述 (a) 或 (b) 的多肽作为部分序列的多肽。
(2). 根据 (1) 所述的免疫诱导剂， 所述 (b) 的多肽是与所述 (a) 的多肽具有 95％以上的序列同一性的多肽。
(3). 根据 (1) 所述的免疫诱导剂， 所述具有免疫诱导活性的多肽是 ： 由序列号 2、 4、 6、 8、 10、 12 或 44 所示的氨基酸序列中的连续 7 个以上氨基酸组成的多肽、 或包含该多肽 作为部分序列的多肽 ； 或者在由序列号 2、 4、 6、 8、 10、 12 或 44 所示的氨基酸序列中的连续 7 个以上氨基酸组成的多肽中缺失、 取代或添加了 1 个～数个氨基酸的多肽、 或包含该多肽 作为部分序列的多肽。
(4). 根据 (3) 所述的免疫诱导剂， 所述具有免疫诱导活性的多肽是具有序列表的 序列号 2、 4、 6、 8、 10、 12 或 44 的氨基酸序列的多肽。
(5). 根据 (3) 所述的免疫诱导剂， 所述具有免疫诱导活性的多肽是 ： 由序列表的 序列号 2、 6、 8、 10、 12 或 44 所示的氨基酸序列中的 aa111 ～ 140、 aa211 ～ 240、 aa248 ～ 278、 aa327 ～ 357、 aa459 ～ 522、 aa909 ～ 972、 aa959 ～ 1022、 aa994 ～ 1057 或 aa1018 ～ 1080 的区域内的连续 7 个以上氨基酸组成的多肽、 或包含该多肽作为部分序列的多肽 ； 或 者在由序列表的序列号 2、 6、 8、 10、 12 或 44 所示的氨基酸序列中的 aa111 ～ 140、 aa211 ～ 240、 aa248 ～ 278、 aa327 ～ 357、 aa459 ～ 522、 aa909 ～ 972、 aa959 ～ 1022、 aa994 ～ 1057 或 aa1018 ～ 1080 的区域内的连续 7 个以上氨基酸组成的多肽中缺失、 取代或添加了 1 个～ 数个氨基酸的多肽、 或包含该多肽作为部分序列的多肽。
(6). 根据 (5) 所述的免疫诱导剂， 所述具有免疫诱导活性的多肽是 ： 由序列表的 序列号 27 ～ 35 所示的氨基酸序列组成的多肽、 或包含该多肽作为部分序列并且氨基酸残 基数为 10 ～ 12 的多肽 ； 或者在由序列表的序列号 27 ～ 35 所示的氨基酸序列组成的多肽 中缺失、 取代或添加了 1 个～数个氨基酸的多肽、 或包含该多肽作为部分序列并且氨基酸 残基数为 10 ～ 12 的多肽。
(7). 根据 (1) ～ (6) 的任一项所述的免疫诱导剂， 其用于预防动物的癌。
(8). 根据 (5) 或 (6) 所述的免疫诱导剂， 其用于治疗动物的癌。
(9). 根据 (7) 或 (8) 所述的免疫诱导剂， 所述癌是表达 PDS5A 的癌。
(10). 根据 (7) ～ (9) 的任一项所述的免疫诱导剂， 所述癌是乳癌、 脑肿瘤、 食道 癌、 肺癌、 肾癌、 大肠癌、 肛周腺癌、 神经母细胞瘤或白血病。
(11). 根据 (1) ～ (10) 的任一项所述的免疫诱导剂， 其还包含免疫增强剂。
(12). 一种分离的抗原呈递细胞， 其包含所述具有免疫诱导活性的多肽与 MHC 分 子的复合体。
(13). 一种分离的 T 细胞， 其选择性结合所述具有免疫诱导活性的多肽与 MHC 分子 的复合体。
(14). 一种具有免疫诱导活性的多肽， 该多肽是 ： 由序列表的序列号 27 ～ 35 所示 的氨基酸序列组成的多肽、 或包含该多肽作为部分序列并且氨基酸残基数为 10 ～ 12 的多 肽； 或者在由序列表的序列号 27 ～ 35 所示的氨基酸序列组成的多肽中缺失、 取代或添加了 1 个～数个氨基酸的多肽、 或包含该多肽作为部分序列并且氨基酸残基数为 10 ～ 12 的多 肽。
(15). 一种癌的检测方法， 其包括下述步骤 ： 针对从生物体分离出的试样， 测定由 序列表的序列号 2、 4、 6、 8、 10、 12 或 44 所示的氨基酸序列组成的多肽、 或与该多肽具有 90％ 以上的序列同一性的多肽的表达。(16). 一种免疫诱导方法， 其包括下述步骤 ： 向个体施用选自以下 (a) ～ (c) 的多 肽类、 并且具有免疫诱导活性的至少 1 种多肽， 或者施用包含编码该多肽的多核苷酸、 并能 够在生物体内表达该多肽的重组载体，
(a) 由序列表的序列号 2、 4、 6、 8、 10、 12 或 44 所示的氨基酸序列中的连续 7 个以上 氨基酸组成的多肽，
(b) 与所述 (a) 的多肽具有 90％以上的序列同一性、 并且由 7 个以上氨基酸组成 的多肽，
(c) 包含所述 (a) 或 (b) 的多肽作为部分序列的多肽。
发明的效果
根据本发明， 提供对癌的治疗和 / 或预防等有用的新的免疫诱导剂。如后述的实 施例中具体所示， 如果对生物体施用本发明中使用的多肽， 则可以在生物体内诱导免疫细 胞， 而且可以使已经产生的癌缩小或萎缩。因此， 该多肽对癌的治疗、 预防是有用的。 附图说明
图 1 是显示鉴定出的 PDS5A 基因的、 在狗正常组织和肿瘤组织或癌细胞株中的表 达模式的图。参照编号 1 ： 狗 PDS5A 基因在狗的各组织和细胞株中的表达模式， 参照编号 2 ： 狗 GAPDH 基因在狗的各组织和细胞株中的表达模式。 图 2 是显示鉴定出的 PDS5A 基因的、 在人正常组织和肿瘤组织或癌细胞株中的表 达模式的图。参照编号 3 ： 人 PDS5A 基因在人的各组织和细胞株中的表达模式， 参照编号 4 ： 人 GAPDH 基因在人的各组织和细胞株中的表达模式。
图 3 是显示鉴定出的 PDS5A 基因的、 在小鼠正常组织和肿瘤组织或癌细胞株中的 表达模式的图。参照编号 5 ： 表示小鼠 PDS5A 基因在小鼠的各组织和细胞株中的表达模式， 参照编号 6 ： 表示小鼠 GAPDH 基因在小鼠的各组织和细胞株中的表达模式。
图 4 是显示通过 PDS5A 施用而确认了抗肿瘤效果 ( 治疗模型 - 神经母细胞瘤细胞 株 ) 的图。使用基因枪免疫仅载体、 或编码 PDS5A 的质粒， 以癌部的面积、 生存小鼠的比例 来评价。此外， 各组使用了 10 只小鼠。对小鼠 1 周进行 2 次观察。数据以平均值 ±SD 表 示。参照编号 7 ： 表示载体的质粒的施用组， 参照编号 8 ： 表示编码 PDS5A 的质粒的施用组。
图 5 是显示通过 PDS5A 施用而确认了抗肿瘤效果 ( 预防模型 - 神经母细胞瘤细胞 株 ) 的图。使用基因枪免疫仅载体、 或编码 PDS5A 的质粒， 以癌部的面积、 生存小鼠的比例 来评价。此外， 各组使用了 10 只小鼠。对小鼠 1 周进行 2 次观察。数据以平均值 ±SD 表 示。 参照编号 9 ： 表示载体的质粒的施用组， 参照编号 10 ： 表示编码 PDS5A 的质粒的施用组。
图 6 显示图 4 的实验中的小鼠的生存的比例。参照编号 11 ： 表示载体的质粒的施 用组， 参照编号 12 ： 表示编码 PDS5A 的质粒的施用组。
图 7 显示图 5 的实验中的小鼠的生存的比例。参照编号 13 ： 表示载体的质粒的施 用组， 参照编号 14 ： 表示编码 PDS5A 的质粒的施用组。
图 8 是显示通过 PDS5A 施用而确认了抗肿瘤效果 ( 治疗模型 - 大肠癌细胞株 ) 的 图。使用基因枪免疫仅载体、 或编码 PDS5A 的质粒， 以癌部的面积、 生存小鼠的比例来评价。 此外， 各组使用了 10 只小鼠。对小鼠 1 周进行 2 次观察。数据以平均值 ±SD 表示。参照 编号 15 ： 表示载体的质粒的施用组， 参照编号 16 ： 表示编码 PDS5A 的质粒的施用组。
图 9 是显示通过 PDS5A 施用而确认了抗肿瘤效果 ( 预防模型 - 大肠癌细胞株 ) 的 图。使用基因枪免疫仅载体、 或编码 PDS5A 的质粒， 以癌部的面积、 生存小鼠的比例来评价。 此外， 各组使用了 10 只小鼠。对小鼠 1 周进行 2 次观察。数据以平均值 ±SD 表示。参照 编号 17 ： 表示载体的质粒的施用组， 参照编号 18 ： 表示编码 PDS5A 的质粒的施用组。
图 10 显示图 8 的实验中的小鼠的生存的比例。参照编号 19 ： 表示载体的质粒的 施用组， 参照编号 20 ： 表示编码 PDS5A 的质粒的施用组。
图 11 显示图 9 的实验中的小鼠的生存的比例。参照编号 21 ： 表示载体的质粒的 施用组， 参照编号 22 ： 表示编码 PDS5A 的质粒的施用组。
图 12 是显示对具有序列表的序列号 27 ～ 35 所示的氨基酸序列的各多肽特异性 的 CD8 阳性 T 细胞识别该多肽与 HLA-A0201 的复合体而产生 IFN-γ 的图。图 12 中， 横轴 的参照编号 25 ～ 33 分别表示使用序列号 27 ～ 35 的肽刺激 T2 细胞而得的 HLA-A0201 阳 性的 CD8 阳性 T 细胞的 IFN-γ 产生能力。参照编号 23 显示未添加多肽而进行上述处理的 情况的结果， 参照编号 24 显示添加序列号 36 所示的本发明的范围外的多肽进行上述处理 的结果。
图 13 是显示对具有序列表的序列号 27 ～ 35 所示的氨基酸序列的各肽特异性的 CD8 阳性 T 细胞的、 对癌细胞的细胞毒活性的图。图 13 中， 横轴的参照编号 36 ～ 44 分别显 示使用序列号 27 ～ 35 的肽进行刺激而得的 HLA-A0201 阳性的 CD8 阳性 T 细胞对 T98G 细 胞的细胞毒活性。参照编号 34 显示未添加多肽而进行了诱导的 CD8 阳性 T 细胞的细胞毒 活性， 参照编号 35 显示使用阴性对照的肽 ( 序列号 36) 进行了诱导的 CD8 阳性 T 细胞的细 胞毒活性。 具体实施方式 作为在本发明的免疫诱导剂中作为有效成分而被包含的多肽， 可列举以下多肽。 另外， 在本发明中， “多肽” 是指多个氨基酸通过肽键而形成的分子， 不仅包含构成的氨基酸 数多的多肽分子， 而且包含氨基酸数少的低分子量的分子 ( 寡肽 )、 全长蛋白质， 本发明中 也包含具有序列号 2、 4、 6、 8、 10、 12 或 44 所示的氨基酸序列的 PDS5A 的全长蛋白质。
(a) ： 由具有序列表的序列号 2、 4、 6、 8、 10、 12 或 44 所示的氨基酸序列的多肽中的 连续 7 个以上氨基酸组成， 并具有免疫诱导活性的多肽，
(b) ： 与 (a) 的多肽具有 90％以上的序列同一性， 由 7 个以上氨基酸组成， 并具有 免疫诱导活性的多肽，
(c) ： 包含 (a) 或 (b) 的多肽作为部分序列， 并具有免疫诱导活性的多肽。
另外， 在本发明中， “具有氨基酸序列” 是指氨基酸残基以这样的顺序排列。因此， 例如， “具有序列号 2 所示的氨基酸序列的多肽” 意味着， 具有序列号 2 所示的 Met Asp Phe Thr......( 中间省略 )......Asp Leu Gln Arg 的氨基酸序列的、 大小为 1337 氨基酸残基 的多肽。此外， 例如， 有时将 “具有序列号 2 所示的氨基酸序列的多肽” 简写为 “序列号 2 的 多肽” 。关于 “具有碱基序列” 这样的表达也是同样的。该情况下， “具有” 这样的用语可以 以 “由 ...... 组成” 这样的表达替换。
这里， “免疫诱导活性” 意味着在生物体内诱导能分泌干扰素等细胞因子的免疫细 胞的能力。
上述多肽是否具有免疫诱导活性可以使用例如公知的酶联免疫斑点 (ELISPOT) 测定法等来确认。 具体而言， 例如后述的实施例中记载的那样， 从施用了要评价免疫诱导活 性的多肽的生物体获得外周血单核细胞等细胞， 将该细胞与该多肽共培养， 使用特异性抗 体测定由该细胞产生的细胞因子产生量， 从而可以测定该细胞中的免疫细胞数， 由此可以 评价免疫诱导活性。
此外， 如后述的实施例中所记载的那样， 如果对荷瘤生物体施用上述 (a) ～ (c) 的 重组多肽， 则也可以通过其免疫诱导活性使肿瘤萎缩。 因此， 上述免疫诱导活性也可以作为 抑制癌细胞增殖或使癌组织 ( 肿瘤 ) 缩小或消失的能力 ( 以下， 称为 “抗肿瘤活性” ) 来评 价。多肽的抗肿瘤活性例如后述的实施例中具体记载的那样， 可以通过实际上对荷瘤生物 体施用该多肽来研究肿瘤是否缩小等从而确认。
或者， 通过研究用该多肽刺激的 T 细胞 ( 即， 与呈递该多肽的抗原呈递细胞接触的 T 细胞 ) 是否在生物体外对肿瘤细胞显示细胞毒活性， 也可以评价多肽的抗肿瘤活性。T 细 胞与抗原呈递细胞的接触如后述那样， 可以通过将两者在液体培养基中共培养来进行。细 胞毒活性的测定可以通过例如 Int.J.Cancer， 58 ： p317， 1994 中记载的被称为 51Cr 释放测定 法的公知方法来进行。在将上述多肽用于癌的治疗和 / 或预防用途的情况下， 没有特别的 限制， 但优选以抗肿瘤活性作为指标来评价免疫诱导活性。 本发明公开的序列表的序列号 2、 4、 6、 8、 10、 12 或 44 中分别显示的氨基酸序列是 通过使用了来源于狗精巢的 cDNA 文库和荷瘤狗的血清的 SEREX 法， 作为来源于荷瘤狗的 血清中特异性存在的抗体结合的多肽和该多肽的人 ( 序列号 4 和 44)、 小鼠 ( 序列号 6)、 牛 ( 序列号 8)、 马 ( 序列号 10) 和鸡 ( 序列号 12) 同源因子而被分离出的 PDS5A 蛋白质的 氨基酸序列 ( 参照实施例 1)。另外， 对于作为狗 PDS5A 的人同源因子的人 PDS5A， 序列同一 性为碱基序列 94％、 氨基酸序列 99％， 对于作为小鼠同源因子的小鼠 PDS5A， 序列同一性为 碱基序列 91％、 氨基酸序列 99％， 对于作为牛同源因子的牛 PDS5A， 序列同一性为碱基序列 95％、 氨基酸序列 99％， 对于作为马同源因子的马 PDS5A， 序列同一性为碱基序列 96％、 氨 基酸序列 99％， 对于作为鸡同源因子的鸡 PDS5A， 序列同一性为碱基序列 83％、 氨基酸序列 98％。
上述 (a) 的多肽为由具有序列号 2、 4、 6、 8、 10、 12 或 44 所示的氨基酸序列的多肽 中的连续 7 个以上、 优选为连续 8、 9 或 10 个以上氨基酸组成的多肽， 其具有免疫诱导活性。 特别优选该多肽具有序列号 2、 4、 6、 8、 10、 12 或 44 所示的氨基酸序列。另外， 如本领域中公 知的那样， 只要是约 7 个氨基酸残基以上的多肽就能够发挥抗原性和免疫原性。因此， 只要 是序列号 2、 4、 6、 8、 10、 12 或 44 的氨基酸序列中的连续 7 个氨基酸残基以上的多肽， 就能够 具有免疫诱导活性， 因此可以用于本发明的免疫诱导剂的调制。
此外， 作为通过施用癌抗原多肽进行的免疫诱导的原理， 已知多肽被抗原呈递细 胞摄取， 然后在该细胞内受到通过被肽酶分解而变成更小的片段， 被呈递至该细胞的表面 上， 细胞毒性 T 细胞等识别该片段， 选择性杀死呈递该抗原的细胞。被呈递至抗原呈递细胞 的表面上的多肽的尺寸比较小， 以氨基酸数计为 7 ～ 30 左右。因此， 从呈递至抗原呈递细 胞上这样的观点出发， 作为上述 (a) 的多肽， 优选形态之一为序列号 2、 4、 6、 8、 10、 12 或 44 所示的氨基酸序列中的连续 7 ～ 30 左右， 更优选只要是由 8 ～ 30 或 9 ～ 30 左右的氨基酸 组成的多肽即是充分的。这些比较小的尺寸的多肽也有时不摄取至抗原呈递细胞内， 而直
接被呈递至抗原呈递细胞上的细胞表面。
此外， 被摄取到抗原呈递细胞的多肽通过该细胞内的肽酶而在任意位置被切割， 产生各种多肽片段， 这些多肽片段被呈递至抗原呈递细胞表面上， 因此如果施用序列号 2、 4、 6、 8、 10、 12 或 44 的全长区域那样的大尺寸的多肽， 则由于在抗原呈递细胞内的分解而在 介由抗原呈递细胞的免疫诱导中必然产生有效的多肽片段。因此， 对于介由抗原呈递细胞 的免疫诱导而言， 可以优选使用尺寸大的多肽， 氨基酸数可以为 30 以上， 更优选为 100 以 上， 进一步优选为 200 以上， 进一步优选为 250 以上， 进一步优选为序列号 2、 4、 6、 8、 10、 12 或 44 的全长区域的多肽。
此外， 本发明的多肽可以通过能够检索由具有 HLA 的各型结合基序的 8 ～ 12 个、 优选为 9 ～ 10 个氨基酸组成的表位肽的比对媒介例如 Bioinformatics & molecular Analysis Selection(BIMAS) 的 HLA Peptide Binding Predictions(http://bimas.dcrt. nih.gov/molbio/hla_bind/index.html) 来比对， 从而筛选能够成为表位肽的肽。具体 而言， 优选由序列号 2、 6、 8、 10、 12 或 44 所示的氨基酸序列中的氨基酸残基编号 aa111 ～ 140、 aa211 ～ 240、 aa248 ～ 278、 aa327 ～ 357、 aa459 ～ 522、 aa909 ～ 972、 aa959 ～ 1022、 aa994 ～ 1057 或 aa1018 ～ 1080 的区域内的连续 7 个以上氨基酸组成的多肽， 此外更优选 在序列号 4 或 44 的多肽中序列号 27 ～ 35 所示的多肽， 或者包含由序列号 27 ～ 35 所示的 氨基酸序列组成的多肽作为部分序列、 且氨基酸残基数为 10 ～ 12 的多肽。
上述 (b) 的多肽是在上述 (a) 的多肽中取代、 缺失和 / 或插入了少数 ( 优选为 1 个或数个 ) 氨基酸残基， 与原序列具有 90％以上、 优选为 95％以上、 更优选为 98％以上、 进 一步优选为 99％以上或 99.5％以上的序列同一性， 并且具有免疫诱导活性的多肽。一般而 言， 本领域技术人员公知， 在蛋白质抗原中， 有时即使在该蛋白质的氨基酸序列中取代、 缺 失或插入了少数氨基酸残基， 也与原蛋白质具有几乎相同的抗原性。因此， 上述 (b) 的多肽 也能够发挥免疫诱导活性， 因此可以用于本发明的免疫诱导剂的调制。此外， 上述 (b) 的多 肽也优选为在序列号 2、 4、 6、 8、 10、 12 或 44 所示的氨基酸序列中取代、 缺失和 / 或插入了 1 个～数个氨基酸残基的多肽。本说明书中的 “数个” 表示 2 ～ 10 的整数， 优选为 2 ～ 6 的 整数， 更优选为 2 ～ 4 的整数。
这里， 氨基酸序列或碱基序列的 “序列同一性” 是指， 以要比较的 2 个氨基酸序列 ( 或碱基序列 ) 的氨基酸残基 ( 或碱基 ) 尽量多地一致的方式使两氨基酸序列 ( 或碱基序 列 ) 排列， 将一致的氨基酸残基数 ( 或一致的碱基数 ) 除以全部氨基酸残基数 ( 或全部碱基 数 ) 而得的结果以百比率表示的数值。在上述排列时， 根据需要， 在进行比较的 2 个序列的 一者或双者中插入适当缺口。这样的序列的排列化可以使用例如 BLAST、 FASTA、 CLUSTALW 等公知的程序来进行。在插入了缺口的情况下， 上述全部氨基酸残基数为将 1 个缺口算作 1 个氨基酸残基后的残基数。这样算出的全部氨基酸残基数在进行比较的 2 个序列之间不 同的情况下， 序列同一性 (％ ) 是将一致的氨基酸残基数除以较长序列的全氨基酸残基数 而算出的。
另外已知， 构成天然的蛋白质的 20 种氨基酸可以如下分组成具有类似性质的氨 基酸 ： 具有低极性侧链的中性氨基酸 (Gly、 Ile、 Val、 Leu、 Ala、 Met、 Pro)、 具有亲水性侧链 的中性氨基酸 (Asn、 Gln、 Thr、 Ser、 Tyr、 Cys)、 酸性氨基酸 (Asp、 Glu)、 碱性氨基酸 (Arg、 Lys、 His)、 芳香族氨基酸 (Phe、 Tyr、 Trp)， 如果在它们之间进行取代， 则一般多肽的性质无变化。因此， 在取代本发明的上述 (a) 的多肽中的氨基酸残基的情况下， 通过在这些各组之 间取代， 可以维持免疫诱导活性的可能性较高， 因此是优选的。
另外， 作为成为上述的表位肽的上述 (b) 的多肽， 优选为在由序列号 2、 6、 8、 10、 12 或 44 所示的氨基酸序列中的 aa111 ～ 140、 aa211 ～ 240、 aa248 ～ 278、 aa327 ～ 357、 aa459 ～ 522、 aa909 ～ 972、 aa959 ～ 1022、 aa994 ～ 1057 或 aa1018 ～ 1080 的区域内的连 续 7 个以上氨基酸组成的多肽中缺失、 取代或添加了 1 个～数个氨基酸、 并且具有免疫诱导 活性的多肽， 或者包含该多肽作为部分序列、 并且具有免疫诱导活性的多肽， 更优选为在序 列号 4 或 44 的多肽中或者由序列号 27 ～ 35 所示的氨基酸序列组成的多肽中缺失、 取代或 添加了 1 个～数个氨基酸、 并且具有免疫诱导活性的多肽， 或者包含该多肽作为部分序列、 并且氨基酸残基数为 10 ～ 12 的多肽。
上述 (c) 的多肽是包含上述 (a) 或 (b) 的多肽作为部分序列， 并具有免疫诱导活 性的多肽。即， 是在 (a) 或 (b) 的多肽的一端或两端添加了其它氨基酸或多肽， 并具有免疫 诱导活性的多肽。这样的多肽也可以用于本发明的免疫诱导剂的调制。
另外， 作为成为上述的表位肽的上述 (c) 的多肽， 优选为包含由序列号 2、 6、 8、 10、 12 或 44 所示的氨基酸序列中的 aa111 ～ 140、 aa211 ～ 240、 aa248 ～ 278、 aa327 ～ 357、 aa459 ～ 522、 aa909 ～ 972、 aa959 ～ 1022、 aa994 ～ 1057 或 aa1018 ～ 1080 的区域内的连 续 7 个以上氨基酸组成的多肽作为部分序列的多肽， 更优选为在序列号 4 或 44 的多肽中由 序列号 27 ～ 35 所示的氨基酸序列组成的多肽中缺失、 取代或添加了 1 个～数个氨基酸的 多肽， 或者包含该多肽作为部分序列、 并包含氨基酸残基数为 10 ～ 12 的多肽作为部分序列 的多肽。 上述的多肽可以按照例如 Fmoc 法 ( 芴基甲氧羰基法 )、 tBoc 法 ( 叔丁氧羰基法 ) 等化学合成法来合成。此外， 也可以利用各种市售的肽合成仪通过常规方法来合成。此外， 可以通过使用公知的基因工程方法， 制备编码上述多肽的多核苷酸， 将该多核苷酸整合到 表达载体中并导入宿主细胞中， 通过在该宿主细胞中生产多肽， 从而获得作为目标的多肽。
编码上述多肽的多核苷酸可以通过公知的基因工程方法和 / 或使用市售的核酸 合成仪的常规方法来容易地制备。例如， 通过使用狗染色体 DNA 或 cDNA 文库作为模板， 使 用以可以扩增序列号 1 中记载的碱基序列的方式设计的一对引物进行 PCR， 从而可以制备 具有序列号 1 的碱基序列的 DNA。如果是具有序列号 3 或 43 的碱基序列的 DNA， 可以通过 使用人染色体 DNA 或 cDNA 文库作为上述模板来同样地制备。PCR 的反应条件可以适当设 定， 可以列举例如， 将由在 94℃经 30 秒 ( 变性 )、 在 55℃经 30 秒～ 1 分钟 ( 退火 )、 在 72℃ 经 2 分钟 ( 伸长 ) 构成的反应历程作为 1 循环， 进行例如 30 循环后， 在 72℃反应 7 分钟的 条件等， 但不限于此。此外， 基于本说明书中的序列表的序列号 1、 3、 5、 7、 9、 11 或 43 所示的 碱基序列和氨基酸序列的信息， 来制备适当的探针、 引物， 使用它们来筛选狗、 人等的 cDNA 文库， 从而可以分离所需的 DNA。cDNA 文库优选由表达序列号 2、 4、 6、 8、 10、 12 或 44 的蛋白 质的细胞、 器官或组织来制作。上述的探针或引物的制备、 cDNA 文库的构建、 cDNA 文库的 筛选以及目标基因的克隆化等操作对本领域技术人员而言是已知的， 例如， 可以按照例如 モレキユラ一クロニング ( 分子克隆实验指南 ) 第 2 版， カレント·プロトコ一ルズ·イ ン·モレキユラバイオロジ一等中记载的方法来进行。可以由这样获得的 DNA 来获得编码 上述 (a) 的多肽的 DNA。此外， 编码各氨基酸的密码子是公知的， 因此可以容易地特定编码
特定氨基酸序列的多核苷酸的碱基序列。因此， 也可以容易地特定编码上述 (b) 或 (c) 的 多肽的多核苷酸的碱基序列， 因此这样的多核苷酸也可以使用市售的核酸合成仪通过常规 方法来容易地合成。
作为上述宿主细胞， 只要是能够表达上述多肽的细胞即可， 作为原核细胞的例子， 可列举大肠杆菌等， 作为真核细胞的例子， 可列举猴肾细胞 COS1、 中国仓鼠卵巢细胞 CHO 等 哺乳动物培养细胞、 芽殖酵母、 裂殖酵母、 蚕细胞、 爪蟾卵细胞等， 但不限于此。
在使用原核细胞作为宿主细胞的情况下， 作为表达载体， 使用具有能够在原核细 胞中复制的复制起点、 启动子、 核糖体结合部位、 DNA 克隆化部位、 终止子等的表达载体。作 为大肠杆菌用表达载体， 可以例示 pUC 系、 pBluescriptII、 pET 表达系统、 pGEX 表达系统 等。如果将编码上述多肽的 DNA 整合到这样的表达载体中， 用该载体转化原核宿主细胞， 然 后培养所得的转化体， 则可以使由上述 DNA 所编码的多肽在原核宿主细胞中表达。此时， 也 可以使该多肽以与其它蛋白质的融合蛋白质的形式表达。
在使用真核细胞作为宿主细胞的情况下， 作为表达载体， 使用具有启动子、 剪接 区域、 多 (A) 添加部位等的真核细胞用表达载体。作为那样的表达载体， 可以例示 pKA1、 pCDM8、 pSVK3、 pMSG、 pSVL、 pBK-CMV、 pBK-RSV、 EBV 载体、 pRS、 pcDNA3、 pMSG、 pYES2 等。与上 述同样地， 如果将编码上述多肽的 DNA 整合到这样的表达载体中， 用该载体转化真核宿主 细胞， 然后培养所得的转化体， 则可以使由上述 DNA 所编码的多肽在真核宿主细胞中表达。 在使用 pIND/V5-His、 pFLAG-CMV-2、 pEGFP-N1、 pEGFP-C1 等作为表达载体的情况下， 可以作 为添加了 His 标签、 FLAG 标签、 myc 标签、 HA 标签、 GFP 等各种标签的融合蛋白质来表达上 述多肽。 表达载体向宿主细胞的导入可以使用电穿孔法、 磷酸钙法、 脂质体法、 DEAE 葡聚糖 法等公知的方法。
为了从宿主细胞中分离纯化目的多肽， 可以组合公知的分离操作来进行。可列举 例如通过尿素等变性剂和 / 或表面活性剂进行的处理、 超声波处理、 酶消化、 盐析和 / 或溶 剂分级沉淀法、 透析、 离心分离、 超滤、 凝胶过滤、 SDS-PAGE、 等电点电泳、 离子交换色谱法、 疏水色谱法、 亲和色谱法、 反相色谱法等， 但不限于此。
通过以上的方法而获得的多肽中如上所述也包含处于与其它任意的蛋白质的融 合蛋白质的形态的多肽。例如， 可以例示与谷胱甘肽 -S- 转移酶 (GST) 和 / 或 His 标签的 融合蛋白质等。这样的融合蛋白质形态的多肽也作为上述 (c) 的多肽而包含在本发明的范 围内。此外， 有时在转化细胞中被表达的多肽在被翻译之后在细胞内受到各种修饰。这样 的经翻译后修饰的多肽只要具有免疫诱导活性也包含在本发明的范围内。 作为这样的翻译 后修饰， 可以例示 N 末端蛋氨酸的脱离、 N 末端乙酰化、 附加糖链、 通过细胞内蛋白酶进行的 限制性分解、 肉豆蔻酰化、 异戊二烯基化、 磷酸化等。
如后述的实施例中具体记载的那样， 如果对荷瘤生物体施用包含上述具有免疫诱 导活性的多肽或编码该多肽的基因的表达载体， 则可以使已经产生的肿瘤萎缩。 此外， 通过 对癌发作前的生物体施用上述的具有免疫诱导活性的多肽或编码多肽的基因， 可以预防肿 瘤的发生。因此， 本发明的免疫诱导剂可以作为癌的治疗剂和 / 或预防剂使用。此外， 上述 的具有免疫诱导活性的多肽可以用于通过免疫诱导进行的癌的治疗和 / 或预防方法。
这里， “肿瘤” 和 “癌” 这样的用语意味着恶性赘生物， 可互换使用。
在该情况下， 作为对象的癌只要是表达 PDS5A 的癌即可， 则没有特别的限制， 但优 选为乳癌、 脑肿瘤、 食道癌、 肺癌、 肾癌、 大肠癌、 肛周腺癌、 神经母细胞瘤或白血病。
此外， 作为对象的动物优选为哺乳动物， 更优选为包含灵长类、 宠物、 家畜类、 竞技 用动物等的哺乳动物， 特别优选为人、 狗或猫。
本发明的免疫诱导剂对生物体的施用途径可以为经口施用也可以为非经口施用， 但优选为肌肉内施用、 皮下施用、 静脉内施用、 动脉内施用等非经口施用。在为了癌的治疗 而使用该免疫诱导剂的情况下， 为了提高抗癌作用， 如后述的实施例中记载的那样， 也可以 施用于作为治疗对象的肿瘤的附近的所属淋巴结。施用量只要是对免疫诱导有效的量即 可， 例如如果是用于癌的治疗和 / 或预防， 则只要是对癌的治疗和 / 或预防有效的量即可。 对癌的治疗和 / 或预防有效的量根据肿瘤的大小和 / 或症状等来适当选择， 通常作为相对 于对象动物每 1 天的有效量为 0.0001 ～ 1000μg， 优选为 0.001 ～ 1000μg， 可以 1 次施用 或分成数次施用。优选分成数次， 每隔数日～数月地施用。如后述的实施例中具体所示那 样， 本发明的免疫诱导剂可以使已经形成的肿瘤萎缩。因此， 对发生初期的少数癌细胞也 能够发挥抗癌作用， 因而如果在癌的发作前、 癌的治疗后使用， 则可以防止癌的发作、 复发。 即， 本发明的免疫诱导剂对癌的治疗和预防两者均有用。 本发明的免疫诱导剂可以仅由多肽构成， 也可以适当混合适合各施用方式的药理 学上容许的载体、 稀释剂、 赋形剂等添加剂来制剂。 制剂方法和能够使用的添加剂在药物制 剂的领域是公知的， 可以使用任一方法和添加剂。 作为添加剂的具体例， 可列举生理缓冲液 那样的稀释剂 ； 砂糖、 乳糖、 玉米淀粉、 磷酸钙、 山梨糖醇、 甘氨酸等那样的赋形剂 ； 糖浆、 明 胶、 阿拉伯树胶、 山梨糖醇、 聚氯乙烯、 黄蓍胶等那样的粘合剂 ； 硬脂酸镁、 聚乙二醇、 滑石、 二氧化硅等润滑剂等， 但不限于这些。 作为制剂形态， 可以列举片剂、 胶囊剂、 颗粒剂、 散剂、 糖浆剂等经口施用剂、 吸入剂、 注射剂、 栓剂、 可溶液体制剂等非经口施用剂等。 这些制剂可 以通过一般已知的制法来制作。
本发明的免疫诱导剂可以与能够强化生物体内的免疫应答的免疫增强剂组合使 用。免疫增强剂可以包含在本发明的免疫诱导剂中， 也可以作为另一个组合物而与本发明 的免疫诱导剂合并对患者施用。
作为上述免疫增强剂， 可以列举例如佐剂。佐剂通过提供抗原的储存所 ( 细胞外 或巨噬细胞内 )， 活化巨噬细胞， 并且刺激特定组的淋巴细胞， 从而能够强化免疫应答， 因此 可以提高抗癌作用。因此， 特别是在将本发明的免疫诱导剂用于癌的治疗和 / 或预防的情 况下， 免疫诱导剂优选除了作为有效成分的上述多肽以外还包含佐剂。多种佐剂在本领域 中是公知的， 可以使用任一佐剂。作为佐剂的具体例， 可列举 MPL(SmithKline Beecham)、 沙门氏菌属的明尼苏达沙门氏菌 (Salmonella minnesota)Re 595 脂多糖类的纯化和酸水 解后得到的同类物 ； 从 QS21(SmithKline Beecham)、 皂树 (Quillja saponaria) 提取物中 纯化的纯 QA-21 皂苷 ； PCT 申请 WO96/33739(SmithKline Beecham) 中记载的 DQS21 ； QS-7、 QS-17、 QS-18 和 QS-L1(So 及其其他 10 人， “molecules and cells” ， 1997 年， 第 7 卷， 第 178-186 页 ) ； 弗氏不完全佐剂 ； 弗氏完全佐剂 ； 维生素 E ； Montanide ； 明矾 ； CpG 寡核苷酸 ( 例如参照 Kreig 以及其他 7 人， “Nature” ， 第 374 卷， 第 546-549 页 ) ； 由多聚 IC 及其衍生 物 ( 多聚 ICLC 等 ) 以及鲨烯和 / 或生育酚那样的生物降解性油调制的各种油包水乳液。 其 中， 优选弗氏不完全佐剂、 Montanide、 多聚 IC 及其衍生物以及 CpG 寡核苷酸。上述佐剂与
多肽的混合比典型地为约 1 ∶ 10 ～ 10 ∶ 1， 优选为约 1 ∶ 5 ～ 5 ∶ 1， 更优选为约 1 ∶ 1。 然而， 佐剂不限于上述例示， 本领域公知的除了上述佐剂以外的佐剂也能够在施用本发明 的免疫诱导剂时使用 ( 例如， 参照 Goding 著， “Monoclonal Antibodies ： Principles and Practice” ， 第 2 版， 1986 年 )。多肽和佐剂的混合物或乳液的调制方法对于预防接种领域 技术人员而言是公知的。
此外， 作为上述免疫增强剂， 除了上述佐剂以外， 也可以使用刺激对象的免疫应答 的因子。例如， 可以将具有刺激淋巴细胞、 抗原呈递细胞的特性的各种细胞因子作为免疫 增强剂与本发明的免疫诱导剂组合使用。这样的能够增强免疫应答的多数细胞因子是本 领域技术人员公知的， 作为其例子， 可列举显示强化疫苗的防御作用的白介素 -12(IL-12)、 GM-CSF、 IL-18、 干扰素 α、 干扰素 β、 干扰素 ω、 干扰素 γ 和 Flt3 配体， 但不限于这些。这 样的因子也可以作为上述免疫增强剂使用， 可以包含在本发明的免疫诱导剂中或作为另一 个组合物与本发明的免疫诱导剂合并对患者施用。
此外， 通过使上述多肽与抗原呈递细胞在体外接触， 可以将该多肽呈递至抗原呈 递细胞。 即， 上述 (a) ～ (c) 的多肽可以作为抗原呈递细胞的处理剂来利用。 这里， 作为抗原 呈递细胞， 可以优选使用带有 MHC 类 I 分子的树突细胞或 B 细胞。 已鉴定出各种 MHC I 类分 子， 是公知的。 人中的 MHC 分子称为 HLA。 作为 HLA I 类分子， 可以列举 HLA-A、 HLA-B、 HLA-C， 更具体而言， 可以列举 HLA-A1、 HLA-A0201、 HLA-A0204、 HLA-A0205、 HLA-A0206、 HLA-A0207、 HLA-A11、 HLA-A24、 HLA-A31、 HLA-A6801、 HLA-B7、 HLA-B8、 HLA-B2705、 HLA-B37、 HLA-Cw0401、 HLA-Cw0602 等。
带有 MHC I 类分子的树突细胞或 B 细胞可以通过公知的方法从外周血调制。例 如， 可以从骨髓、 脐带血或患者外周血， 使用粒细胞巨噬细胞集落刺激因子 (GM-CSF) 和 IL-3( 或 IL-4) 来诱导树突细胞， 在其培养体系中加入肿瘤相关肽， 可以诱导肿瘤特异性树 突细胞。
通过施用有效量的该树突细胞， 可以诱导癌的治疗所期望的应答。所使用的细胞 可以使用由健常人提供的骨髓和 / 或脐带血、 患者本人的骨髓和 / 或外周血等， 但在使用患 者本来的自体细胞的情况下， 还可以期待安全性高、 避免严重的副作用。外周血或骨髓可 以为新鲜试样、 低温保存试样和冷冻保存试样的任一种。关于外周血， 可以培养全血， 也可 以仅分离出白血球成分来培养， 但后者在效率方面是优选的。此外在白血球成分中也可以 分离出单核细胞。 此外， 在以骨髓、 脐带血为起源的情况下， 可以培养构成骨髓的整个细胞， 也可以从其中分离出单核细胞来培养。外周血和 / 或其白血球成分、 骨髓细胞中包含作为 树突细胞的起源的单核细胞、 造血干细胞或未成熟树突细胞、 CD4 阳性细胞等。所使用的细 胞因子只要是确认了安全性和生理活性的特性细胞因子即可， 可以为天然型或基因重组型 等， 与其生产方法无关， 优选以必要最低量使用确保了医疗用品质的标品。 添加的细胞因子 的浓度只要是可诱导树突细胞的浓度即可， 没有特别限定， 通常以细胞因子的合计浓度计 优选为 10 ～ 1000ng/mL 左右， 更优选为 20 ～ 500ng/mL 左右。培养可以使用白血球的培养 中通常使用的公知的培养基来进行。培养温度只要能够实现白血球的增殖即可， 没有特别 的限制， 但最优选为人的体温 37℃左右。 此外， 培养中的气体环境只要能够实现白血球的增 殖即可， 没有特别的限制， 优选通气 5％ CO2。此外， 培养时间只要是诱导必要数目的细胞的 时间即可， 没有特别的限制， 通常进行 3 天～ 2 周时间。 供于细胞的分离、 培养的设备可以使用适当的设备， 但优选确认了医疗用安全性并且操作稳定且简便的设备。特别是关于细胞 培养装置， 不限于培养皿、 烧瓶、 瓶等一般容器， 也可以使用叠层型容器、 多级式容器、 滚瓶、 转瓶、 袋式培养器、 中空丝柱等。
使上述多肽与抗原呈递细胞在体外接触的方法本身可以通过公知的方法来进行。 例如， 可以通过将抗原呈递细胞在包含上述多肽的培养液中培养来进行。对培养基中的肽 浓度没有特别的限制， 但通常为 1 ～ 100μg/ml 左右， 优选为 5 ～ 20μg/ml 左右。对培养 3 7 时的细胞密度没有特别的限制， 通常为 10 ～ 10 个细胞 /ml 左右， 优选为 5×104 ～ 5×106 个细胞 /ml 左右。培养优选按照常规方法， 在 37℃、 5％ CO2 气氛中进行。另外， 抗原呈递细 胞可以呈递至表面上的肽的长度通常最大为 30 氨基酸残基左右。因此， 虽然没有特别的限 制， 但使抗原呈递细胞与多肽在体外接触的情况下， 可以将该多肽调制成约 30 氨基酸残基 以下的长度。
通过在上述的多肽共存下培养抗原呈递细胞， 肽被抗原呈递细胞的 MHC 分子摄 取， 呈递至抗原呈递细胞的表面。因此， 可以使用上述多肽来调制包含该多肽与 MHC 分子的 复合体的分离的抗原呈递细胞。这样的抗原呈递细胞可以在生物体内或体外对 T 细胞呈递 该多肽， 诱导对该多肽特异性细胞毒性 T 细胞， 使其增殖。
通过使以上述方式调制的包含上述多肽与 MHC 分子的复合体的抗原呈递细胞与 T 细胞在体外接触， 可以诱导对该多肽特异性的细胞毒性 T 细胞， 使其增殖。这可以通过将上 述抗原呈递细胞与 T 细胞在液体培养基中共培养来进行。例如， 可以如下进行 ： 将抗原呈 递细胞悬浮在液体培养基中， 放入微孔板的孔等容器中， 在其中添加 T 细胞进行培养。对共 培养时的抗原呈递细胞与 T 细胞的混合比率没有特别的限制， 但通常以细胞数的比率计为 1 ∶ 1 ～ 1 ∶ 100 左右， 优选为 1 ∶ 5 ～ 1 ∶ 20 左右。此外， 对悬浮在液体培养基中的抗原 呈递细胞的密度没有特别的限制， 但通常为 100 ～ 1000 万个细胞 /ml 左右， 优选为 10000 ～ 100 万个细胞 /ml 左右。共培养优选按照常规方法在 37 ℃、 5 ％ CO2 气氛中进行。对培养 时间没有特别的限制， 但通常为 2 天～ 3 周， 优选为 4 天～ 2 周左右。此外， 共培养优选在 IL-2、 IL-6、 IL-7 和 IL-12 那样的白介素 1 种或多种的存在下进行。在该情况下， IL-2 和 IL-7 的浓度通常为 5 ～ 20U/ml 左右， IL-6 的浓度通常为 500 ～ 2000U/ml 左右， IL-12 的 浓度通常为 5 ～ 20ng/ml 左右， 但不限于此。上述的共培养可以补加新鲜的抗原呈递细胞 重复进行 1 次～数次。例如， 可以将舍弃共培养后的培养上清液， 添加新鲜的抗原呈递细胞 的悬浮液再进行共培养这样的操作重复 1 次～数次。各共培养的条件与上述同样即可。
通过上述的共培养， 可诱导并增殖对该多肽特异性的细胞毒性 T 细胞。因此， 可以 使用上述多肽来调制选择性结合该多肽与 MHC 分子的复合体的分离的 T 细胞。
如后述的实施例中记载的那样， 编码 PDS5A 的基因分别在乳癌细胞、 乳癌组织、 脑 肿瘤细胞、 脑肿瘤组织、 食道癌细胞、 食道癌组织、 肺癌细胞、 肺癌组织、 肾癌细胞、 肾癌组 织、 大肠癌细胞、 大肠癌组织、 肛周腺癌组织、 肛周腺癌细胞、 神经母细胞瘤细胞和白血病细 胞中特异性表达。因此认为， 在这些癌种类中， 与正常细胞相比， PDS5A 显著多地存在。癌 细胞内存在的 PDS5A 的一部分被呈递至癌细胞表面上的 MHC 分子， 如果在生物体内施用以 上述方式调制的细胞毒性 T 细胞， 则细胞毒性 T 细胞可以将该呈递有 PDS5A 的一部分的 MHC 分子作为标记来抑制癌细胞。此外， 呈递上述多肽的抗原呈递细胞也可以在生物体内诱导 对该多肽特异性的细胞毒性 T 细胞， 使其增殖， 因此也可以通过将该抗原呈递细胞施用于生物体内来抑制癌细胞。即， 使用上述多肽而调制的上述细胞毒性 T 细胞、 上述抗原呈递细 胞也与本发明的免疫诱导剂同样地作为癌的治疗剂和 / 或预防剂是有用的。
在将上述的分离的抗原呈递细胞、 分离的 T 细胞施用于生物体的情况下， 为了避 免将这些细胞作为异物而攻击的生物体内的免疫应答， 优选如上所述使用上述 (a) ～ (c) 的多肽调制从接受治疗的患者采集的抗原呈递细胞或 T 细胞。
包含抗原呈递细胞或分离的 T 细胞作为有效成分的癌的治疗剂和 / 或预防剂的施 用途径优选为静脉内施用、 动脉内施用那样的非经口施用。此外， 施用量可根据症状、 施用 目的等来适当选择， 但通常为 1 个～ 10 兆个， 优选为 100 万个～ 10 亿个， 优选数天～数月 施用 1 次。制剂可以为例如将细胞悬浮于生理缓冲盐水中而得的制剂等， 也可以与其它抗 癌剂、 细胞因子等合并使用。此外， 也可以添加制剂领域中公知的 1 种或 2 种以上添加剂。
此外， 也可以通过使编码上述 (a) ～ (c) 的多肽的多核苷酸在对象动物的体内表 达， 来在该生物体内进行抗体生产、 诱导细胞毒性 T 细胞， 获得与施用多肽同等的效果。即， 本发明的免疫诱导剂可以是包含编码上述的 (a) ～ (c) 的多肽的多核苷酸、 并包含能够在 生物体内表达该多肽的重组载体作为有效成分的免疫诱导剂。如后述的实施例所示那样， 能够表达这样的抗原多肽的重组载体被称为基因疫苗。 用于制造基因疫苗的载体只要是能够在对象动物细胞内 ( 优选为哺乳动物细胞 内 ) 表达的载体即可， 没有特别的限定， 可以是质粒载体也可以是病毒载体， 可以使用在基 因疫苗领域公知的任何载体。另外， 编码上述多肽的 DNA、 RNA 等多核苷酸， 如上所述， 可以 通过常规方法容易地调制。此外， 该多核苷酸向载体的整合可以通过本领域技术人员公知 的方法来进行。
基因疫苗的施用途径优选为肌肉内施用、 皮下施用、 静脉内施用、 动脉内施用等非 经口施用途径， 施用量可以根据抗原的种类等来适当选择， 但通常为每 1kg 体重， 以基因疫 苗的重量计为 0.1μg ～ 100mg 左右， 优选为 1μg ～ 10mg 左右。
作为利用病毒载体的方法， 可列举例如在反转录病毒、 腺病毒、 腺伴随病毒、 疱疹 病毒、 牛痘病毒、 痘病毒、 脊髓灰质炎病毒、 辛德毕斯病毒等 RNA 病毒或 DNA 病毒中整合编码 上述多肽的多核苷酸， 使对象动物感染该病毒的方法。其中， 特别优选使用反转录病毒、 腺 病毒、 腺伴随病毒、 牛痘病毒等的方法。
作为其它方法， 可列举直接在肌肉内施用表达质粒的方法 (DNA 疫苗法 )、 脂质体 法、 lipofectin 法、 显微注射法、 磷酸钙法、 电穿孔法等， 特别优选 DNA 疫苗法、 脂质体法。
使编码本发明中使用的上述多肽的基因实际上作为药物起作用时， 有将基因直接 导入体内的体内 (in vivo) 方法和从对象动物采集某种细胞在体外将基因导入该细胞并将 该细胞送回体内的体外 (ex vivo) 方法 ( 日経サイエンス， 1994 年 4 月， 20-45 页， 月刊药 事， 1994 年， 第 36 卷， 第 1 号， 23-48 页， 实验医学增刊， 1994 年， 第 12 卷， 第 15 号， 及其引用 文献等 )。更优选 in vivo 方法。
在通过 in vivo 方法来施用的情况下， 可根据治疗目标的疾病、 症状等通过适当施 用途径来施用。例如， 可以施用于静脉、 动脉、 皮下、 肌肉内等。在通过 in vivo 方法来施用 的情况下， 例如可采用可溶液体制剂等制剂形态， 一般而言， 采用含有编码作为有效成分的 本发明的上述肽的 DNA 的注射剂等， 根据需要可以加入惯用的载体。此外， 在含有该 DNA 的 脂质体或膜融合脂质体 ( 仙台病毒 (HVJ)- 脂质体等 ) 中， 可以为悬浮剂、 冷冻剂、 离心分离
浓缩冷冻剂等脂质体制剂的形态。
另外， 在本发明中， 所说的 “序列号 1 所示的碱基序列” ， 除了序列号 1 中实际所示 的碱基序列以外， 也包含与其互补的序列。因此， 所说的 “具有序列号 1 所示的碱基序列的 多核苷酸” ， 包含具有序列号 1 实际所示的碱基序列的单链多核苷酸、 具有其互补的碱基序 列的单链多核苷酸和由它们构成的双链多核苷酸。在调制编码本发明中使用的多肽的多 核苷酸的情况下， 适当选择任一碱基序列， 只要是本领域技术人员， 就可以容易地进行该选 择。
此外， 本发明中使用的多肽为癌特异性表达， 因此仅与荷瘤生物体中的血清特异 性反应， 因而本发明的多肽也可用于癌的检测。
作为检测上述癌的方法， 使用从生物体分离出的试样， 测定由序列号 2、 4、 6、 8、 10、 12 或 44 所示的氨基酸序列组成的多肽的表达， 或者作为其同源因子的与该多肽具有 90％ 以上、 优选为 95％以上、 更优选为 98％以上、 进一步优选为 99％以上或 99.5％以上的序列 同一性的多肽的表达。作为使用上述试样测定多肽的表达的方法， 可列举对试样中所含的 针对该多肽的抗体进行免疫测定的方法 ( 第 1 方法 )、 对试样中所含的该多肽本身进行免疫 测定的方法 ( 第 2 方法 ) 和对试样中所含的编码该多肽的 mRNA 进行测定的方法 ( 第 3 方 法 )。本发明的方法可以以这些方法中的任一方法来测定多肽的表达。另外， 在本发明中， “测定” 这样的用语包含检测、 定量和半定量的任一种。 这里， PDS5A 是通过使用来源于狗乳癌的 cDNA 文库和同一患狗的血清的 SEREX 法， 作为与来源于荷瘤狗的血清中特异性存在的抗体 ( 癌特异性抗体 ) 结合的多肽而被鉴定出 的 ( 参照实施例 1)。即， 荷瘤狗生物体中， 针对 PDS5A 的抗体被特异性诱导出来。因此， 通 过测定荷瘤生物体内的针对 PDS5A 的抗体， 也可以检测表达 PDS5A 的癌。此外， 也可以通 过上述第 2 方法来测定作为抗原的 PDS5A， 从而检测狗的癌。此外， 如后述的实施例中记载 的那样， 编码该抗原多肽的 mRNA 在癌细胞或癌组织、 特别是乳癌细胞、 乳癌组织、 脑肿瘤细 胞、 脑肿瘤组织、 食道癌细胞、 食道癌组织、 肺癌细胞、 肺癌组织、 肾癌细胞、 肾癌组织、 大肠 癌细胞、 大肠癌组织、 肛周腺癌细胞、 肛周腺癌组织、 神经母细胞瘤细胞和白血病细胞中与 正常组织相比显著地高表达 ( 参照实施例 1)， 因此也可以通过测定该 mRNA 来检测狗的癌。
在上述第 1 方法中， 能够在试样中存在的上述癌特异性抗体的测定可以通过使用 与该抗体进行抗原抗体反应的抗原物质的免疫测定来容易地进行。 免疫测定法本身如下文 所详述的那样为公知的常规方法。作为免疫测定的抗原物质， 可以使用上述 (a) ～ (c) 的 多肽。此外， 抗体存在交叉反应性， 即使是实际上成为免疫原的抗原物质以外的分子， 如果 分子上存在与免疫原的表位类似的结构， 则该分子也能够通过抗原抗体反应而与被免疫原 诱导的抗体结合。 例如， 氨基酸序列的序列同一性高的多肽彼此之间表位的结构也多类似， 在该情况下， 两者能够显示同一抗原性。 如后述的实施例中具体记载的那样， 序列号 4 或 44 的来源于人的多肽与在荷瘤狗体内诱导的上述抗体进行抗原抗体反应。因此， 在本发明的 第 1 方法中， 作为免疫测定的抗原， 也可以使用来源于任一哺乳动物的同源因子。
通常， 在蛋白质等那样的具有复杂结构的分子量大的抗原物质的情况下， 分子上 存在结构不同的多个部位。 因此， 在生物体内， 针对这样的抗原物质产生分别识别多个部位 而结合的多种抗体。即， 在生物体内针对蛋白质等抗原物质而产生的抗体是作为多种抗体 的混合物的多克隆抗体。 另外， 在本发明中所谓的 “多克隆抗体” ， 是指来源于体内包含抗原
物质的生物体的血清中存在的抗体， 是针对该抗原物质在该生物体内诱导出的抗体。
试样中的抗体的测定可以通过使用了上述多肽作为抗原的免疫测定来容易地进 行。免疫测定本身在本领域中是公知的， 如果以反应方式分类， 则有夹心法、 竞争法、 凝集 法、 蛋白质印迹法等。此外， 如果以标记分类， 则有放射免疫测定、 荧光免疫测定、 酶免疫测 定、 生物素免疫测定等， 使用任一方法都可以进行上述抗体的免疫测定。没有特别的限制， 但夹层 ELISA、 凝集法由于操作简便且不需要大规模的装置等， 因此可以优选用作本发明的 方法中的上述抗体的免疫测定方法。在使用酶作为抗体的标记的情况下， 作为酶， 只要是 满足周转数大、 即使与抗体结合也稳定、 使底物特异性着色等条件的酶即可， 没有特别的制 限， 也可以使用通常的用于酶免疫测定法酶， 例如， 过氧化物酶、 β- 半乳糖苷酶、 碱性磷酸 酶、 葡萄糖氧化酶、 乙酰胆碱酯酶、 葡萄糖 -6- 磷酸脱氢酶、 苹果酸脱氢酶等。此外， 也可以 使用酶抑制物质、 辅酶等。这些酶与抗体的结合可以通过使用马来酰亚胺化合物等交联剂 的公知的方法来进行。作为底物， 可以根据所使用的酶的种类来使用公知的物质。在例如 使用过氧化物酶作为酶的情况下， 可以使用 3， 3’ ， 5， 5’ - 四甲基联苯胺， 此外在使用碱性磷 3 酸酶作为酶的情况下， 可以使用对硝基苯酚等。 作为放射性同位素， 可以使用 125I、 H 等通常 在放射免疫测定法中使用的物质。 作为荧光色素， 可以使用异硫氰酸荧光素 (FITC)、 四甲基 若丹明异硫氰酸酯 (TRITC) 等通常在荧光抗体法中使用的物质。
另外， 这些免疫测定法本身是公知的， 没必要在本说明书中说明， 但进行简单地记 载， 例如， 在夹心法中， 将作为抗原使用的上述多肽固定化于固相， 使其与血清等试样反应， 洗涤后， 与适当的二抗反应， 洗涤后， 测定与固相结合的二抗。通过将抗原多肽固定化于固 相， 可以容易地除去未结合的二抗， 因此优选作为本发明的癌的检测方法的方式。作为二 抗， 例如试样如果是来源于狗， 则可以使用抗狗 IgG 抗体。通过预先将二抗用上述例示的标 记物质标记， 可以测定与固相结合的二抗。这样测定的二抗量相当于血清试样中的上述抗 体量。 在使用酶作为标记物质情况下， 加入通过酶作用而分解显色的底物， 在光学上测定底 物的分解量， 从而可以测定抗体量。 在使用放射性同位素作为标记物质的情况下， 可以通过 闪烁计数器来测定由放射性同位素所放射的放射线量。
在本发明的第 2 方法中， 测定能够在由生物体获得的试样中包含的、 序列号 2、 4、 6、 8、 10、 12 或 44 的多肽或其同源因子。 如上所述， 在癌患者中， 与序列号 2、 4、 6、 8、 10、 12 或 44 的多肽或其同源因子进行抗原抗体反应的癌特异性抗体的量显著多， 这显示在癌患者体 内， 作为该癌特异性抗体的抗原的这些多肽或其同源因子的产生量显著多。 因此， 也可以通 过测定序列号 2、 4、 6、 8、 10、 12 或 44 的多肽或其同源因子， 与上述第 1 方法同样地， 检测生 物体内的癌。
试样中的多肽的测定可以通过公知的免疫测定法来容易地进行。 具体而言， 例如， 制作与序列号 2、 4、 6、 8、 10、 12 或 44 所示的多肽或其同源因子进行抗原抗体反应的抗体或 其抗原结合性片段， 使用其进行免疫测定， 从而可以测定能够在试样中存在的由序列号 2、 4、 6、 8、 10、 12 或 44 所示的序列组成的多肽或其同源因子。 免疫测定方法本身是如上所述的 公知的常规方法。
这里， “抗原结合性片段” 意味着抗体分子中所含的 Fab 片段、 F(ab’ )2 片段那样 的、 具有与抗原的结合能力的抗体片段。 抗体可以是多克隆抗体也可以是单克隆抗体， 但为 了免疫测定等， 优选再现性高的单克隆抗体。以多肽为免疫原的多克隆抗体和单克隆抗体的制备方法是公知的， 可以通过常规方法来容易地进行。 例如， 通过将使多肽与钥孔血蓝蛋 白 (KLH)、 酪蛋白等载体蛋白质结合成的物质作为免疫原， 与佐剂一起对动物免疫， 从而可 以诱导针对该多肽的抗体。可以使从免疫后的动物采集的脾细胞、 淋巴细胞那样的抗体产 生细胞与骨髓瘤细胞融合来制作杂交瘤细胞， 选择产生与序列号 2、 4、 6、 8、 10、 12 或 44 所示 的多肽或其同源因子结合的抗体的杂交瘤细胞， 使其增殖， 从培养上清液得到以上述蛋白 质为对应抗原的单克隆抗体。另外， 上述的方法是公知的常规方法。
本发明的第 3 方法测定能够在从生物体获得的试样中包含的、 编码 PDS5A 的 mRNA。 如后述的实施例中具体所示那样， 编码 PDS5A 的 mRNA 在癌、 乳癌、 脑肿瘤、 食道癌、 肺癌、 肾 癌、 大肠癌、 肛周腺癌、 神经母细胞瘤和白血病的组织或细胞中显著高表达。 因此， 也可以通 过测定试样中的该 mRNA 来检测生物体内的癌。
本发明的检测方法基于如上所述测定的多肽的表达量来判断对象生物体是否为 癌等。癌的检测也能够仅测定对象生物体中的多肽的表达， 但是从提高检测精度的观点出 发， 优选研究 1 ～多名健常人试样中的多肽的表达量 ( 抗体量、 多肽量或 mRNA 量 ) 来取得 健常人基准值， 将对象生物体的测定值与该健常人基准值进行比较。此外在想要提高检测 精度的情况下， 也可以对从已知罹患癌的多名患者得到的试样研究多肽表达量来取得癌患 者基准值， 将对象生物体的测定值与健常人基准值和癌患者基准值两者进行比较。上述基 准值可以通过例如将各试样中的多肽表达量数值化， 算出其平均值来确定。 另外， 健常人基 准值与癌患者基准值可以预先对多名健常人和癌患者研究多肽表达量来确定好。因此， 在 采用本发明的方法进行与基准值的比较的情况下， 可以使用预先确定的基准值。
本发明的检测方法中可以组合使用通过其它癌抗原、 癌标记进行的检测。 由此， 可 以进一步提高癌的检测精度。
根据本发明的检测方法， 可以检测生物体内的癌。 根据本发明的方法， 连眼睛看不 见的小尺寸的肿瘤、 体内深部的肿瘤也可以检测， 因此对癌的早期发现是有用的。此外， 如 果对癌的治疗后随访中的患者应用本发明的检测方法， 则可以在有癌的复发的情况下早期 检测到该癌。
此外， 在荷瘤生物体中， 如果表达本发明中作为测定对象的上述规定的多肽的癌 细胞的数目增加， 则相应地该生物体内的该多肽及其 mRNA 的蓄积量增大， 血清中大量产生 针对上述多肽的抗体。 另一方面， 如果癌细胞的数目减少， 则相应地生物体内的该多肽及其 mRNA 的蓄积量减少， 血清中的针对上述多肽的抗体减少。 因此， 在上述规定的多肽的表达量 多的情况下， 可以判断为发生肿瘤的增大、 癌的转移， 即癌的进行度进展。
此外， 如后述的实施例所示那样， 在同一种类的肿瘤中， 恶性型与良性型相比上述 抗体量显著多。因此， 在上述规定的多肽的表达量多的情况下， 可以判断为癌的恶性度更 高。即， 根据本发明的方法， 也可以检测癌的恶性度。
此外， 也可以将上述规定的多肽的表达量的增减作为指标来监测癌的治疗效果。 因此， 关于癌的治疗中、 治疗后的个体， 通过观察上述多肽的表达量， 可获得抗癌剂的治疗 效果、 肿瘤摘出后的残存肿瘤有无、 进而即使在随访中也可迅速获知转移、 复发的线索。在 进行了适当治疗的情况下， 多肽的表达量与治疗前的荷瘤状态相比降低， 因此可以判断为 对该生物体进行的 ( 正进行的 ) 治疗的效果良好。在多肽表达量上升或维持的情况下， 或 在观察到暂时降低后再上升的情况下， 可以判断为治疗效果不充分， 成为向其它治疗方法变更、 抗癌剂施用量变更等治疗方法选择的有用判断材料。
作为本发明的癌的检测方法的对象的癌， 是表达 PDS5A 的癌， 可列举乳癌、 脑肿 瘤、 食道癌、 肺癌、 肾癌、 大肠癌、 肛周腺癌、 神经母细胞瘤或白血病作为优选例。此外， 作为 本发明的方法的对象的生物体优选为哺乳动物， 更优选为人、 狗、 猫。
作为供于本发明的方法的试样， 可列举血液、 血清、 血浆、 腹水、 胸水等体液、 组织、 细胞。特别是在上述第 1 方法和第 2 方法中， 可以优选使用血清、 血浆、 腹水和胸水， 此外， 在测定 mRNA 的上述第 3 方法中， 优选组织试样和细胞试样。
第 1 方法中作为免疫测定的抗原使用的上述多肽可以作为癌检测试剂提供。该试 剂可以仅由上述多肽构成， 此外也可以包含对该多肽的稳定化等有用的各种添加剂等。此 外， 该试剂也可以以固定化于板、 膜等固相的状态提供。
第 2 方法中对序列号 2、 4、 6、 8、 10、 12 或 44 所示的多肽或其同源因子进行免疫测 定时使用的、 与该多肽或其同源因子进行抗原抗体反应的抗体或其抗原结合性片段也可以 作为癌检测试剂提供。该情况下的癌检测试剂也可以仅由上述抗体或抗原结合性片段构 成， 此外也可以包含对该抗体或抗原结合性片段的稳定化等有用的各种添加剂等。此外， 该抗体或抗原结合性片段可以结合有锰、 铁等金属。如果将那样的金属结合抗体或抗原结 合性片段施用于体内， 则在抗原蛋白质更多存在的部位更多地集聚该抗体或抗原结合性片 段， 因此如果通过 MRI 等来测定金属， 则可以检测产生抗原蛋白质的癌细胞的存在。
此外， 第 3 方法中用于 mRNA 的测定的上述癌检测用多核苷酸也可以作为癌检测试 剂来提供。 在该情况下， 癌检测用试剂也可以仅由该多核苷酸构成， 此外也可以包含对该多 核苷酸的稳定化等有用的各种添加剂等。 该试剂中所含的该癌检测用多核苷酸优选为引物 或探针。
实施例
以下， 基于实施例更具体地说明本发明。
实施例 1 ： 通过 SEREX 法获得新的癌抗原蛋白
(1)cDNA 文库的制作
从 荷 瘤 狗 的 乳 癌 组 织 通 过 酸 - 胍 盐 - 酚 - 氯 仿 法 (Acid guanidium-Phenol-Chloroform 法 ) 提取总 RNA， 使用 Oligotex-dT30 mRNA purification Kit( 宝酒造社制 ) 按照试剂盒所附的实验方法纯化多聚 A RNA。
使用该获得的 mRNA(5μg) 来合成 cDNA 噬菌体文库。 cDNA 噬菌体文库的制作中使 用 cDNA Synthesis kit、 Zap-cDNA Synthesis Kit、 ZAP-cDNAGigapackIII Gold Cloning Kit(STRATAGENE 社制 )， 按照试剂盒所附的实验方法来制作文库。制作的 cDNA 噬菌体文库 6 的大小为 1×10 pfu/ml。
(2) 利用血清来筛选 cDNA 文库
使用上述制作的 cDNA 噬菌体文库进行免疫筛选。 具体而言， 使其以在 Φ90×15mm 的 NZY 琼脂糖板上为 2340 克隆的方式感染宿主大肠杆菌 (XL1-Blue MRF’ )， 在 42℃培养 3 ～ 4 小时， 制作噬斑 (plaque)， 用浸透了 IPTG( 异丙基 -β-D- 硫代半乳糖苷 ) 的硝基纤维 素膜 (Hybond C Extra ： GE Healthecare Bio-Sciece 社制 ) 在 37℃覆盖板 4 小时， 从而使蛋 白质诱导、 表达， 在膜上转印蛋白质。然后回收膜并浸泡在包含 0.5％脱脂奶粉的 TBS(10mM Tris-HCl， 150mM NaCl(pH 值 7.5)) 中在 4℃振荡一晚， 从而抑制非特异性反应。使该膜与500 倍稀释后的患狗血清在室温反应 2 ～ 3 小时。
作为上述患狗血清， 使用了从肛门附近肿瘤的患狗采集的血清。 这些血清在 -80℃ 保存， 在即将使用前进行了前处理。血清的前处理方法采用以下的方法。即， 使宿主大肠杆 菌 (XL1-BLue MRF’ ) 感染未插入外源基因的 λZAP Express 噬菌体后， 在 NZY 板培养基上 在 37℃培养一晚。然后在板上加入包含 0.5M NaCl 的 0.2M NaHCO3(pH 值 8.3) 的缓冲液， 在 4℃静置 15 小时后， 回收上清液作为大肠杆菌 / 噬菌体提取液。接下来， 将回收的大肠 杆菌 / 噬菌体提取液通入 NHS- 柱 (GE Healthecare Bio-Science 社制 )， 将来源于大肠杆 菌、 噬菌体的蛋白质固定化。 使患狗血清通入该蛋白固定化柱并反应， 从血清中除去吸附于 大肠杆菌和噬菌体的抗体。经过了柱的血清组分用包含 0.5％脱脂奶粉的 TBS 进行 500 倍 稀释， 将其作为免疫筛选材料。
将印迹有上述处理血清和上述融合蛋白质的膜用 TBS-T(0.05％ Tween20/TBS) 进 行洗涤 4 次后， 使作为二抗的用包含 0.5％脱脂奶粉的 TBS 进行了 5000 倍稀释的山羊抗狗 IgG(Goat anti Dog IgG-h+I HRP conjugated ： BETHYL Laboratories 社制 ) 在室温反应 1 小时， 通过使用了 NBT/BCIP 反应液 (Roche 社制 ) 的酶显色反应进行检测， 从 Φ90×15mm 的 NZY 琼脂糖板上采集与显色反应阳性部位一致的菌落， 使其溶解在 SM 缓冲液 (100mM NaCl， 10mM MgClSO4， 50mM Tris-HCl， 0.01％明胶 (pH 值 7.5))500μl 中。采用与上述同样的方 法重复进行二次、 三次筛选直到显色反应阳性菌落单一化， 对与血清中的 IgG 进行反应的 30940 个噬菌体克隆进行筛选， 分离出 1 个阳性克隆。
(3) 分离的抗原基因的序列同一性检索
为了将通过上述方法分离出的 1 个阳性克隆供于碱基序列分析， 进行从噬菌体载 体转换成质粒载体的操作。具体而言， 将以使吸光度 OD600 为 1.0 的方式调制宿主大肠杆菌 (XL1-Blue MRF’ ) 而得的溶液 200μl 与纯化后的噬菌体溶液 100μl 以及 ExAssist helper phage(STRATAGENE 社制 )1μl 混合后， 在 37℃反应 15 分钟后， 添加 3ml LB 培养基并在 37℃ 进行培养 2.5 ～ 3 小时， 立即在 70℃的水浴中保温 20 分钟后， 在 4℃以 1000×g 离心 15 分 钟， 回收上清液作为噬粒 (phagemid) 溶液。 接着将以使吸光度 OD600 为 1.0 的方式调制噬粒 宿主大肠杆菌 (SOLR) 而得的溶液 200μl 与纯化后的噬菌体溶液 10μl 混合， 然后在 37℃ 反应 15 分钟， 接种在 50μl 的含有氨苄青霉素 ( 终浓度 50μg/ml) 的 LB 琼脂培养基中在 37℃培养一晚。采集转化后的 SOLR 的单菌落， 在含有氨苄青霉素 ( 终浓度 50μg/ml) 的 LB 培养基中在 37℃培养后， 使用 QIAGEN plasmid Miniprep Kit( キアゲン社制 ) 纯化具有目 标插入片段的质粒 DNA。
纯化后的质粒使用序列号 13 中记载的 T3 引物和序列号 14 中记载的 T7 引物， 通过引物步移法进行插入片段全长序列的分析。通过该序列分析来获得序列号 1 中记载 的基因序列。使用该基因的碱基序列和氨基酸序列， 进行序列同一性检索程序 BLAST 搜索 (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/) 并进行与已知基因的序列同一性检索， 结果表 明， 所得的基因为 PDS5A 基因。在作为狗 PDS5A 的人同源因子的人 PDS5A 中， 序列同一性为 碱基序列 94％、 氨基酸序列 99％， 在作为小鼠同源因子的小鼠 PDS5A 中， 序列同一性为碱 基序列 91％、 氨基酸序列 99％， 在作为牛同源因子的牛 PDS5A 中， 序列同一性为碱基序列 95％、 氨基酸序列 99％， 在作为马同源因子的马 PDS5A 中， 序列同一性为碱基序列 96％、 氨 基酸序列 99％， 在作为鸡同源因子的鸡 PDS5A 中， 序列同一性为碱基序列 83％、 氨基酸序列98％。将人 PDS5A 的碱基序列示于序列号 3 和 43， 氨基酸序列示于序列号 4 和 44， 将小鼠 PDS5A 的碱基序列示于序列号 5， 氨基酸序列示于序列号 6， 将牛 PDS5A 的碱基序列示于序列 号 7， 氨基酸序列示于序列号 8， 将马 PDS5A 的碱基序列示于序列号 9， 氨基酸序列示于序列 号 10， 将鸡 PDS5A 的碱基序列示于序列号 11， 氨基酸序列示于序列号 12。
(4) 各组织中的表达分析
通过 RT-PCR(Reverse Transcription-PCR) 法来研究通过上述方法而获得的基因 在狗、 人和小鼠的正常组织和各种细胞株中的表达。 反转录反应如下进行。 即， 使用 TRIZOL 试剂 (invitrogen 社制 ) 按照所附的实验方法从各组织 50 ～ 100mg 和各细胞株 5 ～ 10×106 个细胞中提取总 RNA。使用该总 RNA 通过 Superscript First-Strand Synthesis System for RT-PCR(invitrogen 社制 ) 按照所附的实验方法合成 cDNA。人正常组织 ( 脑、 海马、 精 巢、 结肠、 胎盘 ) 的 cDNA 使用了基因库 cDNA(invitrogen 社制 )、 QUICK-Clone cDNA( クロ ンテツク社制 ) 和 Large-Insert cDNA Library( クロンテク社制 )。PCR 反应使用所取得 的基因特异性的引物 ( 狗引物在序列号 15 和 16 记载， 人引物在序列号 17 和 18 记载， 小鼠 引物在序列号 19 和 20 记载 ) 如下进行。即， 按照通过反转录反应而调制的样品 0.25μl、 上述引物各 2μM、 0.2mM 的各 dNTP、 0.65U 的 ExTaq 聚合酶 ( 宝酒造社制 ) 的方式加入各试 剂和所附缓冲液， 使总量为 25μl， 使用 Thermal Cycler(BIO RAD 社制 )， 将 94℃ -30 秒， 55℃ -30 秒， 72℃ -1 分钟的循环重复进行 30 次。为了进行比较对照， 也同时使用了 GAPDH 特异性的引物 ( 狗和人 GAPDH 引物在序列号 21 和 22 记载， 小鼠 GAPDH 引物在序列号 23 和 24 记载 )。其结果是， 如图 1 所示， 狗 PDS5A 基因在健常的狗组织中在大部分组织中未观察 到表达， 另一方面， 在狗肿瘤组织中观察到强的表达。人和小鼠 PDS5A 基因的表达也与狗 PDS5A 基因同样， 在人和小鼠正常组织中几乎不能发现表达， 在癌细胞中在大部分的细胞株 中检测到表达 ( 图 2， 3)。
实施例 2 ： PDS5A 在生物体内的癌抗原性的分析和药效评价
(1) 在生物体内表达 PDS5A 的重组载体的制作
以序列号 5 的碱基序列为基础， 采用以下的方法制作在生物体内表达 PDS5A 的重 组载体。PCR 通过在实施例 1 中观察到表达的小鼠癌细胞株 N2a( 从 ATCC 购入 ) 来调制。 如下进行 ： 按照 cDNA 1μl、 包含 NotI 和 XhoI 限制性酶切序列的 2 种引物 ( 在序列号 25 和 26 记载 ) 各 0.4μM、 0.2mMdNTP、 1.25U 的 PrimeSTAR HS 聚合酶 ( 宝酒造社制 ) 的方式加入 各试剂和所附缓冲液， 使总量为 50μl， 使用 Thermal Cycler(BIO RAD 社制 )， 将 98℃ -10 秒， 55℃ -15 秒， 72℃ -4 分钟的循环重复进行 30 次。另外， 上述 2 种引物是扩增编码序列 号 5 的氨基酸序列全长的区域的引物。PCR 后， 将扩增的 DNA 用 1％琼脂糖凝胶进行电泳， 使用 QIAquick Gel Extraction Kit(QIAGEN 社制 ) 纯化约 4000bp 的 DNA 片段。
将纯化的 DNA 片段与克隆载体 pCR-Blunt(invitrogen 社制 ) 连接。 将其转化至大 肠杆菌后回收质粒， 由测序确认了扩增后的基因片段与目标序列一致。将与目标序列一致 的质粒用 NotI 和 XhoI 限制性酶处理， 用 QIAquick Gel Extraction Kit 纯化后， 将目标基 因序列插入到用 NotI、 XhoI 限制性酶进行了处理的哺乳类表达载体 PCDNA3.1(Invitrogen 社制 ) 中。通过使用该载体在哺乳类的细胞内产生 PDS5A 蛋白。
在由上述制作的质粒 DNA 100μg 中添加 50μg 的金粒子 (Bio Rad 社制 )、 亚精 胺 100μl(SIGMA 社制 )、 1M CaCl2100μl(SIGMA 社制 )， 通过涡旋混合器进行搅拌， 在室温静置 10 分钟 ( 以后记载为金 -DNA 粒子 )。以 3000 转 / 分钟离心 1 分钟后， 舍弃上清液， 用 100％乙醇 (WAKO 社制 ) 洗涤 3 次。在金 -DNA 粒子中加入 100％乙醇 6ml， 通过涡旋混合 器充分地搅拌后， 将金 -DNA 粒子注入 Tefzel Tubing(Bio Rad 社制 ) 中， 使其在壁面沉淀。 将附着有金 -DNA 粒子的 Tefzel Tubing 的乙醇风干， 切割成适合基因枪的长度。
(2) 通过 DNA 疫苗法制成的 PDS5A 的抗肿瘤效果
在 10 只 A/J 小鼠 (7 周龄， 雄， 从日本 SLC 社购入 ) 和 Balb/c 小鼠 (7 周龄， 雄， 从 6 日本 SLC 社购入 ) 的皮下分别移植 1×10 个小鼠神经母细胞瘤细胞株 N2a、 大肠癌细胞株 CT26 后， 将由上述制作的管固定于基因枪， 使用纯氦气以 400psi 的压力对剃毛后的小鼠的 腹腔每隔 7 天透皮施用 DNA 疫苗共计 3 次 ( 质粒 DNA 接种量为 2μg/ 只 )， 评价抗肿瘤效果 ( 治疗模型 )。此外， 同样地操作， 每隔 7 天对 10 只 A/J 小鼠和 Balb/c 小鼠透皮施用 DNA 疫苗共计 3 次后， 移植 N2a 细胞、 CT26 细胞来评价抗肿瘤效果 ( 预防模型 )。另外， 作为对 照， 将未插入 PDS5A 基因的质粒 DNA 在各模型各施用 10 只。
抗肿瘤效果以肿瘤的大小 ( 长径 × 短径 2/2) 和生存小鼠的比例来评价。将结果 示于图 4 ～ 11 中。 本研究的结果是， 在使用了神经母细胞瘤细胞株的治疗模型中， 41 天后， 3 3 对照组和 PDS5A 质粒施用组中分别为 569mm 、 109mm ， PDS5A 质粒施用组中观察到了显著的 肿瘤的缩小 ( 图 4)。同样地在使用了神经母细胞瘤细胞株的预防模型中， 43 日后， 也在对 3 3 照组和 PDS5A 质粒施用组中分别为 476mm 、 0mm ， PDS5A 质粒施用组中观察到了肿瘤的完全 萎缩 ( 图 5)。此外， 在使用了大肠癌细胞株的治疗模型中， 41 日后， 对照组和 PDS5A 质粒施 3 3 用组中分别为 589mm 、 189mm ， PDS5A 质粒施用组中观察到了显著的肿瘤缩小 ( 图 8)。同样 地在使用了大肠癌细胞株的预防模型中， 43 日后， 也在对照组和 PDS5A 质粒施用组中分别 3 3 为 397mm 、 43mm ， PDS5A 质粒施用组中观察到了显著的肿瘤的缩小 ( 图 9)。此外， 观察了使 用了神经母细胞瘤细胞株的两模型中的生存的经过， 结果是， 在治疗模型中， 对照组中施用 后在 84 天全例死亡， 与此相对， PDS5A 质粒施用组中， 60％的小鼠生存 ( 图 6)。此外， 在预 防模型中， 对照组中施用后在 90 天全例死亡， 与此相对， 施用了 PDS5A 质粒的组中， 全部的 小鼠生存 ( 图 7)。此外， 观察了使用了大肠癌细胞株的两模型中的生存的经过， 结果是， 在 治疗模型中， 对照组中在施用后 84 天全例死亡， 与此相对， PDS5A 质粒施用组中， 40％的小 鼠生存 ( 图 10)。 此外， 在预防模型中， 对照组中在施用后 90 天全例死亡， 与此相对， 施用了 PDS5A 质粒的组中， 80％的小鼠生存 ( 图 11)。
由以上的结果可知， PDS5A 质粒施用组与对照组相比确认了显著的抗肿瘤效果， 因 此表明了， PDS5A 为具有强的癌抗原性的癌抗原， 对癌的治疗和预防是有效的。
实施例 3 ： 肽表位反应性 CD8 阳性 T 细胞的诱导
为了预测人 PDS5A 蛋白质的氨基酸序列中的 HLA-A0201 结合基序， 使用了公知的 BIMAS 软件 ( 可在 (http://bimas.dcrt.nih.gov/molbio/hla_bind/) 利用 ) 的计算机预 测程序来分析序列号 4 和 44 的氨基酸序列， 选择预想能够与 HLA I 类分子结合的、 序列号 27 ～ 35 的多肽。
从 HLA-A0201 阳 性 的 健 常 人 分 离 出 外 周 血， 叠 层 在 Lymphocyte separation medium(Organonp Teknika， Durham， NC) 上以 1,500 转 / 分钟在室温离心分离 20 分钟。回 收含有外周血单核细胞 (PBMC) 的组分， 在冷磷酸盐缓冲液中洗涤 3 次 ( 或 3 次以上 )， 得 到了 PBMC。将所得的 PBMC 悬浮在 AIM-V 培养基 (Life Technololgies， Inc.， 美国纽约州Grand Island)20ml 中， 在培养瓶 (Falcon) 中在 37℃、 5％ CO2 的条件下使其附着 2 小时。 非附着细胞用于调制 T 细胞， 附着细胞用于调制树突细胞。
另一方面， 将附着细胞在 AIM-V 培养基中在 IL-4(1000U/ml) 和 GM-CSF(1000U/ml) 的存在下培养。6 天后更换成添加了 IL-4(1000U/ml)、 GM-CSF(1000U/ml)、 IL-6(1000U/ml， Genzyme， Cambridge， MA)、 IL-1β(10ng/ml， Genzyme， Cambridge， MA) 和 TNF-α(10ng/ml， Genzyme， Cambridge， MA) 的 AIM-V 培养基， 再培养 2 天后， 使用所得的非附着细胞群作为树 突细胞。
将调制的树突细胞在 AIM-V 培养基中以 1×106 个细胞 /ml 的细胞密度悬浮， 分别 以 10μg/ml 的浓度添加所选择的多肽， 使用 96 孔板在 37℃、 5％ CO2 的条件下培养 4 小时。 培养后， 进行 X 射线照射 (3000rad)， 用 AIM-V 培养基洗涤， 在含有 10％人 AB 血清 (Nabi， Miami， FL)、 IL-6(1000U/ml) 和 IL-12(10ng/ml， Genzyme， Cambridge， MA) 的 AIM-V 培养基 5 中悬浮， 在 24 孔板每 1 孔中分别添加 1×10 个细胞。然后， 分别以每 1 孔为 1×106 个细胞 添加调制的 T 细胞群， 在 37℃、 5％ CO2 的条件下培养。7 天后， 舍弃各培养上清液， 与上述 同样地操作， 将用所得的各多肽处理后进行了 X 射线照射的树突细胞在含有 10％人 AB 血 清 (Nabi， Miami， FL)、 IL-7(10U/ml， Genzyme， Cambridge， MA) 和 IL-2(10U/ml， Genzyme， 5 Cambridge， MA) 的 AIM-V 培养基中悬浮 ( 细胞密度 ： 1×10 个细胞 /ml)， 在 24 孔板每 1 孔 5 中分别添加 1×10 个细胞， 再进行培养。每隔 7 天将同样的操作重复 4 ～ 6 次后， 回收被 刺激的 T 细胞， 通过流式细胞仪确认诱导了 CD8 阳性 T 细胞的诱导。
实施例 4 ： 刺激 HLA-A0201 阳性 CD8 阳性 T 细胞的 PDS5A 中的细胞毒性 T 细胞抗 原表位的确定
通过显微镜下的细胞数计测确认了在上述诱导后的各孔的 T 细胞内， 被序列号 27 ～ 35 的各多肽刺激了的 T 细胞增殖了。对于观察到了增殖的各 T 细胞， 为了研究针对 4 用于刺激的各多肽的特异性， 对 5×10 个被多肽刺激后的、 表达 HLA-A0201 分子的 T2 细胞 (Salter RD et al.， Immunogenetics， 21 ： 235-246(1985)， 从 ATCC 购入 )( 以 10μg/ml 的 浓度在 AIM-V 培养基中添加各多肽， 在 37℃、 5％ CO2 的条件下培养 4 小时 ) 添加 5×103 个 T 细胞， 采用 96 孔板在包含 10％人 AB 血清的 AIM-V 培养基中培养 24 小时。取培养后的上 清液， 通过 ELISA 法测定 IFN-γ 的产生量。其结果是， 与使用了未进行多肽刺激的 T2 细胞 的孔的培养上清液相比， 在使用进行了序列号 27 ～ 35 的各多肽刺激的 T2 细胞的孔的培养 上清液中， 确认了 IFN-γ 产生 ( 图 12)。因此表明了， 序列号 27 ～ 35 的各多肽是具有特异 性地刺激 HLA-A0201 阳性 CD8 阳性 T 细胞增殖、 诱导 IFN-γ 产生的能力的 T 细胞表位肽。 另一方面， 在添加具有序列号 36 所示的氨基酸序列的本发明的范围外的多肽来进行上述 处理的情况下， 未发现 IFN-γ 产生 ( 图 12)。
接下来研究了， 作为本发明中使用的多肽的序列号 27 ～ 35 的各多肽是否是被呈 递至 HLA-A0201 阳性且表达 PDS5A 的肿瘤细胞上的 HLA-A0201 分子上的多肽， 以及被本多 肽刺激了的 CD8 阳性 T 细胞是否能够抑制 HLA-A0201 阳性且表达 PDS5A 的肿瘤细胞。
在 105 个 50ml 容量的离心管中收集确认了 PDS5A 的表达的恶性脑肿瘤细胞株、 T98G(Stein GH et al.， J.Cell Physiol.， 99 ： 43-54(1979)， 从 ATCC 购入 )， 加入 100μCi 的铬 51， 在 37 ℃温育 2 小时。然后用包含 10 ％人 AB 血清的 AIM-V 培养基洗涤 3 次， 在 3 96 孔 V 底板每 1 孔中各添加 10 个， 然后在其中分别添加被悬浮在包含 10％人 AB 血清的AIM-V 培养基中的 105、 5×104、 2.5×104 和 1.25×104 个被序列号 27 ～ 35 的各多肽刺激后 的 HLA-A0201 阳性的 CD8 阳性 T 细胞， 在 37℃、 5％ CO2 的条件下培养 4 小时。培养后， 测定 从受到抑制的肿瘤细胞释放的培养上清液中的铬 51 的量， 从而算出被序列号 27 ～ 35 的各 多肽刺激后的 CD8 阳性 T 细胞的细胞毒活性。
其结果表明了， 被序列号 27 ～ 35 的各多肽刺激了的 HLA-A0201 阳性的 CD8 阳性 T 细胞具有对 T98G 的细胞毒活性 ( 图 13)。因此明确了， 作为本发明中使用的多肽的序列 号 27 ～ 35 的各多肽被呈递至 HLA-A0201 阳性且表达 PDS5A 的肿瘤细胞上的 HLA-A0201 分 子上， 而且这些多肽具有诱导能够抑制这样的肿瘤细胞的 CD8 阳性细胞毒性 T 细胞的能力。 另一方面， 在添加具有序列号 36 所示的氨基酸序列的本发明的范围外的多肽来进行上述 处理的情况下， 未见细胞毒活性 ( 图 13)。
另外， 关于细胞毒活性， 是显示将上述那样地用本发明中使用的各多肽刺激诱导 5 后的 CD8 阳性 T 细胞 10 个和摄取了铬 51 的 103 个恶性脑肿瘤细胞株 T98G 混合并培养 4 小时， 培养后测定在培养基中释放的铬 51 的量， 通过以下计算式 * 算出的 CD8 阳性 T 细胞 对 T98G 的细胞毒活性的结果。
*式： 细胞毒活性 (％ ) ＝加入了 CD8 阳性 T 细胞时从 T98G 游离的铬 51 游离量 ÷ 从加入了 1N 盐酸的靶细胞游离的铬 51 游离量 ×100。
实施例 5 ： 重组 PDS5A 蛋白质的制作、 药效评价和癌的检测和癌诊断
(1) 重组 PDS5A 蛋白质的制作
以实施例 1 中取得的序列号 1 的基因为基础， 采用以下方法制作重组蛋白质。PCR 如下进行 ： 按照由实施例 1 中获得的噬粒溶液调制并供于序列分析的载体 1μl、 包含 NotI 和 XhoI 限制性酶切序列的 2 种引物 ( 在序列号 37 和 38 中记载 ) 各 0.4μM、 0.2mM dNTP、 1.25U 的 PrimeSTAR HS 聚合酶 ( 宝酒造社制 ) 的方式加入各试剂和所附缓冲液， 使总量为 50μl， 使用 Thermal Cycler(BIO RAD 社制 )， 将 98℃ -10 秒， 55℃ -15 秒， 72℃ -4 分钟的 循环重复进行 30 次。另外， 上述 2 种引物是扩增编码序列号 2 的氨基酸序列全长的区域的 引物。 PCR 后， 将被扩增的 DNA 用 1％琼脂糖凝胶进行电泳， 使用 QIAquick Gel Extraction Kit(QIAGEN 社制 ) 纯化约 4000bp 的 DNA 片段。
将纯化后的 DNA 片段与克隆载体 pCR-Blunt(invitrogen 社制 ) 连接。 将其转化至 大肠杆菌后回收质粒， 由测序确认了被扩增的基因片段与目标序列一致。将与目标序列一 致的质粒用 NotI 和 XhoI 限制性酶处理， 用 QIAquick Gel Extraction Kit 纯化后， 将目标 基因序列插入到用 NotI、 XhoI 限制性酶处理后的大肠杆菌用表达载体 pET30a(Novagen 社 制 ) 中。通过该载体的使用可以产生 His 标签融合型的重组蛋白质。将该质粒转化至表达 用大肠杆菌 BL21(DE3)， 通过 1mM IPTG 进行表达诱导来使目标蛋白质在大肠杆菌内表达。
此外， 以序列号 43 的基因为基础， 采用以下的方法制作人 PDS5A 的重组蛋白质。 PCR 如下进行 ： 按照由实施例 1 制作的各种组织和 / 或细胞 cDNA 通过 RT-PCR 法确认了表达 的 cDNA 1μl、 包含 NotI 和 XhoI 限制性酶切序列的 2 种引物 ( 在序列号 39 和 40 记载 ) 各 0.4μM、 0.2mM dNTP、 1.25U 的 PrimeSTAR HS 聚合酶 ( 宝酒造社制 ) 的方式加入各试剂和所 附缓冲液， 使总量为 50μl， 使用 Thermal Cycler(BIO RAD 社制 )， 将 98℃ -10 秒， 55℃ -15 秒， 72℃ -4 分钟的循环重复进行 30 次。 另外， 上述 2 种引物是扩增编码序列号 44 的氨基酸 序列全长的区域的引物。 PCR 后， 将扩增的 DNA 用 1％琼脂糖凝胶进行电泳， 使用 QIAq uickGel Extraction Kit(QIAGEN 社制 ) 纯化约 4000bp 的 DNA 片段。
将纯化后的 DNA 片段与克隆载体 pCR-Blunt(invitrogen 社制 ) 连接。将其转化 至大肠杆菌后回收质粒， 由测序确认了扩增的基因片段与目标序列一致。将与目标序列一 致的质粒用 NotI 和 XhoI 限制性酶处理， 用 QIAquick Gel Extraction Kit 纯化后， 将目标 基因序列插入到用 NotI、 XhoI 限制性酶处理后的大肠杆菌用表达载体 pET30a(Novagen 社 制 ) 中。通过使用该载体可以产生 His 标签融合型的重组蛋白质。将该质粒转化至表达用 大肠杆菌 BL21(DE3)， 通过 1mM IPTG 进行表达诱导来使目标蛋白质在大肠杆菌内表达。
此外， 以序列号 5 的基因为基础， 用以下的方法制作小鼠 PDS5A 的重组蛋白质。 PCR 如下进行， 按照由实施例 1 制作的各种组织和 / 或细胞 cDNA 通过 RT-PCR 法确认了表达的 cDNA 1μl、 包含 NotI 和 XhoI 限制性酶切序列的 2 种引物 ( 在序列号 41 和 42 记载 ) 各 0.4μM、 0.2mM dNTP、 1.25U 的 PrimeSTAR HS 聚合酶 ( 宝酒造社制 ) 的方式加入各试剂和所 附缓冲液， 使总量为 50μl， 使用 Thermal Cycler(BIO RAD 社制 )， 将 98℃ -10 秒， 55℃ -15 秒， 72℃ -4 分钟的循环重复 30 次。另外， 上述 2 种引物是扩增编码序列号 6 的氨基酸序列 全长的区域的引物。PCR 后， 将扩增的 DNA 用 1％琼脂糖凝胶进行电泳， 使用 QIAquick Gel Extraction Kit(QIAGEN 社制 ) 纯化约 4000bp 的 DNA 片段。
将纯化后的 DNA 片段与克隆载体 pCR-Blunt(invitrogen 社制 ) 连接。 将其转化至 大肠杆菌后回收质粒， 由测序确认了被扩增了的基因片段与目标序列一致。将与目标序列 一致的质粒用 NotI 和 XhoI 限制性酶处理， 用 QIAquick Gel Extraction Kit 纯化后， 将目 标基因序列插入到用 NotI、 XhoI 限制性酶处理后的大肠杆菌用表达载体 pET30a(Novagen 社制 ) 中。通过使用该载体可以产生 His 标签融合型的重组蛋白质。将该质粒转化至表达 用大肠杆菌 BL21(DE3)， 通过 1mM IPTG 进行表达诱导来使目标蛋白质在大肠杆菌内表达。
(2) 重组 PDS5A 蛋白质的纯化
将由上述获得的表达序列号 2、 序列号 44 或序列号 6 的各个重组大肠杆菌在含有 100μg/ml 氨苄青霉素的 LB 培养基中在 37℃培养直到 600nm 的吸光度为 0.7 左右， 然后添 加异丙基 -β-D-1- 硫代半乳糖苷使终浓度为 1mM， 再在 37℃培养 4 小时。然后以 4800 转 / 分钟离心 10 分钟并收集菌体。将该菌体颗粒悬浮在磷酸缓冲化生理盐水中， 再以 4800 转 / 分钟离心 10 分钟并进行菌体的洗涤。
将该菌体悬浮在 50mM Tris- 盐酸缓冲液 (pH 值 8.0) 中， 在冰上进行超声波破碎。 将大肠杆菌超声波破碎液以 6000 转 / 分钟离心分离 20 分钟， 将所得的上清液作为可溶性 级分， 将沉淀物作为不溶性级分。
将不溶性级分在 50mM Tris- 盐酸缓冲液 (pH8.0) 中悬浮， 以 6000 转 / 分钟离心 15 分钟。将本操作重复 2 次， 进行脱蛋白酶操作。
将该残渣悬浮在含有 6M 盐酸胍、 0.15M 氯化钠的 50mM Tris- 盐酸缓冲液 (pH 值 8.0) 中， 在 4 ℃ 静 置 20 小 时 使 蛋 白 质 变 性。 该 变 性 操 作 后， 将 以 6000 转 / 分 钟 离 心 30 分钟而得的可溶性级分添加至按照常规方法调制的镍螯合柱 ( 载体 ： Chelateing Sepharose( 商标 )Fast Flow(GE Health Care 社 )， 柱容量 5mL， 平衡化缓冲液 ： 含有 6M 盐 酸胍、 0.15M 氯化钠 50mMTris- 盐酸缓冲液 (pH 值 8.0)) 中， 再在 4℃静置一晚并进行对镍 螯合化后的载体的吸附。将该柱载体以 1500 转 / 分钟离心 5 分钟来回收上清液， 对于柱载 体， 在磷酸缓冲化生理盐水中悬浮后， 再填充于柱中。将柱未吸附级分用柱容量的 10 倍量的含有 0.5M 氯化钠的 0.1M 乙酸缓冲液 (pH 值 4.0) 进行洗涤操作后， 立即用含有 0.5M 氯化钠的 0.1M 乙酸缓冲液 (pH 值 3.0) 进行溶 出而作为纯化级分， 以后将该纯化级分作为施用试验用的材料。 另外， 各溶出组分中的目标 蛋白质通过按照常规方法进行的考马斯染色确认。
将通过上述方法而获得的纯化标品置换到反应用缓冲液 (50mMTris-HCl， 100mM NaCl， 5mM CaCl2(pH 值 8.0)) 中后， 使用 FactorXa Cleavage Capture Kit(Novagen 社制 ) 按照所附实验方法通过 FactorXa 蛋白酶进行 His 标签的切割和目标蛋白质的纯化。接下 来， 将通过上述方法而获得的纯化标品 12ml 使用超滤 NANOSEP 10K OMEGA(PALL 社制 ) 进行 生理用磷酸缓冲液 ( 日水制药社制 ) 置换后， 用 HT タフリンアクロデイスク 0.22μm(PALL 社制 ) 进行无菌过滤， 将其用于实验。
(3) 重组小鼠 PDS5A 蛋白质对荷瘤小鼠的抗肿瘤效果
在 A/J 小鼠 (7 周龄， 雄， 从日本 SLC 社购入 ) 的皮下移植 1×106 个小鼠神经母细 胞瘤细胞株 N2a， 在肿瘤达到平均 50 ～ 100mm3 的时刻 ( 典型地为肿瘤接种后 7 天 )， 将小 鼠以 1 组 10 只的方式随机分组， 进行重组小鼠 PDS5A 蛋白质的抗肿瘤效果的评价 ( 治疗 模型 )。在如上所述纯化后的重组小鼠 PDS5A 蛋白质 100μg(0.5ml) 中混合 50μg 的多聚 IC 来调制癌治疗剂， 将其对荷瘤小鼠每一周向皮下施用共计 3 次。其结果是， 从癌治疗剂 施用起 31 天后， 肿瘤完全萎缩。另一方面， PBS(-) 施用阴性对照组和多聚 IC 单独施用组 (50μg) 中， 施用后 31 天后， 肿瘤分别为平均 1657mm3、 平均 932mm3。
此外， 调制混合有重组小鼠 PDS5A 蛋白质 100μg(0.5ml) 和 50μg 的多聚 IC 的癌 治疗剂， 将其对 A/J 小鼠每一周向皮下施用共计 3 次后， 移植 1×106 个 N2a 细胞来评价抗肿 瘤效果 ( 预防模型 )。另外， 1 组为 10 只， 作为比较对照， 分成 PBS(-) 施用阴性对照组和多 聚 IC 单独施用组 (50μg)。其结果是， 施用了癌治疗剂的组中， 施用癌治疗剂在 40 天后也 观察不到肿瘤发生。另一方面， PBS(-) 施用阴性对照组和多聚 IC 单独施用组 (50μg) 中， 施用后 40 天后分别为平均 1989mm3、 平均 1843mm3。
用大肠癌模型进行同样的实验。对 Balb/c 小鼠 (7 周龄， 雄， 从日本 SLC 社购入 ) 6 的皮下移植 1×10 个大肠癌细胞株 CT26， 在肿瘤达到平均 50 ～ 100mm3 的时刻 ( 典型地为 肿瘤接种后 7 天 )， 将小鼠以 1 组 10 只的方式随机分组， 进行重组小鼠 PDS5A 蛋白质的抗肿 瘤效果的评价 ( 治疗模型 )。在如上所述纯化后的重组小鼠 PDS5A 蛋白质 100μg(0.5ml) 中混合 50μg 的多聚 IC 来调制癌治疗剂， 将其对荷瘤小鼠每一周向皮下施用共计 3 次。其 结果是， 从癌治疗剂施用起 24 天后， 肿瘤完全萎缩。另一方面， PBS(-) 施用阴性对照组和 多聚 IC 单独施用组 (50μg) 中， 施用后 24 天后， 肿瘤分别为平均 1449mm3、 平均 835mm3。
此外， 调制混合有重组小鼠 PDS5A 蛋白质 100μg(0.5ml) 和 50μg 的多聚 IC 的癌 治疗剂， 将其对 Balb/c 小鼠每一周向皮下施用共计 3 次后， 移植 1×106 个 CT26 细胞来评 价抗肿瘤效果 ( 预防模型 )。另外， 1 组为 10 只， 作为比较对照， 分成 PBS(-) 施用阴性对照 组和多聚 IC 单独施用组 (50μg)。其结果是， 施用了癌治疗剂的组中， 施用癌治疗剂 31 天 后也观察不到肿瘤发生。另一方面， PBS(-) 施用阴性对照组和多聚 IC 单独施用组 (50μg) 中， 施用后 31 天后分别为平均 1781mm3、 平均 1675mm3。
由以上的结果明确了重组 PDS5A 蛋白质对癌的治疗和预防是有效的。
(4) 重组 PDS5A 蛋白质对荷瘤患狗的抗肿瘤效果对表皮具有肿瘤的荷瘤患狗 3 只 ( 乳腺肿瘤 3 只 )， 进行后述的实施例 5 中记载的 重组蛋白质的抗肿瘤效果的评价。进行施用前， 首先， 通过后述的实施例 5(3) 中记载的方 法， 测定针对各患狗的血清中的重组蛋白质的抗体效价， 结果是检测到了高于健常狗的抗 体效价。因此暗示出， 这些荷瘤患狗的生物体中的肿瘤组织中， 具有序列号 2 所示的氨基酸 序列的蛋白质作为癌抗原表达。
在 如 上 所 述 纯 化 后 的 重 组 PDS5A 蛋 白 质 ( 来 源 于 狗 和 来 源 于 人 ) 各 500μg(2.5ml) 中混合等量的不完全弗氏佐剂 ( 和光纯药社制 ) 来调制 2 种癌治疗剂， 将其 每一周向肿瘤附近的所属淋巴结施用共计 3 次。其结果是， 在癌治疗剂施用时大小分别为 3 3 约 500mm 和 1000mm 的肿瘤， 在从癌治疗剂施用起分别 13 天后和 21 天后完全萎缩。另一 方面， PBS(-) 施用阴性对照组中， 在 PBS 施用时刻为约 800mm3 的肿瘤在施用后 21 天后变为 1625mm3。
此外， 对肛门周围发生的腺癌和表皮处发生的扁平上皮癌的患狗各 1 只， 在如后 述的实施例 5 那样在纯化后的重组狗 PDS5A 蛋白质 500μg(2.5ml) 中混合等量的不完全弗 氏佐剂 ( 和光纯药社制 ) 而作为癌治疗剂， 将其每一周向肿瘤附近的皮下施用共计 4 次。 其 3 3 结果是， 在癌治疗剂施用时刻癌的大小分别为约 370mm 和 280mm 的肿瘤， 在从癌治疗剂施 用起分别 35 天后和 42 天后完全萎缩。 (5) 使用了重组 PDS5A 蛋白质的癌的检测
采集被确认了恶性肿瘤的患狗 112 只和健常狗 30 只的血液， 分离出血清。使用 由上述 (2) 制作的狗 PDS5A 蛋白质 ( 序列号 2) 采用 ELISA 法测定与该蛋白质特异性反应 的血清中的抗体效价。制作的蛋白质的固相化如下进行 ： 将用磷酸缓冲化生理盐水稀释成 5μg/mL 的重组蛋白质溶液以 100μl/ 孔添加至 96 孔イモビライザ一氨基酶标板 ( ヌンク 社制 )， 在 4℃进行静置一晚。 封闭如下进行 ： 以 100μl/ 孔加入含有 3％ BSA(bovine serum albumin( 牛血清白蛋白 )， シグマアルドリツチジヤパン社制 ) 的 50mM 碳酸氢钠缓冲溶液 (pH 值 8.4)( 以下称为封闭溶液 )， 在室温振荡 1 小时。以 100μl/ 孔添加使用封闭溶液 进行了稀释的 1000 倍稀释血清， 在室温振荡 3 小时使其反应。用含有 0.05％ Tween20( 和 光纯药工业社制 ) 的磷酸缓冲化生理盐水 ( 以下称为 PBS-T) 洗涤 3 次， 以 100μl/ 孔加 入采用封闭溶液稀释至 3000 倍的 HRP 修饰抗狗 IgG 抗体 (Goat anti Dog IgG-h+I HRP conjugated ： BETHYL Laboratories 社制 )， 在室温振荡 1 小时使其反应。用 PBS-T 洗涤 3 次， 以 100μl/ 孔添加 HRP 底物 TMB(1-Step Turbo TMB( 四甲基联苯胺 )， PIERCE 社 )， 在 以 100μl/ 孔加入 0.5M 硫酸溶液 ( シグマアルドリツ 室温使酶底物反应 30 分钟。然后， チジヤパン社制 ) 来停止反应后， 采用酶标仪测定 450nm 的吸光度。作为对照， 将未对制作 的重组蛋白质固相化的物质、 未使荷瘤狗血清反应的物质与上述同样地进行并比较。
对于用于上述癌诊断的共 112 个样本， 使用摘出的肿瘤组织的病理诊断的结果全 部确诊为恶性。
具体为受到了下述癌诊断的样本， 所述癌是恶性黑素瘤、 恶性混合肿瘤、 肝细胞 癌、 基底细胞癌、 口腔内肿瘤、 肛周腺癌、 肛门囊肿瘤、 肛门囊顶质分泌腺癌、 睾丸支持细胞 瘤、 阴道前庭癌、 皮脂腺癌、 皮脂腺上皮瘤、 皮脂腺腺瘤、 汗腺癌、 鼻腔内腺癌、 鼻腺癌、 甲状 腺癌、 大肠癌、 支气管腺癌、 腺癌、 腺管癌、 乳腺癌、 复合型乳腺癌、 乳腺恶性混合肿瘤、 乳管 内乳头状腺癌、 纤维肉瘤、 血管周皮瘤、 骨肉瘤、 软骨肉瘤、 软组织肉瘤、 组织细胞肉瘤、 粘液
肉瘤、 未分化肉瘤、 肺癌、 肥大细胞瘤、 皮肤平滑肌瘤、 腹腔内平滑肌瘤、 平滑肌瘤、 扁平上皮 癌、 慢性型淋巴细胞性白血病、 淋巴瘤、 消化道型淋巴瘤、 消化器型淋巴瘤、 小～中细胞型淋 巴瘤、 肾上腺髓质肿瘤、 颗粒细胞瘤、 嗜铬细胞瘤等。
来源于这些荷瘤狗生物体的血清与来源于健常狗的血清相比显示对重组蛋白质 的高抗体效价。已知由本诊断法得到的恶性判断为健常狗平均值的 2 倍以上的情况为 94 个样本， 可以以 83.9％诊断恶性癌。该 94 个样本的癌的种类如下。另外， 根据样本不同也 有罹患多种癌的样本， 以下所示的数值是每种癌的累计值。
恶性黑素瘤 5 例， 淋巴瘤 10 例， 颗粒细胞瘤 1 例， 肝细胞癌 3 例， 恶性精巢肿瘤 3 例， 口腔内肿瘤 3 例， 肛周腺癌 5 例， 肉瘤 9 例， 乳腺癌 35 例， 肺癌 1 例， 腺管癌 4 例， 皮脂腺 癌 2 例， 肥大细胞瘤 5 例， 平滑肌肉瘤 1 例， 扁平上皮癌 4 例， 恶性混合肿瘤 2 例， 血管周皮 瘤 1 例。
此外， 使用由上述 (2) 制作的人 PDS5A 蛋白质 ( 序列号 44) 与上述同样地操作进 行癌诊断， 结果得到了同样的结果。
由此表明了， 通过使用 PDS5A 蛋白质测定与该蛋白质特异性反应的血清中的抗体 效价， 可以进行癌的检测和诊断。
产业可利用性
本发明的包含对各种癌发挥抗肿瘤活性的多肽的免疫诱导剂对癌的治疗和 / 或 预防或癌的检测是有用的。