一种治疗肺间质纤维化的药物及其制备方法.pdf

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1、(10)授权公告号 CN 102772633 B (45)授权公告日 2014.07.23 CN 102772633 B (21)申请号 201110122365.8 (22)申请日 2011.05.12 A61K 36/8966(2006.01) A61P 11/00(2006.01) (73)专利权人 北京中医药大学东方医院 地址 100078 北京市丰台区方庄芳星园一区 6 号 (72)发明人 焦扬 (74)专利代理机构 北京太兆天元知识产权代理 有限责任公司 11108 代理人 张韬 CN 1742939 A,2006.03.08, CN 102178698 A,2011.09.14,。

2、 (54) 发明名称 一种治疗肺间质纤维化的药物及其制备方法 (57) 摘要 本发明公开了一种治疗肺间质纤维化药物组 合物及其制备方法， 该药物组合物以生黄芪、 金银 花、 当归、 丹参、 浙贝母等为原料， 该组合物的制备 方法为 ： 对当归、 丹参用乙醇回流提取， 合并醇提 液， 药液备用 ； 生黄芪、 金银花、 浙贝母等加水煎 煮， 经过乙醇回流提取的当归、 丹参药渣单独加水 煎煮、 滤过， 合并滤液， 与上述备用药液合并， 减压 浓缩、 干燥， 粉碎成细粉， 加入常规辅料， 按照常规 工艺， 制得本发明药物组合物。 本发明药物组合物 对肺间质纤维化疗效确切， 作用迅速、 时间持久， 毒副。

3、作用小， 并且本发明工艺简单、 成本低廉， 能 耗低， 适用于工业化生产。 (51)Int.Cl. (56)对比文件 审查员 张溪 权利要求书 2 页 说明书 14 页 附图 3 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利 权利要求书2页 说明书14页 附图3页 (10)授权公告号 CN 102772633 B CN 102772633 B 1/2 页 2 1. 一种治疗肺间质纤维化的药物组合物， 其特征在于该药物组合物的原料药组成为 ： 生黄芪 10 50 重量份 金银花 10 30 重量份 当归 10 30 重量份 丹参 10 20 重量份 浙贝母 5 15 重量份 生甘草。

4、 1 10 重量份 石韦 5 25 重量份 穿山龙 10 20 重量份。 2. 如权利要求 1 所述的药物组合物， 其特征在于该药物组合物的原料药组成为 ： 生黄芪 30 重量份 金银花 20 重量份 当归 20 重量份 丹参 15 重量份浙贝母 10 重 量份 生甘草 6 重量份 石韦 15 重量份 穿山龙 15 重量份。 3. 如权利要求 1 所述的药物组合物， 其特征在于该药物组合物的原料药组成为 ： 生黄芪 20 重量份 金银花 25 重量份 当归 25 重量份 丹参 12 重量份浙贝母 8 重量 份 生甘草 8 重量份 石韦 20 重量份 穿山龙 12 重量份。 4. 如权利要求 1。

5、 所述的药物组合物， 其特征在于该药物组合物的原料药组成为 ： 生黄芪 40 重量份 金银花 15 重量份 当归 15 重量份 丹参 18 重量份浙贝母 12 重 量份 生甘草 4 重量份 石韦 10 重量份 穿山龙 18 重量份。 5. 如权利要求 1-4 任一所述的药物组合物， 其特征在于取原料药， 加入常规辅料， 按 照常规工艺， 制成片剂、 胶囊剂、 散剂、 丸剂、 颗粒剂、 蜜炼膏剂、 缓释制剂、 速释制剂、 控释制 剂、 口服液体制剂或注射制剂。 6. 如权利要求 5 所述的药物组合物， 其特征在于， 所述胶囊剂为软胶囊剂。 7. 如权利要求 5 所述的药物组合物， 其特征在于， 。

6、所述丸剂为滴丸或蜜丸。 8. 如权利要求 5 所述的药物组合物， 其特征在于， 所述注射制剂为冻干粉针剂。 9. 如权利要求 1-4 任一所述的药物组合物的制备方法， 其特征在于该方法为 ： 取当归、 丹参分别用 70% 80% 乙醇回流提取 1 3 次， 每次加乙醇 4 8 重量倍， 每 次 0.5 2 小时 ； 合并醇提液， 在 60 80， 回收乙醇至相对密度为 1.02 1.06 的药 液， 备用 ； 生黄芪、 金银花、 浙贝母、 石韦、 穿山龙、 生甘草加水煎煮24次， 经过乙醇回流提 取的当归、 丹参药渣单独加水煎煮 3 次， 每次加水 6 10 重量倍， 滤过， 在 60 80，。

7、 合 并滤液并浓缩至相对密度为 1.02 1.06 的药液， 与上述备用药液合并， 在 40 60， 减 压浓缩至相对密度为 1.12 1.17 的稠膏， 减压干燥， 粉碎 , 加入常规辅料， 按照常规工艺， 制得药物组合物。 10. 如权利要求 6 所述的药物组合物的制备方法， 其特征在于该方法为 ： 取当归、 丹参分别用 75% 乙醇回流提取 2 次， 每次加乙醇 6 重量倍， 每次 1 小时 ； 合并醇 提液， 在 70， 回收乙醇至相对密度为 1.021.06 的药液， 备用 ； 生黄芪、 金银花、 浙贝母、 石韦、 穿山龙、 生甘草加水煎煮 3 次， 经过乙醇回流提取的当归、 丹参药。

8、渣单独加水煎煮 3 次， 每次加水 8 重量倍， 滤过， 在 70， 合并滤液并浓缩至相对密度为 1.02 1.06 的药液， 与上述备用药液合并， 在 50， 减压浓缩至相对密度为 1.12 1.17 的稠膏， 减压干燥， 粉 碎 , 加入常规辅料， 按照常规工艺， 制得药物组合物。 11. 如权利要求 6 所述的药物组合物的制备方法， 其特征在于该方法为 ： 取当归、 丹参分别用 78% 乙醇回流提取 1 次， 每次加乙醇 5 重量倍， 每次 1.5 小时 ； 合 并醇提液， 在 75， 回收乙醇至相对密度为 1.02 1.06 的药液， 备用 ； 生黄芪、 金银花、 浙 贝母、 石韦、 。

9、穿山龙、 生甘草加水煎煮 2 次， 经过乙醇回流提取的当归、 丹参药渣单独加水煎 煮3次， 每次加水9重量倍， 滤过， 在65， 合并滤液并浓缩至相对密度为1.021.06的药 权 利 要 求 书 CN 102772633 B 2 2/2 页 3 液， 与上述备用药液合并， 在 45， 减压浓缩至相对密度为 1.12 1.17 的稠膏， 减压干燥， 粉碎 , 加入常规辅料， 按照常规工艺， 制得药物组合物。 12. 如权利要求 6 所述的药物组合物的制备方法， 其特征在于该方法为 ： 取当归、 丹参分别用 72% 乙醇回流提取 3 次， 每次加乙醇 7 重量倍， 每次 1 小时 ； 合并 醇提。

10、液， 在 65， 回收乙醇至相对密度为 1.02 1.06 的药液， 备用 ； 生黄芪、 金银花、 浙贝 母、 石韦、 穿山龙、 生甘草加水煎煮 4 次， 经过乙醇回流提取的当归、 丹参药渣单独加水煎煮 3 次， 每次加水 7 重量倍， 滤过， 在 75， 合并滤液并浓缩至相对密度为 1.02 1.06 的药 液， 与上述备用药液合并， 在 55， 减压浓缩至相对密度为 1.12 1.17 的稠膏， 减压干燥， 粉碎 , 加入常规辅料， 按照常规工艺， 制得药物组合物。 13. 如权利要求 1-4 任一所述的药物组合物在制备治疗肺间质纤维化药物中的应用。 权 利 要 求 书 CN 102772。

11、633 B 3 1/14 页 4 一种治疗肺间质纤维化的药物及其制备方法 技术领域 0001 本发明涉及一种中药组合物及其制备方法， 特别涉及一种用于治疗肺间质纤维化 的中药组合物及其制备方法。 背景技术 0002 肺间质纤维化是发病率高， 致残率高， 死亡率高， 严重危害人民身体健康的疾病。 特发性肺间质纤维化病因仍然不明， 确诊后中位生存期为 28.2 个月， 目前西医尚缺乏有 效的治疗手段， 口服糖皮质激素的有效率在 20 -25之间， 但毒副作用大， 病人依从性较 差， 常需选用肺移植手术， 治疗费用高， 风险大。因此研发中药抗肺间质纤维化制剂很有必 要。 发明内容 0003 本发明目。

12、的在于提供一种用于治疗肺间质纤维化的中药组合物 ； 本发明另一个目 的在于提供该组合物的制备方法。 0004 本发明目的是通过如下技术方案实现的 ： 0005 本发明中药组合物原料药组成为 ： 0006 生黄芪 10 50 重量份 金银花 10 30 重量份 当归 10 30 重量份 丹参 10 20 重量份 浙贝母 5 15 重量份 生甘草 1 10 重量份 石韦 5 25 重量份穿 山龙 10 20 重量份 0007 本发明中药组合物的原料药组成优选为 ： 0008 生黄芪 30 重量份 金银花 20 重量份 当归 20 重量份 丹参 15 重量份浙贝 母 10 重量份 生甘草 6 重量份。

13、 石韦 15 重量份 穿山龙 15 重量份 0009 本发明中药组合物原料药组成优选为 ： 0010 生黄芪 20 重量份 金银花 25 重量份 当归 25 重量份 丹参 12 重量份浙贝母 8 重量份 生甘草 8 重量份 石韦 20 重量份 穿山龙 12 重量份 0011 本发明中药组合物原料药组成优选为 ： 0012 生黄芪 40 重量份 金银花 15 重量份 当归 15 重量份 丹参 18 重量份 浙贝 母 12 重量份 生甘草 4 重量份 石韦 10 重量份 穿山龙 18 重量份。 0013 取上述原料药， 加入常规辅料， 按照常规工艺， 制成片剂、 胶囊剂、 散剂、 软胶囊剂、 滴丸。

14、、 蜜丸、 丸剂、 颗粒剂、 蜜炼膏剂、 缓释制剂、 速释制剂、 控释制剂、 口服液体制剂、 冻干粉 针剂或注射制剂。 0014 本发明药物组合物的制备方法包括如下步骤 ： 0015 取当归、 丹参分别用 70 80乙醇回流提取 1 3 次， 每次加乙醇 4 8 重量 倍， 每次 0.5 2 小时 ； 合并醇提液， 在 60 80， 回收乙醇至相对密度为 1.02 1.06 的药液， 备用 ； 生黄芪、 金银花、 浙贝母、 石韦、 穿山龙、 生甘草加水煎煮24次， 经过乙醇回 流提取的当归、 丹参药渣单独加水煎煮3次， 每次加水610重量倍， 滤过， 在6080， 说 明 书 CN 10277。

15、2633 B 4 2/14 页 5 合并滤液并浓缩至相对密度为 1.02 1.06 的药液， 与上述备用药液合并， 在 40 60， 减压浓缩至相对密度为1.121.17的稠膏， 减压干燥， 粉碎成细粉， 加入常规辅料， 按照常 规工艺， 制得本发明药物组合物。 0016 本发明药物组合物的制备方法可以优选如下步骤 ： 0017 取当归、 丹参分别用75乙醇回流提取2次， 每次加乙醇6重量倍， 每次1小时 ； 合 并醇提液， 在 70， 回收乙醇至相对密度为 1.02 1.06 的药液， 备用 ； 生黄芪、 金银花、 浙 贝母、 石韦、 穿山龙、 生甘草加水煎煮 3 次， 经过乙醇回流提取的当。

16、归、 丹参药渣单独加水煎 煮3次， 每次加水8重量倍， 滤过， 在70， 合并滤液并浓缩至相对密度为1.021.06的药 液， 与上述备用药液合并， 在 50， 减压浓缩至相对密度为 1.12 1.17 的稠膏， 减压干燥， 粉碎成细粉， 加入常规辅料， 按照常规工艺， 制得本发明药物组合物。 0018 本发明药物组合物的制备方法可以优选如下步骤 ： 0019 取当归、 丹参分别用78乙醇回流提取1次， 每次加乙醇5重量倍， 每次1.5小时 ； 合并醇提液， 在 75， 回收乙醇至相对密度为 1.02 1.06 的药液， 备用 ； 生黄芪、 金银花、 浙贝母、 石韦、 穿山龙、 生甘草加水煎煮。

17、 2 次， 经过乙醇回流提取的当归、 丹参药渣单独加水 煎煮3次， 每次加水9重量倍， 滤过， 在65， 合并滤液并浓缩至相对密度为1.021.06的 药液， 与上述备用药液合并， 在 45， 减压浓缩至相对密度为 1.12 1.17 的稠膏， 减压干 燥， 粉碎成细粉， 加入常规辅料， 按照常规工艺， 制得本发明药物组合物。 0020 本发明药物组合物的制备方法包括如下步骤 ： 0021 取当归、 丹参分别用 72乙醇回流提取 3 次， 每次加乙醇 7 重量倍， 每次 1 小时 ； 合并醇提液， 在 65， 回收乙醇至相对密度为 1.02 1.06 的药液， 备用 ； 生黄芪、 金银花、 浙。

18、贝母、 石韦、 穿山龙、 生甘草加水煎煮 4 次， 经过乙醇回流提取的当归、 丹参药渣单独加水 煎煮3次， 每次加水7重量倍， 滤过， 在75， 合并滤液并浓缩至相对密度为1.021.06的 药液， 与上述备用药液合并， 在 55， 减压浓缩至相对密度为 1.12-1.17 的稠膏， 减压干燥， 粉碎成细粉， 加入常规辅料， 按照常规工艺， 制得本发明药物组合物。 0022 上述本发明药物组合物及其制备方法中的重量份与体积份的关系为 g/ml 的关 系。 附图说明 ： 0023 附图 1 ： 本发明药物组合物对博莱霉素致肺间质纤维化大鼠体重的影响 0024 附图 2 ： 本发明药物组合物对博莱。

19、霉素致肺间质纤维化大鼠血清中 III 型胶原含 量测定结果 0025 附图 3 ： 本发明药物组合物对博莱霉素致肺间质纤维化大鼠血清中透明质酸含量 测定结果 0026 附图 4 ： 本发明药物组合物对博莱霉素致肺间质纤维化大鼠血清中白介素 -6 测定 结果 0027 附图 5 ： 各组大鼠在各时间点肺泡炎程度 (HE 染色 ) 比较曲线及趋势图 0028 附图 6 ： 各组大鼠在各时间点肺纤维化程度 (HE 染色 ) 比较曲线及趋势图 0029 附图 7 ： 各组大鼠肺组织中 TGF-1 蛋白免疫组化图像分析结果 0030 本发明以生黄芪、 金银花、 当归、 丹参、 浙贝母、 生甘草、 石韦等。

20、为主， 对肺间质纤维 说 明 书 CN 102772633 B 5 3/14 页 6 化疗效确切， 作用迅速、 时间持久， 毒副作用小， 并且本发明工艺简单、 成本低廉， 能耗低， 适 用于工业化生产。 0031 下述实验例和实施例用于进一步说明但不限于本发明。 0032 实验例一 ： 本发明药物组合物对肺间质纤维化大鼠体重及血清中透明 0033 质酸、 III 型胶原、 白介素 -6 影响的研究 0034 1 实验材料 0035 1.1 实验动物 0036 选用健康的成年 SD 大鼠 180 只， 清洁级， 体重 200-250g。购自北京维通利华实验 动物技术有限公司。所有动物均饲养在洁净。

21、级动物房， 所有动物在适应性喂养一周后开始 实验。 0037 1.2 实验药物及试剂 0038 实验药物 ( 本发明药物组合物 ) ： 生黄芪 30g 金银花 20g 当归 20g 丹参 15g 0039 浙贝母 10g 生甘草 6g 石韦 15g 穿山龙 15g， 取当归、 丹参分别用 75乙 醇回流提取 2 次， 每次加乙醇 6 重量倍， 每次 1 小时 ； 合并醇提液， 在 70， 回收乙醇至相对 密度为 1.02 1.06 的药液， 备用 ； 生黄芪、 金银花、 浙贝母、 石韦、 穿山龙、 生甘草加水煎煮 3 次， 经过乙醇回流提取的当归、 丹参药渣单独加水煎煮 3 次， 每次加水 8。

22、 重量倍， 滤过， 在 70， 合并滤液并浓缩至相对密度为 1.02 1.06 的药液， 与上述备用药液合并， 浓缩至制 备为含生药 1g/ml 溶液。醋酸强的松 ( 实验中作为阳性对照药 )， 广东华南制药厂生产， 批 号 011201。注射用盐酸博莱霉素， 日本化药株式会社制造， 批号 X12100。 0040 III 型胶原、 透明质酸、 白介素 -6 放免试剂盒购于上海海研生物技术有限公司。 0041 1.3 实验仪器 0042 GC-911- 放射免疫计数器 ( 中国科技大学实业总公司 ) 0043 2 实验方法 0044 2.1 大鼠造模方法 0045 采用国际上公认博莱霉素诱发肺。

23、纤维化的方法制作肺间质纤维化的模型。用 1.5戊巴比妥钠腹腔注射麻醉 (2.5mL kg-1) 后将大鼠固定， 颈部消毒， 切开颈部皮肤， 钝 性剥离， 暴露气管， 然后向气管内注入 0.3mL 博莱霉素生理盐水溶液 (5mgkg-1) 或 0.9 生理盐水溶液， 继续注入 0.3mL 的空气， 注后立即将动物直立并左右旋转， 使药液在肺内均 匀分布。其中假手术对照组大鼠肺部注入等体积的生理盐水。实验期间， 大鼠自由饮水和 进食。 0046 2.2 实验动物分组和给药方法 0047 动物模型复制 ： 雄性 SD 大鼠 180 只， 体重 20010g， 随机分为博莱霉素 (BLM) 组 (30。

24、 只 )、 假手术组 (30 只 )、 本发明药物组合物大、 中、 小剂量组 (90 只 )、 阳性药物组 (30 只 )。6 组动物同步于实验开始后的第 7、 14、 28 天分别随机处死 10 只。选用本发明药物组 合物， 根据人与动物剂量进行等效换算。并根据浓度的不同分为小、 中、 大 3 个剂量组， 低剂 量中剂量高剂量 1 2 4， 本发明药物组合物低剂量给与 5ml/kg， 本发明药物组合 物中剂量组给予 10ml/kg， 本发明药物组合物高剂量组给与 20ml/kg， 每周灌胃 6 天。阳性 药物组选用临床常规用药强的松， 灌胃给予 3.5mg/kg， 加水稀释为含生药 0.35。

25、mg/ml， 每周 灌胃 6 天。假手术组及模型组均给予生理盐水 2ml 灌胃， 肺间质纤维化造模成功后第 1 天 说 明 书 CN 102772633 B 6 4/14 页 7 各治疗组即开始给药。 0048 2.3 取材 0049 分别于第 7、 14、 28 天时， 各组随机抽取 10 只， 用 1.5戊巴比妥钠腹腔注射麻醉 (2.5mLkg-1) 后将大鼠固定， 腹主动脉取血， 分离血清。 0050 2.4 指标检测 0051 观察并记录大鼠的体重， 采用放免法检测血清中透明质酸、 III 型胶原及白介 素 -6 的含量。 0052 2.4.1 放免法检测血清中透明质酸 0053 采用。

26、竞争性放免分析法测定血清中透明质酸。全部操作参照试剂盒说明书进行。 0054 操作步骤 ： 取若干放免测定试管编号后依次放入试管架。将试剂和待测样品平衡 至室温， 用前缓缓摇匀， 然后按表一依次操作 ( 单位 ： l) 0055 表一 ： 0056 0057 数据处理 ： 拟合方式采用 Logit-log 方程进行， 各标准点结合率为 B/B0 (B-NSB)/(B0-NSB)*100。 以结合率的对数为纵坐标， 标准品浓度的对数为横坐标， 绘制 标准曲线。根据个样品管的结合率即可从曲线上查得其透明质酸含量 (ng/ml) 0058 2.4.2 放免法检测血清中 III 型胶原的含量 0059。

27、 采用竞争性放免分析法测定血清中 III 型胶原的含量。全部操作参照试剂盒说明 书进行。 0060 操作步骤 ： 按表二依次操作 ( 单位 ： ul) 0061 表二 ： 说 明 书 CN 102772633 B 7 5/14 页 8 0062 0063 数据处理 ： 使用自动-计数仪测定沉淀放射性强度时， 采用3/2次方程或四参数 质量作用定律拟合方式处理数据。 0064 2.4.3 放免法检测血清中白介素 -6 的含量 0065 采用竞争性放免分析法测定血清中白介素 -6 含量。全部操作参照试剂盒说明书 进行。 0066 操作步骤 ： 按表三依次操作 ( 单位 ： l) 0067 表三 ：。

28、 0068 0069 数据处理 ： 在半对数坐标纸上绘制标准曲线， 并查出样品值。直接给出有关参数， 标准曲线及样品浓度。 0070 2.5 统计处理 0071 所有实验数据应用 SPSS 11.5 统计软件进行处理。各组大鼠血清中透明质酸及 III 型胶原及白介素 -6 含量的实验结果采用 (xs) 表示， 进行单因素方差分析， P 0.05 说 明 书 CN 102772633 B 8 6/14 页 9 认为组间有显著性差异。 0072 3 实验结果 0073 3.1 一般情况观察 0074 模型组很快出现皮毛干枯、 稀疏， 精神不振， 饮食减少， 从第 7 天开始明显消瘦， 懒 动， 咳。

29、喘 ； 假手术组皮肤光滑， 身体健壮， 饮食如常， 善打斗， 体重增加 ； 本发明药物组合物 各剂量组皮肤尚可， 较活泼， 饮食较模型组好， 尤以本发明药物组合物中剂量组明显 ； 西药 组开始尚可， 后期出现消瘦， 懒动， 皮毛干枯， 咳喘等。 0075 3.2 本发明药物组合物对博莱霉素致肺间质纤维化大鼠体重的影响 0076 大鼠在造模后体重逐渐下降， 在造模后的第 7 天体重降至最低点， 约为正常体重 的75。 在造模后的造模14天后体重逐渐回升， 到28天已恢复接近正常， 经过治疗后的各 组， 体重下降趋势均有所缓解， 可达正常体重的 80左右， 尤以中剂量治疗组体重下降趋势 最为缓和，。

30、 达正常体重的 87。具体见表四和附图一。 0077 表四本发明药物组合物对博莱霉素致肺间质纤维化大鼠体重(g)的影响(n 10) 0078 0079 注 ： 与7天假手术组比较P0.01 ； 与模型组第7天比较*P0.01， *P0.05 与 14 天假手术组比较 P 0.01 0080 3.3 血清中 III 型胶原含量测定结果 0081 结果详见表五和附图二。 0082 表五本发明药物组合物对博莱霉素致肺间质纤维化大鼠血清中 III 型胶原含量 测定结果(n 10)ng/ml 0083 说 明 书 CN 102772633 B 9 7/14 页 10 0084 注 ： 与假手术组比较P 。

31、0.01， 与模型组比较 *P 0.05， *P 0.01， 与大剂量 组比较 1)P 0.05， 与小剂量组比较2)P 0.05 0085 从表五和附图二中可以看出 ： 与假手术组相比， 7、 14、 28 天时模型组大鼠血清中 III 型胶原 (III-C) 的含量均明显升高 (P 0.01)， 以 28 天时血清中 III-C 的含量最高。 与模型组相比， 本发明药物组合物大、 中、 小剂量组均可降低肺纤维化大鼠血清中 III-C 的 含量， 其中 7d、 14d、 28d 时本发明药物组合物中剂量的降低作用较为显著 (P 0.01)， 并与 大、 小剂量组比较具有差异性 (P 0.05。

32、)。 0086 3.4 血清中透明质酸含量测定结果 0087 结果详见表六和附图三。 0088 表六本发明药物组合物对博莱霉素致肺间质纤维化大鼠血清中透明质酸含量测 定结果(n 10)ng/ml 0089 0090 注 ： 与假手术组比较P 0.01， 与模型组比较 *P 0.05， *P 0.01， 与大剂量 组比较 1)P 0.05， 与小剂量组比较2)P 0.05 0091 从表六和附图三中可以看出 ： 与假手术组相比， 7、 14、 28 天时模型组大鼠血清中 透明质酸 (HA) 的含量均明显升高 (P 0.01)， 以 28 天时血清中 HA 的含量最高。与模型 组相比， 本发明药物。

33、组合物大、 中、 小剂量组均可降低肺纤维化大鼠血清中 HA 的含量， 其中 7d， 14d、 28d 时本发明药物组合物中剂量的降低作用较为显著 (P 0.01)， 并与大、 小剂量 组比较具有差异性 (P 0.05)。 0092 3.5 血清中白介素 -6 含量测定结果 0093 结果详见表七和附图四。 说 明 书 CN 102772633 B 10 8/14 页 11 0094 表七本发明药物组合物对博莱霉素致肺间质纤维化大鼠血清中白介素 -6 测定结 果(n 10)pg/ml 0095 0096 注 ： 与假手术组比较P 0.01， 与模型组比较 *P 0.05， *P 0.01， 与大。

34、剂量 组比较 1)P 0.05， 与小剂量组比较2)P 0.05 0097 从表七和附图四中可以看出 ： 与假手术组相比， 7、 14、 28 天时模型组大鼠血清中 白介素 -6(IL-6) 的含量均明显升高 (P 0.01)， 以 28 天时血清中的 IL-6 含量最高。与模 型组相比， 本发明药物组合物大、 中、 小剂量组均可降低肺纤维化大鼠血清中 IL-6 的含量， 其中 7d， 14d、 28d 时本发明药物组合物中剂量的降低作用较为显著 (P 0.01)， 并与大、 小 剂量组比较具有差异性 (P 0.05)。 0098 实验例二 ： 本发明药物组合物对肺间质纤维化大鼠肺组织形态学影。

35、响的研究 0099 1 实验材料 0100 1.1 实验动物 0101 选用健康的成年 SD 大鼠 180 只， 清洁级， 体重 200-250g。购自北京维通利华实验 动物技术有限公司。所有动物均饲养在洁净级动物房， 所有动物在适应性喂养一周后开始 实验。 0102 1.2 实验药物及试剂 0103 实验药物 ( 本发明药物组合物 ) 同实验例一。醋酸强的松 ( 实验中作为阳性对照 药 )， 广东华南制药厂生产， 批号 011201。注射用盐酸博莱霉素， 日本化药株式会社制造， 批 号 X12100。 0104 1.3 实验仪器 0105 鼠板， 光源， 18 号大鼠气管套管， 注射器， 灭。

36、菌手术刀， 试管， 剪， 钳， K-70 全自动高 速冷冻离心机 ( 湘仪 -TOMY 联合制造 )， 匀浆器 ( 型号 ： JY-250 超声粉碎机， 浙江三门超声 波仪器厂 )， 病理切片机 ( 型号 ： LEICA KMI135 德国石蜡切片机 )， 光镜 ( 型号 ： LEICA DMLB 德国显微镜 )， 日本 OLYMPUS 全自动显微摄像系统。 0106 2 实验方法 0107 2.1 大鼠造模方法 0108 采用国际上公认博莱霉素诱发肺纤维化的方法制作肺间质纤维化的模型。用 1.5戊巴比妥钠腹腔注射麻醉 (2.5ml kg-1) 后将大鼠固定， 颈部消毒， 切开颈部皮肤， 钝 。

37、性剥离， 暴露气管， 然后向气管内注入 0.3ml 博莱霉素生理盐水溶液 (5mgkg-1) 或 0.9 说 明 书 CN 102772633 B 11 9/14 页 12 生理盐水溶液， 继续注入 0.3ml 的空气， 注后立即将动物直立并左右旋转， 使药液在肺内均 匀分布。其中假手术对照组大鼠肺部注入等体积的生理盐水。实验期间， 大鼠自由饮水和 进食。 0109 2.2 实验动物分组和给药方法 0110 动物模型复制 ： 雄性 SD 大鼠 180 只， 体重 20010g， 随机分为博莱霉素 (BLM) 组 (30 只 )、 假手术组 (30 只 )、 本发明药物组合物大、 中、 小剂量组。

38、 (90 只 )、 阳性药物组 (30 只)。 6组动物同步于实验开始后的第7、 14、 28天分别随机处死10只。 本发明药物组合物， 根据人与动物剂量进行等效换算。并根据浓度的不同分为小、 中、 大 3 个剂量组， 低剂量 中剂量高剂量 1 2 4， 本发明药物组合物低剂量 5ml/kg， 本发明药物组合物中剂量 组给予 10ml/kg， 本发明药物组合物高剂量组 20ml/kg， 每周灌胃 6 天。阳性药物组选用临 床常规用药强的松， 灌胃给予 3.5mg/kg， 加水稀释为含生药 0.35mg/ml， 每周灌胃 6 天。假 手术组及模型组均给予生理盐水 2ml 灌胃， 肺间质纤维化造模。

39、成功后第 1 天各治疗组即开 始给药。 0111 2.3 取材 0112 分别于第 7、 14、 28 天时， 各组随机抽取 10 只， 用 1.5戊巴比妥钠腹腔注射麻醉 (2.5mLkg-1) 后将大鼠固定， 取出肺脏， 肺组织置于 4多聚甲醛中固定 24h， 常规石蜡包 埋， 连续组织切片 ( 厚 4m)， 进行苏木精 - 伊红 (HE) 染色， 光镜下观察肺组织病理变化。 0113 2.4 指标检测 0114 组织病理学检查 ： 参照 Szaopiel 等方法将肺泡炎和肺纤维化的程度分为四级 ： 0 级无明显改变 (-) ； 1 级轻度改变， 病变范围小于全肺的 20 (+) ； 2 级。

40、中度改变， 病变范 围占全肺的 20 50 (+) ； 3 级重度改变， 病变范围占全肺的 50以上 (+)。 0115 病理图像分析 ： 各组动物左肺标本行 HE 染色后， 根据肺泡腔、 细胞核及肺间质 纤维的灰度不同， 将肺组织HE染色病理切片分成以下三个区域 ： (a)无染区 ： 为肺泡腔， (b) 深染区 ： 为细胞核， (c) 浅染区 ： 为肺间质纤维结缔组织。 0116 进行图像分析， 计算出肺泡炎和肺纤维化分级。 0117 2.5 统计处理 0118 本资料所有数据均采用SPSS 11.5进行统计处理， 其中计量资料用t检验， 计数资 料用 X2 检验， 等级资料用秩和检验。 0。

41、119 3 实验结果 0120 3.1 肺大体形态改变 0121 大鼠解剖后肉眼观察， 假手术组第7天、 14天、 28天双肺呈粉红色， 表面光滑， 弹性 良好。模型组第 7 天， 双肺暗红， 可见炎性渗出， 第 14 天双肺暗红， 散在出血点， 第 28 天肺 脏质地坚硬， 颜色暗红， 表面粗造不平， 触之有橡胶感， 可见纤维索条及瘢痕。 强的松治疗和 本发明药物组合物大、 中、 小治疗组在第 7 天、 14 天、 28 天双肺肺泡炎及纤维化程度较模型 组减轻。 0122 3.2 肺病理结果 0123 3.2.1 光镜观察 ： 假手术组大鼠肺结构清晰， 肺泡腔完整， 各时间点观察均未出现 明。

42、显改变。模型组第 14 天时肺泡间隔水肿增厚， 伴有巨噬细胞、 淋巴细胞、 嗜酸细胞的浸 润， 细支气管腔内可见分泌物， 肺组织局部可见大片的团块状炎症浸润和纤维化灶， 肺泡断 说 明 书 CN 102772633 B 12 10/14 页 13 裂、 肺泡结构破坏。28 天时肺泡壁显著增厚， 肺泡间隔明显增宽， 间质内成纤维细胞和胶原 基质明显增多， 仍有大量有巨噬细胞、 淋巴细胞、 嗜酸细胞的浸润， 病灶内肺泡断裂、 融合、 闭塞， 肺泡结构破坏明显， 肺泡萎缩。7 天时强的松组和本发明药物组合物大、 中、 小治疗组 肺泡炎比模型组减轻。14 天、 28 天时强的松组和本发明药物组合物大、。

43、 中、 小治疗组肺纤维 化均减轻， 肺泡隔轻度增厚， 肺泡结构破坏轻， 肺泡纤维增生较轻。 0124 3.2.2HE 染色 ： 0125 模型组第 7 天时肺泡隔增宽与炎症细胞浸润最重 ： 肺泡隔增宽， 其中大量巨噬细 胞、 淋巴细胞、 嗜酸细胞的浸润 (+ +)。模型组 14 天时肺泡隔增宽与炎症细胞浸润 较 7 天时减轻， 炎症细胞消散 ： 肺泡隔增宽， 有巨噬细胞、 淋巴细胞、 嗜酸细胞的浸润 (+ +)。强的松组与本发明药物组合物组较模型组病变程度轻。结果见表八、 表九和附图 0126 五、 附图六。 0127 表八四组大鼠各时间点肺泡炎程度 (HE 染色 ) 比较 0128 0129。

44、 # ： 与假手术组对照， P 0.05# ： 与假手术组对照， P 0.01* ： 与模型组对照， P 0.05 0130 从表八和附图五可以看出 ： 与假手术组相比， 7、 14、 28 天时模型组大鼠肺泡炎明 显加重 (P 0.01 或 P 0.05)。与模型组相比， 本发明药物组合物大、 中、 小治疗组均较模 型组肺泡炎减轻 (P 0.05)。 0131 表九四组大鼠各时间点肺纤维化程度 (HE 染色 ) 比较 0132 说 明 书 CN 102772633 B 13 11/14 页 14 0133 # ： 与假手术组对照， P 0.05# ： 与假手术组对照， P 0.01* ： 与。

45、模型组对照， P 0.05 从表九和附图六可以看出 ： 与假手术组相比， 7、 14、 28 天时模型组大鼠肺纤维化明 显加重 (P 0.01 或 P 0.05)。与模型组相比， 本发明药物组合物大、 中、 小治疗组均较模 型组肺纤维化减轻 (P 0.05)。 0134 实验例三本发明药物组合物对肺纤维化大鼠肺组织转化生长因子 1(TGF 1) 的影响 0135 1 实验材料 0136 1.1 实验动物 0137 同实验一 0138 1.2 实验药物及试剂 0139 实验药物 ( 本发明药物组合物 ) 同实验例一。醋酸强的松 ( 实验中作为阳性对照 药 )， 广东华南制药厂生产， 批号 011。

46、201。注射用盐酸博莱霉素， 日本化药株式会社制造， 批 号X12100。 兔抗人、 鼠TGF1多克隆抗体， 武汉博士德生物工程有限公司产品， 即用型SABC 免疫组化试剂盒， 武汉博士德生物工程有限公司产品， DAB 显色试剂盒， 武汉博士德生物工 程有限公司产品。 0140 1.3 实验主要仪器 0141 电泳系统 ： 美国 LTI-MODEL， 250 型匀浆机 ： 中大仪器厂 FS-1 离心机 ： HITACHI himac CF15D， 紫外分光光度计 ： UV-1601 电转仪 ： 北京六一 DYY7C。 0142 2 实验方法 0143 2.1 大鼠造模方法 0144 同实验例一。

47、 0145 2.2 实验动物分组 0146 同实验例一 0147 2.3 给药方法 0148 同实验例一 0149 2.4 指标检测 0150 免疫组化法检测肺组织中 TGF-1 表达 0151 免疫组化法 2 ： 载玻片防脱片处理。肺组织常规固定， 切片。切片脱蜡、 水洗， 去除内源性过氧化物酶后水洗、 修复。滴加正常山羊血清封闭液。滴加最佳稀释 说 明 书 CN 102772633 B 14 12/14 页 15 度的一抗于湿盒中。 0.1mol/L PBS 洗， 滴加生物素标记二抗， PBS 洗 5min3 次。滴 加 SABC， PBS 洗 5min3 次。 DAB 显色， 光镜下控制显色程度中止反应， 蒸馏水冲洗切片。 苏木素轻度复染， 盐酸酒精分化， 自来水冲洗还蓝。 梯度酒精逐级脱水干燥， 二甲苯透明， 中性树胶封片。 0152 用 HPIAS-1000 计算机图像分析系统对染色后的切片进行定量分析， 计算每张切 片阳性细胞染色程度， 免疫组化切片以细胞胞浆中呈清晰棕黄色为阳性。高倍镜 (400) 下观察， 随机选上、 下、 左、 右、 中央5个视野， 以病灶边缘正好进入检测光栏为准， 在40倍物 镜下测定标准测量光栏中阳性区域百分比、 平均灰度和积分光密度。平均灰度表示图像透。