新型肽化合物本申请是2006年11月29日提交的题为“新型肽化合物”的
国家申请号为200680051914.4(PCT/JP2006/323827)的发明专利
申请的分案申请。
技术领域
本发明涉及癌症疫苗疗法，特别涉及可用作癌症免疫疗法
的药物的新型肽化合物。具体的说，本发明涉及衍自WT1的癌抗原
肽的衍生物，其具有体内CTL诱导活性，可用作癌症疫苗。
技术背景
细胞介导免疫特别是细胞毒性T细胞(下文称为“CTL”)在
体内排斥癌细胞或病毒感染细胞中起到重要作用。CTL能识别癌细胞
上的衍自癌抗原蛋白的抗原肽(“癌抗原肽”)和MHC(主要组织相容性
复合体)I类抗原(在人类中称为“HLA”抗原)之间的复合物，并攻击和
杀灭该细胞。
能结合MHCI类分子的癌抗原肽通常已知是由蛋白质的胞内加
工产生的具有8-12个氨基酸残基的肽。因此，一般来说，衍自癌抗
原蛋白的具有8-12个氨基酸残基的肽会是癌抗原肽的候选者。当癌
抗原肽中存在谷氨酰胺残基或半胱氨酸残基时，这些氨基酸残基在空
气气氛中一般会自发被氧化。据报道，这种自发氧化会降低该肽与
MHCI类分子的结合亲和力和T细胞受体对该肽的认知应答(参见非
专利文献1和2)。
已从染色体11p13分离出Wilms肿瘤的肿瘤抑制基因
WT1(WT1基因)，该基因根据对作为Wilms肿瘤、无虹膜、泌尿生
殖系统畸形、脑力发育迟缓等的并发症出现的WAGR综合征的分析
鉴定为Wilms肿瘤的致病基因，且WT1的氨基酸序列是公知的(参见
非专利文献3)。WT1基因在人白血病中以高频率表达，当白血病细
胞用WT1反义寡聚物处理时，该细胞的生长受到抑制。因此，WT1
基因据认为能起到促进白血病细胞的生长的作用。此外，WT1基因
在实体癌症如胃癌、结肠癌、肺癌、乳腺癌、胚胎癌、皮肤癌、膀胱
癌、前列腺癌、子宫癌、宫颈癌和卵巢癌中也高度表达，且WT1基
因已被证明是白血病和实体癌症中的新型癌抗原蛋白基因(参见非专
利文献4和5)。另外，已鉴定了作为野生型癌抗原肽的具有WT1蛋
白的部分序列的癌抗原肽(参见专利文献1和2)。
具体的说，WT1235-243
(Cys-Met-Thr-Trp-Asn-Gln-Met-Asn-Leu；SEQIDNO：1)，即横跨癌抗
原蛋白WT1的位置235-243的肽，是一种具有以HLA-A24限制方式
诱导CTL的活性的癌抗原肽(参见非专利文献6和专利文献1)。
WT1235-243的位置2处的甲硫氨酸残基被酪氨酸残基取代所成的修饰
肽(Cys-Tyr-Thr-Trp-Asn-Gln-Met-Asn-Leu；SEQIDNO：2，下文可称
为WT1235-243(2M→Y))，比野生型的肽具有更高的HLA-A24抗原结
合亲和力(参见专利文献3)。将野生型肽WT1235-243和修饰肽WT1235-243
(2M→Y)开发成免疫治疗剂是有前途的。
另外，已知所述野生型肽和所述修饰肽每一个在N末端位点都
具有半胱氨酸残基，该残基在空气气氛中氧化会产生出通过二硫键结
合的二聚体，而所述二聚体也可起到癌抗原肽的作用(参见专利文献
4)。
专利文献1：WO00/06602
专利文献2：WO00/18795
专利文献3：WO02/079253
专利文献4：WO2004/063217
非专利文献1：Immunity.，6：273，1997
非专利文献2：J.Immunol.，160：2099，1998
非专利文献3：Cell，60：509，1990
非专利文献4：J.Immunol.，164：1873-80，2000
非专利文献5：J.Clin.Immunol.，20，195-202，2000
非专利文献6：Clin.Cancer.Res.8：2626，2002
发明内容
本发明要解决的问题
本发明要解决的问题是提供具有体内CTL诱导活性和可
在癌症免疫疗法中用作癌症疫苗的新型肽化合物。
解决问题的手段
本发明人对衍自WT1蛋白的癌抗原肽WT1235-243和
WT1235-243(2M→Y)的修饰认真地进行了各种研究，目的是要产生出
具有改进的理化特性、稳定性和生物活性的癌抗原肽。具体的说，他
们制备了从这些肽修饰而成的化合物，并用HLA-A2402/Kb转基因小
鼠(参见WO02/47474，下文可称为HLA-A24小鼠)验证了免疫原性。
结果，他们通过修饰WT1235-243或WT1235-243(2M→Y)的N
末端位点处的半胱氨酸残基(Cys)，特别是修饰N末端位点处的该半
胱氨酸残基的硫醇基团，成功地制备出具有改进的理化特性和稳定性
的肽化合物。本发明的肽化合物具有改进的免疫原性和CTL诱导活
性。被本发明肽化合物特异性诱导的T细胞由于能与癌细胞最初呈递
的野生型肽WT1235-243发生交叉反应，因此可用作癌症免疫疗法的药
物。
至今为止，其中作为WT1抗原肽的WT1235-243或WT1235-243
(2M→Y)的半胱氨酸残基得到修饰的肽化合物，未曾得知其能显示足
够的免疫原性而起到癌症抗原的作用。本发明人首先发现，通过将N
末端的半胱氨酸残基的硫醇基团与半胱氨酸、谷胱甘肽或硫代乙醇酸
的硫醇基团进行缩合所制备的肽衍生物，可用作有效的癌症抗原。
本发明是基于上述发现得以完成的。
本发明涉及
[1]式(1)的化合物：
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其中X为酪氨酸残基或甲硫氨酸残基；Y和Z各自独立选自单
键和由1-10个氨基酸残基组成的二价肽基团，
R1为氢或烷基，
R2为羟基、氨基、烷基氨基或二烷基氨基，
R3为氢、烷基、氨基、烷基氨基、二烷基氨基或取代的或未取代
的烷基羰基氨基，
R4为氢、烷基、羧基、氨基甲酰基、烷基氨基甲酰基、二烷基氨
基甲酰基或式(2)的基团：
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其中W为氨基酸残基，
m为1或2，和
n为0-2的整数，条件是当n为0时，R3为氢或烷基，
或其药物可接受的盐；
[2]根据以上[1]的化合物或其药物可接受的盐，
其中R3所代表的所述取代的烷基羰基氨基是被一个或两个选自
羧基、氨基、烷基氨基和二烷基氨基的取代基取代的烷基羰基氨基；
[3]根据以上[1]或[2]的化合物或其药物可接受的盐，
R3为氢或式(3)的基团：
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其中r为1-3的整数，和
R4为羧基或式(2′)的基团：
![]()
其中W′为甘氨酸残基或β-丙氨酸残基；
[4]根据以上[3]的化合物或其药物可接受的盐，
其中R3为式(3′)的基团：
![]()
R4为羧基甲基氨基甲酰基；
[5]根据以上[3]的化合物或其药物可接受的盐，
其中R3为氢和R4为羧基；
[6]式(1′)的化合物：
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其中X′为酪氨酸残基或甲硫氨酸残基，
R1′为氢或烷基，
R2′为羟基、氨基、烷基氨基或二烷基氨基，
R3′为氨基、烷基氨基、二烷基氨基或取代的或未取代的烷基羰
基氨基，和
R4′为羧基、氨基甲酰基、烷基氨基甲酰基或二烷基氨基甲酰基，
或其药物可接受的盐；
[7]能特异性结合根据以上[1]-[6]任一项的化合物或其药物可接
受的盐的抗体；
[8]能呈递根据以上[1]-[6]任一项的化合物或其药物可接受的盐
和HLA-A24抗原的复合物的抗原呈递细胞。
[9]由根据以上[1]-[6]任一项的化合物或其药物可接受的盐诱导
的CTL；
[10]根据以上[9]的CTL，其能识别根据以上[1]-[6]任一项的化合
物或其药物可接受的盐和HLA-A24抗原的复合物；
[11]根据以上[9]的CTL，其能识别SEQIDNo：1的肽和
HLA-A24抗原的复合物；
[12]一种包含根据以上[1]-[6]任一项的化合物或其药物可接受
的盐、根据以上[8]的抗原呈递细胞或根据以上[9]-[11]任一项的CTL
及药物可接受载体的药物组合物；
[13]根据以上[12]的药物组合物，其用作癌症疫苗；
[14]根据以上[1]-[6]任一项的化合物或其药物可接受的盐、根据
以上[8]的抗原呈递细胞或根据以上[9]-[11]任一项的CTL用于制备癌
症疫苗的用途；
[15]一种包含根据以上[1]-[6]任一项的化合物或其药物可接受
的盐、根据以上[8]的抗原呈递细胞或根据以上[9]-[11]任一项的CTL
作为活性成分的用于癌症免疫疗法的药物；或
[16]一种治疗或预防癌症的方法，所述方法包括将治疗或预防有
效量的根据以上[1]-[6]任一项的化合物或其药物可接受的盐、根据以
上[8]的抗原呈递细胞或根据以上[9]-[11]任一项的CTL，给予需要进
行癌症的治疗或预防的HLA-A24阳性和WT1阳性患者。
本发明所产生的效果
本发明提供了可用作癌症免疫疗法的药物的新型肽化合
物，例如衍自WT1的具有体内CTL诱导活性和可用作癌症疫苗的癌
症抗原。本发明的肽是通过对位于WT1235-243或WT1235-243(2M→Y)N
末端的半胱氨酸残基的巯基进行修饰、同时保持作为癌症抗原肽的活
性而制备得到，它具有改进的理化特性和稳定性，因此能广泛用于治
疗或研究。具体的说，本发明的新型肽具有诸如以下的优点：操作方
便而无需担心因体外处理所造成的活性降低，显示出稳定的治疗效果
等等。
附图简述
图1图示实施例1的肽化合物所诱导的细胞毒性活性(特
异性裂解)，使用了三只小鼠(图中的黑色柱条)。图中的白色柱条显示
的是用没有用任何肽脉冲的细胞获得的结果(以下各图同样适用)。
图2图示实施例2的肽化合物所诱导的细胞毒性活性(特异性裂
解)，使用了三只小鼠。
图3图示实施例3的肽化合物所诱导的细胞毒性活性(特异性裂
解)，使用了三只小鼠。
图4图示实施例4的肽化合物所诱导的细胞毒性活性(特异性裂
解)，使用了三只小鼠。
图5图示实施例5的肽化合物所诱导的细胞毒性活性(特异性裂
解)，使用了三只小鼠。
图6图示实施例6的肽化合物所诱导的细胞毒性活性(特异性裂
解)，使用了三只小鼠。
图7图示实施例1的肽化合物所诱导的剂量依赖性细胞毒性活性
(特异性裂解)。X轴显示每只小鼠的剂量(600μg、200μg、60μg和20μg)，
Y轴显示细胞毒性活性(特异性裂解)。每个剂量分别给予三只小鼠，
结果以细胞毒性活性平均值和标准偏差(S.D.)表示。
图8图示通过用实施例1的肽化合物免疫小鼠制备的肽特异性T
细胞对用各种肽脉冲的细胞的反应性。图中分别地，阴影线柱条显示
用野生型肽(WT1235-243)脉冲的细胞获得的结果，黑色柱条显示用实施
例1的肽化合物脉冲的细胞获得的结果，白色柱条显示用衍自流感的
肽脉冲的细胞获得的结果。另外在图中，纵轴显示斑点。
图9图示通过用实施例1的肽刺激而从人PBMC衍生的肽特异
性T细胞对用各种肽脉冲的细胞的反应性。图中分别地，“野生型肽”
显示用野生型肽(WT1235-243)脉冲的细胞获得的结果，“修饰肽”显示用
修饰肽(WT1235-243(2M→Y))脉冲的细胞获得的结果，“实施例1的肽”
显示用不用任何肽脉冲的细胞获得的结果。另外在图中，纵轴显示所
产生的γ干扰素的量。
实施本发明的最佳方式
在本申请的说明书和附图中，每种氨基酸残基分别使用以
下缩写。
Ala：丙氨酸残基
Arg：精氨酸残基
Asn：天冬酰胺残基
Asp：天冬氨酸残基
Cys：半胱氨酸残基
Gln：谷氨酰胺残基
Glu：谷氨酸残基
Gly：甘氨酸残基
His：组氨酸残基
Ile：异亮氨酸残基
Leu：亮氨酸残基
Lys：赖氨酸残基
Met：甲硫氨酸残基
Phe：苯丙氨酸残基
Pro：脯氨酸残基
Ser：丝氨酸残基
Thr：苏氨酸残基
Trp：色氨酸残基
Tyr：酪氨酸残基
Val：缬氨酸残基
本说明书中所用的“氨基酸残基”包括天然或非天然的α-
氨基酸残基、β-氨基酸残基、γ-氨基酸残基和δ-氨基酸残基。例如，“氨
基酸残基”包括天然α-氨基酸(例如，Ala、Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、
Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、
Tyr或Val)、鸟氨酸残基、高丝氨酸残基、高半胱氨酸残基、β-丙氨
酸、γ-氨基丁酸或δ-氨基戊酸。
上述氨基酸如为旋光异构体，则可以是L-对映异构体或D-对映
异构体。L-对映异构体更为优选。
在本说明书中，肽化合物的氨基酸序列是按照常规方式描述，N
末端氨基酸残基位于左侧，C末端氨基酸残基位于右侧。
(1)肽化合物
在第一个方面，本发明涉及上述式(1)化合物或其药物可接受的
盐。
在式(1)中，优选地，X代表酪氨酸残基(Tyr)。
在式(1)中，Y和Z所代表的“由1-10个氨基酸残基组成的二价肽
基团”包括由1-10个氨基酸残基组成的相同或不同的二价肽基团，对
氨基酸序列没有任何限制。例如，所述由1-10个氨基酸组成的二价
肽基团包括包含在人WT1(Cell，60：509，1990，GenBank
Acc.No.A38080)的氨基酸序列中的氨基酸序列。例如，Y可代表由人
WT1的225-234这十个氨基酸残基(如下所
示：Asn-Leu-Tyr-Gln-Met-Thr-Ser-Gln-Leu-Glu(SEQIDNo：3))组成的
二价肽基团，或者具有SEQIDNO：3的片段的二价肽基团，该片段
中缺失SEQIDNO：3的N末端处的1-9个氨基酸残基。另外，例如，
Z可代表由人WT1的244-253这十个氨基酸残基(如下所
示：Gly-Ala-Thr-Leu-Lys-Gly-Val-Ala-Ala-Gly(SEQIDNo：4))组成的
二价肽基团，或者具有SEQIDNO：4的片段的二价肽基团，该片段
中缺失SEQIDNO：4的C末端处的1-9个氨基酸残基。优选地，Y
和Z各自可代表单键。
在本说明书中，烷基基团包括例如具有1-6个碳原子的直
链或支链烷基基团。例如，烷基基团包括甲基、乙基、丙基、1-甲基
乙基、丁基、1-甲基丙基、2-甲基丙基、1，1-二甲基乙基、戊基等。
在本说明书中，烷基氨基基团包括例如具有1-6个碳原子的直链
或支链烷基氨基基团。例如，烷基氨基基团包括甲基氨基、乙基氨基、
丙基氨基、1-甲基乙基氨基、丁基氨基、1-甲基丙基氨基、2-甲基丙
基氨基、1，1-二甲基乙基氨基、戊基氨基等。
在本说明书中，二烷基氨基基团包括例如被两个相同或不同的具
有1-6个碳原子的直链或支链烷基基团取代的氨基基团。例如，二烷
基氨基基团包括二甲基氨基、乙基甲基氨基、二乙基氨基、二丙基氨
基、甲基丙基氨基、丁基甲基氨基、甲基戊基氨基等。
在本说明书中，烷基羰基氨基基团中的“烷基”包括如上所述的烷
基基团。烷基氨基甲酰基基团中的“烷基”包括与如上所述的烷基氨基
基团中的烷基相同的烷基。二烷基氨基甲酰基基团中的“烷基，，包括与
如上所述的二烷基氨基基团中的烷基相同的烷基，其中两个“烷基，，可
相同或不同。
R1和R2各自优选代表氢原子。
如R3代表取代的烷基羰基氨基基团，则烷基羰基氨基基团的取
代基包括例如羧基、羟基、氨基、烷基氨基和二烷基氨基，其中所述
烷基羰基氨基基团可被相同或不同的1-4个、优选1个或2个取代基
取代。
式(2)中W代表的氨基酸残基可优选地包括甘氨酸残基(Gly)。
本发明的肽化合物包括例如以下式(4)-(9)的化合物：
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本发明的肽化合物可按照本说明书实施例中描述的方法
或者肽合成中常用的方法来制备。这种制备法的实例是包括以下文献
在内的文献中描述的方法：″PeptideSynthesis(肽合成)″，Interscience，
NewYork，1966；″TheProteins(蛋白质)″，Vol.2，AcademicPressInc.，
NewYork，1976；″Pepuchido-Gosei″，MaruzenCo.Ltd.，1975；
″Pepuchido-Gosei-no-Kiso-to-Jikkenn″，MaruzenCo.Ltd.，1985；和
″Iyakuhin-no-Kaihatu，Zoku，vol.14，Peputido-Gosei″，HirokawaShoten，
1991。制备本发明肽的方法的实例包括按照FmoC方法或Boc方法通
过固相合成仪制备该肽的方法，或者按照液相合成方法通过Boc-氨
基酸或Z-氨基酸的连续缩合制备该肽的方法，其中分别地，Fmoc代
表9-芴甲氧基羰基基团，Boc代表叔丁氧基羰基基团，Z代表苄氧基
羰基基团。
本发明化合物合成过程中的中间化合物的官能团如氨基、羧基和
巯基基团可通过合适的保护基进行保护，被保护化合物如需要可用常
规的保护/脱保护技术进行脱保护。合适的保护基及保护和脱保护方
法详细描述于例如ProtectiveGroupsinOrganicSynthesis2ndEdition
(JohnWiley&Sons，Inc.；1990)。
具体的说，制备本发明化合物的方法的一个实例是以下反
应式所示的方法：
[反应式1]
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其中X、Y、Z、R1、R2、R3、R4、m和n分别如上所述。R和
R′各自独立代表氢原子或巯基保护基。所述巯基保护基的实例包括
例如乙酰胺基甲基或三苯甲基。
式(1)化合物可通过将式(1-1)化合物和式(1-2)化合物在惰
性溶剂中进行氧化来制备。
该氧化可通过肽合成中常用来形成二硫键的常规方法来进行。例
如，二硫键可通过将两种具有巯基基团的中间体在合适的溶剂中混合
并将它们氧化来形成。可使用常规的氧化方法如空气氧化和碘氧化。
溶剂可以是水、乙酸、甲醇、氯仿、DMF或DMSO或者它们的混合
物。氧化反应有时候会产生出对称和不对称二硫化合物的混合物。所
需的不对称二硫化合物可通过将该混合物进行纯化来制备，如用各种
类型的色谱法进行纯化，按照重结晶法进行纯化等。
或者，将具有活化巯基基团的中间体与另一种具有巯基基团的中
间体进行混合，以产生选择性二硫键。具有活化巯基基团的中间体的
实例包括例如具有与Npys基团(3-硝基-2-吡啶亚磺酰基基团)结合的
巯基基团的化合物。
或者，在将具有巯基基团的中间体中的一个与例如2，2′-二硫代双
(5-硝基吡啶)进行混合以使巯基基团活化后，将另一个中间体加入到
所得的混合物以形成选择性二硫键(TetrahedronLetters.Vol.37.No.9，
pp.1347-1350)。
式(1-1)化合物可按照本领域技术人员熟知的液相或固相肽合成
方法来制备。
另外，在式(1-1)化合物为N末端烷基化化合物的情况中，可将
如需要可通过保护基加以保护的N-烷基氨基酸或N，N-二烷基氨基酸
用作N末端氨基酸。N-烷基氨基酸或N，N-二烷基氨基酸可市售获得，
或者按照本领域技术人员熟知的方法制备，在该方法中例如使原料的
氨基酸或被保护氨基酸与烷基卤在碱的存在下进行反应。例如，N-
末端氨基基团可如以下[反应式2]所示，通过使被叔丁氧基羰基基团
保护的氨基酸与烷基卤在碱如氢化钠的存在下进行反应，来进行适当
烷基化。
[反应式2]
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其中X、Z、R1、R2、m和R各自同上所述，Hal代表溴原子
或碘原子，Prot代表保护基。
此外，在化合物是C末端酰胺化或烷基酰胺化化合物的情况中，
可将酰胺化或烷基酰胺化氨基酸用作原料的C末端氨基酸残基。
本发明化合物或或其合成中的中间体可按照本领域技术
人员熟知的方法进行纯化。例如，可通过各种类型的色谱法(例如硅
胶柱色谱、离子交换柱色谱、凝胶过滤色谱或反相色谱)或者重结晶
法进行纯化。重结晶用的溶剂可例如是醇类如甲醇、乙醇和2-丙醇，
醚类如二乙醚，酯类如乙酸乙酯，芳烃类如苯和甲苯、酮类如丙酮，
烃类如己烷，非质子溶剂如二甲基甲酰胺和乙腈，水或者以上溶剂的
混合溶剂。其它纯化用的方法可以是《Jikkenkagakukoza(试验化学讲
座)》(日本化学会编辑，Maruzen(丸善))的第1卷中所述的方法。
在本发明化合物具有一个或多个不对称中心的情况中，可
用具有不对称中心的原料(氨基酸)按照常规方法来制备该化合物。此
外，在生产过程中的适当步骤中可进行光学拆分，以改进本发明化合
物的光学纯度。例如，可按照非对映异构体方法进行光学拆分，在该
方法中将本发明化合物或其中间体与旋光活性酸(例如一元羧酸如扁
桃酸、N-苄氧基丙氨酸和乳酸，二元羧酸如酒石酸、邻-二亚异亚丙
基酒石酸和苹果酸或者磺酸如樟脑磺酸和溴樟脑磺酸)在非活性溶剂
(例如醇类溶剂如甲醇、乙醇和2-丙醇，醚类如二乙醚，酯类溶剂如
乙酸乙酯，烃类溶剂如甲苯，非质子溶剂如乙腈或者以上溶剂的混合
溶剂)中进行混合，以制备盐形式。在本发明化合物或其中间体具有
酸官能团如羧基基团的情况中，光学拆分可通过与旋光活性胺(例如
有机胺如α-苯乙基、奎宁、奎尼定、辛可尼定、辛可宁和马钱子碱)
形成盐来进行。
形成盐的反应可在室温到溶剂沸点的范围内的温度下进
行。为了提高光学纯度起见，优选的是将温度一次性提高到大约溶剂
沸点。如需要可通过将混合物冷却来提高收率，沉淀出的盐可通过过
滤回收。
旋光活性酸或胺的适当用量为底物的约0.5至约2.0当量，优选
为底物的约1当量。如需要，可将晶体在非活性溶剂(例如醇类如甲
醇、乙醇和2-丙醇，醚类如二乙醚，酯类如乙酸乙酯，烃类如甲苯，
非质子溶剂如乙腈或者以上溶剂的混合溶剂)中进行重结晶，以获得
高度纯化的旋光活性盐。另外如需要，可按照常规方法将光学拆分的
盐用酸或碱进行处理，以获得游离形式的化合物。
药物可接受盐包括酸加成盐或碱加成盐。例如，酸加成盐
包括与无机酸所成的盐如盐酸盐、氢溴酸盐、硫酸盐、氢碘酸盐、硝
酸盐和磷酸盐，和与有机酸所成的盐如柠檬酸盐、草酸盐、乙酸盐、
甲酸盐、丙酸盐、苯甲酸盐、三氟乙酸盐、马来酸盐、酒石酸盐、甲
磺酸盐、苯甲磺酸盐和对甲苯磺酸盐。碱加成盐包括与无机碱所成的
盐如钠盐、钾盐、钙盐、镁盐和铵盐，与有机碱所成的盐如三乙基铵
盐、三乙醇铵盐、吡啶鎓盐和二异丙基铵盐，还有与氨基酸如碱性或
酸性氨基酸(包括精氨酸、天冬氨酸和谷氨酸)所成的盐。
另外，本发明包括式(1)所代表的肽化合物或其药物可接
受盐的溶剂合物，包括水合物或乙醇溶剂合物。此外，本发明包括式
(1)所代表的化合物的任何可能立体异构体(包括任何非对映异构体和
对映异构体)以及它们的任何晶形。
在包括将旋光活性α-氨基酸缩合、将各种类型的保护基除去或将
肽从树脂释放的步骤的肽化合物制备过程中，通常会有副产物产生，
包括带有氨基酸缺失的肽，被水解、氧化等降解的肽和具有差向异构
化氨基酸的肽。在实验室规模，可组合使用各种色谱法(例如硅胶柱
色谱、离子交换柱色谱、凝胶过滤或反相色谱)来除去这些杂质，以
获得高度纯化的肽化合物。但是，在工业规模上获得高度纯化的肽化
合物以将它作为药物提供，这是不容易的。
本发明的肽化合物所具有的理化特性能使得可以大规模生产原
料药。具体的说，本发明的肽化合物具有诸如在溶液中溶解度高、稳
定性高或者当被缩合时趋向于不会变成凝胶的特性，这使得高度纯化
的肽化合物可容易地通过用柱色谱法如反向色谱进行纯化甚至大规
模地制备成原料药。
本发明的肽化合物可用作活性成分包含在癌症免疫疗法
用的CTL诱导剂或癌症疫苗中。本发明的肽化合物具有高免疫原性
和高CTL诱导活性，这在本说明书的实施例中证实。被本发明的肽
化合物诱导的CTL出人意料地能识别原先由癌细胞携带的WT1的野
生型肽。因此，本发明的肽化合物可用作药物用于治疗或预防(包括
预防复发)表达WT1基因的癌症，如胃癌、结肠癌、肺癌、乳腺癌、
胚胎癌、皮肤癌、膀胱癌、前列腺癌、子宫癌、宫颈癌和卵巢癌。
(2)本发明的抗体
在第二个方面，本发明涉及能特异性结合式(1)所代表的肽或其药
物可接受盐的抗体(下文可称为“本发明的抗体”)。本发明的抗体并不
限于具体的抗体，可以是用本发明的肽作为免疫原制备的多克隆抗体
或单克隆抗体。
本发明的抗体并不限于具体的抗体，只要它们能特异性结合本发
明的肽化合物即可，具体的实例包括能特异性结合上述式(4)-(9)任一
项所代表的肽的抗体。
制备抗体的方法已经是公知的，本发明的抗体可按照常规
方法(CurrentprotocolsinMolecularBiologyedit(精编现代分子生物学
实验指南).Ausubeletal.(1987)Publish.JohnWileyandSons.Section
11.12-11.13，Antibodies；ALaboratoryManual，Lane，H，D.etal.ed.，
ColdSpringHarberLaboratoryPressPublisher，NewYork1989)来制
备。
具体的说，可这样制备抗体：用本发明的肽化合物(例如
式(4)-(9)任一项所代表的化合物)作为免疫原来免疫非人动物如兔，然
后以常规方式从被免疫动物的血清获得抗体。另一方面，可这样制备
单克隆抗体：用本发明化合物如式(4)-(9)任一项所代表的化合物免疫
非人动物如小鼠，通过细胞融合从获自该动物的脾细胞和骨髓瘤细胞
制备杂交瘤，然后从该杂交瘤获得抗体(CurrentprotocolsinMolecular
Biologyedit(精编现代分子生物学实验指南).Ausubeletal.(1987)
Publish.JohnWileyandSons.Section11.4-11.11)。
抗本发明的肽化合物的抗体可以以用适合于宿主的多种
佐剂使免疫反应得到增强的这样的方式来制备。佐剂的实例包括弗氏
佐剂、矿物凝胶如氢氧化铝、表面活性剂如溶血卵磷脂、复合多元醇、
聚阴离子、肽、油乳液、匙孔血蓝蛋白和二硝基苯酚以及人佐剂如
BCG(卡介苗)和短小棒状杆菌(Corynebacterium-parvum)。
如上所述，能识别本发明化合物的抗体以及能中和该化合
物的活性的抗体，可容易地通过用本发明化合物以常规方式适当免疫
动物来制备。这种抗体可用于亲和色谱、免疫学诊断等。免疫学诊断
可适当地选自免疫印迹分析、放射免疫测定(RIA)、酶联免疫吸附测
定(ELISA)、荧光或发光测定等。免疫学诊断可用于诊断表达WT1基
因的癌症，如胃癌、结肠癌、肺癌、乳腺癌、胚胎癌、皮肤癌、膀胱
癌、前列腺癌、子宫癌、宫颈癌和卵巢癌。
(3)本发明的抗原呈递细胞
在第三个方面，本发明涉及其上呈递本发明化合物和HLA-A24
抗原之间的复合物的抗原呈递细胞。
下文描述的实施例证明本发明化合物的给予能诱导CTL。也就是
说，其上呈递本发明化合物和HLA-A24抗原之间的复合物的抗原呈
递细胞在外周血单核细胞中产生，然后能特异性识别呈递这种复合物
的细胞的CTL得到诱导。其上呈递HLA-A24抗原和本发明化合物之
间的复合物的抗原呈递细胞可用于细胞疗法(DC疗法)中，这在下文
中有描述。
本发明的抗原呈递细胞并不限于具体的细胞，只要它们能
在其表面上呈递本发明化合物和HLA-A24抗原之间的复合物即可。
它们具体地包括例如其上呈递式(4)-(9)任一项所代表的化合物和
HLA-A24抗原之间的复合物的树突细胞的抗原呈递细胞。
用于细胞疗法(DC疗法)的抗原呈递细胞可这样制备：从
癌症患者分离具有抗原呈递能力的细胞，用本发明化合物体外(ex
vivo)脉冲所得的细胞，使得该细胞在其细胞表面上呈递本发明化合物
和HLA-A24抗原之间的复合物。在这个情形中，“具有抗原呈递能力
的细胞”并不限于具体的细胞，只要它是在其表面上表达具有呈递本
发明化合物的能力的HLA-A24抗原的细胞即可，优选的实例是据认
为具有特别高的抗原呈递能力的树突细胞。
本发明的抗原呈递细胞可例如这样制备：从癌症患者分离
具有抗原呈递能力的细胞，用本发明化合物(例如式(4)-(9)任一项的化
合物)体外(exvivo)脉冲该细胞，和制备HLA-A24抗原和本发明化合
物之间的复合物(CancerImmunol.Immunother.，46：82，1998，J.
Immunol.，158：p1796，1997，CancerRes.，59：p1184，1999)。如使用树突
细胞，本发明的抗原呈递细胞可例如这样制备：用Ficoll方法从癌症
患者的外周血分离淋巴细胞，除去非黏附细胞，将黏附细胞在
GM-CSF和IL-4存在下进行温育以诱导树突细胞，并将所得的树突
细胞温育并用本发明化合物脉冲该树突细胞。
如上所述这样制备得到的抗原呈递细胞可用作活性成分包含在
下文所述的细胞疗法(DC疗法)用的CTL诱导剂或癌症疫苗中。
(4)本发明的CTL
本发明的肽化合物衍自人WT1，具有HLA-A24限制性方式的
CTL诱导活性(免疫原性)。在第四个方面，本发明涉及由本发明的肽
化合物诱导的CTL。
下文描述的实施例证明本发明的肽化合物的给予能诱导CTL。也
就是说，其上呈递本发明化合物和HLA-A24抗原之间的复合物的抗
原呈递细胞在外周血单核细胞中产生，然后能特异性识别呈递这种复
合物的细胞的CTL得到诱导。由本发明的肽化合物诱导的CTL可用
于过继免疫治疗，这在下文中有描述。
本发明的CTL并不限于具体的CTL，只要它们是由本发
明的肽化合物诱导即可，特别包括能识别式(4)-(9)任一项所代表的化
合物和HLA-A24抗原之间的复合物的CTL和能识别野生型肽
(WT1235-243：SEQIDNo：1)和HLA-A24抗原之间的复合物的CTL。
用于过继免疫治疗的CTL可例如这样制备：从患者分离
外周淋巴细胞，用本发明化合物(例如式(4)-(9)任一项所代表的化合物)
在体外(invitro)刺激所得的外周淋巴细胞(JoumalofExperimental
Medicine1999，190：1669)。
如上所述制备的本发明CTL可用作活性成分包含在过继免疫治
疗用的癌症疫苗中。
可用作癌症疫苗的药物组合物
以上(1)-(4)所述的本发明化合物、本发明抗原呈递细胞和本发明
CTL可用作活性成分包含在CTL诱导剂即癌症疫苗中，该疫苗配制
成适应于这些各个物质的形式，这在下文中有说明。
1)包含有作为活性成分的本发明化合物或其药物盐的癌
症疫苗
本发明化合物具有CTL诱导活性。由本发明化合物诱导的CTL
能通过它们的细胞毒性活性和淋巴因子的产生来消灭癌症。因此，本
发明化合物可用作活性成分包含在癌症疫苗中用于治疗或预防癌症。
在一个实施方案中，本发明提供包含有本发明化合物作为有效成分的
癌症疫苗(可用作癌症疫苗的药物组合物)。当将本发明的癌症疫苗给
予HLA-A24阳性和WT1阳性的癌症患者时，该化合物(例如式(4)-(9)
任一项所代表的化合物)被呈递在抗原呈递细胞的HLA-A24抗原上，
然后对包含HLA-A24抗原的被呈递复合物具有特异性的CTL得到有
效增殖并消灭癌细胞。这样就实现癌症的治疗或预防。本发明的癌症
疫苗可用来治疗或预防涉及到WT1基因表达水平升高的癌症，包括
血液癌症如白血病、骨髓增生异常综合征、多发性骨髓瘤和恶性淋巴
瘤以及实体癌症如胃癌、结肠癌、肺癌、乳腺癌、胚胎癌、肝癌、皮
肤癌、膀胱癌、前列腺癌、子宫癌、宫颈癌和卵巢癌。
在这点上，作为另一个实施方案，本发明提供治疗或预防癌症的
方法，所述方法包括将有效量的本发明癌症疫苗给予HLA-A24阳性
和WT1阳性的癌症患者。
包含有作为活性成分的本发明化合物的癌症疫苗，可包含
单一癌抗原肽即CTL表位(例如式(4)-(9)任一项所代表的化合物)作为
活性成分，或者包含与另一癌抗原肽(如CTL表位)或辅助表位连接的
表位肽作为活性成分。最近证明，与多个CTL表位(抗原肽)连接的表
位肽具有在体内有效诱导CTL的活性。例如，JournalofImmunology
1998，161：3186-3194描述说，衍自癌抗原蛋白PSA的HLA-A2、-A3、
-A11、B53限制性CTL表位(抗原肽)所线性连接的约30-mer表位肽，
在体内诱导了对相关CTL表位有特异性的CTL。同时还证明，其中
CTL表位和辅助表位线性连接在一起的表位肽有效地诱导了CTL。
当给予这种表位肽形式的本发明肽时，该肽被引入到抗原呈递细胞，
然后经历胞内降解产生出各个能结合HLA抗原而形成复合物的抗原
肽。该复合物在抗原呈递细胞的细胞表面上密实地呈递，然后对该复
合物具有特异性的CTL在体内得到有效增殖并消灭癌细胞。这样就
实现癌症的治疗或预防。
包含有作为活性成分的本发明肽的癌症疫苗，还可与药物
可接受载体如合适的佐剂一起给予，或者以颗粒剂型给予，以有效地
引起细胞免疫。为此目的，文献(Clin.Microbiol.Rev.、7：277-289、1994)
中描述的那些佐剂可适用，具体包括细菌衍生成分，GM-CSF，细胞
因子如白细胞介素-2、白细胞介素-7、白细胞介素-12等，植物衍生
成分，海洋生物衍生成分，矿物凝胶如氢氧化铝，表面活性剂如溶血
卵磷脂和复合多元醇，聚阴离子，肽和油乳液(乳液制剂)。细菌衍生
成分包括脂质A、单磷酰脂质A(为脂质A的衍生物)、灭活细菌(例
如分枝杆菌(Mycobacterium)如BCG)、衍自细菌的蛋白质或多核苷酸、
弗氏不完全佐剂、弗氏完全佐剂、细胞壁成分(例如BCG-CWS)、海
藻糖二霉菌酸酯(TDM)等。
同样还可使用脂质体制剂、其中活性成分与直径几个微米的珠粒
结合的颗粒状制剂或者其中活性成分与脂质连接的制剂。
给药可通过例如皮内、皮下、肌肉内或静脉内注射来实现。
虽然本发明化合物在制剂中的剂量可根据待治疗疾病、患者的年龄和
体重等因素而异，但通常是每隔几天或每隔几个月给予
0.0001mg-1000mg、优选0.001mg-1000mg、更优选0.1mg-10mg的本
发明化合物。
2)包含有作为活性成分的本发明抗原呈递细胞的癌症疫
苗
本发明提供包含有作为活性成分的本发明抗原呈递细胞的癌症
疫苗。
最近，细胞疗法(DC疗法)已有报道，在该疗法中，从癌症患者
的外周血分离淋巴细胞，将从淋巴细胞诱导而成的树突细胞体外用抗
原肽等脉冲以制备抗原呈递细胞，后者然后通过皮下注射等送回患者
体内(CancerImmunol.Immunother.，46：82，1998，J.Immunol.，158：
p1796，1997，CancerRes.，59：p1184，1999，CancerRes.，56：p5672，
1996，J.Immunol.，161：p5607，1998，J.Exp.Med.，184：p465，1996)。因
此，本发明的抗原呈递细胞可在细胞疗法的癌症疫苗中用作活性成
分。
包含有作为活性成分的本发明抗原呈递细胞的癌症疫苗，
优选含有生理盐水、磷酸缓冲盐水(PBS)、介质等，以使抗原呈递细
胞得到稳定保持。它可例如进行静脉内、皮下或皮内给予。剂量的实
例是上述文献中所述的剂量。
通过将癌症疫苗再引入到患者的身体，特异性CTL在HLA-A24
阳性和WT1阳性患者中得到有效诱导，从而实现癌症的治疗或预防。
包含有作为活性成分的本发明抗原呈递细胞的癌症疫苗，可用来治疗
或预防其中WT1基因表达水平升高的癌症，包括血液癌症如白血病、
骨髓增生异常综合征、多发性骨髓瘤和恶性淋巴瘤以及实体癌症如胃
癌、结肠癌、肺癌、乳腺癌、胚胎癌、肝癌、皮肤癌、膀胱癌、前列
腺癌、子宫癌、宫颈癌和卵巢癌。
3)包含有作为活性成分的本发明CTL的癌症疫苗
本发明提供包含有本发明CTL作为有效成分的癌症疫苗(可用作
癌症疫苗的药物组合物)。本发明的CTL可用于过继免疫治疗中，这
在下文有描述。
对于黑素瘤，已观察到过继免疫治疗能实现治疗作用，在该疗法
中，将分离自患者本人的肿瘤浸润性T细胞在体外(exvivo)大量培养，
然后送回患者体内(J.Natl.Cancer.Inst.，86：1159，1994)。同样，在小鼠
黑素瘤中，通过用癌抗原肽TRP-2体外刺激脾细胞，从而使对该癌抗
原肽有特异性的CTL增殖，并将所述CTL给予到移植了黑素瘤的小
鼠中，观察到肿瘤转移得到抑制(J.Exp.Med.，185：453，1997)。这是由
能特异性识别抗原呈递细胞上HLA抗原和癌抗原肽之间的复合物的
CTL的体外增殖所导致的。因此，用本发明化合物体外刺激来自患者
的外周血淋巴细胞以使肿瘤特异性CTL在体外增殖、随后将CTL送
回患者体内这样的治疗癌症的方法，被认为是有用的。因此，本发明
的CTL可用作活性成分包含在用于过继免疫治疗的癌症疫苗中。
包含有作为活性成分的本发明CTL的癌症疫苗，优选含
有生理盐水、磷酸缓冲盐水(PBS)、介质等，以使CTL得到稳定保持。
它可例如进行静脉内、皮下或皮内给予。剂量的实例是上述文献中所
述的剂量。
通过将癌症疫苗再引入到患者的身体，CTL对癌细胞的细胞毒性
作用在HLA-A24阳性和WT1阳性患者中得到增强，并使癌细胞得到
消灭，从而实现癌症的治疗。包含有作为活性成分的本发明CTL的
癌症疫苗，可用于治疗或预防涉及到WT1基因表达水平升高的癌症。
癌症的实例包括血液癌症如白血病、骨髓增生异常综合征、多发性骨
髓瘤和恶性淋巴瘤以及实体癌症症如胃癌、结肠癌、肺癌、乳腺癌、
胚胎癌、肝癌、皮肤癌、膀胱癌、前列腺癌、子宫癌、宫颈癌和卵巢
癌。
本发明将由以下实施例作进一步的说明，但在任何方面都不受这
些实施例的限制。
在以下实施例中，实施例2的化合物、实施例4的化合物和实施
例6的化合物是WT1235-243(SEQIDNo：1)的衍生物，分别对应于
WT1235-243用胱氨酸、谷胱甘肽或硫代乙醇酸修饰而成的衍生物。例
外，实施例1的化合物、实施例3的化合物和实施例5的化合物是
WT1235-243(2M→Y)(SEQIDNo：2)的衍生物，分别对应于WT1235-243
(2M→Y)用胱氨酸、谷胱甘肽或硫代乙醇酸修饰而成的衍生物。
实施例
实施例中所用的缩写如下：
Boc：叔丁氧基羰基
Npys：3-硝基-2-吡啶亚磺酰基
t-Bu：寂丁基
Trt：三苯基甲基
Fmoc：9-芴基甲氧基羰基
DMF：二甲基甲酰胺
HOBT：N-羟基苯并三氮唑
DIPCI：二异丙基碳二亚胺
实施例1
式(4)的肽的合成：
![]()
将下文所述的制备1中制备的肽(1.5g)和Boc-Cys(Npys)-OH
(600mg)在二甲亚砜(20ml)中混合，将混合物在室温下搅拌20分钟。
将乙腈(600ml)加到反应混合物中，将混合物在冰上搅拌，过滤收集
所得沉淀物。将过滤器上的固体用乙腈和二乙醚洗涤，然后减压干燥，
制备出其中Boc-Cys-OH通过二硫键结合的肽(1.65g)。将所得的肽
(0.53g)溶于三氟乙酸(5ml)中，所得溶液在室温下搅拌10分钟。减压
蒸发三氟乙酸后，将残余物溶于乙腈-乙酸-水(10/10/90)的混合溶液
(110ml)中，然后用HPLC进行纯化。
泵：LC-8A型(岛津公司)
柱子：YMCODS-A3cmΦX25cmL、10μm
洗脱液1：H2O/0.1％TFA
洗脱液2：CH3CN/0.1％TFA
流速：20ml/min
检测：UV220nm
将粗肽溶液加到用5％的洗脱液2平衡的柱子上。然后，将5％
的洗脱液2运行10分钟，将15％的洗脱液2运行15分钟，之后以
0.1％/min的速度增加洗脱液2的浓度。收集包含所需产物的流分，减
压蒸发乙腈，然后冻干，制备出所需的肽(300mg)。
·质谱：LC-ESI/MSm/z＝1292[M+1]+(理论值＝1291.5)
实施例2
式(5)的肽的合成：
![]()
所需的肽(104mg)是这样制备：将下文所述的制备2中制备的肽
(500mg)与Boc-Cys(Npys)-OH(200mg)反应，然后在三氟乙酸中除去
Boc基因，按类似于实施例1的方式进行HPLC纯化。
·质谱：LC-ESI/MSm/z＝1260[M+1]+(理论值＝1259.5)
实施例3
式(8)的肽的合成：
![]()
将制备1中制备的肽(240mg)和2，2’-二硫代双(5-硝基吡啶)(60mg)
在二甲亚砜(6ml)中混合，所得混合物在室温下搅拌1小时。向反应
混合物加入还原型谷胱甘肽(120mg)，然后在30℃下搅拌1小时。
再向反应混合物加入还原型谷胱甘肽(60mg)和二甲亚砜(4ml)并搅拌
30分钟后，向反应混合物加入乙腈(200ml)，然后过滤收集所产生的
沉淀物，减压干燥，制备出粗肽(440mg)。将所得的粗肽溶于乙腈-乙
酸-水(10/10/90)的混合物(110ml)中，然后用HPLC进行纯化。
泵：LC-8A型(岛津公司)
柱子：YMCODS-A3cmΦX25cmL，10μm
洗脱液1：H2O/0.1％TFA
洗脱液2：CH3CN/0.1％TFA
流速：20ml/min
检测：UV220nm
将粗肽溶液加到用10％的洗脱液2平衡的柱子上。然后，将10％
的洗脱液2运行10分钟，将17％的洗脱液2运行15分钟，之后以
0.05％/min的速度增加洗脱液2的浓度。收集包含所需产物的流分，
减压蒸发乙腈，然后冻干，制备出所需的肽(107mg)。
·质谱：LC-ESI/MSm/z＝1477[M+1]+(理论值＝1477.5)
实施例4
式(9)的肽的合成：
![]()
将制备2中制备的肽(120mg)和2，2’-二硫代双(5-硝基吡啶)(30mg)
在二甲亚砜(3ml)中混合，所得混合物在室温下搅拌1小时。向反应
混合物加入还原型谷胱甘肽(30mg)，接着在室温下搅拌30分钟，然
后再向反应混合物加入水(1ml)和还原型谷胱甘肽(30mg)，接着搅拌
20分钟。向反应混合物加入乙腈(100ml)后，过滤收集所产生的沉淀
物，减压干燥，制备出粗肽(160mg)。将所得的粗肽溶于乙腈-乙酸-
水(5/5/45)的混合物(55ml)中，然后用HPLC进行纯化。
泵：LC-6A型(岛津公司)
柱子：YMCODS-A2cmΦX25cmL，10μm
洗脱液1：H2O/0.1％TFA
洗脱液2：CH3CN/0.1％TFA
流速：10ml/min
检测：UV220nm
将粗肽溶液加到用10％的洗脱液2平衡的柱子上。然后，将10％
的洗脱液2运行10分钟，将17％的洗脱液2运行15分钟，之后以
0.05％/min的速度增加洗脱液2的浓度。收集包含所需产物的流分，
减压蒸发乙腈，然后冻干，制备出所需的肽(18mg)。
·质谱：LC-ESI/MSm/z＝1445[M+1]+(理论值＝1445.5)
实施例5
式(6)的肽的合成：
![]()
将制备1中制备的肽(240mg)和2，2’-二硫代双(5-硝基吡啶)(60mg)
在二甲亚砜(6ml)中混合，所得混合物在室温下搅拌1小时。向反应
混合物加入硫代乙醇酸钠(100mg)，接着在30℃下搅拌30分钟，然
后再向反应混合物加入硫代乙醇酸钠(50mg)、二甲亚砜(4ml)和水
(2ml)，接着搅拌30分钟。向反应混合物加入乙腈(200ml)后，过滤收
集所产生的沉淀物，减压干燥，制备出粗肽(305mg)。将所得的粗肽
溶于乙腈-乙酸-水(30/30/270)的混合物(330ml)中，接着进行过滤，然
后将所得的滤液用HPLC进行纯化。
泵：LC-8A型(岛津公司)
柱子：YMCODS-A3cmΦX25cmL，10μm
洗脱液1：H2O/0.1％TFA
洗脱液2：CH3CN/0.1％TFA
流速：20ml/min
检测：UV220nm
将粗肽溶液加到用10％的洗脱液2平衡的柱子上。然后，将10％
的洗脱液2运行10分钟，将20％的洗脱液2运行15分钟，将将23％
的洗脱液2运行15分钟，之后以0.05％/min的速度增加洗脱液2的
浓度。收集包含所需产物的流分，减压蒸发乙腈，然后冻干，制备出
所需的肽(15mg)。
·质谱：LC-ESI/MSm/z＝1263[M+1]+(理论值＝1262.5)
实施例6
式(7)的肽的合成：
![]()
将制备2中制备的肽(240mg)和2，2’-二硫代双(5-硝基吡啶)(60mg)
在二甲亚砜(6ml)中混合，所得混合物在室温下搅拌1小时。向反应
混合物加入硫代乙醇酸钠(50mg)，接着在30℃下搅拌30分钟。另
外，在再向反应中加入硫代乙醇酸钠(50mg)并在30℃下搅拌1小时
后，向反应混合物加入乙腈(200ml)。过滤收集所产生的沉淀物，减
压干燥，制备出粗肽(194mg)。将所得的粗肽溶于乙腈-乙酸-水
(10/20/90)的混合物(120ml)中，接着进行过滤，然后将所得的滤液用
HPLC进行纯化。
泵：LC-8A型(岛津公司)
柱子：YMCODS-A3cmΦX25cmL、10μm
洗脱液1：H2O/0.1％TFA
洗脱液2：CH3CN/0.1％TFA
流速：20ml/min
检测：UV220nm
将粗肽溶液加到用10％的洗脱液2平衡的柱子上。然后，将10％
的洗脱液2运行10分钟，将18％的洗脱液2运行15分钟，之后以
0.1％/min的速度增加洗脱液2的浓度。收集包含所需产物的流分，减
压蒸发乙腈，然后冻干，制备出所需的肽(30mg)。
·质谱：LC-ESI/MSm/z＝1230[M+1]+(理论值＝1230.4)
实施例7
式(4)的肽的合成：
1.被保护肽树脂
(Boc-Cys(Boc-Cys-OH)-Tyr(tBu)-Thr(tBu)-Trp(Boc)-Asn(Trt)-Gln(Trt)-
Met-Asn(Trt)-Leu-Alko-树脂)的合成
![]()
将Fmoc-Leu-Alko-树脂(其中Alko为对-烷氧基苄醇)(10g)(0.74
mmol/g，WatanabeChemicalIndustries，Ltd.)装入反应容器(500ml、
TypeACT90固相合成仪、AdvancedChemTech)中，用DMF或类似
溶剂洗涤一次(过程1)。然后用25％哌啶处理树脂(3分钟x1和15
分钟x1)以切割Fmoc基团(过程2)，再用DMF或类似溶剂洗涤(过
程6)以除去哌啶。向反应容器加入Fmoc-Asn(Trt)-OH(13.25g)和
HOBT(1-羟基苯并三氮唑)(3.4g)于NMP(N-甲基吡咯烷酮)(200ml)
中的溶液。加入DIPCI(N，N′-二异丙基碳二亚胺)(3.42ml)后，所得混
合物在室温下搅拌60分钟(过程3)。然后，用NMP洗涤树脂(过程
4)，用Fmoc-Asn(Trt)-OH(13.25g)、HOBT(3.4g)和DIPCI(3.42ml)再
进行偶联反应(过程3)。洗涤树脂(过程6)后，将树脂在25％Ac2O(乙
酸酐)中进行3分钟X1和15分钟X2搅拌，以使未反应的氨基基
团封闭(cap)(过程5)。将树脂洗涤(过程6)，然后脱保护(过程2)，洗
涤(过程6)，以制备H-Asn(Trt)-Leu-Alko-树脂。用Fmoc-Met-OH
(8.25g)、Fmoc-Gln(Trt)-OH(13.56g)、Fmoc-Asn(Trt)-OH(13.25g)、
Fmoc-Trp(Boc)-OH(11.69g)、Fmoc-Thr(tBu)-OH(8.82g)、
Fmoc-Tyr(tBu)-OH(10.2g)和(Boc-Cys-OH)2(19.56g)按类似方式进行
偶联反应，但如果偶联有困难的话要重复进行偶联三次。在位于N
末端的(Boc-Cys-OH)2(N，N′-叔丁氧基羰基胱氨酸)被缩合后，进行洗
涤(过程6)，然后用二乙醚(200ml)洗涤两次，减压干燥，制备出
Boc-Cys(Boc-Cys-OH)-Tyr(tBu)-Thr(tBu)-Trp(Boc)-Asn(Trt)-Gln(Trt)-
Met-Asn(Trt)-Leu-Alko-树脂(式(10)的肽-树脂)(22.87g)。以上合成过
程总结于下表中。
[表1]
![]()
![]()
2.被保护肽树脂的脱保护
将三氟乙酸/乙二醇/H2O/三异丙基甲硅烷(94/2.5/2.5/1)的混合物
(200ml)加到按照上述过程获得的被保护肽树脂
(Boc-Cys(Boc-Cys-OH)-Tyr(tBu)-Thr(tBu)-Trp(Boc)-Asn(Trt)-Gln(Trt)-
Met-Asn(Trt)-Leu-Alko-树脂(22.87g)，所得混合物在室温下搅拌4小
时。反应产物过滤后，将滤液加到二乙醚(400ml)，同时在冰上冷却。
用玻璃过滤器过滤收集所产生的沉淀物，然后用二乙醚洗涤，减压干
燥，制备出粗肽(8.27g)。
3.粗肽的纯化
将所得的粗肽(2.76g)溶于20％乙酸水溶液(1400ml)和乙腈(35ml)
的混合溶液中，过滤除去所产生的不溶性物质。所得的粗肽溶液用反
相液相色谱进行纯化。
泵：LC-8A型(岛津公司)
柱子：YMCODS-A5cmΦX50cmL，15-30μm
洗脱液1：H2O/0.1％TFA
洗脱液2：CH3CN/0.1％TFA
流速：60ml/min
检测：UV280nm
将粗肽溶液加到用10％的洗脱液2平衡的柱子上。然后，将10％
的洗脱液2运行30分钟，之后在120分钟时间里将洗脱液2的浓度
增加到34％。收集包含所需产物的流分，减压蒸发乙腈，然后冻干，
制备出所需的肽：
H-Cys(H-Cys-OH)-Tyr-Thr-Trp-Asn-Gln-Met-Asn-Leu-OH((4)的肽)
(0.91g)。
试验实施例1
(小鼠的免疫(1))
用HLA-A2402/Kb转基因小鼠(参见WO02/47474及下文，该小
鼠可称为HLA-A24小鼠)对实施例1-6制备的每种抗原肽的免疫原性
进行评估。用每种肽免疫三只转基因小鼠，以评估免疫原性。
包含每种合成肽的药物组合物如下制备。将实施例1-3、5、6的
每种合成肽在DMSO中调至40mg/ml。然后，将所得溶液(32.5μl)与
注射用水(540μl)进行混合。然后用玻璃注射器将所得的溶液(550μl)
与弗氏不完全佐剂(700μl)(MontanideISA51)进行混合，制备出油包水
型乳液。将实施例4的肽在DMSO中调至50mg/ml，同时将合成的
辅助肽(FNNFTVSFWLRVPKVSASHLE，SEQIDNo：5)在DMSO中调
至20mg/ml。然后，将30μl的两种肽溶液与注射用水(540μl)混合，然
后与等量的弗氏不完全佐剂(IFA)混合，制备出油包水型乳液。
将所得的制剂(200μl)在尾根处皮内注射到HLA-A2402/Kb转基因
小鼠中进行免疫。实验开始后7-8天，取出脾脏，在载玻片磨砂区域
上磨碎，收集和制备脾细胞。将一部分的用ACK缓冲液(0.15M
NH4Cl、10mMKHCO3、0.1mMEDTA、pH7.2-7.4)进行过溶血处理
的脾细胞用免疫中使用的抗原肽(100μg/ml)脉冲1小时并接种到24-
孔板(7X106个细胞/孔)中。同时，将没有用任何肽脉冲的脾细胞加在
一起(7x105个细胞/孔)，在体外进行刺激，37℃下培养5-6天。体外
刺激是在补充有10％FCS、10mMHEPES、20mML-谷氨酰胺、1mM
丙酮酸钠、1mMMEM非必需氨基酸、1％MEM维生素和55μM2-
巯基乙醇的RPMI-1640培养基中进行。
再刺激开始后5-6天，按照常规方式进行细胞毒性活性试
验。将通过用编码HLA-A2402/Kb的表达载体转化EL-4细胞
(DAINIPPONPHARMACEUTICALCO.、LTD.、目录号06-039)获得
的EL4-A2402/Kb细胞和用抗原肽WT1235-243或WT1235-243(2M→Y)脉
冲的EL4-A2402/Kb细胞用作靶细胞(T)。具体的说，将用WT1235-243
(2M→Y)脉冲的细胞用于对实施例1、3和5的肽的评估，用WT1235-243
脉冲的细胞用于对实施例2、4和6的肽的评估。给这些细胞标记上
51Cr(1.85MBq/106个细胞)，以100μg/ml的速度用肽脉冲1小时(标
记进行2小时，在标记开始1小时后加入肽)。进行51Cr释放测定
(J.Immunol.，159：4753，1997)，以测定体外培养的脾细胞(E)对靶细胞
(T)的细胞毒性活性。在本测定中，E/T比为80。
结果在图1-7中显示。图1-6分别对应于实施例1-6的肽
化合物的细胞毒性活性。在各图中，纵轴显示细胞毒性活性(特异性
裂解)，横轴显示三只小鼠每一只的结果。另外，实施例1的化合物
的剂量依赖关系的结果在图7中显示。在该图中，纵轴显示细胞毒性
活性(特异性裂解)，横轴显示所给予的各个剂量(600μg、200μg、60μg
和20μg)。在该图中，每个剂量使用三只小鼠，显示了细胞毒性活性
的平均值和标准偏差(S.D.)。发现所有的合成肽都具有CTL诱导活性
即免疫原性，这从各图中明显得知。
试验实施例2
(小鼠的免疫(2))
将实施例1的肽在DMSO中调至40mg/ml。然后，将所得溶液
(32.5μl)与注射用水(540μl)进行混合。然后用玻璃注射器将所得的溶
液(550μl)与弗氏不完全佐剂(700μl)(MontanideISA51(注射商标))
(SEPPIC，Inc，法国巴黎)进行混合，制备出油包水型乳液。
将所得的制剂(200μl)在尾根处皮内注射到
HLA-A2402/Kb转基因小鼠中进行免疫。实验开始后7天，去除脾脏，
按常规方式(WO02/47474)制备脾细胞。然后，用小鼠IFNγELISPOT
试剂盒(酶联免疫斑点)(Fujisawa、目录号BD-551083)进行试验。试验
是按照试剂盒附带的说明书进行。将脾细胞以5x105个细胞/孔接种，
将含有实施例1的肽、野生型肽(WT1235-243)或衍自流感病毒的肽
(ASNENMETM，不结合HLA-A24的阴性对照肽)的培养基以10-6M
的初始浓度加入，然后用CO2培养箱在37℃下温育18小时。
按照所附带的说明书，将板洗涤，用KSElispotResearchSystem
(CarlZeiss)检测斑点的数量。已知Elispot方法是细胞毒性活性试验的
另选方法(J.ImmunologicalMethods，1995，181，45-54)。结果在图8中
显示。结果发现，实施例1的肽能诱导HLA-A24特异性细胞介导免
疫，该免疫与野生型肽发生交叉反应。
试验实施例3
(用人PBMC进行试验)
用肝素化真空血液收集管从HLA-A24阳性健康受试者获取外周
血(50ml)。将用PBS(-)稀释两倍的血液覆盖在Ficoll-Paque(Amersham
Biosciences)上(其量为血液量的一半)，然后以2000rpm离心20分钟。
收集含有外周血单核细胞(PBMC)的细胞层，向其中加入3-4倍数量
的PBS(-)，然后以1800rpm离心10分钟。将细胞沉淀用PBS(-)洗涤
两次，收集PMBC。
将PMBC悬浮于培养淋巴细胞用的培养基(RPMI1640∶
AIMV＝1∶1，NEAA，10％FCS)中，在培养瓶中培养两小时，收集非黏
附细胞。使用CD8+T细胞分离试剂盒II(MiltenyiBiotec)，在非黏附
细胞当中收集CD8阳性T细胞。将黏附细胞在含有GM-CSF
(1000U/ml)和IL-4(1000U/ml)的培养淋巴细胞用的培养基中培养7
天。收集漂浮的细胞，作为含有树突细胞(DC)的抗原呈递细胞级分。
将收集的细胞冷冻保藏，以备实验使用。
通过将细胞与肽在含有丝裂霉素(50μg/ml)的AIM-V培养
基中温育1小时，将如上制备的DC级分用实施例1的肽(50μg/ml)
脉冲。在用培养基洗涤三次后，再加入实施例1的肽(50μg/ml)脉冲1
小时，制备出抗原呈递细胞。在第0天，将用肽脉冲的抗原呈递细胞
加到CD8阳性T细胞以进行第一次刺激，用24孔板在含有IL-7
(10ng/ml)的淋巴细胞培养用的培养基中开始细胞培养。在第7天，收
集T细胞，洗涤后，按与第一次刺激相似的方式用肽脉冲的抗原呈递
细胞进行肽刺激。在下一天(第8天)，加入IL-2，使得浓度为50U/ml。
在第14天，收集T细胞，按与第一次或第二次刺激相似的方式进行
第三次刺激。在下一天(第15天)，加入IL-2，使得浓度为50U/ml。
在第21天，收集T细胞，冷冻保藏。
将第21天的T细胞的1X105个细胞加到用或没用每种肽(野生型
肽(WT1235-243)、修饰肽(WT1235-243(2M→Y))或实施例1的肽)脉冲的
VA13/A2402细胞的表达HLA-A2402的2X104个细胞，18小时后，
收集上清液，用ELISA测定IFN-γ的量。
用实施例1的合成肽刺激的T细胞的肽特异性反应性的
结果在图9中显示。用实施例1的合成肽刺激的T细胞不与没有用肽
脉冲的细胞反应，但它们与用实施例1的肽脉冲的细胞充分反应。因
此发现，对肽有特异性的T细胞得到诱导。另外，被诱导的对肽有特
异性的T细胞既与用野生型肽(WT1235-243)脉冲的细胞反应，也与用修
饰肽(WT1235-243(2M→Y))脉冲的细胞反应。
制备1
1.被保护肽树脂
(H-Cys(Trt)-Tyr(tBu)-Thr(tBu)-Trp(Boc)-Asn(Trt)-Gln(Trt)-Met-Asn(Trt
)-Leu-Alko-树脂)的合成
将Fmoc-Leu-Alko-树脂(其中Alko为对-烷氧基苄醇)(10g)(0.82
mmol/g，WatanabeChemicalIndustries，Ltd.)装入反应容器(500ml，
TypeACT90固相合成仪，AdvancedChemTech)中，用DMF或类似溶
剂洗涤一次(过程1)。然后用25％哌啶处理树脂(3分钟x1和15分钟
x1)以切割Fmoc基团(过程2)，再用DMF或类似溶剂洗涤(过程1)
以除去哌啶。向反应容器加入Fmoc-Asn(Trt)-OH(24.46g)和HOBT
(1-羟基苯并三氮唑)(6.28g)于NMP(N-甲基吡咯烷酮)中的溶液(200
ml)。加入DIPCI(N，N′-二异丙基碳二亚胺)(6.3ml)后，所得混合物在
室温下搅拌30分钟(过程3)。30分钟后，用NMP洗涤树脂(过程4)，
用Fmoc-Asn(Trt)-OH(24.46g)、HOBT(6.28g)和DIPCI(6.3ml)再次
进行偶联反应(过程5)，以合成Fmoc-Asn(Trt)-Leu-Alko-树脂。然后
将所得的树脂通过过程2的脱保护转化成H-Asn(Trt)-Leu-Alko-树脂。
洗涤(过程1)后，依次加入Fmoc-Met-OH15.23g、Fmoc-Gln(Trt)-OH
25.04g、Fmoc-Asn(Trt)-OH24.46g、Fmoc-Trp(Boc)-OH21.59g、
Fmoc-Thr(tBu)-OH16.3g、Fmoc-Tyr(tBu)-OH18.84g和
Fmoc-Cys(Trt)-OH24.01g，进行偶联反应(过程3)。在使用
Fmoc-Thr(tBu)-OH进行的偶联反应中，反应重复三次，所得的树脂
用DMF洗涤，用25％AC2O(乙酸酐)处理(15分钟x2)，将未反应的
氨基基团封闭。在N末端Fmoc-Cys(Trt)-OH缩合后，进行脱保护(过
程2)和洗涤(过程6)，获得
H-Cys(Trt)-Tyr(tBu)-Thr(tBu)-Trp(Boc)-Asn(Trt)-Gln(Trt)-Met-Asn(Trt)
-Leu-Alko-树脂。以上合成过程总结于下表中。
[表2]
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2.被保护肽树脂的脱保护
将三氟乙酸/乙二醇/H2O/三异丙基甲硅烷(94/2.5/2.5/1)的混合溶
液(100ml)加到如上制备的被保护肽树脂
(H-Cys(Trt)-Tyr(tBu)-Thr(tBu)-Trp(Boc)-Asn(Trt)-Gln(Trt)-Met-Asn(Trt
)-Leu-Alko-树脂)(10.0g)，所得混合物在室温下搅拌4小时。将反应
混合物加到叔-丁基甲基醚(625ml)，同时在冰上进行冷却，将所得的
混合物搅拌15分钟，然后用玻璃过滤器过滤，获得不溶性物质。将
过滤器上的残余物用叔-丁基甲基醚(约100ml)洗涤五次后，将过滤器
上的残余物用6M盐酸胍水溶液(1L)萃取，制备出粗肽溶液。
3.粗肽的纯化
所得的粗肽溶液用反相液相色谱进行纯化。
泵：LC-8A型(岛津公司)
柱子：YMCODS-A5cmΦX50cmL，15-30μm
洗脱液1：H2O/0.1％TFA
洗脱液2：CH3CN/0.1％TFA
流速：60ml/min
检测：UV220nm
将粗肽溶液加到用10％的洗脱液2平衡的柱子上，在50℃水浴
中保持。
在10％的洗脱液2运行了30分钟后，将洗脱液2的浓度在40
分钟时间里增加到20％，然后在360分钟时间里再增加到40％。
收集包含所需产物的流分，减压蒸发乙腈，然后冻干，制备出所
需的肽H-Cys-Tyr-Thr-Trp-Asn-Gln-Met-Asn-Leu-OH(SEQIDNo：2)
(1.50g)。
氨基酸分析
水解：1％苯酚/6N盐酸水溶液，110℃，10小时
分析方法：茚三酮方法
Asx：1.96(2)Thr：1.05(1)Glx：1.06(1)Met：1.05(1)*Leu：(1)
Tyr：0.87(1)
*)Leu＝标准氨基酸理论值在()中显示。
·质谱分析：LC-ESI/MSm/z＝1173[M+1]+(理论值＝1172.5)
氨基酸序列分析：对从N末端位置2处的Tyr到C末端处Leu
的氨基酸残基进行了序列上的确认。
制备2
1.被保护肽树脂
(H-Cys(Trt)-Met-Thr(tBu)-Trp(Boc)-Asn(Trt)-Gln(Trt)-Met-Asn(Trt)-Le
u-Alko-树脂)的合成
将Fmoc-Leu-Alko-树脂(其中Alko为对-烷氧基苄醇)(10g)(0.81
mmol/g，WatanabeChemicalIndustries，Ltd.)装入反应容器(500ml，
TypeACT90固相合成仪，AdvancedChemTech)中，用DMF或类似溶
剂洗涤一次(过程1)。然后用25％哌啶处理树脂(3分钟x1和15分钟
x1)以切割Fmoc基团(过程2)，再用DMF或类似溶剂洗涤(过程1)
以除去哌啶。向反应容器加入Fmoc-Asn(Trt)-OH(24.17g)和HOBT
(1-羟基苯并三氮唑)(6.2g)于NMP(N-甲基吡咯烷酮)(200ml)中的溶
液。加入DIPCI(N，N′-二异丙基碳二亚胺)(6.2ml)后，所得混合物在
室温下搅拌30分钟(过程3)。30分钟后，用NMP洗涤树脂(过程4)，
用Fmoc-Asn(Trt)-OH(24.17g)、HOBT(6.2g)和DIPCI(6.2ml)再次进
行偶联反应(过程5)，以合成Fmoc-Asn(Trt)-Leu-Alko-树脂。然后将
所得的树脂通过过程2的脱保护转化成H-Asn(Trt)-Leu-Alko-树脂。
洗涤(过程1)后，依次加入Fmoc-Met-OH15.05g、Fmoc-Gln(Trt)-OH
24.73g、Fmoc-Asn(Trt)-OH24.17g、Fmoc-Trp(Boc)-OH21.33g、
Fmoc-Thr(tBu)-OH16.1g、Fmoc-Met-OH15.05g和Fmoc-Cys(Trt)-OH
23.72g，进行偶联反应(过程3)。在使用Fmoc-Thr(tBu)-OH进行的偶
联反应中，反应重复三次，所得的树脂用DMF洗涤，用25％AC2O(乙
酸酐)处理(15分钟x2)，将未反应的氨基基团封闭。在N末端
Fmoc-Cys(Trt)-OH缩合后，进行脱保护(过程2)和洗涤(过程6)，获得
H-Cys(Trt)-Met-Thr(tBu)-Trp(Boc)-Asn(Trt)-Gln(Trt)-Met-Asn(Trt)-Leu
-Alko-树脂。以上合成过程与制备1的表中所述的相同。
2.被保护肽树脂的脱保护
将三氟乙酸/乙二醇/H2O/三异丙基甲硅烷(94/2.5/2.5/1)的混合物
(130ml)加到如上制备的被保护肽树脂
(H-Cys(Trt)-Met-Thr(tBu)-Trp(Boc)-Asn(Trt)-Gln(Trt)-Met-Asn(Trt)-Le
u-Alko-树脂)(13.0g)，所得混合物在室温下搅拌4小时。将反应混合
物加到二乙醚(800ml)，同时在冰上进行冷却，将所得的混合物搅拌
15分钟，然后用玻璃过滤器过滤，获得不溶性物质。将过滤器上的
残余物用二乙醚(约100ml)洗涤五次后，将过滤器上的残余物用6M
盐酸胍水溶液(1.3L)萃取，制备出粗肽溶液。
3.粗肽的纯化
所得的粗肽溶液用反相液相色谱进行纯化。
泵：LC-8A型(岛津公司)
柱子：YMCODS-A5cmΦX50cmL，15-30μm
洗脱液1：H2O/0.1％TFA
洗脱液2：CH3CN/0.1％TFA
流速：60ml/min
检测：UV220nm
将粗肽溶液加到用10％的洗脱液2平衡的柱子上，在50℃水浴
中保持。在10％的洗脱液2运行了30分钟后，将洗脱液2的浓度在
40分钟时间里增加到20％，然后在360分钟时间里再增加到40％。
收集包含所需产物的流分，减压蒸发乙腈，然后冻干，制备出所需的
肽H-Cys-Met-Thr-Trp-Asn-Gln-Met-Asn-Leu-OH(SEQIDNo：1)
(2.32g)。
氨基酸分析
水解4N甲磺酸，110℃，17小时
分析方法：茚三酮方法
Asx：1.87(2)Thr：0.93(1)Glx：0.95(1)Met：1.72(2)*Leu：(1)
Trp：0.80(1)
*)Leu＝标准氨基酸理论值在()中显示。
质谱分析：LC-ESI/MSm/z＝1141[M+1]+(理论值＝1140.5)
氨基酸序列分析：对从N末端位置2处的Met到C末端处Leu
的氨基酸残基进行了序列上的确认。
产业适用性
本发明的肽化合物可用作活性成分包含在癌症免疫疗法用的药
物中。
序列表自由正文
SEQIDNo.1：肽衍生物
SEQIDNo.2：肽衍生物
SEQIDNo.3：肽衍生物
SEQIDNo.4：肽衍生物
SEQIDNo.5：辅助合成肽。
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