一种比酶活提高的碱性果胶酶突变体技术领域
本发明涉及一种比酶活提高的碱性果胶酶突变体，属于酶工程领域。
背景技术
果胶酶是一种复合酶，能够将果胶聚合物分解成不饱和寡聚半乳糖醛酸。该酶分布广泛，
在部分寄生线虫、植物和微生物内都有发现。果胶酶应用广泛，已有40多年的工业应用史。
根据最适反应pH的不同将果胶酶分为酸性果胶酶和碱性果胶酶PGL。其中酸性果胶酶主要
应用于澄清果汁果酒，提取果蔬汁，果实脱皮等方面。PGL应用主要应用于纺织、食品、造
纸行业和环境领域。应用酶法作用上述领域相关反应具有环保、节约原料耗材和反应条件温
和等优点。然而目前对PGL进行分子改造研究较少，进行商品化的PGL也很少。
目前对碱性果胶酶研究比较深入的菌株主要是毕赤酵母、枯草芽孢杆菌和大肠杆菌。综
合比较可表达碱性果胶酶的不同宿主，毕赤酵母虽然表达蛋白易于纯化，产量高，但发酵周
期长、过程复杂、低温诱导耗能高；枯草芽孢杆菌不易表达或表达酶活低等缺点。
发明内容
为了解决上述问题，本发明以前期研究的在PGL蛋白N端以PT-Linker连接一段正负电
荷交替(亲疏水性交替)的双亲短肽(AEAEAKAKAEAEAKAK，即SEQIDNO.3)，简称
PGL-S1，为出发序列，对其进行进一步分子改造，将其中的双亲短肽S1的重复单元进行有
序截短，截短至S1-1(AEAEAKAK，即SEQIDNO.4)，比酶活提高5.7倍。
本发明提供了一种比酶活提高的碱性果胶酶突变体，其氨基酸序列是SEQIDNO.1所示
的序列，突变体简称PGL-S1-1。
在本发明的一种实施方式中，所述突变体的核苷酸序列是SEQIDNO.2所示的序列。
在本发明的一种实施方式中，所述突变体是将原有融合蛋白的短肽序列进行优化改造。
在本发明的一种实施方式中，所述突变体是原有融合双亲短肽的碱性果胶酶的双亲短肽
进行有序截短。
本发明还提供一种表达所述突变体的基因工程菌。
在本发明的一种实施方式中，所述基于工程菌为大肠杆菌。
在本发明的一种实施方式中，所述基因工程菌以大肠杆菌为宿主、pET-22b(+)为载体，
表达碱性果胶酶突变体。
本发明还要求保护编码所述突变体的核苷酸序列，以及所述突变体和基因工程菌在食品、
纺织或造纸方面的应用。
有益效果：相对于现有的突变体PGL-S1而言，本发明的突变体PGL-S1-1的比酶活提高
了5.7倍，而且热稳定性没有受到影响，在60℃的半衰期及Tm值没有改变。本发明的碱性
果胶酶可在碱性条件下催化通过反式消去作用聚半乳糖醛酸的α-1,4糖苷键裂解，广泛应用于
食品、纺织和造纸等行业。
具体实施方式：
培养基：
种子培养基：胰蛋白胨10g/L、酵母粉5g/L、NaCl10g/L，葡萄糖2g/L。
发酵培养基：蛋白胨12g/L、酵母粉24g/L、甘油10g/L、KH2PO42.32g/L、K2HPO416.43g/L。
碱性果胶酶酶活测定：
采用分光光度法测定。单位酶活定义：单位时间裂解聚半乳糖醛酸产生1μmol的不饱和
聚半乳糖醛酸所用的酶量。酶活测定条件为：酶活力检测：发酵液8000rpm离心10min，胞
外PGL即包含于发酵上清液之中，取一定量做检测。PGL反应体系：含0.2％聚半乳糖醛酸
(底物)的甘氨酸-NaOH缓冲液(0.2mol·L-1，0.44mmol·L-1的CaCl2，pH9.4)2mL，待测
样品20μL，无活性的酶液为空白对照。PGL反应条件为：将反应体系置于45℃下水浴15min，
用3mL磷酸溶液(0.03mol·L-1)终止反应，在235nm处测定吸光度值。
实施例1：突变菌株的获得
采用PCR扩增或者化学合成的方法，得到氨基酸序列如SEQIDNO.1所示的碱性果胶酶
基因，然后将基因连接到pET-22b(+)，再转化到大肠杆菌E.coliBL21(DE3)中，筛选，正确
的转化子命名为重组菌E.coliBL21(DE3)(pET-22b(+)/PGL-S1-1)。
实施例2：突变株的验证
种子培养：将重组菌E.coliBL21(DE3)(pET-22b(+)/PGL-S1-1)从甘油管中取适量接种于
LB培养基中(100μg·mL-1氨苄青霉素，2％葡萄糖)，装液量为20mL/250mL。37℃，200r·min-1
摇床上振荡培养10h。
摇瓶发酵：将培养10h的种子液以3％(V/V)的接种量接入发酵培养基TB(100μg·mL-1
氨苄青霉素)中，装液量为20mL/250mL，37℃，200r·min-1培养至菌体浓度OD600＝0.6，
加入终浓度0.04mMIPTG进行诱导，30℃下诱导48h。
实施例3：碱性果胶酶的纯化
将重组菌发酵液8000r/min离心20min，取上清液，加硫酸铵进行梯度盐析，低温离心
收集30～50％硫酸铵沉淀部分，将盐析沉淀的酶溶解在甘氨酸-氢氧化钠缓冲溶液(pH7.5)中，
用20mmol/L甘氨酸-氢氧化钠缓冲溶液透析处理24h。离心所得上清液经阳离子交换层析进
行进一步分离纯化。
实施例4：碱性果胶酶纯酶液比酶活及半衰期测定
将纯化后的碱性果胶酶稀释，按照上述方法测定酶活，用BSA蛋白浓度测定试剂盒测定
蛋白浓度，出发PGL-S1比酶活为458.52±22.9U/mg，而突变体PGL-S1-1比酶活高达
2621.16±30U/mg。
此外，本发明还比较了将PGL-S1中双亲短肽进行不同程度截短得到的突变体的比酶活，
结果显示，与PGL-S1-1相比，截短4个氨基酸，即短肽变为(AEAEAKAKAEAE或
AKAKAEAEAKAK)时，比酶活几乎没有变化；短肽截短只剩下4个氨基酸(即AEAE、AKAK
或AEAK)时，比酶活下降至没有连接短肽的最原始的碱性果胶酶比酶活。
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