技术领域
本发明公开的内容涉及从虎杖提取物的系统分提（systematic fractionation）中获得的部位（fractions），可将所述部位应用于预防和治 疗肥胖症的药物组合物和功能食品。
背景技术
肥胖症是一种由于能量摄取高于能量消耗，而使多余能量以脂肪在 生物体内积累的病症。根据2005年韩国国家健康和营养研究调查，在年 龄为20岁以上的韩国成年人中，肥胖症的患病率为31.8%；在过去10 年中，肥胖症的患病率由1995年的14.8%增加了两倍多（健康福利部， 2006年，第三次韩国国家健康和营养研究调查）。由于这一增高趋势，由 肥胖症所引起的社会经济损失从2001年的17,000亿韩元起逐年增高； 在健康规划中，韩国政府已经设定了到2010年维持成年人肥胖症的患病 率在30%左右的主要目标（健康福利部，2005年，健康规划，第61-64 页）。由于肥胖症不仅具有其自身的问题，它还可引起比如心血管疾病、 糖尿病、呼吸系统疾病或骨关节炎等疾病；全世界已在肥胖症上集中了 大量的关注（Antipatis V.J.等,2001,Obesity as a global problem.In International textbook of obesity.Per Bjorntorp,ed.John Wiley&Sons Ltd, 奇切斯特,英国,第3-22页），世界卫生组织将肥胖症作为全球营养问题 来处理，并认为它是应得到治疗的疾病而非损害健康的简单危险因素 （World Health.1998.Obesity:Preventing and managing the global epidemic.Report of WHO Consultation on Obesity,日内瓦）。肥胖症由多 余的能量摄取、缺乏体育活动以及神经系统中的分泌因子、药物、遗传 因子等的组合引起，利用饮食、体育锻炼、行为矫正疗法、药物治疗等 来缓解肥胖症。
最近，已经对肥胖症治疗剂的开发进行了大量研究，这类研究之一 是关于胰脂肪酶抑制剂。胰脂肪酶是将甘油三酯降解成2-单酰基甘油和 脂肪酸的关键酶（Bitou N.等,1999,Lipid 34:441-445），目前已知的代表 性胰脂肪酶抑制剂为四氢利普司他汀（奥利司他，一种来自毒三素链霉 菌（Streptomyces toxitricini）的利普司他汀衍生物）。奥利司他（赛尼可） 现在可作为药物商购得到，已知其是最有效的胰脂肪酶抑制剂之一，足 以阻止约30%的膳食脂肪的吸收（Drent M.等,1995,Int.J.Obesity.19: 221-226）。尽管如此，已知奥利司他具有副作用，比如胃肠问题、超敏 反应、胆汁障碍、对脂溶性维生素吸收的抑制等（Peter C.等,2001,Br.J. Clin.Pharmacol.51:135-141）。根据减肥治疗的FDA准则，长期使用的 抗肥胖药物应产生体重比给药前减轻5%的效力，并且该减肥作用应保持 至少12个月。然而，相比于仅给予膳食，在长期给予奥利司他两年后， 体重仅减轻3-5%，并显示出抑制脂溶性维生素A、D和E吸收的副作用。 奥利司他在1998年投放市场，在2001年的销售额为900,006,300美元， 但自此发生减缓，这是由于这类副作用且效力差。因此，最近在开发来 自食物和天然产物的、无副作用的胰脂肪酶抑制剂方面进行了研究 （Yamamoto M.等,2000,Int.J.Obesity.24:758-764）。
根据其作用机制（即：参与抑制食欲；抑制脂肪消化和吸收；诱发 热量生成和抑制脂肪积累；以及调节脂类代谢），将使用天然产物开发的 抗肥胖物质划分成不同种类。参与抑制食欲的抗肥胖物质的实例包括羟 基柠檬酸（HCA）、Olibra、膳食纤维（如菊苣和菊粉）。抑制脂肪消化和 吸收的抗肥胖物质的实例包括壳聚糖、类黄酮等。诱发热量生成和抑制 脂肪积累的抗肥胖物质的实例包括辣椒中的辣椒素、绿茶中的儿茶素、 维甲酸等。L-肉碱、缀合的亚油酸（CLA）、乳汁中的钙和相关的蛋白质 被报道为用于调节脂类代谢的抗肥胖物质的实例。作用于体重控制的药 草的实例包括枳、襄荷、决明、绿茶、松针、槐属、蛇床属、吴茱萸属 等（Kim M.H.,2004,Korean J.Heath Psychol.9:493-509;Reddy P.等, 1998,Formulary 33:943-959;Burns A.A.等,2002,Eur.J.Clin.Nutr.56: 368-377;Delzenne N.M.等,2005,Br.J.Nutr.1:157-161;Zacour A.C.等, 1992,J.Nutr.Sci.Vitamilol.38:609-613;Griffiths D.W.等,1986,Adv.Exp. Med.Biol.1999:509-516）。消费者对由天然物质制成的治疗剂（几乎没 有副作用，但具有出色的药物效力）有巨大的兴趣，因此，为满足需求， 需要开发安全且高效的天然药品。
同时，虎杖（Polygonum cuspidatum Sieb.et Zucc.=Reynotria japonica Houtt.）为蓼科家族的成员，为多年生草本植物，具有厚的根茎（rhizome） 和高约1.5m的茎（stems）。叶互生，卵圆形，约6-12cm长，指向顶端， 叶子长在长叶柄上。花为雌雄异株，在6月到8月间开花。果实为瘦果， 三角卵圆形，并具有暗褐色光泽。虎杖生长于遍及韩国的山谷中，并分 布在日本、中国和台湾（Bae Gihwan,Medicinal plants of Korea,Kyohak Publishing有限公司,2003,第89页）。虎杖的根茎和根被称作虎杖或虎 杖根（Polygoni Rhizoma=Reynoutriae Rhizoma），包含于本草纲目的草部 的中品中。在韩国民间医药中，已将虎杖用作姑息剂（palliative）和利 尿剂，并将之用于脓皮炎、膀胱炎、癌症等的治疗中。在中药中，已将 虎杖用于祛风湿、化瘀、治疗痛经、镇咳和解痉（Yuk Changsu,Illustrated Guide to Asian Herbal Medicine,Kyungwon Publishing有限公司,1997,第 140页;Ji Okpyo,1975,Korean Journal of Pharmacognosy,6:1-4）。已报道 的其医疗行为包括抑制脂类代谢（Masaki H.等,1995,Biol.Pharm.Bull. 18:162-166,1995）、抑制蛋白酪氨酸激酶（Jayatilake G.S.等,1993,J.Nat. Prod.56:1805-1810）、抑制致突变性（Su等,1995,Mutat.Res.329: 205-212）等。已知其主要组分为二苯乙烯、蒽醌及其苷，包括虎杖苷、 白藜芦醇、大黄素、大黄素甲醚和大黄根酸（Pan等，2000，Zhong Yao Cai， 23:56-58；Zhang，1999，Tianjin Yi Yao，11:13-14）。然而，到目前为止， 还没有对其部位进行过研究，也没有关于这些部位在治疗和预防肥胖症 中有效的报道。
因此，本发明人尝试使用天然药物来开发治疗和预防肥胖症的药剂， 发现虎杖提取物的部位在抑制胰脂肪酶活性和脂肪吸收方面有效，从而 完成了本发明。
发明内容
技术问题
本发明的一个目的是提供预防或治疗肥胖症的药物组合物，所述药 物组合物在如下方面发挥效力：抑制胰脂肪酶（参与多余能量摄取的重 要酶）的活性、尤其是抑制脂肪吸收（造成肥胖的主要原因之一）；使用 脂质乳剂（lipid emulsion）抑制短期脂肪吸收；以及抑制体重增加和降 低高脂肪膳食诱发的肥胖症中的体重。
本发明的另一目的是提供预防和治疗高脂血症或代谢疾病的药物组 合物和功能食品。
本发明的又一目的是提供预防或治疗肥胖症的方法。
本发明的又一目的是提供虎杖提取物的丁醇部位或乙酸乙酯部位在 制备预防或治疗肥胖症的组合物方面的用途。
技术方案
为实现本发明的目的，本发明提供了治疗和预防肥胖症的组合物， 该组合物包含乙酸乙酯部位或丁醇部位作为活性成分，其中，所述乙酸 乙酯部位或丁醇部位通过用己烷、乙酸乙酯和丁醇对虎杖提取物进行逐 步分提得到，其中虎杖提取物通过用醇、水或其混合物进行提取得到。
本发明还提供了使用该部位预防和治疗肥胖症的方法。
此外，本发明提供了预防和缓解肥胖症的健康功能食品，该健康功 能食品包含该部位作为活性成分。
有益效果
虎杖部位是天然提取物，因此，比用于肥胖症的传统药物毒性更低 且更安全。此外，相比于虎杖提取物或从虎杖提取的化合物（白藜芦醇）， 虎杖部位的胰脂肪酶活性非常有效；并且，虎杖部位对短期脂肪吸收的 抑制作用、对体重增加的抑制作用和降低体重的作用比起虎杖提取物或 白藜芦醇更加出色。因此，可将虎杖部位用于预防和治疗肥胖症的药物 组合物以及缓解肥胖症的健康功能食品。
附图说明
图1显示出虎杖的提取和系统分提。
图2显示出虎杖丁醇部位对肥胖症的预防作用：
NOR：对照；HFD：高脂肪膳食；Xen：赛尼可（阳性对照）；POCU： 虎杖丁醇部位。
图3显示出检验虎杖丁醇部位对肥胖症的预防作用的体重增加量。
图4显示出虎杖丁醇部位对皮下脂肪增加的预防作用：
NOR：对照；HFD：高脂肪膳食；Xen：赛尼可（阳性对照）；POCU： 虎杖丁醇部位。
图5显示出虎杖丁醇部位对性腺脂肪增加的预防作用。
图6显示出虎杖丁醇部位对肾周脂肪增加的预防作用。
图7和图8为示出在虎杖丁醇部位治疗后脂肪细胞尺寸变化（用于 观察对肥胖症的预防作用）的照片和图。
图9-图13显示出脂肪和脂质的变化：
图9：总胆固醇；图10：甘油三酯；图11：游离脂肪酸；图12：高 密度脂蛋白（HDL）；图13：低密度脂蛋白（LDL）。
图14显示出在虎杖丁醇部位给予组中的脂肪肝预防作用。
图15显示出在虎杖丁醇部位给予组中，肝中甘油三酯量增高的预防 作用。
图16显示出在虎杖丁醇部位给予组中，与脂肪肝预防作用有关的 H&E染色的结果。
图17显示出在虎杖丁醇部位给予组中，血清胰岛素抵抗（insulin resistance）的预防作用。
图18显示出在虎杖丁醇部位给予组中，胰腺β细胞破裂（disruption） 的预防作用。
图19显示出在虎杖丁醇部位给予组中，脂肪生成（lipogenesis）标 记物aP2 mRNA升高的预防作用。
图20显示出在极其肥胖的大鼠中的体重降低作用，用于检验在虎杖 丁醇部位给予组中对肥胖症的治疗作用。
图21-图24显示出在极其肥的胖大鼠体内，使来自各躯体部分的脂 肪重量降低的作用，用于检验在虎杖丁醇部位给予组中对肥胖症的治疗 作用。
图21：褐色脂肪；图22：生殖器脂肪；图23：肾周脂肪；图24： 皮下脂肪。
图25和图26为示出虎杖丁醇部位对脂肪细胞尺寸变化的作用的照 片和图。
图27-图30显示出在虎杖丁醇部位给予组中脂肪和脂质的变化：
图27：总胆固醇；图28：甘油三酯；图29：HDL；图30：LDL。
图31显示出在虎杖丁醇部位给予组中的脂肪肝治疗作用。
图32显示出在虎杖丁醇部位给予组中肝重量的变化。
图33显示出在虎杖丁醇部位给予组中肝组织的H&E染色结果。
图34显示出在虎杖丁醇部位给予组中，肝中甘油三酯量的变化。
图35和图36显示出在虎杖丁醇部位给予组中，血清IL-6和血清 TNF-α的浓度。
图37和图38显示出在虎杖丁醇部位给予组中，脂肪组织中的TNF-α 和IL-6的浓度。
图39-图42显示出在虎杖丁醇部位给予组中的血糖、血清胰岛素、 HbA1c和胰岛素敏感性。
图44显示出在虎杖丁醇部位给予组中胰腺β细胞的变化。
图45显示出经虎杖丁醇部位处理的SOCS蛋白的Western印迹分析。
图46显示出经虎杖丁醇部位处理的NF-κB DNA结合活性分析。
图47显示出在虎杖丁醇部位给予组中血清脂联素（adiponectin）浓 度的变化。
图48显示出在虎杖丁醇部位给予组中血清瘦素（leptin）浓度的变 化。
图49-图51显示出在虎杖丁醇部位给予组中，肝组织中的AMPK蛋 白表达的变化。
图52显示出在虎杖丁醇部位给予组中，肝组织中的ACC蛋白表达 的变化。
图53显示出在虎杖丁醇部位给予组中，肝组织中的FAS mRNA表 达的变化。
图54显示出在虎杖丁醇部位给予组中，肝组织中的CPT-1活性的变 化。
具体实施方式
为实现本发明的目的，本发明提供了预防和治疗肥胖症的药物组合 物，所述药物组合物包含部位作为活性成分，其中，所述部位通过如下 步骤制备：用水、醇或其混合溶剂对虎杖进行提取，得到虎杖提取物； 进一步用丁醇对所述虎杖提取物进行萃取。
本发明还提供了预防和缓解肥胖症、高脂血症和代谢疾病的功能食 品，所述功能食品包含部位作为活性成分，其中，所述部位通过如下步 骤制备：用水、醇或其混合溶剂对虎杖进行提取，得到虎杖提取物；进 一步用丁醇对所述虎杖提取物进行萃取。
此外，本发明提供了预防和治疗肥胖症的药物组合物，所述药物组 合物包含部位作为活性成分，其中，所述部位通过如下步骤制备：用水、 醇或其混合溶剂对虎杖进行提取，得到虎杖提取物；进一步用乙酸乙酯 对所述虎杖提取物进行萃取。
本发明还提供了预防和缓解肥胖症的功能食品，所述功能食品包含 部位作为活性成分，其中，所述部位通过如下步骤制备：用水、醇或其 混合溶剂对虎杖进行提取，得到虎杖提取物；进一步用乙酸乙酯对所述 虎杖提取物进行萃取。
此外，本发明提供了治疗肥胖症的方法，所述方法包括向肥胖个体 给予药学上有效量的虎杖丁醇部位。
本发明还提供了预防肥胖症的方法，所述方法包括向肥胖个体给予 药学上有效量的虎杖丁醇部位。
在下文中，将对本发明进行详细描述。
本发明提供了预防和治疗肥胖症、高脂血症和代谢疾病的药物组合 物，所述药物组合物包含部位作为活性成分，其中，所述部位通过如下 步骤制备：用水、醇或其混合溶剂对虎杖进行提取，得到虎杖提取物； 进一步用丁醇或乙酸乙酯对虎杖提取物进行萃取。
本发明人研究了虎杖提取物、虎杖部位和从中萃取的单一化合物（白 藜芦醇），并证实了虎杖的丁醇部位和乙酸乙酯部位对肥胖症的治疗作用 显著地高于虎杖水提取物、虎杖乙醇提取物和白藜芦醇对肥胖症的治疗 作用，因此，本发明人发现可将虎杖的部位用于治疗和预防肥胖症。
可通过本领域已知的一般提取方法制备虎杖的提取物，如超声提取、 过滤和回流提取。
可用水、C1-C4低级醇或其混合溶剂、优选甲醇或乙醇来提取虎杖的 提取物。
可以虎杖体积1-10倍、优选1-5倍的量使用溶剂。
通过向从提取物中蒸除溶剂后得到的残留物中加入水和己烷、并分 离出己烷层，得到本发明中的己烷部位。通过将乙酸乙酯混入去除己烷 层后的水层、并分离出乙酸乙酯层，得到本发明中的乙酸乙酯部位。此 外，通过移除乙酸乙酯层、将丁醇混入去除乙酸乙酯层后的层、并分离 出丁醇层，得到本发明中的丁醇部位。最终，在移除丁醇层后得到了水 层（实施例1-6）。
将提取物中的水提取物和乙醇提取物、和部位中的己烷部位、乙酸 乙酯部位和丁醇部位、以及经纯化和分离的化合物白藜芦醇用于检测对 胰脂肪酶（肥胖症治疗剂的靶标）的抑制作用（实验实施例1和表1）。 结果，丁醇部位的效力分别是乙醇提取物、水提取物和白藜芦醇的效力 4.6倍、22倍和7.8倍高。乙酸乙酯部位在抑制胰脂肪酶方面的效力分别 是乙醇提取物、水提取物和白藜芦醇的效力2.7倍、13.4倍和4.7倍高。
为检测对脂质乳剂吸收的抑制作用，进行了体内实验（实验实施例2 和表2）。虎杖乙醇提取物的丁醇部位具有仅次于阳性对照赛尼可的出色 作用。乙酸乙酯部位对脂质乳剂吸收的抑制作用比起水提取物、乙醇提 取物和白藜芦醇的抑制作用也显著地更加有效。
因此，本发明人发现虎杖提取物的丁醇部位和乙酸乙酯部位抑制了 活体中的脂肪吸收，可将其用于治疗和预防肥胖症的药物组合物。
在证实了虎杖提取物的丁醇部位和乙酸乙酯部位对胰脂肪酶活性和 脂质乳剂吸收产生抑制作用后，通过实际的动物实验对肥胖症预防作用 进行评价。
为检测肥胖症预防作用，本发明人观察了对动物体内脂肪生成的抑 制作用（实验实施例3）。当给予1%的虎杖提取物丁醇部位时，在体重 方面的变化非常类似于正常组的体重变化，并且其对动物体内脂肪生成 的抑制作用比可商购的赛尼可更加出色（图2和图3）。
作为对来自各躯体部分的脂肪增高作用进行观察得出的结果，在所 有的皮下脂肪、性腺脂肪和肾周脂肪方面，脂肪增高率均较低（图4-图 6）。
为在细胞水平上检测体重的变化，将脂肪组织移出并进行观察。在 虎杖丁醇部位给予组中，脂肪细胞尺寸显著减小（图7和图8）。
从接受高脂肪膳食和丁醇部位的大鼠中采集脂肪肝，对如下方面进 行检测：脂肪积累（实验实施例3和实验实施例4以及图14）、肝脏中甘 油三酯量的变化（图15）、肝组织的变化（通过肝组织的H&E染色）（图 16）、血清胰岛素量的变化（图17）、胰腺β细胞的变化（图18）、以及 脂肪生成标记物aP2表达的变化（图19）。肝中脂肪积累被抑制、甘油三 酯的量降低、肝组织的变化小、血清胰岛素量的变化小、胰腺β细胞破 裂被抑制、并且生脂（adipogenic）标记物的表达被抑制。因此，发现虎 杖提取物的丁醇部位对肥胖症具有预防作用。
通过实际的动物试验，对肥胖症治疗作用进行评价。
为检测肥胖症治疗作用，在高脂肪膳食诱发的肥胖大鼠中检测体重 的降低。如实验实施例4中所示，发现丁醇部位具有减轻体重的作用（图 20）。作为对来自各躯体部分的脂肪减少进行检测的结果，当给予1%的 虎杖丁醇部位时，在所有的褐色脂肪、生殖器脂肪、肾周脂肪和皮下脂 肪方面，减少脂肪的作用均出色（图21-图24）。脂肪细胞尺寸也维持在 正常范围内（图25）。由这些结果发现，虎杖提取物的丁醇部位具有出色 的肥胖症治疗作用。
从高脂肪膳食诱发的肥胖大鼠以及给予虎杖提取物丁醇部位的肥胖 大鼠体内采集脂肪肝。对如下方面进行检测：脂肪积累（实验实施例4 和实验实施例5以及图31）；肝重量的变化（图32）；肝组织的变化（通 过肝组织的H&E染色）（图33）；肝脏中甘油三酯量的变化（图34）；血 液和脂肪组织中IL-6和TNF-α的浓度（图35和图36）；血糖、血清胰 岛素、HbA1c、胰岛素敏感性的变化（图39-图43）；以及胰腺β细胞的 变化（图44）。肝中的脂肪被移除；肝重量降低；甘油三酯的量减少；血 液和脂肪组织中的IL-6和TNF-α的浓度降低；血糖、血清胰岛素、HbA1c 和胰岛素敏感性全部类似于正常组。因此，发现虎杖提取物的丁醇部位 具有肥胖症治疗作用。
本发明提供了预防和治疗高脂血症的药物组合物，所述药物组合物 包含部位作为有效成分，其中，所述部位通过如下步骤制备：用水、醇 或其混合溶剂对虎杖进行提取，得到虎杖提取物；进一步用丁醇或乙酸 乙酯对虎杖提取物进行萃取。
为证实高脂血症预防作用，从接受高脂肪膳食以及虎杖提取物丁醇 部位的大鼠体内采集血液，对脂肪代谢涉及的标记物（总胆固醇、甘油 三酯、游离脂肪酸、HDL和LDL）的增加进行了检测。即使在高脂肪膳 食组中，在虎杖提取物丁醇部位给予组中脂肪代谢涉及的标记物显著地 降低，因此证实了对高脂血症的作用（实验实施例3和实验实施例5以 及图9-图13）。
为证实高脂血症治疗作用，从诱发了肥胖症的大鼠以及诱发了肥胖 症但给予虎杖提取物丁醇部位的大鼠体内采集血液，对脂肪代谢涉及的 标记物（如总胆固醇、甘油三酯、游离脂肪酸、HDL和LDL）的增加进 行了检测。即使在高脂肪膳食组中，在虎杖提取物丁醇部位给予组中脂 肪代谢涉及的标记物显著地降低，因此证实了对高脂血症的作用（实验 实施例4-4以及图27-图30）。
本发明提供了用于预防和治疗代谢疾病的药物组合物，所述药物组 合物包含部位作为有效成分，其中，所述部位通过如下步骤制备：用水、 醇或其混合溶剂对虎杖进行提取，得到虎杖提取物；进一步用丁醇或乙 酸乙酯对虎杖提取物进行萃取。
本发明人观察到了虎杖提取物丁醇部位对脂肪代谢的作用（实验实 施例4-实验实施例7），并发现血清脂联素和血清瘦素（影响脂肪代谢的 因子）的浓度降低至正常范围内。
为研究丁醇部位对脂类代谢的作用，对肝组织中的AMPK蛋白表达、 肝组织中的ACC蛋白表达、肝组织中的FAS mRNA表达和肝组织中的 CPT-1活性进行了观察，丁醇部位给予组中的结果类似于正常组中的结 果（图47-图54）。由这些结果发现，虎杖提取物丁醇部位在维持脂肪代 谢方面有效，并可用于预防和治疗脂质代谢综合征的药物组合物。
本发明可含有0.1-99.9wt%（相对于药物组合物的总重量）的本发明 虎杖提取物的部位，并可包含药学上可接受的载体、赋形剂或稀释剂。
本发明的药物组合物可具有各种口服制剂或胃肠外制剂。将通常使 用的稀释剂（如填料、膨胀剂、粘合剂、湿润剂、崩解剂和表面活性剂） 或赋形剂用于药物制剂。用于口服给药的固体制剂包括片剂、丸剂、散 剂、颗粒剂、胶囊剂等。通过将一种或多种化合物与至少一种或多种赋 形剂（如淀粉、碳酸钙、蔗糖或乳糖、明胶等）混合制备这些固体制剂。 同时，除简单的赋形剂外，可使用润滑剂，如硬脂酸镁、滑石等。用于 口服给药的液体制剂包括悬浮剂、内用液剂、乳剂、糖浆剂等。除通常 使用的简单稀释剂（如水和液体石蜡）外，可包含各种赋形剂，如湿润 剂、甜味剂、芳香剂、防腐剂等。用于胃肠外给药的制剂包括无菌溶液 剂、非水溶液剂、悬浮剂、乳剂、冻干制剂和栓剂。可将丙二醇、聚乙 二醇、植物油（如橄榄油）、可注射的酯（如油酸乙酯）等用于非水溶液 剂和悬浮剂。可将Witepsol、聚乙二醇、Tween 61、可可油、月桂油（laurin butter）、甘油明胶等用于栓剂基质。
本发明药物组合物可适用的个体可为脊椎动物、优选哺乳动物、更 优选实验动物（如大鼠、小鼠、兔、豚鼠、仓鼠、狗和猫）、最优选类人 动物（ahthropoids）（如黑猩猩、大猩猩和人）。
可将本发明的药物组合物进行口服给药或胃肠外给药。对于胃肠外 给药，可选择皮肤外用或腹膜内注射、直肠内注射、静脉内注射、肌内 注射、皮下注射、子宫内硬膜外注射或脑血管内注射，最优选可将本发 明的药物组合物用于皮肤外用。
本发明组合物的给药剂量可根据患者的体重、年龄、性别、健康状 况、膳食、给药时间、给药方法、排泄率和待治疗疾病的严重程度而不 同，日给药剂量可为约0.01mg/kg到约1000mg/kg、优选约30mg/kg到 约500mg/kg、更优选约50mg/kg到约300mg/kg的虎杖提取物部位，给 药频率可为每天1-6次。
本发明的药物组合物可单独使用，或与手术、放射疗法、激素疗法、 化学疗法以及采用生物调节剂的方法组合使用。
本发明还提供了预防和缓解选自于由肥胖症、高脂血症和代谢疾病 所组成的组中的一种或多种疾病的功能食品，所述功能食品包含部位作 为有效成分，其中，所述部位通过如下步骤制备：用水、醇或其混合溶 剂对虎杖进行提取，得到虎杖提取物；进一步用丁醇或乙酸乙酯对虎杖 提取物进行萃取。
由于虎杖是已被用于药物的天然提取物、没有生物毒性且被认为是 安全的，所以可将其用于健康食品。此外，虎杖提取物的丁醇部位或乙 酸乙酯部位具有出色的肥胖症预防作用和治疗作用，可将该丁醇部位或 乙酸乙酯部位用于预防和缓解肥胖症的功能食品。
本发明的功能食品可进一步包含各种矫味剂或天然的碳水化合物。 天然的碳水化合物包括单糖（如葡萄糖和果糖）、二糖（如麦芽糖和蔗糖）、 多糖（如糊精和环糊精）以及糖醇（如木糖醇、山梨醇和赤藓糖醇）。甜 味剂包括天然甜味剂（如奇异果甜蛋白和甜叶菊提取物）和合成甜味剂 （如糖精和阿斯巴甜）。每100重量份的本发明健康食品中，可以约0.01- 约0.04重量份、优选约0.02-约0.03重量份的量使用天然碳水化合物。
此外，本发明的功能食品可包含各种营养物（nutraceuticals）、维生 素、电解质、矫味剂、着色剂、果胶酸或其盐、海藻酸或其盐、有机酸、 保护性胶体增稠剂、pH调节剂、稳定剂、防腐剂、甘油、醇、用于碳酸 饮料中的碳酸化剂（carbonating agent）等。同时，本发明的功能食品可 包含用于制备天然果汁、果汁饮料和蔬菜汁的果肉。这些组分可单独或 组合使用。尽管不关键，但是通常以每100重量份本发明健康食品中约 0.01-0.1重量份的量使用这些添加剂。
此外，本发明提供了治疗肥胖症、高脂血症或代谢疾病的方法，所 述方法包括向肥胖个体给予药学上有效量的虎杖丁醇部位或虎杖乙酸乙 酯部位。
在实验实施例4中，发现向高脂肪膳食诱发的肥胖大鼠给予虎杖丁 醇部位实际上对肥胖症、高脂血症和代谢疾病具有治疗作用。
该治疗方法可适用的个体可为脊椎动物、如小鼠（在实施例中得到 了支持）。优选地，所述个体可为哺乳动物、更优选实验动物（如大鼠、 小鼠、兔、豚鼠、仓鼠、狗和猫）、最优选类人动物（如黑猩猩、大猩猩 和人）。
在本发明的实施例中，示出了皮肤外用的治疗方法和经腹膜内注射 的治疗方法，但由于本发明没有细胞毒性，除这些方法外，可将口服或 胃肠外给药用于该治疗方法。对于胃肠外给药，可选择直肠内注射、静 脉内注射、肌内注射、皮下注射、子宫内硬膜外注射或脑血管内注射。 最优选治疗方法可用于皮肤外用，正如实施例中那样。
对于该治疗方法，药物组合物的给药剂量可根据患者的体重、年龄、 性别、健康状况、给药时间、给药方法、排泄率和待治疗疾病的严重程 度而不同。
本发明还提供了预防肥胖症、高脂血症或代谢疾病的方法，所述方 法包括向肥胖个体给予药学上有效量的虎杖丁醇部位。
如实验实施例3中所示，同时施用高脂肪膳食以及虎杖提取物丁醇 部位显示出，本发明的部位对肥胖症、高脂血症或代谢疾病具有预防作 用。因此，向普通个体施用本发明的虎杖提取物丁醇部位可预防该个体 的肥胖症。
此外，本发明提供了部位在制备预防和治疗肥胖症的组合物方面的 用途，其中，所述部位通过如下步骤制备：用水、醇或其混合溶剂对虎 杖进行提取，得到虎杖提取物；进一步用丁醇或乙酸乙酯对虎杖提取物 进行萃取。
本发明的虎杖提取物丁醇部位或乙酸乙酯部位证明，其对肥胖症、 高脂血症或代谢疾病具有预防作用和治疗作用，因此，可将本发明的部 位用于制备治疗所述疾病的药物组合物。
在下文中，将参考下述实施例和实验实施例对本发明进行进一步的 详细描述。
实施例
<实施例1>虎杖水提取物的制备
用于实验中的虎杖（Polygonum cuspidatum Sieb.Et Zucc.=Reynotria japonica Houtt.；蓼科）的根茎购自韩国Daejeon省的Baekjedang草药铺， 由韩国Kyungwon大学生命科学部的Kim Juhwan教授鉴定。已将凭证标 本（voucher specimen）（编号KIOM-POCU1）保藏于韩国东方医学研究 所（Korea Institute of Oriental Medicine）的糖尿病并发症研究中心的植物 标本室（herbarium of Diabetic Complications Research Center）。
向阴干并精细切制的虎杖（30g）中加入300mL的蒸馏水，于室温 下，在提取容器中于2h内重复进行三次提取，过滤后得到水提取物。 在40℃下，用旋转真空浓缩器浓缩水提取物。将浓缩物进行真空干燥， 并最终得到虎杖水提取物（2.5g）。
<实施例2>虎杖乙醇提取物的制备
将阴干并精细切制的虎杖6.8kg放入36L乙醇中，于室温下，在提 取容器中于24h内提取三次，然后在减压、40℃下浓缩，得到乙醇提取 物。将乙醇提取物进行过滤，并在减压下浓缩。在浓缩期间，将温度保 持在40-45℃或更低，以防止成分的分解和水解。从而，得到580g乙醇 提取物。
<实施例3>虎杖己烷部位的制备
如图1中所示，将实施例2中得到的虎杖乙醇提取物悬浮于2L蒸 馏水中，然后用2L正己烷（n-hexane）重复萃取三次，得到46g正己 烷层。
<实施例4>虎杖乙酸乙酯部位的制备
将实施例2中得到的虎杖乙醇提取物悬浮于2L蒸馏水中，然后如 图1中所示，使用2L正己烷分离出正己烷层和水层。将得到的水层用2 L乙酸乙酯重复萃取三次，得到250g乙酸乙酯层。
<实施例5>虎杖丁醇部位的制备
将实施例2中得到的虎杖乙醇提取物悬浮于蒸馏水中，然后如图1 中所示，依次用正己烷、乙酸乙酯(EtOAc)和正丁醇(n-BuOH)进行 系统分离。在减压下浓缩并冻干后，得到150g正丁醇部位。
<实施例6>来自虎杖乙醇提取物乙酸乙酯部位的白藜芦醇的制备
将虎杖乙酸乙酯部位(250g)施于硅胶柱色谱(70-230目，12 ×60cm，二氯甲烷/甲醇＝100∶0→0∶100)，分成10份主要的小份(small fractions)(F1-F10)。在其中，将小份F5(4.9g)施于使用氯仿和甲醇 混合溶剂的中压液相色谱(氯仿100％，40min；98％，30min；95％， 40min；90％，60min；Hi-Flash 2L硅胶柱，12×60cm，Yamazen YFLC AI-580，日本)，分离出纯的反式白藜芦醇并鉴定其结构。
如上所述，分离出180mg单一化合物，在对波谱数据(1H-NMR、 13C-NMR)进行分析后，证实该化合物是白藜芦醇([化学式1])。
白藜芦醇——白色粉末，1H-NMR(300MHz，丙酮-d6)δ：7.36(2H，d， J＝8.4Hz，H-2′/H-6′)，7.02(1H，d，J＝16.4Hz，H-8)，6.78(2H，d，J＝8.4 Hz，H-3′/H-5′)，6.74(1H，d，J＝16.4Hz，H-7)，6.51(2H，d，J＝2.0Hz， H-2/H-6)，6.25(1H，t，J＝2.0Hz，H-4).13C-NMR(75MHz，丙酮-J6)δ： 159.6(C-3′/C-5′)，158.2(C-4)，141.0(C-1′)，130.1(C-1)，129.2(C-8)，128.8 (C-2/C-6)，126.9(C-7)，116.5(C-3/C-5)，105.8(C-2′/C-6′)，102.8(C-4′)。
[化学式1]
<实验实施例1>对胰脂肪酶活性抑制作用的实验
使用虎杖乙醇提取物、虎杖乙醇提取物的己烷部位、乙酸乙酯部位、 丁醇部位、水提取物和白藜芦醇，对猪胰脂肪酶活性的抑制作用进行体 外实验。
使用猪胰脂肪酶对胰脂肪酶活性抑制的实验进行测定。首先，将混 入酶缓冲液中（10mM MOPS（吗啉丙烷磺酸）和1mM EDTA，pH 6.8） 的30μL（10单位）猪胰脂肪酶（Sigma，圣路易斯，密苏里州，美国） 与850μL Tris缓冲液（100mM TrisHC1和5mM CaCl2，pH7.0）混合进 行制备。然后，将各种浓度的试验物质和100μL的阳性对照奥利司他 （Roche，巴塞尔，瑞士）混入其中，并在37℃下孵育15min。然后， 加入20μL的底物溶液（处于二甲基甲酰胺中的10mM p-NPB（对硝基 苯基丁酸酯）），进一步孵育15min。在400nm下，使用ELISA酶标仪 （BIO-TEK，Synergy HT，美国）测定由脂肪酶进行的p-NPB到对硝基 苯酚的水解，来确定脂肪酶活性。将脂肪酶活性的抑制作用表示为试验 物质使光密度降低的百分比，对抑制50%脂肪酶活性所需的浓度（IC50） 进行计算。
根据上述方法制备虎杖乙醇提取物、虎杖乙醇提取物的己烷部位、 乙酸乙酯部位、丁醇部位、水提取物和白藜芦醇，并根据上述实验实施 例进行实验，测定对胰脂肪酶活性的抑制作用并将结果在表1中示出。
[表1]
如表1中所示，按出色与否的次序将抑制作用排列如下：虎杖乙醇 提取物的丁醇部位（15.8±2.6μg/mL）、乙酸乙酯部位（26.4±1.9μg/mL）、 乙醇提取物（72.5±6.7μg/mL）、白藜芦醇（124±6.7μg/mL）、己烷层 （326.9±36.6μg/mL）、水提取物（352.9±16.5μg/mL）。丁醇部位的抑制 作用分别是乙醇提取物、水提取物和白藜芦醇的抑制作用的4.6倍、22 倍和7.8倍高。乙酸乙酯部位的抑制作用分别是乙醇提取物、水提取物 和白藜芦醇的抑制作用的2.7倍、13.4倍和4.7倍高。证明了乙酸乙酯部 位和丁醇部位的抑制作用比起虎杖水提取物或乙醇提取物的抑制作用要 远远出色。
<实验实施例2>对动物体内脂质乳剂短期吸收的抑制作用的分析
测定了虎杖乙醇提取物、虎杖乙醇提取物的己烷部位、乙酸乙酯部 位、丁醇部位、水提取物和白藜芦醇对大鼠肠内脂肪消化和吸收程度的 抑制作用。
使4周龄雄性wistar大鼠（Orient Bio，韩国）适应1周。在实验前， 将所有动物禁食18h，口服给予3mL脂质乳剂（3mL玉米油，50mg 胆酸，3mL盐水和1g胆甾醇油酸酯）以及100mg/kg和250mg/kg的 虎杖乙醇提取物、虎杖乙醇提取物的己烷部位、乙酸乙酯部位、丁醇部 位、水提取物和白藜芦醇。对于阴性对照，仅给予相同量的盐水。对于 药物对照，给予200mg/kg奥利司他（Roche，巴塞尔，瑞士）。在各药 物给药前以及给药后1h、2h、3h、4h从尾静脉取得血样。将采集的血液 在5,500g下离心5min，然后分离出血浆。使用Wako Triglyceride E-test 试剂盒测定血浆三酰甘油酯（triacylglyceride）的浓度。
通过给予脂质乳剂和虎杖乙醇提取物、虎杖乙醇提取物的己烷部位、 乙酸乙酯部位、丁醇部位、水提取物和白藜芦醇进行的短期脂肪吸收抑 制作用的实验显示出：如表2中所示，仅给予脂质乳剂的组中甘油三酯 的量增高至两倍以上。然而，虎杖丁醇部位给予组和虎杖乙酸乙酯部位 给予组中没有显示出甘油三酯的明显增高。
对给予了250mg各药物的组而言，按出色与否的次序将对脂肪吸收 的抑制作用排列如下：丁醇部位（140.1±32.4mg/dL）、乙酸乙酯部位 （170.1±32.4mg/dL）、水提取物（191.3±23.1mg/dL）、乙醇提取物 194.4±18.8mg/dL）、白藜芦醇（228.5±8.4mg/dL）。
也就是说，证明了丁醇部位和乙酸乙酯部位的抑制作用比起虎杖乙 醇提取物、水提取物和白藜芦醇的抑制作用更加出色（表2）。
[表2]
*上述[表2]显示出如下物质在动物体内对脂质乳剂短期吸收的抑制 作用：虎杖乙醇提取物；来自虎杖提取物的己烷层、乙酸乙酯层、丁醇 层和水层的各部位；水提取物和白藜芦醇。
<实验实施例3>抗肥胖作用标记物、抗脂肪生成的作用
评价了虎杖丁醇部位（在下文中，称为“POCU-1b”）对体重增加的 抑制作用以及对脂肪生成、脂肪肝、高脂血症和胰岛素分泌的作用。
对于实验动物，准备了3周龄的雄性C57BL/6小鼠，并喂养高脂肪 膳食以诱发肥胖症。将AIN76A膳食（基于AIN76A的45Kcal%高脂肪 膳食，Research Diets公司，美国，D12451，卡路里组成：脂肪45%，碳 水化合物35%，蛋白20%）用于高脂肪膳食，将Purina Rodent Chow用 于正常膳食。允许动物自由地获取饲料和饮用水。将试验药物POCU以 0.1%和1%的量与高脂肪饲料混合进行供应，将对照药物赛尼可以0.1% 的量与饲料混合进行供应。在10周中，供应混有药物的高脂肪饲料以诱 发肥胖症，在各周对体重的变化进行分析。在10周后进行解剖，将脂肪、 肝、胰腺、肌肉等移出用以分析药物的作用。
<3-1>对体重变化的观察
仅给予高脂肪膳食的组中体重稳定地增高，然而，混有1%POCU-1b 的组中体重增加被显著抑制（*p<0.01）（图2）。高脂肪膳食给予组中体 重增加的量是10.9g，赛尼可给予组中体重增加的量是6.1g，POCU-1b 给予组中体重增加的量是3.6g。因此，POCU-1b预防体重增加的作用比 起赛尼可更加出色（$，*p<0.01）（图3）。
<3-2>对各躯体部分脂肪增加的预防作用的观察
为分析脂肪组织是否增大，小心地移出性腺脂肪（左侧/右侧）、肾 周脂肪（左侧/右侧）、皮下脂肪（左侧/右侧）和褐色脂肪并用生理盐水 洗涤，然后用滤纸除去水，测定脂肪组织的重量。
POCU-1给予组（1%POCU-1混合组）极好地预防了来自各躯体部 分的脂肪增加（皮下脂肪：0.15g；性腺脂肪：0.21g；肾周脂肪：0.07g）。 该作用和单一化合物赛尼可的作用（皮下脂肪：0.14g；性腺脂肪：0.17 g；肾周脂肪：0.04g）同样出色（*p<0.01）（图4、图5和图6）。
<3-3>对脂肪细胞尺寸的抑制作用的观察
将移出的脂肪组织固定于10%甲醛中，用石蜡包埋，并制成玻片。 将玻片用H&E进行染色，在光学显微镜下分析脂肪细胞尺寸。如图7中 所示，高脂肪膳食组的脂肪细胞尺寸显著地增大（125μm），然而， POCU-1b给予组的脂肪细胞尺寸保持在正常范围内（61μm），并且 POCU-1b给予组的作用比起赛尼可的作用（75μm）（#p<0.01）更加出色 （图7）。
<3-4>对于抗高脂血症作用的观察
在试验结束后，将实验动物禁食16h。在解剖时，从腹主动脉采集 血液并在3,000rpm下离心10min，分离出血清和血浆。使用分离出的血 清，用血清自动分析仪（Hitachi 7060，日本）对脂肪代谢涉及的标记物 （即甘油三酯、高密度脂蛋白（HDL）、低密度脂蛋白（LDL）和总胆固 醇）进行测定。
结果，在高脂肪膳食组中，总胆固醇、甘油三酯、LDL和游离脂肪 酸的量分别显著增高183%、161%、267%和114%以上。然而，在POCU-1b （1%）给予组中，总胆固醇（29%）、甘油三酯（22%）、LDL（32%）和 游离脂肪酸（32%）的量显著减少，证明了POCU-1b的效果良好（图9- 图13）。
<3-5>对脂肪肝的预防作用
随着脂肪增加，脂肪在肝脏中积累，发展成脂肪肝。当发展成脂肪 肝时，由于所积累的脂肪的原因，肝脏原来的颜色（微红色）消失。
如图14中所示，POCU-1b（1%）给予组中肝脏的颜色保持与正常 组相同的微红色（图14）。这意味着POCU-1b（1%）的给予预防了脂肪 在肝脏中的积累。
作为对肝脏中的甘油三酯量进行分析的结果，POCU-1b（0.1%、1.0%） 的给药分别以33%和40%显著地防止了甘油三酯的增高（#p<0.01）（图 15）。
将在解剖时采集的肝组织固定于10%中性甲醛中并进行加工。将组 织用苏木精&伊红进行染色，并在光学显微镜下观察。作为肝组织染色 的结果，在正常组中很好地观察到了围绕着中心静脉的肝组织；而在高 脂肪膳食组中，由于脂肪的过度积累而使肝组织发生明显变化。然而， POCU-1b（1%）给予组中的肝组织显示出了与正常组中的肝组织几乎相 同的外观（图16）。这证明POCU-1b（1%）的给予预防了脂肪肝并发症。
<3-6>对于胰岛素抵抗的预防作用的观察
肥胖症诱发了胰岛素抵抗，并进一步自动地发展成糖尿病。证明了 POCU-1b（1%）的给予显著预防了胰岛素抵抗（#p<0.01）（图17）。
同时，对β细胞（在胰腺中分泌胰岛素的细胞）进行了分析。高脂 肪膳食组中的几乎所有β细胞都被破坏，而在POCU-1b（1%）给予组中 观察到了很多与正常组中几乎相同的β细胞（图18）。由此证明，POCU-1b （1%）预防了β细胞的破裂，从而预防了血清胰岛素抵抗。
<3-7>脂肪生成标记物aP2表达的变化
从肝组织中提取mRNA，使用生脂标记物aP2引物进行RT-PCR。如 图19中所示，当通过RT-PCR对脂肪生成标记物aP2 mRNA进行分析时， 来自高脂肪膳食组的aP2标记物增高1.4倍以上，但来自POCU-1b（1%） 给予组的aP2标记物显著减少至正常范围内（*p<0.01）。这意味着通过 POCU-1b预防了经高脂肪膳食的脂肪生成。
<实验实施例4>POCU-1b对脂肪分解（lipolysis）的作用（POCU-1b的 肥胖症治疗作用）
<4-1>对体重降低的观察
为评价POCU-1b对高脂肪膳食诱发的肥胖大鼠的体重降低和脂肪分 解的作用，在给药前10周内，用高脂肪膳食喂养大鼠以诱发极端肥胖症， 然后给予POCU-1b（0.1%，1.0%），观察体重的变化。比起赛尼可，POCU-1b （1%）的给予在降低体重方面显示出更加出色的治疗作用（*，**p<0.01） （图20）。
<4-2>对各躯体部分脂肪增加的预防作用的观察
如图21-图24中所示，对来自各躯体部分的脂肪重量进行测定。来 自高脂肪膳食组的生殖器脂肪约为11g，相比于正常组的6.2g增高至约 两倍。然而，来自POCU-1b（1%）给予组的生殖器脂肪为6.3g，比起 高脂肪膳食组显著减少（p<0.01）。对于肾周脂肪和皮下脂肪的情况，显 示出了和生殖器脂肪相同的结果；对于褐色脂肪的情况，在POCU-1b （0.1%）给予组和POCU-1b（1.0%）给予组中均观察到了脂肪重量的显 著降低。
<4-3>对脂肪细胞尺寸的抑制作用的观察
将在解剖时移出的脂肪组织固定于10%中性甲醛中，用石蜡包埋， 制成玻片。将玻片用H&E进行染色，在光学显微镜下分析脂肪细胞尺寸。
如图25和图26中所示，高脂肪膳食组的脂肪细胞尺寸显著地增加 （79μm），然而，POCU-1b给予组的脂肪细胞尺寸保持在正常范围内（56 μm）（#p<0.01）。
<4-4>抗高脂血症的作用
在试验结束后，将实验动物禁食16h。在解剖时，从腹主动脉采集 血液并在3,000rpm下离心10min，分离出血清和血浆。使用分离出的血 清，用血清自动分析仪（Hitachi 7060，日本）对脂肪代谢涉及的标记物 （即甘油三酯、高密度脂蛋白（HDL）、低密度脂蛋白（LDL）和总胆固 醇）进行测定。
结果，在高脂肪膳食组中，总胆固醇、甘油三酯和LDL分别显著增 高144%、171%和135%以上，同时HDL减少9%。然而，在POCU-1b （1%）给予组中，总胆固醇（27%）、甘油三酯（65%）和LDL（36%） 的量显著减少，证明了POCU-1b的效果良好。通过给予POCU-1b（0.1%、 1.0%），HDL的量分别显著增高127%和121%（#p<0.05）（图27-图30）。
<4-5>对脂肪肝的治疗作用
随着脂肪增加，脂肪在肝脏中积累，发展成脂肪肝。当发展成脂肪 肝时，由于所积累的脂肪的原因，肝脏原来的颜色（微红色）消失。
如图31中所示，POCU-1b（1%）给予组中肝脏的颜色保持与正常 组相同的微红色（图31）。这意味着POCU-1b（1%）的给予预防了脂肪 在肝脏中的积累。
作为对肝脏重量进行分析的结果，发现通过给予POCU-1b（0.1%、 1.0%）显著治疗了甘油三酯的增高（#p<0.01）（图32）。
同时，将在解剖时收集的肝组织固定于10%中性甲醛中并进行加工。 将组织用H&E进行染色，并在光学显微镜下观察。作为肝组织染色的结 果，在正常组中很好地观察到了围绕着中心静脉的肝组织；而在高脂肪 膳食组中，由于脂肪的过度积累而使肝组织发生明显变化。然而， POCU-1b（1%）给予组中的肝组织显示出与正常组中的肝组织几乎相同 的外观（图33）。这证明通过给予POCU-1b（1%）治疗了脂肪肝并发症。 作为对肝脏中甘油三酯的量进行分析的结果，通过给予POCU-1b （0.1%、1.0%）显著地治疗了甘油三酯的增高（#p<0.05）（图34）。
<4-6>对肥胖症诱发的胰岛素抵抗的治疗作用
在肝脏和血清中，分析了POCU-1b对IL-6、TNF-α和SOSC-3（细 胞因子信号-3的抑制因子）（胰岛素代谢的关键酶）的表达变化的作用。 众所周知的是，肥胖症导致胰岛素抵抗，从而引起严重的糖尿病（并发 症）。由于肥胖，IL-6、TNF-α、脂联素等不正常运行，在肝或肌肉中通 过SOCS（细胞因子信号的抑制因子）通路和TSC/mTOR通路引起胰岛 素抵抗。
用ELISA评价IL-6和TNF-α（二者均为血液脂肪细胞因子）的浓度， 用Western印迹评价脂肪细胞中的这些蛋白的浓度。
在高脂肪膳食组中，这些脂肪细胞因子的浓度增高了1.4倍；而通 过给予POCU-1b（1%），增高的血清IL-6和血清TNF-α浓度恢复到正常 水平（图35和图36）。
此外，脂肪组织和血液中的脂肪细胞因子IL-6和TNF-α蛋白的变化 恢复到正常水平，因此证实了治疗作用（图37和图38）。
同时，POCU-1b使血糖、血清胰岛素抵抗、HbA1c、胰岛素敏感性 和HOMA指数恢复到正常水平（图39-图43）。
为观察β细胞（在胰腺中产生胰岛素）的变化，使用抗胰岛素抗体 （Abcam，美国）进行了免疫组织化学染色。
在高脂肪膳食组中，观察到了β细胞的膨大和胰岛素的消失；而在 POCU-1b给予组中，β细胞的形态和胰岛素的量均正常（图44）。
为检测POCU-1b对胰岛素抵抗的改进是否通过SOCS和NF-κB信号 通路介导，进行SOSC的Western印迹分析以及NF-κB基于ELISA的 DNA结合分析。从而发现，POCU-1b对胰岛素抵抗的改进归功于将SOSC 水平和NF-κB活性恢复至正常水平的机制（图45和图46）。
<4-7>对肌肉和肝组织中的脂肪代谢的作用
理想的脂肪代谢是脂肪生成和脂肪分解之间适当地维持平衡。然而， 通过食物而过度摄取营养物打破了这种脂肪代谢平衡，引起过剩的脂肪 在肌肉和肝组织中积累。检测了POCU-1b对脂肪代谢失衡的作用。
存在多种因子影响脂肪代谢，在这些因子中，通ELISA对脂联素和 瘦素（二者为脂肪细胞分泌的血清脂肪细胞因子）的浓度进行测定。如 图47和图48中所示，在高脂肪膳食组中，血清脂联素的浓度减少至0.7 倍，而血清瘦素的浓度增高了约2.5倍。然而，在POCU-1b（1%）给予 组中，血清脂联素和瘦素的浓度复原至正常水平（图47和图48）。
此外，从肝组织（脂肪积累的主要地方）中提取蛋白和mRNA，对 腺苷一磷酸激活的蛋白激酶（AMPK）和乙酰辅酶A羧化酶（ACC）（二 者为参与脂肪代谢的重要因子）以及脂肪酸合酶（FAS）的表达量进行了 分析。
如图49、图50和图51中所示，在高脂肪膳食组中，p-AMPK（磷 酸-AMP-激酶）和AMPK的表达量减少约10%；然而通过给予POCU-1b （1%），p-AMPK和AMPK的表达量复原至正常水平。
如图52中所示，在高脂肪膳食组中，ACC的表达量减少约23%； 然而在POCU-1b（1%）给予组中，ACC的表达量复原至正常水平。
同时，在高脂肪膳食组中，FAS mRNA的表达量增高至约150%；通 过给予POCU-1b，FAS mRNA的表达量以浓度依赖的方式减少（图53）。
为测定肉碱棕榈酰转移酶1（CPT-1）（参与组织中脂肪氧化的重要 酶）的活性，从肝组织中提取蛋白，使用硝基苯基丁酸酯作为底物测定 该酶的活性。
如图54中所示，由于高脂肪膳食的原因，CPT-1（与脂肪氧化相关） 的活性显著降低约58%；然而，通过给予POCU-1b（1%），其活性复原 至正常水平。
通过上述研究结果证明，虎杖乙酸乙酯部位和丁醇部位的抗肥胖作 用在抑制胰脂肪酶活性、抑制肠脂肪吸收、抑制体重增加和降低体重方 面很出色。可将虎杖乙酸乙酯部位和丁醇部位用作诸如肥胖、高脂血症 和代谢疾病等疾病的新治疗剂。
工业实用性
本发明在抑制胰脂肪酶活性方面是有效的，并且对肠道中的脂肪吸 收具有抑制作用，因此本发明是用于治疗和预防肥胖症的有效的天然提 取物。本发明不仅可在药学上用作治疗和预防肥胖症的组合物，而且还 可用作健康功能食品。