技术领域
本发明属于生物医药领域，具体涉及泵铁蛋白的调控及其应用。
背景技术
铁元素是体内合成血红蛋白、肌红蛋白的重要原料，也是一系列氧化还 原反应系统中一些酶的辅酶，参与氧的运输、细胞呼吸，DNA合成等重要生理 过程[1]。铁缺乏可导致细胞生长停滞甚至死亡；而在铁蓄积的状态下，二价 铁与过氧化氢和脂质过氧化物反应，分别产生羟基自由基和脂质自由基，这 些自由基破坏蛋白、核酸及细胞膜，对细胞有毒性。因此铁代谢稳态调控在 维持机体新陈代谢过程中具有重要作用[2]。
泵铁蛋白(Ferroportin)是目前已知的唯一往细胞外运输铁的跨膜蛋白， 它存在于肠壁上皮细胞的基底层、巨噬细胞、肝脏细胞以及胚胎细胞膜上， 将铁从细胞内转运到细胞外[3-4]。Mckie等发现在爪蟾卵母细胞中高表达 Fpn，细胞内铁减少[5]。Donovan等研究发现，斑马鱼胚胎中泵铁蛋白突变， 影响铁从卵黄囊到胚胎的转运，说明Fpn是重要的泵铁蛋白[6]。泵铁蛋白 mRNA的5’端具有铁调控区域，研究发现破坏Fpn启动子区域引起小鼠贫血 [7]。泵铁蛋白突变人群中，脏器内铁逐渐累积，以内皮系统巨噬细胞累积更 为严重。以上都说明了泵铁蛋白具有重要的运输铁功能[8-9]。泵铁蛋白全身 敲除胚胎致死[4]，充分说明了泵铁蛋白在铁转运中的重要作用。
研究发现，铁代谢紊乱会导致很多与铁代谢直接相关或间接相关的疾病。 铁缺乏会导致缺铁性贫血[10]，而铁过载会导致多器官铁累积的血色病 [11-12]，由于铁过载，会导致氧化压力的增加，产生的自由基，破坏细胞及 组织的正常功能，血色病患者晚期多并发糖尿病[13]或肿瘤[14-16]等疾病。 目前很多研究发现，铁代谢和神经系统的发育以及各种神经性疾病相关，如 神经系统内铁代谢紊乱将加速或导致老年痴呆等神经系统疾病的发生和发展 [17-18]。同时，铁是动物、细菌或病毒等微生物体内重要的微量元素，都需 要铁来进行正常的代谢功能，机体和病原体存在着各自的竞争机制来利用铁 元素。铁过载破坏了机体的代谢平衡，使细菌等病原体更容易利用机体内的 铁，增加了机体对细菌的易感性[19-22]。另外在慢性炎症病人中，由于炎症 上调hepcidin的表达(调控铁在肠道的吸收及细胞内铁的外排)，使得肠道 铁吸收减少，细胞内铁外排减少，导致缺铁性贫血[23]。在很多癌症组织中， 铁代谢失调，如在乳腺癌患者中，泵铁蛋白表达下调，乳腺癌患者中泵铁蛋 白高表达，hepcidin低表达，10年存活率大于90％[15]。以上充分说明了铁 代谢平衡在机体代谢中的重要性。
泵铁蛋白是已知的唯一往细胞外运输铁的跨膜蛋白，主要表达在肠道， 巨噬细胞，以及肝脏，定位在细胞膜上控制细胞铁的外排来影响机体和细胞 整体的铁代谢。铁代谢失调会导致贫血及血色病以及其它的并发症，如糖尿 病，感染等。而在很多代谢性疾病中也表现出铁代谢失调，如老年痴呆，癌 症等。由于铁在基础代谢中的重要性，如作为很多分子的组成部分及很多重 要酶的辅酶，因此调控铁代谢平衡也显得尤为重要。鉴于泵铁蛋白在细胞及 组织外排铁的重要性，调控泵铁蛋白可以改变机体或细胞内的铁平衡，因此 寻找影响泵铁蛋白表达的分子或药物成为必然。这些分子和药物可以通过改 变铁代谢，来参与疾病的干预和治疗。我们发现用NF-kB抑制剂或P65敲除 来阻断NF-kB通路可以很好地上调泵铁蛋白的表达。由此完成本发明。
发明内容
本发明人发现，在原代培养的巨噬细胞中，NF-kB通路抑制剂BAY11-7082、 SN-50都可以上调泵铁蛋白的表达。在P65敲除的MEF细胞系中泵铁蛋白表达 也上调；NF-kB的激活分子LPS、PolyI:C和Pam3CSK4则下调泵铁蛋白的表达。 实验充分说明NF-kB通路在调控泵铁蛋白的表达过程中起重要作用，阻断 NF-kB通路可以上调泵铁蛋白的表达，泵铁蛋白上调将改变细胞或机体内的铁 的含量。由于铁在代谢中的重要作用，与很多疾病的发生发展相关，因此调 控泵铁蛋白表达可能成为防治铁代谢紊乱相关疾病重要靶点。本发明为疾病 防治提供了新理论依据和新靶点。
因此，本发明第一方面提供一种调控NF-kB通路的物质在制备调控泵铁 蛋白表达用的药物中的用途。
本发明第二方面提供一种调控NF-kB通路的物质在制备治疗与铁代谢直 接相关或间接相关的疾病中的用途。
在一具体实施例中，所述与铁代谢直接相关或间接相关的疾病选自：缺 铁性贫血、血色病、血色病患者晚期并发的糖尿病或肿瘤、铁代谢紊乱而加 速或导致的神经系统疾病、铁过载导致的机体对细菌的易感性和癌症。
在一具体实施例中，所述物质为NF-kB通路抑制剂或NF-kB通路的激活 分子。
在一具体实施例中，所述物质选自：
(1)脂多糖；
(2)由一条聚合的多肌苷酸链和一条聚合的多胞嘧啶链配对而成的双链 RNA类似物；
(3)N-棕榈酰基-S-[2，3-二(棕榈酰基氧基)-(2RS)-丙基]-[R]-半胱氨 酰基-[S]-丝氨酰基-[S]-赖氨酰基-[S]-赖氨酰基-[S]-赖氨酰基-[S]-赖氨 酸·3HCl；
(4)H2N-Ala-Ala-Val-Ala-Leu-Leu-Pro-Ala-Val-Leu-Leu-Ala-Leu- Leu-Ala-Pro-Val-Gln-Arg-Lys-Arg-Gln-Lys-Leu-Met-Pro-OH；和
本发明第三方面提供一种调控泵铁蛋白表达的方法，所述方法包括向表 达NF-kB通路的体系中给予调控NF-kB通路的物质。
在一具体实施例中，所述方法为体外方法。
在一具体实施例中，所述调控NF-kB通路的物质为NF-kB通路抑制剂或 NF-kB通路的激活分子。
在一具体实施例中，所述物质选自：
(1)脂多糖；
(2)由一条聚合的多肌苷酸链和一条聚合的多胞嘧啶链配对而成的双链 RNA类似物；
(3)N-棕榈酰基-S-[2，3-二(棕榈酰基氧基)-(2RS)-丙基]-[R]-半胱氨 酰基-[S]-丝氨酰基-[S]-赖氨酰基-[S]-赖氨酰基-[S]-赖氨酰基-[S]-赖氨 酸·3HCl；
(4)H2N-Ala-Ala-Val-Ala-Leu-Leu-Pro-Ala-Val-Leu-Leu-Ala-Leu- Leu-Ala-Pro-Val-Gln-Arg-Lys-Arg-Gln-Lys-Leu-Met-Pro-OH；和
本发明第四方面提供一种筛选调控泵铁蛋白表达或治疗或预防与铁代谢 直接相关或间接相关的疾病用的潜在物质的方法，所述方法包括：
在测试组中，在表达NF-kB通路的体系中添加待筛选的候选物，并检测 NF-kB和泵铁蛋白的表达情况；并且，在对照组中，在不添加所述候选物的、 表达NF-kB通路的体系中，检测NF-kB通路和泵铁蛋白的表达情况；和
将测试组中NF-kB和泵铁蛋白的表达情况与对照组中NF-kB和泵铁蛋白 的表达情况进行比较；
其中，与对照组相比，能引起NF-kB的表达上调而泵铁蛋白的表达下调、 或者NF-kB的表达下调而泵铁蛋白的表达上调的候选物为调控泵铁蛋白表达 或治疗或预防与铁代谢直接相关或间接相关的疾病用的潜在物质。
在一具体实施例中，所述表达NF-kB通路的体系选自巨噬细胞、小肠细 胞和肝细胞，或含有所述细胞的组合物。
附图说明
图1显示MEF-P65-KO细胞系中泵铁蛋白表达上调。
图2显示LPS、PolyI:C及Pam3CSK4在mRNA和蛋白水平下调泵铁蛋白的 表达。图中“Fpn”指泵铁蛋白。
图3显示NF-kB抑制剂BAY11-7082、NF-kB SN50上调泵铁蛋白的表达。 图中“Fpn”指泵铁蛋白。
具体实施方式
本发明提供一种调控泵铁蛋白表达的方法，该方法包括调控NF-kB通路， 从而调控泵铁蛋白的表达。
“调控”在本文中包括上调和下调。因此，本发明包括上调泵铁蛋白的 表达和下调泵铁蛋白的表达。
可采用多种方法调控NF-kB通路。例如，可通过给予NF-kB通路抑制剂 或激动剂，从而上调或下调泵铁蛋白的表达。或者，也可通过生物工程技术 改造宿主细胞，使其过表达或不表达NF-kB，从而实现泵铁蛋白的调控。
调节NF-κB通路的物质在美国专利申请公开号20040092430、 20040058930、和20030013170、20030078246和20030078246以及 CN200580023004.0中公开，所有申请的全部内容在此以引用的方式纳入本文。 这类物质包括α-硫辛酸、α-生育酚、anetholdithiolthione(ADT)、还原虾 红素、二丁香酚、丁羟基茴香醚(BHA)、千金藤碱咖啡酸苯乙酯(3，4-二羟基 肉桂酸，CAPE)、鼠尾草酚、卡维地洛、儿茶酚衍生物、 durcumin(diferulolylmethane)、二苯甲基丁内酯木聚糖、二乙基二硫代氨 基甲酸酯(DDC)、iferoxamine、二氢硫辛酸、地拉齐普和非诺贝酸、二甲二 硫氨基甲酸(DMDTC)、姜黄(diferulolylmethane)、双硫仑、依布硒啉、 EPC-Kl(维生素E和维生素C磷酸二酯化合物)、表没食子儿茶精-3-酸酯 (EGCG；绿茶多酚)、麦角硫因、乙基丙酮酸酯、乙二醇四乙酸酯(EGTA)、γ- 谷氨酰半胱氨酸合成酶(γ-GCS)、灵芝多糖、银杏叶提取物品、谷光苷肽、 氧化苏木精、IRFI 042(类维生素E化合物)、ron tetrakis、拉西地平、拉 扎洛依、羽扇醇、厚朴酚、二氧化锰超氧物歧化酶(Mn-SOD)、N-乙酰基-L-半 胱氨酸(NAC)、nacyselyn(NAL)、去甲二氢愈创木酸(NDGA)、邻位二氮杂菲、 酚抗氧化剂(例如对苯二酚和叔丁基对苯二酚)、氧化苯胂(PAO，酪氨酸磷酸 酶抑制剂)、吡咯啉二硫代氨基甲酸盐(PDTC)、橡黄素、Rg(3)(人参衍生物)、 鱼藤酮、S-烯丙基-半胱氨酸(SAC)、sauchinone、(5-(4-氯苯基)-N-羟基-(4- 甲氧基苯基)-N-甲基-1H-吡唑-3-丙酰胺)tepoxaline、α-torphryl琥珀酸、 α-torphryl醋酸、PMC(2，2，5，7，8-五甲基-6-羟基色原烷)及益智酮A 和B。NFκB抑制剂也包括蛋白体抑制剂，如肽醛(ALLnL(N-乙酰基 -leucinyl-leucynil-norleucynal，MG101)、LLM(N-乙酰基 -leucinyl-leucynil-methional)、Z-LLnV(苄氧羰基 -leucinyl-leucynil-norvalinal，MG115)、Z-LLL(苄氧羰基 -leucinyl-leucynil-leucynal，MG132)、lactacystine、b-内酯、硼酸肽、 泛激素连接酶抑制剂、PS-341、环孢霉素A、FK506(他克莫司)、脱氧精胍菌 素、APNE(N-乙酰基-DL-苯丙氨酸-b-萘酯)、BTEE(N-苯甲酰基L-酪氨酸-乙 酯)、DCIC(3，4-二氯异香豆素)、DFP(二异丙基氟磷酸)、TPCK(N-a-甲苯基 磺酰-L-苯丙氨酸氯甲基酮)、calagualine(蕨类衍生物)、LY29和LY30、 pefabloc(丝氨酸蛋白酶抑制剂)、rocaglamides(米仔兰属衍生物)、格尔德 霉素、BMS-345541(4(2′-氨乙基)氨基-1，8-二甲基咪唑(1，2-a)喹啉)、 2-氨基-3-氰基-4-芳基-6-(2-羟基-苯基)pryridine类似物(化合物26)、 anandamide、AS602868、BMS-345541、flavopiridol、jesterone二聚体、5， 7，4′-三羟基黄酮、HB-EGF(肝素连接的表皮生产因子类生长因子、 LF15-0915(15-deoxyspergualine类似物)、MX781(维甲酸拮抗剂)、 itrosylcobalamin(维生素B12类似物)、survanta、PTEN(肿瘤抑制剂)、水 飞蓟素、柳氮磺吡啶、piceatannol、槲皮黄素、十字孢碱、蟛蜞菊内酯、桦 木脑酸、熊果酸、茴脑、阿司匹林、水杨酸钠、叠氮胸苷(AZT)、BAY-117082、 (E3((4-甲基苯基)-磺酰)-2-丙烯腈)、BAY-117083、(E3((4-丁基苯基)-磺 酰)-2-丙烯腈)、苯甲基异硫氰酸酯、cacospongionolide B、calagualine、 卡铂、绒毛膜促性腺激素、环顶环氧菌素、1-羟基-2-羟甲基-pent-1-烯苯酚、 洋地黄毒苷、4-羟基壬烯醛(HNE)、加贝酯、glossogyne tenuifolia、对苯 二酚、布洛芬、靛玉红-3′-肟、干扰素-α、甲氨蝶呤、单氯胺、甲磺酸卡 萘司他、夹竹桃苷、panduratin A、petrosaspongiolide M、肌醇六磷酸(肌 醇六磷酸)、前列腺素A1，20(S)-原人参萜三醇(人参皂苷代谢产物)、血根碱 (血根碱，1，3-甲基-[1，3]-苯并间二氧杂环戊烯-[5，6-c]-1，3-间二氧杂 环戊烯-4，5菲啶)、水飞蓟素、SOCS1、舒林酸、THI 52(1-萘基乙基-6，7- 二羟基-1，2，3，4-四氢异喹啉)、维纳啉酮、YopJ(被耶尔森菌包围的假结 核病)对乙酰氨基酚、α-促黑素细胞激素(α-MSH)、3′，8′-双-4′，5， 7-三羟(基)黄酮、桃叶珊瑚甙、β-拉帕醌、辣椒碱(8-甲基-N-香草基-6-壬 酰胺)、丙型肝炎病毒核心蛋白(HCV)、cyclolinteinone(海绵二倍半萜)、二 酰胺(酪氨酸磷酸酶抑制剂)、E-73(放线菌酮类似物)、依卡倍特钠、布洛芬 (3-甲基-1，6，8-三羟基蒽醌)、erbstatin(酪氨酸激酶抑制剂)、磷霉素、 真菌支霉菌素、加贝酯、染料木黄酮(酪氨酸激酶抑制剂)、格列美脲、硫酸 氨基葡萄糖、γ-glutamycysteine合成酶、次氯酸盐、isomallotochromanol、 异野梧桐色烯、K1L(痘苗病毒蛋白)、Kochiascoparia果(甲醇提取物)、来氟 米特代谢物(A771726)、losartin、LY294002[2-(4-吗啉基)-8-苯并色酮]、 5′-甲硫腺苷、U0126、pervanadate、苯胂氧化物(PAO，酪氨酸磷酸酶抑制 剂)、前列腺素15-脱氧-δ(12，14)-PGJ(2)、resiniferatoxin、倍半萜内酯 (银胶菊内酯、ergolide、愈创木内酯)、硫喷妥钠、TNP-470、富含甘油三酸 的脂蛋白、环氧苯醌A单体、Ro106-9920、conophylline MOL 294(小分子)、 大黄酸、芹菜苷配基(4′，5，7-三羟基黄酮)、二英、黄芪甙IV、阿伐他 汀、脱羟基甲基环氧醌霉素(DHMEQ)、15-脱氧精胍菌素、核液o，o′-二肉豆 蔻酰二硫硫胺(BMT)、烟酰胺、3-氨基苯甲酰胺、7-氨基-4-甲基香豆素、氨 吡酮、血管生成素-1、青蒿素、atrovasta、黄芩苷元(5，6，7-三羟基黄酮)、 苯磷硫胺胆绿素、双酚丙烷、campthothecin、caprofin、capsiate、梓甙、 7-(4′-羟基-3′-甲氧基苯基)-1-苯基七-4-烯-3-酮二芳基庚酸酯、DTD(4， 10-二氯吡啶并[5，6：4，5]噻吩并[3，2-d′：3，2-d]-1，2，3-二三嗪)、E3330(苯 醌衍生物)、环氧氢醌A、氟尼辛葡胺、氟比洛芬、己酮可可碱(1-(5′-氧代 己基)3，7-二甲基黄嘌呤，PTX)、6(5H)-phenanthridinone和苯甲酰胺、苯 基-N-叔丁基氧化氰(PBN)、甲苯吡啶酮、巯氧吡啶、雷索司特、雷巴米特、 利巴韦林、利福酰胺、eolipram、桑根酮C、SUN C8079、T-614、tyrphostin AG-126、APC0576、D609、盐酸环灵杆菌素、普仑司特、鞘氨醇半乳糖甙、喹 唑啉、白藜芦醇、R031-8220、saucerneol D和saucerneol E、曲尼司特[N-(3， 4-二甲氧基肉桂酰)维生素L]、3，4，5-三甲氧基-4′-氟查耳酮、雷公藤内 酯、美沙拉秦、17-烯丙基-17-二甲氧基格尔德霉素、6-氨基喹唑啉衍生物、 毛地黄黄酮、四硫钼酸盐、三亚麻油酸甘油酯、曲格列酮、渥曼青霉素和利 福平。
在具体实施例中，用于本发明的NF-kB通路抑制剂可以选自本领域周知 的各种NF-kB通路抑制剂，包括但不限于PDTC(吡咯烷二硫代氨基甲酸酯)、 SN50(Merck，H2N-Ala-Ala-Val-Ala-Leu-Leu-Pro-Ala-Val-Leu-Leu-Ala-Leu- Leu-Ala-Pro-Val-Gln-Arg-Lys-Arg-Gln-Lys-Leu-Met-Pro-OH)、 BAY-11-7082((E)3-[(4-甲基苯)磺酰]-2-丙烯腈，Sigma)、Parthenolide (一种特异性的IkB激酶(IKK)抑制剂)、堆心菊素(helenalin，一种选择 性的NF-κB抑制剂)、N-乙酰基-亮氨酰-亮氨酰-正亮氨酰-H(ALLN)、6- 氨基喹唑啉衍生物、3-羟基-24-去甲基-2-酮-1(10)，3，5，7-木栓四烯-29- 羧酸(南蛇藤醇)、咖啡酸苯乙基酯、7-甲氧基-5，11，12-三羟基-氧茚香豆素。
BAY-11-7082的结构式如下所示：
下列文献中记载了数种NF-κB抑制剂：C.Wahl等，J.Clin. Invest.101(5)，1163-1174(1998)；R.W.Sullivan等，J.Med.Chem.41， 413-419(1998)；J.W.Pierce等，J.Biol.Chem.272，21096-21103(1997)。 已知海洋天然产物hymenialdisine抑制NF-κB(Roshak，A.等，JPET，283， 955-961(1997)；Breton，J.J.和Chabot-Fletcher，M.C.，JPET， 282，459-466(1997))。
适用于本发明的NF-κB抑制剂还可参见CN99807572.8、CN99807571.X、 CN00814472.9、CN02803628.X、CN200780027179.8等所述的抑制剂。本文将 上述文献的全文以引用的方式纳入。
适用于本发明的NF-kB激动剂可选自LPS(位于革兰氏阴性细菌细胞壁的 外壁层的一类脂多糖类物质，它由类脂A、核心多糖和O-特异性多糖三部分 组成；O-特异性多糖的组成和结构的变化决定了革兰氏阴性细菌细胞表面抗 原决定簇的多样性)、PolyI:C(一种双链RNA类似物，分别由一条聚合的多 肌苷酸链和一条聚合的多胞嘧啶链配对而成，分子量随链的长短，大小不等； 短的一链在0.2-1kb之间，长的链在1.5-8kb之间)和Pam3CSK4(N-棕榈酰 基-S-[2，3-二(棕榈酰基氧基)-(2RS)-丙基]-[R]-半胱氨酰基-[S]-丝氨酰基 -[S]-赖氨酰基-[S]-赖氨酰基-[S]-赖氨酰基-[S]-赖氨酸·3HCl)。
适用于本发明的NF-kB激动剂还可选自MEKKI、NIK、IKK1、IKK2、TRAF2、 TRAF5、TRAF6、TAK、TPL-2或Rel B或其它NF-κB亚基如p65或cRel。更 多的NF-kB还可参见CN200610051522.X、CN200510112974.X等。
上述以及本领域周知的其它调控NF-kB的物质都可用于本发明。
本发明调控泵铁蛋白的表达的方法可在体外或体内实施。例如，当体外 实施时，可给予培养的细胞上述物质。
本发明也包括调控NF-kB通路的物质在制备调控泵铁蛋白表达用的药物 中的用途。
更具体而言，本发明包括调控NF-kB通路的物质在制备治疗与铁代谢直 接相关或间接相关的疾病中的用途。所述与铁代谢直接相关或间接相关的疾 病包括但不限于缺铁性贫血、血色病、血色病患者晚期并发的糖尿病或肿瘤、 铁代谢紊乱而加速或导致的神经系统疾病(如老年痴呆)、铁过载导致的机 体对细菌的易感性、各种癌症(例如乳腺癌)等。
可将上述物质配制成各种制剂，制剂中还可含有药学上可接受的载体或 赋形剂。“药学上可接受的”指载体可与本申请的药物一起给予个体，而不 会在个体体内引起不理想的生物反应，或与组合物中含有的任何其它成分进 行有害的相互作用。可使用的载体如水、盐水、甘油、聚乙二醇、透明质酸、 乙醇等。制剂中活性成分的量依实际的情况而定，这在本领域技术人员所掌 握的知识范围之内。
可将本发明的制剂配制成各种熟知的剂型，例如药片、胶囊、注射剂等， 并按常规的给药途径(例如口服、静脉注射等)给予。这些都在本领域技术 人员所掌握的知识范围之内。
在知晓通过调控NF-kB通路可调控泵铁蛋白的表达之后，本领域技术人 员将NF-kB通路作为筛选调控泵铁蛋白表达的靶点，从而进行药物筛选。更 具体地说，本发明提供一种药物筛选方法，用于筛选能够治疗上述与铁代谢 直接相关或间接相关的疾病，该方法包括使候选物质与培养的细胞接触，然 后检测细胞中NF-kB及泵铁蛋白的表达，其中，与对照相比，NF-kB的表达上 调、而泵铁蛋白的表达下降的物质，以及NF-kB的表达下调、而泵铁蛋白的 表达上升的物质都可作为治疗与铁代谢直接相关或间接相关的疾病的候选药 物。
在具体的实施方式中，本发明涉及一种筛选调控泵铁蛋白表达、或治疗 或预防与铁代谢直接相关或间接相关的疾病用的潜在物质的方法，其特征在 于，所述方法包括：
在测试组中，在表达NF-kB通路的体系中添加待筛选的候选物，并检测 NF-kB和泵铁蛋白的表达情况；并且，在对照组中，在不添加所述候选物的、 表达NF-kB通路的体系中，检测NF-kB通路和泵铁蛋白的表达情况；和
将步骤测试组中NF-kB和泵铁蛋白的表达情况与对照组中NF-kB和泵铁 蛋白的表达情况进行比较；
其中，与对照组相比，能引起NF-kB的表达上调而泵铁蛋白的表达下调、 或者NF-kB的表达下调而泵铁蛋白的表达上调的候选物为调控泵铁蛋白表达 或治疗或预防与铁代谢直接相关或间接相关的疾病用的潜在物质。
NF-kB在几乎所有细胞系中都存在。因此，可使用各种细胞系来实施上述 筛选方法。由于NF-kB抑制剂调控泵铁蛋白的表达，因此优选使用表达泵铁 蛋白的细胞系。表达泵铁蛋白比较高的细胞有巨噬细胞、小肠细胞(特别是 十二指肠基底层细胞)、肝细胞。
下文将以具体实施例的方式详细描述本发明。本发明的实施除非另外说 明，将使用本领域技术人员已知的化学、生物化学、和重组DNA技术常规方 法。这些技术在文献中有完整的解释。参见，A.L.Lehninger，《生物化学》 (Biochemistry)(Worth Publishers，Inc.最新版)；Sambrook等，《分子 克隆：实验室手册》(Molecular Cloning：a Laboratory Manual)，第二版， 1989。
应理解，本申请并不限于这些具体的实施方式。本领域技术人员在不偏 离本申请的精神和范围的情况下，可对本发明作出适当的改动。在没有明示 的情况下，所使用的试剂及其用量单位都是本领域常规的。
下述实施例使用到以下实验材料和方法。
1.1小鼠骨髓细胞的分离、培养与处理
从7-8周的小鼠大腿骨中分离骨髓细胞，吹散，用70μm的细胞筛(BD) 过滤，除去组织等杂质，300g，4℃离心10min，用条件培养基重悬细胞。条 件培养基成分：RPMI1640(Gibco)、20％FBS(Gibco)、30％L-cell Conditioned Medium、2mM谷氨酰胺、100μg/mL链霉素、100单位/mL青霉素(Gibco)。 培养皿用D-Poly-赖氨酸(Sigma)包被。细胞铺板，培养于37℃、5％CO2细 胞培养箱(Thermo)。用条件培养基分化，每隔一天换液，7天后骨髓细胞分 化成成熟的巨噬细胞。待细胞分化成熟，用100ng/mL脂多糖类(LPS)(Sigma)、 5ug/mL PolyI:C(Sigma)、0.5ug/mL Pam3CSK4(InvivoGen)、或NF-kB抑制 剂NF-kB SN-5050ug/mL(Merck)、10uM BAY11-7082(Sigma)刺激细胞，在 不同的时间点收取RNA和蛋白样品。
1.2MFE-WT、MEF-P65-KO细胞的培养与处理
MFE-WT细胞可从ATCC获得。
MEF-P65-KO细胞：从RelA(P65)基因敲除小鼠胚胎分离得到的细胞，该 RelA(P65)基因敲除小鼠的构建方法可参见Amer A.Beg等，Embryonic lethality and liver degeneration in mice lacking the RelA component of NF-kB.(1995)，Nature.376：167-170。所得小鼠RelA基因功能缺失。 从这种小鼠胚胎分离出的成纤维细胞就是MEF-P65-KO细胞，由于来自于胚胎， 这种细胞可以传代培养。P65的缺失抑制了NF-kB的活性，起到了NF-kB抑制 剂的作用。
细胞用DMEM(Gibco)、10％FBS、2mM谷氨酰胺、100μg/mL链霉素、 100units/mL青霉素培养。细胞培养于37℃、5％CO2细胞培养箱(Thermo)。 用100ng/mL LPS处理，在不同时间点收RNA样品。
1.3mRNA的抽提、反转和Real-time PCR检测基因的表达
用TRIZOL Reagent(Invitrogen)抽提细胞总RNA。DNase 37℃处理 30min，除去残余的DNA，加终止溶液(为Promega公司的DNA酶终止液)65 ℃处理10min，灭活DNase。用oligo(dT)18引物(Takara)和M-MLV反转录 酶(promega)反转成cDNA。用Real-time System(Bio-Rad)定量检测泵铁蛋 白的表达。iQTM SYBR Green Supermix(Bio-Rad)。基因的表达用相对定量的 方法，以beta-actin作为内参。
1.4Western Blot检测蛋白的表达
强RIPA裂解液裂解细胞(碧云天)，裂解前加入蛋白酶抑制剂PMSF和 Cocktail(Sigma)。所有操作冰上进行，超声破碎总共8秒，蛋白冻-80℃， 蛋白分装防止反复冻融。跑胶前加入上样缓冲液，混匀，直接上样，样品不 能加热变性。10％SDS PAGE胶分离泵铁蛋白，分子量大小约65kD。以 beta-actin(Sigma)作为内参。
实施例1：MEF-P65-KO细胞系中，泵铁蛋白表达上调
P65是活性NF-kB二聚体中的一个单体，含有核定位序列。P65缺失，导 致NF-kB信号通路受损。MEF-P65-KO细胞系是经过筛选的缺失突变的细胞株， 细胞中的P65缺失。将细胞铺于24孔板，用Trizol收集细胞，抽RNA，进行 反转，用Real-time PCR在检测泵铁蛋白的表达，实验发现，MEF-P65-KO细 胞系中的泵铁蛋白mRNA水平显著高于MEF-WT细胞系中的泵铁蛋白表达量 (图1)。实验说明NF-kB通路影响泵铁蛋白的表达。由于MEF细胞中的泵铁 蛋白表达量比较低，因此无法用Western Blot检测泵铁蛋白蛋白水平的变化， 只检测了mRNA水平。
实施例2：激活NF-kB下调泵铁蛋白的表达
为进一步验证NF-kB通路对泵铁蛋白表达的影响，实验用NF-kB的激活 剂刺激原代培养的巨噬细胞(原代培养的巨噬细胞，泵铁蛋白的表达量比较 高)。首先从8周大的野生型小鼠中分离骨髓细胞，然后用条件培养基分化 至第7天，将成熟的巨噬细胞铺到24孔板，每孔细胞5×105，分别用100ng/mL 的LPS(图2-A)、5ug/mL PolyI:C(图2-B)、0.5ug/mL Pam3CSK4(图2-C) 通过不同的通路来激活NF-kB信号通路，在0h、6h、12h收集细胞，分别用 Real-time和Western Blot检测泵铁蛋白的表达。
实验发现，NF-kB的激活剂，如LPS、PolyI:C、Pam3CSK4都可以在mRNA 和蛋白水平上下调泵铁蛋白的表达。结果进一步说明NF-kB通路影响泵铁蛋 白的表达。
实施例3：NF-kB抑制剂BAY11-7082、NF-kB SN-50上调泵铁蛋白的表 达
BAY11-7082是一种常用的NF-kB抑制剂，BAY11-7082可以抑制一些细胞 因子诱导的IkBα的磷酸化，从而抑制IkBα降解和随后的NF-k B核转运。 其最终的抑制效果来源于抑制了转录因子NF-kB进核，从而导致NF-kB调控 的基因或其下游基因表达受影响。
实验用NF-kB抑制剂BAY11-7082处理原代培养的巨噬细胞，泵铁蛋白的 mRNA和蛋白水平都上调(图3A、3B)。用BAY11-7082预处理原代培养的巨 噬细胞，然后用100ng/mL的LPS(NF-kB激活剂)刺激细胞，泵铁蛋白的下 调程度被削弱(图3A)。
NF-kB SN-50是含26个氨基酸的多肽，是肽段式的NF-kB抑制剂，其N 端含有K-FGF信号肽的疏水区，确保此抑制剂能穿过细胞膜进入细胞内发挥 作用，其C端含有NF-kB P50的核定位序列，通过干扰NF-kB进核，进而阻 断NF-kB通路。研究发现，用NF-kB SN-50预处理原代培养的巨噬细胞，然 后用LPS刺激细胞(下调泵铁蛋白的表达)，泵铁蛋白的下调被削弱(图3C)。 实验结果说明NF-kB抑制剂阻断NF-kB通路可以显著促进泵铁蛋白的表达。
虽然以具体实施例的方式描述了本申请，但是应理解，在不偏离本申请 的精神的情况下，可对本申请作出适当的变动和修改。这些都在本申请权利 要求所限定的保护范围之内。
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