化妆品组合物及组织培养的澳洲拉沃尔菊幼芽提取物的制造方法技术领域
本发明涉及一种化妆品组合物及其制造方法，具体涉及抗氧化、抗
炎及美白效果优异的包含组织培养的澳洲拉沃尔菊幼芽提取物的化妆
品组合物及其制造方法。
背景技术
皮肤具有保护身体免受外部刺激的功能。这种外部刺激即环境、物
理、化学因素与生理上的内部因素不仅降低皮肤功能，与正常皮肤相比，
对外部刺激引起皮肤炎症及如痣与斑痕之类的色素沉着性疾病，还降低
皮肤功能而成为皮肤老化的原因。
因此现在的化妆品开发处于不断寻找皮肤安全性优异、能够保护皮
肤免受各种因素影响的、抗炎、抗氧化及美白效果等能够改善并保护皮
肤的化妆品新材料的阶段。
在构成为了保护皮肤、美化清洁而开发的化妆品的成分中，代表性
的有增溶剂、乳化剂、防腐剂、香料、紫外线阻断剂、合成增粘剂等，
但是这些成分普遍被认为是皮肤炎症或痤疮等的诱发原因。另外，体内
生成的皮脂，汗及化妆品成分中的脂肪酸、蛋白质等可与皮肤中存在的
各种菌反应而诱发炎症。
人体内的活性氧由各种酶的反应而生成，对生理活性物质的生物合
成、免疫功能、药物代谢等起非常重要的作用。但如果不维持体内恒常
性，生成过量时，反而对人体有损伤。例如，自由基及活性氧类使细胞
膜脂质、蛋白质、核酸等人体物质氧化或变质，降低皮肤细胞的功能，
从而成为皮肤问题、炎症、皮肤老化的主要原因。
决定人体皮肤颜色的因素有很多种，其中重要的有黑色素细胞
(melanocyte)、皮肤厚度、血管的分布及人体内外的是否含有色素等
因素。尤其最重要的因素是在人体内的黑色素细胞中由酪氨酸酶等各种
酶作用生成的被称为黑色素的黑色色素。黑色素色素易通过由紫外线照
射之类的外部环境因素产生的痣、雀斑、色素沉着等皮肤色素异常沉着
症状等而形成。为了治疗或减轻过度的黑色素色素沉着，各种物质与化
妆品或药品配合使用。但是，由于美白效果的不充分、对皮肤的安全性
问题、化妆品配料时的剂型及稳定性问题等，其使用受到限制。
防止这些皮肤现象的同时保持健康美丽的皮肤的努力还在继续。最
近对皮肤改善的研究方向是开发无副作用、与人体亲和、能够与体质无
关地安心使用的利用植物提取物的材料。
通常，包含天然植物提取物的功能化妆品可以使用在植物能够生长
的热带雨林气候、亚寒带、寒带气候中生长的所有植物。植物适应各自
的气候，以该条件下的最佳生物机制生长。因此，即使是同种植物，按
照根据其生长的纬度的日照量、气温、降水量等和土壤酸度、肥沃度等
气候条件和不同季节、植物的不同部位，植物内部的2次代谢产物之类
的有效成分的种类与含量不同。不仅如此，很难克服供给难以满足制造，
加工费用多等缺点。为了改善这些各种困难，最近利用植物培养技术的
化妆品原料开发效果显著。
另一方面，菊科的野生草本植物澳洲拉沃尔菊(Raouliaaustralis)野
生生长在新西兰和澳大利亚。澳洲拉沃尔菊以垫子形式生长在易排水的
腐植质土壤上，由于耐寒性强，主要野生生长在高山地带的卵石、岩石
表面，一直使用为园林造景时的地被植物。澳洲拉沃尔菊含有的拉沃尔
酸(Raoulicacid)是由25个碳组成的萜系列的物质，研究表明其具有对
引起副鼻窦炎、中耳炎、慢性支气管炎、无菌性脑膜炎、急性胰腺炎、
心肌炎等的病毒的增殖抑制效果。
具有这些功效的澳洲拉沃尔菊在韩国国内由于地理位置和气候变
化而不宜栽培。虽然随着药效成分被认识，其需求增加，通过研究发现
各种功效，但是已知的对组织培养的澳洲拉沃尔菊幼芽的功效的科学实
验结果很少。另外，也没有任何应用为化妆品成分的研究结果的报告。
发明内容
本发明的目的在于，提供一种化妆品组合物及其制造方法，所述化
妆品组合物中包含抗氧化、抗炎及美白效果优异、且具有皮肤改善及皮
肤保护效果的组织培养的澳洲拉沃尔菊幼芽(tissueculturedRaoulia
australisshoots)的提取物。
本发明的目的不限于上述提及的目的，未提及的其他目的可以从下
述记载中明确地理解。
根据本发明的化妆品组合物，其特征在于，含有组织培养的澳洲拉
沃尔菊幼芽(tissue-culturedRaouliaaustralisshoots)提取物为有效成分。
在这里，相对于所述化妆品组合物总重量，优选以0.1～10重量％
的范围包含所述组织培养的澳洲拉沃尔菊幼芽提取物。
尤其，所述组织培养的澳洲拉沃尔菊幼芽提取物可以用选自纯净
水，C1～C4的醇、以及C1～C5的多元醇中的一种以上的溶剂提取组
织培养的澳洲拉沃尔菊幼芽而得到。
并且，根据本发明的化妆品组合物能够具有选自润肤露、柔肤水、
爽肤水、收敛水、乳液、牛奶乳液、营养乳液、按摩霜、营养霜、护手
霜、粉底霜、隔离霜、两用粉饼、睫毛膏、精华、营养精华、面膜、肥
皂、洁肤泡沫、洁肤露、洁肤霜、身体乳液和沐浴露中的剂型。
另外，根据本发明的组织培养的澳洲拉沃尔菊幼芽提取物的制造方
法，可以包括：(a)将组织培养的澳洲拉沃尔菊幼芽在选自纯净水、C1～
C4的醇、以及C1～C5的多元醇中的一种以上的提取溶剂中浸渍3～30
天而形成浸渍溶液的步骤；以及(b)过滤所述浸渍溶液而获得组织培
养的澳洲拉沃尔菊幼芽提取物的步骤。
在这里，所述提取溶剂可以使用选自乙醇、乙醇与1,3-丁二醇的混
合溶剂、乙醇与丙二醇的混合溶剂、以及乙醇与戊二醇的混合溶剂中的
任一种。
另外，相对于所述组织培养的澳洲拉沃尔菊幼芽重量，所述提取溶
剂优选具有10～20倍的重量比。
根据本发明的化妆品组合物包含组织培养的澳洲拉沃尔菊幼芽提
取物，不会刺激皮肤，具有优异的抗氧化、抗炎及美白效果，而且对皮
肤改善及皮肤保护非常有效。组织培养的澳洲拉沃尔菊幼芽(tissue
culturedRaouliaaustralisshoots)提取物保护皮肤不受各种外部刺激，使
皮肤柔滑润泽，而且显示出对皮肤功能改善的非常显著的效果。
具体实施方式
本发明可进行多种变更，并可具有多种实施例，例示出特定实施例，
并通过详细的说明对此进行详细说明。但是，这并不是将本发明限定在
特定的实施方式，应理解为包含在本发明的思想及技术范围内包含的所
有变更、均等物至替代物。
下面，对根据本发明的包含组织培养的澳洲拉沃尔菊幼芽(tissue
culturedRaouliaaustralisshoots)提取物的化妆品组合物进行说明。
本发明的发明人以对组织培养的澳洲拉沃尔菊幼芽(tissuecultured
Raouliaaustralisshoots)提取物的功效效果的评价为中心，继续对利用
植物培养技术的作为化妆品的应用可能性进行了研究，进而完成了本发
明。其结果，本发明的发明人明确了组织培养的澳洲拉沃尔菊幼芽(tissue
culturedRaouliaaustralisshoots)提取物保护皮肤不受各种外部刺激，使
皮肤柔滑润泽，而且对皮肤功能改善具有非常显著的效果。
相对于组合物的总重量，根据本发明的化妆品组合物优选以0.1～
10重量％的范围包含组织培养的澳洲拉沃尔菊幼芽的提取物。满足所述
范围就能显出有益性效果，即保护皮肤不受各种外部刺激，使皮肤柔滑
润泽，而且显示出有助于皮肤功能改善的效果。另外，考虑到最终产品
的提取物的固有气味、颜色等，最好包含为所述范围。
所述组织培养的澳洲拉沃尔菊幼芽的提取物优选使用选自纯净水、
C1～C4的醇、以及C1～C5的多元醇中的一种以上的溶剂对组织培养
的澳洲拉沃尔菊幼芽进行提取。
能够添加本发明的化妆品组合物的产品，例如有各种润肤露、柔肤
水、爽肤水、收敛水、乳液、牛奶乳液、营养乳液、按摩霜、营养霜、
护手霜、粉底霜、隔离霜、两用粉饼、睫毛膏、精华、营养精华、面膜、
肥皂、洁肤泡沫、洁肤露、洁肤霜、身体乳液和沐浴露等，但并不限定
于此。本发明的化妆品组合物被制造成所述形态的剂型时，能够含有对
该剂型的制剂化必需且适当的各种基质和添加物。另外，这些成分的种
类与量能够容易被本发明所属技术领域的技术人员选定。
下面，说明本发明的组织培养的澳洲拉沃尔菊幼芽提取物的制造方
法。
本发明包括：(a)将组织培养的澳洲拉沃尔菊幼芽在选自纯净水、
C1～C4的醇、以及C1～C5的多元醇中的一种以上的提取溶剂中浸渍
3～30天而形成浸渍溶液的步骤；以及(b)过滤所述浸渍溶液而获得
组织培养的澳洲拉沃尔菊幼芽提取物的步骤。
所述(a)步骤中使用的上述组织培养的澳洲拉沃尔菊幼芽优选为
干燥状态。而且所述(a)步骤的浸渍时间优选为10～20天。
相对于所述干燥的组织培养的澳洲拉沃尔菊幼芽的重量，所述提取
溶剂优选以10～20倍的重量比(w/w)使用。
所述C1～C4的醇可以是甲醇、乙醇、丙醇、丁醇等，特别优选为
乙醇(Ethylalcohol)。另外，所述C1～C5的多元醇优选为选自烷撑二
醇、1,3-丁二醇、丙二醇及戊二醇中的一种以上。
另外，所述提取溶剂为所述醇与烷撑二醇的混合溶剂时，其混合比
(w/w)优选为6:4～9:1(即，相对于醇和烷撑二醇的全部混合溶剂的总
重量，醇的含量优选为60～90重量％)。所述醇与烷撑二醇的混合溶剂
的含量在所述范围时，具有对仅提取所需有效成分更有效的极性。在这
里，所述醇与烷撑二醇的混合溶剂中使用的醇的浓度优选为60％～
100％。
另外，所述提取溶剂也可以为所述纯净水与所述烷撑二醇的混合溶
剂，其混合比优选为3:7～1:9(即，相对于纯净水和烷撑二醇的全部混
合溶剂的总重量，烷撑二醇的含量优选为70～90重量％)。
所述提取溶剂为单一溶剂时优选为乙醇。并且，提取溶剂为混合溶
剂时可以使用乙醇与烷撑二醇的混合溶剂，优选使用乙醇与1,3-丁二醇、
乙醇与丙二醇、或者乙醇与戊二醇的混合溶剂，更优选可以使用乙醇与
1,3-丁二醇的混合溶剂、或者乙醇与戊二醇的混合溶剂。
另外，所述(b)步骤优选进一步包括除去提取溶剂的步骤。
本发明提供包含由所述制造工序获得的组织培养的澳洲拉沃尔菊
幼芽提取物为有效成分的化妆品组合物。在这里，通过以下几个步骤来
确认根据本发明的组织培养的澳洲拉沃尔菊幼芽提取物的功效，其中，
包括：用所述组织培养的澳洲拉沃尔菊幼芽提取物对人成纤维细胞进行
处理，调查对皮肤刺激的细胞毒性效果的步骤；用所述组织培养的澳洲
拉沃尔菊幼芽提取物对人成纤维细胞进行处理，调查对外部刺激的细胞
保护效果的步骤；通过对所述组织培养的澳洲拉沃尔菊幼芽提取物进行
脂氧合酶(Lpoxgenase)活性抑制及氧化氮的生成抑制能力试验，调查抗
炎效果的步骤；通过过氧化物阴离子的(SUPEROXIDEANION)消除活
性及自由基(HYDROXYRADICAL)消除活性能力，调查抗氧化效果的
步骤；调查酪氨酸酶抑制带来的皮肤美白改善效果的步骤。
而且，根据本发明的化妆品组合物并不限于下面例示的剂型，能够
采用本技术领域所熟知的剂型。本发明的化妆品组合物能够在不损害本
发明的目的及效果的范围内在所述提取物中能够配合通常在化妆品中
配合的其他成分。
下面举出根据本发明的制造例、试验例及剂型例进行更具体的说
明，但这些只是为了例示本发明，本发明的范围并不限定于此。
[制造例1～制造例4、以及比较制造例1～比较制造例4]：组织培
养的澳洲拉沃尔菊幼芽提取物的制造
将组织培养的澳洲拉沃尔菊幼芽及天然澳洲拉沃尔菊分别水洗，用
纱布除去水后，干燥及切碎。在这里，本制造例中使用的“组织培养的
澳洲拉沃尔菊幼芽”是由忠北大学的尖端园艺技术开发研究中心提供
的，它是将从新西兰进口的澳洲拉沃尔菊种子在无菌条件下利用植物组
织培养技术诱导幼芽，以营养液培养而成的。
将准备好的组织培养的澳洲拉沃尔菊幼芽及澳洲拉沃尔菊在以表1
中记载的含量存在的混合溶剂中浸渍2周，进行熟化。其后以滤纸(日
本ToyoroshiKaisha,Ltd.销售的5C,185mm)过滤，蒸发乙醇，获得滤
液状的组织培养的澳洲拉沃尔菊幼芽提取物与澳洲拉沃尔菊提取物。
[表1]
![]()
(b1：70％乙醇/b2：1，3-丁二醇/b3：丙二醇)
[试验例1]组织培养的澳洲拉沃尔菊幼芽提取物的细胞毒性测定
通过对制造例1与比较制造例1的细胞毒性试验，评价了安全性。
[细胞培养(Cellculture)]
将从ATCC公司购入的CCD-1064sk人成纤维细胞在10cm细胞培
养皿中，以添加有10％胎牛血清(FBS)、1％青霉素-链霉素
(penicillin-streptomycin)的伊思柯夫改良培养液(Iscove'smodified
Dulbeco'smedium:IMDM)10ml为培养基进行培养，使得在37℃、
5％CO2培养器中细胞融合(confluency)70％～80％。培养基每周更换
2次，达到融合的细胞使用胰酶-EDTA(trypsin-EDTA)进行胰酶处理
(trypsinization)后，以传代培养维持。将所述培养的人成纤维细胞分别
以1×104细胞/孔分在96孔板(96-multiwellplate)上培养24小时。以
2％FBS培养基替换培养的细胞的培养基，以处理浓度分别用培养基稀
释制造例1的组织培养的澳洲拉沃尔菊幼芽提取物与比较制造例1的澳
洲拉沃尔菊提取物后，在CO2培养箱中培养48小时。
[试验例1-1]：细胞毒性效果的测定(MTT检测(assay))
将溶解于PBS(磷酸盐缓冲盐水(phosphatebufferedsaline))的
MTT保存(stock)溶液(5mg/ml)加入新的培养基中稀释10倍，将其溶液
分别添加100μl至放有结束培养的细胞的孔中，在37℃反应4小时。因
为反应后活着的细胞的线粒体中的脱氢酶而黄色水溶性基质
MTT[3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium-bromide
(3-(4,5-二甲基-2-噻唑基)-2,5-二苯基-2H-四氮唑![]()
溴化物)]还原为非
水溶性的MTT-甲![]()
(MTT-formazan)结晶，检测其量就能测定细胞的
存活率。除去培养上清液，在各孔中添加DMSO200μl来溶解细胞中生
成的MTT-甲![]()
晶体后，以吸收分光光度仪(UVmax,MolecularDevice,
USA)测定能够使甲![]()
的吸光度最大的测试滤光片(Testfilter)540nm波
长的O.D值与标准滤光片(Referencefilter)630nm波长的O.D值，以其
差值求出吸光度(参考文献TheEMBOJournal(2002)21,2407-2417外
多数)。细胞毒性以吸光度的百分比示出。
※细胞生存率(％)＝(试样处理组吸光度/无处理组吸光度)×100
以原始(Raw)数据为基础计算无处理组的吸光度与试样处理组的吸
光度的平均值，算出标准偏差。
[表2]
![]()
[试验例1-2]：细胞毒性效果的测定(中性红检测(NeutralRed
assay))
在培养结束的细胞的各孔中分别加入中性红(NeutralRed,
Sigma-Aldrich,USA)50μg/ml，反应3小时。中性红浓缩在完全存活的
细胞或没有损伤的细胞溶酶体内。反应后，以1.0％福尔马林/1.0％氯化
钾固定细胞，然后添加1.0％乙酸/50％乙醇溶液，提取中性红。将提取
的中性红利用吸收分光光度仪(UVmax,MolecularDevice,USA)测定在
540～630nm的各浓度细胞毒性值，并示于下述表3。细胞毒性以吸光度
的百分比示出，以3批(lot)实施3回。
※细胞生存率(％)＝(试样处理组吸光度/无处理组吸光度)×100
[表3]
![]()
以原始(Raw)数据为基础计算无处理组的吸光度与试样处理组的吸
光度的平均值，算出标准偏差。
如表2及表3所示，本发明的制造粒1的MTT50、NR50值在1％以
上，可知与比较制造例1相比是安全的原料。
[试验例2]：组织培养的澳洲拉沃尔菊提取物的细胞保护效果测定
进行对制造例1与比较制造例1的SDS(十二烷基硫酸钠(Sodium
dodecylsulfate))细胞毒性的细胞保护效果实验。
以添加有10％胎牛血清(FBS)、1％青霉素-链霉素的IMDM在37℃、
5％CO2培养器中培养人成纤维细胞。将培养的人成纤维细胞以1×104
细胞/孔分别分在96孔板中，培养24小时。以2％FBS培养基替换培养
的细胞的培养基，将SDS(Sodiumdodecylsulfate)0.002％预处理1个小
时后，以各自处理浓度分别以培养基稀释制造例1及比较制造例1，并
行处理后，在CO2培养箱中培养24小时。在新培养基中10倍稀释溶解
在PBS(phosphatebufferedsaline)中的MTT保存溶液(5mg/ml)，将其
溶液分别添加各100μl到已结束培养的细胞的各自孔中，在37℃反应4
小时。因为反应后活着的细胞的线粒体中的脱氢酶而黄色水溶性基质
MTT[3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium-bromide]还
原为非水溶性的MTT-甲![]()
(MTT-formazan)结晶，检测其量就能测定
细胞的存活率。除去培养上清液，在各孔中添加DMSO200μl来溶解细
胞中生成的MTT-甲![]()
晶体后，以吸收分光光度仪(UVmax,Molecular
Device,USA)测定能够使甲![]()
的吸光度最大的测试滤光片540nm波长的
O.D值与标准滤光片630nm波长的O.D值，以其差值求出吸光度。(参
考文献TheEMBOJournal(2002)21,2407-2417外多数)。细胞保护效
果以吸光度的百分比示出。
细胞生存率(％)＝(试样处理组吸光度/无处理组吸光度)×100
以原始(Raw)数据为基础计算无处理组的吸光度与试样处理组的吸
光度的平均值，算出标准偏差。
[表4]
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如表4所示，可知，对于外部刺激，本发明的制造例1的细胞保护
效果与比较制造例1相比，更能促进细胞保护效果。
[试验例3]：组织培养的澳洲拉沃尔菊幼芽提取物的抗炎效果的测定
测定制造例1与比较制造例1对脂氧合酶活性和一氧化氮生成量而
进行抗炎效果实验。
炎症反应是人体为了维持恒常性，对外部刺激的生物防御反应。生
成刺激引起的炎症的酶的途径以脂氧合酶活性途径及环氧合酶
(cycloxygenase)活性途径为代表。脂氧合酶催化不饱和脂肪酸的氢过氧
化(hydroperoxidation)，生成脂肪过氧化氢(fattyhydroperoxides)，这些
物质再生成环氧化物(epoxide)、羟基、酮、醛等分解产物。脂氧合酶从
由亚麻酸(linolenicacid)生物合成的花生四烯酸(arachidonicacid)生成
与生物体内炎症反应或过敏等相关的多种化学介质(chemical
mediator)。因此，阻碍脂氧合酶的物质显出抑制与各种炎症反应或过敏
等相关的化学介质(chemicalmediators)的生成的结果。虽然由以炎症反
应为媒介的酶等的活性化而生成的一氧化氮(NO)在免疫反应中起重要
作用，但是过多的一氧化氮会引起炎症反应，给免疫体系带来异常。
[试验例3-1]：氧化氮的生成抑制能力的测定
氧化氮(NO)的生成程度以格林等的方法(GreenLC,WagnerDA,
GlogowskiJ,etal.1982.Analysisofnitrate,nitrite,and[15N]nitratein
biologicalfluids.AnalBiochem126:131-138.)测定作为氧化氮(NO)生
成指标的培养基中生成的硝酸盐的量，进行分析。即，处理试样，培养
30分钟后，添加LPS(lipopolysaccharide,1μg/mL)，培养24小时而得
到Raw264.7巨噬细胞培养液，在该Raw264.7巨噬细胞培养液的100μL
培养基上清液中添加50μL的1％磺胺(溶解在5％磷酸(phosphoricacid)
中的磺胺(sulphanilamide))与50μL的0.1％萘二胺二盐酸盐
(naphthylenediaminedihydrochloride)，在室温反应10分钟后，在540nm
测定吸光度。用于所述抗炎活性效果试验的对照组采用了单独处理LPS
的实验组。
※NO抑制率(％)＝(对照组的NO量-各提取物的NO量/对照组的
NO量)×100
以原始(Raw)数据为基础计算平均值，求出标准偏差。
[表5]
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LPS引起的氧化应激中发生的NO的生成抑制能力如所述表5所示
的结果那样，制造例1与比较制造例1相比，显示出约1.5～2倍的NO
生成抑制效果。
[试验例3-2]：测定脂氧合酶(Lipoxygenase)的活性抑制
实施作为对外部刺激的炎症生成因素的代表性的酶的脂氧合酶的
活性抑制试验。向1mM亚麻酸(Sigma-aldrich,USA)1ml中混合待测试
样0.1ml与脂氧合酶(Sigma-aldrich,USA)0.9ml，进行涡震荡(voltexing)
后，在25℃反应10分钟。而后加入20％三氯乙酸(trichloroaceticacid)
0.5ml与0.6％硫代巴比妥酸(thiobarbituricacid)1ml，在热水中反应10
分钟后，在冰水中冷浸2-3分钟，加入丁醇(butanol)2ml，涡震荡20秒
以上后，以3500rpm离心分离5分钟，以UV分光光度计
(spectrophotometer)在513nm测定O.D值，根据下述数学式2算出脂
氧合酶的活性抑制率，在表6中示出。测定试验分3批(batch)实施
了3次，以原始(Raw)数据为基础计算吸光度的平均值，求出标准偏差。
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[表6]
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如表6所示，制造例1的组织培养的澳洲拉沃尔菊幼芽提取物与无
处理的对照组比较时，依赖浓度抑制脂氧合酶，能够确认与比较制造例
1相比，对引起炎症的酶的活性抑制效果更出色。
[试验例4]组织培养的澳洲拉沃尔菊幼芽提取物的抗氧化效果测定
实施了制造例1与比较制造例1的抗氧化效果试验。
[试验例4-1]DPPH(1,1-二苯基-2-苦基肼(1,1-diphenyl-2
picrylhydrazyl))自由基引起的抗羟基自由基活性(％)测定
活性氧引起的反应几乎大部分是自由基反应，包含自动氧化反应过
程。在生物体内抗氧化剂负责阻断自动氧化反应的作用。作为给电子能
力的还原能力越强，越能成为强抗氧化剂。测定抗氧化剂的还原能力的
试剂有1,1-二苯-2-苦基肼(1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl:DPPH)自由
基。DPPH在化合物内以氮为中心的稳定结构的自由基形态存在。在
517nm显示最大吸收，被还原后517nm的吸收消失。将DPPH(D9132,
SIGMA)溶解于乙醇与蒸馏水的6:4(v/v)的混合溶剂中，调整所述DPPH
溶液使其在513nm的吸光度为0.6左右。根据浓度稀释的试样1ml中分
别添加DPPH溶液2ml，进行混合。常温下放置约1个小时后，使用吸
收分光光度仪(UVmax,MolecularDevice,USA)测定513nm的吸光度，
将其结果示于表7。
[表7]
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如表7所示，制造例1显示出了优异的抗氧化效果。
[试验例4-2]：ABTS自由基引起的抗-羟基自由基活性(％)测定
利用米勒[Milleretal.(1993)]的方法测定提取物的总抗氧化能力。以
7mM的浓度将2,2'-连氮基-双(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸酯)
(2,2'-Azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonate))溶于蒸馏水，向
其中以最终浓度为2.45mM的方式添加过硫酸钾(Potassiumpersulfate)
制成ABTS阳离子(cation)自由基。将ABTS与过硫酸钾等量混合，室
温放置在暗处12小时后，在乙醇(ethanol)中稀释此溶液，调整至其在
734nm的吸光度为0.7。混合植物提取物试样10μl、ABTS溶液(Solution)
190μl、蒸馏水50μl，6分钟后在分光光度计(spectrophotometer)734nm
测定吸光度，以百分比(％)求出吸光度差异，将其结果示于表8。
消除率(％)＝(B-A)/B×100
(B：提取物非添加组的吸光度，A：提取物添加组的吸光度)
[表8]
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如表8所示，根据本发明的组织培养的澳洲拉沃尔菊提取物(制造
例1)比比较制造例1显示出更好的抗氧化效果。
[试验例5]：组织培养的澳洲拉沃尔菊幼芽提取物的酪氨酸酶活性及
黑色素合成抑制效果测定。
[试验例5-1]酪氨酸酶活性阻碍试验
为了调查制造例1及比较制造例1的美白活性，进行了酪氨酸酶活
性阻碍试验。为了试验，以磷酸盐缓冲液(pH6.5)溶解蘑菇酪氨酸酶
(mushroomtyrosinase,T-3824,1530U/mg,Sigma)至1000U/ml作为酪氨
酸酶的酶液，以磷酸盐缓冲液(pH6.5)溶解L-酪氨酸(L-tyrosine,
45160-0410,Junseichemicalco.Ltd)至1.5mM作为基质液。
用缓冲液以不同浓度稀释制造例1及比较制造例1，准备了检测液。
加入检测液170μl、酪氨酸酶的酶液10μl，在37℃放置10分钟。其中
加入基质液20μl后，在37℃反应10分钟后，立即在冰中放置5分钟，
然后利用吸收分光光度仪(UVmax,MolecularDevice,USA)测定波长
490nm的吸光度。将所述测定的吸光度代入下述数学式中，计算酪氨酸
酶的活性阻碍率，示于表9。替代检测液放入磷酸盐缓冲液(pH6.5)而制
造的液体作为空白试验液，替代基质液放入磷酸盐缓冲液(pH6.5)而制造
的液体作为修正液。
<数学式>
酪氨酸酶活性阻碍率(％)＝100-(A-A')/(B-B')×100
A：检测液反应后的吸光度
B：空白试验液反应后的吸光度
A'：检测液的修正液
B'：空白试验液的修正液
[表9]
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[试验例4-2]：根据组织培养的澳洲拉沃尔菊幼芽提取物浓度的黑色
素合成抑制测定实验
对制造例1及比较制造例1，利用B-16黑色素细胞(Melanomacell:
韩国细胞株银行)，测定美白效果。测定方法是将来源于黑鼠的B-16黑
色素细胞以含有10％FBS(GIBCO.,USA)的DMEM以2×104细胞/孔的
浓度各添加2ml至6孔组织培养皿，在5％CO2、37℃条件下培养24
小时。培养后除去培养基，以含有10％FBS、2uMa-MSH(Sigma.,USA,
黑素细胞刺激素(MelanocytestimulatingHormone))与2mM茶碱
(Sigma.,USA,theophylline)的DMEM替换后，分别添加以相同培养基
适当稀释的组织培养的澳洲拉沃尔菊幼芽提取物后，在5％CO2、37℃
条件下培养至细胞在孔底达到约80％以上。培养后除去培养基，然后以
PBS(Sigma.,USA,PhosphatebufferedSaline)洗涤，以胰酶处理后，回
收细胞。回收的细胞以5000rpm离心分离10分钟后除去上清液。除去
上清液的细胞在60℃恒温器中干燥24小时后，加入1NNaOH来溶解
细胞内的黑色素。利用吸收分光光度仪(Uvmax,MolecularDevice,USA)
在波长490nm测定溶解的黑色素的吸光度。
<数学式>
黑色素生成阻碍率(％)＝(1-A/A')×100
(A：试验组吸光度，A'：对照组吸光度)
[表10]
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如表9及表10所示，制造例1浓度依赖性地抑制酪氨酸酶的活性，
且比比较制造例1具有更优异的细胞内黑色素生成抑制效果。
[实施例1～实施例2]制造含有组织培养的澳洲拉沃尔菊幼芽提取物
的精华
根据下述表11的组成制造了包含制造例1的精华。
[表11]
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表11中，充分分散、润湿成分A，形成均匀的凝胶(Gel)状，添加B
进行中和。成分(A+B)中加入成分C，均匀搅拌溶解后，在室温中加
入成分D，搅拌使其均匀分布，盛入容器中完成产品化。
[实施例3～4]：制造包含组织培养的澳洲拉沃尔菊幼芽提取物的柔
润化妆水(皮肤)
包含制造例1的化妆品组合物中柔润化妆水(皮肤)的实施例如下
表12所示。
[表12]
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[实施例5～6]：制造包含组织培养的澳洲拉沃尔菊幼芽提取物的霜
包含制造例1的化妆品组合物中霜的处方例如下表13所示。
[表13]
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虽然现在为止对本发明的优选实施例进行了说明，但本发明所属技
术领域的技术人员能够在不超出本发明的本质特性的范围内实现变形
的形态。因此，这里说明的本发明的实施例不是限定的观点，而是从说
明的观点进行了考虑，本发明的范围体现在权利要求范围里，而不是在
所述说明里，应解释为本发明包含所有与其同等范围内的差异点。