胶原特异结合的单链抗体、其编码基因及应用技术领域
本发明涉及一种治疗性抗体，特别涉及一种具有胶原特异性结合能力的单链抗体、其制
备方法及在肿瘤治疗中的应用。
背景技术
胶原蛋白是细胞外基质的主要成分，在动物体内约30％都为胶原蛋白成分，胶原蛋白
在细胞的粘附、迁移、分化、增殖等过程中发挥着重要作用，大量研究表明，在肿瘤细胞发
生的部位相对于正常组织胶原蛋白过表达，胶原蛋白在肿瘤的发生和转移过程中为肿瘤细胞
提供信号转导、物理支架等。目前，针对肿瘤细胞表面靶点的药物越来越多的被发现和研究，
并且在体外实验中获得良好的肿瘤细胞的杀伤效果，但是在体内试验中由于肿瘤细胞表面过
表达的细胞外基质形成了保护肿瘤细胞的微环境，对肿瘤组织起到了保护作用。细胞外基质
成为了肿瘤药物到达肿瘤组织的障碍，大大降低了抗体药物或化学药物到达肿瘤组织的速度
和浓度，降低了药效。例如，胶原蛋白作为细胞外基质的主要成分成为了药物到达肿瘤部位
的一个屏障，但是，同时胶原蛋白也成为了肿瘤靶向治疗和制备靶向递送药物载体的重要的
新靶点。
为了提高药物在肿瘤组织的浓度，一般采用两种方法，其中第一种方法是：首先通过使
用促进胶原蛋白降解的药物促进肿瘤部位胶原的降解，进而使用针对肿瘤的药物进行治疗。
这种方法虽然证实是有效果的，但是靶向性较低，使用范围具有局限性；第二种方法是目前
使用较多的方法，使用针对细胞外基质的抗体与具有肿瘤治疗效果的蛋白或者是药物利用基
因工程方法改造或者化学交联后，利用抗体的特异性结合靶向递送药物到肿瘤外基质，形成
杀伤肿瘤细胞的微环境。但是，利用抗体分子靶向治疗肿瘤时，由于抗体分子量较大，过表
达的胶原造成肿瘤组织内压较高，同时实体瘤内部血管较少，抗体药物复合物穿透血管到达
肿瘤内部速度较慢，难以起到有效杀伤肿瘤的效果；并且由于在体内循环周期较长，容易引
起较大的免疫反应，副作用明显。
靶向性多肽的出现很好的弥补了抗体分子作为靶向治疗的缺点，多肽分子分子量较小、
结构简单通过化学合成易于获得、氨基酸序列易于分析大大降低了免疫原性，并且组织渗透
能力相对于大分子量的蛋白或者抗体要快很多。因此，利用靶向性多肽与治疗性药物结合成
为靶向治疗肿瘤或者细胞成像的新方法，从80年代起第一个靶向多肽开始在临床使用，截
止到目前已经有50多种靶向多肽被批准临床使用，500多种靶向多肽在临床前研究阶段。
西妥昔单抗(cetuximab，商品Erbitux)是抗人表皮生长因子(EGFR)的嵌合型IgG1单克隆
抗体，是鼠人嵌合的单克隆抗EFGR抗体，在两个重链上存在两个N-连接的糖基化位点，
分子量在152kD左右，它可以与EGFR受体胞外域高亲和力结合，从而竞争性拮抗配体与
EGFR的结合，封闭受体与配体的结合从而起到抑制配体介导的EGFR酪氨酸激酶的激活，
试验表明，肿瘤细胞或者肿瘤微环境中多种有EGFR信号介导的通路被阻断等，它于2004
年被美国食品药品管理局批准使用治疗直肠癌，2006年批准用于治疗头颈部肿瘤。但是此类
全长抗体因分子量较大，较难克服肿瘤内压，穿透血管到达肿瘤部位的速度较慢，同时由于
全长抗体在体内循环周期较长，容易引起较大的免疫反应，副作用明显；这些因素极大的降
低了全长抗体的治疗效果。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明的主要目的在于提供一种胶原特异结合的单链抗体，其主
要由胶原特异结合多肽CBD与西妥昔单抗的scFv功能区融合形成。
在一更为具体的实施方案之中，所述胶原特异结合的单链抗体(CBD-scFv)是由具有
SEQIDNO:1所示序列的基因编码形成。
本发明还提供了用以编码所述胶原特异结合的单链抗体的基因。
在一更为具体的实施方案之中，所述基因具有SEQIDNO:1所示序列。
本发明还提供了所述胶原特异结合的单链抗体及其编码基因的用途。
例如，作为其中的应用方案之一，本发明提供了一种含有用以编码胶原特异结合的单链
抗体的基因的表达盒、重组载体、重组菌或转基因细胞系。
又例如，作为其中的应用方案之一，本发明提供了所述胶原特异结合的单链抗体于制备
产品中的应用，并且所述产品至少具有下列功能中的一种：检测肿瘤细胞，辅助鉴定肿瘤细
胞，预防和/或治疗肿瘤，预防和/或治疗由肿瘤细胞诱发的疾病。
又例如，作为其中的应用方案之一，本发明提供了一种药物，其包含所述胶原特异结合
的单链抗体。
又例如，作为其中的应用方案之一，本发明提供了一种用于预防或治疗肿瘤的药物组合
物，其包含所述胶原特异结合的单链抗体和药学可接受的载体、稀释剂或赋形剂。
与现有技术相比，本发明的优点包括：利用酵母表达系统，通过基因工程方法将胶原结
合区(CBD，Collagenbindingdomain)多肽与西妥昔单抗(cetuximab)的功能区scFv
(single-chainantibodyfragment)融合表达，获得的CBD-scFv在酵母表达系统中上清表达，并
且通过体外实验和体内实验证明，CBD-scFv可以与胶原蛋白特异性结合，并且保留了
cetuximab与肿瘤细胞表面的EGFR结合能力以及对肿瘤细胞生长的抑制作用，在体内
CBD-scFv可以靶向性的在胶原富集的肿瘤发生部位聚集，并且相对于全长抗体cetuximab能
更快的靶向到肿瘤部位，在肿瘤靶向治疗和载药领域有良好应用前景。
附图说明
图1是CBD-scFv和NAT-scFv的基因克隆与质粒线性化的电泳图，其中1为NAT-scFv，
2为CBD-scFv，3为pPICZα-CBD-scFv，4为pPICZα-NAT-scFv；
图2a是CBD-scFv的构建模式图；
图2b是纯化后的CBD-scFv和NAT-scFv的聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)图；
图2c是CBD-scFv和NAT-scFv与胶原蛋白的结合释放曲线图；
图3a是CBD-scFv和NAT-scFv与A431细胞表面的EGFR受体的特异性结合的荧光显
微镜照片；
图3b是CBD-scFv和NAT-scFv与EGFR的结合的流式细胞仪检测曲线图，其中实线代
表阴性对照，虚线代表试验组；
图4是MTT法检测CBD-scFv和NAT-scFv对A431肿瘤细胞增殖影响的曲线图；
图5a是CBD-scFv和NAT-scFv对A431肿瘤细胞凋亡的流式细胞仪检测图；
图5b是CBD-scFv和NAT-scFv对A431肿瘤细胞凋亡的流式细胞仪检测的统计图；
图6a图6b分别是肿瘤组织的H&E和Masson染色照片；
图7是以流式细胞仪分析CBD-scFv、NAT-scFv和西妥昔在A431肿瘤部位存留的曲线
图；
图8a是CBD-scFv、NAT-scFv和西妥昔在A431肿瘤部位存留的免疫荧光照片；
图8b是CBD-scFv、NAT-scFv和西妥昔在A431肿瘤部位存留的免疫荧光照片的荧光平
均光密度值/面积统计图；
图9a是CBD-scFv、NAT-scFv和西妥昔治疗四周后肿瘤体积变化图；
图9b是CBD-scFv、NAT-scFv和西妥昔治疗四周后肿瘤的最终瘤重图；
图10a是CBD-scFv、NAT-scFv和西妥昔治疗四周后的肿瘤组织的免疫荧光染色照片；
图10b是CBD-scFv、NAT-scFv和西妥昔治疗四周后的肿瘤组织的免疫荧光染色的平均
光密度值/面积的统计图。
具体实施方式
如前所述，鉴于现有技术存在诸多缺陷，本案发明人经长期研究和大量实践，制备了一
种具有胶原特异结合的单链抗体(CBD-scFv)，其中利用胶原特异结合多肽CBD与治疗性抗
体的功能区，例如cetuximab的scFv功能区融合表达，并优选采用酵母表达系统成功获得了
CBD-scFv融合抗体片段，该CBD-scFv在体外和体内均具有很好的胶原特异结合能力，并且
保持了与EGFR的结合能力和抗肿瘤的活性，CBD-scFv可以很快的在肿瘤发生部位富集，对
肿瘤细胞发挥杀伤作用。
以下结合附图及较佳实施例对本发明的技术方案作更为详尽的说明。
1、CBD-scFv在酵母菌中的高效表达与纯化
i、CBD-scFv表达载体的构建
CBD-scFv抗体的VL和VH链由苏州金维智生物科技有限公司合成。然后，利用overlap
PCR将CBD(TKKTLRT)、VL和VH拼接成CBD-scFv链，连接顺序如下：
XhoI+CBD+linker+VL+linker+VH+NotI。进一步的，CBD-scFv的编码基因序列(SEQIDNO:1)
如下：
CTCGAGAAGAGAGAGGCTGAAGCAACCAAGAAGACCTTACGCACAAGCGGTGGC
GGTGGCAGCGGCGGCGGCGGCAGTGGTGGTGGCGGTGATATCTTACTGACACAGAGCC
CGGTGATCCTGAGCGTTAGTCCTGGTGAGCGCGTGAGCTTCAGCTGCCGTGCCAGCCAG
AGCATCGGCACCAACATCCACTGGTACCAACAGCGCACAAACGGCAGTCCGCGCCTGC
TGATCAAGTATGCAAGCGAGAGCATCAGCGGCATCCCGAGCCGTTTTAGCGGTAGCGGC
AGCGGCACCGACTTTACCCTGAGCATCAACAGCGTGGAGAGCGAGGACATCGCCGACT
ACTACTGCCAGCAGAACAATAACTGGCCGACCACCTTCGGTGCGGGCACCAAACTGGA
GCTGAAAAGTGGCGGTGGTGGTAGTGGCGGTGGCGGTAGCGGTGGCGGCGGTCAGGTG
CAGCTGAAACAGAGCGGTCCGGGTCTGGTGCAGCCGAGTCAGAGTCTGAGCATCACCT
GCACCGTTAGCGGCTTCAGCCTGACCAACTATGGTGTGCACTGGGTTCGCCAGAGTCCT
GGCAAAGGCCTGGAGTGGCTGGGCGTTATCTGGAGCGGCGGTAACACCGACTACAACA
CCCCGTTCACCAGCCGCCTGAGTATCAACAAGGACAACAGCAAAAGTCAAGTGTTTTTC
AAGATGAACAGCCTGCAGAGCAACGACACCGCAATCTACTATTGTGCCCGCGCACTGAC
CTACTACGACTACGAGTTCGCCTACTGGGGTCAGGGTACACTGGTGACCGTGAGTGCAG
CGGCCGC。
通过双酶切将CBD-scFv放入pPICZα-B(Invitrogen)，连接产物转化大肠杆菌，涂布于
LB低盐平板(50μg/mLZeocin)获得的阳性菌落通过测序确认克隆正确，鉴定正确的质粒抽
提质粒(参阅图1)。
ii、CBD-scFv表达载体的转化、鉴定和筛选
按照Invitrogen的操作手册(Invitrogen,Catalogno.V175–20)，准备酵母菌GS115，将10
μgpPICZα-B-CBD-scFv采用SacI进行线性化(请继续参阅图1)，按照酵母表达操作手册
(Invitrogen),准备对数期生长的酵母菌GS115，使用电转化的方法(Bio-Rad)将线性化的
pPICZα-B-CBD-scFv转化到酵母菌中，将转化液铺于YPDS琼脂平皿培养基(1％酵母提取物，
2％蛋白胨,2％葡萄糖,1M山梨醇,2％琼脂,100μg/mLZeocin抗生素)，pPICZα-B空质粒
采用相同方法线性化，转化酵母菌作为空对照。30℃倒置培养5-6天，直到平板上长出大小
可见的菌落克隆，将YPDS平板上正常生长的菌落，采用通用引物：
5’AOX1(5’-GACTGGTTCCAATTGACAAGC)，以及，
3’AOX1(5’-GCAAATGGCATTCTGACATCC)进行鉴定，在含有Zeocin抗生素的YPDS平
板上正常生长并通过PCR鉴定确定阳性的菌落标记为Mut+。
iii、CBD-scFv抗体片段在酵母菌中表达和纯化
挑取标记为Mut+的单菌落，置于装有50mLBMGY增殖培养基(1％酵母提取物,2％
蛋白胨,100mM磷酸钾缓冲液pH6.0,1.34％酵母无氮源培养基，4×10-5％生物素,1％甘
油)的500mL的摇瓶中，于28-30℃/250-300rpm培养至OD600＝2-6(16-18h)，室温下
1500g离心5min，收集菌体，用BMMY诱导培养基(BMGY加入0.5％甲醇替代甘油)
重悬菌体，使OD600＝1.0左右(约100-200mL)；将所得的菌液置于1L的摇瓶中，用双层
纱布或粗棉布封口，放置于28-30℃/250-300rpm的摇床上继续培养，每24h向培养基中
添加无水甲醇至终浓度0.5％。每24h取1mL置于1.5mLEP管中，最大转速离心2～3
min，分别收集上清和菌体，SDS-PAGE确定目的蛋白的表达量和菌液最佳收获时间。蛋白
分子量：30kD左右，确定表达量较高的菌种-80℃保存菌种，采用上述方法大量表达，表
达后菌液8000g，4℃高速离心20min，收集的菌液上清0.22μm滤膜过滤后，用分子量10
kDMilliporePellicon超滤膜堆浓缩到合适体积，将菌液上清透析到20mM磷酸钠缓冲液
(PH＝8.0)加0.5MNaCl中，通过AKTAprimeplus5.0系统利用镍柱亲和柱(His-Trap
affinitycolumns,GE)纯化。使用SDS-PAGE对纯化的抗体进行纯度分析，蛋白浓缩后0.22
μm滤膜除菌，分装，冻存到-80℃，使用BCA试剂盒(碧云天公司)对纯化后的抗体测定
浓度。可以获知，蛋白表达量为2mg/L左右。同时采用同样方法制备不含有CBD的scFv
片段标记为NAT-scFv。如图2b所示制备的抗体纯度均在90％以上。
2、CBD-scFv抗体片段体外功能鉴定
①、CBD-scFv与胶原的特异性结合
首先，使用100μL胶原(100μg/mL)包被96孔板，4℃过夜，吸除多余的胶原溶液，
预冷PBS洗3遍，然后超净台内晾干。将CBD-scFv和NAT-scFv按照0μM到10μM
的浓度梯度每孔加入100μL，4℃孵育过夜，次日吸去多余蛋白，使用预冷PBS洗剂5次，
洗去没有结合的蛋白，然后加入Anti-polyhistidine抗体(1:2000,Sigma)100μL,4℃孵育
2h,接着PBS洗5次后加入anti-mouseIgG-HRP(1:2000,Sigma)避光孵育30min，PBS洗
5次后，加入100μLTMB反应30min，最后加入1MH2SO4终止反应，使用分光光度计
450nm检测吸光度。结果使用GraphPadPrism5.0软件分析，绘制结合解离曲线。NAT-scFv
和CBD-scFv与胶原的结合能力的Kd值为1.58μM和0.21μM(图2c)，Kd值与结合能力
成反比，因此CBD-scFv与胶原的能力比NAT-scFv要强，具有胶原的特异结合能力，试验
结果表明CBD多肽与scFv的融合表达方式没有影响CBD与胶原结合位点的特异结合。
②、CBD-scFv抗体片段与A431细胞表面的EGFR受体的特异结合
将1×105A431细胞接种在48孔板中，37℃、5％CO2过夜培养，细胞贴壁后，弃去
上清培养基，PBS洗3次，加入CBD-scFv和NAT-scFv各100μL(1μg/mL)，4℃孵育1
h，PBS洗5次，然后加入anti-HismAb(1:2000,Sigma)100μL,4℃孵育2h,接着PBS
洗5次后加入anti-mouseIgG1-FITC(1:2000,Sigma)避光孵育30min。然后PBS洗5次
后，加入100μL西妥昔(1μg/mL)抗体作为阳性对照，不加scFv组为阴性对照，在荧光显
微镜(NIKON)下观察荧光结合情况。结果显示，1μg/mLCBD-scFv和NAT-scFv均可以与
细胞表面的EGFR受体结合，荧光强度与西妥昔相似(图3a)。
进一步的，通过流式细胞技术分析CBD-scFv抗体与细胞表面的EGFR受体的特异结
合，使用0.25％胰酶将A431细胞消化，PBS洗3次，细胞计数板计数，然后取1×106A431
细胞分别与100μL(1μg/mL)的CBD-scFv和NAT-scFv4℃孵育1h，然后加入anti-His
mAb(1:2000,Sigma)100μL,4℃孵育2h,接着PBS洗5次后加入anti-mouseIgG1-FITC
(1:2000,Sigma)避光孵育30min，然后PBS洗5次后，加入100μL西妥昔(1μg/mL)抗
体作为阳性对照，不加scFv组为阴性对照,使用流式细胞仪(C6，BDbiosciences)对处理
的细胞进行分析。结果显示：1μgCBD-scFv和NAT-scFv可以与细胞表面的EGFR受体完
全结合，阳性率100％，与阳性对照西妥昔结合率类似(图3b)。
通过荧光显微镜和流式细胞仪分析可知，CBD-scFv、NAT-scFv与西妥昔均可以与A431
细胞表面的EGFR结合，CBD-scFv融合表达后，没有影响scFv与A431细胞表面的
EGFR位点的结合功能。
③、MTT法检测CBD-scFv对A431肿瘤细胞增殖的影响
采用MTT法检测CBD-scFv对A431细胞增殖的影响，A431细胞按照1×105接种在
96孔板中，2h后，待细胞贴壁后，将原培养基吸弃，加入新鲜的培养基，分别加入含有0
μM,10-5μM,10-4μM,10-3μM,10-2μM,10-1μM不同浓度的CBD-scFv和NAT-scFv的培养
基，西妥昔组分别作为阳性对照，每个浓度5个重复，培养48小时后，按照MTT试剂盒
说明书(碧云天)每孔加入20μL5mg/mLMTT，37℃继续培养4h，弃去培养基，加入200
μLDMSO，摇床100rpm震荡10分钟，使用分光光度计检测490nm吸光度，结果使用
GraphPadPrism5.0软件分析，MTT结果显示，CBD-scFv和NAT-scFv在体外均可以抑制
A431肿瘤细胞的增殖，抑制率与西妥昔类似。IC50约为10-3μM(图4)
④、CBD-scFv对A431肿瘤细胞凋亡的分析
CBD-scFv对A431肿瘤细胞凋亡采用AnnexinV-FITCApoptosisDetectionKit(Cat.No
556571)进行分析，按照说明书操作如下：将细胞按照5×105个细胞/mL的密度种植在10-cm
的培养皿中，37℃、5％CO2过夜培养，细胞贴壁后，加入含有0.1μMCBD-scFv和NAT-scFv
的培养基，继续培养48小时，然后将细胞使用0.25％胰酶消化，预冷的PBS洗3次，细
胞计数后，调整细胞密度为：1×106细胞/mL，取100μL转移到5mL离心管中，加入5μL
AnnexinV和10μLPI，斡旋混匀，常温避光孵育15min，然后加入400μL1×BindingBuffer，
流式细胞仪分析结果，西妥昔组作为阳性对照，所有处理均重复5次。结果显示，CBD-scFv
和NAT-scFv均可以引起细胞凋亡，以早期凋亡为主，凋亡率比西妥昔稍弱。分别为：28.9％
±10.1％和29.5％±12.3％(图5a-图5b)。
3、CBD-scFv抗体片段在A431肿瘤动物模型中的功能鉴定
Ⅰ、A431肿瘤细胞动物模型的建立
NudeBALB/cmice(nu/nu)购买自南京斯科瑞动物有限公司，所有动物均采用6-8周龄
的雌鼠，初始体重为18-20g，所有动物均提前一周订购，在新的环境下饲养一周使其适应饲
养环境，培养的A431细胞在汇合度80％左右时，使用0.25％胰酶消化，PBS洗3遍，
最后使用PBS重悬，细胞计数板计数，每只裸鼠采用皮下注射在右下肢的背部种植5×106
个A431细胞/200μL，10天后待瘤大小直径8mm左右时，开始分组治疗。
Ⅱ、肿瘤部位的胶原富集的Masson染色
将肿瘤组织取材后4％多聚甲醛固定30min，然后将组织包埋在石蜡中，4μm切片使
用Masson’s染色试剂盒(北京索莱宝科技有限公司)进行组织染色，组织切片染色结果显示
在肿瘤细胞外基质中存在大量胶原(图6a-图6b)。同时使用H&E常规染色来表征肿瘤的生长
状态和细胞外基质。
Ⅲ、CBD-scFv在肿瘤发生部位的持续释放能力检测
参照文献报道西妥昔的给药量一次是1mg/450μL，换算成同样的摩尔浓度，分别采用
腹腔注射每组注射同样体积的15μMCBD-scFv,NAT-scFv和PBS，然后分别在2h,12h,
24h,48h,72h和96h,每组取材5只小鼠，将5只小鼠的肿瘤取下剪碎后使用
enzyme-freecelldissociationbuffer(LifeTechnologies)和0.03％collagenase(LifeTechnologies)
消化，消化的细胞过100目滤网后，细胞计数板计数，每组1×106个细胞按照以下步骤免
疫荧光染色：加入anti-HismAb(1:2000,Sigma)100μL,4℃孵育2h，接着PBS洗5次，
加入anti-mouseIgG1-FITC(1:2000,Sigma)避光孵育30min，然后PBS洗5次，加入200
μLPBS，流式细胞仪分析结果，结果显示(图7)，CBD-scFv和NAT-scFv均可以比西妥昔
更快的到达肿瘤发生部位，但是，CBD-scFv由于存在CBD的结构在肿瘤部位停留的时间
更长，48h后，NAT-scFv的结合率仅有18.4％，而CBD-scFv组在48h仍有56.8％，阳
性率与全长抗体西妥昔非常相似，同时，将相同时间点的肿瘤进行冰冻切片，通过免疫染色
确定CBD-scFv、NAT-scFv和西妥昔在肿瘤部位的是否存留，利用蛋白末端的HIS标签进
行检测，免疫荧光染色结果显示CBD-scFv存留时间比NAT-scFv时间更长，与西妥昔类似
(图8a-图8b)。试验结果表明：CBD-scFv可以特异的靶向肿瘤组织，并且穿透力比全长抗体
西妥昔要快，CBD增加了scFv在体内的存留时间，有效的增加了scFv的靶向性。
Ⅳ、CBD-scFv在肿瘤动物模型中长期治疗评价
在A431肿瘤动物模型中，当肿瘤大小在8mm左右时，将15μMCBD-scFv,NAT-scFv,
PBS和西妥昔每隔2天采用腹腔注射的方式对小鼠进行治疗，治疗周期为4周，每隔2天
使用游标卡尺记录肿瘤的直径，按照：V＝1/6×长直径×(短直径)2计算肿瘤体积，并且称量最
终的肿瘤重量(图9a-图9b)，CBD-scFv最终的瘤大小为：1231.67±46.59mm3，NAT-scFv最
终的瘤大小为：2033.58±39.17mm3，而对照组的最终的瘤大小为：2490.49±99.67mm3；对相
应的肿瘤组织进行冰冻切片，采用CD31(sc-53411,SANTACRUZ)、MIB-1(sc-101861,SANTA
CRUZ)和TUNEL(碧云天)分别进行免疫荧光显色，评价CBD-scFv、NAT-scFv、PBS和西
妥昔对肿瘤的治疗效果。试验结果表明(图10a-图10b)：肿瘤经4周治疗后，CBD-scFv能明
显抑制肿瘤的生长，血管CD31染色和细胞增殖原Ki67染色表明CBD-scFv显著低于
NAT-scFv组，TUNEL染色显示CBD-scFv组凋亡率显著高于NAT-scFv。试验结果表明：
CBD-scFv在体内能有效的靶向到肿瘤发生部位，抑制肿瘤增殖，引起肿瘤细胞的凋亡，并
且与西妥昔功能类似。
综上所述，本发明使用酵母表达系统成功表达了一种具有胶原特异结合能力的
CBD-EGFR-scFv抗体片段，在体外和体内试验中均表现出了较高的胶原特异结合能力，并
且在体内实验中由于分子量较小，比全长抗体的穿透能力更强，靶向性更好，在肿瘤动物模
型中表现出了良好抗肿瘤效果，在肿瘤靶向治疗和载药领域有良好应用前景。
需要说明的是，在本文中，术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性
的包含，从而使得包括一系列要素的过程、方法、物品或者设备不仅包括那些要素，而且还
包括没有明确列出的其他要素，或是还包括为这种过程、方法、物品或设备所固有的要素。
应当指出，以上所述仅是本发明的具体实施方式，对于本技术领域的普通技术人员来
说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为
本发明的保护范围。
<110>中国科学院苏州纳米技术与纳米仿生研究所
<120>胶原特异结合的单链抗体、其编码基因及应用
<160>3
<210>1
<211>821
<212>DNA
<213>人工序列
<400>1
CTCGAGAAGAGAGAGGCTGAAGCAACCAAGAAGACCTTACGCACAAGCGGTGGCGGTGGCAGCGGCGGCGGCGGCAGTGGTGGTGGCGGTGATATCTTACTGACACAGAGCCCGGTGATCCTGAGCGTTAGTCCTGGTGAGCGCGTGAGCTTCAGCTGCCGTGCCAGCCAGAGCATCGGCACCAACATCCACTGGTACCAACAGCGCACAAACGGCAGTCCGCGCCTGCTGATCAAGTATGCAAGCGAGAGCATCAGCGGCATCCCGAGCCGTTTTAGCGGTAGCGGCAGCGGCACCGACTTTACCCTGAGCATCAACAGCGTGGAGAGCGAGGACATCGCCGACTACTACTGCCAGCAGAACAATAACTGGCCGACCACCTTCGGTGCGGGCACCAAACTGGAGCTGAAAAGTGGCGGTGGTGGTAGTGGCGGTGGCGGTAGCGGTGGCGGCGGTCAGGTGCAGCTGAAACAGAGCGGTCCGGGTCTGGTGCAGCCGAGTCAGAGTCTGAGCATCACCTGCACCGTTAGCGGCTTCAGCCTGACCAACTATGGTGTGCACTGGGTTCGCCAGAGTCCTGGCAAAGGCCTGGAGTGGCTGGGCGTTATCTGGAGCGGCGGTAACACCGACTACAACACCCCGTTCACCAGCCGCCTGAGTATCAACAAGGACAACAGCAAAAGTCAAGTGTTTTTCAAGATGAACAGCCTGCAGAGCAACGACACCGCAATCTACTATTGTGCCCGCGCACTGACCTACTACGACTACGAGTTCGCCTACTGGGGTCAGGGTACACTGGTGACCGTGAGTGCAGCGGCCGC
<210>2
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<400>2
GACTGGTTCCAATTGACAAGC
<210>3
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<400>3
GCAAATGGCATTCTGACATCC