技术领域
本发明涉及一种预防柯萨奇病毒感染的疫苗。
背景技术
传统用于预防柯萨奇病毒(CVB)感染的疫苗有灭活疫苗和减毒活疫苗。灭 活疫苗在其灭活过程中出现抗原性减弱及重要表位丢失，使机体不能产生足够的 保护性免疫。减毒活疫苗接种后常常引起免疫抑制，减毒不充分可致临床病毒感 染，且活病毒疫苗有回复突变产生致病表型的可能，而过分减毒又造成疫苗效价 的降低，削弱其激发机体免疫的能力。新型CVB疫苗有亚单位疫苗和合成肽疫苗。 亚单位疫苗安全、无毒、副作用小，但免疫原性差。近年来把病毒的亚单位成分 通过DNA重组技术加以表达的疫苗，称为基因工程重组亚单位疫苗。基因工程疫 苗已被应用于临床。该疫苗的制备包括基因的分子克隆、表达和蛋白纯化过程， 其研制费用较高，技术难度较大且成功率低。常因诱发对载体自身的免疫反应而 不能重复使用。活重组疫苗亦有回复突变、造成免疫低下、宿主患病甚至死亡的 潜在危险。合成肽疫苗是根据需要有目的设计具有中和或保护性抗原的短肽作为 疫苗。但由于合成肽是一种直链结构，缺乏天然的三维空间结构，功能不同于天 然蛋白。另外合成的短肽分子很小，免疫原性较差。因此人们迫切希望找到新的 安全有效的疫苗。90年代人们开展了针对CVB特异性免疫防治的研究工作，包括 灭活疫苗、减毒活疫苗、亚单位疫苗及合成肽疫苗，通过动物实验接种，显示了 一定的免疫保护作用。但由于CVB有6个血清型，核酸具有感染性，因此研制灭活 疫苗、减毒活疫苗及亚单位疫苗十分困难。上述疫苗本身又有一定的缺陷，故一 直未有CVB的疫苗上市，人们迫切希望找到一种安全有效的新疫苗。近几年发展 起来的基因免疫(genetic immunization)技术为CVB疫苗的研制开辟了一条新途径。
发明内容
本发明的目的是针对现有CVB疫苗存在免疫原性差、安全性差的不足，提 供一种柯萨奇病毒B组3型基因疫苗，即防治柯萨奇病毒B组3型心肌炎的基 因疫苗。本发明的柯萨奇B3病毒(CVB3)基因疫苗是由CVB3编码主要中和 抗原的VP1基因和作为真核表达载体的质粒pCEP4组成的pCEP4-CVB3VP1质 粒。其主要优点为：免疫应答完整、持久，同种异株交叉保护，联合免疫，制备 简便，安全稳定，可重复使用。基因免疫通过直接给动物接种抗原蛋白编码基因 使动物获得对该抗原的免疫力，这种编码抗原蛋白的外源基因既是载体又是抗原 的来源，并具有疫苗的功能，因此被称为基因疫苗或核酸疫苗。基因疫苗的出现 为CVB感染的防治开辟了新的途径。基因疫苗又称核酸疫苗或DNA疫苗，由 病原体抗原编码基因和作为真核表达载体的质粒组成。抗原编码基因的表达产物 必须是病原体的有效成分，才可引发保护性免疫。与传统疫苗相比，本发明的基 因疫苗有下列优点：(1)直接DNA接种，避免了传统疫苗抗原制备纯化等繁琐 过程；(2)免疫应答完整持久，基因免疫时抗原多肽的递呈和自然感染时相似， 以天然构象被免疫系统识别，克服了其它疫苗抗原表位改变的缺点；(3)基因疫 苗具有共同的理化特征，可在同一质粒嵌合多种目的基因，形成联合免疫；(4) 基因疫苗制备简便，成本低，安全稳定，便于贮存和运输。
附图说明
图1为pCR2.1质粒结构图；图2为pCEP4质粒结构图；图3为CBV3VP1 基因的扩增图，其中A：Lamda DNA/Hind III(标记marker)，B：CVB3VP1(0.83 kb)；图4为pCR2.1-CVB3VP1用EcoR I酶切得片段图，A：φX174/Hae III，B： Lamda DNA/EcoR I+Hind III，C：pCR.21-CVB3VP1/EcoR I+Xba I用EcoR I+ Xba I酶切得片段图；图5为pCR2.1-CVB3VP1用Xba I酶切得片段图，A：Lamda DNA/EcoR I+Hind III，B：φX174/Hae III，C：pCR.21-CVB3VP1/Xba I；图6为 pCEP4-CVB3VP1经EcoR I，Xba I，and Nkp I酶切得片段图，其中A：Lamda DNA/Ecor I+Hind III(21.22，5.15，4.97，4.27，3.53，2.03，1.90，1.58，1.4，0.970.83， 0.56，0.12kb)，B：pCEP4-CVB3VP1/EcoR I，C：pCEP4-CVB3/Xba I，D： pCR2.1-CVB3VP1/Xba I，E：pCEP4/uncut；图7为pCR2.1-CVB3VP1和 pCEP4-CVB3VP1的PCR扩增图，A：Lamda DNA/EcoR I+Hind III，B： Amplification of pCEP4-CVB3VP1，C：Amplification of pCR2.1-CVB3VP1；图8 为pCEP4-CVB3VP1转染HeLa细胞图；图9为pCEP4-CVB3VP1接种组ELISA 试验检测小鼠血清中CVB3-IgM抗体对照图；图10为未接种疫苗的血清与等量 病毒混合细胞的HeLa细胞病变观察图；图11为接种pCEP4-CVB3VP1疫苗的 血清与等量病毒混合细胞的HeLa细胞病变观察图；图12为接种pCEP4的血清 与等量病毒混合细胞的HeLa细胞病变观察图；图13为接种病毒的血清与等量 病毒混合细胞的HeLa细胞病变观察图；图14为中和试验的细胞病变对照图； 图15为接种组和pCEP4接种组中和试验结果比较图；图16为pCEP4接种组小 鼠接种CVB3病毒后心脏病理检查图；图17为pCEP4-CVB3VP1接种组小鼠接 种CVB3病毒后心脏病理检查图，图18为pCEP4-CVB3VP1接种组小鼠接种 CVB3病毒后心脏轻微病理变化的检查图。
具体实施方式
具体实施方式一：本实施方式的CVB3基因疫苗是由CVB3编码主要中和抗 原的VP1基因和作为真核表达载体的质粒pCEP4组成的pCEP4-CVB3VP1质粒， pCEP4-CVB3VP1的基因序列参见后面的基因序列表。
具体实施方式二：本实施方式对本发明基因疫苗进行详细介绍。
一、所使用的材料有：
1.病毒：CVB3病毒株为我国标准毒株，由中国地方病中心克山病研究所 钟学宽教授惠赠。病毒在Vero细胞传代，TCID50为10-8。
2.载体、菌株：实验采用的载体包括pCR2.1和pCEP4，均为美国Invitrogen 公司产品。pCR2.1大小为3.9kb，是一个TA克隆载体，特别适合PCR产物克隆， 该载体含有Ptac启动子和LacZα基因，多克隆位点处于该基因中间，因此可以通 过兰白选择来初步筛选重组子。另外pCR2.1在多克隆位点两端具有M13 forward primer和M13 reverse primer，为克隆片段的测序提供了便利(见图1)。PCEP4 大小10.4kb，是真核表达载体，由CMV启动子启动外源基因表达，CMV启动 子是目前重组真核表达载体中最强的启动子，因此该载体被认为是一个高效表达 载体。pCEP4有潮霉素(Hygromycin)基因，可通过加入潮霉素对阳性重组子筛 选(见图2)。pCR2.1的宿主菌株为JM105，其基因型为endAl，thi，rpsL，sbcB15， hsdR4，Δ(lac-proAB)，[F′，traD36.proAB，lacIqZΔM15]。pCEP4的宿主菌株为 JM109，其基因型为endA1，recA1，gyrA96，thi，rpsL，hsdR17(rK-，mK+)，relA1， supE44，Δ(lac-proAB)，[F′，traD36.proAB，lacIqZΔM15]。
3.引物、试剂和酶：用于扩增CVB3VP1的引物是自行设计的两段长25个 碱基的寡核苷酸，委托美国CyberSyn公司合成。序列为：5′-AGG AAT TCA TGG AAGACGCGATAAC-3′(Upstream)，5′-TGT CTA GAT GCT TTG CCT AGT AGT G-3′(Downsteam)。上、下游引物的碱基组成分别为A＝10、G＝7、C＝4、 T＝4和A＝4、G＝7、C＝4、T＝10，退火温度均为66.7℃。上游引物5′端加了一个 EcoR I，下游引物5′端加了一个Xba I位点，以备以后克隆和鉴定之用。实验中 使用的AMV逆转录酶、Taq DNA聚合酶、T4DNA连接酶、限制性内切酶BamH I、Xho I、Xba I、EcoR I、Kpn I、Sal I、DNA分子量标准λ/EcoR I+Hind III、φX174/Hae III均为Promega产品。DNA转染脂质体DOSPER Liposome为德国Mannhein Beoringer公司产品。RNA提取试剂ISOGEN为日本株式会社ニツポンジ一ン产 品。质粒小量、大量提纯试剂为Promega公司的Wizard Minipreps Plasmid Purification Kit和Wizard Maxipreps Plasmid Purification Kit。免疫荧光检测用的羊 抗鼠IgG荧光标记抗体为中国军事医学科学院产品。
4.细胞、培养基：Vero细胞、HeLa细胞由哈尔滨医科大学微生物学教研室 提供，在含10％胎牛血清的Eagle′s MEM传代培养。
5.动物：实验用动物为纯系BALB/C小鼠，购自中国医学科学院动物学部。 实验时鼠龄为6～7星期，20±2g，雌雄各半。
6.CVB3IgM检测试剂：CVB3IgM ELISA检测试剂购自中国军事医学科学 院。
二、制取本发明pCEP4-CVB3VP1质粒的方法如下：
(一)CVB3RNA提取：将感染CVB3的Vero细胞(++++)冻融三次，取 0.2ml置于1.5ml微量离心管中，加入0.8ml ISOGEN，混匀，室温放置5min。 加入0.2ml氯仿，剧烈振摇30sec，室温放置3min。4℃12,000×g离心15min。 取上层水相，加入0.5ml异丙醇，-30℃15min。4℃12,000×g离心15min，去上 清，加入1ml 75％乙醇清洗沉淀，4℃10,000×g离心5min，收集沉淀，干燥， 加ddH2O 20μl重悬沉淀，-70℃保存。
(二)CVB3VP1的扩增：取0.5ml微量离心管加入如下成份：25mM MgCl24μl、10×AMV RT buffer 2μl、10mM dNTP 2μl、rRNasin 1μl、AMV逆转录酶 2μl、50pM下游引物0.5μl、RNA模板7μl、ddH2O 1μl。42℃作用60min进行 cDNA第一链合成，产物-20℃保存。取0.5ml微量离心管加入下述成份：CVB3 RNA逆转录产物10μl、10×Taq DNA聚合酶反应缓冲液4.5μl、25mM MgCl21μl、 10mM dNTP 2μl、50pM上游引物0.5μl、50pM下游引物0.4μl、Taq DNA Polymerase 1μl、ddH2O 1μl。94℃预处理5min，然后进行PCR循环(MJ PTC100)： 94℃30sec、60℃45sec、72℃1min，共35个循环，最后一次延伸时间延长7min。 取10μl扩增产物上1％琼脂糖凝胶电泳。其余-20℃保存。
(三)pCR2.1-CVB3VP1的构建：为了分离目的片段与小分子引物及引物合 聚体，将PCR扩增产物加至1％低熔点琼脂糖凝胶中，60V电泳30min，在UV 照射下将0.83kb片段回收。将回收凝胶置于5倍体积20mM Tris-HCl，pH8.0、1 mM EDTA溶液，65℃5min冷却至室温，加等体积饱和酚(pH8.0)剧烈振荡20 sec，4,000×g离心10min，收集上层水相。酚：氯仿抽提一次，氯仿：异戊醇抽 提一次，收集上层水相，加入1/10体积3M NaAc，pH7.0和等体积异丙醇，-20 ℃过夜。-10℃12,000×g离心15min，弃上清，用75％乙醇洗三次，干燥，加25 μl重悬DNA，终浓度约为0.1μg/μl。取经上述过程纯化的CVB3VP1DNA3μl 加至0.5ml微量离心管中：再加入0.025μg/μl pCR2.12μl、10×T4连接酶反应缓 冲液2μl、T4DNA连接酶1.5U、ddH2O 4.5μl。4℃反应16h。然后加至200μl 感受态JM105，冰浴30min，42℃90Sec，冰浴2min，加入800μlSOC培养基， 37℃孵育45min，接种至含氨苄青霉素的SOB平板，37℃培养18h～24h。转 化实验同时设JM105感受态菌对照。
(四)pCR2.1-CVB3VP1的筛选和鉴定：从转化菌平板中任选20个菌落， 接种于5ml含氨苄青霉素的LB培养基中，37℃摇振培养6h，取1ml菌粗提质 粒，1％琼脂糖电泳检查重组子的大小，作为初步筛选。将经初步筛选含与目 的重组质粒大小相近质粒的细菌接种于5ml含氨苄青霉素的LB培养基中过夜培 养。取出1.5ml细胞提取质粒，参照Sambrook等[156]介绍的方法，略加修改，简 言之，4℃12,000×g离心1min收集细胞，加入100μl冰浴预冷的25mM Tris-HCl， pH8.0、10mM EDTA，pH8.0、50mM葡萄糖溶液重悬细胞，室温放置5min，然 后加入200μl新鲜配制的0.2N NaOH、1％SDS溶液，颠倒数次，冰浴5min， 再加150μl冰冷KAc，pH4.8，颠倒混匀，冰浴5min。4℃12,000×g 5min，将上 清移至另一个微量离心管，加入2.5倍体积100％乙醇，-35℃5min。4℃12,000×g 离心，去上清，75％乙醇洗涤三次，干燥后加50μl含20μg/μl RNase A的ddH2O重悬DNA。取10μl上样测定波长260nm和280nm时的吸光度，获得纯度和浓 度。取4μl提取的pCR2.1-CVB3VP1，用Xba I和Xba I+EcoR I消化3h，1％ 琼脂糖凝胶电泳观察质粒的酶位点并判定片段插入方向。pCR2.1-CVB3VP1可被 Xba I成为应为3.9kb和0.83kb两个片段。如果被Xba I+EcoR I酶切后仍为3.9 kb和0.83kb两个片段，则CVB3VP1基因插入方向为正向，如果被Xba I+EcoR I酶切后为3.9kb、0.5kb、0.3kb三个片段，则VP1插入方向为反向。
(五)pCEP4-CVB3VP1的构建：取2μg pCR2.1-CVB3VP1和2μg pCEP4 分别同时用BamH I和Xha I两个酶切消化，获得两个互补粘端，低熔点琼脂糖 回收酶切后的pCR2.1-CVB3VP1/BamH I+Xho I和pCEP4/BamH I+Xho I。取 pCR2.1-CVB3VP1/BamH I+Xho I 3μl和pCEP4/BamH I+Xho I 2μl加至0.5ml 微量离心管中，加入10×T4连接酶反应缓冲液1μl、T4DNA连接酶1.5U、ddH2O3μl。4℃反应16h。然后加至200μl感受态JM109，冰浴30min，42℃90Sec， 冰浴2min，加入800μl SOC培养基，37℃孵育45min，接种至含氨苄青霉素的 SOB平板，37℃培养18h～24h。转化实验同时设pCEP4未切质粒转化、 pCEP4/BamH I+Xho I转化和JM109感受态菌对照。
(六)pCEP4-CVB3VP1的筛选和鉴定：粗提转化菌落，电泳观察重组质粒 大小，选择可能的菌落提纯质粒。经EcoR I、Sal I、Xba I、Kpn I等酶切，判断 重组子酶切位点和目的基因插入方向。方向正确的pCEP4-CVB3VP1经EcoR I 酶消化可切成4,884kb、2,482kb、2,480kb、0.6kb、0.39kb、0.3kb六个片段。 经Xba I消化可切成10kb、0.83kb、0.46kb三个片段。经Kpn I消化得到全长 线状pCEP4-CVB3VP1，大小为11.23kb。
(七)PCR扩增鉴定重组质粒：小量制备pCR2.1-CVB3VP1和 pCEP4-CVB3VP1，按方法(二)进行PCR，将15μl扩增产物上样到1％琼脂糖 凝胶电泳，UV灯下观察并照相。
(八)DNA序列测定：小量提纯pCR2.1-CVB3VP1和pCEP4-CVB3VP1。 两次酚：氯仿抽提，使A260/A280介于1.8至1.9间，将浓度调整至0.2μg/μl。测 序委托美国CyberSyn公司进行。pCR2.1-CVB3VP1的测序引物选用M13 fowrad primer(20)和M13 reverse primer分别测定两端序列。测序结果由计算机处 理获得插入片段的全序列。pCEP4-CVB3VP1测序目的是验证插入片段的序列 和方向正确与否，因此只测一侧序列。由于pCEP4本身没有为测序所用的通用 引物，因此在微机上用软件Oligo扫描pCEP4200bp至400bp间选择一段特异 序列作为测序引物，最终选择的引物序列为5′-ACC TCC CCC TGA ACC TGA AA-3′。
(九)pCEP4-CVB3VP1转染HeLa细胞：生长良好成层的HeLa细胞经0.02％ EDTA消化后，往培养瓶中放置一块小玻片，5％CO237℃培养过夜，细胞帖玻 片生长良好。微量精提pCEP4-CVB3VP1，使其纯度在A260/A280介于1.8和1.9 间。取经Hepes Buffer Saline(HBS，20mM Hepes、150mM NaCl，pH7.4)，pH7.0 稀释的DOSPER Liposome 3μg与1.5μgpCEP4-CVB3VP1混合，终体积为100 μl，室温放置15min，使DNA/DOSPER复合物形成。去除培养液，加入1ml 新的无血清MEM，然后将DNA/DOSPER复合物100μl滴加至细胞上，轻微旋 转细胞瓶使DNA/DOSPER复合物均匀混在细胞上。5％CO237℃培养6h。去除 含转染液的培养液，加入3ml新鲜无血清的MEM，5％CO237℃培养细胞48h。 冷丙酮固定30min。干燥后4℃保存待检。经0.05M PBS(pH7.2)1∶5稀释的 0.05ml含CVB3-IgG血清滴加至细胞上，37℃30min，水洗10min，滴加经0.05 M PBS 1∶5稀释的0.05ml兔抗鼠IgG荧光抗体，37℃作用30min，水洗10min， PBS洗5min。凉干。荧光显微镜(Olympus IM)下观察荧光标记细胞。
(十)大量提纯制备pCEP4-CVB3VP1和pCEP4：按Promega公司的Wizard Maxipreps Plasmid Purification Kit方法[157]进行，参照Sambrook等[156]的方法略加 修改。简言之，将pCEP4-CVB3VP1-JM109接种于10ml含氨苄青霉素的LB培 养基中37℃振摇培养过夜，然后再接种1000ml含氨苄青霉素的LB培养基，37 ℃过夜振摇培养。将500ml细菌室温5,000×g离心10min，去上清，用18ml细 胞重悬液(50mM Tris-HCl，pH7.5、10mM EDTA、100μg/ml RNaseA)重悬沉 淀。加入40ml细胞裂解液(0.2M NaOH、1％SDS)颠倒混匀，待细胞液变成 澄清，加入20ml中和液(1.32M醋酸钾，pH4.8)，轻摇混匀，14,000×g室温离 心15min。将上清大孔径滤膜过滤移至另一个离心管，加入2倍体积乙醇，-20 ℃20min，14,000×g离心15min，去上清，用2ml TE重悬DNA。将TE重悬的 DNA与10ml树脂(Maxipreps resin)混合，移液至层析柱(Wizard Maxicolumn)， 接上真空泵将液体抽干，加入25ml洗柱液(Column wash solution：80mM KAc、 8.3mM Tris-HCl，pH7.5、40μM EDTA、55％乙醇)，真空抽干。加入5ml 80％乙 醇清洗树脂，待乙醇抽干后，再继续抽真空2～3min。将层析柱插入50ml螺口 离心管中，吊蓝式转子1,300×g离心5min，取出柱，去除离心管和液体，将层 析柱接至真空泵抽真空5min使柱中树脂彻底干燥，将柱放入一个新的50ml螺 口离心管中，加入1.5ml 65℃预热的ddH2O，静置1min，吊蓝式转子1,300×g 离心5～10min，取出洗脱液，用0.2μm孔径滤膜过滤洗脱液。取10μl测定260 nm和280nm波长的吸光度，计算DNA样品的纯度和浓度。终产物-20℃保存待 用。
(十一)动物接种：将鼠龄为6～7星期、20±2g、雌雄各半的BALB/C小 鼠随机分成pCEP4-CVB3VP1接种组、pCEP4接种组、CVB3病毒接种组、正常 对照组，每组10只动物(图4)。将纯度为1.8A260/A280)的DNA样品用水稀 释至500μg/ml，每毫升DNA样品加入30.8μl 5M NaCl使其NaCl终浓度为0.9％。 对pCEP4-CVB3VP1接种组小鼠和pCEP4接种组小鼠，于双侧大腿内侧股四头 肌处各注射0.1mlDNA样品。用10-8TCID50/ml CVB356℃30min作用灭活病毒， 在相同部位接种CVB3病毒接种组小鼠，每只0.1ml。正常对照组在相同部位接 种等量的生理盐水。动物接种间隔一周重复进行，共接种三次，第三次接种时同 时断尾采血，以后每周采血一次。分离血清，56℃30min处理后-20℃保存待检。
(十二)CVB3-IgM ELISA试验：照ELISA试剂盒操作方法进行。简言之， 将2滴标本稀释液滴到包被孔中。将被检血清用生理盐水20倍稀释，取10μl 稀释后血清加至包被孔，混匀，设立阴、阳性对照孔，37℃作用40min。洗涤液 洗3次，甩干。加入1∶50稀释的酶标抗体0.1ml，37℃作用20min。洗涤液洗5 次。加入底物A和底物B各0.05ml。室温放置显色。待阳性对照显兰色后加入 终止液，灯光下观察被检孔结果并照相，然后用酶标仪(Bio-Rad 550)450nm 读取OD值，与空白对照孔校正。计算P/N值，P/N＝被检血清OD值/阴性对照 孔OD值，P/N≥2.1时为阳性，P/N＜2.1为阴性。
(十三)中和试验：将生长良好的HeLa细胞用0.02％EDTA消化后，加到 96孔微量培养板，0.1ml/孔。5％CO237℃培养过夜，待细胞呈80％成层时进行 测试。将pCEP4-CVB3VP1接种组、pCEP4接种组、病毒接种组和正常对照组小 鼠血清均进行1∶10、1∶20、1∶40、1∶80稀释，取25μl稀释后血清与25μl CVB3 病毒液(约为10-5 TCID50)混合。弃去细胞孔中的培养液，加入血清与病毒混 合液，再加入50μl无血清的MEM。同时设立病毒感染对照孔和正常对照孔。 5％CO237℃培养24～48h。待病毒对照孔细胞病变(Cytopathic effect，CPE)为 100％(++++)时，弃去培养液，加入0.1ml含0.2％MTT(Sigma)的MEM培 养4h，弃去MTT培养液，肉眼观察细胞染色情况并照相。加入150μl二甲基亚 砜(DMSO)37℃脱色15min，酶标仪490nm波长读数。对各组动物相同血清 稀释度的A490值进行t检验分析，以获得组间差异资料。
(十四)病毒攻击保护实验：将上述各接种组动物于第五周腹腔接种0.1ml CVB3病毒(约10-6 TCID50)，每间隔二天注射1次，共四次。引颈处死小鼠， 取心脏多聚甲醛固定一周，乙醇系列脱水，二甲苯系列透明，石腊包埋，切片， HE染色，镜下观察心肌改变并照相。心脏组织同时用戊二醛固定，超薄切片， 透射电镜观察照相。
三、结果：
(一)CVB3VP1的扩增、克隆：15μl PCR扩增产物上样至1％琼脂糖凝 胶上80V电泳30min结果见图3。在0.8kb处可见一条明亮的核酸区带，与理 论预期值一致。在泳道中无其他非特异扩增区带可见。CVB3VP1片段与pCR2.1 连接产物转化JM105后获得约300个菌落，JM105菌平板和线状pCR2.1转化平 板均无细菌生长。结果说明pCR2.1-CVB3VP1转化子带有重组质粒。从转化菌 平板中任选20个菌落，接种于5ml含氨苄青霉素的LB培养基中，37℃摇振培 养6h，取1ml菌粗提质粒，1％琼脂糖电泳检查重组子的大小，作为初步筛选。 发现重组质粒大小均在4.7kb左右。提纯其中第23号菌落质粒，分别取4μl质 粒用Xba I和Xba I+EcoR I消化3h，1％琼脂糖凝胶电泳观察质粒的酶位点并判 定片段插入方向。结果见图4、图5。pCR2.1-CVB3VP1可被Xba I成为应为3.9 kb和0.83kb两个片段，初步说明该质粒确为目的克隆。该重组质粒经Xba I+ EcoRI酶切后为3.9kb、0.5kb、0.3kb三个片段，说明VP1插入方向为反向。
(二)pCEP4-CVB3VP1的构建与鉴定：pCEP4-CVB3VP1转化JM109经过 夜培养后可见约150个菌落，而pCEP4未切质粒转化JM105平板长满菌落， pCEP4/BamH I+Xho I转化和JM109感受态菌对照均无菌落，说明转化结果良 好。任意选择pCEP4-CVB3VP1转化菌落5个粗提质粒，电泳观察重组质粒大小 约11kb，与理论预期值一致。进一步提纯质粒，经EcoR I酶消化可切成4,884kb、 2482kb、2,480kb、0.6kb、0.393kb、0.3kb六个片段。经Xba I消化可切成10kb、 0.83kb、0.46kb三个片段。经Kpn I消化得到全长线状pCEP4-CVB3VP1，大小 为11.23kb。初步证明重组质粒为携带CVB3VP1片段的pCEP4，且插入方向正 确(见图6)。
(三)PCR验证pCR2.1-CVB3VP1和pCEP4-CVB3VP1：将小量制备的 pCR2.1-CVB3VP1和pCEP4-CVB3VP1，按方法(二)进行PCR，结果见图7。 pCR2.1-CVB3VP1可扩增一条明亮的0.8kb片段和一条稍弱的3.9kb片段，分别 对应pCR2.1和CVB3VP1两个片段，结果正确。pCEP4-CVB3VP1可扩增出一 条明亮的VP1片段(0.8kb)和微弱的pCEP4质粒(10.4kb)，与预测结果一致。 pCEP4质粒较大，用扩增VP1的条件扩增该质粒效率应当非常低。
(四)DNA序列测定：DNA测序报告显示，每个反应至少可以清晰地读出 550个碱基峰值，说明酚：氯仿小量提纯获得的pCR2.1-CVB3VP1和 pCEP4-CVB3VP1DNA，在纯度上能满足测序的要求。pCR2.1-CVB3VP1的选用 M13fowrad primer(20)和M13reverse primer两个引物从两端测序，中间有约150 个碱基重叠。序列结果输入微机经Plasmid Primier 2.02分析，结果见基因序列表：
简写字母代表的氨基酸如下表
A：Ala F：Phe K：Lys P：Pro T：Thr -：Stop
C：Cys G：Cly L：Leu Q：Gln V：Val
D：Asp H：His M：Met R：Arg W：Trp
E：Glu I：Ile N：Asn S：Ser Y：Tyr 上排为CVB3国际标准株的序列(Klump WM等)。下排为本研究测序结果，第 三排为氨基酸序列，如国际标准株与中国标准株间氨基酸不一致，则将国际标准 株的氨基酸括在括号内。由于CVB3并没有一个特定的VP1读码框，VP1是由 一个大读码框编码的前蛋白质经水解后形成，因此在国际标准株序列中没有起始 密码ATG，下排的ATG是由本研究的引物人为设计的。从上面序列比较发现 CVB3中国标准株VP1与国际标准株之间存在55处核苷酸变异，大多数都发生 在三联密码的第三个碱基，未影响到氨基酸的编码，只有九处变异造成了氨基酸 编码改变。这些变异是第43个氨基酸由Cly变成Ser，第78个氨基酸由Lys变 成Glu，第79个氨基酸由Asn变成Thr，第90个氨基酸由Leu变成Val，第128 个氨基酸由Gln变成Arg，第165个氨基酸由Cly变成Leu，第169个氨基酸由 Glu变成Arg，第225个氨基酸由Cly变成Arg，第228个氨基酸由Lys变成Gln。 pCEP4-CVB3VP1测序目的是验证插入片段的序列和方向正确与否，因此只测一 侧序列。序列结果参见序列表。序列中划线部分为pCEP4，其余为CVB3VP1 基因和部分pCR2.1序列。此序列证明CVB3VP1以正确的方向克隆在pCEP4载 体上。
(五)pCEP4-CVB3VP1转染HeLa细胞：DNA/DOSPER复合物转染的HeLa 细胞经含CVB3-IgG血清作用，第二抗体羊抗鼠IgG荧光抗体检测，在荧光显微 镜(Olympus IM)下可见荧光标记细胞，荧光分布于细胞表面(图8)。未转染 细胞无荧光标记。此结果提示转染细胞表面存在CVB3抗原。
(六)pCEP4-CVB3VP1和pCEP4的大量制备和纯化：实验原定用Promega 公司的Wizard Maxipreps Plasmid Purification Kit进行，但预实验发现该批次一些 试剂不好，核酸产量和纯度均低。因此本研究对细胞裂解和核酸粗提步骤按 Sambrook等介绍的方法进行，对核酸层析纯化则用Wizard Maipreps Kit进行。 结果最终提纯的核酸pCEP4-CVB3VP1的纯度(A260/A280)为1.82，pCEP4的 纯度为1.87。pCEP4-CVB3VP1的浓度为0.4μg/μl，pCEP4的浓度为0.219μg/μl。 每1000ml细菌可收获约900μg。提纯的核酸经1％琼脂糖电泳证明不含染色体 DNA和RNA，酶切结果也正确。
(七)pCEP4-CVB3VP1体内表达的检测：pCEP4-CVB3VP1体内表达结果 本研究从三方面进行考察，即ELISA试验、病毒中和试验、病毒攻击保护实验。
(1)ELISA试验：被检血清加至包被孔作用40min，洗涤3次，加入酶标 抗体作用20min，洗涤5次，加入底物A和底物B，室温放置显色。待阳性对照 显兰色后加入终止液，灯光下观察被检孔结果如图9。上排10孔为 pCEP4-CVB3VP1接种组血清，下排第1孔至第8孔为pCEP4接种血清，第九孔 为阳性对照孔，第10孔为阴性对照孔。照片显示pCEP4-CVB3VP1接种组各均 为黄色，而对照组无色或色浅。提示pCEP4-CVB3VP1接种组中CVB3IgM阳性。 经酶标仪对上面各孔读数，结果如表1。从表1可以看出，pCEP4-CVB3VP1接 种小鼠血清与阴性对照孔相比P/N值均大小2.1，而pCEP4接种小鼠血清与阴性 对照孔相比P/N值均小于2.1。结果说明pCEP4-CVB3VP1接种小鼠可使小鼠体 内产生CVB3IgM，而单纯pCEP4质粒接种则不能产生该抗体。
表1ELISA试验检测pCEP4-CVB3VP1接种组产生CVB3IgM抗体 Group Microplate well 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 pCEP4- VP1 pCEP4 A450 P/N A450 P/N 0,186 3.79 0.073 1.65 0.129 3.58 0.076. 1.73 0.136 3.16 0.068 1.55 0.121 2.75 0.073 1.65 0.180 3.91 0.067 1.52 0.204 4.53 0.075 1.70 0.154 3.85 0.078 1.77 0.136 2.89 0.064 1.45 0.170 3.86 0.125 P 0.195 4.43 0.044 N
注：*N：阴性对照；P：阳性对照。
(2)病毒中和试验：将pCEP4-CVB3VP1接种组、pCEP4接种组、病毒接 种组和正常对照组小鼠血清均进行1∶10、1∶20、1∶40、1∶80稀释，然后与等量病 毒混合细胞，5％CO237℃培养24h时，病毒对照孔CPE为100％(++++)，此 时各孔CPE结果如表2和图10。经MTT染色，肉眼可以看出pCEP4-CVB3VP1 接种组与pCEP4接种组间存在明显差异(图14)。用DMSO脱色490nm波长读， 结果见表3。对中和试验各组用t检验分析比较，1∶10和1∶20稀释血清组 pCEP4-CVB3VP1与pCEP4接种小鼠间存在显著差异(p＜0.05)。1∶40和1∶80稀 释血清组pCEP4-CVB3VP1与pCEP4接种小鼠间存在极显著差异(p＜0.01)(图 15)。pCEP4-CVB3VP1接种组各稀释度组与灭活病毒免疫组间无显著差异 (p＞0.05)。pCEP4-CVB3VP1接种组各稀释度组与细胞板的病毒对照组间存在极 显著差异(p＜0.01)。pCEP4接种组各血清稀释组与细胞板病毒对照组无显著差 异(p＞0.05)，而与灭活病毒免疫组间存在显著差异(p＜0.05)。
表2.pCEP4-CVB3VP1接种组病毒中和试验结果 Group(dilution) Cytopathic effect 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 pCEP4-CVB3VP 1(1∶10) pCEP4-CVB3VP 1(1∶20) pCEP4-CVB3VP 1(1∶40) pCEP4-CVB3VP 1(1∶80) pCEP4(1∶10) pCEP4(1∶20) pCEP4(1∶40) pCEP4(1∶80) Killed virus(1∶10) Killed virus(1∶20) Killed virus(1∶40) Killed virus(1∶80) Normal(1∶10) + + ++ ++ +++ +++ + +++ + +++ + + + + ++ +++ + + + ++ ++ +++ +++ +++ + +++ + - + ++ ++ +++ - + + ++ +++ +++ +++ + +++ + + + + ++ +++ + + + ++ ++ +++ +++ + +++ + +++ + + + ++ +++ +++ + + ++ ++ +++ + +++ +++ + +++ + + - ++ ++ +++ + + ++ ++ +++ +++ +++ +++ + + + ++ ++ +++ + + + ++ ++ +++ +++ + +++ + +++ + + + + + +++ + + + ++ ++ +++ +++ +++ + +++ + + + ++ +++ +++ + + + ++ ++ +++ +++ +++ + +++ + + - + + +++ + + + ++ ++ +++ +++ + +++ + +++ + + + + ++ +++ +
注：*病毒对照孔细胞病变为100％，细胞控制组为阴性。
表3病毒实验结果 Serum(dilution) A490(X±SD) pCEP4-CVB3VP1(1∶10) pCEP4-CVB3VP1(1∶20) pCEP4-CVB3VP1(1∶40) 0.916±0.120 1.012±0.062 1.009±0.128 pCEP4-CVB3VP1(1∶80) pCEP4(1∶10) pCEP4(1∶20) pCEP4(1∶40) pCEP4(1∶80) 0.921±0.097 0.786±0.084 0.857±0.187 0.727±0.052 0.696±0.077
(3)病毒攻击保护实验：将各接种组动物于第5周开始反复腹腔接种CVB3 病毒。取心脏进行病理检查发现，pCEP4接种组和正常对照组小鼠心肌有明显病 变，表现为心肌间质高度扩张、充血，心肌细胞浆颗粒变性(心肌水肿)，间质 小血管炎性细胞附壁渗出，提示局部有炎症反应，但未见明显心肌细胞坏死，这 组小鼠心肌超微结构观察也可见细胞损伤，表现为肌丝溶解、线粒体增多、线粒 体出现空泡和水样变性(图16)。而pCEP4-CVB3VP1接种组小鼠的病理观察和 超微结构观察均未见明显心肌损伤，细胞结构完整(图17)。pCEP4-CVB3VP1 接种组有1例心肌出现轻度损伤，表现为心肌间质血管扩张、充血(图18)。
序列表
一、pCEP4-CVB3VP1的基因序列：
TCTAGAGTCGACCGGTCATGGCTGCGCCCCGACACCCGCCAACACCCGCTGACGCGCCCT
GACGGGCTTGTCTGCTCCCGGCATCCGCTTACAGACAAGCTGTGACCGTCTCCGGGAGCT
GCATGTGTCAGAGGTTTTCACCGTCATCACCGAAACGCGCGAGGCAGCCGGATCATAATC
AGCCATACCACATTTGTAGAGGTTTTACTTGCTTTAAAAAACCTCCCCACCTCCCCCTGA
ACCTGAAACATAAAATGAATGCAATTGTTGTTGTTAACTTGTTTATTGCAGCTTATAATG
GTTACAAATAAAGCAATAGCATCACAAATTTCACAAATAAAGCATTTTTTTCACTGCATT
CTAGTTGTGGTTTGTCCAAACTCATCAATGTATCTTATCATGTCTGGATCCACTAGTAAC
GGCCGCCAGTGTGCTGGAATTCGGCTTAGGAATTCATGGAAGACGCGATAACAGCCGCTA
TAGGGAGAGTTGCGGACACTGTGGGCACAGGGCCAACCAACTCAGAAGCTATACCAGCAC
TCACCGCAGCTGAGACGGGTCACACGTCACAAGTAGTTCCGAGCGACACCATGCAGACAC
GCCGCGTCAAGAACTACCACTCAAGGTCCGAGTCGACCATAGAGAACTTCCTATGTAGGT
CAGCATGCGTGTACTTTACGGAGTATGAAACCTCAGGTGCTAAGCGGTATGCTGAATGGG
TGGTAACACCACGACAAGCAGCACAACTTAGGAGAAAATTAGAGTTCTTTACTTACGTCC
GGTTCGACCTGGAACTGACGTTTGTCATAACAAGCACTCAACAGCCCTCCACCACACGGA
ACCAAGATGCACAGATCCTAACACACCAAATTATGTATGTACCACCAGGTGGACCAGTTC
CAGACAAAGTCGATTCATACGTGTGGCAAACATCTACAAATCCCAGTTTGTTTTGGACCC
GAGGGAACGCCCCACCGCGCATGTCTATACCGTTCTTAAGCATTGGCAACGCCTATTCAA
ATTTCTATGACGGGTGGTCTGAATTCTCCAGGAACGGAGTTTACGGTATCAACACACTAA
ATAACATGGGCACGCTATATGCAAGACACGTTAATGCCGGGAGCACGCGACCAATACAAA
GCACCACTAGAATCTACTTCAAACCAAAGCACGTCAAAGCGTGGATACCTAGACCACCTA
GACTCTGCCAGTACGAGAAAGCAAAGAACGTGAATTTCCAACCCAGTGGGGTTACCACTA
CTAGGCAAAGCATCTAGACAAAGCCGAATTCTGCAGATATCCATCACACTGGCGGCCGCT
CGAGCGGCCGCTAGCAAGCTTGCTAGCAGCTGGTACCCAGCTTCTAGAGATCTGACGGTT
CACTAAACGAGCTCTGCTTATATAGACCTCCCACCGTACACGCCTACCGCCCATTTGCGT
CAACGGGGCGGGGTTATTACGACATTTTGGAAAGTCCCGTTGATTTTGGTGCCAAAACAA
ACTCCCATTGACGTCAATGGGGTGGAGACTTGGAAATCCCCGTGAGTCAAACCGCTATCC
ACGCCCATTGGTGTACTGCCAAAACCGCATCACCATGGTAATAGCGATGACTAATACGTA
GATGTACTGCCAAGTAGGAAAGTCCCGTAAGGTCATGTACTGGGCATAATGCCAGGCGGG
CCATTTACCGTCATTGACGTCAATAGGGGGCGGACTTGGCATATGATACACTTGATGTAC
TGCCAAGTGGGCAGTTTACCGTAAATACTCCACCCATTGACGTCAATGGAAAGTCCCTAT
TGGCGTTACTATGGGAACATACGTCATTATTGACGTCAATGGGCGGGGGTCGTTGGGCGG
TCAGCCAGGCGGGCCATTTACCGTAAGTTATGTAACGCGGAACTCCATATATGGGCTATG
AACTAATGACCCCGTAATTGATTACTATTAATAACTAGTCAATAATCAATGTCAACATGG
CGGTCATATTGGACATGAGCCAATATAAATGTACATATTATGATATAGATACAACGTATG
CAATGGCCAATAGCCAATATTGATTTATGCTATATAACCAATGACTAATATGGCTAATTG
CCAATATTGATTCAATGTATAGATCTTCCATACCTACCAGTTCTGCGCCTGCAGCAATGC
AACAACGTTGCCCGGATCTGCGATGATAAGCTGTCAAACATGAGAATTGGTCGACTAGCT
TGGCACGCCAGAAATCCGCGCGGTGGTTTTTGGGGGTCGGGGGTGTTTGGCAGCCACAGA
CGCCCGGTGTTCGTGTCGCGCCAGTACATGCGGTCCATGCCCAGGCCATCCAAAAACCAT
GGGTCTGTCTGCTCAGTCCAGTCGTGGACCAGACCCCACGCAACGCCCAAAATAATAACC
CCCACGAACCATAAACCATTCCCCATGGGGGACCCCGTCCCTAACCCACGGGGCCAGTGG
CTATGGCAGGGCCTGCCGCCCCGACGTTGGCTGCGAGCCCTGGGCCTTCACCCGAACTTG
GGGGGTGGGGTGGGGAAAAGGAAGAAACGCGGGCGTATTGGCCCCAATGGGGTCTCGGTG
GGGTATCGACAGAGTGCCAGCCCTGGGACCGAACCCCGCGTTTATGAACAAACGACCCAA
CACCCGTGCGTTTTATTCTGTCTTTTTATTGCCGTCATAGCGCGGGTTCCTTCCGGTATT
GTCTCCTTCCGTGTTTCAGTTAGCCTCCCCCATCTCCCCTATTCCTTTGCCCTCGGACGA
GTGCTGGGGCGTCGGTTTCCACTATCGGCGAGTACTTCTACACAGCCATCGGTCCAGACG
GCCGCGCTTCTGCGGGCGATTTGTGTACGCCCGACAGTCCCGGCTCCGGATCGGACGATT
GCGTCGCATCGACCCTGCGCCCAAGCTGCATCATCGAAATTGCCGTCAACCAAGCTCTGA
TAGAGTTGGTCAAGACCAATGCGGAGCATATACGCCCGGAGCCGCGGCGATCCTGCAAGC
TCCGGATGCCTCCGCTCGAAGTAGCGCGTCTGCTGCTCCATACAAGCCAACCACGGCCTC
CAGAAGAAGATGTTGGCGACCTCGTATTGGGAATCCCCGAACATCGCCTCGCTCCAGTCA
ATGACCGCTGTTATGCGGCCATTGTCCGTCAGGACATTGTTGGAGCCGAAATCCGCGTGC
ACGAGGTGCCGGACTTCGGGGCAGTCCTCGGCCCAAAGCATCAGCTCATCGAGAGCCTGC
GCGACGGACGCACTGACGGTGTCGTCCATCACAGTTTGCCAGTGATACACATGGGGATCA
GCAATCGCGCATATGAAATCACGCCATGTAGTGTATTGACCGATTCCTTGCGGTCCGAAT
GGGCCGAACCCGCTCGTCTGGCTAAGATCGGCCGCAGCGATCGCATCCATGGCCTCCGCG
ACCGGCTGCAGAACAGCGGGCAGTTCGGTTTCAGGCAGGTCTTGCAACGTGACACCCTGT
GCACGGCGGGAGATGCAATAGGTCAGGCTCTCGCTGAATTCCCCAATGTCAAGCACTTCC
GGAATCGGGAGCGCGGCCGATGCAAAGTGCCGATAAACATAACGATCTTTGTAGAAACCA
TCGGCGCAGCTATTTACCCGCAGGACATATCCACGCCCTCCTACATCGAAGCTGAAAGCA
CGAGATTCTTCGCCCTCCGAGAGCTGCATCAGGTCGGAGACGCTGTCGAACTTTTCGATC
AGAAACTTCTCGACAGACGTCGCGGTGAGTTCAGGCTTTTTCATATCTCATTGCCCGGGA
TCTGCGGCACGCTGTTGACGCTGTTAAGCGGGTCGCTGCAGGGTCGCTCGGTGTTCGAGG
CCACACGCGTCACCTTAATATGCGAAGTGGACCTGGGACCGCGCCGCCCCGACTGCATCT
GCGTGTTCGAATTCGCCAATGACAAGACGCTGGGCGGGGTTTGTGTCATCATAGAACTAA
AGACATGCAAATATATTTCTTCCGGGGACACCGCCAGCAAACGCGAGCAACGGGCCACGG
GGATGAAGCAGGGCATGGCGGCCGACGCGCTGGGCTACGTCTTGCTGGCGTTCGCGACGC
GAGGCTGGATGGCCTTCCCCATTATGATTCTTCTCGCTTCCGGCGGCATCGGGATGCCCG
CGTTGCAGGCCATGCTGTCCAGGCAGGTAGATGACGACCATCAGGGACAGCTTCAAGGAT
CGCTCGCGGCTCTTACCAGCCTAACTTCGATCACTGGACCGCTGATCGTCACGGCGATTT
ATGCCGCCTCGGCGAGCACATGGAACGGGTTGGCATGGATTGTAGGCGCCGCCCTATACC
TTGTCTGCCTCCCCGCGTTGCGTCGCGGTGCATGGAGCCGGGCCACCTCGACCTGAATGG
AAGCCGGCGGCACCTCGCTAACGGATTCACCACTCCAAGAATTGGAGCCAATCAATTCTT
GCGGAGAACTGTGAATGCGCAAACCAACCCTTGGCAGAACATATCCATCGCGTCCGCCAT
CTCCAGCAGCCGCACGCGGCGCAGCAAAAGGCCAGGAACCGTAAAAAGGCCGCGTTGCTG
GCGTTTTTCCATAGGCTCCGCCCCCCTGACGAGCATCACAAAAATCGACGCTCAAGTCAG
AGGTGGCGAAACCCGACAGGACTATAAAGATACCAGGCGTTTCCCCCTGGAAGCTCCCTC
GTGCGCTCTCCTGTTCCGACCCTGCCGCTTACCGGATACCTGTCCGCCTTTCTCCCTTCG
GGAAGCGTGGCGCTTTCTCATAGCTCACGCTGTAGGTATCTCAGTTCGGTGTAGGTCGTT
CGCTCCAAGCTGGGCTGTGTGCACGAACCCCCCGTTCAGCCCGACCGCTGCGCCTTATCC
GGTAACTATCGTCTTGAGTCCAACCCGGTAAGACACGACTTATCGCCACTGGCAGCAGCC
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TGGCCTAACTACGGCTACACTAGAAGGACAGTATTTGGTATCTGCGCTCTGCTGAAGCCA
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GGTGGTTTTTTTGTTTGCAAGCAGCAGATTACGCGCAGAAAAAAAGGATCTCAAGAAGAT
CCTTTGATCTTTTCTACGGGGTCTGACGCTCAGTGGAACGAAAACTCACGTTAAGGGATT
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TTTAAATCAATCTAAAGTATATATGAGTAAACTTGGTCTGACAGTTACCAATGCTTAATC
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GCCGAGCGCAGAAGTGGTCCTGCAACTTTATCCGCCTCCATCCAGTCTATTAATTGTTGC
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GCAGGCATCGTGGTGTCACGCTCGTCGTTTGGTATGGCTTCATTCAGCTCCGGTTCCCAA
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CCTCCGATCGTTGTCAGAAGTAAGTTGGCCGCAGTGTTATCACTCATGGTTATGGCAGCA
CTGCATAATTCTCTTACTGTCATGCCATCCGTAAGATGCTTTTCTGTGACTGGTGAGTAC
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TCTTCGGGGCGAAAACTCTCAAGGATCTTACCGCTGTTGAGATCCAGTTCGATGTAACCC
ACTCGTGCACCCAACTGATCTTCAGCATCTTTTACTTTCACCAGCGTTTCTGGGTGAGCA
AAAACAGGAAGGCAAAATGCCGCAAAAAAGGGAATAAGGGCGACACGGAAATGTTGAATA
CTCATACTCTTCCTTTTTCAATATTATTGAAGCATTTATCAGGGTTATTGTCTCATGAGC
GGATACATATTTGAATGTATTTAGAAAAATAAACAAATAGGGGTTCCGCGCACATTTCCC
CGAAAAGTGCCACCTGACGTCTAAGAAACCATTATTATCATGACATTAACCTATAAAAAT
AGGCGTATCACGAGGCCCTTTCGTCTTCAAGAATTCTCATGTTTGACAGCTTATCATCGA
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CTGGTGACCTTGAAGAGGAAGAGGAGGGGTCCCGAGAATCCCCATCCCTACCGTCCAGCA
AAAAGGGGGACGAGGAATTTGAGGCCTGGCTTGAGGCTCAGGACGCAAATCTTGAGGATG
TTCAGCGGGAGTTTTCCGGGCTGCGAGTAATTGGTGATGAGGACGAGGATGGTTCGGAGG
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GGGCTGTTGGAGGGGGCAGGAGTCTGCACTCCCTGTATTCACTGAGCGTCGTCTAATAAA
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GGAAATGGCCTAGGAGAGAAGGGAGACACATCTGGACCAGAAGGCTCCGGCGGCAGTGGA
CCTCAAAGAAGAGGGGGTGATAACCATGGACGAGGACGGGGAAGAGGACGAGGACGAGGA
GGCGGAAGACCAGGAGCCCCGGGCGGCTCAGGATCAGGGCCAAGACATAGAGATGGTGTC
CGGAGACCCCAAAAACGTCCAAGTTGCATTGGCTGCAAAGGGACCCACGGTGGAACAGGA
GCAGGAGCAGGAGCGGGAGGGGCAGGAGCAGGAGGGGCAGGAGCAGGAGGAGGGGCAGGA
GCAGGAGGAGGGGCAGGAGGGGCAGGAGGGGCAGGAGGGGCAGGAGCAGGAGGAGGGGCA
GGAGCAGGAGGAGGGGCAGGAGGGGCAGGAGGGGCAGGAGCAGGAGGAGGGGCAGGAGCA
GGAGGAGGGGCAGGAGGGGCAGGAGCAGGAGGAGGGGCAGGAGGGGCAGGAGGGGCAGGA
GCAGGAGGAGGGGCAGGAGCAGGAGGAGGGGCAGGAGGGGCAGGAGCAGGAGGAGGGGCA
GGAGGGGCAGGAGGGGCAGGAGCAGGAGGAGGGGCAGGAGCAGGAGGGGCAGGAGGGGCA
GGAGGGGCAGGAGCAGGAGGGGCAGGAGCAGGAGGAGGGGCAGGAGGGGCAGGAGGGGCA
GGAGCAGGAGGGGCAGGAGCAGGAGGGGCAGGAGCAGGAGGGGCAGGAGCAGGAGGGGCA
GGAGGGGCAGGAGCAGGAGGGGCAGGAGGGGCAGGAGCAGGAGGGGCAGGAGGGGCAGGA
GCAGGAGGAGGGGCAGGAGGGGCAGGAGCAGGAGGAGGGGCAGGAGGGGCAGGAGCAGGA
GGGGCAGGAGGGGCAGGAGCAGGAGGGGCAGGAGGGGCAGGAGCAGGAGGGGCAGGAGGG
GCAGGAGCAGGAGGAGGGGCAGGAGCAGGAGGGGCAGGAGCAGGAGGTGGAGGCCGGGGT
CGAGGAGGCAGTGGAGGCCGGGGTCGAGGAGGTAGTGGAGGCCGGGGTCGAGGAGGTAGT
GGAGGCCGCCGGGGTAGAGGACGTGAAAGAGCCAGGGGGGGAAGTCGTGAAAGAGCCAGG
GGGAGAGGTCGTGGACGTGGAGAAAAGAGGCCCAGGAGTCCCAGTAGTCAGTCATCATCA
TCCGGGTCTCCACCGCGCAGGCCCCCTCCAGGTAGAAGGCCATTTTTCCACCCTGTAGGG
GAAGCCGATTATTTTGAATACCACCAAGAAGGTGGCCCAGATGGTGAGCCTGACGTGCCC
CCGGGAGCGATAGAGCAGGGCCCCGCAGATGACCCAGGAGAAGGCCCAAGCACTGGACCC
CGGGGTCAGGGTGATGGAGGCAGGCGCAAAAAAGGAGGGTGGTTTGGAAAGCATCGTGGT
CAAGGAGGTTCCAACCCGAAATTTGAGAACATTGCAGAAGGTTTAAGAGCTCTCCTGGCT
AGGAGTCACGTAGAAAGGACTACCGACGAAGGAACTTGGGTCGCCGGTGTGTTCGTATAT
GGAGGTAGTAAGACCTCCCTTTACAACCTAAGGCGAGGAACTGCCCTTGCTATTCCACAA
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CCTGGCCCGCTAAGGGAGTCCATTGTCTGTTATTTCATGGTCTTTTTACAAACTCATATA
TTTGCTGAGGTTTTGAAGGATGCGATTAAGGACCTTGTTATGACAAAGCCCGCTCCTACC
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CCACCTATGGTGGAAGGGGCTGCCGCGGAGGGTGATGACGGAGATGACGGAGATGAAGGA
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AATCGTATTAAAAGCCGTGTATTCCCCCGCACTAAAGAATAAATCCCCAGTAGACATCAT
GCGTGCTGTTGGTGTATTTCTGGCCATCTGTCTTGTCACCATTTTCGTCCTCCCAACATG
GGGCAATTGGGCATACCCATGTTGTCACGTCACTCAGCTCCGCGCTCAACACCTTCTCGC
GTTGGAAAACATTAGCGACATTTACCTGGTGAGCAATCAGACATGCGACGGCTTTAGCCT
GGCCTCCTTAAATTCACCTAAGAATGGGAGCAACCAGCATGCAGGAAAAGGACAAGCAGC
GAAAATTCACGCCCCCTTGGGAGGTGGCGGCATATGCAAAGGATAGCACTCCCACTCTAC
TACTGGGTATCATATGCTGACTGTATATGCATGAGGATAGCATATGCTACCCGGATACAG
ATTAGGATAGCATATACTACCCAGATATAGATTAGGATAGCATATGCTACCCAGATATAG
ATTAGGATAGCCTATGCTACCCAGATATAAATTAGGATAGCATATACTACCCAGATATAG
ATTAGGATAGCATATGCTACCCAGATATAGATTAGGATAGCCTATGCTACCCAGATATAG
ATTAGGATAGCATATGCTACCCAGATATAGATTAGGATAGCATATGCTATCCAGATATTT
GGGTAGTATATGCTACCCAGATATAAATTAGGATAGCATATACTACCCTAATCTCTATTA
GGATAGCATATGCTACCCGGATACAGATTAGGATAGCATATACTACCCAGATATAGATTA
GGATAGCATATGCTACCCAGATATAGATTAGGATAGCCTATGCTACCCAGATATAAATTA
GGATAGCATATACTACCCAGATATAGATTAGGATAGCATATGCTACCCAGATATAGATTA
GGATAGCCTATGCTACCCAGATATAGATTAGGATAGCATATGCTATCCAGATATTTGGGT
AGTATATGCTACCCATGGCAACATTAGCCCACCGTGCTCTCAGCGACCTCGTGAATATGA
GGACCAACAACCCTGTGCTTGGCGCTCAGGCGCAAGTGTGTGTAATTTGTCCTCCAGATC
GCAGCAATCGCGCCCCTATCTTGGCCCGCCCACCTACTTATGCAGGTATTCCCCGGGGTG
CCATTAGTGGTTTTGTGGGCAAGTGGTTTGACCGCAGTGGTTAGCGGGGTTACAATCAGC
CAAGTTATTACACCCTTATTTTACAGTCCAAAACCGCAGGGCGGCGTGTGGGGGCTGACG
CGTGCCCCCACTCCACAATTTCAAAAAAAAGAGTGGCCACTTGTCTTTGTTTATGGGCCC
CATTGGCGTGGAGCCCCGTTTAATTTTCGGGGGTGTTAGAGACAACCAGTGGAGTCCGCT
GCTGTCGGCGTCCACTCTCTTTCCCCTTGTTACAAATAGAGTGTAACAACATGGTTCACC
TGTCTTGGTCCCTGCCTGGGACACATCTTAATAACCCCAGTATCATATTGCACTAGGATT
ATGTGTTGCCCATAGCCATAAATTCGTGTGAGATGGACATCCAGTCTTTACGGCTTGTCC
CCACCCCATGGATTTCTATTGTTAAAGATATTCAGAATGTTTCATTCCTACACTAGTATT
TATTGCCCAAGGGGTTTGTGAGGGTTATATTGGTGTCATAGCACAATGCCACCACTGAAC
CCCCCGTCCAAATTTTATTCTGGGGGCGTCACCTGAAACCTTGTTTTCGAGCACCTCACA
TACACCTTACTGTTCACAACTCAGCAGTTATTCTATTAGCTAAACGAAGGAGAATGAAGA
AGCAGGCGAAGATTCAGGAGAGTTCACTGCCCGCTCCTTGATCTTCAGCCACTGCCCTTG
TGACTAAAATGGTTCACTACCCTCGTGGAATCCTGACCCCATGTAAATAAAACCGTGACA
GCTCATGGGGTGGGAGATATCGCTGTTCCTTAGGACCCTTTTACTAACCCTAATTCGATA
GCATATGCTTCCCGTTGGGTAACATATGCTATTGAATTAGGGTTAGTCTGGATAGTATAT
ACTACTACCCGGGAAGCATATGCTACCCGTTTAGGGTTAACAAGGGGGCCTTATAAACAC
TATTGCTAATGCCCTCTTGAGGGTCCGCTTATCGGTAGCTACACAGGCCCCTCTGATTGA
CGTTGGTGTAGCCTCCCGTAGTCTTCCTGGGCCCCTGGGAGGTACATGTCCCCCAGCATT
GGTGTAAGAGCTTCAGCCAAGAGTTACACATAAAGGCAATGTTGTGTTGCAGTCCACAGC
ATGCAAAGTCTGCTCCAGGATGAAAGCCACTCAGTGTTGGCAAATGTGCACATCCATTTA
TAAGGATGTCAACTACAGTCAGAGAACCCCTTTGTGTTTGGTCCCCCCCCGTGTCACATG
TGGAACAGGGCCCAGTTGGCAAGTTGTACCAACCAACTGAAGGGATTACATGCACTGCCC
CGAATACAAAACAAAAGCGCTCCTCGTACCAGCGAAGAAGGGGCAGAGATGCCGTAGTCA
GGTTTAGTTCGTCCGGCGGCGGGGC
二、上排为CVB3国际标准株的序列、中间排为本发明中CVB3序列、第 三排为氨基酸序列的序列对照
CBV3 VP1 (Klump，W.M.) GGCTTCCA GAACTTTCCA
Chinese CGAGCGGCCG CCAGTGTGAT GGATGTCTGC AGAATTCGGC TTAGGAATTC
+1 GTG GAA GAC GCG ATA ACA GCC GCT ATA GGG AGA GTT GCG GAT ACC GTG
ATG GAA GAC GCG ATA ACA GCC GCT ATA GGG AGA GTT GCG GAC ACT GTG
M E D A I T A A I G R V A D T V
49 GGT ACA GGG CCA ACC AAC TCA GAA GCT ATA CCA GCA CTC ACT GCT GCT
GGC ACA GGG CCA ACC AAC TCA GAA GCT ATA CCA GCA CTC ACC GCA GCT
G T G P T N S E A I P A L T A A
GAG ACG GGT CAC ACG TCA CAA GTA GTG CCG GGT GAC ACT ATG CAG ACA
97 GAG ACG GGT CAC ACG TCA CAA GTA GTT CCG AGC GAC ACC ATG CAG ACA
E T G H T S Q V V P S(G) D T M Q T
CGC CAC GTT AAG AAC TAC CAT TCA AGG TCC GAG TCA ACC ATA GAG AAC
145 CGC CGC GTC AAG AAC TAC CAC TCA AGG TCC GAG TCG ACC ATA GAG AAC
R R V K N Y H S R S E S T I E N
TTC CTA TGT AGG TCA GCA TGC GTG TAC TTT ACG GAG TAT AAA AAC TCA
193 TTC CTA TGT AGG TCA GCA TGC GTG TAC TTT ACG GAG TAT GAA ACC TCA
F L C R S A C V Y F T E Y E(K)T(N) S
GGT GCC AAG CGG TAT GCT GAA TGG GTA TTA ACA CCA CGA CAA GCA GCA
241 GGT GCT AAG CGG TAT GCT GAA TGG GTG GTA ACA CCA CGA CAA GCA GCA
G A K R Y A E W V V(L) T P R Q A A
CAA CTT AGG AGA AAG GTA GAA TTC TTT ACC TAC GTC CGG TTC GAC CTG
289 CAA CTT AGG AGA AAA TTA GAG TTC TTT ACT TAC GTC CGG TTC GAC CTG
Q L R R K L E F F T Y V R F D L
GAG CTG ACG TTT GTC ATA ACA AGT ACT CAA CAG CCC TCA ACC ACA CAG
337 GAA CTG ACG TTT GTC ATA ACA AGC ACT CAA CAG CCC TCC ACC ACA CGG
E L T F V I T S T Q Q P S T T R(Q)
AAC CAA GAT GCA CAG ATC CTA ACA CAC CAA ATT ATG TAT GTA CCA CCA
385 AAC CAA GAT GCA CAG ATC CTA ACA CAC CAA ATT ATG TAT GTA CCA CCA
N Q D A Q I L T H Q I M Y V P P
GGT GGA CCT GTA CCA GAT AAA GTT GAT TCA TAC GTG TGG CAA ACA TCT
GGT GGA CCA GTT CCA GAC AAA GTC GAT TCA TAC GTG TGG CAA ACA TCT
433 G G P V P D K V D S Y V W Q T S
ACG AAT CCC AGT GTG TTT TGG ACC GAG GGA AAC GCC CCG CCG CGC ATG
ACA AAT CCC AGT TTG TTT TGG ACC CGA GGG AAC GCC CCA CCG CGC ATG
481 T N P S L(G) F W T R(E) G N A P P R M
TCC ATA CCG TTT TTG AGC ATT GGC AAC GCC TAT TCA AAT TTC TAT GAC
TCT ATA CCG TTC TTA AGC ATT GGC AAC GCC TAT TCA AAT TTC TAT GAC
529 S I P F L S I G N A Y S N F Y D
GGA TGG TCT GAA TTT TCC AGG AAC GGA GTT TAC GGC ATC AAC ACG CTA
GGG TGG TCT GAA TTC TCC AGG AAC GGA GTT TAC GGT ATC AAC ACA CTA
577 G W S E F S R N G V Y G I N T L
AAC AAC ATG GGC ACG CTA TAT GCA AGA CAT GTC AAC GCT GGA AGC ACG
AAT AAC ATG GGC ACG CTA TAT GCA AGA CAC GTT AAT GCC GGG AGC ACG
625 N N M G T L Y A R H V N A G S T
GGT CCA ATA AAA AGC ACC ATT AGA ATC TAC TTC AAA CCG AAG CAT GTC
CGA CCA ATA CAA AGC ACC ACT AGA ATC TAC TTC AAA CCA AAG CAC GTC
673 R(G) P I Q(K) S T T R I Y F K P K H V
AAA GCG TGG ATA CCT AGA CCA CCT AGA CTC TGC CAA TAC GAG AAG GCA
AAA GCG TGG ATA CCT AGA CCA CCT AGA CTC TGC CAG TAC GAG AAA GCA
K A W I P R P P R L C Q Y E K A
721
AAG AAC GTG AAC TTC CAA CCC AGC GGA GTT ACC ACT ACT AGG CAA AGC
AAG AAC GTG AAT TTC CAA CCC AGT GGG GTT ACC ACT ACT AGG CAA AGC
K N V N F Q P S G V T T T R Q S
769
ATC TAG
ATC TAG ACAAAGCCGAA TTCCAGCACACT GGCGGCCGTT ACTAGTGGAT
I -
817
三、pCEP4-CVB3VP1测序序列：
1 GAATGCAATT GTTGTTGTTA ACTTGTTTAT TGCAGCTTAT AATGGTTACA
51 AATAAAGCAA TAGCATCACA AATTTCACAA ATAAAGCATT TTTTTCACTG
101 CATTCTAGTT GTGGTTTGTC CAAACTCATC AATGTATCTT ATCATGTCTG
151 GATCCACTAG TAACGGCCGC CAGTGTGCTG GAATTCGGCT TTGTCTAGAT
201 GCTTTGCCTA GTAGTGGTAA CCCCACTGGG TTGGAAATTC ACGTTCTTTG
251 CTTTCTCGTA CTGGCAGAGT CTAGGTGGTC TAGGTATCCA CGCTTTGACG
301 TGCTTTGGTT TGAAGTAGAT TCTAGTGGTG CTTTGTATTG GTCGCGTGCT
351 CCCGGCATTA ACGTGTCTTG CATATAGCGT GCCCATGTTA TTTAGTGTGT
401 TGATACCGTA